KR20110086013A

KR20110086013A - Ｉｌ－２５에 대한 항체

Info

Publication number: KR20110086013A
Application number: KR1020117009937A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 존 매튜스; 질리안 발로우; 앤드류 닐 제임스 맥킨지
Original assignee: 메디칼 리서취 카운실
Priority date: 2008-09-30
Filing date: 2009-09-30
Publication date: 2011-07-27
Also published as: CA2739050C; MX2011003351A; NZ592274A; JP2012503979A; BRPI0919062A2; WO2010038155A2; PL2344538T3; ME02219B; SI2344538T1; PT2344538E; US20110250195A1; JP5719771B2; ES2537226T3; HRP20150524T1; KR101659452B1; CA2739050A1; DK2344538T3; RS54028B1; AU2009299465B2; AU2009299465A1

Abstract

본 발명은 IL-25 항체 VH 도메인 그리고 이러한 항체 VH 도메인을 포함하며 IL-25과 결합하는 표적 결합 멤버(target binding member) (예를 들어, 항체)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 IL-25와 결합하는 표적 결합 멤버 (예를 들어, 항체), 이러한 표적 결합 멤버를 생성시키는 방법, 그리고 질병 및 질환 (예를 들어, 천식, 염증성 장 질환)의 치료 또는 예방을 위한 이러한 표적 결합 멤버의 용도에 관한 것이다.

Description

ＩＬ－２５에 대한 항체{ANTIBODIES AGAINST IL-25}

관련 출원

본 출원은 2008년 9월 30일에 출원된 미국 가출원 번호 61/101,293 그리고 35 U.S.C. § 119 또는 365에 따라 2008년 9월 30일에 출원된 영국 특허 출원 번호 GB 0817891.5를 우선권으로 주장한다. 상기 출원들의 전체 교시내용은 본원에 참조로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 인터루킨 25 (IL-25)에 대한 항체 및 이의 결합 단편에 관한 것이다.

발명의 배경

천식

천식은 기도의 흔한 만성 염증성 장애이다. 환자 수는 최근 수 십년에 걸쳐 급격하게 증가하였으며 세계 보건 기구는 전세계적으로 약 3억명의 사람들이 천식을 앓고 있는 것으로 추산하고 있다. 알레르기성 천식은 다양한 반응유발성 자극(provocative stimuli)에 의해 유도된 조절불가능한 기도 과민반응(airways hyperresponsiveness, AHR)으로 특징지워지며 폐내로의 타입-2 염증성 침윤과 연관이 있다.

타입-2 사이토카인은 기생선충(parasitic helminth) 감염에 대한 보호 면역을 매개하고, B 세포 성장 및 IgE 분비와 같은 이펙터 기능을 조절하고, 배상세포 과증식(goblet cell hyperplasia) 및 관련 점액(mucus) 생산, 호산백혈구증가증(eosinophilia), 비만세포종(mastocytosis) 및 섬유증(fibrosis)을 유도하는 데에 있어서 중요한 역할을 한다(1). 이러한 이펙터 기능의 조절에서 상기 사이토카인들의 중심적인 역할은 상기 사이토카인들이 천식에서 치료학적 표적이 되게 하였다. 실제로, 이들 사이토카인이 과발현되는 마우스 모델은 천식의 유의미한 특성들을 보여준다. 그후, 놀랍게도 특정한 타입-2 사이토카인을 차단함으로써 실험적 천식을 경감시키려는 노력은, IL-13을 억제시키는 것을 제외하면, 성공적이지 못한 것으로 판명되었다.

IL-13의 억제는 AHR과 기도 염증 둘 모두를 억제시키지만, 그 메커니즘은 여전히 불명확하다 (2, 3). 그러나, 천식의 복잡한 병리생리학과 병인에 대한 빈약한 이해를 고려하면, 개별 경로들을 표적으로 삼는 것이 궁극적으로 치료학적으로 성공적인 것으로 판명될 것인지 여부는 불분명하다.

최근, 구조적으로 관련있는 IL-17 사이토카인 패밀리의 구성원인, IL-25/IL-17E (8)의 과발현이 생체내에서 타입-2 반응을 유도하며(4-6) 기도 효능제에 대한 반응성을 증가시키는 것으로 드러났다(7). Il25^-/- 마우스는 기생선충을 제거하지 못하였는데, 효과없는 타입-2 반응의 핵심적 지시물질(9, 10)인 IL-25는 천식 환자로부터의 샘플에서 상향조절되는 것으로 또한 밝혀졌다.

염증성 장 질환

염증성 장 질환(IBD)는 대장 또는 결장의 점막에 영향을 미치는 만성 염증으로서, 궤양성 대장염(UC) 및 크론병(CD)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질병 상태를 전형적으로 포함한다. UC는 Th2 매개성 질병인 것으로 생각되는데, 대표적인 마우스 모델은 장 염증(gut inflammation)의 발생에 타입 2 사이토카인이 관여함을 나타낸다 (16). IL-25 생성은 Th1 타입 반응에서 Th2 타입 반응으로의 전환 (17)과 함께 만성 결장염의 마우스 모델에서 관찰되었고 (17), 마우스의 위장관 전체에 걸쳐서 IL-25 mRNA의 고발현이 보고되었다 (18). 더욱이, IL-25 유전자는 14번 염색체상의 크론병 감수성 영역내에 위치하지만, 크론병과의 잠재적 연관성은 조사를 해봐야 할 것이다 (19). 또한, IBD는 콜라겐 결장염, 림프구성 결장염, 허혈성 결장염, 전환 결장염(diversion colitis), 베체트 증후군, 감염성 결장염 및 불확정 결장염(indeterminate colitis)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질병 상태를 포함할 수 있다.

IBD 치료를 위한 통상적인 요법은 항생제 또는 스테로이드 유래된 약물을 포함하지만, 이러한 요법은 환자에서 임상적 완화(clinical remission)를 유도하거나이를 유지하는 데에 있어서 현재 성공적이지 못하다 (20). 항-TNF-α 작용제를 포함하는 요법이 또한 현재 이용가능하지만, 불량한 효능을 나타낸다 (21, 22). 이는 염증성 장 질환의 치료에서 더욱 효과적인 신규한 요법이 명백히 필요함을 보여준다.

항체

항체의 기본적인 구조는 당 분야에 널리 공지되어 있다. 천연 항체는 일반적으로 4개의 폴리펩티드 쇄을 지닌다: 이황화물 결합에 의해 연결된, 2개의 동일한 중쇄와 2개의 동일한 경쇄. 중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 각각은 불변 영역 및 가변 영역(또는 도메인)을 지닌다. 가변 영역은 주로 항원 결합을 담당한다. 각각의 가변 영역 내부에는 상보성-결정 영역(CDR)으로 공지된 3개의 하위영역(subregion)이 존재하며 이러한 하위영역이 항원과 접촉한다. 각각의 가변 도메인의 CDR들은 N-말단에서 C-말단 방향으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 번호매겨진다. 상기 CDR들의 N- 말단 및 C-말단 사이는 소위 4개의 프레임워크 영역이 존재하는데, 이러한 영역은 항원과 거의 접촉하지 않는다. 항체의 구조에 관한 더 상세한 사항은 하기 인용된 다수의 문헌들에 예시되어 있는데, 이러한 문헌들은 본원에 참고문헌으로 포함되어 있다.

표적 항원에 대한 항체를 생성시킬 수 있는 다수의 방법이 존재한다. 하이브리도마 기술을 이용하여 모노클로날 항체를 생성하는 것이 그 한 방법이다. 항체는 일반적으로 마우스 또는 다른 설치류에서 생성된다. 이는 고친화성 항체를 생성하기 위한 유용한 방법일 수 있다. 그러나, 이러한 항체가 인간 치료에서 유용하게 되기 위해서는, 일반적으로 그러한 항체의 CDR들을 인간 프레임워크내로 이동시킬 필요가 있다. 이는 환자에서 인간-항-마우스-항체 반응을 회피하고자 하기 위함이다.

CDR-그래프팅의 일반 원칙은 존스(Jones) 등의 문헌과 리히만(Riechman) 등의 문헌에 기재되어 있다 (11, 12). 즉, 마우스 항체의 CDR들이 수용(recipient) 인간 항체의 프레임워크내로 이식된다. 실제로는, 생성된 항체가 본래의 도너(donor) 마우스 항체와 동일한 표적 항원에 결합하지만, 그래프팅된 항체의 친화성은 대개 훨씬 감소한다.

또한, 그래프팅된 항체의 열안정성이 종종 약화될 수 있다.

본래의 항체의 특성을 회복하고 최적화하려는 다양한 방법이 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 프레임워크 영역내에는 특정한 배선(germline) CDR과 관련된 특정한 "케노니컬 구조(canonical structure)" 잔기 (Chothia & Lesk (13))가 존재한다. 또한, 푸트(Foote) & 윈터(Winter)의 문헌 (14)에는 "베르니에 존(Vernier zone)" 잔기들 (이들 중 일부는 또한 케노니컬 구조 잔기들임)이 확인되었는데, 이는 항원-결합 루프 형태 및 이들의 상대적 배열을 뒷받침하며, 이에 따라 항체가 항원에 맞추어지는 것을 미세 조정하는 데에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 제시되었다. 또한, 프레임워크내의 추가의 잔기들이 VH/VL 계면을 안정화시키고 유지시키는 것으로 믿어진다. 따라서, 항체를 인간화시키려는 당업자는 종종 베르니에 존, 케노니컬 및 인터페이스(Interface) ("VCI") 잔기가 본래의 도너 항체와 가능한 한 가깝게 상응하는 인간 프레임워크를 찾는다.

그러나, 각각의 항체는 당업자에게 특유한 문제점을 제시하며, CDR 그래프팅을 위한 어떠한 일반적으로 공지된 방법도 각각의 경우에 직접 적용될 수 있다는 확실성은 존재하지 않는다.

본 발명자들과 동료들 (Ballantyne et al (15))은 IL-25와 결합하고 생체내에서 알레르기성 천식의 기도 과민반응을 차단할 수 있는 마우스 모노클로날 항체인 2C3가 제조되었음을 보고하였다. 현재까지, 그러한 항체의 서열은 대중이 입수할 수 없는 상태이다.

2008년 10월 30일에 WO2008/129263로서 공개된 PCT/GB2008/001365에는 2C3 항체의 서열 그리고 기도 과민반응의 차단에 있어서 이의 용도가 보고되어 있다.

발명의 설명

본 발명은 2C3 서열을 기반으로 하는 인간화된 (CDR-그래프팅된) 항체에 관한 것이다. 이러한 항체를 생성함에 있어서, 다수의 문제점이 극복되어야 한다.

본 발명자들은 우선 최대 VCI 상동성을 지닌, 즉, 22개의 VCI 잔기들 중 20개를 지닌, 수용 인간 항체 VH 쇄를 선택하였다. 그러나, 생성된 항체 ("RHA")는 2C3 자체 보다 훨씬 작은 정도로 IL 25에 결합하는 것으로 나타났다. 체세포 변이를 거의 나타내지 않는 것으로 여겨진 VCI 지정 아미노산 및 잔기에 대한 변화를 포함하는, 그러한 항체에 대한 수 많은 추가 변형에도 불구하고, 항체 결합에 대한 개선은 거의 이루어지지 않았다.

항체 인간화를 위한 VCI 상동성 방법의 실패를 극복하기 위해, VCI 잔기 매치(match)는 적지만 (17/22) 전체 상동성이 아주 약간 높은 상이한 인간 VH 프레임워크가 선택되었다. 생성된 항체는 "RHA" 항체 보다는 높은 결합을 제공하였지만, 여전히 모(parent) 2C3 항체 만큼 높은 결합은 아니었다.

결합을 최대화시키고 항체 반응을 유발할 위험이 있는 비-인간 잔기를 최소화하기 위해, 추가의 프레임워크 및 CDR 변화가 이루어졌다. 생성된 항체는 2C3에 비해 향상된 결합을 지니는 것으로 나타났고, 기도-과민반응의 생체내 억제 시험에서 2C3 보다 훨씬 더 효능있는 것으로 나타났다. 또한, 이러한 항체는 양호한 열안정성을 나타내었다.

본 발명은 2C3으로부터 유래된 인간화된 VH 쇄에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은 이러한 쇄를 포함하는 항체에 관한 것이다. 이러한 항체는 2C3 VL CDR들을 포함하는 인간화된 VL 쇄를 포함할 수 있다.

따라서, 한 가지 양태에서, 본 발명은 하기 SEQ ID NO:1을 포함하는 항체 VH 도메인을 제공한다:

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Xa1 Xa2 Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Xa3 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Xa4 Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Xa5 Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

여기서,

Xa1은 Ser 또는 Thr이고;

Xa2는 Gly, Asp, Ala, Ser, Val, Asn, Lys, Tyr 또는 Met이고;

Xa3는 Met 또는 Ile이고;

Xa4는 Val 또는 Arg이고;

Xa5는 Asp, Asn 또는 Gly이다.

한 가지 양태에서, 잔기들 Xa1 내지 Xa5는 하기 조합들로부터 선택될 수 있다:

Xa1은 Ser 또는 Thr이고;

Xa2는 Gly 또는 Asp이고;

Xa3는 Met 또는 Ile이고;

Xa4는 Val 또는 Arg이고;

Xa5는 Asp, Asn 또는 Gly이다.

일부 구체예에서, Xa2는 Gly이고, Xa5는 Asp 또는 Asn, 바람직하게는 Asp이다.

일부 구체예 (Xa2가 Gly이고, Xa5가 Asp 또는 Asn, 바람직하게는 Asp인 구체예들을 포함함)에서, Xa1는 Ser이다.

일부 구체예 (Xa2가 Gly이고, Xa5가 Asp 또는 Asn, 바람직하게는 Asp인 구체예들을 포함함)에서, Xa1는 Thr이다.

상기 기재된 모든 Xa2, Xa5 및 Xa1의 조합들을 포함하는 일부 구체예에서, Xa3는 Met이다.

상기 기재된 모든 Xa2, Xa5 및 Xa1의 조합들을 포함하는 일부 구체예에서, Xa3는 Ile이다.

상기 기재된 모든 구체예들은 Xa4의 값 중 어느 하나, 즉, Val 또는 Arg과 조합될 수 있다.

상기 잔기들의 특정 조합들이 하기 표에 제시되어 있다. 독자의 편의를 위해 그리고 하기 실시예와의 일관성을 위해, 하기 표에는 잔기들의 Kabat 넘버링(numbering)이 기재되어 있다. 일부 경우, 이는 서열 목록의 넘버링과 상이하다.

VH 도메인은 경쇄 가변 도메인과 조합되어, IL-25와 결합하는 특정한 표적 결합 멤버를 제공할 수 있다.

