CN102245638A

CN102245638A - 针对il-25的抗体

Info

Publication number: CN102245638A
Application number: CN2009801479326A
Authority: CN
Inventors: D·J·马修斯; J·巴罗; A·N·J·麦肯兹
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: British Research and Innovation Agency
Priority date: 2008-09-30
Filing date: 2009-09-30
Publication date: 2011-11-16
Anticipated expiration: 2029-09-30
Also published as: WO2010038155A2; CA2739050A1; MX2011003351A; HRP20150524T1; CY1116313T1; KR101659452B1; KR20110086013A; US8658169B2; SMT201500144B; AU2009299465B2; RS54028B1; CN102245638B; CA2739050C; BRPI0919062A2; US20110250195A1; WO2010038155A3; ES2537226T3; EP2344538B1; EP2344538A2; PT2344538E

Abstract

本发明涉及IL-25抗体VH域和包含此类抗体VH域并且与IL-25结合的靶结合成员(例如抗体)。本发明还涉及包含与IL-25结合的靶结合成员(例如抗体)的组合物，产生此类靶结合成员的方法，以及此类靶结合成员用于治疗或预防疾病和病况(例如哮喘、炎症性肠病)的用途。

Description

针对IL-25的抗体

相关申请

本申请要求2008年9月30日提交的美国临时申请号61/101,293的权益，并根据35U.S.C.§119或365要求2008年9月30日提交的英国申请号GB0817891.5的优先权。上述申请的全部教导通过引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及针对白细胞介素25(IL-25)的抗体，包括其结合片段。

背景技术

哮喘

哮喘是常见的慢性气道炎性病症。近几十年来，患者数目急剧增加，并且世界卫生组织估计世界范围内大约有300,000,000人患有哮喘。过敏性哮喘的特征在于，由多种激发性刺激物诱导的不可控的气道反应过度(AHR)，并且与2型炎性浸润物进入肺相关。

2型细胞因子在介导针对寄生的蠕虫感染的保护性免疫力、调节效应子功能例如B细胞生长和IgE分泌、诱导杯状细胞增生和相关的粘液产生、嗜曙红细胞增多、肥大细胞增多和纤维化中具有重要作用(1)。正是这些细胞因子在调节这些效应子功能中所起的关键作用，使它们成为哮喘中的主要治疗靶标。事实上，在过表达这些细胞因子的小鼠模型中，显示出哮喘的显著特征。然而令人惊奇的是，除了抑制IL-13之外，通过阻断特定的2型细胞因子来改善实验性哮喘的努力却证明是不成功的。

IL-13的抑制阻抑AHR和气道炎症，虽然其机理仍然未知(2，3)。然而，鉴于哮喘的病理生理学的复杂性以及对其病因学知之甚少，仍然不确定的是，靶向单一的途径最终是否会在治疗上取得成功。

最近证明，IL-25/IL-17E(结构上相关的IL-17细胞因子家族的成员)(8)的过表达在体内诱导2型应答(4-6)并且增强对气道激动剂的反应性(7)。Il25^-/-小鼠未能有效驱除蠕虫寄生虫；还已经表明，在来自具有哮喘的患者的样品中，无效2型应答的关键指征IL-25(9，10)上调。

炎症性肠病

炎症性肠病(IBD)是慢性炎症，其影响大肠或结肠的粘膜层，其通常包括选自下列的一种或多种疾病病况：溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。UC被认为是Th2介导的疾病，其代表性小鼠模型显示出2型细胞因子参与肠炎症的产生(16)。已经在慢性结肠炎的小鼠模型中观察到了IL-25的产生，伴随从Th1至Th2型应答的转变(17)，并且已经报道了IL-25mRNA在小鼠整个胃肠道中的高表达(18)。此外，IL-25基因位于14号染色体上的克罗恩病易感区内，虽然其与该疾病的潜在关联仍待研究(19)。此外，IBD可以包括一种或多种选自下列的疾病病况：胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、转向性结肠炎、白塞病、感染性结肠炎和未定型结肠炎。

用于治疗IBD的常规治疗法包括抗生素或甾体衍生的药物；然而目前这些在诱导或维持患者的临床缓解上是不成功的(20)。包括抗-TNF-α试剂的治疗法也是目前可以获得的，虽然其显示出差的功效(21，22)。这说明显然需要新的和更有效的用于治疗炎症性肠病的治疗法。

抗体

抗体的基本结构在本领域中是熟知的。天然存在的抗体通常具有4个多肽链：通过二硫键连接的2个相同的重链和2个相同的轻链。重链和轻链各具有恒定区和可变区(或域)，即VH和VL。可变区主要负责抗原的结合。在每个可变区内，被称作互补决定区(CDR)的三个亚区与抗原接触。每个可变域的CDR从N-末端至C-末端编号为CDR1、CDR2和CDR3。N-和-C末端与CDR之间是4个所谓的框架区，其不与抗原接触或接触极少。在下文列举的很多文献中诠释了关于抗体结构的更详细的内容，这些文献通过引用方式并入本文。

有多种方式可以产生针对靶抗原的抗体。使用杂交瘤技术产生单克隆抗体是此类方法之一。通常在小鼠或其它啮齿类动物中产生抗体。这可以是产生高亲和性抗体的有用方式。然而，对于随后要用于人类治疗中的此类抗体而言，通常需要将抗体的CDR转移进入人类框架区。这是为了避免在患者中出现人-抗-小鼠抗体应答。

Jones等人和Riechman等人(11，12)描述了CDR移植(grafting)的一般原理。即，将小鼠抗体的CDR移植进入受体人抗体的框架区内。在实践中，虽然得到的抗体将与相同的靶抗原结合，如同原始供体小鼠抗体一样，但是，移植的抗体的亲和性通常会大大降低。

此外，移植的抗体的热稳定性通常会被破坏。

试图恢复并优化原始抗体的性质的多种方式是本领域已知的。例如，框架区内包含一些与某些种系CDR相关的“典型(canonical)结构”残基，见Chothia & Lesk(13)。另外，Foote & Winter(14)已经鉴定了“微调区”残基(其中有一些也是典型结构残基)，其支持抗原结合环构象及其相对排列，因此被认为在抗体与抗原的适合性的微调中具有重要作用。此外，认为框架区内的其它残基使VH/VL界面稳定并维持该界面。因此，研究抗体人源化的技术人员通常寻找这样的人类框架：其中微调区、典型残基和界面残基(“VCI”)尽可能接近地对应于原始供体抗体中的那些残基。

然而，每种抗体都代表了对本领域技术人员的独特挑战，不能确定的是，任意一般性的已知的用于CDR移植的方法对于每种情况都是直接适用的。

本发明人和合作者(Ballantyne等人(15))报道了与IL-25结合的小鼠单克隆抗体2C3的产生，其能够在体内阻断过敏性哮喘中的气道反应过度。迄今为止，该抗体的序列是公众不可获得的。

PCT/GB2008/001365，公开日为2008年10月30日，公开号为WO2008/129263，报道了2C3抗体的序列及其在阻断气道反应过度中的用途。

发明内容

本发明涉及基于2C3序列的人源化的(CDR-移植的)抗体。在产生该抗体时，需要克服多种挑战。

本发明人首先选择了具有最大的VCI同源性的受体(recipient)人类抗体VH链，其具有22个VCI残基中的20个。然而发现，得到的抗体(“RHA”)与IL-25的结合程度显著小于2C3本身与IL-25结合的程度。虽然对该抗体进行了很多进一步的修饰，包括改变VCI指定的氨基酸和那些似乎代表罕见的体细胞突变的残基，但是对抗体结合的改善收效甚微。

在试图克服VCI同源性方法在抗体人源化中的失败时，选择了不同的人类VH框架，其具有较低的VCI残基匹配(17/22)，但是具有稍高的总体同源性。得到的抗体提供了比“RHA”抗体更高的结合，虽然其结合仍然不如母体2C3抗体高。

为了使结合最大化并且使具有激发抗体应答的风险的非人残基最少化，进行了另外的框架和CDR变化。发现得到的抗体与2C3相比，具有增强的结合，并且在体内测试对气道反应过度的抑制时发现，该抗体的效力显著高于2C3。该抗体还显示出良好的热稳定性。

本发明涉及衍生自2C3的人源化VH链。在一些方面，本发明涉及包含该链的抗体。所述抗体可以包含含有2C3 VL CDR的人源化VL链。

因此，在一个方面，本发明提供了抗体VH域，其包含SEQ ID NO：1：

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala SerVal Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Xa1 Xa2 Tyr Thr Met AsnTrp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Xa3 Gly Leu Ile Asn ProTyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu ThrXa4 Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser GluAsp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Xa5 Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr PheAla Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

其中：

Xa1是Ser或Thr；

Xa2是Gly、Asp、Ala、Ser、Val、Asn、Lys、Tyr或Met；

Xa3是Met或Ile；

Xa4是Val或Arg；并且

Xa5是Asp、Asn或Gly。

在一个方面，残基Xa1至Xa5可以选自下列组合：

Xa1是Ser或Thr；

Xa2是Gly或Asp；

Xa3是Met或Ile；

Xa4是Val或Arg；并且

Xa5是Asp、Asn或Gly。

在一些实施方式中，Xa2是Gly并且Xa5是Asp或Asn，优选是Asp。

在一些实施方式中(包括那些其中Xa2是Gly并且Xa5是Asp或Asn，优选是Asp的实施方式)，Xa1是Ser。

在一些实施方式中(包括那些其中Xa2是Gly并且Xa5是Asp或Asn，优选是Asp的实施方式)，Xa1是Thr。

在一些实施方式中(包括所有以上描述的Xa2、Xa5和Xa1的组合)，Xa3是Met。

在一些实施方式中(包括所有以上描述的Xa2、Xa5和Xa1的组合)，Xa3是Ile。

所有上述实施方式可以与Xa4的任一选项即Val或Arg组合。

上述残基的特定组合显示于下表中。为了技术人员方便起见并且为了与随附的实施例保持一致，表中列出了残基的Kabat编号。在一些情况下，这与序列表中的编号不同。

VH域可以与轻链可变域组合以提供与IL-25结合的特异性靶结合成员。

合适的轻链域是包含2C3抗体的CDR残基的轻链域。优选地，轻链是人源化的轻链，即，包含人框架区序列和2C3的CDR区。2C3的轻链域显示在SEQ ID NO：15中。CDR区1-3可以包含残基30-34，例如，可以分别包含残基24-34(SEQ ID NO：29)、50-56(SEQ ID NO：30)和89-97(SEQ IDNO：31)。

