CN112638940B

CN112638940B - 抗-il-25抗体及其用途

Info

Publication number: CN112638940B
Application number: CN201880096840.9A
Authority: CN
Inventors: 郭丽; 孙甜甜; 齐晓旭; 董晨
Original assignee: Beijing Xinkanghe Biomedical Technology Co ltd; Suzhou Xinkanghe Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Xinkanghe Biomedical Technology Co ltd; Suzhou Xinkanghe Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2018-11-19
Filing date: 2018-11-19
Publication date: 2022-09-30
Anticipated expiration: 2038-11-19
Also published as: AU2018450414A2; CN112638940A; JP2022510604A; WO2020102935A1; EP3883965A1; KR20210087487A; AU2018450414A1; JP7184310B2; KR102598319B1; EP3883965A4; US20210332123A1

Abstract

本发明提供针对(人)IL‑25的抗‑IL‑25抗体；提供这样的抗体的氨基酸序列以及编码的核酸序列；提供包含这样的抗体的组合物(并且特别是药物组合物)；并且提供这样的抗体和组合物的用途。

Description

抗-IL-25抗体及其用途

发明领域

本发明涉及针对(人)IL-25的抗-IL-25抗体；涉及编码这样的抗体的核酸；涉及包含这样的抗体的组合物(并且特别是药物组合物)；并且涉及这样的抗体和组合物的用途。

背景技术

IL-25是一种20KDa的蛋白质，通常被称为IL-17E，其由14号染色体编码并且含有117个氨基酸。细胞因子IL-17家族由6个成员组成；IL-17A至IL-17F，其中IL-25(即IL-17E)具有独特的结构和功能(Iwakura Y等人,Immunity 2011；34:149–162；Chang SH,DongC.Cell Signal 2011；23:1069–1075.)。IL-25的受体(IL-17BR)在主要的Th2细胞中高度表达(Rouvier E等人,J.Immunol.,1993；150:5445-5456)。IL-25调节适应性免疫反应的内部安全性，其导致开始变应性疾病并且在刺激肺粘膜细胞和成纤维细胞中发挥作用。IL-25还可以对其他细胞因子的生成产生一些影响。例如，在人和小鼠中产生IL-25或向动物注射IL-25已导致产生高浓度的Th2细胞因子，包括IL-4、IL-5和IL-13。初步研究表明，IL-25的mRNA在Th2细胞中具有高表达。研究小组指出，IL-25是一种强炎症细胞因子蛋白，其参与变应性炎症(Fort MM等人,Immunity 2001；15:985-995，Pan G等人,J.Immunol.,2001；167:6559-6567；Kim M等人,Blood,2002；100:2330-2340)。

大多数变应性疾病由2型免疫系统异常引起。几项研究已经证实，Th2细胞和粘膜细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肺上皮细胞是IL-25的隐藏生产者(Rouvier E等人J.Immunol,1993,150:5445-5456)。在哮喘小鼠模型中激活与IgE有关的乳腺细胞后，观察到在IL-25和IgE之间存在横向关系。根据这样的发现，在哮喘患者的肺部感染后24小时观察到最高的产量。已经提出气道巨噬细胞产生IL-25可能在调节肺中的炎症反应中起作用。(Wangy YH等人.,J.Exp Med.2007；204:1837-47)。

呼吸道合胞病毒(RSV)增加了儿童哮喘进展的风险。迄今为止，已经对患有RSV的儿童中NK细胞的缺乏和减少的影响进行了数项研究。然而，重要的问题是RSV感染中NK细胞数量的减少如何导致INF-α产生的抑制，Th2的进展和IL-25的增加，最终导致变应性疾病(Simoes EA等人,Lancet.1999；354:847-52)。Gerard Aie等人在2010年进行的研究表明，Th2反应的增加和来源于呼吸道上皮细胞的IL-25的作用增强了在DC细胞上参差不齐的notch配体的表达、炎症和哮喘(Gerard E Kaiko等人,J Immunol.2010；185:4681-4689)。

此外，在一些人体研究中，连续单次和双重免疫染色用于评估在变应原吸入激发(challenge)之前和之后24小时来自患有哮喘的轻度特应性受试者(n＝5-10)的支气管活检中以及在变应原表皮下注射后长达72小时来自特应性受试者(n＝5-10)的皮肤活检中的IL-25和IL-25R免疫反应性细胞的数量和表型。结果表明，IL-25免疫反应性在基线时由两个器官中的大多数表皮细胞表达，并且未通过激发进一步增强。在激发之前或之后，表皮中的IL-25R免疫反应性细胞稀少。变应原激发与两个器官的粘膜下层中IL-25和IL-25R免疫反应性的显著(P<0.01)增加的表达有关。IL-25免疫反应性与嗜酸性粒细胞、肥大细胞和内皮细胞共定位，而IL-25R免疫反应性与嗜酸性粒细胞、肥大细胞、内皮细胞和T淋巴细胞共定位。在两个器官中，均观察到IL-25表达增加与后期变应原诱导的临床反应幅度之间的相关性。(Corrigan CJ等人.,J.Allergy Clin Immunol,2011；128:117-124)。

在乳腺癌的发展过程中，肿瘤间质中存在增多的白细胞与疾病进展平行；然而，白细胞在调节乳腺的促肿瘤相对于抗肿瘤免疫性方面的功能意义仍然知之甚少。利用乳癌发生的MMTV-PyMT模型，已证明表达IL-4的CD4+T淋巴细胞通过直接调节肿瘤相关的CD11b+Gr1-F4/80+巨噬细胞的表型和效应子功能而间接促进乳腺癌的侵袭和随后的转移，所述巨噬细胞又通过激活恶性乳腺上皮细胞中的表皮生长因子受体信号传导而增强转移。总之，这些数据表明，抗肿瘤获得性免疫程序可以在促肿瘤微环境中被篡夺，并且进而通过接合在功能上参与调节上皮细胞行为的先天免疫系统的细胞组分来促进恶性肿瘤。(DeNardoDG等人.,Cancer cell,2009,16:91–102)。总之，这种细胞因子还在哮喘和自身免疫性疾病的变应性炎症的产生以及在癌症的治疗中起作用。

