CN112041342A - 针对il-5/il-5r和il-4/il-4r或il-13/il-13r的组合拮抗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及组合疗法和其治疗慢性气道疾病的用途，特别是治疗哮喘的用途。所述组合疗法包含(i)IL‑5:IL‑5R的拮抗剂和(ii)IL‑4:IL‑4R的拮抗剂和/或IL‑13:IL‑13R的拮抗剂。本发明还提供了双特异性抗体，其包含结合至IL‑4Rα的抗原结合结构域和结合至IL‑5的抗原结合结构域。所述双特异性抗体可以用于治疗慢性气道疾病，特别是哮喘。

Description

针对IL-5/IL-5R和IL-4/IL-4R或IL-13/IL-13R的组合拮抗剂
技术领域
本发明涉及组合疗法和其治疗慢性气道疾病的用途，特别是治疗哮喘的用途。所述组合疗法包含(i)IL-5:IL-5R的拮抗剂和(ii)IL-4:IL-4R的拮抗剂和/或IL-13:IL-13R的拮抗剂。所述组合的拮抗剂可以是抗体分子，并且优选地，所述组合疗法包含结合至IL-4Rα的抗体分子和结合至IL-5的抗体分子。所述组合疗法通常抑制经由2型细胞因子IL-4、IL-13和IL-5的信号传导。本发明还提供了双特异性抗体，其包含结合至IL-4Rα的抗原结合结构域和结合至IL-5的抗原结合结构域。所述双特异性抗体可以用于治疗慢性气道疾病，特别是哮喘。
背景技术
慢性气道疾病(或慢性呼吸道疾病)是气道和肺部其它结构的慢性疾病。大多数常见形式的慢性气道疾病中的一些是哮喘和慢性阻塞性肺病，所述慢性阻塞性肺病包括慢性支气管炎和肺气肿。
哮喘是传导气道的慢性炎性疾病，其导致咳嗽、喘息和胸闷的症状。哮喘是影响全世界多达三亿人的疾病。在哮喘患者中发生的气道阻塞以可变的病程发展，其中无症状期穿插着恶化期，所述恶化常常由环境过敏原和病毒感染所致。典型特征是支气管高反应性(BHR)，其为气道对如冷空气和运动的刺激作出反应而变狭窄的趋势。
哮喘患者还展现出气道重塑的征象，借此气道壁变厚并且上皮或粘膜下腺中产生粘液的杯状细胞数目增加，这种现象称为杯状细胞化生(GCM)。杯状细胞产生粘蛋白，所述粘蛋白控制覆盖纤毛活动梯(ciliary escalator)的粘液的粘弹性和水合。在哮喘患者中，唾液常常过干而可能导致粘液嵌塞和重度气道阻塞。当前存在极少治疗选项来减少GCM和改善粘液清除。
历史上，用于哮喘的治疗方法涉及使用非特异性剂，如吸入性皮质类固醇和β2-激动剂，取得了不同程度的成功。然而，现在了解到‘哮喘’是描述多种表型的异质性病症，每种表型呈现出不同的临床、生理和分子特征(Wenzel SE(2015)Nature Medicine；18(5):716-725；Ray等(2015)Am J Physiol-Lung Cellular and Molecular Physiology；308:130-140)。
已经尝试基于以下认知将哮喘的临床子组进行分组：每个子组可能由截然不同的致病分子机理驱动，并且因此可能具有不同的病因并且对疗法的反应不同(Gauthier等(2015)American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine；192(6):660-668)。所鉴别的子组的实例包括：早发性和迟发性哮喘，这取决于出现症状本身的年龄；嗜酸性粒细胞性、嗜中性粒细胞性或非炎性哮喘，这取决于所观测到的炎症的存在和类型；运动诱发的哮喘；肥胖相关哮喘；特应性哮喘，其以对如屋尘螨(HDM)的吸入性过敏原的变应性致敏和血清中过敏原特异性IgE的增加为特征；轻度或中度哮喘，其也可以被描述为皮质类固醇反应性的；重度哮喘；以及2型细胞因子相关哮喘，其代表共享2型炎症模式的个体。重要的是，许多表型由于这些分组之间缺乏明确划分而重叠，并且患者可能展现多个组的临床或病理特征，使得难以预测对治疗的个体反应性。
对这些机理上不同的组，有时称为‘内型(endotype)’的了解越来越多，并且开始鉴别相关的细胞或分子生物标志物。在支气管活检体或肺切除样品中，哮喘常常以嗜酸性粒细胞、肥大细胞和CD4+T淋巴细胞的积聚为特征，这些细胞产生上皮和固有层中的2型细胞因子IL-4和/或IL-5。然而，这种2型炎症标记仅在50％患有哮喘的个体中可检测到，特别是患有早发性疾病、具有特应性倾向和高血液嗜酸性粒细胞计数的那些个体。相比之下，在患有哮喘的一些个体，特别是对类固醇反应不良的那些个体中，气道浸润物主要由嗜中性粒细胞组成。这些嗜中性粒细胞可能由IL-17产生细胞，如T辅助17型淋巴细胞或γδT细胞募集至气道(Lambrecht和Hammad(2015)Nat.Immunol.16(1):45-56)。
当前正在开发特异性地靶向慢性气道疾病中所牵涉的分子路径的药物。举例来说，已经开发出用于变应性疾病的许多抗体疗法(Sheridan C(2018)NatureBiotechnology；36:3-5；Godar等(2017)mAbs:Taylor&Francis；1-12)。这些包括结合至IL-4Rα的度匹鲁单抗(dupilumab)、靶向IgE的奥马珠单抗(omalizumab)、靶向IL-5的美泊利单抗(mepolizumab)和瑞利珠单抗(reslizumab)，以及结合IL-13的特洛基单抗(tralokinumab)。然而，在本领域中对改善的疗法存在需要。
发明内容
本发明基于多个2型细胞因子信号传导路径的靶向。最初称为2型细胞因子是因为其由T辅助2型细胞(TH2细胞)释放。在慢性气道疾病，如哮喘中，2型细胞因子不仅由TH2细胞释放，而且由如嗜碱性粒细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞的细胞释放。2型细胞因子在慢性气道疾病，特别是哮喘的发病机理中起关键作用。已经惊讶地发现，靶向多种II型细胞因子，特别是IL-5、IL-4和IL-13在减轻慢性气道疾病的潜在病状和症状中产生意想不到的协同效应。本发明的组合疗法因此特别适合于治疗慢性气道疾病。
在第一个方面，本发明提供了一种组合，其包含：(i)IL-5:IL-5R的拮抗剂；和(ii)IL-4:IL-4R的拮抗剂和/或IL-13:IL-13R的拮抗剂。因为IL-4受体复合物和IL-13受体复合物共享通用亚单位IL-4Rα，所以IL-4Rα的拮抗剂可以充当IL-4:IL-4R和IL-13:IL-13R信号传导路径两者的拮抗剂。因此，在优选实施方案中，本发明的组合包含IL-5:IL-5R的拮抗剂和IL-4Rα的拮抗剂。IL-5:IL-5R的拮抗剂优选为IL-5的拮抗剂。所述组合可以抑制经由IL-5、IL-4和IL-13的信号传导。
组合的拮抗剂可以是抗体分子。因此，在某些实施方案中，IL-5:IL-5R的拮抗剂是抗体分子和/或IL-4:IL-4R的拮抗剂是抗体分子和/或IL-13:IL-13R的拮抗剂是抗体分子。在优选实施方案中，组合包含IL-5:IL-5R的拮抗剂，其为结合至IL-5，优选人类IL-5的抗体分子；和IL-4Rα的拮抗剂，其为结合至IL-4Rα，优选人类IL-4Rα的抗体分子。
在某些实施方案中，组合的抗体分子独立地选自由以下组成的组：抗体轻链可变结构域(VL)；抗体重链可变结构域(VH)；单链抗体(scFv)；F(ab')2片段；Fab片段；Fd片段；Fv片段；单臂(单价)抗体；通过此类抗原结合片段的组合、组装或缀合而形成的双链抗体、三链抗体、四链抗体或任何抗原结合分子。在优选实施方案中，组合包含结合至IL-4Rα的抗体分子和结合至IL-5的抗体分子，其中所述抗体分子独立地选自由以下组成的组：抗体轻链可变结构域(VL)；抗体重链可变结构域(VH)；单链抗体(scFv)；F(ab')2片段；Fab片段；Fd片段；Fv片段；单臂(单价)抗体；通过此类抗原结合片段的组合、组装或缀合而形成的双链抗体、三链抗体、四链抗体或任何抗原结合分子。组合的抗体分子可以是VHH抗体。在优选实施方案中，组合的抗体分子是IgG抗体。
在某些实施方案中，组合的抗体分子，例如，结合至IL-4Rα的抗体分子和/或结合至IL-5的抗体分子，是非人类抗体的人源化或种系化变体或其抗原结合片段，例如，源自骆驼科的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，组合的抗体分子，例如，结合至IL-4Rα的抗体分子和/或结合至IL-5的抗体分子，包含人类IgG的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和/或CH3结构域。或者，抗体分子可以与人类IgG，优选IgG1展现高度同源性。
在某些实施方案中，组合的抗体分子，例如，结合至IL-4Rα的抗体分子和/或结合至IL-5的抗体分子，包含来源于人类IgG，优选IgG1的Fc结构域。Fc结构域可以是未修饰的或可以通过一个或多个氨基酸取代来修饰，例如，以增加对FcRn(新生儿Fc受体)的结合亲和力。在优选实施方案中，抗体分子可以包含Fc结构域，优选来源于人类IgG并且包含以下氨基酸取代的Fc结构域：H433K和N434F；或M252Y、S254T、T256E、H433K和N434F。Fc结构域的编号是根据EU编号方案。
在某些实施方案中，组合的抗体分子，例如，结合至IL-4Rα的抗体分子和/或结合至IL-5的抗体分子，展现pH值依赖性抗原结合活性，特别是在酸性pH值下相比在中性pH值下展现更低抗原结合活性。如由离解常数比率：KD(在酸性pH值下)/KD(在中性pH值下)所测量，在酸性pH值下与在中性pH值下抗原结合活性的比率可以为至少2。
关于组合的配制，可以共同配制或单独地提供IL-5:IL-5R和IL-4:IL-4R和/或IL-13:IL-13R拮抗剂。对于共同配制拮抗剂的实施方案，可以根据1:1比率配制或可以根据非等摩尔比率配制拮抗剂。举例来说，对于包含IL-5:IL-5R的拮抗剂(优选IL-5的拮抗剂)和IL-4Rα的拮抗剂的组合，可以根据例如1:2或2:1的比率配制拮抗剂。
对于组合包含IL-4Rα的拮抗剂和IL-5的拮抗剂并且所述拮抗剂是抗体分子的实施方案，组合可以包含组合成多特异性抗体，例如双特异性抗体的抗体分子。
在某些实施方案中，组合可以包含一种或多种额外治疗剂。
在第二个方面，本发明提供了一种双特异性抗体，其包含结合至IL-4Rα的抗原结合区和结合至IL-5的抗原结合区。在优选实施方案中，结合至IL-4Rα的抗原结合区和/或结合至IL-5的抗原结合区是非人类抗体的人源化或种系化变体或其抗原结合片段，优选骆驼科抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，结合至IL-4Rα的抗原结合区包含第一可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)配对并且结合至IL-5的抗原结合区包含第二可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)配对。双特异性抗体可以是具有结合至IL-4Rα的第一VH-VL配对和结合至IL-5的第二VH-VL配对的IgG抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体是具有与其连接的至少一个scFv片段的IgG抗体。
本发明的双特异性抗体可以展现pH值依赖性抗原结合。举例来说，结合至IL-4Rα的抗原结合区和/或结合至IL-5的抗原结合区在酸性pH值下相比在中性pH值下可以展现更低抗原结合活性。在某些实施方案中，如由KD(在酸性pH值下)/KD(在中性pH值下)所测量，在酸性pH值下与在中性pH值下抗原结合活性的比率为至少2。
已经发现，靶向多个2型细胞因子信号传导路径的组合和双特异性抗体特别适用于治疗慢性气道疾病，特别是哮喘。因此，本发明的另一个方面提供了根据本发明的第一个方面的组合或根据本发明的第二个方面的双特异性抗体，其用于治疗人类受试者的慢性气道疾病。进一步提供了一种用于治疗人类受试者的慢性气道疾病的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据本发明的第一个方面的组合或根据本发明的第二个方面的双特异性抗体。
在某些实施方案中，慢性气道疾病选自：哮喘；慢性鼻腔鼻窦炎(CRS)；免疫球蛋白G4相关疾病(IgG4-RD)；慢性阻塞性肺病(COPD)；慢性支气管炎；肺气肿；慢性血管性水肿；以杯状细胞化生为特征的疾病，包括巴瑞特氏食道症(Barrett's oesophagus)；活性嗜酸性粒细胞性食道炎；鼻息肉病；慢性鼻窦炎；查格-施特劳斯综合征(Churg StraussSyndrome)；变应性支气管肺曲霉病(ABPA)；高嗜酸性粒细胞综合征、大疱性类天疱疮和囊性纤维化。
有待根据本发明方法治疗的慢性气道疾病可以以增加的粘液产生或增加的支气管高反应性为特征。在优选实施方案中，有待治疗的慢性气道疾病是哮喘，任选地是重度哮喘、重度难治性哮喘、高II型哮喘(Type II High asthma)、特应性或变应性哮喘。
本文所描述的方法可以通过减少杯状细胞化生(或GCM)用来治疗慢性气道疾病，优选哮喘。替代地或另外，所述方法可以通过降低支气管高反应性(BHR)用来治疗慢性气道疾病，优选哮喘。所述方法可以包括额外步骤，例如，向患者进一步施用一种或多种额外治疗剂以治疗慢性气道疾病。
附图说明
图1示出了如IL-4诱导的HT-2细胞增殖和IL-5诱导的TF-1细胞增殖的体外细胞测定中所评估的IL-4Rα和IL-5单特异性Ab两者的中和活性。IL-4Rα(正方形)和IL-5(三角形)单特异性Ab分别强效抑制小鼠IL-4和IL-5诱导的HT-2和TF-1细胞增殖。结果表示为两个独立实验的一式三份平均值±SEM。
图2是在变化的浓度(0-20μg/mL)下的mAb(IL-4RαAb、IL-5Ab或无关IgG2a Ab)与固定化的靶标(IL-4Rα或IL-5)之间的相互作用的代表性表面等离子体共振(SPR)传感图。
图3是由mAb(IL-4RαAb、IL-5Ab或无关IgG2a Ab)和其靶标(IL-4Rα或IL-5)组成的混合物与固定化的蛋白质(IL-4、IL-13Rα或IL-5Rα)之间的相互作用的代表性SPR传感图。
图4示出了如通过FACS分析，在IL-4RαmAb处理之前和之后，经过纯化的B细胞的MHC II类抗原。IL-4RαmAb强效抑制IL-4诱导的经过纯化的B细胞的MHC II类抗原。
图5示出了用以测试IL-4Rα和IL-5mAb在活体内鼠类哮喘模型中的作用的实验结果。A是使用屋尘螨(HDM)小鼠模型的实验设置的图形表示。通过在致敏和激发期两者期间向HDM处理的C57BL/6J小鼠注射来递送IL-4Rα和IL-5抗体处理。B示出了如通过FACS分析，接受IL-4Rα单特异性Ab、IL-5单特异性Ab、IL-4α/IL-5单特异性Ab的组合或无关IgG2a Ab的小鼠的支气管肺泡灌洗(BAL)差示细胞计数。通过IgG2a处理的HDM致敏小鼠中的过敏原激发来增加嗜酸性粒细胞计数。与用对照IgG2a Ab处理相比，在用IL-4Rα单特异性Ab、IL-5单特异性Ab处理后以及用IL-4α/IL-5单特异性Ab的组合处理后观测到嗜酸性粒细胞计数的显著减少。P值反映单因素ANOVA测试，ns：不显著，*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001，****P≤0.0001，对比对照IgG2 Ab。
图6是使用屋尘螨(HDM)小鼠模型作为活体内鼠类哮喘模型的实验设置的图形表示。通过仅在激发期期间向HDM处理的C57BL/6J小鼠注射来递送IL-4Rα和IL-5抗体处理。
图7示出了如通过FACS分析，接受IL-4Rα单特异性Ab、IL-5单特异性Ab、IL-4Rα/IL-5单特异性Ab的组合或无关IgG2a Ab的小鼠的BAL差示细胞计数。通过IgG2a处理的HDM致敏小鼠中的过敏原激发来增加嗜酸性粒细胞计数。与用对照IgG2a Ab处理相比，在用IL-4Rα单特异性Ab处理后或用IL-5单特异性Ab处理后观测到嗜酸性粒细胞计数的显著减少。在用IL-4α/IL-5单特异性Ab的组合处理后观测到嗜酸性粒细胞计数的进一步减少。P值反映单因素ANOVA测试，ns：不显著，**P≤0.01，***P≤0.001，****P≤0.0001，对比对照IgG2Ab。
图8示出了如通过ELISA确定，由用HDM离体再刺激三天的肠系膜淋巴结(MLN)细胞产生的IL-5和IL-13细胞因子。通过IgG2a处理的HDM致敏小鼠中的过敏原激发来提高过敏原再刺激的MLN细胞培养物中效应细胞因子IL-5和IL-13的体外产生。然而，在用IL-4Rα单特异性Ab和两种单一疗法的组合处理后显著降低这种反应。P值反映单因素ANOVA测试，ns：不显著，**P≤0.01，***P≤0.001，对比对照IgG2 Ab。
图9示出了通过ELISA确定，在用IL-4Rα单特异性Ab、IL-5单特异性Ab、IL-4Rα/IL-5单特异性Ab的组合或无关IgG2a Ab处理后，HDM特异性IgE和IgG1的血清水平。通过IgG2aAb处理的小鼠中的过敏原激发来提高HDM特异性IgG1和IgE的血清浓度。IL-4RαmAb和IL-4Rα/IL-5mAb组合能够显著减少过敏原诱导的IgG1和IgE的这种增加。P值反映单因素ANOVA测试，*P≤0.05，ns：不显著，**P≤0.01，****P≤0.0001，对比无关IgG2 Ab。
图10示出了用IL-4Rα单特异性Ab、IL-5单特异性Ab和IL-4Rα/IL-5单特异性Ab的组合处理的小鼠的肺中粘蛋白、Muc5AC、Agr2和Spdef的表达。A示出了在用IL-4Rα单特异性Ab、IL-5单特异性Ab、组合的IL-4Rα/IL-5单特异性Ab或无关IgG2a Ab处理后小鼠肺中的Muc5AC共焦染色。B示出了通过qRT-PCR确定的Muc5ac和Agr2的肺mRNA表达水平。与PBS激发相比，在小鼠中通过HDM激发来诱导这两种基因的mRNA表达水平。单独的IL-4Rα和IL-5抗体并不显著逆转Muc5ac或Agr2mRNA水平的这种上升。然而，单特异性IL-4RαmAb和IL-5mAb两者的组合显著降低HDM介导的Muc5ac或Agr2 mRNA水平上升。P值反映单因素ANOVA测试，ns：不显著，**P≤0.01，****P≤0.0001，对比无关IgG2Ab。
图11示出了在暴露于渐增剂量的醋甲胆碱之后使用flexiVent
Figure BDA0002724631320000081
测量的支气管高反应性(BHR)。数据代表三个独立实验，其中每组至少n＝6只小鼠。与用对照IgG2a Ab处理相比，在用IL-4Rα/IL-5单特异性Ab的组合处理后显著降低支气管高反应性，并且阻力水平恢复至如在仅接受PBS的未激发小鼠中观测到的水平。结果表示为平均值±SEM。P值反映单因素ANOVA测试，ns：不显著，*P≤0.05，对比无关IgG2Ab。
图12是用以分离所需和适当配对的双特异性IL-4Rα/IL-5Ab的双重抗独特型纯化过程的示意性图示。(a)从通过不同重链和轻链配对而形成的四种可能组合的混合物，仅识别IL-4Rα单特异性Ab的正确HC/LC配对的抗独特型VHH用于提取含有这种配对的Ab。(b)含有仅识别IL-5单特异性Ab的正确HC/LC配对的VHH抗体的第二抗独特型柱用于收集含有αIL-5单特异性Ab的适当配对的HC/LC的双特异性Ab。(c)这得以分离具有正确HC/LC配对的所需IL-4Rα/IL-5双特异性Ab。
图13验证了IL-4Rα/IL-5双特异性抗体的双重靶向特性。A.在依序注射IL-4Rα单特异性Ab或IL-4Rα/IL-5双特异性Ab，继之以第2次注射IL-4Rα-Fc或IL-5之后，在经过涂布的IL-4Rα-Fc上测量SPR信号。双特异性抗体的一个臂结合至经过涂布的IL-4Rα，并且另一个臂结合至所注射的IL-5。B在依序注射IL-5单特异性Ab或IL-4Rα/IL-5双特异性Ab，继之以第2次注射IL-4Rα-Fc或IL-5之后，在经过涂布的IL-5上测量SPR信号。双特异性抗体的一个臂结合至经过涂布的IL-5，并且另一个臂结合至所注射的IL-4Rα。
图14是实验设置的图形表示，其中仅在激发期期间在HDM处理的C57BL/6J小鼠中注射抗体处理。为比较靶标的等摩尔抑制以及消除Ab总量的差异，向每只小鼠施用以下剂量的抗体：与75μg无关IgG2a Ab组合的75μg每种单特异性Ab；以组合形式注射的75μg每种单特异性Ab；或150μg IL-4Rα/IL-5双特异性Ab。
图15示出了如通过FACS分析，接受IL-4Rα单特异性Ab、IL-5单特异性Ab、组合的IL-4Rα/IL-5单特异性Ab、IL-4Rα/IL-5双特异性Ab或无关IgG2a Ab的HDM处理的小鼠的BAL差示细胞计数。致敏小鼠中的HDM激发增加了BAL流体中嗜酸性粒细胞的数目。在接受单特异性IL-4Rα和IL-5Ab(75μg+75μg)两者的组合的小鼠中和接受IL-4Rα/IL-5双特异性Ab的小鼠中注射之后显著减少嗜酸性粒细胞数目的这种增加。两种单特异性Ab的组合和双特异性抗体使得与接受对照IgG2a Ab的HDM处理的小鼠相比嗜酸性粒细胞的数目显著减少。P值反映单因素ANOVA测试，ns：不显著，***P≤0.001，****P≤0.0001，对比无关IgG2 Ab。
图16示出了如通过ELISA确定，由用HDM离体再刺激三天的肠系膜淋巴结(MLN)细胞产生的IL-5和IL-13细胞因子。P值反映单因素ANOVA测试，ns：不显著，***P≤0.001，****P≤0.0001，对比无关IgG2 Ab。
图17示出了通过ELISA确定，在用IL-4Rα单特异性Ab、IL-5单特异性Ab、组合的IL-4Rα/IL-5单特异性Ab、IL-4Rα/IL-5双特异性Ab或无关IgG2a Ab处理后，HDM特异性IgE和IgG1的血清水平。P值反映单因素ANOVA测试，ns：不显著，*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001，对比无关IgG2 Ab。
图18示出了通过qRT-PCR确定的Muc5ac、Agr2和Spdef的肺mRNA表达水平。与PBS激发相比，通过小鼠中的HDM激发来诱导这两种基因的mRNA表达水平。单独的IL-4Rα和IL-5抗体并不显著逆转Muc5ac或Agr2 mRNA水平的这种增加。然而，单特异性IL-4RαmAb和IL-5mAb两者的组合以及IL-4Rα/IL-5双特异性Ab显著降低HDM介导的Muc5ac或Agr2 mRNA水平上升。P值反映单因素ANOVA测试，ns：不显著，*P≤0.05，**P≤0.01，****P≤0.0001，对比无关IgG2 Ab。
图19示出了在暴露于渐增剂量的醋甲胆碱之后使用flexiVent
Figure BDA0002724631320000101
测量的BHR。数据代表两个独立实验，其中每组n＝6只小鼠。与用对照IgG2a Ab处理相比，在用IL-4Rα/IL-5单特异性Ab的组合处理后以及用IL-4Rα/IL-5双特异性Ab处理后显著降低支气管高反应性。在用单特异性Ab的组合处理后或用双特异性Ab处理后，阻力水平恢复至如在仅接受PBS的未激发小鼠中观测到的水平。结果表示为平均值±SEM。P值反映单因素ANOVA测试，ns：不显著，*P≤0.05，对比无关IgG2a Ab。
图20示出了具有连接至两个IL-5scFv片段的IL-4RαIgG的IL-4Rα/IL-5双特异性抗体的结构。IL-4RαIgG的Fab臂具有抗体36B7的VH和VL结构域序列(分别参见SEQ ID NO:45和46)。IL-5scFv片段的VH和VL结构域来源于抗体95G7并且具有分别由SEQ ID NO:76和79表示的序列。
图21示出了如IL-5诱导的TF-1细胞增殖的体外细胞测定中所评估的IL-4Rα/IL-5双特异性抗体的中和活性。与IL-4RαmAb(36B7)和两种IL-5mAb(95G7hIgG1和95A7mIgG2a)一起测试图20的双特异性抗体。
图22是使用屋尘螨(HDM)小鼠模型作为活体内鼠类哮喘模型的实验设置的图形表示。通过仅在激发期期间向HDM处理的C57BL/6J小鼠注射来递送IL-4Rα和IL-5抗体处理。
图23示出了如通过FACS分析，接受组合的IL-4Rα/IL-5单特异性Ab、IL-4Rα/IL-5双特异性Ab(Bs 4Rsc5)或无关IgG2a Ab的HDM处理的小鼠的BAL差示细胞计数。致敏小鼠中的HDM激发增加了BAL流体中嗜酸性粒细胞和淋巴细胞的数目。在接受单特异性IL-4Rα和IL-5Ab两者的组合的小鼠中和接受IL-4Rα/IL-5双特异性Ab的小鼠中注射之后显著减少细胞数目的这种增加。P值反映单因素ANOVA测试，ns：不显著，***P≤0.001，****P≤0.0001，对比无关IgG2 Ab。
图24示出了通过qRT-PCR确定的Muc5ac、Agr2和Spdef的肺mRNA表达水平。与PBS激发相比，通过HDM激发诱导了小鼠中的这两种基因的mRNA表达水平。
具体实施方式
A.定义
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明技术领域中的技术人员通常所理解的相同的含义。
“组合疗法”-如本文所用，术语“组合疗法”是指向受试者，例如人类受试者给与两种或更多种治疗剂的治疗。本发明的“组合”是为了用作“组合疗法”。通常施用两种或更多种治疗剂以治疗单一疾病，本文中是慢性气道疾病。本发明的组合或组合疗法组合了靶向多个2型细胞因子信号传导路径的拮抗剂。特别地，本文所描述的组合疗法靶向细胞因子:细胞因子受体：IL-5:IL-5R；IL-4:IL-4R和IL-13:IL-13R。这些细胞因子-细胞因子受体在本文中更详细描述。在优选实施方案中，拮抗剂是特异性地结合其相应的细胞因子或细胞因子受体靶标的抗体分子。如本文别处所描述，组合疗法中所包括的拮抗剂可以共同配制或可以独立地提供，例如，作为独立的组合物，以供向有需要的受试者或患者施用。对于组合包含结合至IL-4Rα的抗体分子和结合至IL-5的抗体分子的实施方案，组合的抗体分子可以包含于单一抗体内，例如多特异性抗体形式，如双特异性抗体。
“拮抗剂”-如本文所用，术语“拮抗剂”意指能够抑制其靶标细胞因子或细胞因子受体的功能的任何剂或分子。如本文所用，IL-5:IL-5R的拮抗剂意指能够抑制通过IL-5结合至其同源受体复合物“IL-5R”而起始的信号传导的任何剂或分子。如本文所用，IL-4:IL-4R的拮抗剂意指能够抑制通过IL-4结合至其同源I型受体复合物“IL-4R”而起始的信号传导的任何剂或分子。如本文所用，IL-13:IL-13R的拮抗剂意指能够抑制通过IL-13结合至其同源受体复合物“IL-13R”而起始的信号传导的任何剂或分子。如本文别处所阐明，2型细胞因子IL-5、IL-4和IL-13所结合的受体复合物通常由两个受体亚单位组成。举例来说，IL-5:IL-5R的拮抗剂可以阻止IL-5与其受体复合物之间的缔合或阻止IL-5R复合物的两个亚单位(IL-5Rα和βc)之间的缔合，从而抑制或阻断由IL-5介导的信号传导。类似地，IL-4:IL-4R的拮抗剂或IL-13:IL-13R的拮抗剂可以阻止细胞因子(IL-4或IL-13)与其受体复合物之间的缔合或阻止IL-4R或IL-13R复合物的两个亚单位之间的缔合，从而抑制或阻断由IL-4或IL-13介导的信号传导。如本文别处所阐明，IL-4R和IL-13R复合物共享通用受体亚单位IL-4Rα。此外，细胞因子IL-4可以不仅经由其自身的I型受体复合物“IL-4R”，而且经由IL-13R复合物传导信号。因此，IL-4Rα的拮抗剂可以破坏IL-4R和IL-13R复合物两者，以抑制经由IL-4和IL-13两者的信号传导。此外，在一些情况下，IL-13R复合物的拮抗剂可以抑制经由IL-4的信号传导。
用于本发明的组合中的IL-5:IL-5R、IL-4:IL-4R和IL-13:IL-13R拮抗剂可以采用任何适合剂或分子的形式。在某些实施方案中，拮抗剂可以通过下调靶标的表达，例如IL-4Rα或IL-5的表达来抑制其靶标的功能。在替代性实施方案中，拮抗剂可以通过直接结合至细胞因子或受体亚单位来抑制其靶标的功能。如本文所阐明，IL-5:IL-5R的拮抗剂可以结合至细胞因子IL-5(称作IL-5的拮抗剂)或结合至IL-5R亚单位之一(称作IL-5Rα的拮抗剂或βc的拮抗剂)。类似地，IL-4:IL-4R的拮抗剂可以结合至细胞因子IL-4(称作IL-4的拮抗剂)或结合至I型IL-4R亚单位之一(称作IL-4Rα的拮抗剂或γc的拮抗剂)。
在优选实施方案中，拮抗剂对其靶标具有特异性。举例来说，与其它分子靶标相比，IL-4Rα的拮抗剂(或IL-4Rα拮抗剂)将优先抑制IL-4Rα的功能。与其它分子靶标相比，IL-5拮抗剂将优先抑制IL-5的功能。拮抗剂将通常通过直接与其靶标相互作用，例如通过选择性地结合至IL-4Rα或IL-5mRNA或蛋白质来达成所需水平的特异性。可以充当拮抗剂的适合剂或分子包括但不限于抑制性RNA种类(例如，siRNA或shRNA)、小分子抑制剂、生物拮抗剂。在优选实施方案中，组合的拮抗剂是抗体分子。
