PT2344538E - Anticorpos contra il-25 - Google Patents

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DESCRIÇÃO ANTICORPOS CONTRA IL-25

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a anticorpos, que incluem fragmentos de ligação dos mesmos, dirigidos a interleucina 25 (IL-25). ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Asma A asma é um distúrbio inflamatório crónico comum das vias respiratórias. 0 número de pacientes aumentou espetacularmente durante as últimas décadas e a Organização Mundial da Saúde estima que da ordem de 300 milhões de pessoas no mundo sofrem de asma. A asma alérgica caracteriza-se por hipersensibilidade das vias respiratórias (HVR) incontrolável induzida por uma variedade de estímulos provocativos e está associada a infiltrados inflamatórios do tipo 2 nos pulmões.

As citocinas de tipo 2 desempenham uma função importante em mediar na imunidade protetora a infeção parasitária por helmintos, regular funções efetoras tais como o crescimento de linfócitos B e a secreção de IgE, induzir hiperplasia de células caliciformes e a produção de muco associada, eosinofilia, mastocitose e fibrose (1) . É as principais funções desempenhadas por estas citocinas na regulação destas funções efetoras qua as tornaram alvos terapêuticos chave na asma. De facto, os modelos de ratinho em que estas citocinas são expressas em excesso mostram características significativas da asma. Surpreendentemente então, os esforços para melhorar a asma experimental bloqueando citocinas de tipo 2 específicas demonstraram ser insatisfatórios, com a exceção de inibir IL-13. A inibição de IL-13 suprime tanto HVR como a inflamação das vias respiratórias, embora o mecanismo continue sem estar claro (2, 3) . No entanto, dada a complexa fisiopatologia e a pouco entendida etiologia da asma, é incerto se as rotas individuais que escolhem alvo demostrarão por último lugar ser terapeuticamente satisfatórias.

Recentemente, mostraram que a expressão em excesso de IL-25/IL-17E, um membro da família de citocinas IL-17 estruturalmente relacionada (8), induz resposta de tipo 2 in vivo (4-6) e aumenta a sensibilidade aos agonistas das vias respiratórias ( 7) . Ratinhos deixaram de expulsar parasitas helmínticos eficazmente; um indicador chave de uma resposta de tipo 2 ineficaz (9, 10) . Também foi mostrado que IL-25 é regulada positivamente em amostras de pacientes com asma.

Doença inflamatória intestinal A doença inflamatória intestinal (Eli) é uma inflamação crónica que afeta a camada mucosa do intestino grosso ou colon, que normalmente compreende uma ou mais condições de doença selecionadas do grupo que consiste em colite ulcerosa (CU) e doença de Crohn (DC) . Acredita-se que a CU é uma doença mediada por Th2, mostrando um modelo de ratinho representativo a participação de citocinas de tipo 2 no desenvolvimento de inflamação do intestino (16). Observou-se produção de IL-25 num modelo de ratinho de colite crónica, em associação com uma mudança de resposta de tipo Thl a Th2 (17) e informou-se de alta expressão de ARNm de IL-25 ao longo do tubo gastrointestinal em ratinhos (18) . Além disso, o gene IL-25 está localizado dentro de uma região de suscetibilidade a doença de Crohn no cromossoma 14, embora esteja por investigar sua possível associação com a doença (19). Além disso, a Eli pode compreender uma ou mais condições de doença selecionadas do grupo que consiste em colite colagenosa, colite linfocítica, colite isquémica, colite por desvio, síndrome de Behçet, colite infeciosa e colite indeterminada.

As terapêuticas convencionais para o tratamento de Eli implicam tanto antibióticos como fármacos derivados de esteroides; no entanto, estes não são atualmente satisfatórios em induzir ou manter a remissão clinica em pacientes (20) . Também está atualmente disponível uma terapêutica que implica agentes anti-TNF-OC, a pesar de que mostra má eficácia (21, 22) . Isto mostra que há uma clara necessidade de terapêuticas novas e mais eficazes no tratamento de doenças inflamatórias do intestino.

Anticorpos A estrutura básica de um anticorpo é muito conhecida na técnica. Um anticorpo que é produzido naturalmente normalmente tem quatro cadeias de polipéptidos: duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas ligadas por ligações dissulfureto. As cadeias pesadas (VH) e leves (VL) têm, cada uma, uma região constante e uma região variável (ou domínio) . As regiões variáveis são principalmente responsáveis da ligação ao antigénio. Dentro de cada região variável, três subregiões, conhecidas como as regiões determinantes da complementaridade (CDR), fazem contacto com o antigénio. As CDR de cada domínio variável são enumeradas, da extremidade N à extremidade C, CDR1, CDR2 e CDR3. Entre a extremidade N e C das CDR estão as quatro denominadas regiões estruturais, que fazem alguns contactos, se os fazem, com o antigénio. Mais detalhes referentes às estruturas de anticorpos são ilustrados em muitos dos documentos citados mais adiante, que são incorporados no presente documento por referência. Há várias formas em que podem ser produzidos os anticorpos contra um antigénio alvo. A geração de anticorpos monoclonais utilizando tecnologia de hibridomas é um tal método. Os anticorpos são gerados normalmente em ratinhos ou outros roedores. Isto pode ser uma forma útil de gerar anticorpos de alta afinidade. No entanto, para que tais anticorpos sejam então úteis em terapêutica humana, é normalmente necessário transferir as CDR dos anticorpos a uma região estrutural humana. Isto é, tentar evitar uma resposta de anticorpos humanos anti-ratinho num paciente. 0 princípio geral do enxerto de CDR foi descrito por Jones et al. e Riechman et al. (11, 12). Isto é, as CDR de um anticorpo de ratinho são transplantadas nas regiões estruturais de um anticorpo humano recetor. Na prática, embora o anticorpo resultante se unirá ao mesmo antigénio alvo que o anticorpo de ratinho dador original, a afinidade do anticorpo enxertado é normalmente muito reduzida.

Além disso, a termoestabilidade dos anticorpos enxertados pode ser comprometida frequentemente. São conhecidas na técnica diversas formas para tentar recuperar e otimizar as propriedades do anticorpo original. Por exemplo, dentro das regiões estruturais existem certos resíduos "de estrutura canónica" Chotia & Lesk (13) que estão associados a certas CDR da linha germinal. Além disso, Foote & Winter (14) identificaram resíduos de "zona Vernier" (alguns dos quais também são resíduos de estrutura canónica) que suportam as conformações de alça de ligação ao antigénio e sus disposições relativas e, portanto, foi sugerido que desempenham uma função importante em sintonizar o ajuste de um anticorpo ao antigénio. Além disso, acredita-se que resíduos adicionais dentro da região estrutural estabilizam e mantêm a superfície de separação de VH/VL. Por conseguinte, aqueles peritos na especialidade que buscam humanizar um anticorpo frequentemente buscam regiões estruturais humanas em que os resíduos da zona de Vernier, canónicos e da superfície de separação ("VCI") se correspondam tão estreitamente como seja possível com aqueles do anticorpo dador original.

No entanto, cada anticorpo representa um desafio único para aqueles peritos na especialidade e não há certeza em que qualquer metodologia geralmente conhecida para o enxerto de CDR seja diretamente aplicável em cada caso.

Os presentes inventores e colaboradores (Ballantyne et ai. (15)) informam da produção de um anticorpo monoclonal de ratinho, 2C3, que se liga a IL-25 e in vivo pode bloquear a hipersensibilidade das vias respiratórias em asma alérgica. Até agora, a sequência do anticorpo não esteve disponível para o público. 0 documento PCT/GB2008/001365, publicado em 30 de outubro de 2008 como o documento WO2008/129263, informa da sequência do anticorpo 2C3 e sua utilização em bloquear a hipersensibilidade das vias respiratórias.

DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um anticorpo humanizado (enxertado com CDR) que se baseia na sequência de 2C3. Na produção de este anticorpo vários desafios tiveram que ser superados.

Os inventores selecionaram em primeiro lugar uma cadeia de VH de anticorpo humano recetor com homologia máxima por VCI, concretamente 20 dos 22 resíduos de VCI. No entanto, encontrou-se que o anticorpo resultante ("RHA") se ligou a IL-25 a um grau significativamente menor que o próprio 2C3. Apesar de várias modificações adicionais ao anticorpo, que incluem mudanças aos aminoácidos designados VCI e resíduos que pareceu que representavam mutações somáticas raras, conseguiu-se pouca melhora da ligação ao anticorpo.

Numa tentativa de superar a falha da abordagem de homologia de VCI com a humanização de anticorpos, foi selecionada uma região estrutural de VH humana diferente com uma menor coincidência de resíduos de VCI (17/22), mas homologia global muito ligeiramente maior. O anticorpo resultante proporcionou maior ligação que o anticorpo "RHA", embora isto não fosse ainda tão grande como o anticorpo 2C3 parental.

Com a finalidade de maximizar a ligação e minimizar os resíduos não humanos que têm o risco de provocar uma resposta de anticorpos, foram feitas mudanças na região estrutural e CDR adicionais. Encontrou-se que o anticorpo resultante tinha ligação potenciada em comparação com 2C3 e num teste in vivo de inibição da hipersensibilidade das vias respiratórias encontrou-se que era significativamente mais potente que 2C3. 0 anticorpo também apresentou boa termoestabilidade. 0 alcance da presente invenção é definido pelas reivindicações e qualquer informação que não esteja dentro das reivindicações é proporcionada para informação somente. A presente invenção refere-se à cadeia de VH humanizada derivada de 2C3 para um anticorpo que compreende esta cadeia. 0 anticorpo pode compreender uma cadeia de VL humanizada que compreende as CDR VL de 2C3.

