CN110582512A - 针对il-17a和il-17f二者的单克隆抗体及其用途 - Google Patents
针对il-17a和il-17f二者的单克隆抗体及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了与IL‑17A和IL‑17F二者结合并且抑制IL‑17A和IL‑17F二者的活性的抗‑IL17A/F抗体。所述抗体包含分别由SEQ ID NOs:1‑3表示的重链CDRs 1‑3和分别由SEQ ID NOs:4‑6表示的轻链CDRs 1‑3。本发明还提供所述抗体在制备用于治疗受试者中与IL‑17A和/或IL‑17F有关的疾病的药物中的用途，和包含所述抗体的药物组合物。
Description
发明领域
本发明涉及针对IL-17A和IL-17F二者的抗体及其用途。具体地，本发明提供抗-IL17A/F抗体，其结合IL-17A和IL-17F二者并且抑制IL-17A和IL-17F二者的活性，以及所述抗体的用途。
背景技术
白细胞介素17(IL-17)细胞因子家族中有6个成员，包括IL-17A(通常称为IL-17)、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E(也称为IL-25)和IL-17F。在所有成员中，最清楚IL-17A(CTLA-8，Swiss Prot Q16552)和IL-17F(Swiss-Prot#Q96PD4SEQ ID#NP_443104)的生物学功能和调节。这两种细胞因子共有最强的序列同源性(55％同一性)。编码IL-17A和IL-17F的基因在小鼠和人二者的同一染色体上彼此接近，强调了它们共有的表达模式(Wang X.等人,Immunity 2012；36:23–31.)。在功能上，IL-17A和IL-17F二者都介导促炎反应，具有取决于炎症的类型和位点的某些差异(Ishigame H等人,Immunity 2009；30:108–119；YangXO等人,J Exp Med2008；205:1063–1075.)。IL-25与IL-17A的序列相似性最低，仅为16％，相比之下在IL-17F的情况下为50％。相应地，IL-25在免疫中起不同的作用，主要调节针对蠕虫寄生虫和过敏性炎症的T辅助(Th)2应答(Fallon PG等人,J Exp Med 2006；203:1105–1116.)。已经显示IL-17B、IL-17C和IL-17D诱导促炎细胞因子的产生，但是它们的生物学功能在很大程度上是未知的(Yamaguchi Y等人,J Immunol 2007；179:7128–7136；Wu Q等人,Microbes Infect 2007；9:78–86；Li H等人,Proc Natl Acad Sci USA 2000；97:773–778)。三个不同组的最新研究强调了IL-17C在粘膜免疫和自身免疫反应中的功能(Ramirez-Carrozzi V等人Nat Immunol 2011；12:1159–1166；Song X等人,Nat Immunol2011；12:1151–1158；Chang SH等人,Immunity2011；35:611–621.)。IL-17家族细胞因子通过靶细胞上的表面受体介导它们的生物学功能。IL-17RA是第一个鉴定出的IL-17受体，随后主要基于它们与IL-17RA的序列相似性，鉴定出其他4种IL-17R家族成员IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD和IL-17RE。IL-17家族细胞因子的功能性受体通常以异二聚体的形式存在，IL-17RA作为共有亚基。例如，由IL-17RA和IL-17RC组成的受体复合物识别IL-17A和IL-17F，而IL-17RA与IL-17RB配对，然后与IL-25结合(Iwakura Y等人,Immunity 2011；34:149–162；Chang SH,Dong C.Cell Signal 2011；23:1069–1075.)。
失调的IL-17A和IL-17F的产生可以导致过度的促炎细胞因子表达和慢性炎症，其导致组织损伤和自身免疫。IL-17家族细胞因子与许多自身免疫性疾病有关，包括多发性硬化(MS)、类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病和牛皮癣。长期以来，MS被认为是Th1依赖性疾病，直到研究揭示了Th17细胞和IL-17家族细胞因子在使用EAE发展MS(一种类似人MS的小鼠模型)中的关键作用(Langrish CL等人,J Exp Med 2005；201:233–240；Park H等人,NatImmunol 2005；6:1133–1141.)。Th17细胞和相关细胞因子是驱动相关中枢神经系统炎症和损伤形成的主要力量(Langrish CL等人,J ExpMed 2005；201:233–240；Park H等人,NatImmunol 2005；6:1133–1141)。在RA患者的滑液和滑膜中容易检测到IL-17A(Chabaud M等人,J Immunol1998；161:409–414.)。