“抗体分子”-如本文所用，术语“抗体分子”意图涵盖全长抗体和其抗原结合片段，包括变体，如经过修饰的抗体、人源化抗体、种系化抗体和其抗原结合片段。术语“抗体”通常是指具有两条重链和两条轻链的组合的异源四聚免疫球蛋白多肽，其中所述多肽对所关注的抗原(例如，IL-4Rα或IL-5)具有显著的特异性免疫反应性活性。对于IgG类别的抗体，所述抗体包含分子量为约23,000道尔顿的两条相同多肽轻链和分子量为53,000-70,000的两条相同重链。四条链由二硫键以“Y”构型连接，其中轻链托住始于“Y”的开口处并且延续通过可变区的重链。抗体的轻链归类为κ或λ(κ,λ)。每个重链类别可以与κ或λ轻链结合。一般来说，当由杂交瘤、B细胞或遗传工程改造的宿主细胞产生免疫球蛋白时，轻链和重链彼此共价键结，并且两条重链的“尾巴”部分由共价二硫键联或非共价键联彼此键结。在重链中，氨基酸序列从Y构型的叉形末端的N端延伸至每条链的底部的C端。
本领域技术人员将了解，重链归类为γ、μ、α、δ或ε(γ、μ、α、δ、ε)，其中有一些子类(例如，γ1-γ4)。这条链的性质将抗体的“类别”分别确定为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。免疫球蛋白子类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等经过充分表征并且已知赋予功能特异化。如本文所用，术语“抗体分子”涵盖来自任何抗体类别或子类的全长抗体或其抗原结合片段。
如本文所用，术语“抗体分子”还意图涵盖“仅重链抗体”或“VHH抗体”。术语“仅重链抗体”或“VHH抗体”是指仅由包括骆驼、美洲驼、羊驼的骆驼科物种产生的抗体类型。仅重链抗体由两条重链组成并且不含轻链。每条重链在N端具有可变结构域，并且这些可变结构域称作“VHH”结构域以将其与上文所描述的常规异源四聚抗体的重链的可变结构域，即，VH结构域相区分。
关于通用术语“抗体分子”内所涵盖的抗原结合片段，这些片段是包含比完整或完全抗体少的氨基酸残基，同时保留抗原结合活性的全长抗体或抗体链的局部或部分。如本文所用，术语“抗体分子”意图涵盖选自以下的抗原结合片段：抗体轻链可变结构域(VL)；抗体重链可变结构域(VH)；单链抗体(scFv)；F(ab')2片段；Fab片段；Fd片段；Fv片段；单臂(单价)抗体；通过此类抗原结合片段的组合、组装或缀合而形成的双链抗体、三链抗体、四链抗体或任何抗原结合分子。如本文所用，术语“抗体分子”进一步意图涵盖选自由以下组成的组的抗体片段：单抗体(unibody)；结构域抗体；和纳米抗体。片段可以例如经由对完整或完全抗体或抗体链的化学或酶促处理或通过重组手段来获得。
“可变区”或“可变结构域”-术语“可变区”和“可变结构域”在本文中可互换使用并且意图具有等同的含义。术语“可变”是指以下实情：可变结构域VH和VL的某些部分在抗体之间的序列方面广泛不同并且用于每种特定抗体对其靶抗原的结合和特异性中。然而，可变性在抗体的整个可变结构域中不均匀分布。可变性集中在VL结构域和VH结构域中的每一者中称为“高变环”的三个区段中，这三个区段形成抗原结合位点的一部分。Vλ轻链结构域的第一、第二和第三高变环在本文中称作L1(λ)、L2(λ)和L3(λ)并且可以定义为包含VL结构域中的残基24-33(L1(λ)，由9个、10个或11个氨基酸残基组成)、49-53(L2(λ)，由3个残基组成)和90-96(L3(λ)，由5个残基组成)(Morea等,Methods 20:267-279(2000))。Vκ轻链结构域的第一、第二和第三高变环在本文中称作L1(κ)、L2(κ)和L3(κ)并且可以定义为包含VL结构域中的残基25-33(L1(κ)，由6个、7个、8个、11个、12个或13个残基组成)、49-53(L2(κ)，由3个残基组成)和90-97(L3(κ)，由6个残基组成)(Morea等,Methods 20:267-279(2000))。VH结构域的第一、第二和第三高变环在本文中称作H1、H2和H3并且可以定义为包含VH结构域中的残基25-33(H1，由7个、8个或9个残基组成)、52-56(H2，由3个或4个残基组成)和91-105(H3，长度是高度可变的)(Morea等,Methods 20:267-279(2000))。
除非另有指示，否则术语L1、L2和L3分别是指VL结构域的第一、第二和第三高变环，并且涵盖获自Vκ和Vλ两种同种型的高变环。术语H1、H2和H3分别是指VH结构域的第一、第二和第三高变环，并且涵盖获自已知重链同种型中的任一者(包括γ、ε、δ、α或μ)的高变环。
高变环L1、L2、L3、H1、H2和H3可以各自包含如下文所定义的“互补决定区”或“CDR”的一部分。术语“高变环”和“互补决定区”严格来说是不同义的，因为高变环(HV)在结构的基础上定义，而互补决定区(CDR)基于序列可变性来定义(Kabat等,Sequences ofProteins of Immunological Interest(《具有免疫学意义的蛋白质序列》),第5版PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.,1983)，并且HV和CDR的界限在一些VH和VL结构域中可能不同。
VL和VH结构域的CDR通常可以定义为包含以下氨基酸：轻链可变结构域中的残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)，以及重链可变结构域中的残基31-35或31-35b(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；(Kabat等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest(《具有免疫学意义的蛋白质序列》),第5版,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。因此，除非另有指示，否则HV可以包含于对应的CDR内并且在本文中对VH和VL结构域的“高变环”的提及应解释为还涵盖对应的CDR，反之亦然。
可变结构域的更高度保守部分称为如下文所定义的构架区(FR)。原生重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR(分别是FR1、FR2、FR3和FR4)，其主要采用由三个高变环连接的β-折叠构型。每条链中的高变环由FR紧密地保持在一起，并且与来自另一条链的高变环一起促成抗体的抗原结合位点形成。抗体的结构分析揭露了由互补决定区形成的结合位点的序列与形状之间的关系(Chothia等,J.Mol.Biol.227:799-817(1992))；Tramontano等,J.Mol.Biol,215:175-182(1990))。尽管存在高度序列可变性，但六个环中的五个环仅采用一小组的主链构象，称为“典型结构”。这些构象首先由环的长度决定，其次由环中和构架区中在某些位置处的关键残基的存在所决定，这些关键残基通过其堆积、氢键结或呈现非常见主链构象的能力来决定构象。
“CDR”-如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”意指在重链和轻链多肽两者的可变区内所发现的非相连抗原组合位点。这些特定区已经由Kabat等,J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977)和Kabat等,Sequences of protein of immunological interest(《具有免疫学意义的蛋白质序列》),(1991)以及由Chothia等,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)和MacCallum等,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)描述，其中定义包括当与彼此相比较时氨基酸残基的重叠或子组。陈述了涵盖如由上文引用的参考文献中的每一者所定义的CDR的氨基酸残基以供比较。优选地，术语“CDR”是如由Kabat基于序列比较所定义的CDR。
表1：CDR定义
Figure BDA0002724631320000161
1残基编号遵循Kabat等(同上)的命名
2残基编号遵循Chothia等(同上)的命名
3残基编号遵循MacCallum等(同上)的命名
“构架区”-如本文所用，术语“构架区”或“FR区”包括作为可变区的一部分，但不是CDR(例如，使用CDR的Kabat定义)的一部分的氨基酸残基。因此，可变区构架的长度为约100-120个氨基酸，但仅包括在CDR外的那些氨基酸。对于重链可变结构域的特定实例并且对于如由Kabat等所定义的CDR，构架区1对应于涵盖氨基酸1-30的可变区的结构域；构架区2对应于涵盖氨基酸36-49的可变区的结构域；构架区3对应于涵盖氨基酸66-94的可变区的结构域；并且构架区4对应于从可变区的氨基酸103至末端的可变区的结构域。轻链的构架区由轻链可变区CDR中的每一者以类似方式隔开。类似地，使用Chothia等或McCallum等的CDR定义，构架区边界由如上文所描述的相应CDR端隔开。在优选实施方案中，CDR如由Kabat所定义。
在天然存在的抗体中，每个单体抗体上所存在的六个CDR是氨基酸的短的非相连序列，其特异性地定位以在抗体于水性环境中呈现其三维构型时形成抗原结合位点。重和轻可变结构域的其余部分在氨基酸序列中显示出较少分子间可变性并且称为构架区。构架区主要采用β-折叠构象并且CDR形成环，这些环连接在一起并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。因此，这些构架区用以形成支架，所述支架使得六个CDR通过链间非共价相互作用以正确的取向定位。由定位的CDR形成的抗原结合位点界定了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这个互补表面促进抗体与免疫反应性抗原表位的非共价结合。CDR的位置可以由本领域一般技术人员容易地鉴别。
“恒定区”-如本文所用，术语“恒定区”是指在可变结构域或可变区外的抗体分子部分。免疫球蛋白轻链具有单一结构域“恒定区”，通常称作“CL或CL1结构域”。这个结构域处于VL结构域的C端。免疫球蛋白重链在其恒定区方面不同，这取决于免疫球蛋白的类别(γ、μ、α、δ、ε)。重链γ、α及δ具有由三个免疫球蛋白结构域(称作CH1、CH2和CH3)组成的恒定区，其中柔性铰链区将CH1和CH2结构域隔开。重链μ和ε具有由四个结构域(CH1-CH4)组成的恒定区。重链的恒定结构域定位于VH结构域的C端。
免疫球蛋白重链和轻链中的氨基酸编号从Y构型的叉形末端的N端延伸至每条链的底部的C端。不同编号方案用于定义免疫球蛋白重链和轻链的恒定结构域。根据EU编号方案，IgG分子的重链恒定结构域如下鉴别：CH1-氨基酸残基118-215；CH2-氨基酸残基231-340；CH3-氨基酸残基341-446。根据Kabat编号方案，IgG分子的重链恒定结构域如下鉴别：CH1-氨基酸残基114-223；CH2-氨基酸残基244-360；CH3-氨基酸残基361-477。“Fc结构域”或“Fc区”通常定义包括CH2和CH3结构域的重链的恒定区部分。Fc区还可以包括来自铰链区的一些残基。“铰链区”包括将CH1结构域连接至CH2结构域的重链分子部分。这个铰链区包含约25个残基并且是柔性的，因此允许两个N端抗原结合区独立地活动。铰链区可以细分成三个不同结构域：上、中和下铰链结构域(Roux K.H.等J.Immunol.161:4083-90 1998)。包含“完全人类”铰链区的本发明抗体可以含有下表2中所示的铰链区序列之一。
表2：人类铰链序列
Figure BDA0002724631320000181
Figure BDA0002724631320000191
“特异性”和“多特异性抗体”-用于本文所描述的组合疗法中的抗体分子结合至特定靶抗原。优选的是，抗体分子“特异性地结合”至其靶抗原，其中术语“特异性地结合”是指任何抗体分子优先与给定的靶标，例如IL-4Rα和IL-5发生免疫反应的能力。本发明组合和方法的抗体分子可以是单特异性的并且含有一个或多个特异性地结合特定靶标的结合位点。本发明组合和方法的抗体分子可以合并成“多特异性抗体”形式，例如双特异性抗体，其中多特异性抗体结合至两个或更多个靶抗原。举例来说，在一个实施方案中，本发明的组合包含双特异性抗体，所述双特异性抗体包含特异性地结合至IL-4Rα的第一抗体分子和特异性地结合至IL-5的第二抗体分子。为了达成多重特异性，“多特异性抗体”通常经过工程改造以包括具有不同VH-VL对的重链和轻链多肽的不同组合或配对。多特异性，特别是双特异性抗体可以经过工程改造以采用原生抗体的整体构象，例如，具有缀合至Fc区的不同特异性的Fab臂的Y形抗体。或者，多特异性抗体，例如双特异性抗体可以经过工程改造以采用非原生构象，例如，其中具有不同特异性的可变结构域或可变结构域对定位于Fc区的相对末端。
“经过修饰的抗体”-如本文所用，术语“经过修饰的抗体”包括经过改变以使其不是天然存在的合成形式的抗体，例如，包含至少两个重链部分，但不包含两个完整重链的抗体(如结构域缺失抗体或微抗体)；经过改变以结合至两个或更多个不同抗原或结合至单一抗原上的不同表位的多特异性形式的抗体(例如，双特异性、三特异性等)；连接至scFv分子的重链分子，等等。scFv分子在本领域中是已知的并且在例如美国专利5,892,019中描述。另外，术语“经过修饰的抗体”包括多价形式的抗体(例如，结合至相同抗原的三个或更多个拷贝的三价、四价等抗体)。在另一个实施方案中，本发明的经过修饰的抗体是融合蛋白，所述融合蛋白包含缺乏CH2结构域的至少一个重链部分并且包含含有受体配体对的一个成员的结合部分的多肽结合结构域。
“人源化取代”-如本文所用，术语“人源化取代”是指氨基酸取代，其中抗体的VH或VL结构域中的特定位置处所存在的氨基酸残基由参考人类VH或VL结构域中等同位置处出现的氨基酸残基置换。参考人类VH或VL结构域可以是由人类种系编码的VH或VL结构域。可以在本文所定义的抗体的构架区和/或CDR中作出人源化取代。
“人源化变体”-如本文所用，术语“人源化变体”或“人源化抗体”是指与参考抗体相比含有一个或多个“人源化取代”的变体抗体，其中参考抗体的一部分(例如，VH结构域和/或VL结构域或其含有至少一个CDR的部分)具有来源于非人类物种的氨基酸，并且“人源化取代”在来源于非人类物种的氨基酸序列内发生。
“种系化变体”-术语“种系化变体”或“种系化抗体”在本文中用于特定指代其中“人源化取代”使得抗体的VH或VL结构域中一个或多个特定位置处所存在的一个或多个氨基酸残基由人类种系编码的参考人类VH或VL结构域中等同位置处出现的氨基酸残基置换的“人源化变体”。典型的是，对于任何给定的“种系化变体”，取代至种系化变体中的置换氨基酸残基完全或主要获自单一人类种系编码的VH或VL结构域。术语“人源化变体”和“种系化变体”常常可互换使用。将一个或多个“人源化取代”引入源自骆驼科(例如，源自美洲驼)的VH或VL结构域中得以产生源自骆驼科(美洲驼)的VH或VL结构域的“人源化变体”。如果取代入的氨基酸残基主要或完全来源于单一人类种系编码的VH或VL结构域序列，那么结果可以是源自骆驼科(美洲驼)的VH或VL结构域的“人类种系化变体”。
“亲和力变体”-如本文所用，术语“亲和力变体”是指与参考抗体相比在氨基酸序列中展现一个或多个变化的变体抗体，其中亲和力变体与参考抗体相比对靶抗原展现改变的亲和力。举例来说，亲和力变体与参考IL-4Rα或IL-5抗体相比将对靶标，例如IL-4Rα或IL-5展现变化的亲和力。优选地，亲和力变体与参考抗体相比将对靶抗原展现改善的亲和力。亲和力变体与参考抗体相比通常在CDR的氨基酸序列中展现一个或多个变化。此类取代可以使得CDR中给定位置处所存在的原始氨基酸由不同氨基酸残基置换，所述氨基酸残基可以是天然存在的氨基酸残基或非天然存在的氨基酸残基。氨基酸取代可以是保守或非保守的。
“IL-5:IL-5R”-如本文所用，术语“IL-5”是指白介素-5细胞因子并且术语“IL-5R”是指白介素5细胞因子所结合的受体复合物。术语“IL-5:IL-5R”在本文中用于指示IL-5细胞因子/细胞因子受体信号传导复合物。细胞因子IL-5也称为B-细胞分化因子I、嗜酸性粒细胞分化因子和T-细胞替代因子(TRF)。IL-5的人类同源物的长度为134个氨基酸(http://www.uniprot.org/uniprot/P05113)。如本文所用，术语“IL-5”意图涵盖蛋白质的任何剪接变体。单体IL-5不具有活性，并且对于功能来说需要同源二聚体。一个IL-5同源二聚体啮合一个IL-5受体(IL-5R)。IL-5的受体由两个亚单位组成。第一亚单位是“IL-5受体亚单位α”或“IL-5Rα”，也称为IL-5R-α、IL-5RA、CDw125和CD_抗原：CD125；这个亚单位形成受体复合物的配体结合部分。IL-5Rα的人类同源物的长度为420个氨基酸(http://www.uniprot.org/uniprot/Q01344)。IL-5R复合物的第二亚单位是非配体结合通用信号转导β亚单位或β链(βc)。IL-5由有限数目的间质细胞类型分泌。已知表达IL-5的细胞包括嗜酸性粒细胞、NK细胞、TC2 CD8+T细胞、肥大细胞、CD45+CD4+T细胞、γδT细胞和IL-1β活化内皮细胞。已知IL-5调控B细胞和嗜酸性粒细胞的增殖、细胞存活和成熟以及效应功能中所涉及的基因的表达。
“IL-4:IL-4R”-如本文所用，术语“IL-4”是指白介素-4细胞因子并且术语“IL-4R”是指白介素4细胞因子所结合的I型受体复合物。术语“IL-4:IL-4R”用于指示IL-4细胞因子/I型细胞因子受体信号传导复合物。细胞因子IL-4也称为B-细胞刺激因子1(BSF-1)、人白介素4(Binetrakin)和淋巴细胞刺激因子1。IL-4的人类同源物的长度为153个氨基酸(http://www.uniprot.org/uniprot/P05112)。如本文所用，术语“IL-4”意图涵盖蛋白质的任何剪接变体。IL-4的I型受体由两个亚单位组成。第一亚单位是“IL-4Rα”，也称为白介素-4受体亚单位α、白介素-4结合亚单位和CD124。IL-4Rα是I类细胞因子受体家族中广泛表达的140kDa跨膜糖蛋白。IL-4Rα的人类同源物的长度为825个氨基酸(http://www.uniprot.org/uniprot/P24394)。如本文所用，术语“IL-4Rα”意图涵盖蛋白质的任何剪接变体。在I型IL-4受体复合物中，IL-4Rα与第二亚单位通用γ链(γc)缔合，并且γc亚单位增加IL-4Rα对IL-4的亲和力以实现经由IL-4的下游信号传导。IL-4受体复合物存在于例如B-细胞、T-细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和成纤维细胞中，并且IL-4Rα偶联至JAK1/2/3-STAT6路径。IL-4反应涉及到促进Th2分化，并且调控变应性炎症部位处的IgE产生以及趋化因子和粘液产生。
“IL-13:IL-13R”-如本文所用，术语“IL-13”是指白介素-13细胞因子并且术语“IL-13R”是指白介素13细胞因子所结合的受体复合物。IL-13受体还充当IL-4的II型受体。术语“IL-13:IL-13R”用于指示IL-13细胞因子/细胞因子受体信号传导复合物。IL-13的人类同源物的长度为146个氨基酸(http://www.uniprot.org/uniprot/P35225)。如本文所用，术语“IL-13”意图涵盖蛋白质的任何剪接变体。IL-13的受体由两个亚单位组成。第一亚单位是“IL-4Rα”，也称为白介素-4受体亚单位α、白介素-4结合亚单位和CD124。如上文所提及，这个亚单位是IL-4和IL-13受体两者通用的。在IL-13受体复合物中，IL-4Rα与第二亚单位白介素-13受体亚单位α1或“IL-13Rα1”或“IL-13Rα1”或“IL-13RA1”缔合。这个第二亚单位充当IL-13的配体结合亚单位。由IL-4Rα和IL-13Rα1亚单位组成的IL-13R复合物对IL-13(经由结合至IL-13Rα1)和IL-4(经由结合至IL-4Rα)有反应，并且细胞因子结合至这个受体复合物起始经由JAK1/2/3-STAT6路径的信号传导。类似于IL-4:IL-4R复合物，经由IL-4Rα和IL-13Rα1亚单位所组成的IL-13R复合物的信号传导涉及到调控变应性炎症部位处的IgE产生以及趋化因子和粘液产生。关于IL-4和IL-13细胞因子-受体信号传导路径的额外信息可以在例如McCormick和Heller(2015)Cytokine 75(1):38-50中找到，其内容以全文并入本文中。
“慢性气道疾病”-如本文所用，术语“慢性气道疾病”可以与‘慢性呼吸道疾病(CRD)’互换使用并且意图意指气道和肺部其它结构的任何疾病。大多数常见形式的慢性气道疾病中的一些是慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、职业性肺病和肺高压。除了吸烟以外，其它风险因素包括空气污染、职业性化学品和粉尘，以及在儿童期频繁的下呼吸道感染。其它慢性气道疾病可以包括但不限于：慢性鼻腔鼻窦炎(CRS)、免疫球蛋白G4相关疾病(IgG4-RD)、慢性支气管炎、肺气肿、慢性血管性水肿、杯状细胞化生特异性疾病(如巴瑞特氏食道症)、活性嗜酸性粒细胞性食道炎、鼻息肉病、慢性鼻窦炎、查格-施特劳斯综合征、变应性支气管肺曲霉病(ABPA)、高嗜酸性粒细胞综合征、大疱性类天疱疮和囊性纤维化。
“哮喘”-如本文所用，“哮喘”意图意指与肺中空气通道的炎症有关的任何疾病或病状。通常，炎症影响气道中的神经末梢的敏感度以使其变得易受刺激。在哮喘发作期间，通道的内衬肿胀，导致气道变窄并且减少空气流入和流出肺部。哮喘是描述多种表型的异质性病症，每种表型呈现出不同的临床、生理和分子特征。例示性哮喘亚型可以包括重度哮喘、重度难治性哮喘、轻度或中度哮喘、肥胖相关哮喘、运动诱发的哮喘、阿司匹林诱发的哮喘、特应性或变应性哮喘、嗜酸性粒细胞性哮喘、嗜中性粒细胞性哮喘、少粒细胞性或非炎性哮喘、早发性哮喘、迟发性哮喘、高II型哮喘、低II型哮喘(type II low asthma)和I型/Th17哮喘。
B.用以抑制2型细胞因子信号传导的组合疗法
本发明涉及组合或组合疗法和其治疗慢性气道疾病，特别是治疗哮喘的用途。本发明的组合包含靶向2型细胞因子和/或其相应受体的拮抗剂。由本发明的组合靶向的细胞因子和细胞因子受体包括IL-5和其受体IL-5R；IL-4和其I型受体IL-4R；以及IL-13和其受体IL-13R。
在第一个方面，本发明提供了一种组合，其包含：(i)IL-5:IL-5R的拮抗剂；和(ii)IL-4:IL-4R的拮抗剂和/或IL-13:IL-13R的拮抗剂。在一个实施方案中，组合包含IL-5:IL-5R的拮抗剂和IL-4:IL-4R的拮抗剂。在另一个实施方案中，组合包含IL:5:IL-5R的拮抗剂和IL-13:IL-13R的拮抗剂。在又一个实施方案中，组合包含IL-5:IL-5R的拮抗剂、IL-4:IL-4R的拮抗剂和IL-13:IL-13R的拮抗剂。在某些实施方案中，组合抑制经由IL-5和IL-4的信号传导。在某些实施方案中，组合抑制经由IL-5和IL-13的信号传导。在优选实施方案中，组合抑制经由IL-5、IL-4和IL-13的信号传导。
不希望受理论约束，据信本发明的组合鉴于在阻断2型细胞因子活性中的组合作用而特别有效地治疗慢性气道疾病，特别是哮喘。IL-4、IL-13和IL-5是2型细胞因子并且本发明的组合可以抑制经由这些细胞因子全部三者的信号传导。“2型免疫反应”是指主要由称为T辅助(TH2)细胞的CD4+T细胞亚群调控的免疫反应。然而，气道2型免疫反应还可以由嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、TH2细胞、第2组固有淋巴样细胞(ILC2)和产生IgE的B细胞介导。
IL-4、IL-13和IL-5负责由B细胞产生IgE、嗜酸性粒细胞活化和募集以及粘液产生。2型细胞因子驱动一连串下游事件，包括气道上皮细胞的活化、效应细胞(肥大细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)的化学吸引以及上皮和上皮下基质的重塑。在慢性气道疾病，例如哮喘中，经由IL-4、IL-13和IL-5的异常信号传导可以导致气道嗜酸性粒细胞增多症、气道重塑和支气管高反应性(参见Lambrecht和Hammad(2015)同上)。相关重塑变化可以包括平滑肌细胞变化(增生和肥大)、粘液细胞变化(杯状细胞化生)和血管重塑。总之，气道中的这些炎性和病理变化使个体倾向于对吸入性恶化剂(inhaled exacerbant)的反应增大。
本发明者已经显示，通过阻断经由IL-4、IL-13和IL-5的信号传导，观测到令人惊讶的协同效应。相对于用仅阻断IL-4和IL-13的IL-4Rα单一疗法或仅阻断IL-5的IL-5单一疗法的治疗，观察到这种效应。本文所提供的数据显示，包含靶向IL-5:IL-5R信号传导轴的拮抗剂和靶向IL-4:IL-4R和/或IL-13:IL-13R信号传导轴的拮抗剂的本发明的组合疗法产生协同效应。在慢性气道疾病的活体内模型中，在粘蛋白产生(指示杯状细胞化生)减少的层面上和支气管高反应性降低的层面上观察到这种效应。重要地，已经显示包含靶向2型细胞因子的拮抗剂的根据本发明的组合疗法完全阻止活体内模型中的支气管高反应性。
本发明的组合包含拮抗剂，其靶向(i)IL-5:IL-5R；和(ii)IL-4:IL-4R和/或IL-13:IL-13R。如本文所描述，术语“拮抗剂”在宽泛的意义上用于意指能够抑制其靶标的功能的任何剂或分子。举例来说，IL-5:IL-5R拮抗剂将抑制IL-5细胞因子-IL-5受体复合物的功能，从而抑制经由IL-5的信号传导。类似地，IL-4:IL-4R拮抗剂将抑制IL-4细胞因子-IL-4受体复合物的功能，从而抑制经由IL-4的信号传导。同样地，IL-13:IL-13R拮抗剂将抑制IL-13细胞因子-IL-13受体复合物的功能，从而抑制经由IL-13的信号传导。
本文所描述的2型细胞因子-受体配对的拮抗剂，亦即，IL-5:IL-5R、IL-4:IL-4R和IL-13:IL-13R的拮抗剂将通常靶向细胞因子-受体复合物的一种组分或与这种组分相互作用。举例来说，IL-5:IL-5R的拮抗剂可以与IL-5相互作用以抑制经由IL-5:IL-5R信号传导路径的信号传导。或者，IL-5:IL-5R的拮抗剂可以与受体亚单位IL-5Rα相互作用以抑制经由IL-5:IL-5R信号传导路径的信号传导。在优选实施方案中，IL-5:IL-5R的拮抗剂是IL-5的拮抗剂。类似地，IL-4:IL-4R的拮抗剂和IL-13:IL-13R的拮抗剂可以分别与细胞因子IL-4和IL-13相互作用，或可以与受体亚单位相互作用以分别抑制IL-4和/或IL-13信号传导。
特别优选的是，本发明的组合包含受体亚单位IL-4Rα的拮抗剂。更优选地，组合包含IL-5的拮抗剂和IL-4Rα的拮抗剂。优选靶向IL-4Rα的原因在于这个受体亚单位形成IL-4的I型受体复合物的一部分(与γc一起)以及IL-13受体复合物的一部分(与IL-13Rα1一起)。因此，IL-4Rα的拮抗剂可以同时充当IL-4:IL-4R和IL-13:IL-13R的拮抗剂，从而抑制经由IL-4和IL-13两者的信号传导。特别地，包含IL-5:IL-5R的拮抗剂(优选IL-5的拮抗剂)和IL-4Rα的拮抗剂的组合可以抑制经由IL-5、IL-4和IL-13的信号传导。本文所描述的组合的拮抗剂优选结合至其相应的人类靶标。
在优选实施方案中，IL-5:IL-5R、IL-4:IL-4R和/或IL-13:IL-13R的拮抗剂是抗体分子。更优选地，组合包含结合至IL-5的抗体分子和结合至IL-4Rα的抗体分子。
在某些实施方案中，组合包含结合至IL-5的抗体分子作为IL-5:IL-5R拮抗剂。或者，组合可以包含结合至IL-5Rα的抗体分子作为IL-5:IL-5R拮抗剂。可以并入本文所描述的组合中的IL-5和IL-5R抗体分子包括本领域技术人员所知的任何适合的IL-5和IL-5Rα抗体。例示性抗体包括结合至IL-5的美泊利单抗
Figure BDA0002724631320000251
和瑞利珠单抗
Figure BDA0002724631320000252
以及结合至IL-5Rα的贝那利珠单抗(benralizumab)
Figure BDA0002724631320000253
在某些实施方案中，组合包含结合至IL-4的抗体分子作为IL-4:IL-4R拮抗剂。在某些实施方案中，组合包含结合至IL-13的抗体分子作为IL-13:IL-13R拮抗剂。在优选实施方案中，组合包含结合至IL-4Rα的抗体分子。如上文所提及，这种拮抗剂充当IL-4:IL-4R和IL-13:IL-13R两者的拮抗剂，这是因为IL-4Rα亚单位是为IL-4和IL-13受体复合物两者共有。可以并入本文所描述的组合中的靶向IL-4和IL-13信号传导路径的抗体分子包括本领域技术人员所知的任何适合的IL-4、IL-13、IL-4Rα和IL-13Rα1抗体。此类抗体包括度匹鲁单抗
Figure BDA0002724631320000261
其为针对IL-4Rα受体的完全人源化mAb。还参见：Sheridan C.(2018)Nat.Biotechnol.36(1):3-5。
本发明组合的抗体分子，例如，结合IL-4Rα的抗体分子和结合IL-5的抗体分子，可以选自对其相应靶标展现免疫反应性的任何适合的抗体分子。如上文所提及，术语“抗体分子”在本文中用于意指全长抗体以及其抗原结合片段。