Assim, num aspeto, a invenção proporciona um domínio VH de anticorpo que compreende SEQ ID N°: 1:

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro

Gly Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser

Phe Xal Xa2 Tyr Thr Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly

Gin Arg Leu Glu Trp Xa3 Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly r*1if rpV%v Oav> ΦΐΓν> A AM m M ^ AM T)Ua Ttrn Λ v/<r ΦΚι- T All α ui. úci iyi non vjj.ii non rnc nyo vjiy ναι mi jjcu

Thr Xa4 Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn

Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg

Glu Xa5 Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp

Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser em que:

Xal é Ser ou Thr;

Xa2 é Gly, Asp, Ala, Ser, Vai, Asn, Lys, Tyr ou Met;

Xa3 é Met ou Ile;

Xa4 é Vai ou Arg; e

Xa5 é Asp, Asn ou Gly, combinado com uma cadeia de VL que compreende as CDR VL de 2C3.

Num aspeto, os resíduos Xal - Xa5 podem ser lecionados a partir das seguintes combinações:

Xal é Ser ou Thr;

Xa2 é Gly ou Asp;

Xa3 é Met ou lie;

Xa4 é Val ou Arg; e

Xa5 é Asp, Asn ou Gly.

Em algumas formas de realização, Xa2 é Gly e Xa5 é Asp ou Asn, preferentemente Asp.

Em algumas formas de realização (incluindo aquelas em que Xa2 é Gly e Xa5 é Asp ou Asn, preferentemente Asp), Xal é Ser.

Em algumas formas de realização (incluindo aquelas em que Xa2 é Gly e Xa5 é Asp ou Asn, preferentemente Asp), Xal é Thr.

Em algumas formas de realização, que incluem todas as combinações anteriormente descritas de Xa2, Xa5 e Xal, Xa3 é Met.

Em algumas formas de realização, que incluem todas as combinações anteriormente descritas de Xa2, Xa5 e Xal, Xa3 é lie.

Todas as formas de realização anteriormente descritas podem ser combinadas com quaisquer dos valores de Xa4, isto é, Val ou Arg.

Combinações particulares dos resíduos anteriores são expostas no seguinte quadro. Por comodidade do leitor perito e por coerência com os exemplos adjuntos, o quadro enumera a numeração de Kabat dos resíduos. Em alguns casos, esta se diferencia da numeração da lista de sequências.

0 domínio VH pode ser combinado com um domínio variável da cadeia leve para proporcionar um membro de ligação a alvo especifico que se liga a IL-25.

Um domínio da cadeia leve adequado é um que compreende os resíduos de CDR do anticorpo 2C3. Preferentemente, a cadeia leve é uma cadeia leve humanizada, isto é, compreende sequências da região estrutural humana e as regiões CDR de 2C3. 0 domínio da cadeia leve de 2C3 é mostrado como SEQ ID N° : 15. As regiões CDR 1-3 podem compreender resíduos 30-34, por exemplo, podem compreender resíduos 24-34 (SEQ ID N°: 29); 50-56 (SEQ ID N°: 30) e 89-97 (SEQ ID N°: 31), respetivamente.

Os resíduos de CDR podem estar na cadeia leve do anticorpo 2C3 nativo ou podem ser transferidos a uma molécula de cadeia leve humanizada.

Os resíduos 35-38, embora não compreendam a CDR, estão muito conservados entre sequências de cadeia leve de ratinho e humana e também podem ser transferidos.

Um exemplo de uma cadeia de VL humanizada compreende os resíduos 21-127 de SEQ ID N° : 25. No entanto, também podem ser utilizadas outras regiões estruturais humanas que compreendem as três regiões CDR da SEQ ID N° : 15. Além disso, como se indica mais adiante, podem ser utilizadas sequências líder de anticorpos diferentes à sequência líder de anticorpo não nativo de uma cadeia de VL. Portanto, numa forma de realização, a cadeia de VL compreende a SEQ ID N°: 25. Em outra forma de realização, a cadeia de VL pode compreender uma sequência líder de anticorpo tal como a descrita no presente documento mais adiante fusionada aos resíduos 21-127 da SEQ ID N°: 25. A invenção proporciona além disso a utilização de membros de ligação a alvo da invenção, por exemplo, em forma de uma composição farmacêutica, para o tratamento de doenças, incluindo condições patológicas inflamatórias, tais como asma (incluindo asma alérgica), doença de Crohn e colite ulcerosa.

Estes e outros aspetos adicionais da invenção são descritos com maior detalhe mais adiante e com referência aos exemplos adjuntos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra a sequência de nucleótidos da cadeia leve kappa (SEQ ID N° : 16) e de aminoácidos (SEQ ID N° : 15) do anticorpo de ratinho 2c3. 0 sombreado indica as CDR. A Figura 2 mostra a sequência de nucleótidos da cadeia pesada (SEQ ID N° : 18) e de aminoácidos (SEQ ID N° : 17) do anticorpo de ratinho 2c3. 0 sombreado indica as CDR. A Figura 3 mostra a sequência de ADN (SEQ ID N°: 20) e de aminoácidos (SEQ ID N°: 19) de AY393094. A Figura 4 mostra a sequência de ADN (SEQ ID N°: 22) e de aminoácidos (SEQ ID N°: 21) de RHA de 2c3 humanizado. A Figura 5 mostra a sequência de ADN (SEQ ID N°: 24) e de aminoácidos (SEQ ID N°: 23) de AY510106. A Figura 6 mostra a sequência de ADN (SEQ ID N°: 26) e de aminoácidos (SEQ ID N°: 25) da cadeia leve kappa humanizada de RKA de 2c3.

As Figuras 7A-C mostram uma comparação da atividade de ligação do anticorpo humanizado RHA/RKA 2c3 e variantes com 2c3 quimérico. A Figura 8 mostra a sequência de ADN (SEQ ID N°: 28) e de aminoácidos (SEQ ID N°: 27) da região estrutural AJ399823 utilizada no projeto de 2c3-RH2 humanizado.

As Figuras 9A e B mostram o efeito de mutações de CDR especificas a RH2bcdef de 2c3 que se liga a IL-25. A Figura 10 mostra o efeito da ligação de IL-25 combinando mutações de CDR D31G e G96D. A Figura 11 mostra a comparação da ligação de RH2.5_S30T de 2c3 e RH2.5 R71V de 2c3 a IL-25. A Figura 12 é o protocolo para o modelo de ratinho in vivo de HVR.

As Figuras 13A e B mostram o efeito de administrar RH2.5_R71V de 2c3 sobre a resistência pulmonar em resposta a metacolina.

As Figuras 14A e B mostram o comprimento do colon e peso corporal de ratinhos num modelo de colite. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Membro de ligação a alvo

Este descreve um membro de um par de moléculas que têm especificidade de ligação entre si. Os membros de um par de ligação especifico podem ser derivados naturalmente ou ser produzidos sinteticamente completa ou parcialmente. Um membro do par de moléculas tem uma zona sobre sua superfície, ou uma cavidade, que se liga especificamente a e, portanto, é complementar a uma organização espacial e polar particular do outro membro do par de moléculas. Portanto, os membros do par têm a propriedade de se ligar especificamente entre si. Exemplos de tipos de pares de ligação específicos são antigénio-anticorpo, biotina-avidina, hormona-recetor de hormona, recetor-ligando e enzima-substrato. O presente pedido refere-se às reações de tipo antigénio-anticorpo. Por conseguinte, um membro de ligação a alvo da invenção compreenderá pelo menos uma parte de uma molécula de anticorpo, mais particularmente pelo menos uma parte do domínio de ligação ao antigénio de uma tal molécula.

Em geral, a região variável da cadeia pesada (domínio VH) de um anticorpo desempenha uma função significativa na ligação de um anticorpo a um antigénio. Portanto, os membros de ligação a alvo da invenção baseiam-se, portanto, em aqueles que compreendem o domínio VH que inclui SEQ ID N° : 1.

Para preparar os domínios de VH da presente invenção, encontrou-se que as regiões CDR do anticorpo 2C3 melhoravam alterando as sequências de CDR1 e CDR3. Por conseguinte, embora as formas de realização preferidas da invenção descritas no presente documento contemplem domínios de VH da SEQ ID N° : 1 em que Xa2 é Gly e Xa5 é Asp, a invenção também contempla domínios de VH humanizados que têm regiões estruturais humanas que incluem as regiões CDRl-3 de SEQ ID N°: 34, SEQ ID N°: 35 e SEQ ID N°: 36 respetivamente.

Assim, em outros aspetos adicionais, a invenção proporciona um membro de ligação a alvo que se liga a IL-25 em que a região determinante da complementaridade (CDR) da cadeia pesada Hl tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N° : 34. Em outro aspeto, a invenção proporciona um membro de ligação a alvo que se liga a IL-25 em que a região determinante da complementaridade (CDR) da cadeia pesada H2 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 35. Em outro aspeto, a invenção proporciona um membro de ligação a alvo que se liga a IL-25 em que a região determinante da complementaridade (CDR) da cadeia pesada H3 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 36.

Num aspeto adicional, a invenção proporciona um membro de ligação a alvo que se liga a IL-25 em que a região determinante da complementaridade (CDR) da cadeia leve LI tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 29. Em outro aspeto, a invenção proporciona um membro de ligação a alvo que se liga a IL-25 em que a região determinante da complementaridade (CDR) da cadeia leve L2 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N° : 30. Em outro aspeto, a invenção proporciona um membro de ligação a alvo que se liga a IL-25 em que a região determinante da complementaridade (CDR) da cadeia leve L3 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 31.

Num aspeto adicional, a invenção proporciona um membro de ligação a alvo que se liga a IL-25 em que a região determinante da complementaridade (CDR) da cadeia pesada Hl tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 34, a CDR da cadeia pesada H2 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N° : 35 e a CDR da cadeia pesada H3 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 36. Numa forma de realização, um tal membro de ligação a alvo tem uma CDR da cadeia leve LI com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 29, uma CDR da cadeia leve L2 de SEQ ID N°: 30 e uma CDR da cadeia leve L3 de SEQ ID N°: 31. A região estrutural de tais membros de ligação a alvo pode ser unicamente humana, unicamente murina ou, de acordo com a presente invenção, uma região estrutural que é principalmente humana, mas que retém um ou mais resíduos murinos de maneira que se potencie a afinidade de ligação.