적절한 경쇄 도메인은 2C3 항체의 CDR 잔기를 포함하는 것이다. 바람직하게는, 경쇄는 인간화된 경쇄인데, 즉, 인간 프레임워크 서열 및 2C3의 CDR 영역을 포함한다. 2C3의 경쇄 도메인은 SEQ ID NO:15로서 제시된다. CDR 영역 1 내지 3은 잔기 30-34를 포함할 수 있는데, 예를 들어 각각 잔기 24-34 (SEQ ID NO:29); 50-56 (SEQ ID NO:30) 및 89-97 (SEQ ID NO:31)을 포함할 수 있다.

CDR 잔기들은 원래의 2C3 항체 경쇄에 존재할 수 있거나 인간화된 경쇄 분자내로 옮겨질 수 있다.

잔기 35-38은 CDR을 포함하지는 않지만 마우스와 인간 경쇄 서열 간에 고도로 보존되며, 이러한 잔기들 또한 옮겨질 수 있다.

인간화된 VL 쇄의 예는 잔기 21-127인 SEQ ID NO:25를 포함한다. 그러나, SEQ ID NO:15의 3개의 CDR 영역을 포함하는 다른 인간 프레임워크가 또한 사용될 수 있다. 또한, 하기 설명되는 바와 같이, VL 쇄의 비-천연(non-native) 항체 리더 서열이 아닌 항체 리더 서열이 사용될 수 있다. 따라서, 한 가지 구체예에서, VL 쇄는 SEQ ID NO:25를 포함한다. 또 다른 구체예에서, VL 쇄는 SEQ ID NO:25의 잔기 21-127에 융합된 하기 기재된 것과 같은 항체 리더 서열을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 표적 결합 멤버의 용도를 제공하는데, 예를 들어 염증 질환, 예를 들어 천식 (알레르기성 천식을 포함함), 크론병 및 궤양성 대장염(ulcerative colitis)을 포함하는 질병을 치료하기 위한 약제 조성물 형태로서의 용도를 제공한다.

본 발명의 이러한 양태들 및 추가의 양태들은 하기에서 실시예를 참조하여 더욱 상세히 설명된다.

도 1은 2c3 마우스 항체의 카파 경쇄 뉴클레오티드 (SEQ ID NO:16) 및 아미노산 (SEQ ID NO:15) 서열을 도시한다. 음영은 CDR을 나타낸다.
도 2는 2c3 마우스 항체의 중쇄 뉴클레오티드 (SEQ ID NO:18) 및 아미노산 (SEQ ID NO:17) 서열을 도시한다. 음영은 CDR을 나타낸다.
도 3은 AY393094의 DNA (SEQ ID NO:20) 및 아미노산 (SEQ ID NO:19) 서열을 도시한다.
도 4는 인간화된 2c3 RHA의 DNA (SEQ ID NO:22) 및 아미노산 (SEQ ID NO:21) 서열을 도시한다.
도 5는 AY510106의 DNA (SEQ ID NO:24) 및 아미노산 (SEQ ID NO:23) 서열을 도시한다.
도 6은 인간화된 카파 경쇄 2c3 RKA의 DNA (SEQ ID NO:26) 및 아미노산 (SEQ ID NO:25) 서열을 도시한다.
도 7A 내지 도 7C는 인간화된 항체 2c3 RHA/RKA과 변이체의 결합 활성을 키메라 2c3과 비교한 도면이다.
도 8은 인간화된 2c3-RH2의 설계에 사용된 프레임워크 AJ399823의 DNA (SEQ ID NO:28) 및 아미노산 (SEQ ID NO:27) 서열을 도시한다.
도 9A 및 도 9B는 IL-25에 결합하는 데에 있어서 2c3 RH2bcdef에 대한 특정 CDR 변이의 효과를 도시한다.
도 10은 CDR 변이 D31G와 G96D를 조합시킨 경우 IL-25 결합에 대한 효과를 도시한다.
도 11은 2c3 RH2.5_S30T와 2c3 RH2.5_R71V가 IL-25에 결합하는 것을 비교한 도면이다.
도 12는 AHR의 생체내 마우스 모델에 대한 프로토콜이다.
도 13A 및 도 13B는 메타콜린으로 인한 폐 내성(pulmonary resistance)에 대한 2c3 RH2.5_R71V의 투여 효과를 도시한다.
도 14A 및 도 14B는 결장염 모델에서 마우스의 결장 길이 및 체중을 도시한다.

발명의 상세한 설명

표적 결합 멤버

상기 용어는 서로에 대해 결합 특이성을 지닌 한 쌍의 분자의 멤버를 나타낸다. 특정 결합 쌍의 멤버들은 천연적으로 유래되거나 완전히 또는 부분적으로 합성에 의해 생성될 수 있다. 분자들의 쌍 중의 하나의 멤버는, 분자들의 쌍 중의 나머지 멤버의 특정한 공간적 그리고 극성 체계(organization)에 특이적으로 결합하고 이에 따라 그러한 organisation에 상보적인 공동(cavity) 또는 영역을 그 표면상에 지닌다. 따라서, 그러한 쌍의 멤버들은 서로에 대해 특이적으로 결합하는 특성을 지닌다. 특정 결합쌍의 전형적인 예로는 항원 항체, 바이오틴 아비딘, 호르몬 호르몬 수용체, 수용체-리간드, 및 효소 기질이 있다.

본 출원은 항원 항체 유형 반응에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 표적 결합 멤버는 항체 분자의 적어도 일부, 더욱 상세하게는 그러한 분자의 항원-결합 도메인의 적어도 일부를 포함한다.

일반적으로, 항체의 중쇄 가변 영역 (VH 도메인)은 항체가 항원에 결합하는 데에 있어서 중요한 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 표적 결합 멤버들은 SEQ ID NO:1을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 것들을 기초로 한다.

본 발명의 VH 도메인을 제작하는 경우, CDR1과 CDR3 서열을 변화시킴으로써 2C3 항체 CDR 영역이 개선되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본원에 기재된 본 발명의 바람직한 구체예들은 Xa2가 Gly이고 Xa5가 Asp인 SEQ ID NO:1의 VH 도메인을 고려하지만, 본 발명은 또한 각각 SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35 및 SEQ ID NO:36의 CDR1 내지 3 영역을 함유하는 인간 프레임워크 영역을 지닌 인간화된 VH 도메인을 고려한다.

따라서, 추가의 양태에서, 본 발명은 IL-25와 결합하는 표적-결합 멤버로서, H1 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)이 SEQ ID NO:34의 아미노산 서열을 지닌, 표적 결합 멤버를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 IL-25와 결합하는 표적-결합 멤버로서, H2 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)이 SEQ ID NO:35의 아미노산 서열을 지닌, 표적 결합 멤버를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 IL-25와 결합하는 표적-결합 멤버로서, H3 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)이 SEQ ID NO:36의 아미노산 서열을 지닌, 표적 결합 멤버를 제공한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명은 IL-25와 결합하는 표적-결합 멤버로서, L1 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)이 SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 지닌, 표적 결합 멤버를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 IL-25와 결합하는 표적-결합 멤버로서, L2 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)이 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 지닌, 표적 결합 멤버를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 IL-25와 결합하는 표적-결합 멤버로서, L3 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)이 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 지닌, 표적 결합 멤버를 제공한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 IL-25와 결합하는 표적-결합 멤버로서, H1 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)이 SEQ ID NO:34의 아미노산 서열을 지니고 H2 중쇄 상보성 결정 영역이 SEQ ID NO:35의 아미노산 서열을 지니고 H3 중쇄 상보성 결정 영역이 SEQ ID NO:36의 아미노산 서열을 지닌, 표적 결합 멤버를 제공한다. 한 가지 구체예에서, 그러한 표적 결합 멤버는 SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 지닌 L1 경쇄 CDR, SEQ ID NO:30을 지닌 L2 경쇄 CDR 및 SEQ ID NO:31을 지닌 L3 경쇄 CDR을 지닌다.

그러한 표적-결합 멤버들의 프레임워크는 오로지 인간일 수 있거나, 오로지 뮤린(murine)일 수 있거나, 본 발명에 따르면, 주로 인간이지만 결합 친화성을 향상시키도록 하나 이상의 뮤린 잔기를 보유하는 프레임워크일 수 있다.

따라서, 상기 CDR들을 포함하는 표적 결합 멤버들은 본 발명의 추가의 양태를 형성하고, SEQ ID NO:1을 포함하는 VH 도메인을 지닌 표적 결합 멤버들에 대해 본원에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.

일반적으로, 표적 결합 멤버는, 항체 항원 결합 도메인을 제공하기 위해 VL 도메인과 쌍을 이룬 VH 도메인을 포함한다. 한 가지 구체예에서, VH 도메인은, CDR들 그리고 임의로 인간과 마우스 사이에 보존된 임의의 프레임워크 잔기들이 2C3 항체로부터 유래된 것인 VL 도메인과 쌍을 이룬다.

그러나, 경쇄 불규칙성(promiscuity)은 본원에서 추가로 논의되는 바와 같이 당 분야에 잘 확립되어 있고, 이에 따라 VH는 2C3 유래된 VL이 아닌 VL 도메인과 쌍을 이룰 수 있다. 이러한 VL은 본원에서 하기 논의되는 바와 같이 선택될 수 있다.

면역글로불린 가변 도메인의 구조 및 위치는 문헌 [Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services. 1987] 및 이의 최신판들을 참조하여 결정될 수 있다. 이러한 데이터베이스에 질의하기 위해 다수의 학술 및 상업적 온라인 수단을 이용할 수 있다 (참조예: Martin, A.C.R. Accessing the Kabat Antibody Sequence Database by Computer PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 25 (1996), 130-133 and the associated on-line resource, currently at the web address of http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html).

본 발명에 따른 표적 결합 멤버는 하기 기재된 RHA2.5 R71V 항체의 친화성, 예를 들어 + 10%와 실질적으로 유사한 친화성을 지니며 IL-25와 결합할 수 있다. 표적 결합 멤버는 대체로 IL-25에 대해 특이적이다. 따라서, 표적 결합 멤버는 이의 특이적 결합 파트너(들)이 아닌 분자들에 대해 임의의 현저한 결합을 나타내지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 항체가 유래되는 2C3 항체는 IL-4, IL-5 및 IL-13과 교차반응하지 않으며, 이에 따라 천식 및 유사한 과정에 관여하는 다른 사이토카인들에 대한 교차반응성이 회피되는 것이 본 발명의 표적 결합 멤버들의 바람직한 특징인 것으로 밝혀졌다.

전형적으로, 특이성은 일련의 항원들을 사용하는 ELISA와 같은 결합 검정에 의해 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 표적 결합 멤버는 IL-25를 인식할 수 있지지만 IL-17 패밀리의 다른 멤버들, 특히 IL-17A, IL-17B 및 IL-17C 중 어느 하나, 더욱 바람직하게는 IL-17A, IL-17B 및 IL-17C 셋 모두를 인식할 수 없다. 본 발명에 따른 표적 결합 멤버가 IL-25와 결합하는 것은 재조합 IL-25와의 경합에 의해 제거될 수 있다.

다양한 표적 결합 멤버들의 결합 친화성 및 중화 역가(neutralisation potency)는 적절한 조건하에서 비교될 수 있다.

항체 분자

상기 용어는 천연적인 것이든 부분적으로 또는 완전히 합성에 의해 생성된 것이든 면역글로불린을 나타낸다. 전항체의 단편들이 결합 항원들의 기능을 수행할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 항체라 함은 또한 항체 결합 단편을 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다.

결합 단편들의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)); (v) 2개의 연결된 Fab 단편들을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vi) VH 도메인과 VL 도메인이 펩티드 링커에 의해 연결되어 있으며 상기 펩티드 링커는 상기 2개의 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 회합될 수 있게 하는, 단일 쇄 Fv 분자 (scFv) (Bird et al, Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); (vii) 2중특이적 단일 쇄 Fv 이량체 (PCT/US92/09965); 및 (viii) 유전자 융합에 의해 구성된 다가 또는 다중특이적 단편인 "디아바디(diabody)" (WO94/13804; P. Holliger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993). Fv, scFv 또는 디아바디 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결시키는 이황화물 다리를 포함시킴으로써 안정화될 수 있다 (Y. Reiter et al, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996). CH3 도메인에 결합된 scFv를 포함하는 미니보디(minibody)가 또한 제조될 수 있다 (S. Hu et al, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996).

2중특이적 항체가 사용되는 경우, 이러한 항체는 예를 들어 화학적으로 제조되거나 하이브리드 하이브리도마로부터 제조되는 바와 같이 다양한 방법으로 제조될 수 있는 2중특이적 항체 (Holliger, P. and Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993))일 수 있거나, 상기 언급된 2중특이적 항체 단편들 중 어느 하나일 수 있다. 디아바디 및 scFv는 단지 가변 도메인만을 사용하여 Fc 영역없이 구성될 수 있는데, 이는 항-이디오타입 반응의 효과를 잠재적으로 감소시킨다.

2중특이적 전항체와 대조적으로 2중특이적 디아바디가 또한 특히 유용할 수 있는데, 그 이유는 이러한 디아바디가 용이하게 작제될 수 있고 대장균에서 발현될 수 있기 때문이다. 적절한 결합 특이성을 지닌 디아바디 (및 항체 단편들과 같은 많은 다른 폴리펩티드)는 라이브러리로부터 파지 디스플레이 (WO94/13804)를 이용하여 선택될 수 있다. 디아바디의 한 쪽 아암(arm)이, 예를 들어 IL-25에 대한 특이성을 지닌 채로, 일정하게 유지되는 경우, 나머지 아암이 변화되는 라이브러리가 제조되고 적절한 특이성을 지닌 항체가 선택될 수 있다. 2중특이적 전항체는 놉-인투-홀 엔지니어링(knob-into-hole engineering)에 의해 제조될 수 있다 (J. B. B. Ridgeway et al, Protein Eng., 9, 616-621, 1996).

모노클로날 및 다른 항체로부터 재조합 DNA 기술을 이용하여 본래의 항체의 특이성을 보유하는 다른 항체 또는 키메라 분자를 생성시키는 것이 가능하다. 그러한 기술은 항체의 면역글로불린 가변 영역 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 엔코딩하는 DNA를 상이한 면역글로불린의 불변 영역 또는 불변 영역 + 프레임워크 영역에 도입시키는 것을 포함할 수 있다 (참조: EP-A-184187, GB 2188638A 또는 EP-A-239400).

바람직하게는, 2C3의 VL 쇄의 CDR 영역이 인간 프레임워크 영역내로 그래프팅된다. 인간 프레임워크 영역은 다수의 방법에 의해 선택될 수 있는데, 예를 들어 마우스 프레임워크 영역 또는 마우스 VL 영역 서열을 공지된 인간 프레임워크 또는 VL 영역 서열과 비교하고 최대의 아미노산 유사성 또는 동일성 정도를 지니거나 최대의 아미노산 유사성 또는 동일성 정도들 중 하나를 지니는 인간 프레임워크 영역을 선택하는 방법이 있다. 천연 인간 서열의 프레임워크 영역들에 대한 변형은 생성된 CDR 그래프팅된 항체를 추가로 최적화하기 위해 이루어질 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태에서 VH와 VL 도메인 쌍을 포함하는 항체 분자들이 바람직하지만, VH 또는 VL 도메인 서열들 중 어느 하나를 기반으로 하는 단일 결합 도메인들이 본 발명의 추가의 양태들을 형성한다. 단일 면역글로불린 도메인, 특히 VH 도메인이 특이적 방식으로 표적 항원과 결합할 수 있는 것으로 알려져 있다.