使用RA小鼠模型的一些研究已证明IL-17A在疾病进展中的关键作用(Murphy CA等人,J Exp Med 2003；198:1951–1957；Nakae S等人,J Immunol2003；171:6173–6177；Nakae S等人Proc NatlAcad Sci USA 2003；100:5986–5990；Lubberts E等人,Arthritis Rheum 2004；50:650–659；Ruddy MJ等人,J Leukoc Biol2004；76:135–144)。在疾病发作后阻断IL-17有效地防止骨和软骨侵蚀并且降低临床症状的严重程度(Lubberts E等人,Arthritis Rheum 2004)。IL-17A在许多自身免疫性疾病中的广泛参与使得该细胞因子成为理想的药物靶标。实际上，人源化IL-17A抗体已被开发用于治疗RA、牛皮癣和葡萄膜炎，得到有利的结果(Genovesse MC等人,Arthritis Rheum2010；62:929–939；Hueber W等人,Sci Transl Med 2010；2:52-72.)。
总之，IL-17A和IL-17F冗余地在促进炎症方面具有相同的受体和功能。IL-17A和IL-17F可以诱导多种炎症细胞因子、趋化因子和粘附分子的产生，并且将嗜中性粒细胞和巨噬细胞募集到炎症部位。IL-17A和IL-17F二者类似地作为促进剂参与人类以及人类疾病的动物模型中的多种自身免疫性疾病和炎性疾病的进展和病理学，包括类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、骨关节炎和炎性肠病(IBD)。在RA患者的滑膜组织中检测到高水平的IL-17A(Chabaud M等人,J Immunol 2003；171:6173-6177)。IL-17A在MS患者的脑脊液中过表达(Hellings,P.W.等人,Am.J.Resp.Cell Mol Biol.28(2003)42-50)。
发明内容
IL-17A和IL-17F二者的证明的免疫活性说明了IL-17A和IL17F拮抗剂的临床或治疗潜力以及对其的需求。具体地，与IL-17A和IL-17F二者结合并且阻断IL-17A和IL-17F二者的活性的抗体将具有新的和/或改善的治疗性质。因此，需要针对IL-17A和IL-17F二者的拮抗剂。用单克隆抗体阻断IL-17A和IL-17F二者将具有比用于治疗牛皮癣、牛皮癣性关节炎和强直性脊柱炎的IL-17A拮抗剂更好的临床或治疗潜力。
本发明提供了这样的抗体，所述抗体能够特异性结合人IL-17A和IL-17F二者(本文中可互换地称为“交叉反应性抗体”、“IL-17A/F抗体”等)并且能够调节IL-17A和IL-17F二者的活性，并且因此可用于治疗各种疾病和病理状况，诸如免疫相关疾病和炎症性疾病。抗体的特征在于包含由SEQ ID NO:1表示的CDR1H，由SEQ ID NO:2表示的CDR2H，由SEQIDNO:3表示的CDR3H；以及由SEQ ID NO:4表示的CDR1L，由SEQ ID NO:5表示的CDR2L和由SEQ ID NO:6表示的CDR3L。
在一个实施方案中，这样的抗-IL17A/F抗体是鼠、嵌合或人源化变体。抗-IL17A/F抗体是单克隆和双特异性抗体。
在一个实施方案中，抗体的特征在于包含：
由SEQ ID NO:7表示的可变重链结构域(VH1-1)，和由SEQ ID NO:8表示的可变轻链结构域(VL5)或由SEQ ID NO:9表示的VL2-1。
在一个实施方案中，抗体的特征在于包含：
由SEQ ID NO:7表示的可变重链结构域(VH1-1)，和由SEQ ID NO:8表示的可变轻链结构域(VL5)。
在一个实施方案中，抗体的特征在于是人IgG类型。
在一个实施方案中，抗体的特征在于包含：
由SEQ ID NO:10表示的重链，和
由SEQ ID NO:11表示的轻链。
IL-17A/F抗体尤其可以用于体外、原位或体内诊断或治疗与存在IL-17A和/或IL-17F有关的哺乳动物细胞或病理状况。在一个实施方案中，与IL-17A和/或IL-17F有关的疾病是自身免疫性疾病或炎性疾病，例如，包括但不限于牛皮癣、牛皮癣性关节炎、强直性脊柱炎、类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、系统性红斑狼疮、骨关节炎或炎性肠病(IBD)。
附图描述
图1示出了在非还原和还原条件下亲本抗体的SDS-PAGE结果。在每个泳道中加载约2μg蛋白质。(A)标记，页面标尺预染蛋白梯(page rulerpre-stained protein ladder)(Thermo Scientific，产品编号：26616)；BSA-N，非还原的；QH_VH1-1+QH_VL2-1-N，非还原的；QH_VH1-1+QH_VL5-N，非还原的；QH_VH1-1+QH_VL2-1-R，还原的；QH_VH1-1+QH_VL5-R，还原的；BSA-R，还原的；(B)标记示出的分子量。
图2示出了抗-IL17A/F抗体对HFF-1细胞中IL-17A、IL-17F和IL-17A/F诱导IL-6的抑制效果(IC50，以nM计)，即本发明的抗-IL17A/F抗体的功能性测定的结果。(A)IL-17A诱导的IL-6产生被抗-IL17A/F抗体VH1-1/VL5mAb抑制，并且IC50为1.727nM；(B)IL-17F诱导的IL-6产生被抗-IL17A/F抗体VH1-1/VL5mAb抑制，并且IC50为1.77nM；(C)IL-17A/F异二聚体诱导的IL-6产生被抗-IL-17A/F抗体VH1-1/VL5mAb抑制，并且IC50为0.99nM。人IgG1(hIgG1)用作对照抗体。