CDR残基可以在天然2C3抗体轻链中，或者可以转移至人源化轻链分子中。

虽然不包含CDR，但是残基35-38在小鼠和人轻链序列中是高度保守的，也可以被转移。

人源化VL链的实例包括SEQ ID NO：25的残基21-127。然而，也可以使用包含SEQ ID NO：15的3个CDR区的其它人类框架。另外，如下文所述，可以使用VL链的除非天然抗体引导序列之外的抗体引导序列。因此，在一个实施方式中，VL链包含SEQ ID NO：25。在另一个实施方式中，VL链可以包含抗体引导序列，例如如下文描述的与SEQ ID NO：25的残基21-127融合的抗体引导序列。

本发明还提供了本发明的靶结合成员(例如药物组合物的形式)用于治疗疾病的用途，所述疾病包括炎性病况，例如哮喘(包括过敏性哮喘)、克罗恩病和溃疡性结肠炎。

以下更详细地并且通过参考随附的实施例描述了本发明的这些方面和其它方面。

附图说明

图1显示了2c3小鼠抗体的κ轻链核苷酸序列(SEQ ID NO：16)和氨基酸序列(SEQ ID NO：15)。阴影表示CDR。

图2显示了2c3小鼠抗体的重链核苷酸序列(SEQ ID NO：18)和氨基酸序列(SEQ ID NO：17)。阴影表示CDR。

图3显示了AY393094的DNA序列(SEQ ID NO：20)和氨基酸序列(SEQID NO：19)。

图4显示了人源化2c3 RHA的DNA序列(SEQ ID NO：22)和氨基酸序列(SEQ ID NO：21)。

图5显示了AY510106的DNA序列(SEQ ID NO：24)和氨基酸序列(SEQID NO：23)。

图6显示了人源化的κ轻链2c3RKA的DNA序列(SEQ ID NO：26)和氨基酸序列(SEQ ID NO：25)。

图7A-C显示了人源化抗体2c3RHA/RKA及变体与嵌合2c3的结合活性的比较。

图8显示了在设计人源化2c3-RH2时使用的框架AJ399823的DNA序列(SEQ ID NO：28)和氨基酸序列(SEQ ID NO：27)。

图9A和B显示了特定的CDR突变对于2c3 RH2bcdef与IL-25的结合的影响。

图10显示了通过组合CDR突变D31G和G96D而对IL-25的结合产生的影响。

图11显示了2c3 RH2.5_S30T和2c3 RH2.5_R71V与IL-25的结合的比较。

图12是AHR的体内小鼠模型的程序。

图13A和B显示了给予2c3 RH2.5_R71V对于肺对乙酰甲胆碱应答的抗性的影响。

图14A和B显示了结肠炎模型中小鼠的结肠长度和体重。

具体实施方式

靶结合成员

这描述了对彼此具有结合特异性的分子对的成员。特异性结合对的成员可以是天然衍生的，或全部或部分合成产生的。分子对的一个成员在其表面上具有区域，或腔穴，它们特异性结合该分子对的另一个成员的特定的空间和极性结构并因此与其互补。因此，该对的成员具有彼此特异性结合的特性。特定结合对的类型的实例有：抗原-抗体、生物素-亲和素、激素-激素受体、受体-配体，和酶-底物。

本申请涉及抗原-抗体类型的反应。因此，本发明的靶结合成员将包含抗体分子的至少一部分，更特别是此类分子的抗原结合域的至少一部分。

一般而言，抗体的重链可变区(VH域)在抗体与抗原的结合中具有重要作用。因此，本发明的靶结合成员基于包含包括SEQ ID NO：1的VH域的那些(based around the those that comprise the VH domain that includes SEQ IDNO：1)。

在制备本发明的VH域时发现，通过改变CDR1和CDR3序列改善了2C3抗体的CDR区。因此，虽然本文描述的本发明的优选实施方式涉及SEQID NO：1的VH域，其中Xa2是Gly并且Xa5是Asp，但是本发明也涉及人源化的VH域，其具有人框架区，该人框架区带有分别为SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36的CDR1-3区。

因此，在另一个方面，本发明提供了与IL-25结合的靶结合成员，其中H1重链互补决定区(CDR)具有SEQ ID NO：34的氨基酸序列。在另一个方面，本发明提供了与IL-25结合的靶结合成员，其中H2重链互补决定区(CDR)具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列。在另一个方面，本发明提供了与IL-25结合的靶结合成员，其中H3重链互补决定区(CDR)具有SEQ IDNO：36的氨基酸序列。

在另一个方面，本发明提供了与IL-25结合的靶结合成员，其中L1轻链互补决定区(CDR)具有SEQ ID NO：29的氨基酸序列。在另一个方面，本发明提供了与IL-25结合的靶结合成员，其中L2轻链互补决定区(CDR)具有SEQ ID NO：30的氨基酸序列。在另一个方面，本发明提供了与IL-25结合的靶结合成员，其中L3轻链互补决定区(CDR)具有SEQ ID NO：31的氨基酸序列。

在另一个方面，本发明提供了与IL-25结合的靶结合成员，其中H1重链互补决定区(CDR)具有SEQ ID NO：34的氨基酸序列，H2重链CDR具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列，并且H3重链CDR具有SEQ ID NO：36的氨基酸序列。在一个实施方式中，此类靶结合成员具有氨基酸序列为SEQID NO：29的L1轻链CDR，SEQ ID NO：30的L2轻链CDR，和SEQ ID NO：31的L3轻链CDR。

此类靶结合成员的框架可以仅是人的，仅是鼠的，或根据本发明，该框架主要是人的但保留一个或多个鼠残基以增强结合亲和性。

包含所述CDR的靶结合成员由此构成本发明的另一个方面，并且可如本文的描述用于具有包含SEQ ID NO：1的VH域的靶结合成员。

一般而言，靶结合成员包含与VL域配对的VH域以提供抗体抗原结合域。在一个实施方式中，VH域与这样的VL域配对：所述VL域的CDR以及任选的任何在人和小鼠之间保守的框架残基来自于2C3抗体。

然而，轻链混乱性(promiscuity)是本领域熟知的，如本文进一步讨论，因此，VH可以与除了2C3衍生的VL之外的VL域配对。可以按照下文的讨论来选择此类VL。

可以通过参考Kabat，E.A.等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest.第4版.US Department of Health and Human Services.1987及其更新内容来确定免疫球蛋白可变域的结构和位置。可以获得多个学术上的和商业上的在线资源来查询该数据库。例如，参见Martin，A.C.R.Accessing theKabat Antibody Sequence Database by Computer PROTEINS：Structure，Function and Genetics，25(1996)，130-133以及相关的在线资源，目前的网址是http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html。

根据本发明的靶结合成员可以以实质上类似于以下描述的RHA2.5R71V抗体的亲和性例如+10％的亲和性与IL-25结合。靶结合成员一般是对于IL-25特异性的。因此，靶结合成员将不显示对于除了其(一个或多个)特异性结合伴侣之外的分子的任何显著的结合。例如，已经发现本发明的抗体所衍生自的2C3抗体不与IL-4、IL-5和IL-13交叉反应，因此避免了与参与哮喘的其它细胞因子的此类交叉反应活性，类似过程是本发明的靶结合成员的想要的特征。

通常而言，可以通过使用一组抗原进行结合测定例如ELISA来确定特异性。根据本发明的靶结合成员可以识别IL-25，但不识别IL-17家族的其它成员，尤其是IL-17A、IL-17B和IL-17C中的任一项；更优选IL-17A、IL-17B和IL-17C的所有三项。根据本发明的靶结合成员与IL-25的结合可以通过以重组IL-25的竞争来消除。

可以在合适的条件下比较不同靶结合成员的结合亲和性和中和效力。

抗体分子

这描述了免疫球蛋白，可以是天然的，或部分或全部合成产生的。已经证明完整抗体的片段可以执行结合抗原的功能。因此，提及抗体也涵盖了包含抗体结合片段的任何多肽或蛋白。

结合片段的实例有：(i)由VL、VH、CL和CH1域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1域组成的Fd片段；(iii)由单抗体的VL和VH域组成的Fv片段；(iv)由VH域组成的dAb片段(Ward，E.S.等人.，Nature 341，544-546(1989))；(v)F(ab′)2片段，其是包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vi)单链Fv分子(scFv)，其中VH域和VL域通过肽连接子连接，这允许两个域结合以形成抗原结合位点(Bird等人，Science，242，423-426，1988；Huston等人，PNAS USA，85，5879-5883，1988)；(vii)双特异性单链Fv二体(PCT/US92/09965)和(viii)″双抗体(diabody)″，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO94/13804；P.Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448，1993)。可以通过掺入连接VH和VL域的二硫桥使Fv、scFv或双抗体分子稳定(Y.Reiter等人，Nature Biotech，14，1239-1245，1996)。还可以制备小抗体(minibody)，其包含连接至CH3域的scFv(S.Hu等人，CancerRes.，56，3055-3061，1996)。

当使用双特异性抗体时，它们可以是常规的双特异性抗体，其可以通过多种方式来制备(Holliger，P.and Winter G.Current Opinion Biotechnol.4，446-449(1993))，例如通过化学方式制备或来自杂交体杂交瘤，或者可以是任意上文提及的双特异性抗体片段。可以构建不含Fc区的双抗体和scFV，仅使用可变域，潜在地降低抗-独特型反应的效应。