단일 쇄 결합 도메인들 중 어느 하나의 경우, 이러한 도메인들은 본원에서 하기에 추가로 논의되는 바와 같이 IL 25와 결합할 수 있는 2-도메인(two-domain) 표적 결합 멤버를 형성할 수 있는 상보적 도메인들을 스크리닝하는 데에 사용될 수 있다.

본 발명의 항체 분자는 항체 불변 영역 또는 이의 일부를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 이의 C-말단 단부에서 인간 Cκ 또는 Cλ쇄, 바람직하게는 Cκ쇄를 포함하는 항체 경쇄 불변 도메인에 결합될 수 있다. 유사하게, VH 도메인을 기반으로 하는 표적 결합 멤버는 이의 C-말단 단부에서 임의의 항체 이소타입, 예를 들어 IgG, IgA, IgE 및 IgM 그리고 이소타입 서브클래스(sub-class) 중 어느 하나, 특히 IgG1 및 IgG4로부터 유래되는 면역글로불린 중쇄의 전부 또는 일부에 결합될 수 있다. IgG4가 바람직하다. WO99/58572에 기재된 Δnab 및 Δnac와 같은 Fc 영역이 사용될 수 있다.

따라서, 또 다른 폴리펩티드에 융합된 표적 결합 도메인 또는 등가물을 포함하는 키메라 분자가 포함된다. 키메라 항체의 클로닝 및 발현은 EP-A-0120694 및 EP-A-0125023에 기재되어 있다.

또한, 본 발명의 항체 분자의 프레임워크 영역은 하나 이상의 당화(glycosylation) 부위를 포함하는 당화 서열을 포함할 수 있다. 표적 결합 멤버가 발현되는 숙주 세포에 따라, 당화 패턴이 달라질 수 있다. 따라서, 당화 부위들을 엔코딩하는 핵산 작제물은 그러한 부위를 제거하도록 변형되거나 그러한 부위들이 단백질내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 진핵생물 단백질에서 N-당화 부위들은 아미노산 트리플렛(triplet) Asn-X-Y를 특징으로 하는데, 여기서 X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산이고 Y는 Ser 또는 Thr이다. 이러한 트리플렛들을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 적절한 치환, 첨가 또는 결실은 Asn 측쇄에서의 탄수화물 잔기의 결합을 억제한다. 예를 들어 Asn이 상이한 아미노산으로 대체되도록 선택되는 단일 뉴클레오티드의 변화가 N-당화 부위를 비활성화시키기에 충분하다. 단백질에서 N-당화 부위를 비활성화시키기 위한 공지된 절차들로는 미국 특허 제 5,071,972호 및 EP 276,846에 기재된 것들이 있다.

항원-결합 도메인

상기 용어는 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 이에 상보적인 영역을 포함하는 항체 분자의 일부를 나타낸다. 항원이 큰 경우, 항체는 그러한 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있는데, 상기 특정 부분은 에피토프라 명명된다. 항원 결합 도메인은 하나 이상의 항체 가변 도메인에 의해 제공될 수 있다 (예를 들어, VH 도메인으로 구성된, 소위 Fd 항체 단편). 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 적어도 항체 경쇄 가변 영역(VL)의 상당 부분 그리고 적어도 항체 중쇄 가변 영역(VH)의 상당 부분을 포함한다.

면역글로불린 가변 도메인의 상당 부분은 적어도 3개의 CDR 영역을 그 사이에 있는 프레임워크 영역과 함께 포함한다. 바람직하게는, 상기 상당 부분은 제 1 프레임워크 영역과 제 4 프레임워크 영역 중 어느 하나 또는 둘 모두의 적어도 약 50%를 또한 포함하는데, 이러한 50%는 제 1 프레임워크 영역의 C-말단 50%와 제 4 프레임워크 영역의 N-말단 50%이다. 상기 가변 도메인의 상당한 부분의 N-말단 또는 C-말단 단부에 있는 추가의 잔기들은 정상적으로는 천연 가변 도메인 영역과 관련되지 않은 잔기들일 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 본 발명의 표적 결합 멤버들을 작제하는 것은 클로닝 또는 다른 조작 단계들을 용이하게 하도록 도입되는 링커들에 의해 엔코딩되는 N- 또는 C-말단 잔기들을 도입시킬 수 있다. 다른 조작 단계들은 면역글로불린 중쇄, 다른 가변 도메인 (예를 들어, 디아바디를 생성시키는 경우) 또는 하기 더욱 상세히 논의되는 단백질 표지를 포함하는 추가의 단백질 서열에 본 발명의 가변 도메인을 결합시키기 위해 링커를 도입하는 것을 포함한다.

포함하다

상기 용어는 포괄한다는 의미로 일반적으로 사용되는데, 즉, 하나 이상의 특징들 또는 성분들의 존재를 허용한다는 의미이다.

분리된

상기 용어는 VH 도메인들, 본 발명의 표적 결합 멤버들, 또는 이러한 결합 멤버드릉ㄹ 엔코딩하는 핵산이 본 발명에 따라 일반적으로 존재하는 상태를 지칭한다. 멤버들 및 핵산은 이러한 멤버들과 핵산과 천연 상태에서 결합되어 있는 물질, 예를 들어 상기 멤버들과 핵산이 천연 환경 또는 상기 멤버들과 핵산이 시험관내 또는 생체내에서 실시되는 재조합 DNA 기술에 의해 제조되는 경우 그렇게 제조되는 환경 (예를 들어, 세포 배양)에서 함께 발견되는 다른 폴리펩티드들 또는 핵산들을 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않는다.

표적 결합 멤버들 및 핵산은 희석제 또는 애주번트와 함께 제형화될 수 있고 여전히 실용적인 목적을 위해 분리될 수 있는데, 예를 들어, 상기 멤버들은 면역검정에 사용되는 마이크로타이터 플레이트를 코팅하기 위해 사용되는 경우 젤라틴 또는 다른 담체들과 일반적으로 혼합되거나, 진단 또는 치료에 사용되는 경우 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 혼합된다. 표적 결합 멤버들은 천연적으로 또는 이종성 진핵생물 세포(예를 들어, CHO 또는 NS0 (ECACC 85110503) 세포)의 시스템에 의해 당화될 수 있거나, 당화되지 않을 수 있다(예를 들어, 원핵생물 세포에서의 발현에 의해 생성되는 경우).

표적 결합 멤버의 추가적인 특징.

본 발명에 따른 표적 결합 멤버는, 항체 서열에 더하여, 다른 아미노산들을 포함할 수 있는데, 이는 예를 들어, 폴딩된 도메인과 같은 펩티드 또는 폴리펩티드를 형성하거나 항원과 결합하는 특성에 더하여 또 다른 기능적 특징을 분자에 부여하기 위함이다. 본 발명의 표적 결합 멤버들은 검출가능한 표지를 함유하거나 (예를 들어, 펩티딜 결합 또는 링커를 통해) 독소 또는 효소에 컨쥬게이션될 수 있다.

검출가능한 표지는 131I 또는 99Tc와 같은 방사성표지를 포함하는데, 이러한 방사성표지는 항체 이미지화(antibody imaging) 분야에 공지된 통상적인 화학을 사용하여 본 발명의 항체에 부착될 수 있다. 표지는 또한 호스라디쉬 퍼옥시다제와 같은 효소 표지를 포함한다. 표지는 검출가능한 특이적 동족(cognate) 모이어티, 예를 들어, 표지된 아비딘에 결합하는 것을 통해 검출될 수 있는 바이오틴과 같은 화학적 모이어티를 추가로 포함한다.

추가적인 특징이 폴리펩티드 도메인 또는 표지인 경우, 표적 결합 멤버는 재조합 기법에 의해, 즉, 표적 결합 멤버와 그러한 추가 도메인의 융합체를 엔코딩하는 핵산의 발현에 의해, 생산될 수 있다.

쇄 셔플링(Chain Shuffling)

본 발명의 추가의 양태는 IL-25에 대한 항체-항원 결합 도메인을 수득하기 위한 방법을 제공하는데, 이러한 방법은 본 발명의 표적 결합 멤버의 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 조합하고, 이러한 VH/VL 조합물 또는 조합물들을 IL-25에 대한 항체-항원 결합 도메인에 대해 시험하는 것을 포함한다.

상기 VL 도메인은 실질적으로 본원에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 지닐 수 있다.

본원에 기재된 VL 도메인의 하나 이상의 서열 변이체를 하나 이상의 VH 도메인과 조합하는 유사한 방법이 이용될 수 있다.

이는 WO92/01047호에 개시된 것과 같은 소위 계층적 이중 조합법(hierarchical dual combinatorial approach)을 사용하는 파지 디스플레이 스크리닝 방법에 의해 달성될 수 있는데, 이러한 방법에서, H 또는 L 쇄 클론 중 어느 하나를 함유하는 개별 콜로니가 나머지 쇄(L 또는 H)를 엔코딩하는 클론들의 완전한 라이브러리를 감염시키기 위해 사용되고 그 결과 생성된 2쇄(two-chain) 표적 결합 멤버가 상기 문헌에 기재된 기법과 같은 파지 디스플레이 기법에 따라 선별된다.

따라서, 본 발명은 IL-25에 대해 항체 분자를 선별하는 방법을 제공하는데, 이러한 방법은,

(a) IL-25에 결합하며 본 발명의 항체 VH 도메인을 포함하는, 표적 결합 멤버를 포함하는 VH 도메인을 제공하고;

(b) 상기 VH 도메인을 다수의 항체 VL 도메인과 조합하여 항체 분자들을 제공하고;

(c) 상기 항체 분자들을 IL-25에 결합하는 것에 대해 스크리닝하고;

(d) IL-25에 결합하는 항체 분자를 선별하는 것을 포함한다.

이러한 방법에서, VH 및 VL 도메인은 재조합 DNA, 특히, 파지 또는 파지미드 DNA에 의해 발현되는 단백질의 형태로 제공될 수 있다.

상기 다수의 VL 도메인은 10⁴개 이상의 개별 도메인, 예를 들어, 10⁶ 내지 10⁸개 또는 10¹⁰개 도메인일 수 있다.

항체 분자, 및 그러한 분자를 엔코딩하는 핵산은 본 발명의 추가의 부분을 형성할 수 있다.

IL-25

당 분야에서 IL-17E로도 일컬어지는 IL-25는, 상업적인 공급원(예를 들어, R&D Systems, MN, USA)으로부터 구입가능하거나 당 분야에서 이용가능한 IL-25의 서열을 참조하여 클로닝되거나 합성될 수 있다. 뮤린 IL-25 (NCBI 단백질 NP_542767)는 허스트 등의 문헌[Hurst et al, 2002 (하기 참고문헌 7 참조)]에 기재되어 있다. 인간 IL-25 (NCBI 단백질 Q9H293)는 포트 등의 문헌[Fort et al (하기 참고문헌 4 참조)]에 기재되어 있다. 항체의 생산 또는 면역검정에서의 용도를 위해, 재조합 IL-25의 단편이 사용될 수 있는데, 특히 N-말단에서 트렁케이팅된(truncated) 것들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 시판되는 재조합 인간 IL-25 (IL-17E)는 수탁번호 Q9H293의 Tyr 33 - Gly 177의 성숙한 단백질 서열을 포함하고, 시판되는 뮤린 IL-25는 마우스 IL-17E의 잔기 Val 17 - Ala 169 (수탁번호 NP_542767)를 포함한다.

핵산 및 벡터

추가 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 표적 결합 멤버, VH 도메인 또는 VL 도메인을 엔코딩하는 서열을 포함하는 분리된 핵산, 그리고 본 발명의 표적 결합 멤버, VH 도메인 또는 VL 도메인을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 표적 결합 멤버, VH 도메인 또는 VL 도메인을 생성시키게 하는 조건하에서 상기 핵산을 발현시키고, 이를 회수하는 단계를 포함한다.

본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:40 (중쇄에 대한 것) 또는 SEQ ID NO:26 (경쇄에 대한 것)의 서열, 또는 이의 관련 부분, 또는 본 발명의 다른 VH 및 VL 도메인을 엔코딩하도록 예를 들어 특정 부위 변이유발(site-directed mutagenesis)에 의해 변형된 이러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 또한, 요망되는 숙주 세포에서 서열의 발현을 최적화시키기 위해 코돈 사용빈도(codon usage)가 달라질 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 표적 결합 멤버를 엔코딩하는 분리된 핵산을 제공한다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함한다.

본 발명에 따른 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있고, 완전히 또는 부분적으로 합성적일 수 있다. 본원에 제시된 뉴클레오티드 서열은 특정 서열을 지닌 DNA 분자를 포함하고, 별다른 기재가 없는 한 U가 T 대신 치환된 특정 서열을 지닌 RNA 분자를 포함한다.

또한, 본 발명은 벡터를 제공하는데, 예를 들어, 플라스미드, 바이러스, 예를 들어, 파지, 또는 파지미드, 코스미드, 상기 하나 이상의 핵산을 하나 이상 포함하는 전사 또는 발현 카세트의 형태로 벡터를 제공한다.

프로모터 서열, 터미네이터 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 적절한 다른 서열을 포함하는, 적절한 조절 서열을 함유하는 적합한 벡터가 선택되거나 작제될 수 있다. 추가의 세부 사항에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press]이 참조된다.

또한, 본 발명의 벡터는 생체내에서 인간 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 벡터, 예를 들어, 아데노바이러스, 레트로바이러스 또는 아데노 관련 바이러스 벡터를 포함한다. 그러한 벡터는 인간 또는 동물 피검체의 세포에서 본 발명의 표적 결합 멤버를 발현시킴으로써 상기 표적 결합 멤버를 생성시켜서 상기 피검체로 전달하는 데에 유용할 수 있다.

본 발명의 표적 결합 멤버를 엔코딩하는 핵산 서열은 한 가지 양태에서는 숙주 세포에서 그러한 표적 결합 멤버의 발현을 일으키도록 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 그러한 서열은 숙주 세포내에서 및/또는 이러한 숙주 세포로부터 표적 결합 멤버의 발현 및/또는 분비를 촉진시키도록 이의 5' 단부에 선도 서열을 포함할 수 있다. 다수의 적합한 선도 서열이 당 분야에 그 자체로 공지되어 있고, 숙주 세포를 고려하여 당업자에 의해 선택될 수 있다.

적합한 선도 서열로는 임의의 인간 또는 다른 포유동물 면역글로불린 선도 서열이 있지만, 포유동물 비-면역글로불린 선도 서열 또는 합성 선도 서열이 대신 사용될 수 있다. 바람직하게는, VH 쇄의 발현을 위해, 인간 VH 선도 서열이 사용될 수 있다. 바람직하게는, VL 쇄의 발현을 위해, 인간 VL 선도 서열이 사용된다.