发明概述

在一个方面，本发明提供了能够特异性地结合人IL-25的抗体，包括鼠抗-IL-25单克隆抗体18H3。更特别地，本发明涉及一种抗体，所述抗体(i)与鼠抗体18H3竞争与(人)IL-25的结合；和/或(ii)与18H3结合(人)IL-25上的相同表位；和/或(iii)交叉阻断18H3与(人)IL-25的结合。

在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸，其编码根据本发明的抗体。

在又一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含上述核酸。

在再一个方面，本发明提供了一种制备根据本发明的抗体的方法，所述方法包括培养上述宿主细胞以便制备抗体。

在另一个方面，本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含根据本发明的抗体和药用载体。

在另一个方面，本发明还提供了一种治疗受试者中与IL-25有关的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据本发明的抗体。

本发明还提供了根据本发明的抗体用于制备药物的用途，所述药物用于治疗受试者中与IL-25有关的疾病。

具体地，本发明涉及：

[1]一种抗-IL-25抗体，所述抗体(i)与鼠抗体18H3竞争与(人)IL-25的结合；和/或(ii)与18H3结合(人)IL-25上的相同表位；和/或(iii)交叉阻断18H3与(人)IL-25的结合。

[2]根据上述[1]所述的抗-IL-25抗体，其中所述抗体包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中所述重链可变结构域包含：

a)包含以下氨基酸序列或基本上由其组成的CDR1：(i)氨基酸序列GFSLSTSGMGLG(SEQ ID NO:1)，或(ii)与氨基酸序列GFSLSTSGMGLG(SEQ ID NO:1)仅具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

b)包含以下氨基酸序列或基本上由其组成的CDR2：(i)氨基酸序列HIWWDDVKHYKPALKS(SEQ ID NO:2)，或(ii)与氨基酸序列HIWWDDVKHYKPALKS(SEQ ID NO:2)仅具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；以及

c)包含以下氨基酸序列或基本上由其组成的CDR3：(i)氨基酸序列MGQLHYYGYDYAMDY(SEQ ID NO:3)，或(ii)与氨基酸序列MGQLHYYGYDYAMDY(SEQ ID NO:3)仅具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

并且

其中所述轻链可变结构域包含：

a)包含以下氨基酸序列或基本上由其组成的CDR1：(i)氨基酸序列SASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)，或(ii)与氨基酸序列SASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)仅具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

b)包含以下氨基酸序列或基本上由其组成的CDR2：(i)氨基酸序列RTSNLAS(SEQID NO:5)，或(ii)与氨基酸序列RTSNLAS(SEQ ID NO:5)仅具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；以及

c)包含以下氨基酸序列或基本上由其组成的CDR3：(i)氨基酸序列QLYHSYPPTWT(SEQ ID NO:6)，或(ii)与氨基酸序列QLYHSYPPTWT(SEQ ID NO:6)仅具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

[3]根据上述[2]所述的抗-IL-25抗体，其中所述重链可变结构域包含具有氨基酸序列GFSLSTSGMGLG(SEQ ID NO:1)的CDR1、具有氨基酸序列HIWWDDVKHYKPALKS(SEQ ID NO:2)的CDR2和具有氨基酸序列MGQLHYYGYDYAMDY(SEQ ID NO:3)的CDR3，并且所述轻链可变结构域包含具有氨基酸序列SASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)的CDR1、具有氨基酸序列RTSNLAS(SEQID NO:5)的CDR2和具有氨基酸序列QLYHSYPPTWT(SEQ ID NO:6)的CDR3。

[4]根据上述[1]至[3]中任一项所述的抗-IL-25抗体，其中所述重链可变结构域与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少70％、诸如至少80％、例如至少85％、诸如至少90％或大于95％的序列同一性，和/或所述轻链可变结构域与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少70％、诸如至少80％、例如至少85％、诸如至少90％或大于95％的序列同一性。

[5]根据上述[1]至[4]中任一项所述的抗-IL-25抗体，其中所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12的氨基酸序列，和/或所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13的氨基酸序列。

[6]根据上述[5]所述的抗-IL-25抗体，其中：

i)所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；

ii)所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；

iii)所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，并且所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；

iv)所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，并且所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；

v)所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，并且所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；

vi)所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，并且所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；或者

vii)所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，并且所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。

[7]根据上述[1]所述的抗-IL-25抗体，所述抗体是单克隆抗体，和/或鼠、人源化或嵌合抗体，优选地是IgG类型。

[8]根据上述[1]所述的抗-IL-25抗体，所述抗体是与(人)IL-25结合的抗体片段，优选地选自由以下各项组成的组：Fv、Fab、Fab-SH、Fab’-SH、Fab’、Fab-C、Fab’-C、Fab’-C-SH、Fab-C-SH、scFv、双抗体(diabody)或F(ab’)₂；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

[9]一种分离的核酸，其编码根据上述[1]至[8]中任一项所述的抗体。

[10]一种宿主细胞，其包含根据上述[9]所述的核酸。

[11]一种制备根据上述[1]至[8]中任一项所述的抗体的方法，所述方法包括培养根据上述[10]所述的宿主细胞以便制备所述抗体。

[12]一种药物组合物，所述药物组合物包含根据上述[1]至[8]中任一项所述的抗体和药用载体。

[13]一种治疗受试者中与IL-25有关的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据上述[1]至[8]中任一项所述的抗体、根据上述[9]所述的核酸、根据上述[10]所述的宿主细胞或根据上述[12]所述的药物组合物。

[14]根据上述[13]所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物，优选大鼠、小鼠、猴或人。

[15]根据上述[13]或[14]所述的方法，其中所述与IL-25有关的疾病选自其中IgE、IL-4、IL-5和/或IL-13被过表达/过度产生的自身免疫性疾病、炎性疾病或癌症，优选变应性(炎性)疾病，并且更优选地选自哮喘(asthma)(例如，变应性哮喘(allergicasthma))、特应性皮炎(atopic dermatitis)、特应性变应性疾病(atopic allergicdisease)、变应性鼻炎(allergic rhinitis)、枯草热(hay fever)、变应性结膜炎(hayfever)、湿疹(eczema)、食物过敏(food allergy)、牛皮癣(psoriasis)、牛皮癣性关节炎(psoriatic arthritis)、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)、多发性硬化(multiple sclerosis，MS)、系统性红斑狼疮(systemic lupus)、骨关节炎(osteoarthritis)或炎性肠病(inflammatory boweldisorder，IBD)。