与双特异性完整抗体相反，双特异性双抗体也可以是特别有用的，因为它们可以容易地构建并在大肠杆菌中表达。可以通过使用噬菌体显示(WO94/13804)从文库中容易地选择具有合适的结合特异性的双抗体(和很多其它的多肽例如抗体片段)。如果双抗体的一条臂要保持恒定，例如，具有针对IL-25的特异性，则可以制备这样的文库：其中另一条臂被改变并选择具有合适特异性的抗体。可以通过knobs-into-holes工程(J.B.B.Ridgeway等人，Protein Eng.，9，616-621，1996)来制备双特异性完整抗体。

可以使用单克隆和其它抗体并使用重组DNA技术来产生保留原始抗体的特异性的其它抗体或嵌合分子。此类技术可以包括，将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补决定区(CDR)的DNA导入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区+框架区。参见，例如，EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400。

优选地，将2C3的VL链的CDR区移植到人框架区中。可以通过多种方法选择人框架区，例如通过将小鼠框架区或小鼠VL区序列与已知的人框架或VL区序列比较并选择具有最高的氨基酸相似性或同一性或具有氨基酸相似性或同一性的最高程度之一的人框架区。可以对天然人序列的框架区进行修饰以进一步优化得到的CDR移植的抗体。

虽然在本发明的优选方面，包含一对VH和VL域的抗体分子是优选的，但是基于VH或VL域序列之一的单结合域构成本发明的其它方面。已知单免疫球蛋白域，尤其是VH域，能够以特异性方式结合靶抗原。

在任一单链结合域的情况下，这些域可用于筛选互补域，所述互补域能够形成能结合IL-25的二域(two-domain)靶结合成员，如下文进一步所讨论。

本发明的抗体分子还可以包含抗体恒定区或其部分。例如，VL域可在其C末端与抗体轻链恒定域(包括人Cκ或Cλ链，优选Cκ链)连接。类似地，基于VH域的靶结合成员可以在其C末端与衍生自任意抗体同种型例如IgG、IgA、IgE和IgM和任意同种型亚类特别是IgG1和IgG4(优选IgG4)的免疫球蛋白重链的全部或一部分连接。可以使用Fc区，例如在WO99/58572中公开的Δna和Δnac。

因此，包括嵌合分子，其包含与另一种多肽融合的靶结合域或其等同物。嵌合抗体的克隆和表达的描述见EP-A-0120694和EP-A-0125023。

本发明的抗体分子的框架区还可以包括糖基化序列，其包括一个或多个糖基化位点。取决于表达靶结合成员的宿主细胞，糖基化的模式可以变化。因此，编码糖基化位点的核酸构建体可以被修饰以除掉该位点，或者可替代地，可以将此类位点导入蛋白中。例如，真核蛋白中的N-糖基化的特征在于氨基酸三元组Asn-X-Y，其中X是除了Pro之外的任意氨基酸，Y是Ser或Thr。对编码这些三元组的核苷酸序列进行的适当的替换、添加或删除将阻止碳水化合物残基在Asn侧链上的附着。改变单一核苷酸，例如选择为将Asn替换为不同的氨基酸，足以使N-糖基化位点失活。用于使蛋白中的N-糖基化位点失活的已知程序包括描述于美国专利号5,071,972和EP 276,846中的那些。

抗原-结合域

这描述了抗体分子的部分，其包含特异性结合抗原的一部分或全部并与其互补的区域。当抗原是大抗原时，抗体可能仅与抗原的特定部分结合，该部分被称作表位。可以通过一个或多个抗体可变域(例如由VH域组成的所谓的Fd抗体片段)提供抗原结合域。优选地，抗原结合域包含抗体轻链可变区(VL)的至少实质部分和抗体重链可变区(VH)的至少实质部分。

免疫球蛋白可变域的实质部分将包含至少3个CDR区，以及将它们隔开的框架区。优选地，所述部分还将包括第一和第四框架区之一或二者的至少大约50％，所述的50％是第一框架区的C-末端那50％和第四框架区的N-末端那50％。可变域的实质部分的N-末端或C-末端的另外的残基可以是那些正常情况下不与天然存在的可变域区域相连的残基。例如，通过重组DNA技术进行本发明靶结合成员的构建可以导致引入由连接子编码的N-或C-末端残基，以促进克隆或其它操作步骤。其它操作步骤包括引入连接子以将本发明的可变域连接至其它蛋白序列，包括免疫球蛋白重链、其它可变域(例如在产生双抗体时)或蛋白标记物，如下文更详细地讨论。

包含

这一般以包括的含义来使用，也就是说，允许存在一个或多个特征或成分。

分离的

这是指这样的状态：其中VH域、本发明的靶结合成员或编码此类结合成员的核酸将一般符合本发明。成员和核酸将不含或实质上不含天然与其结合的物质，例如其它多肽或核酸，所述其它多肽或核酸与其一起存在于其天然环境中，或者，当此类制备物是通过在体外或体内实施的重组DNA技术制备时，存在于它们被制备时所存在的环境中(例如细胞培养物)。

可以以稀释剂或佐剂配制靶结合成员和核酸，并且为了实际中的目的，仍然被分离——例如，如果用于包被微量滴定板以用于免疫测定，则所述成员通常将与明胶或其它载体混合；或者，当用于诊断或治疗时，将与药学上可接受的载体或稀释剂混合。靶结合成员可以是糖基化的，可以是天然糖基化的或通过异源真核细胞(例如CHO或NS0(ECACC 85110503)细胞)的系统进行糖基化，或者它们可以是(例如如果通过在原核细胞中表达来产生)非糖基化的。

靶结合成员的另外的特征

除了抗体序列之外，根据本发明的靶结合成员可以包含其它氨基酸，例如形成肽或多肽，例如折叠的结构域，或赋予分子除了与抗原结合的能力之外的其它功能性特征。本发明的靶结合成员可以携带可检测的标记物，或者可以与毒素或酶缀合(例如通过肽键或连接子)。

可检测标记物包括放射性标记物，例如131I或99Tc，可以使用抗体成像领域已知的常规化学方法将其附着至本发明的抗体。标记物还包括酶标记物，例如辣根过氧化物酶。标记物还包括化学部分，例如生物素，其可以通过与特定的相关可检测部分例如标记的亲和素的结合而被检出。

当所述另外的特征是多肽结构域或标记物时，可以通过重组技术来产生靶结合成员，即通过表达编码靶结合成员与另外的结构域的融合体的核酸来产生。

链改组

本发明的另一个方面提供了用于获得针对IL-25的抗体抗原-结合域的方法，所述方法包括：提供本发明的靶结合成员的VH域与一个或多个VL域的组合，并就针对IL-25的抗体-抗原结合域测定该VH/VL组合(一个或多个)。

所述VL域可以具有基本上如本文所示的氨基酸序列。

可以使用类似的方法：其中如本文公开的VL域的一个或多个序列变体与一个或多个VH域组合。

这可以使用如WO92/01047中公开的所谓的分等级的双组合方式通过噬菌体显示筛选法来实现，其中含有H或L链克隆的单一群落用于感染编码另一链(L或H)的完整克隆库，并使用噬菌体显示技术例如该文献中描述的那些技术来选择得到的两条链的靶结合成员。

因此，本发明提供了用于选择针对IL-25的抗体分子的方法，所述方法包括：

(a)提供VH域，其包含结合IL-25的靶结合成员，并且其包括本发明的抗体VH域；

(b)将所述VH域与多种抗体VL域组合以提供抗体分子；

(c)就与IL-25的结合筛选所述抗体分子；和

(d)选择与IL-25结合的抗体分子。

在此种方法中，可以以通过重组DNA尤其是通过噬菌体或噬菌粒DNA表达的蛋白的形式提供VH和VL域。

所述多种VL域可以是来自104种各域以上的任意项(anying from 104individual domains upwards)，例如106至108或1010个域。

抗体分子和编码此类分子的核酸可以形成本发明的另一个部分。

IL-25

Il-25，在本领域中也称作IL-17E，可以从商业渠道获得(例如R&DSystems，MN，USA)，或者可以通过参考本领域可获得的IL-25的序列来克隆或合成。鼠IL-25(NCBI蛋白NP_542767)的描述见Hurst等人，2002(下面的参考文献7)。人IL-25(NCBI蛋白Q9H293)的描述见Fort等人(下面的参考文献4)。为了产生抗体或用于免疫测定，可以使用重组IL-25的片段，尤其是那些在N-末端截短的片段。例如，商业上可获得的重组人IL-25(IL-17E)包含登记号为Q9H293的成熟蛋白序列的Tyr 33-Gly 177，商业上可获得的鼠IL-25包含小鼠IL-17E(登记号NP_542767)的残基Val 17-Ala169。

核酸和载体

在其它方面，本发明提供了分离的核酸，其包含编码根据本发明的靶结合成员、VH域或VL域的序列，本发明还提供制备本发明的靶结合成员、VH域或VL域的方法，所述方法包括在产生所述靶结合成员、VH域或VL域的条件下表达所述核酸，并进行回收。

本发明的核酸可以包含SEQ ID NO：40(对于重链而言)或SEQ ID NO：26(对于轻链而言)的序列或其相关部分(例如CDR编码区)，或者，通过例如定点诱变进行修饰以编码本发明的其它VH和VL域的这些序列的变体。另外，可以改变密码子使用，例如，以优化所述序列在需要的宿主细胞中的表达。

本发明还提供了编码本发明的靶结合成员的分离的核酸。核酸包括DNA和RNA。

根据本发明的核酸可以包括DNA或RNA，并且可以是完全或部分合成的。除非上下文另有需要，否则提及本文中的核苷酸序列包括具有指定序列的DNA分子，并且包括具有指定序列的RNA分子，其中以U替换T。

本发明还提供了载体，例如质粒、病毒、例如噬菌体或噬菌粒、粘粒、转录或表达盒形式的载体，其包含至少一种如上所述的核酸。

可以选择或构建合适的载体，其包含合适的调节序列，包括启动子序列、终止子序列、多腺苷化序列、增强子序列、标记物基因和其它序列，视需要而定。关于进一步的详细内容，参见，例如，Molecular Cloning：a LaboratoryManual：第二版，Sambrook等人.，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press。

