JP6876156B2 - Il−17a及びil−17fに反応するモノクローナル抗体、及びその使用 - Google Patents
Il−17a及びil−17fに反応するモノクローナル抗体、及びその使用 Download PDFInfo
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Description
ヒトIL−17A(Cell Signaling#8928SF、www.cellsignal.com)と、IL−17F(Cell Signaling#8906LC、www.cellsignal.com)(10μgずつ)と、完全フロイントアジュバント(Sigma−Aldrich、Cat#F6881)とを、BALB/cマウス(16−18g、6週齢、北京バイタルリバーラボラトリーアニマルテクノロジー社から購入)に皮下注射して免疫を行った。免疫は3日間隔で5回繰り返した。最終ブーストの3日後、注射部位に近いリンパ節を慎重に切り取した。リンパ球は、PEG1500(ポリエチレングリコール1500、Roche TM.Cat#:783641、10×4mlで75 mM Hepes液に含まれ、PEG 50%W/Vである)によりAg 8.653骨髄腫細胞(Sigma−Aldrich、Cat#85011420)と融合させ、HAT セレクション(Sigma cat #:H0262)とHFCS(Hybridoma Fusion and Cloning Supplement、50x、Roche cat#:11−363−735−001)でクローンした。ヒトIL−17A及びIL−17Fの両者とを結合できる抗体の産生は、ELISA及びサイトカイン放出アッセイにて、ハイブリドーマ上清液を用いてスクリーニングを行った(実施例5を参照)。選択されたマウス抗IL17A/Fクローン(1−15−X)は、CDR−移植と復帰突然変異(back mutation)を使用してヒト化した。
DYNLN
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YDYGDAMDY
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KVSNRFS
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ヒト化IgG重鎖(配列番号10のアミノ酸配列)、軽鎖(配列番号11のアミノ酸配列)をコードするDNA配列を合成し、pTGE5ベクター(Genescriptから購入可能)に挿入されて、全長IgGの発現プラスミドを構築した。親抗体の発現は、100mlのHEK293細胞培養で行われ(HEK293細胞はThermoFisher Scientificから購入可能)、その上清液をプロテインAアフィニティーカラムで精製した。精製した抗体は、PD−10脱塩カラム(Thermofisher Scientificから購入可能)を用いてPBSにバッファーを交換した。精製したタンパク質の濃度と純度は、それぞれ、OD280とSDS−PAGEで測定した。ヒト化した抗体は、30 mlの HEK 293細胞培養で発現した。細胞はスピンダウンした。上清液をろ過し、SDS−PAGE分析を行いた(図1)。
QFQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNLNWVRQAPGKGLEWMGVIHPDYGTTSYNQKFKDRVTMTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCVRYDYGDAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
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抗ヒトFcガンマ特異抗体(Jackson Immuno Research、ロット番号124448、コード109−008−098)をアミンカップリング法にてセンサーチップに固定した。培地に分泌された4つの抗体、及び親抗体を注入され、それぞれ抗ヒトFc抗体によってFc(捕捉相)を介して捕捉された。平衡させた後、300秒かけてIL−17を注入し(結合相)、次に、1200秒かけてランニングバッファーを注入した(解離相)。参照フロー細胞(フロー細胞1)の応答は、サイクルごとにヒト化した抗体のフロー細胞の応答から差し引かれた。次のヒト化した抗体を注入する前に、その表面は再生させた。このプロセスが、全ての抗体を分析したまで繰り返された。ヒト化した抗体の解離率は、Biacore T200エバリュエーションソフトを用いて、実験データをローカルマシンで1:1インタラクションモデルにフィットすることで取得した。前記抗体は、それらの解離速度定数(解離率、Kd)によって順位付けされた。IL−17とインタラクションする時に、親抗体と類似の親和性を有するバインダーを選択した。