本文所描述的组合的抗体意图用于人类治疗用途并且因此将通常是IgA、IgD、IgE、IgG、IgM类型，常常是IgG类型，在这种情况下所述抗体可以属于四种子类IgG1、IgG2a和b、IgG3或IgG4中的任一者。在优选实施方案中，组合的抗体分子是IgG抗体，任选地是IgG1抗体。抗体可以是单克隆、多克隆、多特异性(例如，双特异性抗体)抗体，条件是所述抗体对其靶标展现适当的免疫特异性。单克隆抗体是优选的，这是因为其针对单一抗原位点具有高度特异性。
本文所描述的组合的抗原结合片段将通常包含全长抗体的一部分，一般是其抗原结合或可变结构域。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2、双特异性Fab'和Fv片段，由抗体片段形成的线性抗体、单链抗体分子、单链可变片段(scFv)和多特异性抗体(参见Holliger和Hudson(2005)Nature Biotechnol.23:1126-36，以引用的方式并入本文中)。
本文所描述的组合的抗体分子可以展现高度人类同源性。具有高度人类同源性的此类抗体分子可以包括包含原生非人类抗体的VH和VL结构域的抗体，所述原生非人类抗体与人类种系序列展现足够高的序列同一性％。在某些实施方案中，抗体分子是非人类抗体的人源化或种系化变体。
在某些实施方案中，本文所描述的组合的抗体分子可以源自骆驼科。源自骆驼科的抗体可以是仅重链抗体，亦即，VHH抗体，或可以是常规异源四聚抗体。在优选实施方案中，组合的抗体分子来源于骆驼科异源四聚抗体。
举例来说，抗体分子可以选自通过如下方法获得的免疫文库，所述方法包括用所关注的靶标使骆驼科免疫的步骤。可以用靶蛋白或其多肽片段，或用表达蛋白质或其多肽片段的mRNA分子或cDNA分子使骆驼科免疫。用于在骆驼科物种中产生抗体以及从骆驼科免疫文库中选择针对优选靶标的抗体的方法在例如国际专利申请号WO2010/001251中描述，其以引用的方式并入本文中。
在某些实施方案中，抗体分子可以源自骆驼科，这是因为其包含获自骆驼科物种的VH结构域或VL结构域的至少一个高变(HV)环或互补决定区。特别地，抗体分子可以包含通过用例如IL-4Rα和IL-5对远交系骆驼科，例如美洲驼进行主动免疫而获得的VH和/或VL结构域或其CDR。
术语“获自”在这个情形中意味着在抗体分子的HV或CDR体现了最初由骆驼科免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列(或其微小变体)的意义上的结构关系。然而，这不一定意味着就用于制备抗体分子的生产过程来说的特定关系。
源自骆驼科的抗体分子可以来源于任何骆驼科物种，尤其包括美洲驼、单峰驼、羊驼、骆马、原驼或骆驼。
包含源自骆驼科的VH和VL结构域或其CDR的抗体分子通常是重组表达的多肽，并且可以是嵌合多肽。术语“嵌合多肽”是指通过本来不相连出现的两个或更多个肽片段的毗连而创造的人工(非天然存在的)多肽。在这个定义内包括通过两个或更多个物种(例如骆驼科和人类)编码的肽片段的毗连而创造的“物种”嵌合多肽。
在某些实施方案中，整个VH结构域和/或整个VL结构域可以获自骆驼科物种。源自骆驼科的VH结构域和/或源自骆驼科的VL结构域然后可以经受蛋白质工程改造，其中将一个或多个氨基酸取代、插入或缺失引入骆驼科氨基酸序列中。这些工程改造的变化优选包括相对于骆驼科序列的氨基酸取代。此类变化包括“人源化”或“种系化”，其中骆驼科编码的VH或VL结构域中的一个或多个氨基酸残基由来自同源人类编码的VH或VL结构域的等同残基置换。
通过用例如IL-4Rα或IL-5对骆驼科(例如，美洲驼)进行主动免疫而获得的分离的骆驼科VH和VL结构域可以用作工程改造用于本文所描述的组合中的抗体分子的基础。从完整骆驼科VH和VL结构域开始，工程改造脱离起始骆驼科序列的一个或多个氨基酸取代、插入或缺失是可能的。在某些实施方案中，此类取代、插入或缺失可以存在于VH结构域和/或VL结构域的构架区中。
在其它实施方案中，提供了“嵌合”抗体分子，其包含源自骆驼科的VH和VL结构域(或其工程改造的变体)和来自非骆驼科抗体的一个或多个恒定结构域，例如，人类编码的恒定结构域(或其工程改造的变体)。在此类实施方案中，优选的是，VH结构域和VL结构域两者均获自相同骆驼科物种，例如，VH和VL两者均可以来自大羊驼(Lama glama)或VH和VL两者均可以来自小羊驼(Lama pacos)(在引入工程改造的氨基酸序列变异之前)。在此类实施方案中，VH和VL结构域两者均可以来源于单一动物，特别是已经用所关注的抗原主动免疫的单一动物。
作为骆驼科VH和/或VL结构域的初级氨基酸序列中的工程改造变化的替代方案，可以将个别源自骆驼科的高变环或CDR或其组合从骆驼科VH/VL结构域中分离并且通过CDR移植而转移至替代性(即，非骆驼科)构架，例如人类VH/VL构架中。
在非限制性实施方案中，组合的抗体分子可以包含CH1结构域和/或CL结构域(分别来自重链和轻链)，其氨基酸序列是完全或基本上人类的。对于意图用于人类治疗用途的抗体分子，典型的是，抗体的整个恒定区或其至少一部分具有完全或基本上人类氨基酸序列。因此，CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域和CL结构域(和CH4结构域，如果存在的话)中的一者或多者或任何组合关于其氨基酸序列可以是完全或基本上人类的。CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域和/或CL结构域(和/或CH4结构域，如果存在的话)可以来源于人类抗体，优选人类IgG抗体，更优选人类IgG1抗体亚型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
有利地，CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域和CL结构域(和CH4结构域，如果存在的话)可以全部具有完全或基本上人类氨基酸序列。在人源化或嵌合抗体或抗体片段的恒定区的情形中，术语“基本上人类”是指与人类恒定区至少90％、或至少92％、或至少95％、或至少97％、或至少99％的氨基酸序列同一性。术语“人类氨基酸序列”在这个情形中是指由人类免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列，所述人类免疫球蛋白基因包括种系、重排和体细胞突变的基因。本发明还涵盖包含“人类”序列的恒定结构域的多肽，所述恒定结构域已经关于人类序列通过一个或多个氨基酸添加、缺失或取代而改变，但明确需要存在“完全人类”铰链区的那些实施方案除外。
Fc区的修饰
组合的抗体分子在重链和/或轻链的恒定区内，特别是在Fc区内可以具有一个或多个氨基酸取代、插入或缺失。氨基酸取代可以使得所取代的氨基酸由不同的天然存在的氨基酸或由非天然或经过修饰的氨基酸置换。还允许进行其它结构修饰，例如，糖基化模式的变化(例如，通过N-连接或O-连接的糖基化位点的添加或缺失)。
可以在Fc区内修饰组合的抗体分子以增加对新生儿受体FcRn的结合亲和力。可以在酸性pH值(例如，约pH 5.5至约pH 6.0)下可测得增加的结合亲和力。还可以在中性pH值(例如，约pH 6.9至约pH 7.4)下可测得增加的结合亲和力。“增加的结合亲和力”意指相对于未修饰的Fc区，对FcRn的结合亲和力增加。通常，未修饰的Fc区将具有人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的野生型氨基酸序列。在此类实施方案中，将相对于野生型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4对FcRn的结合亲和力来测量具有经过修饰的Fc区的抗体分子的增加的FcRn结合亲和力。
在优选实施方案中，可以用不同氨基酸取代Fc区内的一个或多个氨基酸残基以增加与FcRn的结合。已经报道了增加FcRn结合，从而改善抗体药物动力学的若干Fc取代。此类取代在例如Zalevsky等(2010)Nat.Biotechnol.28(2):157-9；Hinton等(2006)JImmunol.176:346-356；Yeung等(2009)J Immunol.182:7663-7671；Presta LG.(2008)Curr.Op.Immunol.20:460-470；以及Vaccaro等(2005)Nat.Biotechnol.23(10):1283-88中报道，其内容以全文并入本文中。
在优选实施方案中，本文所描述的组合的抗体分子中的一者或多者包含经过修饰的人类IgG Fc结构域，所述结构域包含或由氨基酸取代H433K和N434F组成，其中Fc结构域编号是根据EU编号。在另一个优选实施方案中，本文所描述的组合的抗体分子中的一者或多者包含经过修饰的人类IgG Fc结构域，所述结构域包含或由氨基酸取代M252Y、S254T、T256E、H433K和N434F组成，其中Fc结构域编号是根据EU编号。
在某些实施方案中，组合的抗体分子，例如IL-4Rα和/或IL-5抗体分子，包含经过修饰的人类IgG Fc结构域，所述结构域相对于对应的野生型IgG序列由至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多12个、至多15个、至多20个取代组成。
还可以修饰抗体分子以形成包含缀合至细胞毒性剂的抗体的免疫缀合物，所述细胞毒性剂如化学治疗剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即，放射性缀合物)。还可以工程改造Fc区以延长半衰期，如由Chan和Carter(2010)Nature Reviews:Immunology 10:301-316所描述，其以引用的方式并入本文中。
在特定实施方案中，可以工程改造Fc区以使得效应功能不存在。在某些实施方案中，本发明的抗体分子可以具有来源于天然存在的IgG同种型的Fc区，所述IgG同种型具有降低的效应功能，例如IgG4。可以进一步修饰来源于IgG4的Fc区以增加治疗效用，例如，通过活体内引入使IgG4分子之间的臂交换最小化的修饰。可以修饰来源于IgG4的Fc区以包括S228P取代。
在某些实施方案中，关于糖基化来修饰组合的抗体分子。举例来说，可以制造去糖基化抗体(即，抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化以例如增加抗体对靶抗原的亲和力。此类碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。举例来说，可以进行一个或多个氨基酸取代，以便消除一个或多个可变区构架糖基化位点，从而消除那个位点处的糖基化。此种去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。
pH值依赖性抗体
组合的抗体分子可以展现pH值依赖性抗原结合。
将结合有抗原的抗体吸收至细胞中并且运输至内体-溶酶体降解路径。能够在早期内体中从其抗原离解的抗体可以再循环回到细胞表面。将在内体区室中以高亲和力结合至其抗原的抗体通常运输至溶酶体用于降解。先前已经显示，如果抗体分子具有pH值依赖性抗原结合活性，使得其在早期内体pH值下与血浆pH值相比对其抗原具有较低结合亲和力，那么所述抗体将更有效地再循环至细胞表面。这可以延长抗体血浆半衰期并且允许同一抗体结合至多个抗原。出于此原因，有利的是，本文所描述的组合的抗体分子，例如IL-4Rα和/或IL-5抗体分子，展现pH值依赖性抗原结合。
工程改造抗体分子中的pH值依赖性抗原结合活性的方法在例如EP2275443中描述，其以引用的方式并入本文中。工程改造抗体分子中的pH值依赖性抗原结合的方法也在WO2018/206748中描述，其以引用的方式并入本文中。可以根据EP2275443或WO2018/206748中所描述的方法来修饰本文所描述的抗体分子，以使其展现pH值依赖性抗原结合。
对于本文所描述的组合的pH值依赖性抗体分子，在内体pH值下的抗原结合活性与在血浆pH值下的抗原结合活性相比较低。内体pH值通常是酸性pH值，而血浆pH值通常是中性pH值。因此，组合的抗体分子，例如，本文所描述的IL-4Rα和/或IL-5抗体分子，可以展现pH值依赖性抗原结合，以使其在酸性pH值下的抗原结合活性与在中性pH值下的抗原结合活性相比较低。内体pH值或“酸性pH值”可以是以下pH值：约pH 4.0至约pH 6.5，优选约pH 5.5至约pH 6.5，优选约pH 5.5至约pH 6.0，优选pH 5.5、pH 5.6、pH 5.7或pH 5.8。血浆pH值或“中性pH值”可以是以下pH值：约pH 6.9至约pH 8.0，优选约pH 7.0至约pH 8.0，优选约pH7.0至约pH 7.4，优选pH 7.0或pH 7.4。
在某些实施方案中，抗体分子，例如，IL-4Rα抗体分子和/或IL-5抗体分子，展现pH值依赖性结合，以使得在pH 5.8下的抗原结合活性与在pH 7.4下的抗原结合活性相比较低。pH值依赖性抗体分子，例如，IL-4Rα抗体分子和/或IL-5抗体分子，特征在于在酸性pH值或pH 5.8下抗体-抗原相互作用的离解常数(KD)高于在中性pH值或pH 7.4下抗体-抗原相互作用的离解常数(KD)。在某些实施方案中，抗体分子，例如，IL-4Rα抗体分子和/或IL-5抗体分子，展现pH值依赖性结合，以使得在pH 5.8下对抗原的KD与在pH 7.4下对抗原的KD的比率(KD(pH5.8)/KD(pH7.4))为2或更大、4或更大、6或更大、8或更大、10或更大、12或更大。
可以通过修饰抗体分子来工程改造抗体分子的pH值依赖性抗原结合活性以赋予在酸性pH值下的抗原结合能力和/或增加在中性pH值下的抗原结合能力。举例来说，可以通过用组氨酸取代抗体分子的至少一个氨基酸，或通过将至少一个组氨酸插入抗体分子中来修饰抗体分子。此种组氨酸突变(取代或插入)位点不受特别限制，并且任何位点都是可接受的，只要与突变或插入之前相比，在内体pH值(例如，pH 5.8)下的抗原结合活性低于在血浆pH值(例如，pH 7.4)下的抗原结合活性即可。
在某些实施方案中，可以通过将一个或多个取代引入可变结构域中来工程改造抗体分子，例如，IL-4Rα抗体分子和/或IL-5抗体分子，以展现pH值依赖性抗原结合。在优选实施方案中，可以通过将一个或多个取代引入抗体分子的CDR中来工程改造抗体分子，例如，IL-4Rα抗体分子和/或IL-5抗体分子，以展现pH值依赖性抗原结合。取代可以将一个或多个His残基引入可变结构域，优选重链和/或轻链CDR的一个或多个位点中，以赋予pH值依赖性抗原结合。还可以将非组氨酸取代并入本文所描述的pH值依赖性抗体的可变结构域，特别是CDR中。可以根据WO2018/206748中所描述的方法来工程改造抗体分子，例如，IL-4Rα抗体分子和/或IL-5抗体分子。
在优选实施方案中，工程改造具有上文所列举的CDR、VH和/或VL结构域序列的本文所描述的例示性IL-4Rα和IL-5抗体，以使其展现pH值依赖性抗原结合。举例来说，可以通过引入一个或多个组氨酸取代来修饰本文所列举的例示性IL-4Rα和/或IL-5抗体分子的CDR序列，以产生展现pH值依赖性抗原结合的抗体分子。
在特别优选的实施方案中，本文所描述的组合的pH值依赖性抗体，例如，IL-4Rα和/或IL-5抗体分子，包含对新生儿受体FcRn具有增加的结合亲和力的Fc结构域。本文别处描述了可以增加Fc结构域对FcRn的结合亲和力的取代并且可以将任何此类取代并入本发明组合的pH值依赖性抗体分子中。
在特别优选的实施方案中，组合包含pH值依赖性IL-4Rα抗体分子和pH值依赖性IL-5抗体分子，其中抗体分子中的一者或两者包含经过修饰的人类IgG Fc结构域，所述结构域包含或由氨基酸取代H433K和N434F组成，其中Fc结构域编号是根据EU编号。在另一个优选实施方案中，组合包含pH值依赖性IL-4Rα抗体分子和pH值依赖性IL-5抗体分子，其中抗体分子中的一者或两者包含经过修饰的人类IgG Fc结构域，所述结构域包含或由氨基酸取代M252Y、S254T、T256E、H433K和N434F组成，其中Fc结构域编号是根据EU编号。
例示性IL-4Rα抗体和IL-5抗体
如上文所提及，在优选实施方案中，组合包含结合至IL-5的抗体分子和结合至IL-4Rα的抗体分子。在此类实施方案中，组合可以抑制经由全部三种2型细胞因子IL-5、IL-4和IL-13的信号传导。
结合至人类IL-4Rα并且可以并入本文所描述的组合中的抗体分子包括包含选自以下的可变重链CDR3(HCDR3)、可变重链CDR2(HCDR2)和可变重链CDR1(HCDR1)、可变轻链CDR3(LCDR3)、可变轻链CDR2(LCDR2)和可变轻链CDR1(LCDR1)的组合的抗体分子：
(i)包含或由SEQ ID NO:3组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:2组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:1组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:12组成的LCDR3；包含或由SEQ ID NO:11组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:10组成的LCDR1；
(ii)包含或由SEQ ID NO:6组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:5组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:4组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:15组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:14组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:13组成的LCDR1；
(iii)包含或由SEQ ID NO:9组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:8组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:7组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:18组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:17组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:16组成的LCDR1；
(iv)包含或由SEQ ID NO:91组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:8组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:7组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:18组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:17组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:16组成的LCDR1；
(v)包含或由SEQ ID NO:92组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:8组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:7组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:97组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:17组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:16组成的LCDR1；
(vi)包含或由SEQ ID NO:93组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:8组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:7组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:98组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:96组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:16组成的LCDR1；
(vii)包含或由SEQ ID NO:94组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:8组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:7组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:98组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:17组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:16组成的LCDR1；和
(viii)包含或由SEQ ID NO:95组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:8组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:7组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:98组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:17组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:16组成的LCDR1。
结合至IL-4Rα并且可以并入本文所描述的组合中的抗体分子还包括包含选自以下的可变重链CDR3(HCDR3)、可变重链CDR2(HCDR2)和可变重链CDR1(HCDR1)、可变轻链CDR3(LCDR3)、可变轻链CDR2(LCDR2)和可变轻链CDR1(LCDR1)的组合的抗体分子：
(i)包含或由SEQ ID NO:27组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:26组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:25组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:36组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:35组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:34组成的LCDR1；
(ii)包含或由SEQ ID NO:30组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:29组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:28组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:39组成的LCDR3；包含或由SEQID NO:38组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:37组成的LCDR1；和
(iii)包含或由SEQ ID NO:33组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:32组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:31组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:42组成的LCDR3；包含或由SEQID NO:41组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:40组成的LCDR1。
在某些实施方案中，结合至人类IL-4Rα的抗体分子选自包含或由选自以下的可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)组成的抗体分子：
(i)包含或由SEQ ID NO:19的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VH结构域和包含或由SEQID NO:20的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VL结构域；
(ii)包含或由SEQ ID NO:21的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VH结构域和包含或由SEQID NO:22的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VL结构域；
(iii)包含或由SEQ ID NO:23的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VH结构域和包含或由SEQID NO:24的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VL结构域；
(iv)包含或由SEQ ID NO:99的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VH结构域和包含或由SEQID NO:100的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VL结构域；
(v)包含或由SEQ ID NO:101的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VH结构域和包含或由SEQID NO:102的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VL结构域；
(vi)包含或由SEQ ID NO:103的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VH结构域和包含或由SEQID NO:104的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VL结构域；
(vii)包含或由SEQ ID NO:105的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VH结构域和包含或由SEQ ID NO:106的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VL结构域；和
(viii)包含或由SEQ ID NO:107的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VH结构域和包含或由SEQ ID NO:108的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VL结构域。
在某些实施方案中，结合至IL-4Rα的抗体分子选自包含或由选自以下的可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)组成的抗体分子：
(i)包含或由SEQ ID NO:43的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VH结构域和包含或由SEQID NO:44的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VL结构域；
(ii)包含或由SEQ ID NO:45的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％的氨基酸序列组成的VH结构域和包含或由SEQ ID NO:46的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VL结构域；和
(iii)包含或由SEQ ID NO:47的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VH结构域和包含或由SEQID NO:48的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VL结构域。