본 발명의 VH 도메인의 발현을 위한 적합한 선도 서열은 다음과 같다:

MGSTAILGLLLAVLQGVCA (SEQ ID NO:37).

본 발명의 VL 도메인의 발현을 위한 적합한 선도 서열은 인간 또는 뮤린 VK 선도 서열이다. 이러한 서열은 2C3 선도 서열인 MRVPAQLLGLLLLWLPDTRC (SEQ ID NO:38) 또는 인간 동족체(homologue), 예를 들어 MDMRVPAQLLGLLLLWLPDTRC (SEQ ID NO:39)일 수 있다.

하기 실시예에서, 본 발명자들은 항체 선도 서열로 시작되는 코딩 서열에 선행하는 HindIII 부위 및 컨센서스 Kozak 서열 (AAGCTTGCCGCCACC, SEQ ID NO:41)을 포함하는 발현 작제물을 사용하였다. 이는 포유동물 숙주 세포에서 항체 도메인들을 발현시키기에 적합한다. 그러나, 실험자의 선호도 그리고 항체 도메인을 발현시키려는 숙주 세포에 따라 다른 작제물들이 사용될 수 있다.

예를 들어 핵산 작제물의 제조에 사용되는, 핵산의 조작, 돌연변이유발, 시퀀싱, DNA의 세포내 도입과 유전자 발현, 및 단백질의 분석을 위한 다수의 공지된 기법들 및 프로토콜들 하기 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992]에 상세하게 기재되어 있다. 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌과 아우수벨(Ausubel) 등의 문헌에 교시된 내용이 본원에 참조로 포함된다.

숙주 세포 및 표적 결합 멤버의 생산

추가의 양태는 본 발명의 핵산 (예를 들어, 벡터 형태의 핵산 서열)으로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.

한 가지 구체예에서, 본 발명의 핵산은 숙주 세포의 게놈 (예를 들어, 염색체)내로 통합된다. 통합은 표준 기법에 따라서, 게놈과의 재조합을 촉진시키는 서열을 포함시킴으로써 촉진될 수 있다.

추가의 양태는 본 발명의 표적 결합 멤버의 생산 방법을 제공하는데, 이러한 방법은 엔코딩 핵산으로부터 발현을 유발시키는 것을 포함한다. 그러한 방법은 상기 표적 결합 멤버가 생산되는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.

발현에 의한 생산후, VH 또는 VL 도메인, 또는 표적 결합 멤버는 임의의 적합한 기법을 사용하여 분리 및/또는 정제될 수 있고, 이후 적절하게 사용될 수 있다. 생산 방법은 생성물의 분리 및/또는 정제 단계를 포함할 수 있다.

생성물의 정제후, 표적 결합 멤버는, 예를 들어 단백질의 안정성 또는 생물학적 반감기를 변화시키는, 예를 들어 증가시키는, 보호기를 도입하기 위해, 물리적 또는 화학적 수단에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 그러한 효과를 달성하기 위한 단백질의 페길화(PEGylation)가 당 분야에 그 자체로 공지되어 있고, 본 발명의 표적 결합 멤버들은 페길화된 형태로 존재할 수 있다.

생산 방법은 하나 이상의 추가 성분, 예를 들어 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물로 상기 생성물을 제형화시키는 것을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기한 바와 같이 하나 이상의 핵산 또는 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 그 자체로 제공되는 임의의 CDR, VH 또는 VL 도메인, 또는 표적 결합 멤버를 엔코딩하는 핵산은 본 발명의 양태를 형성하며, 엔코딩된 생성물에 대한 엔코딩 핵산으로부터 발현시키는 것을 포함하는 엔코딩된 생성물의 생산 방법도 본 발명의 양태를 형성한다.

다양한 상이한 숙주 세포에서 폴리펩티드를 클로닝하고 발현시키기 위한 시스템은 잘 알려져 있다. 적합한 숙주 세포는 박테리아, 포유동물 세포, 효모 및 배큘로바이러스(baculovirus) 시스템을 포함한다. 이종성 폴리펩티드의 발현을 위해 당 분야에서 입수가능한 포유동물 세포주로는 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary) 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 세포, NS0 마우스 흑색종 세포, YB2/0 래트 골수종 세포 및 많은 기타 세포가 있다. 바람직한 통상적인 박테리아 숙주는 E. coli이다.

원핵생물 세포, 예를 들어 E. coli에서 항체 및 항체 단편을 발현시키는 것은 당 분야에 잘 확립되어 있다 (참조: Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991)). 배양 중인 진핵생물 세포에서 발현시키는 것이 또한 표적 결합 멤버의 생산을 위한 옵션으로써 당업자가 이용할 수 있다 (참조: Ref, M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576; Trill J.J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560.

조성물

따라서, 본 발명에 따른 약제 조성물은 본 발명에 따라 사용되는 경우 활성 성분에 더하여 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 당업자에게 잘 알려진 다른 물질을 포함할 수 있다. 그러한 물질은 무독성이어야 하며 활성 성분의 효능을 간섭하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 특성은 투여 경로에 좌우될 것인데, 그러한 경로는 경구, 또는 주사, 예를 들어, 정맥 주사일 수 있다.

표적 결합 멤버의 치료용 제형은, 동결건조된 분말 또는 수용액의 형태로, 요망되는 순도를 지니는 표적 결합 멤버를 임의의 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 저장용으로 제조될 수 있다 (참조: "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins.). 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 유해하지 않고, 이는 완충제, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코브산을 포함하는 항산화제; 저분자량(약 10개 잔기 미만의) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라진, 아르기닌 또는 리신; 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA; 당 알코올, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예를 들어 소듐; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈(Tween), 플루로닉(Pluronics) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.

생체내 투여용으로 사용되는 표적 결합 멤버의 경우, 이는 멸균 상태이어야 한다. 멸균은 동결건조 및 재구성 이전에 또는 이후에 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 표적 결합 멤버는 통상적으로 동결건조된 형태 또는 용액 상태로 저장된다.

경구 투여용 약제 조성물은 정제, 캡슐, 분말 또는 액체 형태일 수 있다. 정제는 고체 담체, 예를 들어 젤라틴 또는 애쥬번트를 포함할 수 있다. 액체 약제 조성물은 일반적으로 액체 담체, 예를 들어 물, 페트롤리움(petroleum), 동물성 또는 식물성 오일, 미네랄 오일 또는 합성 오일을 포함한다. 생리학적 식염수 용액, 덱스트로스 또는 다른 당류 용액 또는 글리콜, 예를 들어 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다.

정맥 주사 또는 환부로의 주사의 경우, 활성 성분은 발열원(pyrogen)이 없고 적당한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용가능한 수용액의 형태이다. 당업자는, 예를 들어 등장성 비히클, 예를 들어 소듐 클로라이드 주사액, 링거 주사액, 락테이트화된 링거 주사액을 사용하여 적합한 용액을 충분히 제조할 수 있다. 방부제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요에 따라 포함될 수 있다.

본 발명의 치료학적 용도

본 발명은 IL-25에 대한 항체가 천식의 핵심적인 증상인 생체내 기도 과민반응을 예방하거나 감소시키는 데에 효과적이라는 최초로 입증하였다. 따라서, 한 가지 양태에서, 본 발명은 기도 과민반응을 치료할 필요가 있는 피검체 (예를 들어, 인간)에서 기도 과민반응을 예방하거나 감소시키는 방법을 제공하는데, 이러한 방법은 상기 피검체에게 IL-25에 결합하는, 표적 결합 멤버, 특히 항체 분자를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 천식을 치료할 필요가 있는 피검체에서 천식을 예방, 감소 또는 치료하는 방법을 제공하는데, 이러한 방법은 상기 피검체에게 IL-25에 결합하는, 표적 결합 멤버, 특히 항체 분자를 투여하는 것을 포함한다. 천식은 알레르기성 천식을 포함한다.

상기 방법은 본 발명에 따른 표적 결합 멤버 (이의 조성물을 포함함)를 사용하여 실시될 수 있는데, 상기 표적 결합 멤버는, IL-25에 결합하고, 바람직하게는 IL-25의 작용을 길항하는 데에 있어서 유용하며 IL-25가 소정의 역할을 담당하는 다양한 질병 및 장애에서 치료 잠재력을 지닌다. 그러한 질병들로는 천식 뿐만 아니라 염증과 관련된 다른 질환, 예를 들어 크론병 및 궤양성 대장염이 있다. 또한, 상기 방법은 하기 실시예에 기재된 바와 같이 수득될 수 있는 IL-25에 결합하는 다른 표적 결합 멤버 (이의 조성물을 포함함)를 사용하여 실시될 수 있다.

본 발명에 따른 표적 결합 멤버 (이의 조성물을 포함함)은 인간 또는 동물 피검체의 치료 (예방적 치료를 포함함) 또는 진단 방법에 사용될 수 있다. 그러한 치료 또는 진단 방법 (예방적 치료를 포함할 수 있음)은 상기 피검체에게 유효량의 본 발명의 표적 결합 멤버를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 대표적인 질병 및 장애는 하기에서 상세히 논의된다.

또한, 인간 또는 동물 피검체에게 투여하기 위한 약제 제조에 있어서 본 발명의 표적 결합 멤버 (이의 조성물을 포함함)의 용도가 제공된다.

치료적 이익을 제공하기 위해 항-IL-25 표적 결합 멤버가 사용될 수 있는 임상 적응증(indications)으로는 IL-25가 병리학적 중요성을 갖는 임의의 질환이 있다. 따라서, 일반적으로, 본 발명의 표적 결합 멤버는 원치 않는 Th2 반응 또는 타입-2 반응과 관련된 임의의 질환의 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 표적 결합 멤버는 알레르기 및 천식, 특히 천식의 치료에 사용될 수 있다.

항-IL-25 치료제는 주사 (예를 들어, 정맥 주사) 또는 국소 전달 방법에 의해 주어질 수 있다. 항-IL-25는 유전자-매개 기술에 의해 전달될 수 있다. 대안적인 제형화 전략은 경구 또는 좌제 경로에 적합한 제제를 제공할 수 있다. 투여 경로는 효능을 최적화시키거나 부작용을 최소화하기 위해 치료제의 물리화학적 특성, 질병에 관한 특별한 고려사항에 의해 결정될 수 있다.

본 발명에 따르면, 제공된 조성물은 개체에 투여될 수 있다. 투여는 바람직하게는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되는데, 이는 환자에게 이익을 나타내기에 충분한 양이다. 그러한 이익은 하나 이상의 증상의 적어도 완화일 수 있다. 투여되는 실제 양, 및 투여의 속도 및 시간-경과는 치료되어야 하는 것의 특성 및 중증도에 좌우될 것이다. 치료의 처방, 예를 들어, 투여량에 관한 결정 등은 일반적인 처방의 및 다른 의사의 책임에 속한다. 항체의 적절한 투여량은 당 분야에 잘 알려져 있다 (참조: Ledermann J.A. et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664; Bagshawe K.D. et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922).

정확한 투여량은 항체가 진단용인지 치료용인지 여부, 치료될 부위의 크기 및 위치, 항체의 정확한 특성 (예를 들어, 전항체, 단편 또는 디아바디), 및 항체에 부착된 임의의 검출가능한 표지 또는 기타 분자의 특성을 포함하는, 다수의 인자들에 좌우된다. 전형적인 항체 투여량은 0.5mg - 1.0g 의 범위이고, 이는 요구되는 투여량을 달성하기 위해 적절한 경우 수 시간에 걸쳐 주입액(infusion)으로서 또는 볼루스(bolus)로서 정맥내 투여될 수 있다. 투여의 다른 양상은, 유사한 총 누적 투여량을 달성하기 위해 수 시간에 걸친 정맥내 주입을 포함한다. 이는 성인 환자의 1회 치료를 위한 투여량인데, 이는 어린이와 유아에 대해 비례적으로 조정될 수 있고, 또한 분자량에 비례하여 다른 항체 포맷을 위해 조정될 수 있다. 치료는 의사의 재량에 따라 매일, 1주에 2회, 매주 또는 매월 간격으로 반복될 수 있다.

투여의 추가의 양상은 유치 장치(indwelling devices)의 사전코팅(precoating), 또는 이러한 장치내로의 혼입을 포함하는데, 최적 항체량은 적절한 실험에 의해 결정된다.

본 발명의 몇몇 바람직한 구체예에서 항체 분자는 단량체 단편, 예를 들어 F(ab) 또는 scFv이다. 그러한 항체 단편은 비교적 짧은 반감기 및 더 적은 혈소판 활성화 위험의 이점을 가질 수 있는데, 이러한 혈소판 활성화는 수용체 클러스터화(clustering)에 의해 유발될 수 있다. 혈소판 활성화를 야기시키는 클러스터화는, 예를 들어 IL-25 분자들의 클러스터화 또는 IL-25와 FcγRII 분자의 클러스터화 중 어느 하나일 수 있다.

전항체가 사용되는 경우, 이는 혈소판을 활성화시키고/거나 파괴할 수 없는 형태인 것이 바람직하다. IgG4 이소타입 또는 대안적으로 IgG1 백본에서 유래된 "디자이너(designer)" 이소타입 (신규한 Fc 유전자 작제물 (WO99/58572, Clark, Armour, Williamson))이 바람직한 선택안이다. 보다 작은 항체 단편, 예를 들어 F(ab')2가 사용될 수 있다. 또한, 2중 에피토프 특이성 (예를 들어, scFv 2C3에 의해 인지되는 에피토프에 대한 특이성)을 지니는 전항체 또는 단편 (예를 들어, F(ab')2 또는 디아바디)가 사용될 수 있다. 그러한 구체예가 수용체 클러스터화를 촉진시킬 수 있지만, 개별 수용체들에 대한 높은 결합 속도가 이러한 문제를 제거할 수 있다.

본 발명의 표적 결합 멤버는 일반적으로 약제 조성물의 형태로 투여되는데, 이러한 약제 조성물은 표적 결합 멤버에 더하여 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 표적 결합 멤버는 치료하려는 질환에 따라 단독으로 투여되거나 동시에 또는 순차적으로 다른 치료와 조합하여 투여될 수 있다. 다른 치료는 적당한 용량의 진통제(pain relief drug), 예를 들어 비스테로이드성(non-steroidal) 항염증 약물 (예를 들어, 아스피린, 파라세타몰, 이부프로펜 또는 케토프로펜) 또는 오피에이트(opiate), 예를 들어 몰핀의 투여; 항-구토제의 투여; 또는 천식에 대해 활성인 하나 이상의 다른 화합물, 일반적으로 기도 이완을 발생시키거나 점액 제거를 향상시키는 기관지확장제, 예를 들어 베타-효능제 (예를 들어, 살부타몰, 살메테롤), 디소듐 크로모글리케이트, 스테로이드 또는 PDEIV의 억제제의 투여를 포함할 수 있다.