图3示出了抗-IL17A/F抗体对IL-17A、IL-17F或IL-A/F与IL-17受体之间相互作用的阻断效果。(A)抗-IL17A/F抗体，即抗-IL17A/FVH1-1/VL5抗体，阻断IL-17A和IL-17RA之间的相互作用；(B)抗-IL17A/F抗体，即抗-IL17A/F VH1-1/VL5抗体，阻断IL-17F和IL-17RA之间的相互作用；(C)抗-IL17A/F抗体，即抗-IL17A/F VH1-1/VL5抗体，阻断IL-17A/F和IL-17RA之间的相互作用。人IgG1(hIgG1)用作对照抗体。
图4示出了hIgG VH1-1/VL5与人IL-17家族成员的结合特性。将2μg/ml的人IL-17A、B、C、D、E和F分别包被到ELISA板中，并且与一系列浓度的hIgG VH1-1/VL5抗体(A～F)一起温育。人IgG1(hIgG1)用作对照抗体。结合特性由OD450nm表示。通过GraphPad Prism计算EC50值。
图5示出了hIgG VH1-1/VL5与食蟹猴IL-17A和F的结合特性。将2μg/ml的食蟹猴IL-17A(A)和17F(B)分别包被到ELISA板中，并且与hIgGVH1-1/VL5抗体(抗体浓度为0.3nM至66.67nM)一起温育。人IgG1(hIgG1)用作对照抗体。通过GraphPad Prism计算EC50值。
图6抗-IL17A/F抗体在小鼠药效学模型中抑制人IL-17诱导的CXCL1分泌。在每只小鼠静脉内(i.v.)注射20μg抗-IL17A/F抗体后1小时，将人IL-17A(3μg)皮下(s.c.)施用至小鼠。在人IL-17A注射后2小时通过ELISA测定KC水平。每组n＝5只小鼠。
发明详述
现在将进一步描述本发明。在以下段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。除非明确相反地指明，否则如此定义的每个方面可以与任何其他方面或多个方面组合。特别地，在不偏离由权利要求限定的本发明范围的情况下，指示为优选或有利的任何特征可以与指示为优选或有利的任何其他特征或多个特征组合。
除非另有说明，本发明的实践将采用分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术、生物信息学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。这样的技术在文献中得到充分说明。
在第一方面，本发明提供抗-IL17A/F抗体，其结合IL-17A和IL-17F二者并且抑制IL-17A和IL-17F的活性。抗体包含由SEQ ID NO:1表示的CDR1H，由SEQ ID NO:2表示的CDR2H，由SEQ ID NO:3表示的CDR3H；以及由SEQ ID NO:4表示的CDR1L，由SEQ ID NO:5表示的CDR2L和由SEQ ID NO:6表示的CDR3L。
本发明的抗-IL17A/F抗体是具有双特异性结合活性的单克隆抗体。
抗-IL17A/F抗体可以抑制IL-17A和IL-17F与其受体的结合。
在一个实施方案中，这样的抗-IL17A/F抗体是鼠、嵌合或人源化变体。在一个实施方案中，抗体包含由SEQ ID NO:7表示的可变重链结构域(VH1-1)，和由SEQ ID NO:8表示的可变轻链结构域(VL5)或由SEQ ID NO:9表示的VL2-1。在一个实施方案中，抗体包含由SEQID NO:7表示的可变重链结构域(VH1-1)，和由SEQ ID NO:8表示的可变轻链结构域(VL5)。
在一个实施方案中，抗体的特征在于是人IgG类型。在一个实施方案中，人源化抗体包含由SEQ ID NO:10表示的重链和由SEQ ID NO:11表示的轻链。
在第二方面，本发明提供了编码第一方面的抗-IL17A/F抗体的核苷酸序列。如本领域中公知的，核苷酸序列可以是密码子优化的，这取决于用于表达抗-IL17A/F抗体的细胞类型。
本申请还提供了编码第一方面的抗-IL17A/F抗体的重链可变结构域和/或轻链可变结构域的核苷酸序列。
包含编码第一方面的抗-IL17A/F抗体的核苷酸序列的重组表达载体也在本发明的范围内。重组表达载体可以在原核或真核宿主细胞中表达所述核苷酸序列。
如本领域中已知的，包含编码第一方面的抗-IL17A/F抗体的表达载体或核苷酸序列的宿主细胞也在本发明的范围内。宿主细胞可以产生本发明的抗-IL17A/F抗体。可以通过用包含所述核苷酸序列的重组表达载体转化或转染细胞来获得所述宿主细胞。宿主细胞可以包含含有核苷酸序列的重组表达载体，或者核苷酸序列可以通过同源重组整合到宿主细胞的基因组中。宿主细胞可以是原核或真核宿主细胞，例如来源于哺乳动物物种的细胞系，诸如CHO细胞、HEK293细胞或骨髓瘤细胞等。哺乳动物物种可以选自但不限于大鼠、小鼠、猴或人。优选地，宿主细胞是人细胞。
在这方面，本发明的抗-IL17A/F抗体可以由宿主细胞表达，所述宿主细胞包含编码第一方面的抗-IL17A/F抗体的表达载体或核苷酸序列。在表达后，可以通过常规蛋白质纯化方法从所述细胞或细胞培养上清液中回收抗-IL17A/F抗体。抗体的重组制备是本领域中公知的。在另一个方面，本发明的抗-IL17A/F抗体可以通过以下方式合成或制备：用合适的抗原免疫动物，然后从收集自免疫动物的腹水中回收抗-IL17A/F抗体。