Assim, os membros de ligação a alvo que compreendem as ditas CDR formam um aspeto adicional da invenção e podem ser utilizadas como é descrito no presente documento para membros de ligação a alvo com um domínio VH que compreende SEQ ID N°: 1.

Geralmente, um membro de ligação a alvo compreende um domínio VH emparelhado com um domínio VL para proporcionar um domínio de ligação anticorpo-antigénio. Numa forma de realização, o domínio VH está emparelhado com um domínio VL cujas CDR e, opcionalmente qualquer resíduo da região estrutural conservado entre humano e ratinho, são os do anticorpo 2C3.

No entanto, a promiscuidade da cadeia leve está bem estabelecida na técnica, como foi descrito adicionalmente no presente documento e, portanto, VH pode ser emparelhada com um domínio VL diferente ao VL derivado de 2C3. Um tal VL pode ser selecionado como se trata mais adiante no presente documento.

As estruturas e localizações dos domínios variáveis de imunoglobulina podem ser determinadas por referência a Rabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4a edição. US Department of Health and Human Services. 1987, e atualizações da mesma. Estão disponíveis várias fontes em linha académicas e comerciais para consultar esta base de dados. Por exemplo, veja-se A.C.R. Accessing the Rabat Antibody Sequence Database by Computer PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 25 (1996), ISO-133.

Um membro de ligação a alvo de acordo com a presente invenção pode se ligar a IL-25 com uma afinidade substancialmente similar à do anticorpo RHA2,5 R71V2 descrito mais adiante, por exemplo + 10 %. Um membro de ligação a alvo geralmente será específico para IL-25. Portanto, o membro de ligação a alvo não mostrará nenhuma ligação significativa a moléculas distintas de su(s) componente (s) de ligação específica. Por exemplo, encontrou-se que o anticorpo 2C3, do qual se derivam os anticorpos da invenção, não reage de maneira cruzada com IL-4, IL-5 e IL-13 e, portanto, a anulação de tal reatividade cruzada com outras citocinas implicadas na asma e processos similares é uma característica desejável dos membros de ligação a alvo da invenção.

Normalmente, a especificidade pode ser determinada por meio de um ensaio de ligação tal como ELISA que utiliza um painel de antigénios. Um membro de ligação a alvo de acordo com a presente invenção pode reconhecer IL-25 e nenhum outro membro da família IL-17, particularmente nenhum de IL-17A, IL-17B e IL-17C; mais preferentemente os três IL-17A, IL-17B e IL-17C. A ligação de um membro de ligação a alvo de acordo com a invenção com IL-25 pode ser anulada por competição com IL-25 recombinante. A afinidade de ligação e a força de neutralização de diferentes membros de ligação a alvo podem ser comparados em condições apropriadas.

Molécula de anticorpo

Este descreve uma imunoglobulina tanto natural como produzida parcial ou completamente de forma sintética. Foi mostrado que os fragmentos de um anticorpo completo podem realizar a função de antigénios de ligação. Portanto, a referência a um anticorpo também engloba qualquer polipéptido ou proteína que compreenda um fragmento de ligação a anticorpo.

Exemplos de fragmentos de ligação são (i) o fragmento Fab que consiste nos domínios VL, VH, CL e CHI; (ii) o fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CHI; (iii) o fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um anticorpo único; (iv) o fragmento dAb (Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)) que consiste num domínio VH; (v) fragmentos F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab unidos; (vi) moléculas Fv de cadeia simples (scFv), em que um domínio VH e um domínio VL estão unidos por um conector de péptidos que permite que os dois domínios se associem para formar um local de ligação a antigénio (Bird et al, Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); (vii) dímeros Fv de cadeia simples biespecíficos (documento PCT/US92/09965) e (viii) "diacorpos", fragmentos multivalentes ou multiespecificos construídos por fusão génica (documento WO94/13804; P. Holliger et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 6444-6448, 1993) . As moléculas de Fv, scFv ou diacorpo podem se estabelecidas pela incorporação de pontes dissulfureto que ligam os domínios VH e VL (E. Reiter et al, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996). Também podem ser preparados minicorpos que compreendem um scFv ligado a um domínio CH3 (S. Hu et al, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996).

Quando são utilizados anticorpos biespecificos, estes podem ser anticorpos biespecificos convencionais, que podem ser preparados de diversas maneiras (Holliger, P. e Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)), por exemplo, ser preparados quimicamente ou a partir de hibridomas híbridos ou podem ser quaisquer dos fragmentos de anticorpo biespecificos mencionados anteriormente. Os diacorpos e scFv podem ser construídos sem nenhuma região Fc, utilizando unicamente domínios variáveis, reduzindo possivelmente os efeitos de reação anti-idiotípica.

Os diacorpos biespecificos, ao contrário dos anticorpos completos biespecificos, também podem ser particularmente úteis devido a que podem ser construídos facilmente e expressos em E. coli. Os diacorpos (e muitos outros polipéptidos tais como fragmentos de anticorpos) de especificidades de ligação apropriadas podem ser selecionados facilmente utilizando expressão em fago (documento WO94/13804) a partir de bibliotecas. Se um braço do anticorpo se mantém constante, por exemplo, com uma especificidade dirigida contra IL-25, então pode ser preparada uma biblioteca em que se varia o outro braço e se seleciona um anticorpo de especificidade apropriada. Podem ser preparados anticorpos completos biespecificos por engenharia de botão em olhai (J. B. B. Ridgeway et al, Protein Eng., 9, 616-621, 1996). É possível tomar anticorpos monoclonais e outros e utilizar técnicas de tecnologia de ADN recombinante para produzir outros anticorpos ou moléculas quiméricas que retêm a especificidade do anticorpo original. Tais técnicas podem implicar introduzir ADN que codifica a região variável de imunoglobulina, ou as regiões determinantes da complementaridade (CDR), de um anticorpo nas regiões constantes ou regiões constantes mais regiões estruturais, de uma imunoglobulina diferente. Vejam-se, por exemplo, os documentos EP-A-184187, GB 2188638A ou EP-A-239400.

Preferentemente, as regiões CDR da cadeia de VL de 2C3 são enxertadas numa região estrutural humana. A região estrutural humana pode ser selecionada por diversos métodos, por exemplo, comparando as sequências da região estrutural de ratinho ou da região VL de ratinho com sequências da região estrutural humana ou da região VL conhecidas e selecionando uma região estrutural humana que tenha o maior grau de similaridade ou de identidade de aminoácidos ou um dos maiores. Podem ser feitas modificações nas regiões estruturais de sequências humanas nativas com a finalidade de otimizar adicionalmente os anticorpos com CDR enxertada resultantes.

Embora num aspeto preferido da invenção sejam preferidas moléculas de anticorpo que compreendam um par de domínios VH e VL, os domínios de ligação únicos baseados em sequências de domínio VH ou VL formam aspetos adicionais da invenção. Sabe-se que os domínios de imunoglobulina únicos, especialmente domínios VH, podem unir antigénios alvo de uma maneira especifica.

No caso de quaisquer dos domínios de ligação de cadeia única, estes domínios podem ser utilizadas para rastrear domínios complementares capazes de formar um membro de ligação a alvo de dois domínios capaz de se ligar a IL-25, como se trata adicionalmente no presente documento mais adiante.

As moléculas de anticorpo da presente invenção podem compreender adicionalmente regiões constantes de anticorpo ou partes das mesmas. Por exemplo, um domínio VL pode se ligar em su extremidade C aos domínios constantes da cadeia leve de anticorpo incluindo cadeias CK ou ϋλ humanas, preferentemente CK. Similarmente, um membro de ligação a alvo basado num domínio VH pode se ligar em sua extremidade C a toda ou parte de uma cadeia pesada de imunoglobulina derivada de qualquer isotipo de anticorpo, por exemplo,

IgG, IgA, IgE e IgM e quaisquer das subclasses de isotipo, particularmente lgGl e lgG4. Prefere-se lgG4. Podem ser utilizadas regiões Fc tais como Anab e Anac, como é revelado no documento W099/58572.

Portanto, são incluídas moléculas quiméricas que compreendem um domínio de ligação a alvo, ou equivalente, fusionadas a outro polipéptido. A clonagem e a expressão de anticorpos quiméricos são descritas nos documentos EP-A-0120694 e EP-A-0125023.

As regiões estruturais das moléculas de anticorpo da invenção também podem incluir sequências de glicosilação que incluem um ou mais locais de glicosilação. Dependendo da célula hospedeira na qual é expresso o membro de ligação a alvo, pode variar o padrão de glicosilação. Portanto, as construções de ácido nucleico que codificam locais de glicosilação podem ser modificadas para eliminar o local ou alternativamente tais locais podem ser introduzidas na proteína. Por exemplo, os locais de N-glicosilação em proteínas eucariotas são caracterizadas por um triplete de aminoácidos Asn-X-E, em que X é qualquer aminoácido, exceto Pro e Y é Ser ou Thr. Substituições, adições ou deleções apropriadas da sequência de nucleótidos que codifica estes tripletes resultarão na prevenção da ligação de resíduos de hidratos de carbono na cadeia lateral de Asn. A alteração de um único nucleótido, selecionado de maneira que Asn seja substituído com um aminoácido diferente, por exemplo, é suficiente para inativar um local de N-glicosilação. Procedimentos conhecidos para inativar locais de N-glicosilação em proteínas incluem aqueles descritos na patente U.S. n° 5.071.972 e no documento EP 276.846.

Domínio de ligação a antigénio.

Esta descreve a parte de uma molécula de anticorpo que compreende a área que se liga especificamente a e é complementar a parte ou todo um antigénio. Quando o antigénio é grande, um anticorpo pode se ligar unicamente a uma parte particular do antigénio, parte que se denomina um epitopo. Pode ser proporcionado um domínio de ligação a antigénio por meio de um ou mais domínios variáveis de anticorpo (por exemplo, um fragmento de anticorpo denominado Fd que consiste num domínio VH). Preferentemente, um domínio de ligação a antigénio compreende pelo menos uma porção substancial de uma região variável da cadeia leve de anticorpo (VL) e pelo menos uma porção substancial de uma região variável da cadeia pesada de anticorpo (VH).