검정 방법

본 발명은 본원에 제공된 것과 같은 표적 결합 멤버가 IL-25에 결합하게 하거나 결합할 수 있게 하는 방법을 제공한다. 인식되는 바와 같이, 그러한 결합은 생체내에서, 예를 들어 표적 결합 멤버, 또는 표적 결합 멤버를 엔코딩하는 핵산의 투여 후 일어날 수 있거나, 시험관내에서, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯팅, 면역-세포화학, 면역-침전 또는 친화력 크로마토그래피에서 일어날 수 있다.

IL-25에 표적 결합 멤버가 결합하는 양이 결정될 수 있다. 정량은 시험 샘플내의 항원량과 관련될 수 있고, 이는 진단학적 관심 대상이 될 수 있다.

샘플에 대한 항체의 반응성은 임의의 적절한 수단에 의해 측정될 수 있다. 방사면역검정(Radioimmunoassay, RIA)이 가능한 수단이다. 방사성 표지된 항원을 비표지된 항원 (시험 샘플)과 혼합합고 항체에 결합하게 한다. 결합된 항원을 비결합된 항원으로부터 물리적으로 분리하고 항체에 결합된 방사성 항원의 양을 측정한다. 항원이 시험 샘플내에 더 많이 존재하면 할수록, 방사성 항원은 항체에 더 적게 결합한다. 또한, 리포터 분자에 연결된 항원 또는 유사체를 사용하여, 경쟁적 결합 검정이 비-방사성 항원과 함께 사용될 수 있다. 리포터 분자는 스펙트럼적으로 구별되는 흡수 또는 방출 특성을 지니는 형광발색단(fluorochrome), 인광체(phosphor) 또는 레이저 염료일 수 있다. 적합한 형광발색단으로는 플루오레세인, 로다민, 피코에리쓰린 및 텍사스 레드(Texas Red)가 있다. 적당한 발색 염료로는 디아미노벤지딘이 있다.

다른 리포터로는 거대분자 콜로이드성 입자 또는 미립자 물질, 예를 들어 착색되거나 자성 또는 상자성인 라텍스 비드, 및 가시적으로 관찰되거나, 전자적으로 검출되거나 다른 방식으로 기록되게 할 수 있는 생물학적 또는 화학적 활성제가 있다. 이들 분자는 , 예를 들어, 발색시키거나 색을 변화시키거나 전기적 특성의 변화를 일으키는 반응을 촉매하는 효소일 수 있다. 이들은 분자적으로 여기될 수 있고, 이로써 에너시 상태들 간의 전자적 전이가 특징적인 스펙트럼 흡수 또는 방출을 유도할 수 있다. 이들은 바이오센서와 연계하여 사용되는 화학 물질(chemical entity)을 포함할 수 있다. 바이오틴/아비딘 또는 바이오틴/스트렙타비딘 및 알카리 포스파타제 검출 시스템이 사용될 수 있다.

개별 항체-리포터 컨쥬게이트에 의해 생성된 신호는 샘플 (정상 및 시험)내에서의 관련 항체 결합의 정량가능한 절대 또는 상대 데이터를 유도하기 위해 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 경쟁 검정에서 항원 수준을 측정하기 위한 상기와 같은 표적 결합 멤버의 용도를 제공하는데, 즉, 경쟁 검정에서 본 발명에 의해 제공된 것과 같은 표적 결합 멤버를 사용함으로써 샘플내 항원의 수준을 측정하는 방법을 제공한다. 이는 비결합된 항원으로부터 결합된 항원의 물리적 분리가 요구되지 않는 경우일 수 있다. 물리적 또는 광학적 변화가 일어나도록 표적 결합 멤버에 리포터 분자를 연결시키는 것이 한 가지 방법이 된다. 리포터 분자는 검출가능하고, 바람직하게는 측정가능한 신호를 직접 또는 간접적으로 생성시킬 수 있다. 리포터 분자들의 연결은 직접 또는 간접적으로 이루어지는데, 펩티드 결합을 통해서와 같이 공유적으로, 또는 비공유적으로 이루어질 수 있다. 펩티드 결합을 통한 연결은 항체를 항체 및 리포터 분자를 엔코딩하는 유전자 융합체의 재조합적 발현의 결과일 수 있다.

또한, 본 발명은, 예를 들어 바이오센서 시스템내에서, 본 발명에 따른 표적 결합 멤버를 사용함으로써 항원의 수준을 직접적으로 측정하는 방법을 제공한다.

결합을 측정하는 방식은 본 발명의 특징이 아니며 당업자는 이들의 선호도 및 일반 지식에 따라서 적합한 방식을 선택할 수 있다.

실시예

본 발명의 양태 및 구체예는 이제 하기 실험을 참조하여 예로서 설명된다.

비교예:

2c3의 1차 서열

선도 서열을 제외한 카파 경쇄 서열이 도 1에 도시되어 있고 (SEQ ID NO:15), CDR 루프의 아미노산 서열은 Kabat에 의해 규정된 바와 같이 L1 (SEQ ID NO:29), L2 (SEQ ID NO:30) 및 L3 (SEQ ID NO:31)로 명명된다. 2c3 경쇄의 인간화를 위한 도너 서열이 바로 L1, 2 및 3 서열이다. 중쇄의 서열 (SEQ ID NO:17)은 도 2에 도시되어 있고, CDR은 마찬가지로 H1 (SEQ ID NO:32), H2 (SEQ ID NO:35) 및 H3 (SEQ ID NO:33)로 확인된다.

2c3 중쇄와 경쇄의 분석

인간 항체 서열들의 데이터베이스를 분석하여 2c3에 대한 억셉터 프레임워크 서열을 확인하였다. 인간 항체 서열들의 데이터베이스는 9597개의 중쇄 서열과 2695개의 경쇄 서열로 이루어져 있다. 첫 번째로 최대의 VCI 스코어, 두 번째로 프레임워크(FR) 스코어 그리고 세 번째로 동일성(identity) 스코어를 기초로 하여 적절한 억셉터 서열들을 예비적으로 확인하였다. 최종적으로, H1 H2, L1 및 L2에 대해 보존된 루프 길이를 지니지 않는 임의의 서열들을 배제시켰다. 그 후, 상위 20개의 인간 항체 서열을 검사하여 인간화된 항체, 크게 변이된 scFv 항체 및 마우스 항체를 제외시켰다. 비정형적 위치(atypical position)에 시스테인 또는 프롤린 잔기를 지닌 서열들을 또한 제외시켰다.

2c3에 대한 중쇄 억셉터의 분석

2c3 중쇄에 대한 상위 20개 서열을 확인하였다. 최대 VCI 스코어를 지니며 단지 2개의 상이한 VCI 잔기들인 A67V와 L69I를 지닌 AY393094 서열이 도 3에 도시되어 있다. 그러한 2개 모두는 보존적 변화이다. 프레임워크 서열의 나머지의 분석은 87개의 잔기 중에서 59개가 보존됨을 나타낸다. 2c3과 AY393094에서 발견되는 인터페이스(interface) 잔기들은 본 발명자들의 제안된 경쇄 AY510106에 대한 동족 중쇄 (AY510106)에서 보존된다. 종합해보면, 분석은 AY393094 (SEQ ID NO:19)가 VCI 역변이(back mutation)를 거의 요구하지 않을 수 있는 양호한 후보임을 나타낸다.

그러나, AY393094의 H3 루프 길이는 2c3에서 발견되는 13개의 잔기라기 보다는 17개의 잔기이지만, H3의 길이의 이러한 차이는 인간화 동안 보기 드문 것이 아니며 VCI 잔기들을 보존하는 것 보다 덜 중요하게 여겨진다.

2c3의 중쇄의 인간화된 작제물 (RHA)

인간화된 중쇄 작제물은 도 4에 도시되어 있는데, 이를 RHA (SEQ ID NO:21)라 명명하였다. 선도 서열 및 프레임워크 서열은 AY393094로부터 유래된 것이고, Kabat에 의해 규정되는 H1-3 루프는 2c3로부터 유래된 것이다. 5' 단부에 컨센서스 Kozak 서열 및 HindIII 제한 부위를 첨가하였고, 3' 단부에 ApaI 제한 부위를 첨가하였다. 제한 부위들은 발현 벡터를 보조하기 위한 것이고, Kozak 컨센서스 서열은 단백질 발현을 최대화하고자 하는 것이다. N-결합된 당화 부위들은 모티프 NX(S/T)을 지니는데, 이들 중 어느 것도 인간화된 중쇄에서 발견되지 않았다. 펩티드 절단 부위의 특성은 RHA의 아미노 말단 펩티드 서열에 시그널(Signal) P 프로그램을 적용함으로서 평가하였다. 그 결과, VH5a 선도 서열이 VCA (신호 펩티드의 C-말단 단부)와 EVR (FR1의 N-말단 단부) 사이에서 절단되는 것으로 확인되었다.

경쇄 프레임워크 분석

최상의 VCI 및 프레임워크 스코어를 지닌 다수의 인간 경쇄 프레임워크가 확인되었다. 그러나, 스코어 높은 상위 3개의 서열을 고려한 후, 이들 모두를 무시하였다. 그 이유는 첫 번째 서열은 이의 경쇄가 아밀로이드 피브릴(amyloid fibril) 형성과 관련된 것으로 밝혀진 항체로부터 유래되었기 때문이고, 그 다음의 두 서열은 1번과 3번 위치에서 보존되지 않은 잔기들을 지니기 때문이다. 인간화와 관련된 본 발명자들의 과거 경험상 이러한 잔기들은 보존되어야 하는 것으로 믿어졌다.

그 다음으로 최상인 서열들은 2개의 VCI 잔기들인 V44P와 Y71F에서 상이할 뿐이었지만, 추가 분석시에 최대의 프레임워크 스코어를 지닌 후보들은 매우 유사하지만 L73F 또는 I83F 매스매치를 지니는 것으로 나타났다. 페닐알라닌은 비교적 큰 변화이고, 이러한 2가지 타입의 경쇄들에서 보존되는 것으로 여겨진다. 2c3 유사 경쇄 프레임워크의 추가 분석에 의해 83번 위치에 발린을 지니고 더불어 73번 위치에 류신을 지니는 상당수가 밝혀졌고, 이에 따라 83번 위치에 Phe를 지닌 프레임워크에 대한 대안을 제공한다. 이를 고려하여 본 발명자들은 경쇄 AY510106을 선택하였는데, 이는 2c3과 동일한 CDR 루프 길이를 지닌 V83 경쇄이다. AY510106 (SEQ ID NO:23)에 대한 서열은 도 5에 도시되어 있다.

2c3의 경쇄의 인간화된 작제물 (RKA)

인간화된 카파 경쇄 작제물은 도 6에 도시되어 있는데, 이를 RKA (SEQ ID NO:25)라 명명하였다. 선도 서열 및 프레임워크 서열은 AY510106으로부터 유래된 것이고, L1-3은 2c3로부터 유래된 것이다. 5'-단부에 컨센서스 Kozak 서열 및 HindIII 제한 부위를 첨가하였고, 3'-단부에 BamHI 제한 부위 및 스플라이스 부위를 첨가하였다. 제한 부위들과 스플라이스 부위들은 pKN100 발현 벡터에서 작제물을 클로닝하고 발현시키는 데에 필요하고, Kozak 컨센서스 서열은 단백질 발현을 최대화하고자 하는 것이다. N-결합된 당화 부위들은 모티프 NX(S/T)을 지니는데, 이들 중 어느 것도 인간화된 경쇄에서 발견되지 않았다. 펩티드 절단 부위의 특성은 2c3 RKA의 아미노 말단 펩티드 서열에 시그널 P 프로그램을 적용함으로서 평가하였다. 그 결과, VK1-A20 선도 서열이 잔기들인 TRC (신호 펩티드의 C-말단 단부)와 DI (FR1의 N-말단 단부) 사이에서 절단되는 것으로 확인되었다.

RHA와 RKA 대 키메라 2c3의 비교

인간화된 2c3 중쇄 RHA와 카파 경쇄 RKA cDNA를 합성하고 (GeneArt AG), 각각 IgG1 중쇄 발현 벡터 pG1D200과 경쇄 발현 벡터 pKN100내로 클로닝하였다. 먼저, 키메라 2c3으로부터의 중쇄 및 경쇄 cDNA 작제물과 인간화된 항체를 조합하고, 이를 사용하여 HEK293T 세포를 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 세포들로부터의 상층액을 ELISA에서 사용하여 항체가 IL-25에 결합하는 것을 측정하였다. 결과 (도 7(A))는 인간화된 중쇄인 RHA를 지닌 키메라 2c3 경쇄를 포함하는 인간화된 항체가 키메라 2c3 경쇄와 중쇄를 포함하는 항체 보다 IL-25에 훨씬 적게 결합함을 나타내었다. 대조적으로, 키메라 2c3 중쇄와 결합된 키메라 2c3 경쇄 또는 인간화된 경쇄인 RKA의 경우 IL-25에 동등하게 결합하는 것으로 나타났다.

인간화된 중쇄에 대한 최대 결합을 회복하기 위해, VCI 잔기들인 A67V와 I69L을 변이유발에 의해 대체하였다 경쇄 RKA와 조합된 2중 변이체 RHA_A67V_I69L 및 RHA_I69L의 항원 결합을 키메라 2c3의 항원 결합과 비교하였다. HEK 293T 세포를 다양하게 변이유발된 중쇄 및 RKA로 코트랜스펙션시키고(co-transfected), 상층액을 IL-25 결합 ELISA에서 사용하였다. 도 7(B)에 도시된 결과는 IL-25에 대한 최대 항체 결합이 A67V와 I69L 잔기들 둘 모두의 대체에 의해 부분적으로만 회복되었음을 나타낸다.

RHA에 대해 추가의 변이유발을 수행하였다. 아미노산 대체 R3Q, S82aL을 생성시키고, 일시적으로 트랜스펙션된 HEK293T 세포로부터의 상층액을 IL-25 결합 ELISA에서 사용하였다. 도 7(C)의 결과에 의하면 이러한 대체는 IL-25에 대한 인간화된 항체의 결합을 향상시키는 것에 대해 거의 효과가 없거나 전혀 효과가 없다.

따라서, 결론적으로, 경쇄 인간화는 성공적이었고 추가의 변형을 필요로 하지 않았지만, 중쇄가 추가로 공학처리(engineering)됨에도 명백히 잘 보존된 VCI 잔기들을 지닌 중쇄내로의 CDR의 전달을 기초로 한 인간화는 성공적이지 않았다.

실시예 1 - 고친화성 인간화된 항체의 설계

VCI 스코어에 비해 높은 서열 동일성 우선권을 지닌 항체 프레임워크 영역을 제공하는 베르니에 또는 캐노니컬 잔기들의 대체에도 불구하고 프레임워크 AY393094는 만족스러운 인간화된 항체를 제공하지 못하였다. 이러한 방법은 상이한 부류의 인간 프레임워크들을 확인하였다. 이들 중에서, 최대 VCI 스코어를 지니는 것을 선택하였다. 이의 선도 서열은 공지되어 있지 않았고, 따라서 VH5a 선도 서열을 대체물로서 사용하였다. 선택된 인간 VH 도메인인 AJ399823 (SEQ ID NO:27)의 서열은 도 8에 도시되어 있다.