在一个实施方案中，本发明提供了用于制备第一方面的抗-IL17A/F抗体的方法，其中所述方法包括以下步骤：通过培养宿主细胞表达抗-IL17A/F抗体，所述宿主细胞包含编码第一方面的抗-IL17A/F抗体的表达载体或核苷酸序列，并且从宿主细胞或细胞培养上清液中回收抗-IL17A/F抗体。
在第三方面，本发明涉及第一方面的抗-IL17A/F抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗受试者中与IL-17A和/或IL-17F有关的疾病。在一个实施方案中，与IL-17A和/或IL-17F有关的疾病是自身免疫性疾病或炎性疾病，例如，包括但不限于牛皮癣、牛皮癣性关节炎、强直性脊柱炎、类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、系统性红斑狼疮、骨关节炎和炎性肠病(IBD)。受试者可以是哺乳动物，诸如大鼠、小鼠、猴或人。优选地，受试者是人。
在第四方面，本发明提供了用于治疗受试者中与IL-17A和/或IL-17F有关的疾病的药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的第一方面的抗-IL17A/F抗体和药用赋形剂。本领域技术人员可以为药物组合物选择合适的赋形剂。在一个实施方案中，与IL-17A和/或IL-17F有关的疾病是自身免疫性疾病或炎性疾病，例如，包括但不限于牛皮癣、牛皮癣性关节炎、强直性脊柱炎、类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、系统性红斑狼疮、骨关节炎和炎性肠病(IBD)。受试者可以是哺乳动物，诸如大鼠、小鼠、猴或人。优选地，受试者是人。
在第五方面，本发明提供了用于治疗受试者中与IL-17A和/或IL-17F有关的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明第四方面的药物组合物的步骤。在一个实施方案中，与IL-17A和/或IL-17F有关的疾病是自身免疫性疾病或炎性疾病，例如，包括但不限于牛皮癣、牛皮癣性关节炎、强直性脊柱炎、类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、系统性红斑狼疮、骨关节炎和炎性肠病(IBD)。受试者可以是哺乳动物，诸如大鼠、小鼠、猴或人。优选地，受试者是人。
虽然前述公开内容提供了涵盖在本发明范围内的主题的一般描述，包括制备和使用本发明的方法及其最佳模式，但是提供以下实施例以进一步使得本领域技术人员能够实施本发明并且提供其完整的书面描述。然而，本领域技术人员将理解，这些实施例的细节不应理解为对本发明的限制，应当从附于本公开的权利要求及其等同物中理解本发明的范围。鉴于本发明的公开内容，本发明的各种另外的方面和实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。
在本文中使用的情况下，“和/或”被视为具体公开了两个特定特征或组分的每一个，其与另一个一起或不与另一个一起公开。例如，“A和/或B”将被视为具体公开了(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每一个，就好像每一个在本文中个别地列出。
除非另有说明，否则上述特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案，并且同样适用于所描述的所有方面和实施方案。
上述申请和在其中引用或在其审查期间引用的所有文献和序列登记号(“申请引用文献”)以及引用文献中引用或参考的所有文献，以及本文中引用或参考的所有文献(“本文引用文献”)，以及本文引用文献中引用或参考的所有文献，连同用于本文提及的任何产品或通过引用结合于此的任何文献中的任何制造商说明书、描述、产品说明书和产品页，均通过引用结合于此，并且可以用于实施本发明。更具体地，所有参考文献通过引用并入，其程度如同每个单独的文件被具体和单独地指出通过引用并入。
实施例
实施例1.抗-IL17A/F抗体的制备
通过皮下注射人IL-17A(Cell Signaling#8928SF，www.cellsignal.com)和IL-17F(Cell Signaling#8906LC，www.cellsignal.com)(每种10μg)与完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich，Cat#F6881)，免疫BALB/c小鼠(16-18g，6周龄，购自Beijing Vital RiverLaboratory Animal Technology Co.,Ltd.)。以3天的间隔重复免疫5次。最后一次加强后3天，仔细切出靠近注射部位的淋巴结。使用PEG1500(聚乙二醇1500，Roche TM.Cat#:783641，10×4ml，在75mM Hepes中，PEG 50％W/V)将淋巴细胞与Ag8.653骨髓瘤细胞(Sigma-Aldrich，Cat#85011420)融合，并且用HAT选择(Sigma cat#:H0262)和HFCS(杂交瘤融合和克隆补充剂，50×，Roche cat#:11-363-735-001)克隆。通过ELISA和细胞因子释放测定筛选杂交瘤上清液，用以制备可以结合人IL-17A和IL-17F二者的抗体(参见实施例5)。使用CDR移植和回复突变将选择的鼠抗-IL17A/F克隆(1-15-X)人源化。