Uma porção substancial de um domínio variável de imunoglobulina compreenderá pelo menos as três regiões CDR, juntamente com sus regiões estruturais intermediárias. Preferentemente, a porção também incluirá pelo menos aproximadamente 50 % de uma ou ambas das primeira e quarta regiões estruturais, sendo o 50 %, 50 % da extremidade C da primeira região estrutural e 50 % da extremidade N da quarta região estrutural. Resíduos adicionais na extremidade N ou C da parte substancial do domínio variável podem ser aqueles que não estão normalmente associados com regiões de domínio variável que são produzidos naturalmente. Por exemplo, a construção de membros de ligação a alvo da presente invenção preparados por meio de técnicas de ADN recombinante pode dar como resultado a introdução de resíduos da extremidade N ou C codificados por ligantes introduzidos para facilitar a clonagem ou outras etapas de manipulação. Outras etapas de manipulação incluem a introdução de ligantes para ligar domínios variáveis da invenção a sequências de proteínas adicionais que incluem cadeias pesadas de imunoglobulina, outros domínios variáveis (por exemplo, na produção de diacorpos) ou marcadores de proteína como se trata com mais detalhe mais adiante.

Compreende

Este é utilizado geralmente no sentido de incluir, isto é, permitir a presença de uma ou mais caracteristicas ou componentes.

Isolado

Este refere-se ao estado em que os domínios VH, membros de ligação a alvo da invenção ou ácidos nucleicos que codificam tais membros de ligação, estarão geralmente de acordo com a presente invenção. Os membros e ácido nucleico estarão livres ou substancialmente livres de material com os quais estão naturalmente associados tais como outros polipéptidos ou ácidos nucleicos com os quais se encontram em seu ambiente natural ou o ambiente em que são preparados (por exemplo, cultura celular) quando tal preparação é por tecnologia de ADN recombinante realizada in vitro ou in vivo.

Os membros de ligação a alvo e ácido nucleico podem ser formulados com diluentes ou adjuvantes e ainda ser isolados com fins práticos - por exemplo, os membros são misturados normalmente com gelatina ou outros veículos se forem utilizados para revestir placas de microtitulação para utilização em imunoensaios ou são misturados com veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis quando são utilizados em diagnóstico ou terapêutica. Os membros de ligação a alvo podem estar glicosilados, tanto naturalmente como por meio de sistemas de células eucariotas heterólogas (por exemplo, células CHO ou NSO (ECACC 85110503) ou podem estar sem glicosilar (por exemplo, se forem produzidos por expressão numa célula procariota).

Caracteristicas adicionais de membros de ligação a alvo.

Além das sequências de anticorpos, um membro de ligação a alvo de acordo com a presente invenção pode compreender outros aminoácidos, por exemplo, formando um péptido ou polipéptido, tal como um domínio dobrado ou para conferir à molécula outra característica funcional adicional à capacidade de se ligar a antigénio. Os membros de ligação a alvo da invenção podem levar um marcador detetável ou podem ser conjugados com uma toxina ou enzima (por exemplo, por meio de uma ligação ou ligante peptidilo).

Marcadores detetáveis incluem radiomarcadores tais como 1311 ou 99Tc, que podem se ligar aos anticorpos da invenção utilizando química convencional conhecida na técnica de obtenção de imagens de anticorpos. Os marcadores também incluem marcadores enzimáticos tais como peroxidase de rábano picante. Os marcadores também incluem resíduos químicos tais como biotina que podem ser detetados através da ligação a um resíduo detetável análogo específico, por exemplo, avidina marcada.

Quando a característica adicional é um domínio polipeptídico ou marcador, o membro de ligação a alvo pode ser produzido por técnicas recombinantes, isto é, pela expressão de um ácido nucleico que codifica uma fusão do membro de ligação a alvo e o domínio adicional. Embaralhamento de cadeias

Um aspeto adicional da invenção proporciona um método para obter um domínio de ligação anticorpo-antigénio para IL-25, compreendendo o método proporcionar a combinação de um domínio VH de um membro de ligação a alvo da invenção com um ou mais domínios VL e testar a combinação ou combinações de VH/VL para o domínio de ligação anticorpo-antigénio para IL-25. 0 dito domínio VL pode ter uma sequência de aminoácidos que é substancialmente como foi exposto no presente documento.

Pode ser utilizado um método análogo em que uma ou mais variantes de sequência de um domínio VL revelado no presente documento são combinados com um ou mais domínios VH.

Isto pode ser conseguido por métodos de rastreio por expressão em fago utilizando o denominado abordagem combinatória dupla hierárquico como é revelado no documento W092/01047 em que é utilizado uma colonia individual que contém tanto um clone da cadeia H como L para infetar uma biblioteca completa de clones que codificam a outra cadeia (L ou H) e o membro de ligação a alvo de duas cadeias resultante se seleciona de acordo com técnicas de expressão em fago tais como as descritas nessa referência.

Portanto, a presente invenção proporciona um método para selecionar uma molécula de anticorpo para IL-25, compreendendo o método: (a) proporcionar um domínio VH que compreende um membro de ligação a alvo que se liga a IL-25 e que compreende um domínio VH de anticorpo da presente invenção; (b) combinar o dito domínio VH com uma pluralidade de domínios VL de anticorpo para proporcionar moléculas de anticorpo; (c) rastrear as ditas moléculas de anticorpo para a ligação a IL-25; e (d) selecionar uma molécula de anticorpo que se liga a IL-25.

Em tal método, os domínios VH e VL podem ser proporcionados em forma de proteínas expressas por ADN recombinante, particularmente por meio de um ADN de fago ou fagémido. A pluralidade de domínios VL pode ser quaisquer de 104 domínios individuais para cima, por exemplo, de 106 a 108 ou 1010 domínios.

As moléculas de anticorpo, e ácido nucleico que codifica as ditas moléculas, podem formar uma parte adicional da presente invenção. IL-25 IL-25, também denominado na técnica IL-17E, está disponível de fontes comerciais (por exemplo R&D Systems, MN, USA) ou pode ser clonado ou sintetizado por referência às sequências de IL-25 disponíveis na técnica. A IL-25 murina (proteína NCBI NP_542767) é descrita por Hurst et ai, 2002 (Ref. 7 mais adiante) . A IL-25 humana (proteína NCBI Q9H293) é descrita por Fort et al. (Ref. 4 mais adiante). Para a produção de anticorpos ou utilização em imunoensaios, podem ser utilizadas fragmentos de IL-25 recombinante, particularmente os truncados na extremidade N. Por exemplo, a IL-25 humana recombinante comercialmente disponível (IL-17E) compreende a sequência de proteína madura de Tyr 33 - Gly 177 de n° de acesso Q9H293) e a IL-25 murina comercialmente disponível compreende os resíduos Vai 17 - Ala 169 de IL-17E de ratinho (n° de Acesso NP_542 7 67) . Ácidos nucleicos e vetores

Em aspetos adicionais, a invenção proporciona um ácido nucleico isolado que compreende uma sequência que codifica um membro de ligação a alvo, um domínio VH ou um domínio VL de acordo com a presente invenção, e métodos para preparar um membro de ligação a alvo, um domínio VH ou um domínio VL da invenção, que compreende expressar o dito ácido nucleico em condições para provocar a produção do dito membro de ligação a alvo, domínio VH ou domínio VL e recuperá-lo.

Os ácidos nucleicos da invenção podem compreender as sequências ou porções relevantes das mesmas (por exemplo, regiões que codificam CDR) de SEQ ID N° : 40 (para cadeias pesadas) ou SEQ ID N°: 26 (para cadeias leves), ou variantes destas sequências modificadas por meio de, por exemplo, mutagénese dirigida ao local para codificar outros domínios VH e VL da invenção. Adicionalmente, a utilização de codão pode ser variada, por exemplo, para otimizar a expressão da sequência numa célula hospedeira desejada. A presente invenção proporciona além disso um ácido nucleico isolado que codifica um membro de ligação a alvo da presente invenção. O ácido nucleico inclui ADN e ARN. O ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode compreender ADN ou ARN e pode ser completa ou parcialmente sintético. Referência a uma sequência de nucleótidos, como é exposto no presente documento, inclui uma molécula de ADN com a sequência especificada e engloba uma molécula de ARN com a sequência especificada em que U é substituído por T, a menos que o contexto requeira de outro modo. A presente invenção também proporciona vetores, por exemplo, em forma de plasmideos, vírus, por exemplo, fago ou fagémido, cósmidos, cassetes de transcrição ou expressão que compreendem pelo menos um ácido nucleico como anteriormente.

Podem ser escolhidos ou construídos vetores adequados que contenham sequências reguladoras apropriadas, incluindo sequências promotoras, sequências terminadoras, sequências de poliadenilação, sequências potenciadoras, genes marcadores e outras sequências conforme for apropriado. Para detalhes adicionais veja-se, por exemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2a edição, Sambrook et ai., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Os vetores da invenção também incluem vetores virais que podem infetar células humanas in vivo, por exemplo, vetores adenovirais, retrovirais ou de vírus adeno-associados. Tais vetores podem ser úteis para a expressão de um membro de ligação a alvo da invenção nas células de um indivíduo humano ou animal, para proporcionar a produção e administração do membro de ligação a alvo ao dito indivíduo.

Uma sequência de ácido nucleico que codifica um membro de ligação a alvo da invenção, num aspeto, estará operativamente ligada a um promotor para efetuar a expressão do membro de ligação a alvo numa célula hospedeira. A sequência pode incluir em sua extremidade 5' uma sequência líder para facilitar a expressão e/ou secreção do membro de ligação a alvo em e/ou a partir de uma célula hospedeira. São conhecidas numerosas sequências líder adequadas como tais na técnica e podem ser selecionados por um perito na especialidade levando em consideração a célula hospedeira.