[16]根据上述[1]至[8]中任一项所述的抗体、根据上述[9]所述的核酸、根据上述[10]所述的宿主细胞或根据上述[12]所述的药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗受试者中与IL-25有关的疾病。

[17]根据上述[1]至[8]中任一项所述的抗体、根据上述[9]所述的核酸、根据上述[10]所述的宿主细胞或根据上述[12]所述的药物组合物，其用于治疗受试者中与IL-25有关的疾病的方法。

附图简述

图1示出了抗-IL-25抗体的表达和纯化，如实施例2所述，其中VH1-1-VL1-2代表由可变重链结构域(VH1-1)和可变轻链结构域(VL1-2)形成的抗体，并且这样的命名法适用于其他抗体。例如，VH2-1-VL1-2代表由VH2-1和VL1-2形成的抗体，VH2-1-VL2-1代表由VH2-1和VL2-1形成的抗体，VH1-1-VL2-2代表由VH1-1和VL2-2形成的抗体，并且VH1-2-VL2-1代表由VH1-2和VL2-1形成的抗体。

图2示出了如通过ELISA测量的抗-IL-25抗体与人IL-25(hII25-HIS)的结合，如实施例4所述。人IgG1(hIgG1)用作对照抗体。通过GraphPad Prism计算EC50/IC50值。

图3示出了抗-IL-25抗体阻断人IL-25刺激的炎症细胞因子CXCL1产生，如实施例5所述。人IgG1(hIgG1)和鼠IgG1(mIgG1)用作对照抗体。通过GraphPad Prism计算EC50/IC50值。

图4示出了抗-IL-25抗体与人IL-25结合，并且如通过ELISA测量的，其与IL-17家族的其他成员没有交叉反应性，而是与小鼠和食蟹猴IL-25具有交叉反应性，如实施例6和7所述。图中的亲本鼠mAb是鼠18H3。图中的“1121”代表由VH1-1和VL2-1形成的抗体，并且图中的“2112”代表由VH2-1和VL1-2形成的抗体。人IgG1(hIgG1)用作对照抗体。通过GraphPadPrism计算EC50/IC50值。

图5示出了抗-IL-25抗体在动物体内的体内效果，如实施例8所述。

发明详述

虽然将结合列举的实施方案对本发明进行描述，但是应当理解它们不旨在将本发明限制于那些实施方案。相反地，本发明旨在涵盖可以包括在由权利要求书限定的本发明的范围内的所有替代物、变型和等同物。本领域技术人员将认识到与本文描述的那些类似或等同的许多方法和材料，其可以用于实施本发明。本发明决不限于所描述的方法和材料。

I.定义

当在本说明书和权利要求书中使用时，词语“包含(comprise)”、“包含(comprising)”、“包括(include)”、“包括(including)”和“包括(includes)”旨在指明存在所陈述的特征、整体、组分或步骤，但是它们不排除存在或增加一个或多个其他特征、整体、组分、步骤或其组。

“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间非共价相互作用的总计强度。除非另外指出，否则如本文中使用的，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力可以通常由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常见方法测量，包括本文所述的那些方法。

术语“抗体”在本文中以最广泛意义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展现所需的抗原结合活性即可。

术语“抗-IL-25抗体”和“与IL-25结合的抗体”是指这样的抗体：所述抗体能够以足够的亲和力结合IL-25从而该抗体可用作靶向IL-25的诊断剂和/或治疗剂。在一些实施方案中，抗-IL-25抗体与不相关的非IL-25蛋白质结合的程度小于该抗体与IL-25结合的约10％，如例如通过SPR所测量的。在某些实施方案中，与IL-25结合的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤5nm、≤4nM、≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10^-8M以下，例如10^-8M至10^-13M，例如10^-9M至10^-13M)的解离常数(K_D)。在某些实施方案中，抗-IL-25抗体与在来自不同物种(例如，小鼠、人和食蟹猴)的IL-25之间保守的IL-25表位结合。

“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的一部分并且结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab-SH、Fab’-SH、Fab’、Fab-C、Fab’-C、Fab’-C-SH、Fab-C-SH、scFv、双抗体或F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

如本文中使用的，“Fab”是指这样的抗体：所述抗体包含重链恒定区，所述重链恒定区包含CH1结构域或CH1结构域的足够的部分以与轻链恒定区形成二硫键，但是不含有CH2结构域或CH3结构域。如本文中使用的，Fab可以包含铰链区的一个或多个氨基酸。因此，如本文中使用的，术语“Fab”涵盖Fab’抗体。Fab可以包含另外的非天然氨基酸，诸如C-末端半胱氨酸，在该情况下其可以称为Fab-C。如下讨论的，术语Fab-C还涵盖包含铰链区的天然氨基酸(包括C-末端处的天然半胱氨酸)的Fab。在一些实施方案中，Fab包含工程改造的半胱氨酸(即，Fab可以是THIOMAB)。

与参比抗体“结合相同表位的抗体”是指在竞争测定中阻断参比抗体与其抗原的结合达50％以上的抗体，并且反过来，参比抗体在竞争测定中阻断该抗体与其抗原的结合达50％以上。

术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分来源于特定的来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分来源于不同的来源或物种。

抗体的“类别”是指由其重链拥有的恒定结构域或恒定区的类型。存在抗体的五种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。优选地，本发明的抗体是IgG类别。

术语“表位”是指抗体所结合的抗原分子上的特定位点。

术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体结合至抗原的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)通常具有相似的结构，各结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如Kindt等人KubyImmunology，第6版,W.H.Freeman&Co.,第91页(2007))。单个VH结构域或VL结构域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可以使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域进行分离以分别筛选互补VL结构域或VH结构域的文库。参见，例如Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。

如本文中使用的，当比较两个氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指与第二序列相比，第一序列的某个位置上单个氨基酸残基的插入、缺失或置换；应当理解，两个氨基酸序列可以含有一个、两个或更多个这种氨基酸差异。更特别地，在如本文所述的氨基酸序列和/或多肽中，术语“氨基酸差异”是指与考虑的CDR序列相比，指定CDR序列的某个位置上的单个氨基酸残基的插入、缺失或置换。在这个方面，考虑的氨基酸序列可以是通过使用本身已知的亲和力成熟的一种或多种技术来源于指定氨基酸序列的氨基酸序列。优选地，“氨基酸差异”是“保守性”氨基酸置换，如下所定义。