本发明的载体还包括能够在体内感染人类细胞的病毒载体，例如腺病毒、逆转录病毒或腺相关病毒载体。此类载体可用于在人或动物受试者的细胞中表达本发明的靶结合成员，以提供靶结合成员的产生并将其递送至所述受试者。

在一个方面，编码本发明的靶结合成员的核酸将与启动子可操作地连接，以使靶结合成员在宿主细胞中表达。序列可以在其5’末端包括引导序列，以促进靶结合成员在宿主细胞中的表达和/或从宿主细胞中的分泌。多种合适的引导序列是本领域已知的，本领域普通技术人员可以根据宿主细胞进行选择。

合适的引导序列包括任意的人或其它哺乳动物免疫球蛋白引导序列，虽然也可以使用非免疫球蛋白的哺乳动物引导序列或合成的引导序列。对于表达VH域，优选可以使用人VH引导序列。对于表达VL域，优选使用人VL引导序列。

用于表达本发明的VH域的合适的引导序列是：

MGSTAILGLLLAVLQGVCA(SEQ ID NO：37)。

用于表达本发明的VL域的合适的引导序列是人或鼠VK引导序列。此类序列可以是2C3引导序列：

MRVPAQLLGLLLLWLPDTRC(SEQ ID NO：38)或人同源物，例如MDMRVPAQLLGLLLLWLPDTRC(SEQ ID NO：39)。

在随附的实施例中，我们使用了表达构建体，其包括HindIII位点和Kozak共有序列(AAGCTTGCCGCCACC，SEQ ID NO：41)，后跟编码序列，编码序列以抗体引导序列开端。这适合于在哺乳动物宿主细胞中表达抗体域。然而，可以使用其它构建体，这取决于实验员的优先选择和要表达抗体域的宿主细胞。

用于操作核酸的很多已知的技术和程序，例如用于制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA导入细胞和基因表达，以及蛋白分析，描述于CurrentProtocols in Molecular Biology，第二版，Ausubel等人编，John Wiley & Sons，1992。Sambrook等人和Ausubel等人的公开内容通过引用方式并入本文。

宿主细胞和靶结合成员的产生

另一个方面提供了以本发明的核酸(例如载体形式的核酸序列)转化的宿主细胞。

在一个实施方式中，本发明的核酸整合进入宿主细胞的基因组(例如染色体)中。可以根据标准技术，通过包括促进与基因组重组的序列来促进整合。

另一个方面提供了产生本发明的靶结合成员的方法，所述方法包括引起从编码核酸的表达。此类方法还包括在产生所述靶结合成员的条件下培养宿主细胞。

通过表达方式产生之后，可以使用任意合适的技术分离和/或纯化VH或VL域或靶结合成员，然后视需要使用它们。产生方法可以包括分离和/或纯化产物的步骤。

纯化产物之后，可以通过物理或化学方式修饰靶结合成员，例如导入保护性基团，其改变例如增加蛋白的稳定性或生物学半衰期。例如，对蛋白进行聚乙二醇化以达到此效应是本领域已知的，本发明的靶结合成员可以是聚乙二醇化的形式。

产生方法可以包括将产物配制进入组合物中，所述组合物包括至少一种另外的成分，例如药学上可接受的赋形剂。

本发明还提供了重组宿主细胞，其包括一种或多种如上文所述的核酸或载体。编码所提供的任意CDR、VH或VL域或靶结合成员的核酸本身构成本发明的一个方面，产生编码产物的方法也构成本发明的一个方面，所述方法包括从编码核酸表达它们。

用于在多种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是本领域熟知的。合适的宿主细胞包括：细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。本领域可获得的用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NS0小鼠黑素瘤细胞、YB2/0大鼠黑素瘤细胞，等等。常见的优选的细菌宿主是大肠杆菌。

在原核细胞例如大肠杆菌中表达抗体和抗体片段已经是本领域中的成熟操作。综述见例如Plückthun，A.Bio/Technology 9：545-551(1991)。作为产生靶结合成员的一种选择，本领域技术人员也可以使用在真核细胞培养物中的表达，最近的综述见例如参考文献M.E.(1993)Curr.Opinion Biotech.4：573-576；Trill J.J.等人.(1995)Curr.Opinion Biotech 6：553-560。

组合物

因此，根据本发明的和用于本发明的药物组合物，除了包括活性成分之外，还可以包括药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其它物质。此类物质应该是无毒的并且不应该干扰活性成分的功效。载体或其它物质的确切性质将取决于给药途径，可以是口服或通过注射例如静脉内注射的途径。

可以这样制备用于储存的靶结合成员的治疗性制剂：将具有需要的纯度的靶结合成员与任选的生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合(参见，例如，“Remington：The Science and Practice of Pharmacy”，第20版，2000，pub.Lippincott，Williams & Wilkins.)，其形式为冻干的粉末或水溶液。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度对受体是无毒的，包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括维C酸；低分子量(少于大约10个残基)的多肽；蛋白，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐反荷离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂，例如Tween、Pluronics或聚乙二醇(PEG)。

用于体内给药的靶结合成员必须是无菌的。这可以通过在冻干和复原之前或之后经由无菌滤膜过滤来容易地实现。靶结合成员通常将以冻干形式或在溶液中储存。

用于口服给药的药物组合物可以是药片、胶囊、粉末或液体形式。药片可以包括固体载体，例如明胶或佐剂。液体药物组合物一般包含液体载体，例如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐溶液、葡萄糖或其它糖溶液或二醇类例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。

对于静脉内注射，或在患处注射，活性成分将是肠胃外可接受的水溶液形式，其为无热原的并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员完全能够使用例如等渗介质例如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液来制备合适的溶液。视需要可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。

本发明的治疗性用途

本发明首次证明了：抗IL-25的抗体有效预防或减少“体内的气道反应过度”这一哮喘的主要症状。因此，在一个方面，本发明提供了预防或减少需要治疗的受试者(例如人)中的气道反应过度的方法，其包括向所述受试者给予结合IL-25的靶结合成员，尤其是抗体分子。在另一个方面，本发明提供了预防、减少或治疗有治疗需要的受试者中的哮喘的方法，其包括向所述受试者给予结合IL-25的靶结合成员，尤其是抗体分子。哮喘包括过敏性哮喘。

可以使用根据本发明的靶结合成员(包括其组合物)来实施以上方法，其用于与IL-25结合，并优选拮抗IL-25的作用，在多种涉及IL-25的疾病和病症中具有治疗性潜力。除了哮喘以外，此类疾病包括其它与炎症相关的病况，例如克罗恩病和溃疡性结肠炎。还可以使用其它与IL-25结合的靶结合成员(包括其组合物)来实施所述方法，它们可以按照以下随附的实施例中的描述来获得。

根据本发明的靶结合成员(包括其组合物)可用于人类或动物受试者中的治疗(包括预防性治疗)或诊断方法。此类治疗或诊断方法(其可以包括预防性治疗)可以包括向所述受试者给予有效量的本发明的靶结合成员。以下进一步讨论了示例性疾病和病症。

还提供了本发明的靶结合成员(包括其组合物)在制备用于给予人类或动物受试者的药物中的用途。

抗-IL-25靶结合成员可用于其中以提供治疗性益处的临床适应症包括IL-25在其中具有病理性后果的任意病况。因此一般而言，本发明的靶结合成员可用于治疗任何与不想要的Th2应答或2型应答相关的病况。例如，本发明的靶结合成员可用于治疗过敏症和哮喘，尤其是哮喘。

可以通过注射(例如静脉内)或通过局部递送方法来给予抗-IL-25治疗。可以通过基因介导的方法来递送抗-IL-25。替代性的配制策略可以提供适合于口服或栓剂途径的制备物。给药途径可以根据治疗的理化特性、通过对疾病的特殊考虑来确定，以优化疗效或使副作用最小化。

根据本发明，可以向个体给予所提供的组合物。优选以“治疗上有效的量”来给予，该量足以显示对患者的益处。此类益处可以是至少一种症状的至少缓解。所给予的实际量和给药的途径和时间进程将取决于所治疗的疾病的性质和严重性。治疗的处方例如关于使用多少剂量的决定，将是普通医生和其它医疗医生的职责。抗体的合适剂量是本领域熟知的；参见LedermannJ.A.等人.(1991)Int.J.Cancer 47：659-664；Bagshawe K.D.等人.(1991)Antibody，Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4：915-922。

精确剂量将取决于多个因素，包括：抗体是用于诊断还是用于治疗，待处理的区域的大小和位置，抗体的确切性质(例如，完整抗体、片段或双抗体)，以及与所述抗体附着的任何可检测标记物或其它分子的性质。典型的抗体剂量为0.5mg-1.0g，可以作为药团或作为输注通过静脉内给药，视需要在数小时内给予以达到需要的剂量。其它给药模式包括在数小时内进行静脉内输注，以达到类似的总累积剂量。这是对于成年患者的单次处理的剂量，对于儿童和幼儿可以按比例调整，并且对于其它抗体形式根据分子量按比例调整。治疗可以按照每日、每周两次、每周或每月的间隔重复，根据医生的判断进行。

另一种给药模式使用留置装置的预先包被物，或掺入留置装置内，将通过合适的实验来确定用于其的最适抗体量。

在本发明的一些优选实施方式中，抗体分子是单体片段，例如F(ab)或scFv。此类抗体片段可以具有以下优势：相对较短的半衰期，和较小的血小板激活风险，血小板激活可能由受体聚集引起。引起血小板激活的聚集可以是例如IL-25分子的聚集，或IL-25与FcγRII分子的聚集。

如果使用的是完整抗体，则其优选为不能激活和/或破坏血小板的形式。优先选择IgG4同种型，或者可替代地，源自IgG1骨架的“设计者”同种型(新型Fc基因构建体WO99/58572，Clark，Armour，Williamson)。可以使用较小的抗体片段，例如F(ab’)2。此外，可以使用完整抗体或具有双表位特异性(例如，针对由scFv 2C3识别的表位)的片段(例如F(ab’)2或双抗体)。虽然此类实施方式可能促进受体聚集，但是与单一受体的高结合速率可以解决这个问题。