结合至人类IL-5并且可以并入本文所描述的组合中的抗体分子包括包含选自以下的可变重链CDR3(HCDR3)、可变重链CDR2(HCDR2)和可变重链CDR1(HCDR1)、可变轻链CDR3(LCDR3)、可变轻链CDR2(LCDR2)和可变轻链CDR1(LCDR1)的组合的抗体分子：
(i)包含或由SEQ ID NO:51组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:50组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:49组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:54组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:53组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:52组成的LCDR1；
(ii)包含或由SEQ ID NO:51组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:50组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:49组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:57组成的LCDR3；包含或由SEQID NO:56组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:55组成的LCDR1；
(ii)包含或由SEQ ID NO:51组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:50组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:49组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:59组成的LCDR3；包含或由SEQID NO:56组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:58组成的LCDR1；
(iv)包含或由SEQ ID NO:51组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:50组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:49组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:61组成的LCDR3；包含或由SEQID NO:60组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:58组成的LCDR1；和
(v)包含或由SEQ ID NO:51组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:50组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:49组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:62组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:56组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:58组成的LCDR1。
结合至IL-5并且可以并入本文所描述的组合中的抗体分子包括包含选自以下的可变重链CDR3(HCDR3)、可变重链CDR2(HCDR2)和可变重链CDR1(HCDR1)、可变轻链CDR3(LCDR3)、可变轻链CDR2(LCDR2)和可变轻链CDR1(LCDR1)的组合的抗体分子：
(i)包含或由SEQ ID NO:72组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:71组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:70组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:74组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:38组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:73组成的LCDR1；和
(ii)包含或由SEQ ID NO:72组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:71组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:70组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:75组成的LCDR3；包含或由SEQID NO:38组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:73组成的LCDR1。
在某些实施方案中，结合至人类IL-5的抗体分子选自包含或由选自以下的可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)组成的抗体分子：
(i)包含或由SEQ ID NO:63的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VH结构域和包含或由SEQID NO:64的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VL结构域；
(ii)包含或由SEQ ID NO:63的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VH结构域和包含或由SEQID NO:65的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VL结构域；
(iii)包含或由SEQ ID NO:63的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VH结构域和包含或由SEQID NO:66的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VL结构域；
(iv)包含或由SEQ ID NO:63的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VH结构域和包含或由SEQID NO:67的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VL结构域；
(v)包含或由SEQ ID NO:63的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VH结构域和包含或由SEQID NO:68的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VL结构域；和
(vi)包含或由SEQ ID NO:63的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VH结构域和包含或由SEQID NO:69的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VL结构域。
在某些实施方案中，结合至IL-5的抗体分子选自包含或由选自以下的可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)组成的抗体分子：
(i)包含或由SEQ ID NO:76的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VH结构域和包含或由SEQID NO:77的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VL结构域；
(ii)包含或由SEQ ID NO:76的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VH结构域和包含或由SEQID NO:78的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VL结构域；和
(iii)包含或由SEQ ID NO:76的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VH结构域和包含或由SEQID NO:79的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VL结构域。
在优选实施方案中，组合包含具有结合至人类IL-4Rα的CDR、VH和/或VL序列的抗体分子和具有结合至人类IL-5的CDR、VH和/或VL序列的抗体分子。
当将特定抗体分子鉴别为包含通过参考特定氨基酸序列所定义的VH结构域或重链和也通过参考特定氨基酸序列所定义的VL结构域或轻链的组合时，那么对于所列出的每个特定VH/VL或重链/轻链组合(除非另有规定)，这个定义可以视为包括由与规定的VH/重链氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的VH结构域/重链和与规定的VL/轻链氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的VL结构域/轻链的组合而形成的抗体分子。
在每种情况下，由与规定的结构域/链氨基酸序列的序列同一性％所定义的结构域/链可以保留与规定的VH/VL结构域或重/轻链氨基酸序列中所存在的那些序列相同的CDR序列，同时在CDR区以外的构架区或其它区内展现氨基酸序列变异。
在某些实施方案中，定义为具有上文所列举的CDR序列或定义为与上文所列举的特定VH/VL结构域氨基酸序列具有特定同一性百分比的IL-4Rα和/或IL-5抗体分子是所述CDR、VH和/或VL序列所来源的抗体或其抗原结合片段的人源化、种系化或亲和力变体。
在优选实施方案中，具有上文所列举的CDR序列的例示性IL-4Rα和IL-5抗体分子展现高度人类同源性，例如是CDR序列所来源的抗体或其抗原结合片段的人源化或种系化变体。
在非限制性实施方案中，具有本文所描述的CDR、VH和/或VL序列的例示性IL-4Rα和IL-5抗体分子可以包含CH1结构域和/或CL结构域(分别来自重链和轻链)，其氨基酸序列是完全或基本上人类的。对于意图用于人类治疗用途的抗体分子，典型的是，抗体的整个恒定区或其至少一部分具有完全或基本上人类氨基酸序列。因此，CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域和CL结构域(和CH4结构域，如果存在的话)中的一者或多者或任何组合关于其氨基酸序列可以是完全或基本上人类的。
有利地，CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域和CL结构域(和CH4结构域，如果存在的话)可以全部具有完全或基本上人类氨基酸序列。在人源化或嵌合抗体或抗体片段的恒定区的情形中，术语“基本上人类”是指与人类恒定区至少90％、或至少92％、或至少95％、或至少97％、或至少99％的氨基酸序列同一性。术语“人类氨基酸序列”在这个情形中是指由人类免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列，所述人类免疫球蛋白基因包括种系、重排和体细胞突变的基因。本发明还涵盖包含“人类”序列的恒定结构域的多肽，所述恒定结构域已经关于人类序列通过一个或多个氨基酸添加、缺失或取代而改变，但明确需要存在“完全人类”铰链区的那些实施方案除外。本文所描述的例示性Fc区修饰中的任一者可以并入具有上文所列举的CDR和/或VH/VL结构域序列的IL-4Rα和/或IL-5抗体中。在优选实施方案中，具有上文所列举的CDR和/或VH/VL结构域序列的IL-4Rα和/或IL-5抗体包括包含或由氨基酸取代H433K和N434F组成的经过修饰的人类IgG Fc结构域，其中Fc结构域编号是根据EU编号。在优选实施方案中，具有上文所列举的CDR和/或VH/VL结构域序列的IL-4Rα和/或IL-5抗体包括包含或由氨基酸取代M252Y、S254T、T256E、H433K和N434F组成的经过修饰的人类IgG Fc结构域。
在非限制性实施方案中，可以如上文所描述来修饰具有本文所描述的CDR、VH和/或VL序列的例示性IL-4Rα和IL-5抗体分子，以使其展现pH值依赖性抗原结合。举例来说，可以修饰具有本文所描述的CDR、VH和/或VL序列的例示性IL-4Rα和IL-5抗体分子以具有pH值依赖性结合，使得在pH 5.8下的抗原结合活性与在pH 7.4下的抗原结合活性相比较低。上文所描述的用于工程改造抗体以赋予pH值依赖性抗原结合的方法可以应用于具有本文所描述的CDR、VH和/或VL序列的例示性IL-4Rα和IL-5抗体分子中的任一者。举例来说，可以通过组氨酸取代或插入来修饰可变结构域和/或CDR区以赋予pH值依赖性结合。
除非在本申请中另有规定，否则在两个氨基酸序列之间的序列同一性％可以通过比较以最佳方式比对的这两个序列来确定并且其中所比较的氨基酸序列关于参考序列可以包含添加或缺失用于在这两个序列之间进行最佳比对。同一性百分比通过以下方式计算：确定在两个序列之间氨基酸残基相同的相同位置的数目，用相同位置的这个数目除以比较窗口中位置的总数，以及用所获得的结果乘以100以获得这两个序列之间的同一性百分比。举例来说，有可能使用在网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html上可用的BLAST程序“BLAST 2序列”(Tatusova等,“Blast 2sequences-a new tool forcomparing protein and nucleotide sequences(Blast 2序列-用于比较蛋白质和核苷酸序列的新工具)”,FEMS Microbiol Lett.174:247-250)，所使用的参数是由缺省值(特别是对于参数“开放空位罚分”：5，和“扩展空位罚分”：2；所选矩阵是例如由程序提议的矩阵“BLOSUM 62”)给出的那些参数，通过程序直接计算所比较的两个序列之间的同一性百分比。
C.组合的配制
可以通过允许向有需要的受试者或患者，优选人类受试者或患者施用组合疗法的任何方式来组合或配制组合的不同拮抗剂或抗体分子。可以将组合配制成用于单次剂量施用或用于多次剂量施用。
在某些实施方案中，组合的拮抗剂或抗体分子是共同配制，即，配制成单一药物组合物的独立分子。对于共同配制拮抗剂或抗体分子的实施方案，组合或组合物适合于同时施用两种组分。可以将组合物配制成用于单次剂量施用或多次剂量施用。对于共同配制拮抗剂或抗体分子的实施方案，可以按等同量配制拮抗剂或抗体分子，例如，对于包含靶向不同细胞因子或受体的第一和第二拮抗剂或抗体分子的组合根据1:1比率。或者，可以配制拮抗剂或抗体分子以使得不同拮抗剂或抗体分子的比率不为1:1。举例来说，对于组合包含或由结合至不同靶标的第一和第二拮抗剂或抗体分子组成的实施方案，第一和第二拮抗剂或抗体分子的比率可以为2:1，任选3:1，任选4:1。或者，可以根据1:2，任选1:3，任选1:4的比率配制拮抗剂或抗体分子。
在某些实施方案中，独立地配制组合的拮抗剂或抗体分子，例如，作为个别的组合物。对于独立地配制拮抗剂或抗体分子的实施方案，有可能同时或独立施用不同组分或组合物。如果独立地施用拮抗剂或抗体分子或含有其的独立组合物，那么可以按任一次序来依序施用拮抗剂/抗体分子或组合物。举例来说，可以首先施用结合至IL-4Rα的抗体分子，继之以结合至IL-5的抗体分子，反之亦然。施用拮抗剂/抗体分子或组合物之间的间隔可以是任何适合的时间间隔。可以一次性(对于单次剂量施用)或重复(对于多次剂量施用)进行不同组合物的施用。
在拮抗剂是抗体分子的某些实施方案中，可以将组合的抗体分子组合成多特异性抗体，例如双特异性抗体。举例来说，如果组合包含结合IL-4Rα的Fab片段和结合至IL-5的Fab片段，那么可以将两个Fab片段并入单一双特异性抗体分子中，所述抗体分子具有缀合至IgG Fc部分的两个Fab区。
可以根据任何适合的双特异性/多特异性抗体形式来构造根据本发明的双特异性或多特异性抗体。举例来说，可以将组合的抗体分子并入双特异性或多特异性抗体形式中，以使得抗体以“反式”结合至不同靶标，例如，Y形抗体的每个Fab臂具有不同结合特异性的情况。在替代性实施方案中，可以将抗体分子并入双特异性或多特异性抗体形式中，以使得在“顺式”位置中结合靶标。举例来说，能够结合抗原的Fab区或可变结构域可以定位于IgGFc部分的相对末端。
双特异性或多特异性抗体可以具有原生IgG结构，所述结构具有对第一靶标具有结合特异性的两个Y形Fab臂，和对第二靶标具有结合特异性的定位于Fc结构域的C端的一个或多个额外抗原结合结构域。举例来说，在一个实施方案中，构造根据本发明的双特异性抗体以使得原生IgG结构上所存在的Fab区的两个典型抗原结合结构域结合至IL-4Rα，并且定位于Fc结构域的C端的一个或多个VHH结构域结合至IL-5。相反构型也是可能的，其中原生IgG结构上所存在的Fab区的两个典型抗原结合结构域结合至IL-5，并且Fc结构域的C端所存在的一个或多个VHH结构域结合至IL-4Rα。
或者，双特异性或多特异性抗体可以具有原生IgG结构，所述结构具有对第一靶标具有结合特异性的两个Y形Fab臂，和定位于Fc结构域的C端的对第二靶标具有结合特异性的一个或多个scFv片段。举例来说，在一个实施方案中，构造根据本发明的双特异性抗体以使得原生IgG结构上所存在的Fab区的两个典型抗原结合结构域结合至IL-4Rα，并且定位于Fc结构域的C端的一个或多个scFv结构域结合至IL-5。相反构型也是可能的，其中原生IgG结构上所存在的Fab区的两个典型抗原结合结构域结合至IL-5，并且Fc结构域的C端所存在的一个或多个scFv结构域结合至IL-4Rα。在此类实施方案中，双特异性抗体可以由IgG Fc结构域的C端所存在的两个scFv结构域组成。
双特异性或多特异性抗体可以是不对称IgG抗体，以使得一个Fab区由不同抗原结合结构域，例如VHH结构域置换。举例来说，在另一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体可以类似于原生IgG结构来构造，所述原生IgG结构包含结合至IL-4Rα的抗体的一个完整臂上的Fab区和置换第二Fab区的结合至IL-5的VHH结构域。相反构型也是可能的，其中抗体的一个完整臂上的Fab区结合至IL-5并且结合至IL-4Rα的VHH结构域置换第二Fab区。
对于拮抗剂是抗体分子并且共同配制抗体分子的实施方案和/或对于作为独立的组合物提供抗体分子的实施方案和/或当以多特异性抗体形式提供抗体分子时，可以使用任何适合的药物载剂或赋形剂来配制抗体分子。用于配制供人类治疗用途的抗体的技术在本领域中是众所周知的并且例如在Wang等(2007)Journal of Pharmaceutical Sciences,96:1-26中评述，其内容以全文并入本文中。对于独立地配制抗体分子的实施方案，药物载剂或赋形剂对于不同组合物可能是不同的或是相同的。
可以用于配制组合物的药学上可接受的赋形剂包括但不限于：离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(如人血清白蛋白)、缓冲物质(如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(如硫酸鱼精蛋白)、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质(例如，羧甲基纤维素钠)、聚乙二醇、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
在某些实施方案中，配制组合物用于经由任何适合的施用途径向受试者施用，所述施用途径包括但不限于肌肉内、静脉内、皮内、腹膜内注射、皮下、硬膜外、经鼻、经口、经直肠、局部、吸入、经颊(例如，舌下)和经皮施用。对于独立地配制拮抗剂或抗体分子的实施方案，可以配制每种组合物用于经由不同途径施用。
在某些实施方案中，组合物包含一种或多种额外治疗剂。额外治疗剂可以是适合于预防或治疗慢性气道疾病的剂。可以配制一种或多种额外剂用于与组合的拮抗剂或抗体分子相比经由相同途径或经由不同途径施用。
D.双特异性IL-4Rα和IL-5抗体
如上文所论述，本文所描述的组合的抗体分子可以按多特异性抗体形式，例如双特异性抗体形式提供。在优选实施方案中，组合包含结合至IL-5的抗体分子和结合至IL-4Rα的抗体分子，这些抗体分子以双特异性抗体形式提供。
因此，根据本发明的另一个方面，本文提供了一种双特异性抗体，其包含结合至IL-4Rα的抗原结合区和结合至IL-5的抗原结合区。此种双特异性抗体在本文中称为“IL-4Rα/IL-5双特异性”抗体。上文关于独立的IL-4Rα和IL-5抗体分子所描述的所有实施方案同样适用于本发明的这另一个方面。特别地，本文所描述的双特异性抗体的“抗原结合区”可以采用本文别处所描述的抗体或抗原结合片段中的任一者的形式，包括VHH抗体。
如本文别处所描述，本发明的双特异性抗体可以根据任何适合的双特异性/多特异性抗体形式来构造。举例来说，可以构造双特异性抗体以使得在“反式”位置中(即，在分子的同一末端)或在“顺式”位置中(即，在分子的相对末端)结合靶标。
在某些实施方案中，双特异性抗体具有原生IgG结构，其中抗原结合区包含于两个Fab臂内。第一Fab臂可以对IL-4Rα展现结合特异性并且第二Fab臂可以对IL-5展现结合特异性。在替代性实施方案中，双特异性抗体具有原生IgG结构并且另外包含定位于Fc区的C端的一个或多个额外抗原结合区。在此类实施方案中，原生IgG的两个Fab臂可以结合至同一靶标，例如IL-4Rα，并且定位于Fc区的C端的一个或多个额外抗原结合区可以结合至第二靶标，例如IL-5。一个或多个额外抗原结合区可以采用任何适合的抗原结合形式，包括但不限于VHH结构域或scFv。
在一个实施方案中，本发明的IL-4Rα/IL-5双特异性抗体包含结合至IL-4Rα的Fab区和结合至IL-5的VHH结构域。在一个实施方案中，本发明的IL-4Rα/IL-5双特异性抗体包含结合至IL-5的Fab区和结合至IL-4Rα的VHH结构域。
在一个实施方案中，本发明的IL-4Rα/IL-5双特异性抗体包含结合至IL-4Rα的Fab区和结合至IL-5的scFv。在一个实施方案中，本发明的IL-4Rα/IL-5双特异性抗体包含结合至IL-5的Fab区和结合至IL-4Rα的scFv。在优选实施方案中，本发明的IL-4Rα/IL-5双特异性抗体包含或由结合至IL-4Rα的IgG抗体和结合至IL-5的一个或多个scFv组成。在此类实施方案中，IL-4Rα/IL-5双特异性抗体可以包含或由结合至IL-4Rα的IgG抗体和结合至IL-5的两个scFv片段组成。结合至IL-5的一个或多个scFv片段优选定位于IgG抗体的Fc区的C端，即，与结合至IL-4Rα的两个Fab臂相对的Fc区的末端。
本发明的双特异性抗体可以构造成不对称IgG抗体，其中一个Fab区(或Fab臂)由不同抗原结合区或结构域，例如VHH结构域置换。在一个实施方案中，IL-4Rα/IL-5双特异性抗体类似于原生IgG结构来构造，其包含结合至IL-4Rα的抗体的一个完整臂上的Fab区和结合至IL-5的置换第二Fab区的VHH结构域。相反构型也是可能的，其中抗体的一个完整臂上的Fab区结合至IL-5，并且置换第二Fab区的VHH结构域结合至IL-4Rα。
本发明，即，根据本文所描述的形式中的任一者构造的IL-4Rα/IL-5双特异性抗体可以包含结合至人类IL-4R的抗原结合区，其中抗原结合区包含可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)，其中VH和VL结构域包含选自由以下组成的组的CDR序列：
(i)包含或由SEQ ID NO:3组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:2组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:1组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:12组成的LCDR3；包含或由SEQ ID NO:11组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:10组成的LCDR1；
(ii)包含或由SEQ ID NO:6组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:5组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:4组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:15组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:14组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:13组成的LCDR1；
(iii)包含或由SEQ ID NO:9组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:8组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:7组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:18组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:17组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:16组成的LCDR1；
(iv)包含或由SEQ ID NO:91组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:8组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:7组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:18组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:17组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:16组成的LCDR1；
(v)包含或由SEQ ID NO:92组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:8组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:7组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:97组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:17组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:16组成的LCDR1；
(vi)包含或由SEQ ID NO:93组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:8组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:7组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:98组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:96组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:16组成的LCDR1；
(vii)包含或由SEQ ID NO:94组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:8组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:7组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:98组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:17组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:16组成的LCDR1；和