Sequências líder adequadas incluem qualquer sequência líder de imunoglobulina humana ou de outro mamífero, embora em seu lugar poderia ser utilizada uma sequência líder de mamífero de não imunoglobulina ou uma sequência líder sintética. Preferentemente para a expressão de uma cadeia de VH é utilizada uma sequência líder VH humana. Preferentemente para a expressão de uma cadeia de VL é utilizada uma sequência líder VL humana.

Uma sequência líder adequada para a expressão de um domínio VH da invenção é: MGSTAILGLLLAVLQGVCA (SEQ ID N°: 37).

Uma sequência líder adequada para a expressão de um domínio VL da invenção é uma sequência líder VK humana ou murina. Uma sequência tal pode ser a sequência líder de 2C3 : MRVPAQLLGLLLLWLPDTRC (SEQ ID N° : 38) ou um homólogo humano, tal como MDMRVPAQLLGLLLLWLPDTRC (SEQ ID N°: 39).

Nos exemplos anexos os presentes inventores utilizaram construções de expressão que incluem um local Hindlll e uma sequência de Kozak consenso (AAGCTTGCCGCCACC, SEQ ID N°: 41) que precede à sequência codificante que começa com uma sequência líder de anticorpo. Isto é adequado para a expressão de domínios de anticorpo em células hospedeiras de mamíferos. No entanto, podem ser utilizadas outras construções dependendo da preferência de quem realiza a experiência e da célula hospedeira em que será expresso o domínio de anticorpo.

Muitas técnicas e protocolos conhecidos de manipulação de ácidos nucleicos, por exemplo, na preparação de construções de ácido nucleico, mutagénese, sequenciamento, introdução de ADN em células e expressão génica, e análise de proteínas, são descritos com detalhe em Current

Protocols in Molecular Biology, segunda edição, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992. As divulgações de Sambrook et al. e Ausubel et al. são incorporados no presente documento por referência. Células hospedeiras e produção de membros de ligação a alvo

Um aspeto adicional proporciona uma célula hospedeira transformada com um ácido nucleico (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico em forma de um vetor) da invenção.

Numa forma de realização, o ácido nucleico da invenção se integra no genoma (por exemplo, cromossoma) da célula hospedeira. A integração pode ser promovida pela inclusão de sequências que promovem a recombinação com o genoma, de acordo com técnicas convencionais.

Outro aspeto adicional proporciona um método de produção de um membro de ligação a alvo da invenção, o método incluindo provocar a expressão do ácido nucleico codificante. Um tal método pode compreender cultivar células hospedeiras em condições para a produção do dito membro de ligação a alvo.

Após a produção por meio de expressão pode ser isolado e/ou purificado um domínio VH ou VL ou membros de ligação a alvo utilizando qualquer técnica adequada, utilizando então conforme for apropriado. Um método de produção pode compreender uma etapa de isolamento e/ou de purificação do produto.

Após a purificação do produto, o membro de ligação a alvo pode ser modificadas por meios físicos ou químicos, por exemplo, para introduzir grupos protetores que alterem, por exemplo, que aumentem, a estabilidade ou semivida biológica da proteína. Por exemplo, a PEGilação de proteínas para conseguir tais efeitos é conhecido como tal na técnica e os membros de ligação a alvo da invenção podem estar em forma PEGilada.

Um método de produção pode compreender formular o produto numa composição que inclui pelo menos um componente adicional, tal como um excipiente farmaceuticamente aceitável. A presente invenção também proporciona uma célula hospedeira recombinante que compreende um ou mais ácidos nucleicos ou vetores como anteriormente. Um ácido nucleico que codifica qualquer CDR, domínio VH ou VL ou membro de ligação a alvo como é proporcionada por si mesmo forma um aspeto da presente invenção igual que um método de produção do produto codificado, cujo método compreende a expressão a partir de ácido nucleico codificante para isto. São bem conhecidos sistemas para a clonagem e expressão de um polipéptido numa diversidade de células hospedeiras diferentes. Células hospedeiras adequadas incluem bactérias, células de mamífero, levedura e sistemas de baculovírus. As linhas de células de mamífero disponíveis na técnica para a expressão de um polipéptido heterólogo incluem células de ovário de hámster Chino, células HeLa, células de rim de hámster recém nascendo, células de melanoma de ratinho NSO, células de mieloma de rato YB2/0 e muitas outras. Um hospedeiro bacteriano preferido comum é E. coli. A expressão de anticorpos e fragmentos de anticorpo em células procariotas tais como E. coli está bem estabelecido na técnica. Para uma revisão veja-se, por exemplo, Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991) . A expressão em células eucariotas em cultura também está disponível para os peritos na especialidade como uma opção para a produção de um membro de ligação a alvo, vejam-se para revisões recentes, por exemplo, Ref, M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576; Trill J.J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560.

Composições

Assim, as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção e para utilização de acordo com a presente invenção podem compreender, além do princípio ativo, um excipiente, veículo, tampão, estabilizador farmaceuticamente aceitável ou outros materiais bem conhecidos pelos peritos na especialidade. Tais materiais devem ser não tóxicos e não devem interferir com a eficácia do princípio ativo. A natureza exata do veículo ou outro material dependerá da via de administração, que pode ser oral, ou por meio de injeção, por exemplo, intravenosa.

Podem ser preparados formulações terapêuticas do membro de ligação a alvo para armazenamento misturando o membro de ligação a alvo, que tem o grau desejado de pureza, com veículos, excipientes ou estabilizadores fisiologicamente aceitáveis opcionais (veja-se, por exemplo, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20a Edição, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins), em forma de pó liofilizado ou soluções aquosas. Veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não tóxicos para os recetores às doses e concentrações utilizadas e incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes que incluem ácido ascórbico; polipéptidos de baixa massa molecular (menos de aproximadamente 10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono que incluem glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; álcoois de açúcar tais como manitol ou sorbitol; contraiões formadores de sal tais como sódio; e/ou tensioativos não iónicos tais como Tween, Pluronics ou polietilenoglicol (PEG).

Para utilizar o membro de ligação a alvo para a administração in vivo este deve ser estéril. Isto consegue-se facilmente por filtração através de membranas de filtração estéreis, antes de ou após a liofilização e reconstituição. O membro de ligação a alvo normalmente será armazenado em forma liofilizada ou em solução.

As composições farmacêuticas para administração por via oral podem estar em forma de comprimido, cápsula, pó ou líquido. Um comprimido pode compreender um veículo sólido tal como gelatina ou um adjuvante. As composições farmacêuticas líquidas geralmente compreendem um veículo líquido tal como água, vaselina, óleos animais ou vegetais, óleo mineral ou óleo sintético. Podem ser incluídos solução salina fisiológica, dextrose ou outra solução de sacáridos ou glicois tais como etilenoglicol, polipropilenoglicol ou polietilenoglicol.

Para injeção intravenosa ou injeção no local de aflição, o princípio ativo estará em forma de uma solução aquosa parentericamente aceitável que está livre de pirogénios e tem pH, isotonicidade e estabilidade adequados. Os peritos na especialidade podem preparar soluções adequadas utilizando, por exemplo, veículos isotónicos tais como injeção de cloreto de sódio, injeção de solução de Ringer e injeção de Ringer com lactato. Podem ser incluído, conforme for necessário, conservantes, estabilizadores, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos.

Utilizações terapêuticas da invenção A presente invenção proporciona pela primeira vez uma demostração de que os anticorpos contra IL-25 são eficazes para prevenir ou reduzir a hipersensibilidade das vias respiratórias in vivo, um sintoma chave da asma. Assim, é revelado um método para prevenir ou reduzir a hipersensibilidade das vias respiratórias num indivíduo (por exemplo, um ser humano) em necessidade de tratamento que compreende administrar ao indivíduo um membro de ligação a alvo, particularmente uma molécula de anticorpo, que se liga a IL-25. Além disso, é revelado um método para prevenir, reduzir ou tratar asma num indivíduo em necessidade de tratamento que compreende administrar ao indivíduo um membro de ligação a alvo, particularmente uma molécula de anticorpo, que se liga a IL-25. A asma inclui asma alérgica.

Os métodos anteriores podem ser postos em prática com membros de ligação a alvo (incluindo composições dos mesmos) de acordo com a presente invenção, que são úteis para se ligar a e preferentemente antagonizar a ação de IL-25, com potencial terapêutico em diversas doenças e distúrbios em que IL-25 desempenha uma função. Além da asma, tais doenças incluem outras condições patológicas associadas à inflamação, tais como doença de Crohn e colite ulcerosa. Os métodos também podem ser postos em prática com outros membros de ligação a alvo (incluindo composições dos mesmos) que se ligam a IL-25 que podem ser obtidos como é descrito mais adiante nos exemplos anexos.

Os membros de ligação a alvo (incluindo composições dos mesmos) de acordo com a invenção podem ser utilizados num método de tratamento (incluindo tratamento profilático) ou diagnóstico num indivíduo humano ou animal. Um tal método de tratamento ou diagnóstico (que pode incluir tratamento profilático) pode compreender administrar ao dito indivíduo uma quantidade eficaz de um membro de ligação a alvo da invenção. Doenças e distúrbios exemplares são discutidos adicionalmente mais adiante.

Também é proporcionada a utilização de um membro de ligação a alvo (incluindo uma composição do mesmo) da invenção no fabrico de um medicamento para administração a um indivíduo humano ou animal.

As indicações clínicas em que pode ser utilizado um membro de ligação a alvo anti-IL25 para proporcionar beneficio terapêutico incluem qualquer condição patológica em que IL-25 tenha consequências patológicas. Assim, em geral, o membro de ligação a alvo da invenção pode ser utilizado no tratamento de qualquer condição patológica associada a uma resposta Th2 não desejada ou respostas de tipo 2. Por exemplo, o membro de ligação a alvo da invenção pode ser utilizado para o tratamento de alergia e asma, particularmente asma. 0 tratamento anti-IL-25 pode ser administrado por meio de injeção (por exemplo, intravenosamente) ou por meio de métodos de administração local. Anti-IL25 pode ser administrado por meio de tecnologias mediadas por genes. Estratégias de formulação alternativas podem proporcionar preparações adequadas para a via oral ou de supositório. A via de administração pode ser determinada pelas caracteristicas fisico-quimicas do tratamento, por meio de considerações especiais para a doença, para otimizar a eficácia ou para minimizar os efeitos secundários.