이의 CDR을 2c3의 CDR로 대체하였고, 제 2의 인간화된 항체를 RH2로 명명하였다. 이러한 서열은 SEQ ID NO:4로서 제시된다. RH2은 5개의 비보존된 VCI 잔기들인 Ser 30; Met 48; Val 67; Arg 71 및 Thr 73 (Kabat 넘버링)을 지닌다. 이러한 잔기들은 하기에서 각각 b, c, d, e 및 f로 지칭된다.

모든 VCI 대체물을 함유하는 인간화된 중쇄를 RH2bcdef로 명명하였고, 이를 경쇄 RKA와 함께 시험하였다. 일시적으로 트랜스펙션된 HEK293T 세포로부터의 상층액을 IL-25 결합 ELISA에서 사용하였다. RHA와 RH2bcdef의 비교는 RHA에 비해 IL-25에 대해 개선된 결합을 나타내었지만, 키메라 2c3에 의해 나타나는 100% 결합을 수복하지는 못하였다. 따라서, 결론적으로, 2c3의 간단한 인간화를 위한 또 다른 방법이 필요하였다.

실시예 2 - RH2bcdef의 CDR 변형

2개의 CDR 잔기들은 인간화된 항체의 역가를 개선시키는 것으로 밝혀졌다. 변이 D31G와 G96D를 RH2bcdef내로 도입하고, 이를 사용하여 HEK293T 세포를 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 상층액을 IL-25 결합 ELISA에서 사용하였다. 도 9(A)의 결과는 D31G 변이가 RH2bcdef의 역가를 2c3의 수준으로 회복시킴을 나타낸다. 그러나, 도 9(B)의 G96D 변이는 2c3의 항원 결합 역가를 훨씬 넘어서게 항원 결합 역가를 증가시킨다.

상기 두 변이가 상가적인 지의 여부를 시험하기 위해, 둘 모두의 변이를 RH2bcdef내로 포함시켰다. 일시적으로 트랜스펙션된 HEK293T 세포로부터의 상층액을 IL-25 결합 ELISA에서 사용하였다. 도 10에 도시된 결과는 둘 모두의 CDR 변이를 포함시킴으로써 인간화에서 역가의 작지만 유의할 만한 증가가 일어남을 제시한다.

또한, 본 발명의 데이터는 항체의 유사한 결합 특성을 유지하기 위해 31번 위치가 Gly 또는 Asp에 더하여 Ala, Ser, Val, Asn, Lys, Tyr 또는 Met로부터 또한 선택될 수 있음을 나타낸다.

실시예 3 - 잔기 96 (Kabat) 변형

96번 잔기에서 어느 아미노산들이 관용될 수 있는 지를 보다 잘 이해하기 위해, 글리신을 변이유발에 의해 일련의 대표적인 아미노산들로 대체하였다. 하기 변이를 RH2bcdef에 적용하였다: G96Y, G96N, G96S, G96L, G96K 및 G96E. 발현 작제물을 RKA와 함께 HEK293T 세포내로 코트랜스펙션시키고, 상층액을 IL-25 결합 ELISA에서 사용하였다. 결과는 단지 96번 위치에서 아스파르테이트가 아스파라긴에 의해 치환된 경우 동등한 역가를 지녔고, 이러한 위치에서 시험된 모든 다른 잔기들은 IL-25에 결합하는 것에 대해 유해한 효과를 나타내었음을 보여주었다. 놀랍게도, 역가에 대한 유해한 효과는 또한 아스파르테이트와 유사한 음 하전된 잔기인 글루타메이트에 의한 치환을 포함하였다. 아스파르테이트가 역가를 증가시키는 데에 있어서 음 하전이 주된 기여인자가 아닌 것으로 결론내려질 수 있다.

따라서, 본 발명의 VH 도메인에서 잔기 96 (Kabat)은 아스파르테이트 또는 아스파라긴일 수 있다.

실시예 4 - RH2를 위한 마우스 VCI 잔기들의 최소 요건의 결정

인간화된 항체에 대한 잠재적인 면역원성 영향을 최소화하기 위해, 뮤린 아미노산 프레임워크 대체물의 수를 최소화하는 것이 바람직하다. 인간화된 중쇄 RH2bcdef_G96D를 RH2.1로 명명하였는데, 이는 2c3으로부터의 5개의 VCI 대체물을 지녔다. 먼저, 4개를 제거하여 어느 잔기들이 역가에 기여하는 지를 확인하였다.

변이 c, d, e, 및 f를 단일 변이로서 내인성 인간 프레임워크 잔기로 대체하였다. HEK 293T 세포를 VCI 변이 및 RKA로 코트랜스펙션시키고, 상층액을 IL-25 결합 ELISA에서 시험하였다. 놀랍게도, 인간 잔기 V67 또는 T73을 재도입시키는 것이 역가를 약간 향상시켰는데, 이는 예상치 못한 것이었다. 48번에서 Met을 다시 뮤린 Ile로 변화시키는 것은 어떠한 유의할 만한 효과도 나타내지 못했다.

그러나, 인간 아르기닌 잔기가 71번 위치에 존재하는 것은 IL-25에 결합하는 것에 대해 유해한 효과를 나타내는 것으로 여겨졌다. 따라서, 결론적으로, 인간화된 항체에서 뮤린 VCI 잔기 Val 71만이 매우 바람직한 것이었다. 다른 잔기들은 마우스 또는 인간 잔기일 수 있다.

최적의 최종 인간화된 중쇄를 확인하기 위해, RH2.5 (SEQ ID NO:4)로 명명되는 새로운 중쇄 변형체를 합성하였는데, 이는 뮤린 VCI 잔기들을 전혀 함유하지 않았다. 또한, VCI 변이 S30T (SEQ ID NO:3) 또는 R71V (SEQ ID NO:2)를 지니도록 RH2.5의 2개의 변형체를 제조하였다. 이러한 3개의 신규한 인간화된 항체가 IL-25에 결합하는 것을 ELISA에 의해 분석하였다. 결과는 도 11에 도시되어 있다. RH2.5와 비교하여 S30T 또는 R71V를 첨가하는 것은 인간 IL-25에 결합하는 것을 동일하게 향상시키는 것으로 밝혀졌다.

따라서, 본 발명의 일부 구체예에서, 중쇄의 30번 및 71번 위치는 각각 S에서 T로 그리고 R에서 V로 개별적으로 또는 함께 변형될 수 있다.

실시예 5 - 항체 열안정성

RH2.5_S30T (SEQ ID NO:3) 및 RH2.5_R71V (SEQ ID NO:2)의 열안정성을 측정하였다. 항체를 다양한 온도에서 10분간 유지시킨 후, 신속히 실온으로 냉각시키고, IL-25와 결합하는 능력을 ELISA에 의해 측정하였다. 2c3 키메라 항체 (대조군)는 보다 큰 열안정성을 보유하며 75℃의 온도까지 활성인 것으로 나타났다. RH2.5_R71V는 65℃까지 활성을 유지하였고, RH2.5_S30T는 60℃까지 활성이었다.

실시예 6 - 인간화된 항체의 비(non) B/비(non) T 세포 생물학적 검정(bio-assay)

IL-25 활성을 측정하기 위해 이용가능한 시험관내 생물학적 검정은 거의 없다. 한 가지 효능있는 검정은 마우스의 장간막(mesenteric) 림프절로부터 분리된 비B/비T (NB/NT) 세포로부터의 IL-13 방출을 측정하는 것이다. 이러한 검정에서, 세포를 IL-25 및 다양한 농도의 항체와 인큐베이션시키고, IL-13을 자극후 3일째에 측정하였다. 결과는 뮤린 2c3 항체가 단지 부분적으로 IL-13 생산을 억제하였음을 나타내었다. 대조적으로, RH2.5_R71V와 S30T 둘 모두는 IL-13 생산을 제거하였고, RH2.5는 IL-13 생산을 현저히 감소시켰다. 흥미롭게도, RH2.5_R71V와 RH2.5_S30T 둘 모두는 0.25 μg/ml의 낮은 농도에서 IL-13 생산의 완전한 억제를 여전히 나타내었지만, 이러한 농도에서 다소 낮은 수준의 사이토카인 생산이 RH2.5에 대해 관찰될 수 있다. 이러한 데이터는 인간화된 항체가 2c3 키메라 항체 보다 효능있고 변이 R71V와 S30T가 향상된 항원 결합 역가를 지닌다는 견해와 일치한다.

실시예 7 - 기도 과민반응을 억제하는 RH2.5-R71V

추가의 실험에서, 인간화된 RH2.5_R71V를 급성 기도 과민반응(AHR)의 마우스 모델에서 시험하였다. 실험 프로토콜은 도 12에 요약되어 있다. 먼저, 마우스를 오발부민에 감작시킨 후, 항-IL-25 항체의 존재하에서 공격(challenge)하였다. 도 13(A)의 결과는 AHR 반응이 마우스 당 2c3 500㎍ 투여량의 첨가에 의해 차단되었지만 투여량이 마우스 당 50㎍로 낮추어진 경우에는 차단되지 않았음을 나타낸다. 대조적으로, AHR은 도 13(B)에 도시된 바와 같이 인간화된 항체 RH2.5_R71V를 50㎍ 투여량 (2.5 mg/Kg)으로 사용한 경우에만 차단되었다. 이러한 데이터는 인간화된 항체가 2c3 항체 보다 훨씬 더 효능있다는 견해를 추가로 뒷받침한다.

실시예 8 - 대장염(colitis) 치료

암컷 BALB/c 마우스 (그룹 당 10마리)를 예비감작시키기 위해, 복부 피부 영역을 면도하고, 100% 에탄올 중의 3% (w/v) 옥사졸론 용액 150 μl를 적용하였다. 대조 마우스는 150 μl의 100% 에탄올을 적용함으로써 예비감작시켰다. 예비감작시킨 지 7일 후에, 마우스를 이소플루란 마취하에 50% 에탄올 중의 3% 옥사졸론 150 μl 또는 50% 에탄올 단독 (대조군)으로 직장내(intrarectally) 재공격하였다. 전체 결장 및 맹장내에서의 옥사졸론의 분포를 보장하기 위해, 마우스를 주입 후 1분간 수직 자세로 유지시켰다. 인간 IgG1 백본 중의 마우스 2C3 서열의 키메라인 항체 (100 μg/투여량)를 예비감작시키기 전날과 옥사졸론을 직장내(i.r.) 투여하기 전날에 복강내(i.p.) 투여하였다. 대조 마우스는 이소타입 대조 인간 IgG4 (100 μg/투여량)를 투여받았다. 본 실시예에 약술된 모든 동물 실험은 UK 홈 오피스(Home Office)의 승인을 받고 이루어졌다.

결장 길이는 하기 성분들의 1일 3회 투여 후에 마우스 그룹에서 측정하였다: 50% 에탄올 + IgG4 이소타입 대조군 i.p. (50% EtOH IgG4); 50% 에탄올 i.r. + 항-IL-25 i.p. (50% EtOH 항-IL-25); 50% 에탄올과 3% 옥사졸론 i.r. + IgG1 이소타입 대조군 i.p. (3% 옥사졸론 IgG4) 및 50% 에탄올과 3% 옥사졸론 i.r. + 항-IL-25 i.p. (3% 옥사졸론 항-IL-25).

동물 체중을 상기한 바와 같은 처리 후에 매일 측정하였다.

도 14A는 옥사졸론의 투여가 대장염의 지표로서 결장 길이의 감소를 유도함을 나타낸다. 옥사졸론과 2C3 유래된 항-IL-25 항체로 처리된 동물은 옥사졸론과 IgG4-이소타입 처리된 동물에 비해 보다 긴 결장 (개선된 예후)의 경향을 나타낸다. 또한, 옥사졸론에 의한 처리는 비히클 단독 대조군과 비교하여 체중 손실을 유도한다 (도 14B). 옥사졸론과 항-IL-25로 처리된 동물도 체중이 감소하였지만 3일째에 옥사졸론 IgG4-이소타입 처리된 군 보다 더욱 신속히 체중을 회복하는 경향을 나타낸다.

재료 및 방법

약어

AHR 기도 과민성(Airways hyperreactivity)

℃ 섭씨

bp 염기쌍

DMEM 둘베코(Dulbecco)의 변형 이글 배지

DMSO 디메틸 설폭시드

DNA 데옥시리보핵산

ELISA 효소 결합 면역흡착 검정

FCS 우태아 혈청

FR 프레임워크

g 그램

HEK 293T SV40 거대 T 항원을 발현하는 인간 배아 신장 세포 (HEK 293T 세포)

hr 시간

HRP 호스라디쉬 퍼옥시다제

IgG 면역글로불린

mAb 모노클로날 항체

min 분

NB/NT 마우스 장간막 림프절로부터 분리된 비B/비T 세포

NIMR 국립 의학 연구소(National Institute for Medical Research) (UK)

nm 나노미터

OD 광학 밀도

PBS 포스페이트 완충 식염수

PCR 중합효소 연쇄 반응

RH 재조합 중쇄

RK 재조합 카파 쇄

RT 실온

sec 초

UV 자외선

VH 면역글로불린 중쇄 가변 영역

VL 면역글로불린 경쇄 가변 영역

VK 면역글로불린 카파 경쇄 가변 영역

면역학 및 분자 생물학 시약

키메라 및 인간화된 항체 가변 유전자의 클로닝

2c3의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 cDNA 및 인간화된 항체의 가변 영역 cDNA를 합성하였다 (GeneArt AG). 중쇄 V 영역을 HindIII 및 ApaI 제한 효소 부위에 의해 pG1D200내로 클로닝하였다. 유사하게, 경쇄 V 영역을 HindIII 및 BamHI 부위에 의해 pKN100내로 클로닝하였다. 37℃에서 2시간 동안 멀티코어(multicore) (Promega) 제한 분해 완충액 중에서 20개 단위의 HindIII와 ApaI를 사용하여 5㎍의 DNA를 분해시킴으로써 리게이션(ligation)을 위해 pG1D200 벡터를 준비하였다. 그 후, 앤타크틱 알칼리 포스파타제(NEB) 1개 단위를 DNA에 첨가하고, 제조업자의 지시사항에 따라 15분 내지 30분간 인큐베이션시켰다. 그 후, 벡터 제조물을 제조업자의 지시사항에 따라 Qiaquick (Qiagen) 컬럼상에서 정제하였다. 벡터를 50㎕로 용리시켰다. 유사하게, 37℃에서 1시간 동안 완충액 E (Promega) 중에서 20개 단위의 HindIII와 BamHI를 사용하여 5㎍의 DNA를 분해시킴으로써 pKN100 벡터를 준비하였다. DNA를 앤타크틱 알칼리 포스파타제로 처리하고, 상기 기재된 바와 같이 정제하였다. V 영역 인서트(insert) DNA (약 4μg)를 상기 기재된 바와 같이 분해시키고, 중쇄 및 경쇄 단편을 겔 전기영동에 의해 벡터로부터 정제하였다. 적절한 밴드를 겔로부터 절제하고, Qiaquick 컬럼 (Qiagen)상에서 정제하고, 제조업자의 지시사항에 따라 50μl로 용리시켰다. 1x Quick 리가아제 완충액 (NEB)과 1μl의 NEB Quick 리가아제 중의 1㎕ 또는 3㎕의 인서트 DNA와 1㎕의 벡터를 혼합함으로써 리게이션을 수행하고, 실온 (20℃)에서 10분간 인큐베이션시켰다. 반응물을 사용하여 50㎕의 10β 컴피턴트 세포 (NEB)를 형질전환시켰다. 벡터 작제물은 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였는데, 이는 GATC Biotech Ltd (Cambridge)가 수행하였다..