通常将以药物组合物的形式给予本发明的靶结合成员，所述药物组合物可以包含除了靶结合成员之外的至少一种成分。

可以单独给予本发明的靶结合成员或与其它治疗组合给予，可以同时或依次给予，这取决于待治疗的病况。其它治疗可以包括给予合适剂量的缓解疼痛的药物，例如非甾体类抗炎药(例如，阿司匹林、扑热息痛、布洛芬或酮洛芬)或阿片制剂例如吗啡；给予止吐药；或给予至少一种针对哮喘的其它化合物，通常为支气管扩张剂，其产生气道松弛或增强粘膜清除，例如β-激动剂(例如舒喘宁、沙美特罗)、色甘酸二钠、甾体或PDEIV的抑制剂。

测定方法

本发明提供了包括引起或允许如本文提供的靶结合成员与IL-25结合的方法。正如指出的，此类结合可以发生在体内，例如在给予靶结合成员或编码靶结合成员的核酸之后，或者其可以发生在体外，例如在ELISA、Western印迹、免疫细胞化学、免疫沉淀或亲和色谱中。

可以测定与IL-25结合的靶结合成员的量。定量可以与诊断上受关注的测试样品中抗原的量相关。

可以通过任意合适的方式测定样品中抗体的反应活性。放射免疫测定(RIA)是一种可能的方式。将放射活性标记的抗原与未经标记的抗原(测试样品)混合，并允许与抗体结合。通过物理方式将结合的抗原与未结合的抗原分离，并测定与抗体结合的放射性抗原的量。在测试样品中存在的抗原越多，与抗体结合的放射性抗原的量越少。还可以使用非放射性的抗原，使用与报告分子连接的抗原或类似物进行竞争性结合测定。所述报告分子可以是具有光谱上分离的吸收或发射特性的荧光团、磷或激光染料。合适的荧光团包括荧光素、若丹明、藻红蛋白和德克萨斯红。合适的发色染料包括二氨基联苯胺。

其它报告分子包括大分子胶体颗粒或微粒物质，例如有颜色的、磁性的或顺磁性的乳胶珠子，以及可以直接或间接引起可检测的信号被目视观测到、以电学方式检出或记录的生物或化学活性试剂。这些分子可以是例如催化产生颜色或改变颜色的反应或引起电学性质变化的反应的酶。它们可以是分子上可激发的，从而能量状态之间的电子转移引发特征性光谱吸收或发射。它们可以包括用于与生物传感器缀合的化学实体。可以使用生物素/亲和素或生物素/链霉亲和素和碱性磷酸酶检测系统。

由各个抗体-报告分子缀合物产生的信号可用于产生样品(正常和测试)中的相关抗体结合的可定量的绝对或相对数据。

本发明还提供了如上所述的靶结合成员用于在竞争性测定中测定抗原水平的用途，也就是说，通过在竞争性测定中使用如本发明提供的靶结合成员测定样品中的抗原水平的方法。这可以是，结合的抗原与未结合的抗原无需进行物理分离的情况。将报告分子连接至靶结合成员从而产生关于结合的物理上的或光学上的变化是一种可能。所述报告分子可以直接或间接产生可检出的，优选可测定的信号。报告分子的连接可以是直接的，或间接的，共价的，例如通过肽键共价连接，或者是非共价的。通过肽键连接可以是编码抗体和报告分子的基因融合物的重组表达的结果。

本发明还提供了使用根据本发明的靶结合成员在例如生物传感器系统中直接测定抗原水平的方法。

测定结合的模式不是本发明的特征，本领域技术人员能够根据其偏好和一般知识选择合适的模式。

实施例

现在将通过参考以下实验以实施例的方式来诠释本发明的方面和实施方式。

比较实施例：

2c3的初级序列

在图1中显示了κ轻链的序列(SEQ ID NO：15)，其中不包括其引导序列，以及如Kabat定义的CDR环的氨基酸序列，即L1(SEQ ID NO：29)、L2(SEQID NO：30)和L3(SEQ ID NO：31)。L1、L2和L3序列正是用于2c3轻链的人源化的供体序列。图2中显示了重链的序列(SEQ ID NO：17)，其CDR标示为H1(SEQ ID NO：32)、H2(SEQ ID NO：35)和H3(SEQ ID NO：33)。

2c3重链和轻链的分析

分析了人类抗体序列数据库以鉴定用于2c3的受体框架序列。所述人类抗体序列数据库包含9597个重链序列和2695个轻链序列。首先基于下列项初步鉴定合适的受体序列：第一是最高的VCI得分，第二是框架(FR)得分，第三是同一性得分。最后，放弃任何不具有针对H1H2、L1和L2的保守性环长度的序列。然后检查排名前20的人类抗体序列，以除掉人源化抗体、重链突变的(heavily mutated)scFV抗体和小鼠抗体。另外，也除掉那些在非典型位置具有半胱氨酸或脯氨酸残基的序列。

2c3的重链受体的分析

鉴定用于2c3重链的排名前20的序列。在图3中显示了序列AY393094，其具有最高的VCI得分(SEQ ID NO：19)，仅具有2个不同的VCI残基A67V和L69I。这二者均是保守性变化。对框架序列的其余部分的分析显示：87个残基中有59个是保守性的。对于我们建议的轻链AY510106，在2c3和AY393094中发现的界面残基在同源重链(AY510106)中是保守的。综上的分析表明：AY393094(SEQ ID NO：19)是良好的候选物，其需要极少的VCI回复突变。

然而，AY393094的H3环的长度是17，而不是如存在于2c3中的13个残基，但是，H3长度的这种差异在人源化过程中不是罕见的，认为其重要性小于VCI残基的保守性。

2c3的重链的人源化构建体(RHA)

图4中显示了人源化的重链构建体，其被称作RHA(SEQ ID NO：21)。引导序列和框架序列来自AY393094，如Kabat定义的H1-H3环来自2c3。在5’末端添加了Kozak共有序列和HindIII限制性位点，在3’末端添加了ApaI限制性位点。所述限制性位点是为了辅助表达载体，Kozak共有序列旨在使蛋白表达最大化。N-连接的糖基化位点具有基序NX(S/T)，在人源化重链中没有发现任何(这种位点)。通过向RHA氨基末端肽序列施以Signal P程序来检测肽切割位点的质量。结果确认：VH5a引导序列将在VCA(信号肽的C-末端)和EVR(FR1的N-末端)之间被切割。

轻链框架的分析

鉴定了具有最高的VCI和框架得分的多个人类轻链框架。但是，在考虑3个得分最高的序列之后，摒弃了所有序列。第一个是由于该轻链是来自已经显示与淀粉样原纤维形成相关的抗体，接下来两个是由于序列在位置1和3处具有非保守残基。本发明人之前关于人源化的经验促使他们相信这些残基应该是保守的。

接下来的最佳序列仅有2个VCI残基的差异：V44P和Y71F，虽然进一步的分析表明具有最高的框架得分的候选物是非常相似的，但是具有L73F或I83F错配。苯丙氨酸是相对大的变化，并且似乎在这两种类型的轻链中是保守的。对2c3样轻链框架的进一步分析发现了相当多的在位置83处具有缬氨酸并且在位置73处具有亮氨酸，因此提供了对那些在位置83处具有苯丙氨酸的框架的替代方式。有鉴于此，本发明人选择了轻链AY510106，其是V83轻链，具有与2c3相同的CDR环长度。AY510106的序列显示于图5(SEQ ID NO：23)。

2c3轻链的人源化构建体(RKA)

图6中显示了人源化的κ轻链构建体，其被称作RKA(SEQ ID NO：25)。引导序列和框架序列来自AY510106，L1-L3来自2c3。在5’末端添加了Kozak共有序列和HindIII限制性位点，在3’末端添加了BamHI限制性位点和剪接位点。所述限制性位点和剪接位点是在pKN100表达载体中克隆和表达构建体所需的，Kozak共有序列旨在使蛋白表达最大化。N-连接的糖基化位点具有基序NX(S/T)，在人源化轻链中没有发现任何(这种位点)。通过向2c3RKA氨基末端肽序列施以Signal P程序来检测肽切割位点的质量。结果确认：VK1-A20引导序列在残基TRC(信号肽的C-末端)和DI(FR1的N-末端)之间被切割。

RHA和RKA与嵌合2c3的比较

合成人源化的2c3重链RHA和κ轻链RKA cDNA(GeneArt AG)并分别克隆进入IgG1重链表达载体pG1D200和轻链表达载体pKN100。最初，将来自嵌合2c3和人源化抗体的重链和轻链cDNA构建体组合，并用于瞬间转染HEK293T细胞。来自经转染的细胞的上清液用于在ELISA中测定与IL-25结合的抗体。结果(图7(A))表明包含嵌合2c3轻链与人源化重链RHA的人源化抗体与IL-25的结合显著小于包含嵌合2c3轻链和重链的抗体。相反，发现与嵌合2c3重链结合的人源化轻链RKA或嵌合2c3轻链对于IL-25的结合是等同的。

在尝试恢复人源化重链的最大结合时，通过诱变替换VCI残基A67V和I69L。将双突变体RHA_A67V_I69L和RHA_I69L与轻链RKA的组合对于抗原之结合与嵌合2c3对于抗原之结合相比较。以多种诱变的重链和RKA共转染HEK 293T细胞，上清液用于IL-25结合ELISA中。图7(B)显示的结果证明：通过替换A67V和I69L两残基仅恢复了部分与IL-25的最大抗体结合。

对RHA进行了进一步诱变。制备了氨基酸替换物R3Q、S82aL，来自瞬间转染的HEK293T细胞的上清液用于IL-25结合ELISA中。图7(C)中的结果显示：这些替换对于改善人源化抗体与IL-25的结合影响甚微或无影响。

因此，结论是：轻链人源化是成功的，并且无需进一步修饰；然而，即使对重链进行进一步工程化改造，基于将CDR转移到具有表面上良好保守的VCI残基的重链中的人源化是不成功的。