通过CDR移植的抗体人源化：制定了精选的受体框架。使用NCBIIg-Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/igblast/)，在人种系数据库中搜索亲本抗体的可变结构域序列。选择每种重链和轻链的五种不同的人受体(即与亲本抗体具有高同源性的人可变结构域)。人受体的CDR用它们的小鼠对应物替换，产生人源化可变结构域序列。重链和轻链的CDR序列(SEQ ID NOs:1-6)分别如下所示。设计、合成5条人源化重链和5条人源化轻链，并且将其插入表达载体中。表达人源化抗体，然后用于亲和力排序测试。选择具有最强结合亲和力的抗体(VH1-VL5和VH1-VL2)进行回复突变。在这些变体中，选择VH1-1/VL5和VH1-1/VL2-1用于进一步表征。VH1-1/VL5显示出最佳的结合亲和力。
CDR1H氨基酸序列(SEQ ID NO:1)
DYNLN
CDR2H氨基酸序列(SEQ ID NO:2)
VIHPDYGTTSYNQKFKD
CDR3H氨基酸序列(SEQ ID NO:3)
YDYGDAMDY
CDR1L氨基酸序列(SEQ ID NO:4)
RSSQSLVHSNGNTYLH
CDR2L氨基酸序列(SEQ ID NO:5)
KVSNRFS
CDR3L氨基酸序列(SEQ ID NO:6)
SQSTHVPLT
可变重链结构域(VH1-1)氨基酸序列(SEQ ID NO:7)
QFQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNLNWVRQAPGKGLEWMGVIHPDYGTTSYNQKFKDRVTMTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCVRYDYGDAMDYWGQGTLVTVSS
可变轻链结构域(VL5)氨基酸序列(SEQ ID NO:8)
DIVMTQSPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQPPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPLTFGQGTKLEIK
可变轻链结构域(VL2-1)氨基酸序列(SEQ ID NO:9)
DIVMTQTPLSSSVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWLQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPLTFGQGTKLEIK
实施例2.抗-IL17A/F抗体的表达和纯化
合成编码人源化IgG重链(SEQ ID NO:10的氨基酸序列)和轻链(SEQID NO:11的氨基酸序列)的DNA序列，并且将其插入pTGE5载体(可从Genescript商购获得)以构建全长IgG的表达质粒。亲本抗体的表达在100mlHEK293细胞培养物中进行(HEK293细胞可从ThermoFisher Scientific商购获得)，并且将上清液用蛋白A亲和柱纯化。将纯化的抗体使用PD-10脱盐柱(可从Thermofisher Scientific商购获得)缓冲液交换到PBS中。纯化蛋白的浓度和纯度分别通过OD280和SDS-PAGE测定。人源化抗体在30mlHEK 293细胞培养物中表达。将细胞旋转沉淀。将上清液过滤并且进行SDS-PAGE分析(图1)。
包含VH1-1的重链氨基酸序列(SEQ ID NO:10，全长序列)
QFQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNLNWVRQAPGKGLEWMGVIHPDYGTTSYNQKFKDRVTMTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCVRYDYGDAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
包含VL5的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:11，全长序列)
DIVMTQSPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQPPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
实施例3.SPR分析抗-IL17A/F抗体与人IL-17A和IL-17F的结合亲和力
使用胺偶联方法将抗-人Fcγ特异性抗体(Jackson Immuno Research，批号124448，代码109-008-098)固定在传感器芯片上。注射分泌到培养基的4种抗体连同亲本抗体，并且通过Fc(捕获相)单独地由抗-人Fc抗体捕获。平衡后，注射IL-17达300秒(结合期)，然后注射运行缓冲液达1200秒(解离期)。在每个循环期间从那些人源化抗体流动细胞中减去参考流动细胞(流动细胞1)的响应。在注射另一种人源化抗体之前使表面再生。重复该过程直至分析所有抗体。使用Biacore T200评价软件，通过将实验数据局部拟合至1:1相互作用模型来获得人源化抗体的解离速率。通过其解离速率常数(解离速率，Kd)对抗体进行排序。选择以与亲本抗体类似的亲和力与IL-17相互作用的结合物。
表1.亲和力测量数据
实施例4.通过ELISA测量与人IL-17A和IL-17F的结合