MaxiSorp 96 wellプレート(NUNC#449824、www.thermofisher.com)は、2μg/mlのヒトIL−17A(Cell Signaling#8928SF、www.cellsignal.com)又はヒトIL−17F(Cell Signaling#8906LC、 www.cellsignal.com)を含む1xPBS(50μl/well)を用してコートされた。プレートは4℃で一晩培養した。コーティング液を除去し、プレートを200μl/wellのPBST(0.05%tween−20を含む1xPBS)で1回洗浄した。次に、200μl/wellのブロッキングバッファー(0.05%tween−20を含む1x PBS、3%BSA)を添加し、室温で1時間培養した。ブロッキングバッファーを除去し、プレートを200μl/wellのPBST(0.05%tween−20を含む1x PBS)で3回洗浄した。1xPBSで抗IL−17A/F抗体(実施例2で作製した)を10、3.33、1.11、0.37、0.123、0.041、0.0137、0.0046、0.0015、0.00031、0.000102、0.000034μg/mlに希釈し、プレートに加えた(50μl/well)。プレートを室温で2時間培養した。ウェルの中に存在した抗体を除去し、プレートを200μl/wellのPBST(0.05%tween−20を含む1xPBS)で3回洗浄した。ヤギ抗ヒトIgG(H&L)−HRP二次抗体(Jackson Immuno Research#109−035−088、www.jacksonimmuno.com)を1xPBSで1:5000に希釈して、各ウェルに追加した(50μl/well)。プレートを室温で1時間培養した。二次抗体を除去し、プレートを200μl/wellのPBST(0.05%tween−20を含む1xPBS)で7回洗浄した。50μl/wellのTMB(eBioscience#85−00−4201−56、www.ebioscience.com)を加えて、プレートを室温で数分間培養した。次に、50μl/wellの2N H2SO4を加えて反応を停止させた。光学密度(吸光度)は、ヒトIL−17A及びIL−17Fへの結合に関連する450nmで測定された。平衡定数であるEC50(nM)を表2に示す。以上の結果から、抗IL17A/F抗体は、ヒトIL−17AとIL−17Fの両者に対して高い親和性で結合できることを示す。
抗IL17A/F抗体(実施例2で作製した)は、IL−17A、IL−17F又はIL17A/FのIL−17受容体への結合に対する作用をELISAにて検査した。IL−17A、IL−17F、又はIL−17A/Fは、96wellプレートにおいて50μl/wellのタンパク質溶液(タンパク質濃度は0.5μg/ml)で、4℃で一晩コートされた。前記ウェルは、200μl/wellの1%BSA(0.05%のtween)を含むPBSTにより、室温で1時間ブロックされた。ウェルをPBSTで3回洗浄した。抗IL17A/F抗体、及びアイソタイプ対照抗体としてのヒトIgG1(Biolegend cat#403102)をPBSで、30μg/mlから0.0005μg/mlまで(30、10、3.33、1.11、0.37、0.123、0.041、0.0137、0.0046、0.0015、0.0005μg/ml)に希釈した。抗体を対応するウェルに加えて(50μl/well)、室温で4時間培養した。ウェルをPBSTで3回洗浄した。hIL17RA−mIgG2aFc(10μg/ml、標準分子生物学技術、Carson S、Molecular Biology Techniques、2012に基づく内製した)を各ウェルに加えて(50μl/well)、室温で1時間培養した。ウェルをPBSTで3回洗浄した。ヤギ抗ヒトIgG−HRP(1:5000でPBSに含まれ、EASYBIO Cat#BE0102)を各ウェルに(50μl/well)加えて、室温で30分間培養した。ウェルをPBSTで6回洗浄した。各ウェルにTMB基質を加えて(ウェルずつ50μl)、反応は各ウェルに50μlの2N H2SO4を加えることで停止させた。プレートは450nmと570nmで読み取られた。図3に示すように、抗IL17A/F抗体は、IL−17A、IL17F、さらにはIL−17A/FのIL−17受容体への結合をブロックする。上記データから、抗IL17A/F抗体はサイトカインとその受容体との間のインタラクションを遮断することにより、IL−17A、IL−17F及びIL17A/Fの活性を阻害することをさらに実証する。
MaxiSorp 96wellプレート(NUNC#449824、www.thermofisher.com)は、2μg/mlのヒトIL−17A(Cell Signaling#8928SF、www.cellsignal.com)、ヒトIL−17F(Cell Signaling#8906LC、www.cellsignal.com)、ヒトIL−17B(Peprotech#200−28、www.peprotech.com)、ヒトIL−17C(R&Dシステム#1234−IL−025/CF、www.rndsystems.com)、ヒトIL −17D((Peprotech#200−27、www.peprotech.com)、ヒトIL−17E(R&D systems#1258−IL−025/CF、www.rndsystems.com)、それぞれを含む1x PBS(50μl/well)を用いてコートされた。プレートは4℃で一晩培養した。コーティング液を除去し、プレートを200μl/wellのPBST(0.05%tween−20を含む1xPBS)で1回洗浄した。次に、200μl/wellのブロッキングバッファー(0.05%tween−20を含む1x PBS、3%BSA)を加えて、室温で1時間培養した。ブロッキングバッファーを除去し、プレートを200μl/wellのPBST(0.05%tween−20を含む1xPBS)で3回洗浄した。1x PBSで抗IL17A/F抗体、hIgG VH1−1/VL5を10、3.33、1.11、0.37、0.123、0.041、0.0137、0.0046、0.0015、0.00031、0.000102、0.000034μg/mlに希釈し、プレートに加えた(50μl/well)。プレートを室温で2時間培養した。ウェルの中に存在した抗体を除去し、プレートを200μl/wellのPBST(0.05%tween−20を含む1xPBS)で3回洗浄した。ヤギ抗ヒトIgG(H&L)−HRP二次抗体(Jackson Immuno Research#109−035−088、www.jacksonimmuno.com)を1xPBSで1:5000に希釈したものを、各ウェルに追加した(50μl/well)。