实施例1-高亲和性人源化抗体的设计

框架AY393094不能提供令人满意的人源化抗体，虽然替换了微调或典型残基，产生了相对于VCI得分具有高度序列同一性优先权的抗体框架区。该方法鉴定了不同类的人类框架。在这些之中，选择了具有最高的VCI得分的一个。其引导序列是未知的，因此使用VH5a引导序列作为替代。所选的人VH域AJ399823(SEQ ID NO：27)的序列显示于图8。

其CDR被替换为2c3的CDR，并且第二人源化的抗体被称作RH2。其序列显示为SEQ ID NO：4。RH2具有5个非保守VCI残基：Ser 30、Met 48、Val 67、Arg 71和Thr 73(Kabat编号)。这些残基在下文中分别称作b、c、d、e和f。

含有所有的VCI替换的人源化重链被称作RH2bcdef，测试其与轻链RKA的结合。来自瞬间转染的HEK293T细胞的上清液用于IL-25结合ELISA中。RHA与RH2bcdef的比较显示出相对于RHA而言与IL-25的结合的改善，但是未能重新捕获如嵌合2c3所显示的100％结合。因此，结论是：需要替代直接人源化2c3的替代性方式。

实施例2-RH2bcdef的CDR修饰

发现2个CDR残基改善人源化抗体的效力。将突变D31G和G96D导入RH2bcdef，并用于瞬间转染HEK293T细胞。上清液用于IL-25结合ELISA中。图9(A)中的结果显示D31G突变使RH2bcdef的效力恢复至2c3的水平。然而，如图9(B)所示，G96D突变使抗原结合效力增加至实质上超过2c3。

为了测试2个突变是否是加成效应，将二者都引入RH2bcdef中。来自瞬间转染的HEK293T细胞的上清液用于IL-25结合ELISA中。图10中的结果说明：通过引入2个CDR突变，产生了小的但明显的人源化效力增加。

我们的数据还表明：除了Gly或Asp之外，位置31也可以选自Ala、Ser、Val、Asn、Lys、Tyr或Met，以维持相似的抗体结合特性。

实施例3-残基96(Kabat)的修饰

为了更好地理解哪些氨基酸能够在残基96处被容纳，通过诱变将甘氨酸替换为代表性的氨基酸选择。对RH2bcdef进行以下突变：G96Y、G96N、G96S、G96L、G96K和G96E。将表达构建体与RKA共转染进入HEK293T细胞，上清液用于IL-25结合ELISA中。结果显示：只有位置96处的天冬氨酸替换为天冬酰胺具有等同效力，在该位置测试的所有其它残基对于与IL-25的结合都具有不利效应。令人惊奇的是，对效力的不利效应还包括替换为谷氨酸，其为带负电的残基，与天冬氨酸类似。可以得出结论：负电荷不是天冬氨酸促成效力增加的首要因素。

因此，本发明的VH域中的残基96(Kabat)可以是天冬氨酸或天冬酰胺。

实施例4-确定对于RH2的小鼠VCI残基的最低要求

为了使对于人源化抗体的潜在免疫原性影响最小化，需要使鼠氨基酸框架替换的数目最小化。人源化的重链RH2bcdef_G96D被称作RH2.1，其具有来自2c3的5个VCI替换。首先除掉4个以鉴定哪些残基对效力有贡献。

将突变c、d、e和f替换为内源性的人框架残基，作为单一突变。以VCI突变和RKA共转染HEK 293T细胞，在IL-25结合ELISA中测定上清液。令人惊奇的是，发现重新导入人残基V67或T73使效力稍许增强，这是未预料到的。将位置48处的Met变回鼠Ile未产生任何显著效应。

然而，存在于位置71处的人精氨酸残基似乎对于与IL-25的结合具有不利效应。因此，结论是：仅有鼠VCI残基Val 71在人源化抗体中是非常需要的。其它残基可以是小鼠的或人的。

为了鉴定最佳的最终的人源化重链，合成了重链的新形式，称作RH2.5(SEQ ID NO：4)，其不含鼠的VCI残基。此外，制备了RH2.5的2个修饰形式，其含有VCI突变S30T(SEQ ID NO：3)或R71V(SEQ ID NO：2)。通过ELISA分析这3个新的人源化抗体与IL-25的结合。结果显示于图11。发现与RH2.5相比，添加S30T或R71V等同地使与人IL-25的结合增强。

因此，在本发明的一些实施方式中，可以单独地或联合地使重链的位置30和71分别从S变为T，以及从R变为V。

实施例5-抗体热稳定性

测定了RH2.5_S30T(SEQ ID NO：3)和RH2.5_R71V(SEQ ID NO：2)的热稳定性。将抗体在多个温度中放置10分钟，然后迅速冷却至室温，通过ELISA测定其与IL-25结合的能力。发现2c3嵌合抗体(对照)保持较高的热稳定性，在直至75℃的温度都是有活性的。RH2.5_R71V在直至65℃保持活性，RH2.5_S30T在直至60℃保持活性。

实施例6-人源化抗体的非B/非T细胞生物测定

可以获得几种体外生物测定法以测定IL-25的活性。一种有效的测定法是测定从分离自小鼠的肠系膜的淋巴结的非B/非T(NB/NT)细胞释放的IL-13。在该测定中，将细胞与IL-25和不同浓度的抗体一起温育，在刺激后3天测定IL-13。结果显示：鼠2c3抗体仅部分地抑制IL-13的产生。相反，RH2.5_R71V和S30T都消除了IL-13的产生，并且RH2.5显著降低了IL-13的产生。有趣的是，RH2.5_R71V和RH2.5_S30T二者在低至0.25μg/ml的浓度时仍然显示出完全抑制IL-13的产生，但是对于该浓度的RH2.5而言，存在一些低水平的细胞因子产生。这些数据与“人源化抗体比2c3嵌合抗体效力更高以及突变R71V和S30T具有增强的抗原结合效力”的观察是一致的。

实施例7-RH2.5-R71V抑制气道反应过度

在进一步的实验中，在急性气道反应过度(AHR)的小鼠模型中测定了人源化抗体RH2.5_R71V。实验程序总结于图12。首先将小鼠针对卵白蛋白致敏，然后在存在抗-IL-25抗体的情况下进行刺激。图13(A)中的结果显示：通过加入剂量为500μg/小鼠的2c3阻断了AHR应答，但是当剂量下降至50μg/小鼠时，不能阻断。相反，如图13(B)所示，仅使用剂量为50μg(2.5mg/Kg)的人源化抗体RH2.5_R71V即阻断了AHR。这些数据进一步支持以下观点：人源化的抗体的效力显著高于2c3抗体。

实施例8-结肠炎的治疗

为了预敏化雌性BALB/c小鼠(每组10只)，剃掉其腹部皮肤的一个区域，施以150μl 3％(w/v)的噁唑酮溶液(在100％乙醇中)。对照小鼠通过施以150μl 100％乙醇进行预敏化。预敏后7天，在异氟烷麻醉的情况下，使用150μl 3％噁唑酮(在50％乙醇中)或仅使用50％乙醇(对照)通过直肠内方式重新刺激小鼠。为了确保噁唑酮在整个结肠和盲肠内的分布，在注射后将小鼠在垂直位置放置1分钟。在预敏化前一天和直肠内(i.r.)给予噁唑酮前一天，通过腹膜内(i.p.)给予抗体，所述抗体为小鼠2C3序列在人IgG1骨架上的嵌合体(100μg/剂)。对照小鼠接受同种型对照人IgG4(100μg/剂)。本文记载的所有动物实验经过UK Home Office的批准而进行。

经过3次每日腹膜内给予50％乙醇+IgG4同种型对照(50％EtOHIgG4)、直肠内给予50％乙醇+腹膜内给予抗-IL-25(50％EtOH抗-IL-25)、直肠内给予50％乙醇与3％噁唑酮+腹膜内给予IgG1同种型对照(3％噁唑酮IgG4)和直肠内给予50％乙醇与3％噁唑酮+腹膜内给予抗-IL-25(3％噁唑酮抗-IL-25)之后，测定每组小鼠的结肠长度。

在如上所述的处理后，每日测量动物体重。

图14A显示：给予噁唑酮诱导了结肠长度的减少，其为结肠炎的指示。相对于以噁唑酮和IgG4-同种型处理的动物，以噁唑酮和2C3衍生的抗-IL-25抗体处理的动物显示出向较长结肠的趋势(改善的预后)。相对于仅以介质处理的对照，以噁唑酮处理还诱导了体重下降(图14B)。以噁唑酮和抗-IL-25处理的动物体重也减少，虽然在第3天显示出比噁唑酮IgG4-同种型处理的组更快的体重恢复趋势。