相对于参比多肽序列的“百分比(％)(氨基酸)序列同一性”定义为在对序列进行比对并且在需要的情况下引入空位以实现最大百分比的序列同一性并且不考虑任何保守性置换作为序列同一性的一部分之后，候选序列中与参比多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为了确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术人员能力范围内的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括实现被比较的全长序列范围内最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.创作，并且源代码已经随用户文档提交至U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559(美国版权办公室华盛顿特区20559)，其中它以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序可从Genentech,Inc.,South San Francisco(南旧金山),California(加利福尼亚州)公开获得或可以从源代码编译。应当将ALIGN-2程序编译用以在UNIX操作系统(包括数字式UNIX V4.0D)上使用。全部序列比较参数通过ALIGN-2程序设定并且不变动。

在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，如下计算给定的氨基酸序列A与、同或针对给定的氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(这可以备选地描述为给定的氨基酸序列A具有或包含与、同或针对给定的氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)：

100乘以分数X/Y，

其中X是通过序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。将可以理解的是，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另外特别声明，否则本文所用的全部％氨基酸序列同一性值如紧接前段中所述的使用ALIGN-2计算机程序获得。

此外，在确定两个氨基酸序列之间的序列同一性程度中，技术人员可以考虑所谓的“保守性”氨基酸置换，其通常可以被描述为这样的氨基酸置换，其中氨基酸残基被具有类似化学结构并且对多肽的功能、活性或其他生物学性质几乎没有或者基本上没有影响的另一种氨基酸残基替换。这种保守性氨基酸置换是本领域公知的，例如，从WO 04/037999、GB 335768、WO 98/49185、WO 00/46383和WO 01/09300中可知；并且这种置换的(优选)类型和/或组合可以基于来自WO 04/037999以及WO 98/49185和来自其中引用的其他参考文献的相关教导进行选择。

这种保守性置换优选地是这样的取代，其中下述组(a)-(e)内的一个氨基酸被同组内的另一个氨基酸残基置换：(a)小的脂肪族的、非极性的或稍有极性的残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b)极性的、带负电的残基及其(不带电的)酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c)极性的、带正电的残基：His、Arg和Lys；(d)大的脂肪族的、非极性的残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；以及(e)芳族残基：Phe、Tyr和Trp。特别优选的保守性置换如下：Ala变为Gly或变为Ser；Arg变为Lys；Asn变为Gln或变为His；Asp变为Glu；Cys变为Ser；Gln变为Asn；Glu变为Asp；Gly变为Ala或变为Pro；His变为Asn或变为Gln；Ile变为Leu或变为Val；Leu变为Ile或变为Val；Lys变为Arg、变为Gln或变为Glu；Met变为Leu、变为Tyr或变为Ile；Phe变为Met、变为Leu或变为Tyr；Ser变为Thr；Thr变为Ser；Trp变为Tyr；Tyr变为Trp；和/或Phe变为Val、变为Ile或变为Leu。

如本文中使用的，术语“交叉阻断(cross-block)”意指免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合剂干扰其他免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或结合剂与给定靶标结合的能力。一种特别合适的定量交叉阻断测定使用BIAcore仪器，其可以使用表面等离子体共振技术测量相互作用的程度。另一种合适的定量交叉阻断测定使用基于ELISA的方法以测量免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合剂之间在其与靶标结合方面的竞争。

“药用载体”是指除活性成分之外，药物制剂中对受试者无毒的成分。药用载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

如本文中使用的，“治疗(treatment)”(及其语法变型诸如“治疗(treat/treating)”)是指意欲改变正在治疗的个体的天然过程的临床干预，并且可以为了预防进行或在临床病理学过程期间进行。所需的治疗效果包括，但不限于，防止疾病出现或复发，减轻症状，减小疾病的任何直接或间接病理学后果，降低病情进展速率，改善或缓和疾病状态，以及缓解或预后改善。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延缓疾病的发展或用于减慢疾病的进展。在免疫相关疾病的治疗中，治疗剂可以直接改变免疫反应的组分的反应程度，或者通过其他治疗剂(例如，抗生素、抗真菌剂、消炎剂、化疗剂等)使疾病对治疗更敏感。

如本文中使用的，术语“载体”是指能够传播与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及并入宿主细胞(已经向所述宿主细胞中引入该载体)的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们可操作地连接的核酸的表达。这种载体在本文中称作“表达载体”。

II.组合物和方法

A.示例性抗-IL-25抗体

本文提供了与(例如人)IL-25结合的分离的抗体。特别地，本文提供了以非常高的亲和力(诸如，以小于100pM、或小于75pM、或小于50pM、或小于10pM的K_D)与IL-25结合的抗体(如通过实施例中描述的一种或多种方法所测定的)。此外，本文提供了高度可溶的抗体，诸如Fab。在本文描述的任一个实施方案中，抗体可以是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体可以是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在本文描述的任一个实施方案中，抗体可以是Fab片段。

在一些实施方案中，本发明提供了抗-IL-25抗体，所述抗体(i)与鼠抗体18H3竞争与(人)IL-25的结合；和/或(ii)与18H3结合(人)IL-25上的相同表位；和/或(iii)交叉阻断18H3与(人)IL-25的结合。

在一些实施方案中，所述抗体包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中重链可变结构域包含：

并且

其中轻链可变结构域包含：

在一些实施方案中，重链可变结构域包含具有氨基酸序列GFSLSTSGMGLG(SEQ IDNO:1)的CDR1、具有氨基酸序列HIWWDDVKHYKPALKS(SEQ ID NO:2)的CDR2和具有氨基酸序列MGQLHYYGYDYAMDY(SEQ ID NO:3)的CDR3，并且所述轻链可变结构域包含具有氨基酸序列SASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)的CDR1、具有氨基酸序列RTSNLAS(SEQ ID NO:5)的CDR2和具有氨基酸序列QLYHSYPPTWT(SEQ ID NO:6)的CDR3。优选地，重链可变结构域与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少70％、诸如至少80％、例如至少85％、诸如至少90％或大于95％(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)氨基酸序列同一性，和/或轻链可变结构域与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少70％、诸如至少80％、例如至少85％、诸如至少90％或大于95％(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，重链/轻链可变结构域相对于参比序列含有置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含该序列的抗-IL-25抗体保留与IL-25结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NOs:1至6、12和13中的任一个或多个中总计1至10个(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9和10个)氨基酸已经置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失出现在CDR外部的区域中(即，在FR中)。