(viii)包含或由SEQ ID NO:95组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:8组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:7组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:98组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:17组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:16组成的LCDR1。
本发明的IL-4Rα/IL-5双特异性抗体可以包含结合至IL-4R的抗原结合区，其中抗原结合区包含可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)，其中VH和VL结构域包含选自由以下组成的组的CDR序列：
(i)包含或由SEQ ID NO:27组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:26组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:25组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:36组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:35组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:34组成的LCDR1；
(ii)包含或由SEQ ID NO:30组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:29组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:28组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:39组成的LCDR3；包含或由SEQID NO:38组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:37组成的LCDR1；和
(iii)包含或由SEQ ID NO:33组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:32组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:31组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:42组成的LCDR3；包含或由SEQID NO:41组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:40组成的LCDR1。
结合至人类IL-4Rα的抗原结合区可以包含选自由以下组成的组的可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)：
(i)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列的VL结构域；
(ii)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列的VL结构域；
(iii)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列的VL结构域；
(iv)包含或由SEQ ID NO:99的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VH结构域和包含或由SEQID NO:100的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VL结构域；
(v)包含或由SEQ ID NO:101的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VH结构域和包含或由SEQID NO:102的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VL结构域；
(vi)包含或由SEQ ID NO:103的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VH结构域和包含或由SEQID NO:104的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VL结构域；
(vii)包含或由SEQ ID NO:105的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VH结构域和包含或由SEQ ID NO:106的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VL结构域；和
(viii)包含或由SEQ ID NO:107的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VH结构域和包含或由SEQ ID NO:108的氨基酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的VL结构域。
结合至IL-4Rα的抗原结合区可以包含选自由以下组成的组的可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)：
(i)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域；
(ii)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域；和
(iii)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域。
本发明的IL-4Rα/IL-5双特异性抗体可以包含结合至人类IL-5的抗原结合区，其中抗原结合区包含可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)，其中VH和VL结构域包含选自由以下组成的组的CDR序列：
(i)包含或由SEQ ID NO:51组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:50组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:49组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:54组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:53组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:52组成的LCDR1；
(ii)包含或由SEQ ID NO:51组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:50组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:49组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:57组成的LCDR3；包含或由SEQID NO:56组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:55组成的LCDR1；
(ii)包含或由SEQ ID NO:51组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:50组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:49组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:59组成的LCDR3；包含或由SEQID NO:56组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:58组成的LCDR1；
(iv)包含或由SEQ ID NO:51组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:50组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:49组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:61组成的LCDR3；包含或由SEQID NO:60组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:58组成的LCDR1；和
(v)包含或由SEQ ID NO:51组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:50组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:49组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:62组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:56组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:58组成的LCDR1。
本发明的IL-4Rα/IL-5双特异性抗体可以包含结合至IL-5的抗原结合区，其中抗原结合区包含可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)，其中VH和VL结构域包含选自由以下组成的组的CDR序列：
(i)包含或由SEQ ID NO:72组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:71组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:70组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:74组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:38组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:73组成的LCDR1；和
(ii)包含或由SEQ ID NO:72组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:71组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:70组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:75组成的LCDR3；包含或由SEQID NO:38组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:73组成的LCDR1。
结合至人类IL-5的抗原结合区可以包含选自由以下组成的组的可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)：
(i)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域；
(ii)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域；
(iii)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域；
(iv)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域；
(v)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域；和
(vi)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域。
结合至IL-5的抗原结合区可以包含选自由以下组成的组的可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)：
(i)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域；
(ii)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域；和
(iii)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域。
在每种情况下，由与规定的结构域/链氨基酸序列的序列同一性％所定义的结构域/链可以保留与规定的VH/VL结构域或重/轻链氨基酸序列中所存在的那些CDR序列相同的CDR序列，同时在CDR区以外的构架区或其它区内展现氨基酸序列变异。
在优选实施方案中，本发明的IL-4Rα/IL-5双特异性抗体可以包含结合至IL-4Rα的抗原结合区和结合至IL-5的抗原结合区，其中结合至IL-4Rα的抗原结合区包含第一可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)配对并且结合至IL-5的抗原结合区包含第二可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)配对，
其中第一VH-VL结构域配对包含选自以下的CDR序列：
(i)包含或由SEQ ID NO:3组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:2组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:1组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:12组成的LCDR3；包含或由SEQ ID NO:11组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:10组成的LCDR1；
(ii)包含或由SEQ ID NO:6组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:5组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:4组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:15组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:14组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:13组成的LCDR1；和
(iii)包含或由SEQ ID NO:9组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:8组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:7组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:18组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:17组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:16组成的LCDR1；并且
其中第二VH-VL结构域配对包含选自以下的CDR序列：
(i)包含或由SEQ ID NO:51组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:50组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:49组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:54组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:53组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:52组成的LCDR1；
(ii)包含或由SEQ ID NO:51组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:50组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:49组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:57组成的LCDR3；包含或由SEQID NO:56组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:55组成的LCDR1；
(ii)包含或由SEQ ID NO:51组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:50组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:49组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:59组成的LCDR3；包含或由SEQID NO:56组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:58组成的LCDR1；
(iv)包含或由SEQ ID NO:51组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:50组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:49组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:61组成的LCDR3；包含或由SEQID NO:60组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:58组成的LCDR1；和
(v)包含或由SEQ ID NO:51组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:50组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:49组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:62组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:56组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:58组成的LCDR1。
在优选实施方案中，本发明的IL-4Rα/IL-5双特异性抗体可以包含结合至IL-4Rα的抗原结合区和结合至IL-5的抗原结合区，其中结合至IL-4Rα的抗原结合区包含第一可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)配对并且结合至IL-5的抗原结合区包含第二可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)配对，
其中第一VH-VL结构域配对选自：
(i)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域；
(ii)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域；和
(iii)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域，
并且其中第二VH-VL结构域配对选自：
(i)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域；
(ii)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域；
(iii)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域；
(iv)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域；
(v)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域；和
(vi)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域。
在优选实施方案中，本文所描述的双特异性抗体的抗原结合区展现高度人类同源性。举例来说，抗原结合区可以是CDR序列所来源的VH和/或VL结构域的人源化或种系化变体。
本发明的双特异性抗体还可以包含具有完全或基本上人类的氨基酸序列的一个或多个恒定结构域。举例来说，本发明的双特异性抗体可以包含来源于人类IgG抗体，例如人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc结构域。
如本文别处所描述，可以在Fc区内修饰具有Fc结构域的本发明的双特异性抗体以提高对新生儿受体FcRn的结合亲和力。举例来说，可以用不同氨基酸残基取代Fc区内的一个或多个氨基酸残基以增加与FcRn的结合。Fc区内的优选氨基酸取代在本文别处描述，并且同样适用于本发明的双特异性抗体。
如本文别处所描述，可以修饰本发明的双特异性抗体以具有pH值依赖性抗原结合活性。特别地，可以修饰双特异性抗体以使得在酸性pH值下的IL-4Rα和/或IL-5结合活性与在中性pH值下的结合活性相比较低。可以通过用组氨酸取代抗体分子的IL-4Rα抗原结合区和/或IL-5抗原结合区的至少一个氨基酸，或通过将至少一个组氨酸插入抗体分子的抗原结合区的一者或两者中来修饰双特异性抗体。如本文所描述，优选在重链可变结构域和/或轻链可变结构域的CDR内的一个或多个位点处引入组氨酸取代和/或插入。
E.治疗方法
如本文所描述的组合疗法和双特异性抗体用于治疗人类受试者的慢性气道疾病的方法中。
因此，本发明提供了包含(i)IL-5:IL-5R的拮抗剂和(ii)IL-4:IL-4R的拮抗剂和/或IL-13:IL-13R的拮抗剂的组合，其用于治疗人类受试者的慢性气道疾病。本发明还提供了包含结合至IL-4Rα的抗原结合区和结合至IL-5的抗原结合区的双特异性抗体，其用于治疗人类受试者的慢性气道疾病。本发明提供了IL-5:IL-5R IL-5的拮抗剂，其用于治疗人类受试者的慢性气道疾病，其中所述拮抗剂与IL-4:IL-4R的拮抗剂和/或IL-13:IL-13R的拮抗剂组合施用。本发明提供了IL-4:IL-4R的拮抗剂和/或IL-13:IL-13R的拮抗剂，其用于治疗人类受试者的慢性气道疾病，其中所述拮抗剂与IL-5:IL-5R的拮抗剂组合施用。在优选实施方案中，本发明提供了IL-5的拮抗剂，其用于治疗人类受试者的慢性气道疾病，其中所述拮抗剂与IL-4Rα的拮抗剂组合施用。在其它优选实施方案中，本发明提供了IL-4Rα的拮抗剂，其用于治疗人类受试者的慢性气道疾病，其中所述拮抗剂与IL-5的拮抗剂组合施用。在其它优选实施方案中，用于方法中的拮抗剂是抗体分子。
在又一个方面，本发明提供了一种用于治疗人类受试者的慢性气道疾病的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据本发明的第一个方面的组合或根据本发明的第二个方面的双特异性抗体。上文关于本发明的第一个方面的组合或本发明的第二个方面的双特异性抗体所描述的所有实施方案同样可适用于本文所描述的方法。
在某些实施方案中，本文所描述的方法用于治疗慢性气道疾病。如本文别处所描述，慢性气道疾病涵盖气道和肺部其它结构的任何疾病。非限制性实例包括哮喘；慢性鼻腔鼻窦炎(CRS)；免疫球蛋白G4相关疾病(IgG4-RD)；慢性阻塞性肺病(COPD)；慢性支气管炎；肺气肿；慢性血管性水肿；以杯状细胞化生为特征的疾病，包括巴瑞特氏食道症、活性嗜酸性粒细胞性食道炎、鼻息肉病、慢性鼻窦炎、查格-施特劳斯综合征、变应性支气管肺曲霉病(ABPA)、高嗜酸性粒细胞综合征；大疱性类天疱疮和囊性纤维化。
在某些实施方案中，本文所描述的方法用于治疗以增加的粘液产生为特征的慢性气道疾病。以增加的粘液产生为特征的疾病的一个实例是囊性纤维化。在其它实施方案中，本文所描述的方法用于治疗以支气管高反应性为特征的慢性气道疾病。
在优选实施方案中，本文所描述的方法用于治疗哮喘。例示性哮喘亚型包括但不限于：重度哮喘、重度难治性哮喘、轻度或中度哮喘、肥胖相关哮喘、运动诱发的哮喘、阿司匹林诱发的哮喘、特应性或变应性哮喘、嗜酸性粒细胞性哮喘、嗜中性粒细胞性哮喘、少粒细胞性或非炎性哮喘、早发性哮喘、迟发性哮喘、高II型哮喘、低II型哮喘和I型/Th17哮喘。
在优选实施方案中，本文所描述的方法用于治疗特应性或变应性哮喘。特应性或变应性哮喘是临床上如下定义的哮喘形式：与血清IgE抗体的存在和/或对常见吸入性或摄入性过敏原的(脂)蛋白呈阳性的皮肤点刺测试所定义的变应性致敏一致的疾病，所述过敏原如屋尘螨(HDM)、动物皮屑、真菌孢子、植物或树木花粉或花生(Lambrecht和Hammad(2015)同上)。绝大多数早发性哮喘病例是变应性或特应性类型。因而，本发明的方法也可以用于治疗早发性哮喘。
在其它优选实施方案中，本文所描述的方法用于治疗高II型(或II型Hi)哮喘。高II型哮喘以2型细胞因子分子标记的存在为特征。与低II型哮喘患者相比，患有高II型哮喘的受试者通常表达较高水平的IL-13和IL-5，具有较大数目的嗜酸性粒细胞和肥大细胞，并且显示更多特应性和SBM(上皮下基底膜)增厚(参见Wenzel(2012)同上和Gauthier等(2015)同上)。本发明的组合和双特异性抗体靶向多个2型细胞因子信号传导路径。因此，此处所描述的组合和双特异性抗体可以特别有效地治疗患有高II型哮喘的人类受试者。
在某些实施方案中，本文所描述的方法用于治疗重度哮喘或重度难治性哮喘。
几乎所有形式的哮喘都与病理性杯状细胞化生或GCM相关联。GCM是由在IL-4和/或IL-13和表皮生长因子受体配体影响下纤毛细胞和克拉拉细胞(Clara cell)转分化为杯状细胞而引起。因此，在某些实施方案中，本文所描述的方法通过减少杯状细胞化生而用于治疗哮喘。在此类实施方案中，与治疗前杯状细胞化生的水平相比，杯状细胞化生减少。
患有慢性气道疾病的患者，包括大多数哮喘患者，还罹患支气管高反应性(BHR)。BHR定义为对广泛多种的气道变窄刺激的敏感度增加。患有哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)的大多数患者展现此种提高的敏感度。在某些实施方案中，本文所描述的方法通过降低支气管高反应性而用于治疗慢性气道疾病。在优选实施方案中，本文所描述的方法通过降低支气管高反应性而用于治疗哮喘。在此类实施方案中，相对于治疗前支气管高反应性的水平，支气管高反应性降低。可以用支气管激发测试来评估支气管高反应性。这最常使用如醋甲胆碱或组织胺等产物。这些化学品也触发正常个体中的支气管痉挛，但具有支气管高反应性的人们具有较低临界值。
患有慢性气道疾病的患者，包括大多数哮喘患者，还展现过量粘液产生。在某些实施方案中，本文所描述的方法通过减少粘液产生而用于治疗慢性气道疾病。在优选实施方案中，本文所描述的方法通过减少粘液产生而用于治疗哮喘。在此类实施方案中，相对于治疗前粘液产生的水平，粘液产生减少。可以通过测量粘蛋白的表达和/或活性，例如muc5AC的表达和/或活性来评估粘液产生。在某些实施方案中，本文所描述的方法通过相对于治疗前的表达和/或活性降低粘蛋白的表达和/或活性而用于治疗慢性气道疾病。在某些实施方案中，本文所描述的方法通过相对于治疗前的表达和/或活性降低粘蛋白的表达和/或活性而用于治疗哮喘。
慢性气道疾病也以不良肺功能为特征。用力呼气量(FEV)是肺功能的量度，并且可以使用肺量计来评估。用力呼气量(FEV)测量在用力呼吸期间一个人可以呼出多少空气。用力肺活量(FVC)是在FEV测试期间呼出的空气总量。FEV1/FVC比率，也称为蒂弗诺-皮内利指数(Tiffeneau-Pinelli index)，是代表一个人能够在用力呼气的第一秒内呼气的肺活量占整个肺活量的比例的计算比率。FEV1/FVC比率的正常值为约70-80％。在某些实施方案中，本文所描述的方法通过改善肺功能而用于治疗慢性气道疾病。在优选实施方案中，本文所描述的方法通过改善肺功能而用于治疗哮喘。在此类实施方案中，相对于治疗前的肺功能，肺功能得到改善。在某些实施方案中，本文所描述的方法通过相对于治疗前的FEV1/FVC比率增加FEV1/FVC比率而用于治疗慢性气道疾病。在某些实施方案中，本文所描述的方法通过相对于治疗前的FEV1/FVC比率增加FEV1/FVC比率而用于治疗哮喘。