材料和方法

缩写

AHR 气道反应过度

℃ 摄氏度

bp 碱基

DMEM Dulbecco改良Eagles培养基

DMSO 二甲基亚砜

DNA 脱氧核糖核酸

ELISA 酶联免疫吸附测定

FCS 胎牛血清

FR 框架

g 克

HEK 293T 表达SV40大T抗原的人胚胎肾细胞(HEK 293T细胞)

hr 小时

HRP 辣根过氧化物酶

IgG 免疫球蛋白

mAb 单克隆抗体

min 分钟

NB/NT 分离自小鼠肠系膜的淋巴结的非B/非T细胞

NIMR 国立医学研究机构(UK)

nm 纳米

OD 光密度

PBS 磷酸盐缓冲液

PCR 聚合酶链式反应

RH 重组重链

RK 重组κ链

RT 室温

sec 秒

UV 紫外

VH 免疫球蛋白重链可变区

VL 免疫球蛋白轻链可变区

VK 免疫球蛋白κ轻链可变区

免疫学和分子生物学试剂

嵌合和人源化抗体可变区基因的克隆

合成了2c3的重链和轻链可变区cDNA和人源化抗体的可变区cDNA(GeneArt AG)。将重链可变区通过HindIII和ApaI限制性酶位点克隆进入pG1D200。类似地，将轻链可变区通过HindIII和BamHI位点克隆进入pKN100。通过在37℃以multicore(Promega)限制性消化缓冲液中的20单位的HindIII和ApaI将5μg DNA消化2小时来准备pG1D200载体，以用于连接。随后，按照生产商的说明书，将1单位的Antarctic碱性磷酸酶(NEB)加入到DNA中，并温育15至30分钟。然后，按照生产商的说明书，在Qiaquick(Qiagen)柱上纯化载体制备物。在50μl中洗脱载体。类似地，通过在37℃以缓冲液E(Promega)中的20单位的HindIII和BamHI将5μg DNA消化1小时来准备pKN100载体。以Antarctic碱性磷酸酶处理DNA并按照上文描述进行纯化。按照上文描述消化可变区插入子DNA(大约4μg)，通过凝胶电泳从载体中纯化重链和轻链片段。从凝胶上切下合适的条带，并按照生产商的说明书，在Qiaquick(Qiagen)柱上纯化，在50μl中洗脱。连接这样进行：将1μl载体与1x Quick连接酶缓冲液(NEB)中的1μl或3μl插入子DNA与1μl NEB Quick连接酶混合，并在室温(20℃)温育10分钟。反应用于转化50μl 10β感受态细胞(NEB)。通过DNA测序确认载体构建体，由GATC BiotechLtd(Cambridge)进行操作。

可变区基因的合成和定点诱变

可变区基因由GeneArt AG(Regensburg，Germany)合成。

根据生产商的说明书，使用QuickChange

II XL定点诱变试剂盒(Stratagene)进行定点诱变。除了对于RHA突变R3Q和L82aS根据生产商的说明书使用Phusion^TM定点诱变试剂盒(NEB)方法之外。

IgG1 ELISA

以0.4μg/ml山羊抗-人IgG抗体包被Maxisorp平板，并储存于4℃，储存时间不超过1个月。在使用前，以PBS/0.02％Tween 20(v/v)洗涤平板3次，然后以PBS/0.02％Tween 20(v/v)/0.2％(w/v)BSA封闭。按照如上所述洗涤平板，加入2倍稀释的浓度范围的样品上清液，并在37℃温育1小时。按照如上所述洗涤平板，并与1∶5000稀释的山羊抗人-κ轻链过氧化物酶缀合物(Sigma)一起温育。按照如上所述洗涤平板，然后加入150μl K BlueOne-Step底物(Neogen)。10分钟后，以50μl Red Stop溶液(Neogen)终止反应，在655nm测定光密度。

细胞因子结合测定

以碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(Sigma)中的0.25μg/ml人IL-25(R&D systems)包被Maxisorp平板，并储存于4℃，储存时间不超过1个月。在使用前，以PBS/0.02％Tween 20(v/v)洗涤平板3次，然后以PBS/0.02％Tween 20(v/v)/0.5％(w/v)BSA封闭。按照如上所述洗涤平板，加入2倍稀释浓度范围的样品上清液，并在37℃温育1小时。按照如上所述洗涤平板，并与1∶5000稀释的山羊抗人-κ轻链过氧化物酶缀合物(Sigma)一起温育。按照如上所述洗涤平板，然后加入150μl K Blue One-Step底物(Neogen)。10分钟后，以50μl Red Stop溶液(Neogen)终止反应，在655nm测定光密度。

小鼠

BALB/c小鼠获自Harlan UK(Bicester，UK)，维持在Small Animal BarrierUnit and Central Biomedical Services LMB Cambridge的特定的无热原环境中。本报告中给出的所有动物实验都经过UK Home Office的批准而进行。

非B非T细胞测定

非B/非T(NBNT)细胞纯化自肠系膜的淋巴结，在存在或不存在10ng/ml rmIL-25的情况下与小鼠IgG1同种型(抗-c-myc)或抗-mIL-25 2c3一起温育：不同浓度的人IgG1同种型对照(抗-疟疾)、抗-hIL-25 RH2.5 R71V、抗-hIL-25 RH2.5 S30T或抗-hIL-25 RH2.5。通过ELISA测定来自细胞上清液的IL-13产生，其是从2份一式两份的孔汇集来的。使用Quantikine MurineIL-13Kit(R&D Systems)进行IL-13ELISA。

气道反应过度(AHR)的急性模型的实验设计

在第0天和第12天，通过腹膜内给予(20μg/注射)PBS中的卵白蛋白与明矾的复合物，或仅PBS和明矾(对照)将BALB/c小鼠(6-12周)致敏。在第19、20和21天，通过气雾剂方式给予1％卵白蛋白，每天20分钟。对照动物接受PBS。在每次肺部刺激前2小时，小鼠还接受腹膜内给予2c3、小鼠IgG1对照或人IgG1同种型对照(抗-疟疾)，或抗-hIL-25RH2.5 R71V。在第22天，使用受限的体积描记术分析动物以评测AHR。作为内毒素测定卵白蛋白和抗体，发现除了对于RH2.5_R71V是1.2EU/ml以外，其余都低于0.1EU/ml。

AHR的测定

将动物麻醉，进行气管切开术，置于呼吸机(Minivent 845呼吸机，EMMS，UK)上，速率为大约150次呼吸/分钟，潮气量为0.15ml。在受限的全身体积描记器(EMMS Hants，UK)上监测小鼠，通过内嵌传导器测定肺与肺内腔之间的压差。记录稳定的基线肺抗性之后，使用超声喷雾器通过气雾剂方式给予浓度渐增的乙酰-β-甲胆碱氯化物(乙酰甲胆碱；Sigma，Dorset，United Kingdom)10秒钟，记录3分钟的时间段内的肺的抗性。使用EDaq软件(EMMS Hants，UK)分析气道抗性、依从性和标准的肺参数。

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22.Yun，L.，and Hanauer，S.Expert Rev Gastroenterol Hepatol 3，235-248(2009)

序列：

SEQ ID NO：1-人源化VH域(人工的)

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val LysVal Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Xa1 Xa2 Tyr Thr Met Asn Trp ValArg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Xa3 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr AsnGly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Xa4 AspThr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr GlyVal Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Xa5 Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met AspTyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

其中：

Xa1是Ser或Thr；

Xa2是Gly、Asp、Ala、Ser、Val、Asn、Lys、Tyr或Met；

Xa3是Met或Ile；

Xa4是Val或Arg；并且

Xa5是Asp、Asn或Gly。

SEQ ID NO：2-人源化VH域RH2.5_S30T(人工的)

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro GlyAla Ser Val LysVal Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val ArgGln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn GlyGly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp ThrSer Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly ValTyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp TyrTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

SEQ ID NO：3-人源化VH域RH2.5_R71V(人工的)

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val LysVal Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val ArgGln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn GlyGly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp ThrSer Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Glu Asp Thr Gly ValTyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp TyrTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Val Ser Ser

SEQ ID NO：4-人源化VH域RH2(人工的)

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val LysVal Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val ArgGln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn GlyGly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp ThrSer Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly ValTyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp TyrTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

SEQ ID NO：5-人源化VH域(人工的)

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val LysVal Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val ArgGln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn GlyGly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp ThrSer Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly ValTyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp TyrTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

SEQ ID NO：6-人源化VH域(人工的)

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val LysVal Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Tyr Thr Met Asn Trp Val ArgGln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn GlyGly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp ThrSer Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly ValTyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp TyrTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

SEQ ID NO：7-人源化VH域(人工的)

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val LysVal Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asn Trp ValArg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Tyr AsnGly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg AspThr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr GlyVal Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met AspTyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

SEQ ID NO：8-人源化VH域(人工的)

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val LysVal Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asn Trp ValArg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Tyr AsnGly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val AspThr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr GlyVal Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met AspTyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

SEQ ID NO：9-人源化VH域(人工的)

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val LysVal Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val ArgGln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly GlyThr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr SerAla Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly ValTyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp TyrTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

SEQ ID NO：10-人源化VH域(人工的)

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val LysVal Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val ArgGln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly GlyThr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr SerAla Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly ValTyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp TyrTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

SEQ ID NO：11-人源化VH域(人工的)

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val LysVal Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val ArgGln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly GlyThr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr SerAla Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly ValTyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp TyrTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

SEQ ID NO：12-人源化VH域(人工的)

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val LysVal Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Tyr Thr Met Asn Trp Val ArgGln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly GlyThr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr SerAla Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly ValTyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp TyrTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

SEQ ID NO：13-人源化VH域(人工的)

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val LysVal Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asn Trp ValArg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn GlyGly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp ThrSer Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly ValTyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp TyrTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

SEQ ID NO：14-人源化VH域(人工的)

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val LysVal Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asn Trp ValArg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn GlyGly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp ThrSer Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly ValTyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp TyrTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

SEQ ID NO：15-2c3的VK域(鼠)

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKADGTVELLIYYTS SLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEIK

SEQ ID NO：16-编码2c3的VK域的核酸

GACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACCGGGTGACCATCAGCTGCAGCGCCTCCCAGGGCATCAGCAACTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGGCCGACGGCACCGTCGAGCTGCTGATCTACTACACCAGCAGCCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTTAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCTCCAACCTGGAACCCGAGGATATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGCAAGCTGCCCTACACCTTTGGCGGCGGAACAAAGCTGGAAATCAAG

SEQ ID NO：17-具有引导序列的2c3的VH域

MVLSLLYLLTALPGILSEVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTDYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTSYNQNFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCAREGYDGYLYFAMDYWGQGTSVTVSS

SEQ ID NO：18-编码2c3的VH域的核酸

ATGGTGCTGTCCCTGCTGTACCTGCTGACCGCCCTGCCCGGCATCCTGAGCGAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCTGAGCTGGTGAAGCCTGGCGCCAGCATGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGCTTCACCGACTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCACGGCAAGAACCTGGAATGGATCGGCCTGATCAACCCCTACAACGGCGGCACCAGCTACAACCAGAACTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGTGGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGGAACTGCTGTCTCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAGGGCTACGACGGCTACCTGTACTTCGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCAGC

SEQ ID NO：19-AY393094VH域(人)