在本文中的任一个实施方案中，抗-IL-25抗体可以是人源化的。在一些实施方案中，抗-IL-25抗体包含如任一个上述实施方案中的CDR，并且进一步包含人受体框架，例如，人免疫球蛋白框架或人共有框架。在某些实施方案中，人受体框架是人VLκI共有(VL_KI)框架和/或VH框架VH₁。在某些实施方案中，人受体框架是人VLκI共有(VL_KI)框架和/或VH框架VH₁，其包含本文描述的突变中的任一个。

更优选地，重链可变结构域包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQID NO:12的氨基酸序列，和/或轻链可变结构域包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:13的氨基酸序列。最优选地，在根据本发明的抗-IL-25抗体中，i)重链可变结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且轻链可变结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；ii)重链可变结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且轻链可变结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；iii)重链可变结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，并且轻链可变结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；iv)重链可变结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，并且轻链可变结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；v)重链可变结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，并且轻链可变结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；vi)重链可变结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，并且轻链可变结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；或者vii)重链可变结构域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，并且轻链可变结构域包含SEQ IDNO:13的氨基酸序列。

在另一个方面，提供了抗-IL-25抗体，其中所述抗体包含如上文提供的任一个实施方案中的VH，和如上文提供的任一个实施方案中的VL。

在另一个方面，本文提供了这样的抗体，所述抗体与上文提供的任一个实施方案中的抗-IL-25抗体结合相同的表位。

在本发明的另一个方面，根据任一个上述实施方案的抗-IL-25抗体是单克隆抗体，包括人抗体。在一些实施方案中，抗-IL-25抗体是抗体片段，例如，Fv、Fab、Fab-SH、Fab’-SH、Fab’、Fab-C、Fab’-C、Fab’-C-SH、Fab-C-SH、scFv、双抗体或F(ab’)₂片段。在另一个实施方案中，抗体是基本上全长抗体，例如，IgG1抗体、IgG2a抗体或如本文定义的其他抗体类别或同种型。在一些实施方案中，抗-IL-25抗体是Fab。

B.重组方法和组合物

抗体可以使用重组方法和组合物制备。在一些实施方案中，提供了分离的核酸，所述核酸编码本文描述的抗-IL-25抗体。这种核酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在另一个实施方案中，提供了包含这种核酸的一种或多种载体(例如，表达载体)。在另一个实施方案中，提供了包含这种核酸的宿主细胞。

在一些实施方案中，宿主细胞是真核的，例如HEK293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一些实施方案中，提供了产生抗-IL-25抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体的条件下培养如上文提供的包含编码抗体的核酸的宿主细胞，并且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收该抗体。

C.测定

对于本文提供的抗-IL-25抗体，可以通过本领域已知的多种测定来鉴定、筛选或表征它们的物理/化学特性和/或生物活性。在一些实施方案中，例如通过已知方法诸如ELISA、SPR、

FACS或蛋白质印迹来测试本发明的抗体的抗原结合活性。

在另一个方面，竞争测定可以用于鉴定与本文描述的任一个抗体竞争结合至IL-25的抗体。在某些实施方案中，这种竞争性抗体与本文描述的抗体所结合的相同表位(例如，线性或构象表位)结合。用于抗体所结合的表位的作图的详细示例性方法在Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols(表位作图法),”Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中提供。

D.用于诊断和检测的方法和组合物

在某些实施方案中，本文提供的任一个抗-IL-25抗体可用于检测生物样品中IL-25的存在。如本文中使用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。“生物样品”包含例如细胞或组织。

在一些实施方案中，提供了用于诊断或检测方法中的抗-IL-25抗体。在另一个方面，提供了检测生物样品中IL-25的存在的方法。在某些实施方案中，所述方法包括在容许抗-IL-25抗体与IL-25结合的条件下使生物样品与本文描述的抗-IL-25抗体接触，并且检测抗-IL-25抗体和在生物样品中的IL-25之间是否形成复合物。这种方法可以是体外或体内方法。在一些实施方案中，抗-IL-25抗体用于选择适合用抗-IL-25抗体治疗的受试者，例如，其中IL-25是选择患者的生物标志物。

E.药物制剂

本发明还涉及药物组合物，所述药物组合物包含本发明的抗体和药用载体。

通过将具有所需纯度的这种抗体与一种或多种任选的药用载体混合，以冻干制剂或水溶液的形式制备本文描述的抗-IL-25抗体的药物制剂(Remington’s PharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.编著(1980))。药用载体在采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)；等等。

本文中的制剂也可以根据需要含有多于一种关于待治疗的特定适应证的活性成分。在一些实施方案中，活性成分具有彼此不产生不利影响的互补活性。

F.治疗方法和组合物

本文提供的任一个抗-IL-25抗体可以用于例如治疗方法的方法。

本发明还涉及治疗受试者中与IL-25有关的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据本发明的抗体、核酸、宿主细胞或药物组合物。特别地，所述有效量可以是足以调节IL-25、其生物学或药理学活性和/或IL-25参与的生物学途径或信号传导的量。

根据本文中的任一个实施方案的“受试者”可以是哺乳动物，优选大鼠、小鼠、猴或人。

抗-IL-25抗体可以通过任何合适的手段施用，包括肠胃外施用、皮下施用、腹膜内施用、玻璃体内施用、肺内施用和鼻内施用以及如有需要用于局部免疫抑制治疗的病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、玻璃体内和皮下施用。另外，抗体适宜地通过脉冲输注(pulse infusion)施用，特别是使用递减剂量的抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)。在一些实施方案中，给药可以通过注射(诸如静脉内或皮下注射)进行，这部分地取决于施用是短暂的还是长期的。

根据本发明的抗-IL-25抗体可以用于预防和/或治疗与IL-25有关的疾病。这种疾病可以与过量或不受控的IL-25产生/表达/活性有关。例如，与IL-25有关的疾病可以选自其中IgE、IL-4、IL-5和/或IL-13过表达的自身免疫性疾病或炎性疾病，优选变应性(炎性)疾病，并且更优选地选自哮喘(例如，变应性哮喘)、特应性皮炎、特应性变应性疾病、变应性鼻炎、枯草热、变应性结膜炎、湿疹、食物过敏、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、强直性脊柱炎、类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、系统性红斑狼疮、骨关节炎或炎性肠病(IBD)。