将MaxiSorp 96-孔板(NUNC#449824，www.thermofisher.com)用在1xPBS(50μl/孔)中的2μg/ml人IL-17A(Cell Signaling#8928SF，www.cellsignal.com)或人IL-17F(Cell Signaling#8906LC，www.cellsignal.com)包被。将板在4℃温育过夜。移除包被溶液，并且将板用200μl/孔的PBST(1x PBS，具有0.05％吐温-20)洗涤1次。然后加入200μl/孔的封闭缓冲液(1x PBS，具有0.05％吐温-20、3％BSA)并且在室温温育1小时。移除封闭缓冲液，并且将板用200μl/孔的PBST(1x PBS，具有0.05％吐温-20)洗涤3次。通过1x PBS将抗-IL-17A/F抗体(实施例2中制备)稀释至10、3.33、1.11、0.37、0.123、0.041、0.0137、0.0046、0.0015、0.00031、0.000102、0.000034μg/ml，并且加入板中(50μl/孔)。将板在室温温育2小时。移除孔中的抗体，并且将板用200μl/孔的PBST(1x PBS，具有0.05％吐温-20)洗涤3次。将山羊抗-人IgG(H&L)-HRP二抗(Jackson Immuno Research#109-035-088，www.jacksonimmuno.com)在1x PBS中1:5000稀释，并且加入各孔(50μl/孔)。将板在室温温育1小时。移除二抗，并且将板用200μl/孔的PBST(1x PBS，具有0.05％吐温-20)洗涤7次。加入50μl/孔的TMB(eBioscience#85-00-4201-56，www.ebioscience.com)并且将板在室温温育几分钟。然后加入50μl/孔的2N H2SO4以终止反应。对于人IL-17A和IL-17F结合，在450nm处测量光密度。表2示出了平衡常数EC50(nM)。该结果表明抗-IL17A/F抗体可以以高亲和力与人IL-17A和IL-17F二者结合。
表2.
实施例5.抗-IL17A/F抗体阻断由IL-17A、IL17F或IL17A/F异二聚体刺激的炎症细胞因子产生。
IL-17A和IL-17F的受体分别是IL-17RA和IL-17RC。这些受体普遍表达于成纤维细胞和上皮细胞上。IL-17A和IL-17F可以与细胞上的受体结合并且诱导细胞产生和释放多种细胞因子，诸如IL-6、IL-8和TNF-α。IL-17A或IL-17F特异性抗体分别可以与可溶性IL-17A或IL-17F结合并且阻断它们与IL-17RA或IL-17RC的结合，从而抑制细胞因子的诱导，并且进一步抑制炎症的发展。
如在用预温育抗-IL-17A/F抗体(实施例2中制备)刺激hIL-17A、hIL-17F或IL17-A/F异二聚体(R&D system Cat#5837-IL)后检测HFF-1细胞(人皮肤成纤维细胞，干细胞库，中科科学院，#SCSP-109)的hIL-6产生，进行该测定。HFF-1细胞在细胞表面表达IL-17受体。可溶性hIL-17A或hIL-17F与所述受体结合并且诱导HFF-1细胞表达并释放hIL-6细胞因子。针对hIL-17A和hIL-17F的抗-IL-17A/F抗体可以阻断细胞因子与IL-17受体的结合并且抑制IL-17A/F刺激的hIL-6表达。可以通过ELISA检测培养上清液中释放的hIL-6。hIL-6的测量可以指示抗-IL-17A/F抗体的抑制效果。
将HFF-1细胞在具有15％FBS(可从ThermoFisher Scientific商购获得)、1％青霉素链霉素(PS，可从ThermoFisher Scientific商购获得)的0.3ml/孔DMEM培养基中以1.5x105个细胞/孔的细胞密度接种于48-孔板，并且在37℃和5％CO2下温育12小时。然后移除孔中的培养基，并且将细胞用PBS(300μl/孔)洗涤1次。向细胞中加入300μl/孔的无血清DMEM培养基，并且将细胞在37℃饥饿6小时。饥饿6小时后，从细胞中移除孔中的无血清DMEM培养基。向细胞中加入150μl/孔的具有30％FBS、2％PS的DMEM培养基。随后，将150μl/孔的抗-IL-17A/F抗体和hIL-17A、IL17F或IL-17A/F异二聚体的混合物加入相应的孔中。将板在37℃温育24小时。然后收获上清液用于hIL-6ELISA。通过使用人IL-6ELISAReady-SET-Go(eBioscience#88-7066-88)进行hIL-6测量。结果显示在图2中，证明了抗-IL17A/F抗体(VH1-1-VL5mAb)阻断由细胞因子IL-17A、IL-17F和IL-IL17A/F异二聚体诱导的刺激的IL-6产生(图2，A、B和C)。
实施例6.抗-IL17A/F抗体阻断IL-17A、IL-17F或IL17A/F与IL-17受体的结合