LLLAVLQGVCAEVRLVQSGAEVKKPGESLKISCKASGYSFTSNWIGWVRQMPGKGLEWIGIIFPGDSDTIYSPSFQGQVTISVDKSINTAYLQWSSLKATDTAMYYCARQNPPEYSGAYHDGWFDPWGQGTLVIVSS

SEQ ID NO：20-编码AY393094VH域的核酸

CTCCTCCTGGCTGTTCTCCAAGGAGTCTGTGCCGAGGTGCGCCTTGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCGGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGCTTCTGGATACAGTTTTACCAGTAACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATTGGGATCATCTTTCCTGGTGACTCTGATACCATATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATTTCAGTCGACAAGTCCATCAATACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCACGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGACAGAACCCCCCCGAGTATAGTGGCGCATATCATGATGGGTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCATCGTCTCCTCA

SEQ ID NO：21-RHA VH域(人工的)

MGSTAILGLLLAVLQGVCAEVRLVQSGAEVKKPGESLKISCKASGYSFTDYTMNWVRQMPGKGLEWIGLINPYNGGTSYNQNFKGQVTISVDKSINTAYLQWSSLKATDTAMYYCAREGYDGYLYFAMDYWGQGTLVIVSS

SEQ ID NO：22-编码RHA VH域的核酸(人工的)

ATGGGGTCAACCGCCATCCTTGGCCTCCTCCTGGCTGTTCTCCAAGGAGTCTGTGCCGAAGTGCGCCTTGTGCAGTCTGGAGCAGAAGTGAAAAAGCCGGGGGAGTCTCTGAAGATCTCTTGCAAGGCTTCTGGATACAGTTTTACCGACTACACCATGAACTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATTGGGCTTATTAATCCTTACAATGGTGGTACTAGCTACAACCAGAATTTCAAGGGCCAAGTCACCATTTCAGTCGACAAGTCCATCAATACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCACGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGAGAGGGCTATGATGGTTACCTTTACTTTGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCATCGTCTCCTCAG

SEQ ID NO：23-AY510106VK域(人)

MRVPAQLLGLLLLWLPDTRCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKVPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQKYNSAPYTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO：24-编码AY510106VK域的核酸

ATGAGGGTCCCTGCTCAGCTCCTGGGACTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGATACCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCGAGTCAGGGCATTAGCAATTATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAACTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAATCAGGGGTCCCATCTCGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAAAAGTATAACAGTGCCCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA

SEQ ID NO：25-人源化2c3VK域RKA(人工的)

MRVPAQLLGLLLLWLPDTRCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQKPGKVPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQYSKLPYTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO：26-编码人源化2c3VK域RKA的核酸

ATGAGGGTCCCTGCTCAGCTCCTGGGACTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGATACCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAGTGCATCCCAGGGCATTAGCAATTATCTGAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAACTCCTGATCTATTACACATCAAGTTTACACTCAGGGGTCCCATCTCGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAGCAGTATAGCAAGCTGCCGTACACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA

SEQ ID NO：27-AJ399823VH域(人)

EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFSSYGIHWVRQAPGQRLEWMGWINGGTGFTKYSQNFQGRVTLTRDTSASTAYLELNSLRSEDTGVYYCARDPYNNYAAELDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO：28-编码AJ399823VH域的核酸(人)

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAAGTTTCGTGCAAGGCTTCTGGATACTCCTTCAGTAGTTATGGTATACATTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGACAAAGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACGGTGGCACTGGTTTTACAAAATATTCACAGAATTTTCAGGGCAGAGTCACCCTAACCAGGGACACTTCCGCGAGCACAGCCTACTTGGAACTGAACAGCCTGAGATCTGAAGACACGGGTGTATATTACTGTGCGAGGGATCCCTACAATAACTACGCGGCGGAACTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA

SEQ ID NO：29-轻链CDR1(鼠)

SASQGISNYLN

SEQ ID NO：30-轻链CDR2(鼠)

YTSSLHS

SEQ ID NO：31-轻链CDR3(鼠)

QQYSKLPYT

SEQ ID NO：32-重链CDR1(鼠)

DYTMN

SEQ ID NO：33-重链CDR3(鼠)

EGYDGYLYFAMDY

SEQ ID NO：34-重链CDR1(人工的)

GYTMN

SEQ ID NO：35-重链CDR2(鼠)

LINPYNGGTSYNQNFKG

SEQ ID NO：36-重链CDR3(人工的)

EDYDGYLYFAMDY

SEQ ID NO：37VH域引导序列：

MGSTAILGLLLAVLQGVCA

SEQ ID NO：38-2C3VK域引导序列：

MRVPAQLLGLLLLWLPDTRC

SEQ ID NO：39-人VL引导序列：

MDMRVPAQLLGLLLLWLPDTRC

SEQ ID NO：40-编码RH2.5 R71V的核酸(人工的)

ATGGGCAGCACAGCCATTCTGGGCCTGCTGCTGGCCGTGCTGCAGGGCGTGTGCGCCGAGGTGCAGCTGGTCGAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCAGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGCTTCTCCGGCTACACCATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGAGGCTGGAATGGATGGGCCTGATCAACCCCTACAACGGCGGCACCAGCTACAACCAGAACTTCAAGGGCAGGGTGACACTGACCGTGGATACCAGCGCCAGCACCGCCTACCTGGAACTGAACAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGGCGTGTACTACTGCGCCAGAGAGGACTACGACGGCTACCTGTACTTCGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC

SEQ ID NO：41-Kozak共有序列(人工的)

AAGCTTGCCGCCACC

本文引用的所有专利、公布的申请和参考文献的教导内容通过引用方式全文并入本文。

通过参考其实施例实施方式特别显示并描述了本发明，本领域技术人员应该理解，可以不脱离随附的权利要求所包括的本发明的范围而对其作出形式和细节上的多种改变。

Claims

1.抗体VH域，其包含SEQ ID NO：1：

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val LysVal Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Xa1 Xa2 Tyr Thr Met Asn Trp ValArg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Xa3 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr AsnGly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Xa4 AspThr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr GlyVal Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Xa5 Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met AspTyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser，

其中：

Xa1是Ser或Thr；

Xa2是Gly、Asp、Ala、Ser、Val、Asn、Lys、Tyr或Met；

Xa3是Met或Ile；

Xa4是Val或Arg；并且

Xa5是Asp、Asn或Gly。

2.权利要求1的VH域，其中Xa2是Gly并且Xa5是Asp或Asn。

3.权利要求2的VH域，其中Xa2是Gly并且Xa5是Asp。

4.权利要求1的VH域，其中Xa1是Ser。

5.权利要求1的VH域，其中Xa1是Thr。

6.权利要求1的VH域，其中Xa3是Met。

7.权利要求1的VH域，其中Xa3是Ile。

8.权利要求1的VH域，其中Xa4是Val。

9.权利要求1的VH域，其中Xa4是Arg。

10.权利要求1的VH域，其中残基Xa1-Xa5是以下组合：

。

11.靶结合成员，其与IL-25结合并且包含抗体VH域，其中所述VH域是根据权利要求1的VH域。

12.权利要求11的靶结合成员，其包含VL域，所述VL域的KabatCDR1-CDR3分别是SEQ ID NO：15的残基24-34(SEQ ID NO：29)、50-56(SEQ ID NO：30)和89-97(SEQ ID NO：31)。

13.权利要求12的靶结合成员，其中所述VL域还包括SEQ ID NO：15的残基35-38，其邻近CDR1(SEQ ID NO：29)。

14.权利要求12的靶结合成员，其包含SEQ ID NO：15。

15.权利要求12的靶结合成员，其中所述VL域是人源化的。

16.权利要求15的靶结合成员，其序列包含SEQ ID NO：25的氨基酸21-127。

17.权利要求11的靶结合成员，其是Fab、F(ab′)₂、scFv、Fv或dAb抗体片段。

18.权利要求11的靶结合成员，其包含抗体恒定区。

19.权利要求18的靶结合成员，其中所述恒定区是人IgG1或IgG4恒定区。

20.权利要求18的靶结合成员，其包括完整抗体。

21.分离的核酸，其包含编码权利要求1的VH域的核苷酸序列。

22.表达载体，其包含与启动子可操作地连接的权利要求21的核酸。

23.宿主细胞，其携带权利要求22的表达载体。

24.产生靶结合成员的方法，所述方法包括在产生所述靶结合成员的条件下培养根据权利要求23的宿主细胞。

25.权利要求24的方法，其还包括分离所述靶结合成员。

26.权利要求25的方法，其还包括将所述靶结合成员配制进入包括至少一种另外的成分的组合物中。

27.组合物，其包含权利要求11的靶结合成员和药学上可接受的载体。

28.权利要求27的组合物，其为冻干的粉末形式。

29.用于治疗或预防哮喘的方法，所述方法包括向有治疗需要的受试者给予有效量的权利要求11的靶结合成员。

30.用于治疗或预防哮喘的权利要求11的靶结合成员。

31.用于治疗或预防炎症性肠病的方法，所述方法包括向有治疗需要的受试者给予有效量的权利要求11的靶结合成员。

32.用于治疗或预防溃疡性结肠炎的方法，所述方法包括向有治疗需要的受试者给予有效量的权利要求11的靶结合成员。

33.用于治疗或预防克罗恩病的方法，所述方法包括向有治疗需要的受试者给予有效量的权利要求11的靶结合成员。

34.用于治疗或预防炎症性肠病的权利要求11的靶结合成员。

35.用于治疗或预防溃疡性结肠炎的权利要求11的靶结合成员。

36.用于治疗或预防克罗恩病的权利要求11的靶结合成员。

37.产生针对IL-25的抗体的方法，其包括：

(a)提供权利要求1的抗体VH域；

(b)将所述VH域与多种抗体VL域组合以提供抗体分子；

(c)就与IL-25的结合筛选所述抗体分子；和

(d)选择与IL-25结合的抗体分子。

38.分离的核酸，其包含编码权利要求11的靶结合成员的核苷酸序列。