本文所描述的方法还可以用于治疗与慢性气道疾病相关联的并存疾病，例如，与哮喘相关联的并存疾病。重度哮喘与许多并存疾病相关联，所述并存疾病包括但不限于：慢性鼻窦炎；鼻息肉病；变应性鼻炎；呼吸失能；声带功能异常；焦虑和抑郁；肥胖；阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(OSAS)；胃食管反流病(GERD)；支气管扩张；变应性支气管肺曲霉病(ABPA)；和嗜酸性粒细胞性肉芽肿伴多血管炎(EGPA)(参见Porsbjerg和Menzies-Gow(2017)Respirology 22:651-661)。本文所描述的方法可以用于治疗上文所列的哮喘并存疾病中的任一者。
本文所描述的方法可以包括施用其它治疗剂。在某些实施方案中，本文所描述的方法包括施用一种或多种额外治疗剂以治疗慢性气道疾病。可以与额外治疗剂独立地、同时、依序或并行施用根据本发明的组合或双特异性抗体。
根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者可能已经接受治疗，如皮质类固醇治疗。根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者可以归类为‘皮质类固醇反应性的’或‘皮质类固醇非反应性的’。患者或受试者可以展现与慢性气道疾病相关联的一种或多种症状。在某些实施方案中，患者或受试者可以是处于医疗护理下和/或主动寻求医疗护理用于治疗慢性气道疾病的个体。
在某些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者可以是患有以高嗜酸性粒细胞增多症为特征的疾病的患者。在具有高嗜酸性粒细胞水平的患者中，无法指定靶向IL-4Rα的某些现有剂，如度匹鲁单抗，因为患者的循环嗜酸性粒细胞水平将处于不可接受的高水平。不希望受理论约束，据信使用IL-4Rα拮抗剂(例如，IL-4Rα抗体)和IL-5拮抗剂(例如，IL-5抗体)的组合治疗将适用于具有高嗜酸性粒细胞水平的患者，这是因为IL-5促进嗜酸性粒细胞增殖。因此，IL-5与IL-4Rα一起的组合抑制可以防止或减少使用IL-4Rα抗体疗法所见的嗜酸性粒细胞水平增加。
援引并入
在前面的描述中和贯穿以下实施例引用了各种公布，这些公布中的每一者以全文引用的方式并入本文中。
实施例
参考以下非限制性实施例将进一步理解本发明。
实施例1：中和IL-4Rα和IL-5单克隆抗体的产生
A.美洲驼免疫和文库构建：
用重组小鼠IL-4Rα-Fc在一个肩部和重组小鼠IL-5在另一个肩部对根据法国动物福利法户外养殖的两只美洲驼进行肌肉内免疫(R&D Systems)，并且每周加强免疫持续六周。简单地说，这两只美洲驼接受在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中缓冲并且与不完全弗氏佐剂(Incomplete Freund's Adjuvant)(Sigma-Aldrich)混合的100μg IL-4Rα-Fc和50μg IL-5持续前两周，并且接受50μg IL-4Rα-Fc和25μg IL-5持续剩余的四周。使用如先前所描述的专有SIMPLE抗体平台来产生Fab文库(参见WO2010/001251，其内容以全文并入本文中)。在最后免疫之后五天，从美洲驼收集400mL含有外周血淋巴细胞的血液，通过菲科-帕克梯度(Ficoll-Paque gradient)离心来纯化，并且用于提取总RNA。然后使用逆转录酶将总RNA转化成随机引发cDNA，并且分离编码美洲驼IgG1的VH-CH1区和VL-CL结构域(κ和λ)的基因序列并且亚克隆至噬菌粒载体pCB3中。pCB3载体允许重组抗体表达为融合至噬菌体pIII包膜蛋白的Fab片段。
为了产生结合至人类IL-4Rα和人类IL-5的重组抗体，进行平行研究。遵循与上文所描述相同的方案，用重组人类IL-4Rα-Fc和重组人类IL-5对美洲驼进行肌肉内免疫。
B.结合至IL-4Rα和IL-5的Fab的选择：
使用重组噬菌粒转化大肠杆菌菌株TG1(荷兰细菌保藏中心(NetherlandsCulture Collection of Bacteria))以产生表达Fab的噬菌体文库(每个免疫的美洲驼有一个λ和一个κ文库)。因为用偶联至片段可结晶(Fc)部分的IL-4Rα使美洲驼免疫，所以首先用无关人类Ab对表达Fc结合抗原结合片段(Fab)的噬菌体进行反选择。然后使多样性在108-109范围内的所得表达Fab的噬菌体吸附于固定化的重组生物素化IL-4Rα-Fc或IL-5上，并且如先前所描述使用胰蛋白酶洗脱(De Haard等(1999)Journal of BiologicalChemistry,274:18218-30)。进行三轮选择以富集表达IL-4Rα或IL-5特异性Fab的噬菌体。最后用所选噬菌体感染TG1大肠杆菌，并且分离个别的菌落。在低葡萄糖浓度(0.1％w/v)下使用异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(Sigma-Aldrich)诱导Fab分泌至大肠杆菌菌株TG1的周质中，并且收集含有Fab的细菌周质部分。
C.Fab筛选、表征和生产：
通过表面等离子体共振(SPR)使用Biacore 3000装置(GE Healthcare)来确定Fab与其相应小鼠或人类靶标的结合以及Fab中和所述靶标的能力。在乙酸钠缓冲液(GEHealthcare)中使用胺偶联将IL-4Rα-Fc和IL-5固定于羧甲基葡聚糖传感器芯片(CM-5)上。以30μL/min的流动速率加载含有Fab的周质提取物。经过90秒时段测量Fab离解速率。
D.单特异性Ab生产、纯化和表征：
将编码所选强效中和IL-4Rα和IL-5特异性Fab片段的VH和VL(λ或κ)结构域的cDNA分别工程改造至包含编码小鼠IgG2a(或人类IgG1)的CH1、CH2和CH3结构域的cDNA并且含有消除由Fc受体或CL(λ或κ)介导的Ab效应功能的突变的两个独立的pUPE哺乳动物表达载体中。然后如先前所描述进行所得最佳强效中和抗IL-4Rα和抗IL-5IgG2a(或IgG1)分子的生产(通过哺乳动物细胞的瞬时转染)和纯化(通过蛋白A亲和色谱法)(Basilico等(2014)Journal of Clinical Investigation 124:3172)。
所选抗体的CDR、VH和VL序列在下表3-14中示出。
Figure BDA0002724631320000631
Figure BDA0002724631320000641
Figure BDA0002724631320000651
Figure BDA0002724631320000661
Figure BDA0002724631320000671
Figure BDA0002724631320000681
Figure BDA0002724631320000691
Figure BDA0002724631320000701
Figure BDA0002724631320000711
实施例2：IL-4Rα和IL-5mAb的体外表征
测试小鼠IL-4Rα和IL-5mAb(m4RMP36B7和m5MP95G7)体外结合至其相应靶标以及抑制由IL-4Rα和IL-5信号传导介导的细胞效应的能力。
A.对IL4和IL5诱导的HT-2和TF-1细胞增殖的抑制：
在体外细胞测定中评估IL-4Rα和IL-5单特异性Ab两者的中和活性，其中小鼠IL-4和小鼠IL-5分别诱导HT-2和TF-1细胞的增殖。
在37℃与5％(v/v)CO2下在分别含有RPMI 1640(Sigma)、10％(v/v)热灭活胎牛血清(Sigma)、1X庆大霉素(Sigma)和2ng/mL人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(R&DSystems)或人类IL-2(R&D Systems)的生长培养基中培养人类TF-1细胞(成红细胞，
Figure BDA0002724631320000721
CRL-2003TM)和小鼠HT-2克隆体A5E细胞(IL-2依赖性T淋巴细胞，
Figure BDA0002724631320000722
CRL-1841TM)。测定培养基是不含对于TF-1细胞的人类GM-CSF或对于HT-2细胞的人类IL-2的生长培养基。将0.5ng/mL对于TF-1细胞的小鼠IL-5(R&D Systems)或对于HT-2细胞的小鼠IL-4(R&D Systems)添加至测定培养基中。在含有1ng对于TF-1细胞的小鼠IL-5或0.75ng对于HT-2细胞的小鼠IL-4的测定培养基中将Ab对于TF-1细胞连续稀释10倍或对于HT-2细胞连续稀释5倍。在37℃下孵育细胞1小时，随后洗涤，并且以对于TF-1细胞1.1×106个细胞/毫升或对于HT-2细胞0.2×106个细胞/毫升的最终体积再悬浮。然后将细胞添加至每个孔中，随后添加CellTiter
Figure BDA0002724631320000723
水性单溶液试剂(AQueous One Solution Reagent)(Promega)。孵育3小时后，测量吸光度。
如图1中所示，IL-4Rα(正方形)和IL-5(三角形)单特异性Ab分别强效抑制小鼠IL-4和IL-5诱导的HT-2和TF-1细胞增殖。具体地说，IL-4Rα和IL-5Ab可以分别以等于0.2nM和0.6nM的EC50阻断由小鼠IL-4和IL-5诱导的细胞增殖。
B.IL-4RαmAb和IL-5mAb分别与IL-4Rα和IL-5的结合：
图2示出了在变化的浓度(0-20μg/mL)下的mAb(IL-4RαAb、IL-5Ab或无关IgG2aAb)与固定化的靶标(IL-4Rα或IL-5)之间的相互作用的代表性表面等离子体共振(SPR)传感图。两种mAb均结合至其靶标，而无关IgG2a不结合至任一靶标。IL-4Rα和IL-5单特异性Ab分别以8E-11M和2E-12M的亲和力结合其靶标。
另外，在SPR上测试单特异性Ab与其靶标竞争的能力。图3示出了由mAb(IL-4Rα、IL-5或无关IgG2a)和其靶标(IL-4Rα或IL-5)组成的混合物与固定化的蛋白质(IL-4、IL-13Rα或IL-5Rα)之间的竞争性相互作用的代表性SPR传感图。由IL-4RαmAb和IL-4Rα组成的混合物抑制IL-4Rα与固定化的IL-4配体的结合。由IL-4RαmAb和IL-13组成的混合物抑制IL-13与固定化的IL-13Rα的结合。类似地，由IL-5mAb和IL-5组成的混合物抑制IL-5与固定化的IL-5Rα的结合。
C.通过FACS分析的对IL-4诱导的经过纯化的B细胞的MHC II类抗原的抑制：
FACS分析用于测试IL-4Rα单特异性Ab是否可以与小鼠IL-4竞争，据知所述小鼠IL-4诱导MHC II类易位至B细胞的表面。
对于FACS分析，遵循制造商的方案使用磁性活化细胞分选小鼠抗CD19微珠(Miltenyi Biotec)收集B细胞。在含有或不含IL-4(0.1ng/mL)的24孔板(Costar)中在500ng/mL的抗IL-4Rα或无关IgG2a Ab或含有或不含抑制剂的培养基对照存在下将经过纯化的B细胞(5×105个细胞/毫升)培养16小时。洗涤细胞并且在冰上与大鼠IgG2b抗鼠类FcγR单特异性Ab 2.4G2(Bioceros)一起预孵育20分钟以阻断IgG Fc受体。然后用针对MHCII类(M5/114.15.2，eBioscience)和CD19(1D3，eBioscience)的Ab将细胞染色，随后在4℃下孵育30分钟，然后洗涤。通过使用可固定的活力染料(eFluor506，eBioscience)从分析中排除死细胞。在LSR Fortessa流式细胞仪(BD Biosciences)上分析经过染色的细胞。用FlowJo 10.0.7版软件(Tree Star)进行最终分析和图形输出。
如图4中所示，B细胞上的MHC II类抗原表达在IL-4存在下相比不存在IL-4的情况显著更高。IL-4RαmAb强效抑制IL-4诱导的经过纯化的B细胞的MHC II类抗原表达。
实施例3：鼠类屋尘螨(HDM)模型中抗小鼠IL-4Rα和IL-5mAb的活体内表征
屋尘螨(HDM-尘螨属种(Dermatophagoides sp.))是全世界最常见的过敏原之一。50-85％的哮喘患者对HDM过敏。长期暴露于HDM导致粘液细胞密度增加的气道重塑和气道高反应性，这种气道高反应性在停止HDM暴露后保持升高。鼠类HDM模型是用于研究哮喘的有效活体内模型。
实验配置1：
雌性C57Bl/6J野生型小鼠获自杰克逊实验室(The Jackson Laboratory)。实验获VIB-UGent炎症研究中心(Center for Inflammation Research)的伦理委员会批准。所使用的所有小鼠都介于6-8周龄之间。使用年龄匹配组进行实验。如图5A中所示，实验设计涉及在整个致敏和激发期期间施用的Ab处理。第0天，将小鼠用异氟烷(2.5％，于空气中)轻度麻醉并且气管内接受1μg HDM(Greer Laboratories)。第6-10天，将小鼠用异氟烷(2.5％，于空气中)轻度麻醉并且每天用10μg HDM鼻内激发。第-1天、第1天、第6天、第8天和第10天，小鼠接受以下任一处理：(i)IL-4Rα单特异性Ab(m4RMP36B7)；(ii)IL-5单特异性Ab(m5MP95G7)；(iii)IL-4Rα和IL-5单特异性Ab(m4RMP36B7和m5MP95G7)的组合；或(iv)无关IgG2a Ab。第-1天和第1天代表致敏期并且第6天、第8天和第10天代表激发期。每组处理至少n＝6只小鼠。
A.在鼠类HDM哮喘模型中以组合形式注射的强效中和IL-4RαmAb和IL-5mAb减轻嗜酸性粒细胞增多症：
BAL流体的收集和分析。第14天，对小鼠施以无痛致死术。使用3×1mL含有EDTA的PBS进行支气管肺泡灌洗(BAL)至插管的气管中，并且如先前所描述通过荧光活化细胞分选(FACS)确定BAL流体的细胞组成(Deckers等(2017)Journal of Allergy and ClinicalImmunology 140(5),1364-1377；Dullaers等(2017)Journal of Allergy and ClinicalImmunology,140:76-88；Schuijs等(2015)Science,349:1106-10)。
图5B示出了接受IL-4RαmAb、IL-5mAb、IL-4Ra mAb和IL-5mAb的组合或无关IgG2aAb的小鼠的支气管肺泡灌洗流体差示细胞计数。通过FACS分析对细胞进行计数。通过IgG2a处理的HDM致敏小鼠中的过敏原激发来增加嗜酸性粒细胞计数。与用对照IgG2a Ab处理相比，在用IL-4α/IL-5单特异性Ab的组合处理后观测到嗜酸性粒细胞计数的显著减少。
实验配置2：
设计第二个实验方案以进一步测试在临床上相关的治疗设置中IL-4Rα和IL-5抗体在鼠类HDM模型中的作用。如图6中所示的实验设计与图5A中的实验配置的不同之处在于程序涉及仅在激发期期间而不在致敏期期间施用的Ab处理。因此，小鼠仅在第6天、第8天和第10天激发前4小时接受其处理(IL-4Rα单特异性Ab；IL-5单特异性Ab；IL-4Rα/IL-5单特异性Ab或无关IgG2a Ab)。小鼠接受150μg每种单特异性Ab、150μg以组合形式注射的每种单特异性抗体或150μg无关小鼠IgG2a mAb。每组处理至少n＝6只小鼠。
随后针对以下方面来评估根据这个方案处理的小鼠：BAL流体中炎性细胞的总计数(图7)；纵隔淋巴结中的细胞因子产生(图8)；血清免疫球蛋白产生(图9)；杯状细胞化生的指征(图10)；和支气管高反应性(图11)。
A.在鼠类HDM哮喘模型中以组合形式注射的强效中和IL-4RαmAb和IL-5mAb减轻嗜酸性粒细胞增多症：
BAL流体的收集和分析。第14天，对小鼠施以无痛致死术。使用3×1mL含有EDTA的PBS进行支气管肺泡灌洗(BAL)至插管的气管中，并且如先前所描述通过荧光活化细胞分选(FACS)确定BAL流体的细胞组成(Deckers等(2017)Journal of Allergy and ClinicalImmunology 140(5),1364-1377；Dullaers等(2017)Journal of Allergy and ClinicalImmunology,140:76-88；Schuijs等(2015)Science,349:1106-10)。
图7示出了如通过FACS分析，接受IL-4RαmAb、IL-5mAb、IL-4Rα/IL-5组合的mAb或无关IgG2a Ab的HDM处理小鼠的BAL差示细胞计数。在无关IgG2a Ab处理的小鼠中，气道HDM暴露使BAL流体中炎性细胞的总计数与PBS激发的小鼠相比增加。更具体地说，这增加了嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞的数目。令人感兴趣地，与用对照IgG2a Ab处理相比，在用单一疗法处理后嗜酸性粒细胞的数目显著减少。在用组合疗法处理的小鼠中可见嗜酸性粒细胞的最少数目。
B.IL-4RαmAb和IL-4Rα/IL-5mAb组合减少细胞因子产生：
体外测试IL-4Rα和IL-5mAb对由过敏原再刺激的肠系膜淋巴结(MLN)细胞产生细胞因子的影响。通过经100μm细胞筛均化器官从MLN获得单细胞悬浮液(2×106个细胞/毫升)。在96圆底板中用15μg/mL HDM离体再刺激细胞3天并且收集上清液以通过使用
Figure BDA0002724631320000761
ELISA套件(eBioscience)确定细胞因子产生。
如图8中所示，通过IgG2a处理的HDM致敏小鼠中的过敏原激发提高了过敏原再刺激的MLN细胞培养物中效应细胞因子IL-5和IL-13的体外产生。然而，在用IL-4Rα单特异性Ab和IL-4RαmAb与IL-5mAb的组合处理后显著降低这种反应，而IL-5单特异性Ab不具有显著影响。
C.IL-4RαmAb和IL-4Rα/IL-5mAb组合减少HDM特异性IgE和IgG1的产生：
从髂静脉获得血液，然后制备血清并且如先前所描述来确定HDM特异性IgG1和IgE的量(Schuijs等(2015)Science,349:1106-10)。
如图9中所示，在IgG2a Ab处理的小鼠中通过过敏原激发提高了HDM特异性IgG1和IgE的血清浓度。IL-4RαmAb和IL-4Rα/IL-5mAb组合能够显著减少过敏原诱导的IgG的这种增加。IL-4RαmAb、IL-5mAb和IL-4Rα/IL-5mAb组合能够显著减少过敏原诱导的IgE的增加。
D.IL-4Rα和IL-5mAb组合减少Muc5AC和Agr2的表达：
通过免疫染色来评估肺中的粘蛋白表达。向肺中注射PBS/OCT(1:1)溶液，在液氮中速冻并且保持于-80℃下直至进一步加工用于如先前所描述进行Muc5AC免疫荧光染色(Deckers等(2017)Journal of Allergy and Clinical Immunology 140(5),1364-1377)。
杯状细胞化生(GCM)由IL-13驱动并且以增加的Muc5AC产生为特征，Muc5AC是哮喘小鼠和人类的气道中所存在的形成凝胶的粘蛋白。在IgG2a Ab处理和HDM致敏的小鼠中，与PBS激发相比，HDM激发上调气道上皮中的Muc5AC表达(图10A)。增加的Muc5AC染色不受IL-4RαAb或IL-5Ab单一疗法所影响。然而，引人关注地，与其它HDM致敏和激发组相比，来自用IL-4RαAb/IL-5Ab的组合处理的小鼠的肺具有大大降低的Muc5AC染色强度。
为确认和定量IL-4Rα和IL-5mAb对GCM的影响，然后通过qRT-PCR在肺组织中测量Muc5ac以及GCM中所涉及的另一个IL-13/STAT6下游靶标基因Agr2的mRNA表达水平。
将肺在液氮中速冻并且保持于-80℃下直至进一步加工用于如先前所描述进行实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)(Dullaers等(2017)Journal of Allergy andClinical Immunology,140:76-88)。简单地说，通过使用TriPure分离试剂(Roche,Mannheim,Germany)获得RNA并且根据制造商的说明书分离。用转录因子高保真cDNA合成试剂盒(Roche)对RNA进行逆转录，并且通过使用具有LightCycler 480系统(Roche)的基于SYBR绿的qRT-PCR针对参考基因(Rpl13a、Hprt和Sdha)来分析样品。
如图10B中所示，通过小鼠中的HDM激发诱导了这两个基因的mRNA表达水平。单独的IL-4Rα抗体和IL-5抗体并不显著逆转Muc5ac或Agr2 mRNA水平的这种上升。然而，IL-4RαmAb和IL-5mAb的组合显著降低HDM介导的Muc5ac或Agr2 mRNA水平上升。
E.IL-4RαAb和IL-5mAb组合减小肺阻力：
支气管高反应性(BHR)是气道对少量的如毒蕈碱受体激动剂醋甲胆碱的支气管收缩剂作出反应而收缩的趋势。使用动态阻力的侵入性测量(Flexivent,Scireq)来进行肺功能分析。
在最后HDM激发之后24小时，通过使苏醒的小鼠暴露于气雾化PBS以设定基线值，继而使用超声波雾化器增加气雾化醋甲胆碱的浓度(0-400μg/kg-1)来测量非特异性气道反应性。对于动态阻力的侵入性测量，将小鼠用乌拉坦(urethane)麻醉，切开气管，并且插入18-G导管，继而用Flexivent装置(SCIREQ)进行机械通气。呼吸频率设定为120次呼吸/分钟并且潮气量是0.2mL，并且施加2mL H2O的呼气末正压。在每10秒给与标准化吸入策略持续2分钟后记录动态阻力。在施用后续剂量的醋甲胆碱之前恢复基线阻力。
如图11中所示，在对照IgG2a Ab处理的小鼠、HDM激发和致敏的小鼠中，醋甲胆碱使得气道阻力与PBS激发的HDM致敏小鼠相比增加。用IL-5抗体和IL-4Rα抗体处理并不显著降低BHR。然而，用IL-4RαmAb和IL-5mAb的组合处理的小鼠完全受到保护以免发展BHR。这些结果证实了IL-4Rα/IL-5抗体组合在治疗慢性气道疾病的基本方面的协同效应。
总而言之，这些结果显示，在HDM处理的小鼠中激发期间给与的αIL-5单特异性Ab和αIL-4Rα单特异性Ab的组合对哮喘的关键方面(包括GCM和BHR)具有协同效应。
通过使用GraphPad Prism软件7.01版和Genstat软件19版进行统计分析。对于所有实验，结果表示为平均值±平均值标准误差(SEM)并且使用单因素ANOVA测试来计算组之间的差异。对比用HDM致敏和激发并且用对照IgG2 Ab处理的小鼠组，当*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001以及****P≤0.0001时，组之间的差异视为显著的。
实施例4：IL-4Rα/IL-5双特异性抗体的产生和体外表征
使用4RMP36B7 IL-4Rα抗体和5MP95G7 IL-5抗体的序列产生IL-4Rα/IL-5双特异性抗体。修饰抗体的Fc部分以包括“杵臼”样突变，这类突变在双特异性抗体的情形中促进正确的链配对(Ridgway等(1996)Protein Engineering,Design and Selection,9:617-21)。具体地，在鼠类Fc区的CH3结构域中工程改造IL-4Rα抗体4RMP36B7以引入取代T366S、L368A和Y407V。在鼠类Fc区的CH3结构域中工程改造IL-5抗体5MP95G7以引入取代T366W。
如Godar等(2016,Scientific Reports,6:31621)所描述，共表达IL-4Rα和IL-5抗体的两条突变重链和两条轻链并且使用抗独特型VHH抗体纯化包含正确重链-轻链配对的双特异性抗体。这个纯化过程在图12中以示意图表示。
使用高分辨率光谱法确认IL-4Rα/IL-5双特异性抗体的纯度并且通过BIAcore确认这种抗体的双重靶向特性。
A.IL-4Rα/IL-5双特异性Ab与IL-4Rα和IL-5的结合：
如图13中所示，使用SPR确认IL-4Rα/IL-5Ab的双特异性特性。双特异性Ab特异性地结合至芯片固定的IL-4Rα-Fc，并且当然后添加IL-5时观测到增加的信号，这指示双特异性Ab能够同时结合至经过涂布的IL-4Rα和溶液中的IL-5(图13A)。还以相反次序进行实验并且确认如图13B中所描绘的分子的双特异性性质。
总之，这些结果显示，双重抗独特型方法允许分离纯的和功能性IL-4Rα/IL-5双特异性Ab。
实施例5：鼠类HDM模型中抗小鼠IL-4Rα/IL-5双特异性抗体的活体内表征
在上文实施例3中所描述的鼠类HDM模型中测试实施例4中所产生的IL-4Rα/IL-5双特异性抗体。实验方案如图14中所示。对小鼠进行HDM致敏和激发方案并且仅在激发期期间用Ab处理。
将IL-4Rα/IL-5双特异性Ab的活体内活性与单一疗法(IL-4Rα单特异性Ab或IL-5单特异性Ab)和组合(αIL-4Rα/αIL-5单特异性Ab)相比较。为了比较靶标的等摩尔抑制以及消除Ab总量的差异，抗体如下剂量给药：与75μg无关IgG2a Ab组合的75μg每种单特异性Ab用于测试个别Ab；以组合形式注射的75μg每种单特异性Ab；和150μg双特异性Ab。
随后针对以下方面来评估根据这个方案处理的小鼠：BAL流体中的总炎性细胞计数(图15)；纵隔淋巴结中的细胞因子产生(图16)；血清免疫球蛋白产生(图17)；杯状细胞化生的指征(图18)；和支气管高反应性(图19)。实验方案如上文实施例3中所描述来进行。
A.在鼠类HDM哮喘模型中注射的IL-4Rα/IL-5双特异性Ab减少嗜酸性粒细胞增多症：
如图15中所示，致敏小鼠中的HDM激发增加了BAL流体中嗜酸性粒细胞的数目。在接受IL-4RαAb和IL-5Ab(75μg+75μg)的组合的小鼠中显著减少嗜酸性粒细胞数目的这种增加。值得注意地，双特异性IL-4Rα/IL-5Ab(150μg)与IL-4Rα和IL-5mAb两者的组合在减轻通过过敏原激发而诱发的气道嗜酸性粒细胞增多症和淋巴细胞增多症中一样有效。
B.IL-4Rα/IL-5双特异性Ab减少细胞因子产生：
如图16中所示，在用IL-4RαAb和IL-5Ab的组合以及双特异性Ab处理后显著降低HDM诱导的MLN 2型细胞因子(IL-5和IL-13)水平。
C.IL-4Rα/IL-5双特异性Ab减少HDM特异性IgE和IgG1的产生：
如图17中所示，在用IL-4RαAb和IL-5Ab的组合以及双特异性Ab处理后还显著减少HDM特异性IgE和IgG1。
D.IL-4Rα/IL-5双特异性Ab减少Muc5AC和Agr2的表达：
为了测试和比较双特异性Ab对杯状细胞化生(GCM)的影响，在肺组织中测量Muc5ac和Agr2的mRNA表达水平。由IL-4RαAb和IL-5Ab的组合以及双特异性Ab显著减少HDM致敏和激发的小鼠中观测到的增加的Muc5ac和Agr2表达(图18)，而单独的IL-4Rα和IL-5Ab处理不具有显著影响。
E.IL-4Rα/IL-5双特异性Ab减小肺阻力：
如由醋甲胆碱诱导的支气管收缩所评估，用IL-4RαAb和IL-5Ab的组合处理以及用双特异性Ab处理同样很好地保护肺以免发生HDM诱导的BHR。如图19中所示，用IL-4RαmAb和IL-5mAb的组合以及双特异性Ab处理的小鼠完全受到保护以免发展BHR。相比之下，用单独的IL-4Rα抗体和IL-5抗体处理的HDM致敏和激发的小鼠中观测到的阻力并无显著减小。这证明了组合疗法(以共同施用个体的IL-4Rα抗体和IL-5抗体的形式或作为双特异性抗体)在治疗慢性气道疾病，特别是哮喘的基本方面的协同效应。
总而言之，这些结果显示，同时靶向IL-4Rα和IL-5的双特异性Ab当在HDM驱动的哮喘模型中激发期期间施用时有效减少所有突出的哮喘特征。
实施例6：IL-4RαmAb和IL-5mAb的体外表征
如实施例2中所描述，测试人类IL-4RαmAb和IL-5mAb(h4RMP5D1、h4RMP3B2、4RMP3D6和h5MP90A9、h5MP90D9、h5MP92B4、h5MP90C8、h5MP90E7、h5MP90G7)体外结合至其相应靶标以及抑制由IL-4Rα和IL-5信号传导介导的细胞效应的能力。修改增殖测定以使用在提供次最佳细胞增殖的浓度下的hIL-4和hIL-5。结果在下表中示出。
表15
Figure BDA0002724631320000811
表16
Figure BDA0002724631320000812
实施例7：第二IL-4Rα/IL-5双特异性抗体的产生和体外表征
使用4RMP36B7 IL-4Rα抗体和5MP95G7 IL-5抗体的序列产生第二IL-4Rα/IL-5双特异性抗体。用15或20个氨基酸的连接子(15GS＝(GGGS)3或20GS＝(GGGS)4)以单链Fv(scFv)片段形式产生5MP95G7抗体的VH-VL结构域并且将这些scFv片段中的两者经由(GGGS)3接头(15GS)附接至4RMP36B7 IgG抗体的Fc结构域的C端。此外，为了稳定scFv，引入两个突变，一个在VH95G7中(G44C)并且一个在VL97G7中(G100C)。这个第二IL-4Rα/IL-5双特异性抗体的示意图在图20中示出。