本发明还涉及根据本发明的抗-IL-25抗体、核酸、宿主细胞或药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗受试者中与IL-25有关的疾病。

实施例

以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，鉴于上文提供的一般表述，可以实施多种其他实施方案。

实施例1.抗-IL-25抗体的制备

通过皮下注射10μg人IL-25蛋白(NCBI基因ID：64806)与完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich，Cat#F6881)来免疫IL-25KO小鼠(16-18g，6周龄，n＝3，由清华大学(TsinghuaUniversity)Chen Dong教授实验室提供)，所述人IL-25蛋白按照用于蛋白质表达的一般标准方法内部制备。以3天的间隔重复免疫5次。最后一次加强后3天，仔细切出靠近注射部位的淋巴结。在PEG1500(聚乙二醇1500，Roche TM.Cat#:783641，10×4ml，在75mM Hepes中，PEG 50％W/V)的存在下将淋巴细胞与Ag8.653骨髓瘤细胞(Sigma-Aldrich，Cat#85011420)融合，并且用HAT选择(Sigma cat#:H0262)和HFCS(杂交瘤融合和克隆克隆补充剂，50×，Roche cat#:11-363-735-001)克隆。通过ELISA筛选杂交瘤上清液，用以制备可以结合人IL-25的抗体。此外，根据基于细胞的功能测定选择拮抗性抗-IL-25mAb(参见Raig R等人,Gut 2000；46:350-358)。使用CDR移植和回复突变将选择的鼠IL-25拮抗性mAb候选物(18H3，mIgG1)测序(SEQ ID No.12&13)，然后人源化。

通过CDR移植的抗体人源化：制定了精选的受体框架。使用NCBI Ig-Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/igblast/)，在人种系数据库中搜索亲本抗体的可变结构域序列。鼠IL-25拮抗性mAb候选物(18H3)的重链和轻链的六个CDR序列(SEQ IDNOs:1-6)分别如下所示。选择每种重链和轻链的五种不同的人受体(即与亲本抗体具有高同源性的人可变结构域)。人受体的CDR用它们的小鼠对应物替换，产生人源化可变结构域序列。分别设计、合成五条人源化重链和五条人源化轻链，并且将其插入表达载体中。表达人源化抗体，然后用于亲和力排序测试。选择具有最强结合亲和力的抗体(VH1-VL2、VH1-VL1、VH2-VL2和VH2-VL1)进行回复突变。在这些变体中，基于结合和功能测定选择VH1-1-VL2-1、VH1-1-VL1-2、VH2-1-VL1-2和VH2-1-VL2-1(SEQ ID NOs:7-10)。

CDR1H氨基酸序列(SEQ ID NO:1)

GFSLSTSGMGLG

CDR2H氨基酸序列(SEQ ID NO:2)

HIWWDDVKHYKPALKS

CDR3H氨基酸序列(SEQ ID NO:3)

MGQLHYYGYDYAMDY

CDR1L氨基酸序列(SEQ ID NO:4)

SASSSVSYMY

CDR2L氨基酸序列(SEQ ID NO:5)

RTSNLAS

CDR3L氨基酸序列(SEQ ID NO:6)

QLYHSYPPTWT

可变重链结构域(VH1-1)氨基酸序列(SEQ ID NO:7)

QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGLGWIRQPPGKALEWLAHIWWDDVKHYKPALKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNVDPVDTATYYCARMGQLHYYGYDYAMDYWGQGTLVTVSS

可变重链结构域(VH2-1)氨基酸序列(SEQ ID NO:8)

QVTLRESGPALLKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGLGWIRQPPGKALEWLAHIWWDDVKHYKPALKSRLTISKDTSKNQVVLTITNVDPVDTATYYCARMGQLHYYGYDYAMDYWGQGTLVTVSS

可变重链结构域(VH1-2)氨基酸序列(SEQ ID NO:9)

MGWSWILLFLLSVTAGVHSQVTLKESGPTLLKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGLGWIRQPPGKALEWLAHIWWDDVKHYKPALKSRLTITKDTSKNQVVLTITNVDPVDTATYYCARMGQLHYYGYDYAMDYWGQGTLVTVSS

可变轻链结构域(VL2-1)氨基酸序列(SEQ ID NO:10)

DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSSVSYMYWYQQKPGKAPKPLIYRTSNLASGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSMQPEDFATYYCQLYHSYPPTWTFGQGTKLEIK

可变轻链结构域(VL1-2)氨基酸序列(SEQ ID NO:11)

EIVLTQSPATLSASPGERVTISCSASSSVSYMYWYQQKPGQAPRPLIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSMEPEDFATYYCQLYHSYPPTWTFGQGTKLEIK

18H3的可变重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDVKHYKPALKSRLTISKDISSSQVFLTIASVDTADTATYYCARMGQLHYYGYDYAMDYWGQGTSVTVSS

18H3的可变轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTISCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPKPWIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQLYHSYPPTWTFGGGTKLEIK

实施例2.抗-IL-25抗体的表达和纯化

合成编码人源化IgG重链(SEQ ID NO:7、8或9的可变结构域氨基酸序列)和轻链(SEQ ID NO:10或11的可变氨基酸序列)的DNA序列，并且将其插入pCDNA3.1载体(可从LifeTechnology商购获得)以构建全长IgG的表达质粒。亲本抗体的表达在100ml HEK293细胞培养物中进行(HEK293细胞可从ThermoFisher Scientific商购获得)，并且将上清液用蛋白A亲和柱(可从GE Healthcare life Science商购获得)纯化。将纯化的抗体使用PD-10脱盐柱(可从Thermofisher Scientific商购获得)缓冲液交换到PBS中。纯化蛋白的浓度和纯度分别通过OD280和SDS-PAGE测定。人源化抗体在30ml HEK293细胞培养物中表达。将细胞旋转沉淀。将上清液过滤并且进行SDS-PAGE分析(图1)。