가변 유전자의 합성 및 부위 특이적 변이유발

가변 유전자들을 GeneArt AG (Regensburg, Germany)에 의해 합성하였다.

부위 특이적 변이유발을 제조업자의 지시사항에 따라 QuickChange® II XL 부위 특이적 변이유발 키트 (Stratagene)를 사용하여 수행하였다. 단, RHA 변이 R3Q 및 L82aS에 대해서는, Phusion™ 부위 특이적 변이유발 키트 (NEB) 방법을 제조업자의 지시사항에 따라 이용하였다.

IgG1 ELISA

Maxisorp 플레이트를 0.4μg/ml의 염소 항-인간 IgG 항체로 코팅하고, 4℃에서 1개월 미만 동안 저장하였다. 사용 전에, 플레이트를 PBS/0.02% Tween 20 (v/v) 중에서 3회 세척한 후, PBS/0.02% Tween 20 (v/v)/0.2% (w/v) BSA 중에서 블록킹시켰다. 플레이트를 앞서와 같이 세척하고, 샘플 상층액을 2배 희석법을 사용하여 농도 범위에 걸쳐 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 앞서와 같이 세척하고, 1:5000 희석률로 염소 항-인간 카파 경쇄 퍼옥시다제 컨쥬게이트 (Sigma)와 인큐베이션시켰다. 플레이트를 앞서와 같이 세척한 후, 150μl의 K Blue One-Step 기질 (Neogen)을 첨가하였다. 10분 후, 50μl의 레드 스탑 용액(Red Stop solution) (Neogen)을 사용하여 반응을 정지시키고, 655nm에서 광학 밀도를 측정하였다.

사이토카인 결합 검정

Maxisorp 플레이트를 카보네이트-바이카보네이트 완충액 (Sigma) 중의 0.25μg/ml의 인간 IL-25 (R&D systems)로 코팅하고, 4℃에서 1개월 미만 동안 저장하였다. 사용 전에, 플레이트를 PBS/0.02% Tween 20 (v/v) 중에서 3회 세척한 후, PBS/0.02% Tween 20 (v/v)/0.5% (w/v) BSA 중에서 블록킹시켰다. 플레이트를 앞서와 같이 세척하고, 샘플 상층액을 2배 희석법을 사용하여 농도 범위에 걸쳐 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 앞서와 같이 세척하고, 1:5000 희석률로 염소 항-인간 카파 경쇄 퍼옥시다제 컨쥬게이트 (Sigma)와 인큐베이션시켰다. 플레이트를 앞서와 같이 세척한 후, 150μl의 K Blue One-Step 기질 (Neogen)을 첨가하였다. 10분 후, 50μl의 레드 스탑 용액(Red Stop solution) (Neogen)을 사용하여 반응을 정지시키고, 650nm에서 광학 밀도를 측정하였다.

마우스

BALB/c 마우스를 할란 유케이(Harlan UK) (Bicester, UK)로부터 입수하고, 병원체가 없는 특수한 환경을 갖춘 시설인 더 스몰 애니멀 배리어 유닛 앤드 센트럴 바이오메디컬 서비시즈 엘엠비 캠브리지(the Small Animal Barrier Unit and Central Biomedical Services LMB Cambridge)에서 유지시켰다. 보고서에 약술된 모든 실험은 UK 홈 오피스의 승인을 받고 이루어졌다.

비B 비T 세포 검정

비B/비T (NBNT) 세포를 장간막 림프절로부터 정제하고, 다양한 농도의 인간 IgG1 이소타입 대조군 (항-말라리아), 항-hIL-25 RH2.5 R71V, 항-hIL-25 RH2.5 S30T, 또는 항-hIL-25 RH2.5에서, 10 ng/ml rmIL-25의 존재 또는 부재하에서, 그리고 마우스 IgG1 이소타입 (anti-c-myc) 또는 항-mIL-25 2c3의 존재하에서72시간 동안 인큐베이션시켰다. IL-13 생산을 ELISA에 의해 세포 상층액으로부터 평가하였는데, 이러한 상층액은 2개의 듀플리케이트 웰(duplicate well)로부터 풀링된(pooled) 것이었다. Quantikine Murine IL-13 키트 (R&D Systems)를 사용하여 IL-13 ELISA를 수행하였다.

기도 과민반응(AHR)의 급성 모델의 실험 설계

0일 및 12일째에 명반(alum)과 병용되는 PBS 중의 오발부민 (20 μg/주입)의 복강내 투여, 또는 PBS 및 명반 단독 (대조군)의 복강내 투여에 의해 BALB/c 마우스 (6주 내지 12주)를 감작시켰다. 19일, 20일 및 21일째에 하루에 20분간 1% 오발부민의 에어로졸 투여를 수행하였다. 대조 동물에게는 PBS를 투여하였다. 각각의 폐 공격 2시간 전에, 마우스에게 2c3, 마우스 IgG1 대조군, 또는 인간 IgG1 이소타입 대조군 (항-말라리아), 또는 항-hIL-25 RH2.5 R71V를 또한 복강내 투여하였다. 22일째에, 구속식 혈량측정법(restrained plethysmography)을 사용하여 동물들을 분석함으로써 AHR 오발부민을 평가하고, 항체들을 엔도톡신(endotoxin)에 대해 시험하였는데, 1.2 EU/ml인 RH2.5_R71V를 제외하고는 0.1 EU/ml 미만인 것으로 나타났다.

AHR의 측정

동물들을 마취시키고, 기관절개하고(tracheostomized), 1회 호흡량(tidal volume)이 0.15 ml이고 분 당 약 150회 호흡 속도로 인공호흡기 (Minivent 845 ventilator, EMMS, UK)를 달았다. 마우스를 구속식 전신 혈량측정계 (EMMS Hants, UK)로 모니터하고, 인라인 트랜스듀서(inline transducer)에 의해 경폐 압력을 평가하였다. 안정한 기선 폐 내성을 기록한 후, 초음파 분무기를 사용하여 10초간 에어로졸에 의해 아세틸-β-메틸콜린 클로라이드 (메타콜린; Sigma, Dorset, United Kingdom)를 농도를 증가시키며 투여하고, 폐 내성을 3분 기간 동안 기록하였다. EDaq 소프트웨어 (EMMS Hants, UK)를 사용하여 기도 저항, 순응성 및 표준 폐 파라미터를 분석하였다.

참고문헌

서열:

SEQ ID NO:1 - 인간화된 VH 도메인 (인공(artificial))

여기서,

Xa1은 Ser 또는 Thr이고;

Xa2는 Gly, Asp, Ala, Ser, Val, Asn, Lys, Tyr 또는 Met이고;

Xa3는 Met 또는 Ile이고;

Xa4는 Val 또는 Arg이고;

Xa5는 Asp, Asn 또는 Gly이다.

SEQ ID NO:2 - 인간화된 VH 도메인 RH2.5_S30T (인공)

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro GlyAla Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

SEQ ID NO:3 - 인간화된 VH 도메인 RH2.5_R71V (인공)

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Val Ser Ser

SEQ ID NO:4 - 인간화된 VH 도메인 RH2 (인공)

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

SEQ ID NO:5 - 인간화된 VH 도메인 (인공)

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

SEQ ID NO:6 - 인간화된 VH 도메인 (인공)

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

SEQ ID NO:7 - 인간화된 VH 도메인 (인공)

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

SEQ ID NO:8 - 인간화된 VH 도메인 (인공)

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

SEQ ID NO:9 - 인간화된 VH 도메인 (인공)

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

SEQ ID NO:10 - 인간화된 VH 도메인 (인공)

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

SEQ ID NO:11 - 인간화된 VH 도메인 (인공)

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

SEQ ID NO:12 - 인간화된 VH 도메인 (인공)

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

SEQ ID NO:13 - 인간화된 VH 도메인 (인공)

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

SEQ ID NO:14 - 인간화된 VH 도메인 (인공)

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

SEQ ID NO:15 - 2c3의 VK 도메인 (뮤린(murine))

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKADGTVELLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEIK

SEQ ID NO:16 - 2c3의 VK 도메인을 엔코딩하는 핵산

GACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACCGGGTGACCATCAGCTGCAGCGCCTCCCAGGGCATCAGCAACTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGGCCGACGGCACCGTCGAGCTGCTGATCTACTACACCAGCAGCCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTTAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCTCCAACCTGGAACCCGAGGATATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGCAAGCTGCCCTACACCTTTGGCGGCGGAACAAAGCTGGAAATCAAG

SEQ ID NO:17 - 선도 서열을 지닌 2c3의 VH 도메인 (뮤린)

MVLSLLYLLTALPGILSEVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTDYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTSYNQNFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCAREGYDGYLYFAMDYWGQGTSVTVSS

SEQ ID NO:18 - 2c3의 VH 도메인을 엔코딩하는 핵산

ATGGTGCTGTCCCTGCTGTACCTGCTGACCGCCCTGCCCGGCATCCTGAGCGAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCTGAGCTGGTGAAGCCTGGCGCCAGCATGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGCTTCACCGACTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCACGGCAAGAACCTGGAATGGATCGGCCTGATCAACCCCTACAACGGCGGCACCAGCTACAACCAGAACTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGTGGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGGAACTGCTGTCTCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAGGGCTACGACGGCTACCTGTACTTCGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCAGC

SEQ ID NO:19 - AY393094 VH 도메인 (인간(human))

LLLAVLQGVCAEVRLVQSGAEVKKPGESLKISCKASGYSFTSNWIGWVRQMPGKGLEWIGIIFPGDSDTIYSPSFQGQVTISVDKSINTAYLQWSSLKATDTAMYYCARQNPPEYSGAYHDGWFDPWGQGTLVIVSS

SEQ ID NO:20 - AY393094 VH 도메인을 엔코딩하는 핵산

CTCCTCCTGGCTGTTCTCCAAGGAGTCTGTGCCGAGGTGCGCCTTGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCGGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGCTTCTGGATACAGTTTTACCAGTAACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATTGGGATCATCTTTCCTGGTGACTCTGATACCATATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATTTCAGTCGACAAGTCCATCAATACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCACGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGACAGAACCCCCCCGAGTATAGTGGCGCATATCATGATGGGTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCATCGTCTCCTCA

SEQ ID NO:21 - RHA VH 도메인 (인공)

MGSTAILGLLLAVLQGVCAEVRLVQSGAEVKKPGESLKISCKASGYSFTDYTMNWVRQMPGKGLEWIGLINPYNGGTSYNQNFKGQVTISVDKSINTAYLQWSSLKATDTAMYYCAREGYDGYLYFAMDYWGQGTLVIVSS

SEQ ID NO:22 - RHA VH 도메인을 엔코딩하는 핵산 (인공)

ATGGGGTCAACCGCCATCCTTGGCCTCCTCCTGGCTGTTCTCCAAGGAGTCTGTGCCGAAGTGCGCCTTGTGCAGTCTGGAGCAGAAGTGAAAAAGCCGGGGGAGTCTCTGAAGATCTCTTGCAAGGCTTCTGGATACAGTTTTACCGACTACACCATGAACTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATTGGGCTTATTAATCCTTACAATGGTGGTACTAGCTACAACCAGAATTTCAAGGGCCAAGTCACCATTTCAGTCGACAAGTCCATCAATACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCACGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGAGAGGGCTATGATGGTTACCTTTACTTTGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCATCGTCTCCTCAG

SEQ ID NO:23 - AY510106 VK 도메인 (인간)

MRVPAQLLGLLLLWLPDTRCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKVPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQKYNSAPYTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO:24 - AY510106 VK 도메인을 엔코딩하는 핵산

ATGAGGGTCCCTGCTCAGCTCCTGGGACTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGATACCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCGAGTCAGGGCATTAGCAATTATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAACTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAATCAGGGGTCCCATCTCGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAAAAGTATAACAGTGCCCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA

SEQ ID NO:25 - 인간화된 2c3 VK 도메인 RKA (인공)

MRVPAQLLGLLLLWLPDTRCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQKPGKVPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQYSKLPYTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO:26 - 인간화된 2c3 VK 도메인 RKA를 엔코딩하는 핵산

ATGAGGGTCCCTGCTCAGCTCCTGGGACTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGATACCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAGTGCATCCCAGGGCATTAGCAATTATCTGAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAACTCCTGATCTATTACACATCAAGTTTACACTCAGGGGTCCCATCTCGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAGCAGTATAGCAAGCTGCCGTACACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA

SEQ ID NO:27 - AJ399823 VH 도메인 (인간)

EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFSSYGIHWVRQAPGQRLEWMGWINGGTGFTKYSQNFQGRVTLTRDTSASTAYLELNSLRSEDTGVYYCARDPYNNYAAELDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:28 - AJ399823 VH 도메인을 엔코딩하는 핵산 (인간)

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAAGTTTCGTGCAAGGCTTCTGGATACTCCTTCAGTAGTTATGGTATACATTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGACAAAGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACGGTGGCACTGGTTTTACAAAATATTCACAGAATTTTCAGGGCAGAGTCACCCTAACCAGGGACACTTCCGCGAGCACAGCCTACTTGGAACTGAACAGCCTGAGATCTGAAGACACGGGTGTATATTACTGTGCGAGGGATCCCTACAATAACTACGCGGCGGAACTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA

SEQ ID NO:29 - 경쇄 CDR1 (뮤린)

SASQGISNYLN

SEQ ID NO:30 - 경쇄 CDR2 (뮤린)

YTSSLHS

SEQ ID NO:31 - 경쇄 CDR3 (뮤린)

QQYSKLPYT

SEQ ID NO:32 - 중쇄 CDR1 (뮤린)

DYTMN

SEQ ID NO:33 - 중쇄 CDR3 (뮤린)

EGYDGYLYFAMDY

SEQ ID NO:34 - 중쇄 CDR1 (인공)

GYTMN

SEQ ID NO:35 - 중쇄 CDR2 (뮤린)

LINPYNGGTSYNQNFKG

SEQ ID NO:36 - 중쇄 CDR3 (인공)

EDYDGYLYFAMDY

SEQ ID NO:37 VH 도메인 선도 서열:

MGSTAILGLLLAVLQGVCA

SEQ ID NO:38 - 2C3 VK 도메인 선도 서열:

MRVPAQLLGLLLLWLPDTRC

SEQ ID NO:39 - 인간 VL 선도 서열:

MDMRVPAQLLGLLLLWLPDTRC

SEQ ID NO:40 - RH2.5 R71V를 엔코딩하는 핵산 (인공)

ATGGGCAGCACAGCCATTCTGGGCCTGCTGCTGGCCGTGCTGCAGGGCGTGTGCGCCGAGGTGCAGCTGGTCGAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCAGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGCTTCTCCGGCTACACCATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGAGGCTGGAATGGATGGGCCTGATCAACCCCTACAACGGCGGCACCAGCTACAACCAGAACTTCAAGGGCAGGGTGACACTGACCGTGGATACCAGCGCCAGCACCGCCTACCTGGAACTGAACAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGGCGTGTACTACTGCGCCAGAGAGGACTACGACGGCTACCTGTACTTCGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC

SEQ ID NO:41 - Kozak 컨센서스 서열 (인공)

AAGCTTGCCGCCACC

본원에 인용된 모든 특허, 공개 출원 및 참고문헌의 교시내용은 그 전문이 참조로 포함된다.