プレートを室温で1時間培養した。二次抗体を除去し、プレートを200μl/wellのPBST(0.05%tween−20を含む1xPBS)で7回洗浄した。50μl/wellのTMB(eBioscience#85−00−4201−56、www.ebioscience.com)を加えて、プレートを室温で数分間培養した。次に、50μl/wellの2N H2SO4を加えて反応を停止させた。プレートを450 nmで読み取った。結果を表3に示す。抗IL17A/F抗体であるhIgG VH1−1/VL5は、ヒトIL−17A及び17Fの両者との結合能を持つ(図4のAとF)、EC50はそれぞれ、0.046、0.047nMである。それ以外、hIgG VH1−1/VL5はヒトIL−17B、17C、17D及び17Eに結合しなかった(図4、B、C、D及びE)。したがって、hIgG VH1−1/VL5抗体は、ヒトIL−17A及び17Fへの結合特異性を持つ、他のIL−17ファミリーのメンバーとは交差反応性を有しない。
抗IL−17A/F抗体がカニクイザルIL−17A及びIL−17Fへの結合能は、ELISAにて測定した。なお、ヒトIL−17A及びFをそれぞれ、カニクイザルIL−17A(GeneID:XM_005552759.2、標準分子生物学技術、Carson S、Molecular Biology Techniques、2012による内製した)及びIL−17F(GeneID:XM_005552757.2、標準分子生物学技術、Carson S、Molecular Biology Techniques、2012による内製した)に置き換えた以外、実施例7と同様の方法でアッセイを実施した。
hIgG VH1−1−VL5抗体は、カニクイザルII−17A及び17Fへの結合能を持つ、EC50はそれぞれ0.06、0.18nMである(表4、及び図5のA、B)。
ヒトIL−17(Cell Signaling Cat#8928SF、3μg/マウス)を皮下注射する1時間前に、抗IL−17A/F抗体(実施例2で作製したVH1−1/VL5、20μg/マウス)をC57BL/6Nマウスに(群各n = 5、8週齢、体重:18−20g 、Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.、Ltd.から購入可能)静脈内投与した。IL−17を投与したから2時間の時点で血液サンプルを採取し、血漿中のCXCL1ケモカインのレベルをELISA(マウスCXCL1/GROアルファDuoSet ELISAキット、R&Dシステム、DY345)を用いて測定した。アイソタイプ対照抗体としては、ヒトIgG1(BioLegend Cat#40312)を用いた。図6に示すように、抗IL17A/F抗体(実施例2で作製した)は、アイソタイプ対照抗体と比較して、C57BL/6マウスの血漿におけるヒトIL−17Aで誘導したケモカインの分泌を低下させることができる。この結果から、抗IL17A/F抗体が、IL−17の活性を阻害、遮断、または中和するための医薬品として使用できることを示唆している。
Claims (14)
- IL−17A及びIL−17Fの両者に結合し、IL−17A及びIL−17Fの両者の活性を阻害する抗IL17A/F抗体であり、配列番号1で表されるCDR1H、配列番号2で表されるCDR2H、配列番号3で表されるCDR3H、配列番号4で表されるCDR1L、配列番号5で表されるCDR2L、及び、配列番号6で表されるCDR3Lを含む、抗IL17A/F抗体。
- 配列番号7で表される可変重鎖ドメイン(VH1−1)並びに配列番号8で表される可変軽鎖ドメイン(VL5)又は配列番号9で表される可変軽鎖ドメイン(VL2−1)を含む、請求項1に記載の抗IL17A/F抗体。
- ヒトIgGクラスに属する、請求項1に記載の抗IL17A/F抗体。
- マウス、キメラ又はヒト化バリアントである、請求項1に記載の抗IL17A/F抗体。
- 配列番号10で表される重鎖と配列番号11で表される軽鎖とを含む、請求項1に記載の抗IL17A/F抗体。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の抗IL17A/F抗体をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項6に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
- 請求項7に記載の組換え発現ベクターを含む、宿主細胞。
- 被験体におけるIL−17A及び/又はIL−17F関連疾病を治療するための医薬組成物であって、治療に有効な量の請求項1〜5のいずれか一項に記載の抗IL17A/F抗体及び医薬的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
- 前記IL−17A及び/又はIL−17F関連疾病が、自己免疫疾患又は炎症性疾患から選択される、請求項9に記載の医薬組成物。
- 前記IL−17A及び/又はIL−17F関連疾病が乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、関節リウマチ(RA)、多発性硬化症(MS)、全身性エリテマトーデス、変形性関節症又は炎症性腸疾患(IBD)から選択される、請求項10に記載の医薬組成物。
- 被験体が哺乳類である、請求項9に記載の医薬組成物。
- 前記被験体が、ラット、マウス、サル又はヒトから選択される、請求項12に記載の医薬組成物。
- 被験体がヒトである、請求項13に記載の医薬組成物。
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