测试这个第二IL-4Rα/IL-5双特异性抗体抑制IL-5诱导的TF-1细胞增殖的能力。与IL-4Rα抗体36B7hIgG1以及IL-5抗体95G7hIgG1和95G7mIgG2a一起测试双特异性抗体。
大体上如上文实施例2中所描述来进行测定。简单地说，将固定浓度的mIL-5(R&DSystems)与5倍连续稀释的抗体(从100nM开始)一起预孵育并且添加至500.000人类TF-1细胞(成红细胞，
Figure BDA0002724631320000821
CRL-2003TM；小鼠IL-5(R&D Systems)的最终浓度0.25ng/mL)中，并且在37℃下于5％CO2中孵育细胞48小时。添加20μl CellTiter
Figure BDA0002724631320000822
水性单溶液试剂(Promega)并且在37℃下孵育细胞3小时。在A490对比A655下测量吸光度。
结果在图21和下表17中示出。
表17
Figure BDA0002724631320000823
正如预期，IL-4Ra抗体对TF-1细胞增殖无影响，而构造成人类IgG1或鼠类IgG2a抗体的95A7抗体能够抑制IL-5诱导的细胞增殖。令人感兴趣地，IL-4Rα/IL-5双特异性抗体能够以比95A7 IgG抗体高得多的效力-效力提高100倍来抑制IL-5诱导的细胞增殖。换句话说，在IL-4RαIgG抗体的Fc区的C端构造成scFv片段的95A7抗体的VH-VL结构域比在原生IgG结构中构造成Fab臂时的效力高得多。
实施例8：鼠类HDM模型中抗小鼠IL-4Rα/IL-5 IgG-scFv双特异性抗体的活体内表 征
在上文实施例3和5中所描述的鼠类HDM模型中测试上文实施例7中所描述的IL-4Rα/IL-5双特异性抗体。实验方案如图22中所示。对小鼠进行HDM致敏和激发方案并且仅在激发期期间用Ab处理。
将IL-4Rα/IL-5双特异性Ab(4Rsc5)的活体内活性与抗mIL-4Rα(36B7)和抗mIL5(95G7)的组合相比较。每种注射液是150μg或75μg双特异性抗体(4Rsc5)或组合(在那种情况下75μg每种抗体以达到总共150μg或36.75μg每种抗体以达到每次注射75μg的剂量)。
随后针对以下方面来评估根据这个方案处理的小鼠：BAL流体中的总嗜酸性粒细胞和淋巴细胞计数(图23)以及muc5a、spdef和agr2的表达(图24)。实验方案如上文实施例3中所描述来进行。
实施例9：工程改造人类IL-4Rα抗体
工程改造人类IL-4RαmAb-4RMP3D6以与猕猴/恒河猴IL-4Rα交叉反应。通过随机诱变使用易错PCR方法来产生4RMP3D6的变体。为此，使用GeneMorphII EZClone结构域诱变试剂盒(Agilent)。根据供应商的推荐，将突变引入4RMP3D6的VH和VK中。将突变的VH(VHm*)和VK(VKm*)进一步克隆至含有CH1和CK恒定结构域的噬菌粒载体(PCB13)中以产生突变的Fab文库。
测序证实了这个程序在每个V结构域(VH和VK)中产生约3至5个氨基酸取代。制作数个文库(VHm*/VKwt、VHwt/VKm*和VHm*/VKm*)并且用于对猕猴重组IL-4Rα(agroBioscience目录号ILR-C52H8)进行的数轮噬菌体展示选择。在3轮选择之后，选择克隆体(来自第2轮和第3轮)，并且从周质提取物产生Fab并且通过SPR测试。对于SPR，Biacore3000与用人类IL-4Rα或猕猴IL-4Rα涂布的CM5芯片组合使用。如下表18中所示来记录结合(R0)和离解(kd，s-1)。
表18
Figure BDA0002724631320000841
所选抗体的CDR、VH和VL序列在下表19-21中示出。
Figure BDA0002724631320000851
Figure BDA0002724631320000861
Figure BDA0002724631320000871
序列表
<110> 阿根思公司
<120> 细胞因子组合疗法
<130> P158919WO00
<150> GB1802487.7
<151> 2018-02-15
<160> 108
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 1
Ser Tyr Ile Met Ser
1 5
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 2
Gly Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ile Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 3
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
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1 5
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 5
Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 8
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1 5 10 15
Asp
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<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
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<213> 人工
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<223> 合成肽
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
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<213> 人工
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<223> 合成肽
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<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
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1 5
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 15
Gln Val Trp Asp Thr Ser Ala Val Val
1 5
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
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Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Ala
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<212> PRT
<213> 人工
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<223> 合成肽
<400> 17
Gly Gly Ser Arg Leu Gln Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 18
Leu Gln Asp Tyr Ser Trp Pro Leu Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 19
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ile Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ile Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ala Gly Leu Leu Arg Val Glu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 20
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Ser Ser Gly Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Asn Tyr Pro Gly Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ser
35 40 45
Leu Ile Tyr Ala Thr Ala Ser Arg His Ser Gly Val Pro Ser Arg Tyr
50 55 60
Ser Gly Ser Ile Ser Gly Asn Lys Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Glu Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu His Lys Gly Thr
85 90 95
Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 21
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Leu Arg Thr Val Val His Asp Arg Arg Leu Phe Tyr Ile
100 105 110
Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 22
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 22
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Val Ala Leu Arg Gln
1 5 10 15
Thr Ala Lys Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Ala
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Ala Asp Ser Arg Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Val Ser Gly Ala Gln Ala Glu
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Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Thr Ser Ala Val Val
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Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
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<213> 人工
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<223> 合成肽
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ser Leu Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Lys Ala Arg Gly Gly Thr Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Leu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Lys Pro Leu Tyr Asn Asn Phe Ala Gly Asp Phe Gly Ser Trp Gly
100 105 110
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<220>
<223> 合成肽
<400> 24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Gly Ser Arg Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu Thr
65 70 75 80
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Gly
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Gly
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Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Ala Ile Tyr
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Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr
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<400> 63
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Gly
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<400> 76
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Ser Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Met Ser Gly Thr Leu Gly Lys
1 5 10 15
Thr Leu Thr Ile Ser Cys Ala Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Asp Trp
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Phe Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Ser Glu Val Asn Lys Arg Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Ser Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Tyr Arg Ser Gly
85 90 95
Asn Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 78
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 78
Gln Ala Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Met Ser Gly Thr Leu Gly Lys
1 5 10 15
Thr Leu Thr Ile Ser Cys Ala Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Asp Trp
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Glu Val Asn Lys Arg Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Ser Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Ser Tyr Arg Ser Gly
85 90 95
Asn Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 79
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 79
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Leu Thr Ile Ser Cys Ala Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Asp Trp
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Phe Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Ser Glu Val Asn Lys Arg Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Ser Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Tyr Arg Ser Gly
85 90 95
Asn Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 80
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 80
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
1 5 10
<210> 81
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 81
Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 82
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 82
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
1 5
<210> 83
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 83
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr
1 5 10
<210> 84
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 84
Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
35 40 45
Cys Pro
50
<210> 85
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 85
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
1 5
<210> 86
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 86
Cys Pro Ser Cys Pro
1 5
<210> 87
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 87
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro
1 5
<210> 88
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 88
Glu Arg Lys
1
<210> 89
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 89
Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 90
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 90
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro
1 5
<210> 91
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 91
Pro Leu Tyr Ser Asn Leu Ala Gly Asp Leu Gly Ser
1 5 10
<210> 92
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 92
Pro Leu Tyr Ser Asn Leu Ala Gly Asp Phe Gly Ser
1 5 10
<210> 93
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 93
Pro Leu Tyr Asn Asn Leu Ala Gly Asp Phe Gly Ser
1 5 10
<210> 94
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 94
Pro Leu Tyr Ser Asn Phe Ala Gly Asp Phe Gly Ser
1 5 10
<210> 95
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 95
Pro Leu Tyr Asn Asn Phe Ala Gly His Phe Gly Ser
1 5 10
<210> 96
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 96
Gly Gly Ser Arg Leu Gln Ala
1 5
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 97
Leu Gln Val Tyr Ser Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 98
Gln Gln Asp Tyr Ser Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 99
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 99
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Leu Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Lys Ala Arg Gly Gly Thr Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Leu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro Leu Tyr Ser Asn Leu Ala Gly Asp Leu Gly Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 100
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 100
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Gly Ser Arg Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 101
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 101
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Leu Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Lys Ala Arg Gly Gly Thr Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro Leu Tyr Ser Asn Leu Ala Gly Asp Phe Gly Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 102
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 102
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Gly Ser Arg Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Val Tyr Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 103
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 103
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Leu Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Lys Ala Arg Gly Gly Thr Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Leu Val Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro Leu Tyr Asn Asn Leu Ala Gly Asp Phe Gly Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 104
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 104
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Gly Ser Arg Leu Gln Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Phe Thr Leu Thr Ile Gly Gly Leu Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 105
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 105
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Leu Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Lys Ala Arg Gly Gly Thr Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Leu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Lys Pro Leu Tyr Ser Asn Phe Ala Gly Asp Phe Gly Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 106
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 106
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Gly Ser Arg Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 107
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 107