본 발명이 이의 예시적인 구체예들을 참조로 하여 구체적으로 제시되고 설명되었지만, 당업자라면 하기 특허청구범위에 포함되는 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 형태 및 세부 사항의 다양한 변화가 이루어질 수 있음을 인식할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Medical Research Council Matthews, David Barlow, Jillian McKenzie, Andrew <120> Antibodies Against IL-25 <130> 4433.1001002 <150> US 61/101,293 <151> 2008-09-30 <150> GB 0817891.5 <151> 2008-09-30 <160> 41 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Humanised VH domain <220> <221> VARIANT <222> (30)..(30) <223> Xaa is Ser or Thr <220> <221> VARIANT <222> (31)..(31) <223> Xaa is Gly, Asp, Ala, Ser, Val, Asn, Lys, Tyr or Met <220> <221> VARIANT <222> (48)..(48) <223> Xaa is Met or Ile <220> <221> VARIANT <222> (72)..(72) <223> Xaa is Val or Arg <220> <221> VARIANT <222> (100)..(100) <223> Xaa is Asp, Asn or Gly <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Xaa Xaa Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Xaa 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Xaa Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Xaa Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Humanised VH domain RH2.5_S30T <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Humanised VH domain RH2.5_R71V <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Val Ser Ser 115 120 <210> 4 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Humanised VH domain RH2 <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Humanised VH domain <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Humanised VH domain <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Humanised VH domain <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Humanised VH domain <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Humanised VH domain <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Humanised VH domain <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Humanised VH domain <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 12 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Humanised VH domain <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 13 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Humanised VH domain <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Humanised VH domain <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Asp Gly Thr Val Glu Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 16 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 16 gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60 atcagctgca gcgcctccca gggcatcagc aactacctga actggtatca gcagaaggcc 120 gacggcaccg tcgagctgct gatctactac accagcagcc tgcacagcgg cgtgcccagc 180 cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaaccc 240 gaggatatcg ccacctacta ctgccagcag tacagcaagc tgccctacac ctttggcggc 300 ggaacaaagc tggaaatcaa g 321 <210> 17 <211> 139 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Met Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala Leu Pro Gly Ile Leu 1 5 10 15 Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 20 25 30 Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp 50 55 60 Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn 65 70 75 80 Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 85 90 95 Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Ala Arg Glu Gly Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 18 <211> 417 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 18 atggtgctgt ccctgctgta cctgctgacc gccctgcccg gcatcctgag cgaggtgcag 60 ctgcagcaga gcggccctga gctggtgaag cctggcgcca gcatgaagat cagctgcaag 120 gccagcggct acagcttcac cgactacacc atgaactggg tgaagcagag ccacggcaag 180 aacctggaat ggatcggcct gatcaacccc tacaacggcg gcaccagcta caaccagaac 240 ttcaagggca aggccaccct gaccgtggac aagagcagca gcaccgccta catggaactg 300 ctgtctctga ccagcgagga cagcgccgtg tactactgcg ccagagaggg ctacgacggc 360 tacctgtact tcgccatgga ctactggggc cagggcacca gcgtgaccgt gagcagc 417 <210> 19 <211> 137 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly Val Cys Ala Glu Val Arg Leu Val 1 5 10 15 Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser 20 25 30 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Asn Trp Ile Gly Trp Val 35 40 45 Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ile Ile Phe Pro 50 55 60 Gly Asp Ser Asp Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr 65 70 75 80 Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser 85 90 95 Leu Lys Ala Thr Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Asn Pro 100 105 110 Pro Glu Tyr Ser Gly Ala Tyr His Asp Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Ile Val Ser Ser 130 135 <210> 20 <211> 411 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 ctcctcctgg ctgttctcca aggagtctgt gccgaggtgc gccttgtgca gtctggagca 60 gaggtgaaaa agccggggga gtctctgaag atctcctgta aggcttctgg atacagtttt 120 accagtaact ggatcggctg ggtgcgccag atgcccggga aaggcctgga gtggattggg 180 atcatctttc ctggtgactc tgataccata tacagcccgt ccttccaagg ccaggtcacc 240 atttcagtcg acaagtccat caataccgcc tacctgcagt ggagcagcct gaaggccacg 300 gacaccgcca tgtattactg tgcgagacag aacccccccg agtatagtgg cgcatatcat 360 gatgggtggt tcgacccctg gggccaggga accctggtca tcgtctcctc a 411 <210> 21 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: RHA VH domain <400> 21 Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Gly Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly 1 5 10 15 Val Cys Ala Glu Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Asn Phe Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Thr Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ile Val Ser Ser 130 135 140 <210> 22 <211> 424 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Nucleic acid encoding RHA VH domain <400> 22 atggggtcaa ccgccatcct tggcctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 60 gtgcgccttg tgcagtctgg agcagaagtg aaaaagccgg gggagtctct gaagatctct 120 tgcaaggctt ctggatacag ttttaccgac tacaccatga actgggtgcg ccagatgccc 180 gggaaaggcc tggagtggat tgggcttatt aatccttaca atggtggtac tagctacaac 240 cagaatttca agggccaagt caccatttca gtcgacaagt ccatcaatac cgcctacctg 300 cagtggagca gcctgaaggc cacggacacc gccatgtatt actgtgcgag agagggctat 360 gatggttacc tttactttgc tatggactac tggggccagg gaaccctggt catcgtctcc 420 tcag 424 <210> 23 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly 35 40 45 Ile Ser Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn 100 105 110 Ser Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 24 <211> 381 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 atgagggtcc ctgctcagct cctgggactc ctgctgctct ggctcccaga taccagatgt 60 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120 atcacttgcc gggcgagtca gggcattagc aattatttag cctggtatca gcagaaacca 180 gggaaagttc ctaaactcct gatctatgct gcatccactt tgcaatcagg ggtcccatct 240 cggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 300 gaagatgttg caacttatta ctgtcaaaag tataacagtg ccccgtacac ttttggccag 360 gggaccaagc tggagatcaa a 381 <210> 25 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Humanised 2c3 VK domain RKA <400> 25 Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Gly 35 40 45 Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser 100 105 110 Lys Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 26 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Nucleic acid encoding humanised 2c3 VK domain RKA <400> 26 atgagggtcc ctgctcagct cctgggactc ctgctgctct ggctcccaga taccagatgt 60 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120 atcacttgca gtgcatccca gggcattagc aattatctga attggtatca gcagaaacca 180 gggaaagttc ctaaactcct gatctattac acatcaagtt tacactcagg ggtcccatct 240 cggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 300 gaagatgttg caacttatta ctgtcagcag tatagcaagc tgccgtacac gtttggccag 360 gggaccaagc tggagatcaa a 381 <210> 27 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Gly Gly Thr Gly Phe Thr Lys Tyr Ser Gln Asn Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Tyr Asn Asn Tyr Ala Ala Glu Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 28 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 gaggtgcagc tggtggagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaagtt 60 tcgtgcaagg cttctggata ctccttcagt agttatggta tacattgggt gcgccaggcc 120 cccggacaaa ggcttgagtg gatgggatgg atcaacggtg gcactggttt tacaaaatat 180 tcacagaatt ttcagggcag agtcacccta accagggaca cttccgcgag cacagcctac 240 ttggaactga acagcctgag atctgaagac acgggtgtat attactgtgc gagggatccc 300 tacaataact acgcggcgga acttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29 Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 31 Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 32 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32 Asp Tyr Thr Met Asn 1 5 <210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 33 Glu Gly Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 34 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Heavy Chain CDR1 <400> 34 Gly Tyr Thr Met Asn 1 5 <210> 35 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 35 Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 36 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Heavy Chain CDR3 <400> 36 Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 37 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Gly Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly 1 5 10 15 Val Cys Ala <210> 38 <211> 20 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 38 Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Arg Cys 20 <210> 39 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Asp Thr Arg Cys 20 <210> 40 <211> 423 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Nucleic acid encoding RH2.5 R71V <400> 40 atgggcagca cagccattct gggcctgctg ctggccgtgc tgcagggcgt gtgcgccgag 60 gtgcagctgg tcgagagcgg agccgaggtg aagaagccag gcgccagcgt caaggtgtcc 120 tgcaaggcca gcggctacag cttctccggc tacaccatga actgggtgcg gcaggcccca 180 ggccagaggc tggaatggat gggcctgatc aacccctaca acggcggcac cagctacaac 240 cagaacttca agggcagggt gacactgacc gtggatacca gcgccagcac cgcctacctg 300 gaactgaaca gcctgagaag cgaggacacc ggcgtgtact actgcgccag agaggactac 360 gacggctacc tgtacttcgc catggactac tggggccagg gcaccctggt gaccgtgagc 420 agc 423 <210> 41 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Kozak consensus sequence <400> 41 aagcttgccg ccacc 15

Claims

하기 SEQ ID NO:1을 포함하는, 항체 VH 도메인:

여기서,
Xa1은 Ser 또는 Thr이고;
Xa2는 Gly, Asp, Ala, Ser, Val, Asn, Lys, Tyr 또는 Met이고;
Xa3는 Met 또는 Ile이고;
Xa4는 Val 또는 Arg이고;
Xa5는 Asp, Asn 또는 Gly이다.
제 1항에 있어서, Xa2가 Gly이고, Xa5가 Asp 또는 Asn인, VH 도메인.
제 2항에 있어서, Xa2가 Gly이고, Xa5가 Asp인, VH 도메인.
제 1항에 있어서, Xa1이 Ser인, VH 도메인.
제 1항에 있어서, Xa1이 Thr인, VH 도메인.
제 1항에 있어서, Xa3가 Met인, VH 도메인.
제 1항에 있어서, Xa3가 Ile인, VH 도메인.
제 1항에 있어서, Xa4가 Val인, VH 도메인.
제 1항에 있어서, Xa4가 Arg인, VH 도메인.
제 1항에 있어서, 상기 잔기들 Xa1 내지 Xa5가 하기 조합으로 존재하는, VH 도메인:
IL-25와 결합하고 항체 VH 도메인을 포함하는 표적 결합 멤버(target binding member)로서, 상기 VH 도메인이 제 1항에 따른 VH 도메인인, 표적 결합 멤버.
제 11항에 있어서, VL 도메인을 포함하고, 이러한 VL 도메인의 Kabat CDR 1 내지 3이 각각 SEQ ID NO:15의 잔기 24-34 (SEQ ID NO:29); 50-56 (SEQ ID NO:30) 및 89-97 (SEQ ID NO:31)로서 제시된 바와 같은, 표적 결합 멤버.
제 12항에 있어서, 상기 VL 도메인이 CDR1 (SEQ ID NO:29)에 인접한 SEQ ID NO:15의 잔기 35-38을 추가로 포함하는, 표적 결합 멤버.
제 12항에 있어서, SEQ ID NO:15를 포함하는, 표적 결합 멤버.
제 12항에 있어서, 상기 VL 도메인이 인간화된, 표적 결합 멤버.
제 15항에 있어서, 상기 표적 결합 멤버의 서열이 SEQ ID NO:25의 아미노산 21-127을 포함하는, 표적 결합 멤버.
제 11항에 있어서, Fab, F(ab')₂, scFv, Fv 또는 dAb 항체 단편인, 표적 결합 멤버.
제 11항에 있어서, 항체 불변 영역을 포함하는, 표적 결합 멤버.
제 18항에 있어서, 상기 불변 영역이 인간 IgG1 또는 IgG4 불변 영역인, 표적 결합 멤버.
제 18항에 있어서, 전항체(whole antibody)를 포함하는, 표적 결합 멤버.
제 1항의 VH 도메인을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 분리된 핵산.
프로모터에 작동적으로 연결된 제 21항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
제 22항의 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포.
표적 결합 멤버를 생성시키는 조건하에서 제 23항에 따른 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하여, 표적 결합 멤버를 생성시키는 방법.
제 24항에 있어서, 상기 표적 결합 멤버를 분리하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
제 25항에 있어서, 상기 표적 결합 멤버를, 하나 이상의 추가 성분을 포함하는 조성물로 제형화하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
제 11항의 표적 결합 멤버와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
제 27항에 있어서, 동결건조된 분말의 형태로 존재하는, 조성물.
천식을 치료하거나 예방할 필요가 있는 피검체에게 유효량의 제 11항의 표적 결합 멤버를 투여하는 것을 포함하여, 천식을 치료하거나 예방하는 방법.
제 11항에 있어서, 천식의 치료 또는 예방에 사용되는, 표적 결합 멤버.
염증성 장 질환을 치료하거나 예방할 필요가 있는 피검체에게 유효량의 제 11항의 표적 결합 멤버를 투여하는 것을 포함하여, 염증성 장 질환을 치료하거나 예방하는 방법.
궤양성 대장염(ulcerative colitis)을 치료하거나 예방할 필요가 있는 피검체에서 유효량의 제 11항의 표적 결합 멤버를 투여하는 것을 포함하여, 궤양성 대장염을 치료하거나 예방하는 방법.
크론병을 치료하거나 예방할 필요가 있는 피검체에서 유효량의 제 11항의 표적 결합 멤버를 투여하는 것을 포함하여, 크론병을 치료하거나 예방하는 방법.
제 11항에 있어서, 염증성 장 질환의 치료 또는 예방에 사용되는, 표적 결합 멤버.
제 11항에 있어서, 궤양성 대장염의 치료 또는 예방에 사용되는, 표적 결합 멤버
제 11항에 있어서, 크론병의 치료 또는 예방에 사용되는, 표적 결합 멤버
(a) 제 1항의 항체 VH 도메인을 제공하고;
(b) 상기 VH 도메인을 다수의 항체 VL 도메인과 조합하여 항체 분자들을 제공하고;
(c) IL-25에 결합하는 것에 대해 상기 항체 분자들을 스크리닝하고;
(d) IL-25와 결합하는 항체 분자를 선택하는 것을 포함하여, IL-25에 대한 항체를 생성시키는 방법.
제 11항의 표적 결합 멤버를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 분리된 핵산.