实施例3.SPR分析抗-IL-25抗体与人IL-25的结合亲和力

使用胺偶联方法将抗-人Fcγ特异性抗体(Jackson Immuno Research，批号124448，代码109-008-098)固定在Biacore T200传感器芯片上。注射分泌到培养基的四种抗体连同亲本抗体，并且通过Fc(捕获相)单独地由抗-人Fc抗体捕获。平衡后，注射IL-25达300秒(结合期)，然后注射运行缓冲液达1200秒(解离期)。在每个循环期间从那些人源化抗体流动细胞中减去参考流动细胞(流动细胞1)的响应。在注射另一种人源化抗体之前使表面再生。重复该过程直至分析所有抗体。使用Biacore T200评价软件，通过将实验数据局部拟合至1:1相互作用模型来获得人源化抗体的解离速率。通过其解离速率常数(解离速率，K_d)对抗体进行排序。选择以与亲本抗体类似的亲和力与IL-25相互作用的结合物(表1)。

表1.亲和力测量数据

^aVH1-1+VL1-2代表由Vh1-1和VL1-2形成的抗体。这样的命名法适用于其他抗体。

实施例4.通过ELISA测量的与人IL-25的结合

将MaxiSorp 96-孔板(NUNC#449824，www.thermofisher.com)用在1x PBS(50μl/孔)中的2μg/ml人IL-25(R&D systems#1258-IL-025/CF)包被。将板在4℃温育过夜。移除包被溶液，并且将板用200μl/孔的PBST(1x PBS，具有0.05％吐温-20)洗涤一次。然后加入200μl/孔的封闭缓冲液(1x PBS，具有0.05％吐温-20、3％BSA)并且在室温温育1小时。移除封闭缓冲液，并且将板用200μl/孔的PBST(1x PBS，具有0.05％吐温-20)洗涤三次。通过1xPBS将抗-IL-25抗体(实施例2中制备)稀释至10、3.33、1.11、0.37、0.123、0.041、0.0137、0.0046、0.0015、0.00031、0.000102、0.000034μg/ml，并且加入板中(50μl/孔)。将板在室温温育2小时。移除孔中的抗体，并且将板用200μl/孔的PBST(1x PBS，具有0.05％吐温-20)洗涤三次。将山羊抗-人IgG(H&L)-HRP二抗(Jackson Immuno Research#109-035-088，www.jacksonimmuno.com)在1x PBS中1:5000稀释，并且加入各孔(50μl/孔)。将板在室温温育1小时。移除二抗，并且将板每次用200μl/孔的PBST(1x PBS，具有0.05％吐温-20)洗涤七次。加入50μl/孔的TMB(eBioscience#85-00-4201-56,www.ebioscience.com)并且将板在室温温育几分钟。然后加入50μl/孔的2N H₂SO₄以终止反应。对于人IL-25结合，在450nm处测量光密度。图2示出了平衡常数EC₅₀(nM)。该结果表明抗-IL25抗体可以以高亲和力与人IL-25结合。

实施例5.抗-IL-25抗体阻断由人IL-25刺激的炎症细胞因子产生

用抗-IL-25抗体(实施例2中制备)预温育，在IL-25蛋白(R&D systems#1258-IL-025/CF)刺激后检测HT-29细胞(中国科学院，#TCHu103)的CXCL1/GROα产生，进行该测定。HT-29细胞在细胞表面表达IL-25受体。抗-IL-25抗体可以阻断细胞因子与IL-25受体的结合并且抑制IL-25刺激的CXCL1表达。可以通过ELISA检测培养上清液中释放的CXCL1。CXCL1的测量可以指示抗-IL-25抗体的抑制效果。

将HT29细胞在具有10％FBS(可从ThermoFisher Scientific商购获得)、1％青霉素链霉素(PS，可从ThermoFisher Scientific商购获得)的0.2ml/孔McCoy’s 5A(改良)培养基中以1.0x10⁴个细胞/孔的细胞密度接种于96-孔板。将抗-IL-25抗体和hIL-25的混合物加入相应的孔中，然后将细胞在37℃温育48小时。然后收获上清液用于CXCL1 ELISA。通过使用人CXCL1 ELISA Ready-SET-Go(R&D system#DY275)试剂盒进行CXCL1测量。结果显示在图3中，证明了抗-IL25抗体阻断由细胞因子诱导的刺激的CXCL产生，由此抑制炎症的发展。

实施例6.通过ELISA测量的与人IL-25的结合和与其他IL-17家族成员的交叉反应性

将MaxiSorp 96-孔板(NUNC#449824，www.thermofisher.com)分别用在1x PBS(50μl/孔)中的2μg/ml人IL-17A(Cell Signaling#8928SF，www.cellsignal.com)、人IL-17F(Cell Signaling#8906LC，www.cellsignal.com)、人IL-17B(Peprotech#200-28，www.peprotech.com)、人IL-17C(R&D systems#1234-IL-025/CF，www.rndsystems.com)、人IL-17D((Peprotech#200-27，www.peprotech.com)、人IL-17E(R&D systems#1258-IL-025/CF，www.rndsystems.com)包被。将板在4℃温育过夜。移除包被溶液，并且将板用200μl/孔的PBST(1x PBS，具有0.05％吐温-20)洗涤一次。然后加入200μl/孔的封闭缓冲液(1x PBS，具有0.05％吐温-20、3％BSA)并且在室温温育1小时。移除封闭缓冲液，并且将板用200μl/孔的PBST(1x PBS，具有0.05％吐温-20)洗涤三次。通过1x PBS将抗-IL-25抗体(实施例2中制备)稀释至10、3.33、1.11、0.37、0.123、0.041、0.0137、0.0046、0.0015、0.00031、0.000102、0.000034μg/ml，并且加入板中(50μl/孔)。将板在室温温育2小时。移除孔中的抗体，并且将板每次用200μl/孔的PBST(1x PBS，具有0.05％吐温-20)洗涤三次。将山羊抗-人IgG(H&L)-HRP二抗(Jackson Immuno Research#109-035-088，www.jacksonimmuno.com)在1x PBS中1:5000稀释，并且加入各孔(50μl/孔)。将板在室温温育1小时。移除二抗，并且将板每次用200μl/孔的PBST(1x PBS，具有0.05％吐温-20)洗涤七次。加入50μl/孔的TMB(eBioscience#85-00-4201-56，www.ebioscience.com)并且将板在室温温育几分钟。然后加入50μl/孔的2N H₂SO₄以终止反应。在450nm处读板。结果显示在表2中。抗-IL-25抗体对IL-25具有结合能力，但是不与人IL-17A、17B、17C、17D或17F结合，由此与其他IL-17家族成员没有交叉反应性。

表2.与IL-17家族成员的结合能力(EC50)