通过ELISA测试抗-IL17A/F抗体(实施例2中制备)对IL-17A、IL-17F或IL17A/F与IL-17受体结合的影响。将IL-17A、IL-17F或IL-17A/F用50μl/孔蛋白质溶液(蛋白质浓度为0.5μg/ml)在96孔板中在4℃包被过夜。将孔用200μl/孔的PBST中的1％BSA(吐温0.05％)在室温封闭1小时。将孔用PBST洗涤3次。将抗-IL17A/F抗体和同种型对照抗体人IgG1(Biolegend cat#403102)用PBS稀释为30μg/ml至0.0005μg/ml(30、10、3.33、1.11、0.37、0.123、0.041、0.0137、0.0046、0.0015、0.0005μg/ml)。将抗体加入相应的孔中(50μl/孔)并且在室温温育4小时。将孔用PBST洗涤3次。将hIL17RA-mIgG2aFc(10μg/ml，根据标准分子生物学技术(CarsonS，Molecular Biology Techniques，2012)内部制备)加入各孔(50μl/孔)中并且在室温温育1小时。将孔用PBST洗涤3次。将山羊抗-人IgG-HRP(1:5000，在PBS中，EASYBIO Cat#BE0102)加入各孔(50μl/孔)中，并且在室温温育30分钟。将孔用PBST洗涤6次。将TMB底物加入各孔中(50μl/孔)，并且通过向各孔中加入50μl的2N H2SO4来终止反应。在450nm和570nm处读板。如图3所示，抗-IL17A/F抗体阻断IL17A、IL17F和甚至IL-17A/F与IL-17受体的结合。数据进一步证明了抗-IL17A/F抗体通过阻断所述细胞因子与其受体之间的相互作用来抑制IL-17A、IL-17F和IL17A/F的活性。
实施例7.通过ELISA测量的与人IL-17A、IL-17F的结合和与其他IL-17家族成员的交叉反应性
将MaxiSorp 96-孔板(NUNC#449824,www.thermofisher.com)分别用在1x PBS(50μl/孔)中的2μg/ml人IL-17A(Cell Signaling#8928SF，www.cellsignal.com)、人IL-17F(Cell Signaling#8906LC，www.cellsignal.com)、人IL-17B(Peprotech#200-28，www.peprotech.com)、人IL-17C(R&D systems#1234-IL-025/CF，www.rndsystems.com)、人IL-17D((Peprotech#200-27，www.peprotech.com)、人IL-17E(R&D systems#1258-IL-025/CF，www.rndsystems.com)包被。将板在4℃温育过夜。移除包被溶液，并且将板用200μl/孔的PBST(1x PBS，具有0.05％吐温-20)洗涤1次。然后加入200μl/孔的封闭缓冲液(1x PBS，具有0.05％吐温-20、3％BSA)并且在室温温育1小时。移除封闭缓冲液，并且将板用200μl/孔的PBST(1x PBS，具有0.05％吐温-20)洗涤3次。通过1x PBS将抗-IL17A/F抗体hIgG VH1-1/VL5稀释至10、3.33、1.11、0.37、0.123、0.041、0.0137、0.0046、0.0015、0.00031、0.000102、0.000034μg/ml，并且加入板中(50μl/孔)。将板在室温温育2小时。移除孔中的抗体，并且将板用200μl/孔的PBST(1x PBS，具有0.05％吐温-20)洗涤3次。将山羊抗-人IgG(H&L)-HRP二抗(Jackson Immuno Research#109-035-088，www.jacksonimmuno.com)在1xPBS中1:5000稀释，并且加入各孔(50μl/孔)。将板在室温温育1小时。移除二抗，并且将板用200μl/孔的PBST(1x PBS，具有0.05％吐温-20)洗涤7次。加入50μl/孔的TMB(eBioscience#85-00-4201-56，www.ebioscience.com)并且将板在室温温育几分钟。然后加入50μl/孔的2NH2SO4以终止反应。在450nm处读板。结果显示在表3中。抗-IL17A/F抗体hIgG VH1-1/VL5对人IL-17A和17F具有结合能力(图4，A和F)，EC50分别为0.046和0.047nM。另外，hIgG VH1-1/VL5不与人IL-17B、17C、17D和17E结合(图4，B、C、D和E)。因此，hIgG VH1-1/VL5抗体对人IL-17A和17F具有结合特异性，并且与其他IL-17家族成员没有交叉反应性。
表3.与IL-17家族成员的结合能力(EC50)
实施例8.与食蟹猴IL-17A和IL-17F的交叉反应性(结合测定)
通过ELISA测定抗-IL-17A/F抗体与食蟹猴IL-17A和IL-17F的结合。除了将食蟹猴IL-17A(基因ID：XM_005552759.2，根据标准分子生物学方法(Carson S，MolecularBiology Techniques，2012)内部制备)和IL-17F(基因ID：XM_005552757.2，根据标准分子生物学方法(Carson S，Molecular Biology Techniques，2012)内部制备)分别用于替代人IL-17A和F以外，以与实施例7相同的方法进行测定。
hIgG VH1-1-VL5抗体对食蟹猴Il-17A和17F具有结合能力，EC50分别为0.06和0.18nM(表4和图5A和B)。
表4.与食蟹猴Il-17A和F的结合能力(EC50)
与食蟹猴IL-17A和IL-17F的交叉反应性表明：食蟹猴有资格用于抗-IL17A/F抗体的药代动力学、药效学和毒理学研究。开发抗-IL17A/F抗体作为药物组合物是有利的。
实施例9.抗-IL17A/F抗体效果的体内动物研究