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Leu Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Lys Ala Arg Gly Gly Thr Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Leu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro Leu Tyr Asn Asn Phe Ala Gly His Phe Gly Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 108
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 108
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Gly Ser Arg Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105

Claims (59)

1.一种组合，其包含：
(i)IL-5:IL-5R的拮抗剂；和
(ii)IL-4:IL-4R的拮抗剂和/或IL-13:IL-13R的拮抗剂。
2.根据权利要求1所述的组合，其包含：
(i)IL-5:IL-5R的拮抗剂；和
(ii)IL-4Rα的拮抗剂。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合，其抑制经由IL-5、IL-4和IL-13的信号传导。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合，其中(i)的所述拮抗剂是抗体分子和/或(ii)的至少一种拮抗剂是抗体分子。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合，其中(i)的所述拮抗剂是结合至IL-5，优选人类IL-5的抗体分子。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的组合，其中(ii)的所述拮抗剂是结合至IL-4Rα，优选人类IL-4Rα的抗体分子。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的组合，其中(i)的所述抗体分子和/或(ii)的所述抗体分子独立地选自由以下组成的组：抗体轻链可变结构域(VL)；抗体重链可变结构域(VH)；单链抗体(scFv)；F(ab')2片段；Fab片段；Fd片段；Fv片段；单臂(单价)抗体；通过此类抗原结合片段的组合、组装或缀合而形成的双链抗体、三链抗体、四链抗体、VHH抗体或任何抗原结合分子。
8.根据权利要求4-6中任一项所述的组合，其中(i)的所述抗体分子和/或(ii)的所述抗体分子是IgG抗体。
9.根据权利要求4-8中任一项所述的组合，其中(i)的所述抗体分子和/或(ii)的所述抗体分子是非人类抗体的人源化或种系化变体。
10.根据权利要求9所述的组合，其中所述非人类抗体源自骆驼科。
11.根据权利要求4-10中任一项所述的组合，其中(i)的所述抗体分子和/或(ii)的所述抗体分子包含人类IgG的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和/或CH3结构域。
12.根据权利要求4-11中任一项所述的组合，其中(i)的所述抗体分子和/或(ii)的所述抗体分子与人类IgG，优选IgG1展现高度同源性。
13.根据权利要求4-12中任一项所述的组合，其中(i)的所述抗体分子和/或(ii)的所述抗体分子包含来源于人类IgG，优选IgG1的Fc结构域。
14.根据权利要求13所述的组合，其中所述Fc结构域通过一个或多个氨基酸取代来修饰以增加对FcRn的结合亲和力。
15.根据权利要求14所述的组合，其中所述Fc结构域包含氨基酸取代：H433K和N434F。
16.根据权利要求14所述的组合，其中所述Fc结构域包含氨基酸取代：M252Y、S254T、T256E、H433K和N434F。
17.根据权利要求2-16中任一项所述的组合，其中(ii)的所述拮抗剂是结合至IL-4Rα的抗体分子，并且其中所述抗体分子包含可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)，其中所述VH和VL结构域包含选自由以下组成的组的CDR序列：
(i)包含或由SEQ ID NO:3组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:2组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:1组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:12组成的LCDR3；包含或由SEQ ID NO:11组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:10组成的LCDR1；
(ii)包含或由SEQ ID NO:6组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:5组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:4组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:15组成的LCDR3；包含或由SEQ ID NO:14组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:13组成的LCDR1；和
(iii)包含或由SEQ ID NO:9组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:8组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:7组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:18组成的LCDR3；包含或由SEQ ID NO:17组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:16组成的LCDR1。
18.根据权利要求2-16中任一项所述的组合，其中(ii)的所述拮抗剂是结合至IL-4Rα的抗体分子，并且其中所述抗体分子包含可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)，其中所述VH和VL结构域包含选自由以下组成的组的CDR序列：
(i)包含或由SEQ ID NO:27组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:26组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:25组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:36组成的LCDR3；包含或由SEQ ID NO:35组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:34组成的LCDR1；
(ii)包含或由SEQ ID NO:30组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:29组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:28组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:39组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:38组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:37组成的LCDR1；和
(iii)包含或由SEQ ID NO:33组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:32组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:31组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:42组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:41组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:40组成的LCDR1。
19.根据权利要求2-18中任一项所述的组合，其中(ii)的所述拮抗剂是结合至IL-4Rα的抗体分子，并且其中所述抗体分子包含选自由以下组成的组的可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)：
(i)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域；
(ii)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域；和
(iii)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域。
20.根据权利要求2-18中任一项所述的组合，其中(ii)的所述拮抗剂是结合至IL-4Rα的抗体分子，并且其中所述抗体分子包含选自由以下组成的组的可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)：
(i)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域；
(ii)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域；和
(iii)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域。
21.根据权利要求2-20中任一项所述的组合，其中(i)的所述拮抗剂是结合至IL-5的抗体分子，并且其中所述抗体分子包含可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)，其中所述VH和VL结构域包含选自由以下组成的组的CDR序列：
(i)包含或由SEQ ID NO:51组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:50组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:49组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:54组成的LCDR3；包含或由SEQ ID NO:53组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:52组成的LCDR1；
(ii)包含或由SEQ ID NO:51组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:50组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:49组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:57组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:56组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:55组成的LCDR1；
(ii)包含或由SEQ ID NO:51组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:50组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:49:X组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:59组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:56组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:58组成的LCDR1；
(iv)包含或由SEQ ID NO:51组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:50组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:49组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:61组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:60组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:58组成的LCDR1；和
(v)包含或由SEQ ID NO:51组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:50组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:49组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:62组成的LCDR3；包含或由SEQ ID NO:56组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:58组成的LCDR1。
22.根据权利要求2-20中任一项所述的组合，其中(i)的所述拮抗剂是结合至IL-5的抗体分子，并且其中所述抗体分子包含可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)，其中所述VH和VL结构域包含选自由以下组成的组的CDR序列：
(i)包含或由SEQ ID NO:72组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:71组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:70组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:74组成的LCDR3；包含或由SEQ ID NO:38组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:73组成的LCDR1；和
(ii)包含或由SEQ ID NO:72组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:71组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:70组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:75组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:38组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:73组成的LCDR1。
23.根据权利要求2-22中任一项所述的组合，其中(i)的所述拮抗剂是结合至IL-5的抗体分子，并且其中所述抗体分子包含选自由以下组成的组的可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)：
(i)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域；
(ii)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域；
(iii)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域；
(iv)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域；
(v)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域；和
(vi)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域。
24.根据权利要求2-22中任一项所述的组合，其中(i)的所述拮抗剂是结合至IL-5的抗体分子，并且其中所述抗体分子包含选自由以下组成的组的可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)：
(i)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域；
(ii)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域；和
(iii)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的VL结构域。
25.根据权利要求4-24中任一项所述的组合，其中(i)的所述抗体分子和/或(ii)的所述抗体分子在酸性pH值下展现比在中性pH值下更低的抗原结合活性。
26.根据权利要求25所述的组合，其中(i)的所述抗体分子是结合至IL-5的抗体分子并且(ii)的所述抗体分子是结合至IL-4Rα的抗体分子。
27.根据权利要求25或权利要求26所述的组合，其中如由KD(在酸性pH值下)/KD(在中性pH值下)所测量，在酸性pH值下与在中性pH值下抗原结合活性的比率为至少2。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的组合，其中(i)的所述拮抗剂和(ii)的所述拮抗剂是共同配制的。
29.根据权利要求28所述的组合，其中(i)的所述拮抗剂是结合至IL-5的抗体分子并且(ii)的所述拮抗剂是结合至IL-4Rα的抗体分子。
30.根据权利要求28或权利要求29所述的组合，其中根据1:1或1:2或2:1的比率配制(i)的所述拮抗剂和(ii)的所述拮抗剂。
31.根据权利要求1-27中任一项所述的组合，其中(i)的所述拮抗剂和(ii)的所述拮抗剂是单独提供的。
32.根据权利要求31所述的组合，其中(i)的所述拮抗剂是结合至IL-5的抗体分子并且(ii)的所述拮抗剂是结合至IL-4Rα的抗体分子。
33.根据权利要求1-27中任一项所述的组合，其包含结合至IL-4Rα的抗体分子和结合至IL-5的抗体分子，其中所述抗体分子组合成多特异性抗体。
34.根据权利要求33所述的组合，其中所述结合至IL-4Rα的抗体分子和所述结合至IL-5的抗体分子组合成双特异性抗体。
35.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中所述组合包含一种或多种额外治疗剂。
36.一种双特异性抗体，其包含结合至IL-4Rα的抗原结合区和结合至IL-5的抗原结合区。
37.根据权利要求36所述的双特异性抗体，其中所述结合至IL-4Rα的抗原结合区包含第一可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)配对并且所述结合至IL-5的抗原结合区包含第二可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)配对。
38.根据权利要求37所述的双特异性抗体，其中所述抗体是具有结合至IL-4Rα的第一VH-VL配对和结合至IL-5的第二VH-VL配对的IgG抗体。
39.根据权利要求36或权利要求37所述的双特异性抗体，其中所述抗体是具有与其连接的至少一个scFv片段的IgG抗体。
40.根据权利要求39所述的双特异性抗体，其中在所述IgG内包含所述结合至IL-4Rα的抗原结合区并且在所述至少一个scFv片段内包含所述结合至IL-5的抗原结合区。
41.根据权利要求36-40中任一项所述的双特异性抗体，其中所述结合至IL-4Rα的抗原结合区包含第一可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)配对并且所述结合至IL-5的抗原结合区包含第二可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)配对，
其中所述第一VH-VL结构域配对包含选自以下的CDR序列：
(i)包含或由SEQ ID NO:3组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:2组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:1组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:12组成的LCDR3；包含或由SEQ ID NO:11组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:10组成的LCDR1；
(ii)包含或由SEQ ID NO:6组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:5组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:4组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:15组成的LCDR3；包含或由SEQ ID NO:14组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:13组成的LCDR1；和
(iii)包含或由SEQ ID NO:9组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:8组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:7组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:18组成的LCDR3；包含或由SEQ ID NO:17组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:16组成的LCDR1；并且
其中所述第二VH-VL结构域配对包含选自以下的CDR序列：
(i)包含或由SEQ ID NO:51组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:50组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:49组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:54组成的LCDR3；包含或由SEQ ID NO:53组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:52组成的LCDR1；
(ii)包含或由SEQ ID NO:51组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:50组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:49组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:57组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:56组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:55组成的LCDR1；
(ii)包含或由SEQ ID NO:51组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:50组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:49:X组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:59组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:56组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:58组成的LCDR1；
(iv)包含或由SEQ ID NO:51组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:50组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:49组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:61组成的LCDR3；包含或由SEQ IDNO:60组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:58组成的LCDR1；和
(v)包含或由SEQ ID NO:51组成的HCDR3；包含或由SEQ ID NO:50组成的HCDR2；包含或由SEQ ID NO:49组成的HCDR1；包含或由SEQ ID NO:62组成的LCDR3；包含或由SEQ ID NO:56组成的LCDR2；包含或由SEQ ID NO:58组成的LCDR1。
42.根据权利要求36-41中任一项所述的双特异性抗体，其中所述结合至IL-4Rα的抗原结合区和/或所述结合至IL-5的第二抗原结合区是非人类抗体的人源化或种系化变体或其抗原结合片段。
43.根据权利要求42所述的双特异性抗体，其中所述非人类抗体是骆驼科抗体或其抗原结合片段。
44.根据权利要求36-43中任一项所述的双特异性抗体，其中所述结合至IL-4Rα的抗原结合区和/或所述结合至IL-5的抗原结合区在酸性pH值下展现比在中性pH值下更低的抗原结合活性。
45.根据权利要求44所述的双特异性抗体，其中如由KD(在酸性pH值下)/KD(在中性pH值下)所测量，在酸性pH值下与在中性pH值下抗原结合活性的比率为至少2。
46.根据权利要求1-35中任一项所述的组合或根据权利要求36-45中任一项所述的双特异性抗体，其用于治疗人类受试者的慢性气道疾病。
47.一种用于治疗人类受试者的慢性气道疾病的IL-5:IL-5R的拮抗剂，其中所述拮抗剂与IL-4:IL-4R的拮抗剂和/或IL-13:IL-13R的拮抗剂组合施用。
48.一种用于治疗人类受试者的慢性气道疾病的IL-4:IL-4R的拮抗剂和/或IL-13:IL-13R的拮抗剂，其中所述拮抗剂与IL-5:IL-5R的拮抗剂组合施用。
49.根据权利要求47或权利要求48所使用的拮抗剂，其中所述IL5:IL-5R的拮抗剂是结合至IL-5的抗体分子并且所述IL-4:IL-4R或IL-13:IL-13R的拮抗剂是结合至IL-4Rα的抗体分子。
50.一种用于治疗人类受试者的慢性气道疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1-35中任一项所定义的组合或根据权利要求36-45中任一项所定义的双特异性抗体。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述慢性气道疾病选自：哮喘；慢性鼻腔鼻窦炎(CRS)；免疫球蛋白G4相关疾病(IgG4-RD)；慢性阻塞性肺病(COPD)；慢性支气管炎；肺气肿；慢性血管性水肿；以杯状细胞化生为特征的疾病，包括巴瑞特氏食道症；活性嗜酸性粒细胞性食道炎；鼻息肉病；慢性鼻窦炎；查格-施特劳斯综合征；变应性支气管肺曲霉病(ABPA)；高嗜酸性粒细胞综合征；大疱性类天疱疮和囊性纤维化。
52.根据权利要求50或权利要求51所述的方法，其中所述慢性气道疾病以增加的粘液产生为特征。
53.根据权利要求50-52中任一项所述的方法，其中所述慢性气道疾病以支气管高反应性为特征。
54.根据权利要求50-53中任一项所述的方法，其中所述慢性气道疾病是哮喘。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述方法用于治疗重度哮喘、重度难治性哮喘或II型哮喘。
56.根据权利要求54所述的方法，其中所述方法用于治疗特应性或变应性哮喘。
57.根据权利要求50-56中任一项所述的方法，其中杯状细胞化生(GCM)减少。
58.根据权利要求50-57中任一项所述的方法，其中支气管高反应性(BHR)降低。
59.根据权利要求50-58中任一项所述的方法，所述方法还包括施用一种或多种额外治疗剂以治疗所述慢性气道疾病。
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