实施例7.与小鼠和食蟹猴IL-25的交叉反应性(结合测定)

通过ELISA测定抗-IL-25抗体与小鼠和食蟹猴IL-25的结合。除了将食蟹猴IL-25(基因ID：XM_005560861，根据标准分子生物学方法(Carson S,Molecular BiologyTechniques,2012)内部制备)和小鼠IL-25(基因ID：AF458060.1，根据标准分子生物学方法(Carson S,Molecular Biology Techniques,2012)内部制备)分别用于替代人IL-25以外，以与实施例6相同的方法进行测定。如图4所示，抗-IL25抗体对小鼠和食蟹猴IL-25二者具有结合能力，并且因此可以用于鼠和食蟹猴动物疾病模型。

与食蟹猴IL-25的交叉反应性表明：小鼠和食蟹猴有资格用于抗-IL-25抗体的药代动力学、药效学和毒理学研究。开发抗-IL-25抗体作为药物组合物是有利的。

实施例8.抗-IL-25抗体效果的体内动物研究

变应性哮喘的特征在于由各种刺激性刺激诱导的不可控制的气道高反应性(AHR)，并且与向肺中的2型炎性浸润有关。2型免疫反应的特征在于存在产生细胞因子(包括IgE、IL-4、IL-5和IL-13)的CD4+TH2细胞亚群。白介素(IL)-25(IL-17E)已被证明在哮喘的发病机理中起到重要作用。IL-25的过表达或外源施用在体内重现哮喘病理生理学特征，包括上皮细胞增生、粘液分泌过多和气道高反应性。

在C57BL6J小鼠(n＝5/组，8周龄，体重：18-20g，可从Beijing Vital RiverLaboratory Animal Technology Co.,Ltd.商购获得)中，研究抗-IL-25抗体(18H3)在OVA诱导的哮喘模型治疗中的体内功效。在第1天，向所有小鼠腹膜内注射明矾中的鸡卵清蛋白0.5mg/ml，每只小鼠200μl(在PBS中制成1mg/ml OVA，过滤灭菌，与明矾以1:1的比率混合，然后涡旋1小时)。在第17天，对所有小鼠进行第二次腹膜内(IP)免疫(与第1天相同的方案)，并且向麻醉的小鼠施用PBS中的卵清蛋白(50μl(100μg)OVA)的第1次鼻内注射(在PBS中制成2mg/ml OVA，过滤灭菌，每只小鼠50μl)。在第25、26、27天，每天重复鼻内注射，并且在第28天，在最后一次注射后24小时内处死小鼠。对于PBS和抗-IL25抗体18H3(图5中的抗-hIL25抗体)，基于体重调节给药体积(10μl/g)。表3示出了体内研究设计。通过将从小鼠中收集的血液离心(8000rpm，10分钟)来制备血清样品，并且将其储存于-80℃直至分析。BALF(支气管肺泡灌洗液)收集：用致死剂量的戊巴比妥钠(150mg/kg)杀死动物，并且立即用0.7冷PBS破坏右肺，并且收集约0.5ml的BALF。然后，将BALF以2500rpm离心5分钟，收集上清液，并且储存于-80C直至分析。血清和BALF样品用于细胞因子IL-4、IL-5、IL-13和IgE的测量(用于这些细胞因子的测量试剂盒可从eBioscience商购获得)。如图5所示，在哮喘动物模型中，抗-IL25抗体18H3抑制IL-4、IL-13、IL-5和IgE的产生。数据表明，抗-IL-25抗体能够用于治疗其中这些细胞因子和/或IgE升高的自身免疫和炎症疾病(即哮喘)。

表3

尽管为了清楚理解的目的已经通过说明和实施例的方式较详细地描述了前述发明，但是描述和实施例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容明确地通过引用整体并入。

Claims

1.一种抗-IL-25抗体，其中所述抗体包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中所述重链可变结构域包含氨基酸序列为GFSLSTSGMGLG(SEQ ID NO:1)的CDR1、氨基酸序列为HIWWDDVKHYKPALKS(SEQ ID NO:2)的CDR2和氨基酸序列为MGQLHYYGYDYAMDY(SEQ ID NO:3)的CDR3，并且所述轻链可变结构域包含氨基酸序列为SASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)的CDR1、氨基酸序列为RTSNLAS(SEQ ID NO:5)的CDR2和氨基酸序列为QLYHSYPPTWT(SEQ ID NO:6)的CDR3。

2.根据权利要求1所述的抗-IL-25抗体，其中：

i)所述重链可变结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，并且所述轻链可变结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；

ii)所述重链可变结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，并且所述轻链可变结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；

iii)所述重链可变结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，并且所述轻链可变结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；

iv)所述重链可变结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，并且所述轻链可变结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；

v)所述重链可变结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，并且所述轻链可变结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；或者

vi)所述重链可变结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，并且所述轻链可变结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。

3.根据权利要求1所述的抗-IL-25抗体，所述抗体是单克隆抗体。

4.根据权利要求1所述的抗-IL-25抗体，所述抗体是鼠、人源化或嵌合抗体。

5.根据权利要求3所述的抗-IL-25抗体，其中所述抗体是IgG类型。

6.根据权利要求1所述的抗-IL-25抗体，所述抗体是与人IL-25结合的抗体片段、线性抗体或多特异性抗体。

7.根据权利要求6所述的抗-IL-25抗体，其中所述抗体选自由以下各项组成的组：Fv、Fab、Fab’、双抗体或F(ab’)₂。

8.一种分离的核酸，其编码根据前述权利要求中任一项所述的抗体。

9.一种宿主细胞，其包含根据权利要求8所述的核酸。

10.一种制备根据权利要求1至7中任一项所述的抗体的方法，所述方法包括培养根据权利要求9所述的宿主细胞以便制备所述抗体。

11.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至7中任一项所述的抗体和药用载体。

12.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体、根据权利要求8所述的核酸、根据权利要求9所述的宿主细胞或根据权利要求11所述的药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗受试者中与IL-25有关的疾病，其中所述疾病为哮喘、特应性皮炎、变应性鼻炎、湿疹、食物过敏、牛皮癣、或炎性肠病(IBD)。

13.根据权利要求12所述的用途，其中所述受试者是哺乳动物。

14.根据权利要求12所述的用途，其中所述受试者是大鼠、小鼠、猴或人。