De acordo com a presente invenção, as composições proporcionadas podem ser administradas a indivíduos. A administração é preferentemente numa "quantidade terapeuticamente eficaz", sendo esta suficiente para mostrar benefício a um paciente. Tal benefício pode ser pelo menos a melhora de pelo menos um sintoma. A quantidade real administrada e a taxa e o transcurso de tempo de administração dependerão da natureza e gravidade do que esteja a ser tratado. A prescrição do tratamento, por exemplo, decisões sobre a dosagem, etc., está dentro da responsabilidade dos médicos generais e outros doutores em medicina. As doses apropriadas de anticorpo são bem conhecidas na técnica; vejam-se Ledermann J.A. et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664; Bagshawe K.D. et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922. A dose exata dependerá de vários fatores, incluindo se o anticorpo é para diagnóstico ou para tratamento, o tamanho e a localização do área que vai ser tratadas, a natureza exata do anticorpo (por exemplo, anticorpo completo, fragmento ou diacorpo) e a natureza de qualquer marcador detetável ou outra molécula ligada ao anticorpo.

Uma dose de anticorpo típica estará no intervalo 0,5 mg -1,0 g e esta pode ser administrada intravenosamente como um bolus ou como uma infusão ao longo de várias horas conforme for apropriado para conseguir a dose necessária. Outros modos de administração incluem infusão intravenosa durante várias horas, para conseguir uma dose acumulada total similar. Esta é uma dose para um único tratamento de um paciente adulto, que pode ser ajustada proporcionalmente para crianças e lactantes e também ser ajustada para outros formatos de anticorpo em proporção ao peso molecular. Os tratamentos podem ser repetidos diariamente, duas vezes por semana, semanalmente ou a intervalos mensais, de acordo com o critério do médico.

Um modo de administração adicional utiliza o revestimento prévio de, ou de outra maneira, a incorporação em, dispositivos permanentes, para os quais a quantidade ótima de anticorpo será determinada por meio de experiências apropriadas.

Em algumas formas de realização preferidas da invenção, uma molécula de anticorpo é um fragmento monomérico, tal como F(ab) ou scFv. Tais fragmentos de anticorpo podem ter a vantagem de uma semivida relativamente curta e menos risco de ativação plaquetária, a qual pode ser produzida pela agregação de recetor. A agregação que ocasiona a ativação plaquetária poderia ser tanto de moléculas IL-25 como de moléculas IL-25 com FcyRIl, por exemplo.

Se for utilizado um anticorpo completo, este está preferentemente numa forma que é incapaz de ativar e/ou destruir plaquetas. O isotipo lgG4 ou alternativamente os isotipos de "designer" derivados do esqueleto de lgGl (construções génicas de Fc novas do documento W099/58572, Clark, Armour, Williamson) são opções preferidas. Podem ser utilizados fragmentos de anticorpos mais pequenos, tais como F(ab')2. Adicionalmente, podem ser utilizados anticorpos completos ou fragmentos (por exemplo, F(ab')2 ou diacorpos) com doble especificidade epitópica (por exemplo, pelos epitopos reconhecidos por scFv 2C3) . Embora tal uma forma de realização possa promover a agregação de recetor, uma alta taxa de associação com respeito aos recetores individuais pode descartar este problema.

Os membros de ligação a alvo da presente invenção normalmente serão administrados em forma de uma composição farmacêutica, que pode compreender pelo menos um componente além do membro de ligação a alvo.

Um membro de ligação a alvo da invenção pode ser administrado só ou em combinação com outros tratamentos, tanto simultaneamente como sequencialmente dependendo da condição patológica que vai ser tratada. Outros tratamentos podem incluir a administração de dose adequadas de fármacos analgésicos tais como fármacos anti-inflamatórios não esteroides (por exemplo, aspirina, paracetamol, ibuprofeno ou ketoprofeno) ou opiáceos tais como morfina; a administração de antieméticos; ou a administração de pelo menos outro composto ativo contra a asma, geralmente um agente broncodilatador que produz relaxamento das vias respiratórias ou potência a eliminação de muco, por exemplo, um beta-agonista (por exemplo, salbutamol, salmeterol), cromoglicato dissódico, esteroides ou um inibidor de PDEIV. Métodos de ensaio A presente invenção proporciona um método que compreende provocar ou permitir a ligação de um membro de ligação a alvo como é proporcionada no presente documento a IL-25. Como foi indicado, tal ligação pode ocorrer in vivo, por exemplo, após a administração de um membro de ligação a alvo ou ácido nucleico que codifica um membro de ligação a alvo, ou pode ocorrer in vitro, por exemplo, em ELISA, transferência Western, imunocitoquimica, imunoprecipitação ou cromatografia de afinidade. A quantidade de ligação do membro de ligação a alvo a IL-25 pode ser determinada. A quantificação pode ser relacionada à quantidade do antigénio numa amostra de ensaio, que pode ser de interesse diagnóstico.

Podem ser determinadas as reatividades dos anticorpos numa amostra por meio de qualquer meio apropriado. 0 radioimunoensaio (RIA) é uma possibilidade. 0 antigénio radioativo marcado é misturado com antigénio não marcado (a mostra de teste) e se permite que se ligue ao anticorpo. 0 antigénio ligado é separado fisicamente do antigénio não ligado e determina-se a quantidade de antigénio radioativo ligado ao anticorpo. Quanto mais antigénio haja na mostra de teste, menos antigénio radioativo se ligará ao anticorpo. Também pode ser utilizado um ensaio de ligação competitiva com antigénio não radioativo, utilizando antigénio ou um análogo ligado a uma molécula indicadora. A molécula indicadora pode ser um fluorocromo, fósforo ou corante laser com caracteristicas de absorção ou emissão espectralmente isoladas. Fluorocromos adequados incluem fluoresceina, rodamina, ficoeritrina e vermelho de Texas. Os corantes cromogénicos adequados incluem diaminobencidina.

Outros indicadores incluem partículas coloidais macromoleculares ou material particulado tal como contas de látex que são agentes coloridos, magnéticos ou paramagnéticos, e biológica ou quimicamente ativos que podem provocar direta ou indiretamente sinais detetáveis que vão ser observados visualmente, ser detetados eletronicamente ou ser registados de outra maneira. Estas moléculas podem ser enzimas que catalisam reações que, por exemplo, desenvolvem ou mudam as cores ou provocam mudanças nas propriedades elétricas. Podem ser molecularmente excitáveis, de forma que as transições eletrónicas entre os estados de energia produzam absorções ou emissões espectrais caracteristicas. Podem incluir entidades químicas utilizadas juntamente com biossensores. Podem ser utilizados sistemas de deteção de biotina/avidina ou biotina/estreptavidina e de fosfatase alcalina.

Os sinais gerados por conjugados individuais de anticorpo-indicador podem ser utilizados para derivar dados absolutos ou relativos quantificáveis da ligação do anticorpo relevante em amostras (normais e de ensaio). A presente invenção também proporciona a utilização de um membro de ligação a alvo como anteriormente para medir os níveis de antigénio num ensaio de competição, isto é, um método para medir o nível de antigénio numa amostra utilizando um membro de ligação a alvo como é proporcionado pela presente invenção num ensaio de competição. Este pode ser onde não seja necessária a separação física de antigénio ligado do não ligado. Ligar uma molécula indicadora ao membro de ligação a alvo de forma que ocorra uma mudança física ou óptica à ligação é uma possibilidade. A molécula indicadora pode gerar direta ou indiretamente sinais detetáveis e preferentemente medíveis. A ligação de moléculas indicadoras pode ser direta ou indiretamente, covalentemente, por exemplo, através de uma ligação peptídico ou não covalentemente. A ligação por meio de uma ligação peptídica pode ser o resultado de expressão recombinante de uma fusão génica que codifica o anticorpo e a molécula indicadora. A presente invenção também proporciona a medição de níveis de antigénio diretamente, utilizando um membro de ligação a alvo de acordo com a invenção, por exemplo, num sistema biossensor. 0 modo para determinar a ligação não é uma caracteristica da presente invenção e os peritos na especialidade podem escolher um modo adequado de acordo com sua preferência e conhecimento geral.

Exemplos

Os aspetos e formas de realização da presente invenção serão ilustrados agora exemplares com referência aos seguintes experiências.

Exemplo comparativo:

Sequência primária de 2c3 A sequência da cadeia leve kappa excluindo sua sequência líder é mostrado na Figura 1 (SEQ ID N°: 15) e a sequência de aminoácidos dos alças de CDR, como são definidos por Rabat, são denominados LI (SEQ ID N°: 29), L2 (SEQ ID N° : 30) e L3 (SEQ ID N° : 31). As sequências LI, L2 e L3 foram as sequências dadoras para a humanização da cadeia leve de 2c3. A sequência da cadeia pesada (SEQ ID N° : 17) é mostrado na Figura 2 e de novo as CDR são identificadas como Hl (SEQ ID N°: 32), H2 (SEQ ID N°: 35) e H3 (SEQ ID N°: 33).

Análise de cadeias pesadas e leves de 2c3

Foi analisada uma base de dados de sequências de anticorpos humanos para identificar as sequências da região estrutural aceitadora para 2c3. A base de dados de sequências de anticorpos humanos compreende 9597 sequências da cadeia pesada e 2695 sequências da cadeia leve. As sequências aceitadoras adequadas foram identificadas preliminarmente com base em primeiro lugar na maior pontuação de VCI, em segundo lugar na pontuação de região estrutural (FR) e em terceiro lugar a pontuação de identidade. Finalmente, foi descartada qualquer sequência que não teve comprimentos de alça conservados para Hl, H2, LI e L2. Posteriormente, foram comprovadas as 20 primeiras sequências de anticorpos humanos para eliminar anticorpos humanizados, anticorpos com scFv fortemente mutados e anticorpos de ratinho. Também foram eliminadas aquelas sequências com resíduos de cisteina ou prolina em posições atípicas.