在皮下注射人IL-17(Cell Signaling Cat#8928SF，3μg/小鼠)之前1小时，将抗-IL-17A/F抗体(实施例2中制备的VH1-1/VL5，20μg/小鼠)静脉内施用至C57BL/6N小鼠(每组n＝5，8周龄，体重：18-20g，可从BeijingVital River Laboratory Animal TechnologyCo.,Ltd.商购获得)。在IL-17施用后2小时，收集血液样品，并且通过ELISA(小鼠CXCL1/GROαDuoSet ELISA试剂盒，R&D system，DY345)测定血浆中的CXCL1趋化因子水平。人IgG1(BioLegend Cat#40312)用作同种型对照抗体。如图6所示，与同种型对照抗体相比，抗-IL17A/F抗体(实施例2中制备)能够降低C57BL/6小鼠血浆中人IL-17A诱导的趋化因子分泌。该结果表明抗-IL17A/F抗体可以用作抑制、阻断或中和IL-17活性的药剂。
体内和体外研究证明了抗-IL17A/F抗体在制备用于治疗受试者中与IL-17A和/或IL-17F有关的疾病的药物中的用途。与IL-17A和/或IL-17F有关的疾病可以选自自身免疫性疾病或炎性疾病，例如，包括但不限于牛皮癣、牛皮癣性关节炎、强直性脊柱炎、类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、系统性红斑狼疮、骨关节炎和炎性肠病(IBD)。受试者可以是哺乳动物，诸如大鼠、小鼠、猴或人。优选地，受试者是人。
Claims (20)
1.一种抗-IL17A/F抗体，所述抗体与IL-17A和IL-17F二者结合并且抑制IL-17A和IL-17F二者的活性，其中所述抗体包含由SEQ ID NO:1表示的CDR1H，由SEQ ID NO:2表示的CDR2H，由SEQ ID NO:3表示的CDR3H；以及由SEQ ID NO:4表示的CDR1L，由SEQ ID NO:5表示的CDR2L和由SEQ ID NO:6表示的CDR3L。
2.根据权利要求1所述的抗-IL17A/F抗体，其中所述抗体包含由SEQ ID NO:7表示的可变重链结构域(VH1-1)，和由SEQ ID NO:8表示的可变轻链结构域(VL5)或由SEQ ID NO:9表示的VL2-1。
3.根据权利要求1所述的抗-IL17A/F抗体，其中所述抗体是人IgG类型。
4.根据权利要求1所述的抗-IL17A/F抗体，其中所述抗体是鼠、嵌合或人源化变体。
5.根据权利要求1所述的抗-IL17A/F抗体，其中所述抗体包含由SEQ ID NO:10表示的重链和由SEQ ID NO:11表示的轻链。
6.一种核苷酸序列，其编码根据权利要求1至5中任一项所述的抗-IL17A/F抗体。
7.一种重组表达载体，其包含根据权利要求6所述的核苷酸序列。
8.一种宿主细胞，其包含根据权利要求7所述的重组表达载体。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的抗-IL17A/F抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗受试者中与IL-17A和/或IL-17F有关的疾病。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述与IL-17A和/或IL-17F有关的疾病选自自身免疫性疾病或炎性疾病。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述疾病选自牛皮癣、牛皮癣性关节炎、强直性脊柱炎、类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、系统性红斑狼疮、骨关节炎或炎性肠病(IBD)。
12.根据权利要求9所述的用途，其中所述受试者是哺乳动物。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述受试者选自大鼠、小鼠、猴或人。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述受试者是人。
15.一种药物组合物，其用于治疗受试者中与IL-17A和/或IL-17F有关的疾病，所述药物组合物包含治疗有效量的根据权利要求1至5中任一项所述的抗-IL17A/F抗体和药用赋形剂。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述与IL-17A和/或IL-17F有关的疾病选自自身免疫性疾病或炎性疾病。
17.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述疾病选自牛皮癣、牛皮癣性关节炎、强直性脊柱炎、类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、系统性红斑狼疮、骨关节炎或炎性肠病(IBD)。
18.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述受试者是哺乳动物。
19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述受试者选自大鼠、小鼠、猴或人。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中所述受试者是人。
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