Análise do aceitador de cadeia pesada para 2c3

Foram identificadas as 20 primeiras sequências para a cadeia pesada de 2c3. Na Figura 3 é mostrado a sequência AY393094, com a pontuação de VCI superior (SEQ ID N°: 19), com unicamente 2 resíduos de VCI diferentes A67V e L691. Estas duas mudanças são conservativas. A análise do resíduo da sequência da região estrutural mostra que 59 dos 87 resíduos estão conservados. Os resíduos da superfície de separação encontrados em 2c3 e AY393094 são conservadas na cadeia pesada relacionada (AY510106) para a cadeia leve proposta pelos presentes inventores, AY510106. Em conjunto, a análise faz com que AY393094 (SEQ ID N°: 19) seja um bom candidato que pode requerer poucas retromutações de VCI.

No entanto, o comprimento da alça H3 de AY393094 é 17 em lugar dos 13 resíduos encontrados em 2c3, mas esta diferença no comprimento de H3 não é pouco comum durante as humanizações e se considera menos importante que conservar os resíduos de VCI.

Construção humanizada da cadeia pesada de 2c3 (RHA)

Na Figura 4 é mostrada a construção da cadeia pesada humanizada e foi denominada RHA (SEQ ID N°: 21). A sequência líder e a sequência da região estrutural são de AY393094 e as alças de Hl-3, como são definidos por Rabat são de 2c3. Na extremidade 5' foi adicionada uma sequência consenso de Kozak e um local de restrição Hindlll enquanto que na extremidade 3' foi adicionado um local de restrição Apal. Os locais de restrição são para ajudar aos vetores de expressão e a sequência consenso de Kozak tem por objetivo maximizar a expressão de proteínas. Os locais de glicosilação ligados a N têm o motivo NX(S/T), não encontrou-se nenhum na cadeia pesada humanizada. A qualidade do local de clivagem peptídico foi avaliada aplicando o programa Signal P à sequência de péptidos da extremidade amino de RHA. Os resultados confirmaram que a sequência líder de VH5a será clivada entre VCA (a extremidade C do péptido sinal) e EVR (a extremidade N de FR1) .

Análise da região estrutural da cadeia leve

Foram identificadas várias regiões estruturais da cadeia leve humana com as melhores pontuações de VCI e de região estrutural. No entanto, depois de considerar as três sequências de maior pontuação, todas foram descartadas. A primeira porque esta cadeia leve era de um anticorpo que tinha sido mostrado que se associava com a formação de fibrila amiloide, as duas seguintes já que as sequências não têm resíduos conservados nas posições 1 e 3. A experiencia de humanização prévia dos inventores os levou a acreditar que estes resíduos deveriam estar conservados.

As seguintes melhores sequências somente foram diferenciadas em dois resíduos de VCI V44P e Y71F, embora numa análise adicional observou-se que os candidatos com as maiores pontuações da região estrutural foram muito similares, mas tinham tanto desemparelhamentos L73F como I83F. A fenilalanina é uma mudança relativamente grande e parece estar conservada nestes dois tipos de cadeias leves. A análise adicional de regiões estruturais da cadeia leve similares a 2c3 encontrou um número significativo que tinha uma valina na posição 83 combinada com leucina na posição 73 e assim proporciona uma alternativa a aquelas regiões estruturais com uma Phe na posição 83. Em vista disto, os inventores selecionaram uma cadeia leve, AY510106, que é uma cadeia leve de V83 com os mesmos comprimentos de alça de CDR que 2c3. A sequência para AY510106 (SEQ ID N°: 23) é mostrada na Figura 5.

Construção humanizada da cadeia leve de 2c3 (RKA)

Na Figura 6 é mostrado a construção da cadeia leve kappa humanizada e foi denominada RKA (SEQ ID N° : 25) . A sequência líder e a sequência de região estrutural são de AY510106 e Ll-3 é de 2c3. Na extremidade 5' foi adicionada uma sequência de Kozak consenso e um local de restrição Hindlll enquanto que na extremidade 3' foi adicionada um local de restrição de BamHI e um local de splice. Os locais de restrição e os locais de splice são necessários para clonar e expressar a construção no vetor de expressão pKNIOO e a sequência consenso de Kozak tem por objeto maximizar a expressão de proteínas. Os locais de glicosilação ligados a N têm o motivo NX(S/T), nenhum encontrou-se na cadeia leve humanizada. A qualidade do local de clivagem peptídico foi avaliada aplicando o programa Signal P à sequência de péptidos da extremidade amino de RKA de 2c3. Os resultados confirmaram que a sequência líder VK1- A20 foi clivada entre os resíduos TRC (em a extremidade C do péptido de sinal) e Dl (em a extremidade N de FR1).

Comparação de RHA e RKA com 2c3 quimérico

Foram sintetizados os ADNc de RHA da cadeia pesada e RKA da cadeia leve kappa de 2c3 humanizados (GeneArt AG) e foram clonados no vetor de expressão de cadeia pesada de lgGl pGlD200 e o vetor de expressão de cadeia leve pKNIOO, respetivamente. Inicialmente, foram combinadas as construções de ADNc da cadeia pesada e leve de 2c3 quimérico e o anticorpo humanizado e foram utilizadas para transfetar transitoriamente células HEK293T. Os sobrenadantes das células transfetadas foram utilizados num ELISA para medir a ligação de anticorpo a IL-25. Os resultados (Figura 7(A)) indicaram que o anticorpo humanizado, que compreende a cadeia leve de 2c3 quimérico com a cadeia pesada humanizada, RHA, ligou-se significativamente menos a IL-25 que o anticorpo que compreende cadeias leves e pesadas de 2c3 quimérico. Ao contrário, observou-se a ligação equivalente a IL-25 para a cadeia leve humanizada, RKA, ou a cadeia leve de 2c3 quimérica associada à cadeia pesada 2c3 quimérica.

Numa tentativa de recuperar a ligação máxima para a cadeia pesada humanizada, os resíduos de VCI A67V e I69L foram substituídos por mutagénese. A ligação ao antigénio do mutante duplo RHA_A67V_I69L e RHA_I69L combinados com RKA de cadeia leve foi comparada com a do 2c3 quimérico.

Foram co-transfetadas células HEK 293T com as diversas cadeias pesadas mutagenizadas e RKA e o sobrenadante usado num ELISA de ligação a IL-25. Os resultados mostrados na Figura 7(B) mostram que a ligação de anticorpo máxima a IL-25 foi recuperada somente parcialmente por meio da substituição de tanto os resíduos A67V como I69L.

Foi realizada mutagénese adicional em RHA. Foram feitas substituições de aminoácidos R3Q, S82aL e foram utilizados os sobrenadantes de células HEK293T transitoriamente transfetadas num ELISA de ligação a IL-25. Os resultados na Figura 7(C) mostram que estas substituições tiveram pouco ou nenhum efeito em melhorar a ligação de anticorpo humanizado a IL-25.

Portanto, chegou-se à conclusão de que a humanização da cadeia leve foi satisfatória e não precisou modificação adicional enquanto que inclusive com modificação por engenharia genética adicional da cadeia pesada a humanização baseada na transferência das CDR numa cadeia pesada com resíduos de VCI aparentemente bem conservados não foi satisfatória.

Exemplo 1 - Projeto de anticorpo humanizado de alta afinidade A região estrutural AY393094 deixou de proporcionar um anticorpo humanizado satisfatório apesar da substituição de resíduos de vernier ou canónicos, dando regiões estruturais de anticorpo com uma alta prioridade de identidade de sequência acima da pontuação de VCI. Este método identificou uma classe diferente de regiões estruturais humanas. Destas, foi selecionada a que tinha a maior pontuação de VCI . Sua sequência líder era desconhecida de forma que foi utilizada a sequência líder de VH5a como substituição. A sequência do domínio VH humano selecionado, AJ399823 (SEQ ID N°: 27) é mostrada na Figura 8.

Suas CDR foram substituídas com aquelas de 2c3 e o segundo anticorpo humanizado foi denominada RH2. A sequência é mostrada como SEQ ID N° : 4. RH2 tem cinco resíduos de VCI não conservados: Ser 30; Met 48; Vai 67; Arg 71 e Thr 73 (numeração de Rabat) . Estes resíduos são denominados mais adiante b, c, d, e e f, respetivamente. A cadeia pesada humanizada que contém todas as substituições de VCI foi denominada RH2bcdef e foi testada juntamente com a RKA de cadeia leve. Os sobrenadantes de células HEK293T transitoriamente transfetadas foram utilizadas num ELISA de ligação a IL-25. Uma comparação entre RHA e RH2bcdef mostrou ligação melhorada a IL-25 em comparação com RHA, mas deixou de recuperar o 100 % de ligação mostrada pelo 2c3 quimérico. Portanto, chegou-se à conclusão de que era necessária uma abordagem alternativa à humanização simples de 2c3.

Exemplo 2 - Modificação de CDR de RH2bcdef

Encontrou-se que dois resíduos de CDR melhoravam a força do anticorpo humanizado. Foram introduzidas as mutações D31G e G96D em RH2bcdef e foram utilizadas para transfetar transitoriamente células HEK293T. Os sobrenadantes foram utilizados num ELISA de ligação a IL-25. Os resultados na Figura 9(A) mostram que a mutação D31G recupera a força de RH2bcdef até os níveis de 2c3. No entanto, a mutação G96D, Figura 9(B), aumenta a força de ligação a antigénio substancialmente mais allá da de 2c3.

Para testar se as duas mutações eram aditivas ambas foram incorporadas em RH2bcdef. Foram utilizados sobrenadantes de células HEK293T transitoriamente transfetadas num ELISA de ligação a IL-25. Os resultados mostrados na Figura 10 sugerem que existe um pequeno aumento, mas significativo, na força de humanização incorporando ambas as mutações de CDR.

Os dados dos presentes inventores também indicam que além disso de Gly ou Asp, a posição 31 também poderia ser selecionada de Ala, Ser, Vai, Asn, Lys, Tyr ou Met para manter propriedades de ligação similares à do anticorpo.

Exemplo 3 - Modificações do resíduo 96 (Kabat)

Coma finalidade de entender melhor quais aminoácidos podem ser tolerados no resíduo 96, a glicina foi substituída por mutagénese por seleção representativa de aminoácidos. Foram feitas as seguintes mutações a RH2bcdef: G96Y, G96N, G96S, G96L, G96K e G96E. As construções de expressão foram co-transfetadas com RKA em células HEK293T e os sobrenadantes foram utilizadas num ELISA de ligação a IL-25. Os resultados mostraram que unicamente a substituição do aspartato na posição 96 por asparagina foi de força equivalente, todos os outros resíduos testados nesta posição tiveram um efeito prejudicial sobre a ligação a IL-25. Surpreendentemente, um efeito prejudicial sobre a força também incluiu a substituição por glutamato que é um resíduo negativamente carregado, similar ao aspartato. Pode chegar à conclusão de que a carga negativa não é a contribuição principal que o aspartato realiza para o aumento da força.

Por conseguinte, o resíduo 96 (Kabat) num domínio VH da invenção pode ser aspartato ou asparagina.

Exemplo 4 - Determinação do requerimento mínimo de resíduos VCI de ratinho para RH2

Com a finalidade de minimizar o possível impacto imunogénico sobre o anticorpo humanizado é desejável minimizar o número de substituições da região estrutural de aminoácidos murinos. A cadeia pesada humanizada RH2bcdef_G96D foi denominada RH2.1 e tinha cinco substituições de VCI de 2c3. Inicialmente foram eliminadas quatro para identificar quais resíduos contribuíam à força.

As mutações c, d, e e f foram substituídas com o resíduo da região estrutural humana endógeno como mutações únicas. As células HEK 293T foram co-transfetadas com as mutações de VCI e RKA e os sobrenadantes foram testados num ELISA de ligação a IL-25. Surpreendentemente, encontrou-se que a reintrodução dos resíduos humanos V67 ou T73 tinha uma leve melhora da força que era inesperada. A mudança de Met em 48 a lie murina não teve nenhum efeito significativo.

No entanto, pareceu que a presença do resíduo de arginina humano na posição 71 tinha um efeito prejudicial na ligação a IL-25. Portanto, a conclusão foi que unicamente o resíduo de VCI murino Vai 71 era muito desejável no anticorpo humanizado. Os outros resíduos podem ser tanto de ratinho como humanos.

Com a finalidade de identificar uma cadeia pesada humanizada final ótima foi sintetizada uma nova versão da cadeia pesada denominada RH2.5 (SEQ ID N° : 4) que não continha resíduos de VCI murinos. Adicionalmente, foram feitas duas versões modificadas de RH2.5 com tanto as mutações de VCI S30T (SEQ ID N° : 3) como R71V (SEQ ID N° : 2) . A ligação destes três anticorpos humanizados novos a IL-25 foi analisada por ELISA. Os resultados são mostrados na Figura 11. Encontrou-se que em comparação com RH2.5, a adição de S30T ou R71V melhorou igualmente a ligação a IL-25 humana.

Portanto, em algumas formas de realização da invenção, as posições 30 e 71 da cadeia pesada podem estar modificadas, por separado ou em combinação, de S a T e R a V, respetivamente.

Exemplo 5 - Termoestabilidade do anticorpo

Foi determinada a termoestabilidade de RH2.5_S30T (SEQ ID N° : 3) e RH2.5_R71V (SEQ ID N°: 2) . Os anticorpos foram mantidos a diversas temperaturas durante 10 minutos, depois foram arrefecidos rapidamente até temperatura ambiente e foi medida sua capacidade para se ligar a IL-25 por ELISA. Encontrou-se que o anticorpo quimérico 2c3 (controlo) retém maior termoestabilidade e é ativo até temperaturas de 75 °C. RH2.5_R71V permaneceu ativo até 65 °C e RH2.5_S30T foi ativo até 60 °C.

Exemplo 6 - Bioensaio de linfócitos não B/não T dos anticorpos humanizados

Existem alguns bioensaios in vitro disponíveis para medir a atividade de IL-25. Um poderoso ensaio é medir a libertação de IL-13 de linfócitos não B/não T (NB/NT) isolados dos gânglios linfáticos mesentéricos de ratinhos. Neste ensaio, foram incubadas células com IL-25 e concentrações variáveis de anticorpo e foi medida IL-13 três dias depois da estimulação. Os resultados mostraram que o anticorpo 2c3 murino inibiu unicamente parcialmente a produção de IL-13. Ao contrário, RH2.5_R71V e S30T cortam ambos a produção de IL-13 e RH2.5 reduziu significativamente a produção de IL-13. De forma interessante, tanto RH2.5_R71V como RH2.5_S30T ainda mostraram inibição completa da produção de IL-13 a concentrações tão baixas como 0,25 pg/ml, mas podem ser encontrados alguns níveis pequenos de produção de citocinas para RH2.5 nesta concentração. Estes dados coincidem com a ideia de que o anticorpo humanizado é mais forte que o anticorpo quimérico 2c3 e que as mutações R71V e S30T têm uma força de ligação a antigénio melhorada.

Exemplo 7 - RH2.5-R71V inibe a hipersensibilidade das vias respiratórias

Em experiências adicionais, foi testado o anticorpo humanizado RH2.5_R71V num modelo de ratinho de hipersensibilidade aguda das vias respiratórias (HVR). O protocolo experimental se resume na Figura 12. Os ratinhos foram sensibilizados inicialmente a albumina de ovo, depois foram expostos em presença dos anticorpos anti-IL-25. Os resultados na Figura 13(A) mostram que a resposta de HVR foi bloqueada por meio da adição de uma dose de 500 pg de 2c3 por ratinho, mas não foi bloqueada quando a dose se reduziu a uma dose de 50 pg por ratinho. Ao contrário, HVR foi bloqueada utilizando unicamente uma dose de 50 pg (2,5 mg/Kg) do anticorpo humanizado RH2.5_R71V como é mostrado na Figura 13 (B) . Estes dados apoiam adicionalmente o ponto de vista de que o anticorpo humanizado é significativamente mais forte que o anticorpo 2c3.

Exemplo 8 - Tratamento de colite

Para sensibilizar previamente ratinhos BALB/c fêmea (10 por grupo) foi raspado um campo da pele abdominal e foram aplicados 150 μΐ de uma solução a 3 % (p/v) de oxazolona em etanol a 100 %. Os ratinhos de controlo foram sensibilizados previamente por meio da aplicação de 150 μΐ de etanol a 100 %. 7 dias depois da sensibilização prévia, os ratinhos foram expostos novamente por via intrarretal a 150 μΐ de oxazolona a 3 % em etanol a 50 % ou unicamente etanol a 50 % (controlo), com anestesia com isoflurano.

Para garantir a distribuição da oxazolona dentro de todo o colon e o ceco, os ratinhos forma mantidos numa posição vertical durante 1 minuto depois da injeção. Foi administrado um anticorpo que é uma quimera da sequência de 2C3 de ratinho num esqueleto de IgGl humana (100 pg/dose) por via intraperitoneal (i.p.) tanto no dia antes da sensibilização prévia como no dia antes da administração intrarretal (i.r.) de oxazolona. Os ratinhos de controlo receberam IgG4 humana de isotipo de controlo (100 pg/dose). Todas as experiências com animais explicados resumidamente aqui foram realizadas com a aprovação do Departamento de Interior do RU.

Foi medida o comprimento do colon em grupos de ratinhos após três administrações diárias de tanto etanol a 50 % mais controlo de isotipo IgG4 i.p. (EtOH a 50 % IgG4); etanol a 50 % i.r. mais anti-IL-25 i.p. (EtOH a 50 % anti-IL-25) ; etanol a 50 % com oxazolona a 3 % i.r. mais controlo de isotipo IgGl i.p. (oxazolona a 3 % IgG4) e etanol ao 50% com oxazolona ao 3% i.r. mais anti-IL-25 i.p. (oxazolona a 3 % anti-IL-25).

Após o tratamento, foram medidos os pesos dos animais como anteriormente. A Figura 14A mostra que a administração de oxazolona induz uma redução no comprimento do colon como um indicador de colite. Os animais tratados com oxazolona e anticorpo anti-IL-25 derivado de 2C3 mostram uma tendência para colones mais largos (um pronóstico melhorado) com relação aos animais tratados com oxazolona e isotipo de IgG4. 0 tratamento com oxazolona também induz a perda de peso em comparação com o controlo somente com veiculo (Figura 14B). Os animais tratados com oxazolona e anti-IL-25 também perdem peso embora mostrem uma tendência a voltar a ganhar peso mais rapidamente que o grupo tratado com oxazolona-isotipo IgG4 o dia 3.

Materiais e métodos Abreviaturas HVR Hipersensibilidade das vias respiratórias °C Graus centígrados pb Pares de bases DMEM Meio de Eagle modificado por Dulbecco DMSO Sulfóxido de dimetilo ADN Ácido desoxirribonucleico ELISA análise imunoenzimática de adsorção FCS Soro fetal de bezerro FR Região estrutural g Gramas HEK293T Células de rim embrionário humano que expressam o antigénio T grande do SV40 células HEK 293T) h Hora HRP Peroxidase de rábano picante

IgG Imunoglobulina mAb Anticorpo monoclonal min Minuto NB/NT Linfócitos não B/não T isolados de gânglios linfáticos mesentéricos de ratinho NI MR Instituto Nacional de Investigação Médica (RU) nm Nanómetro DO Densidade óptica PBS Solução salina tamponada com fosfato PCR Reação em cadeia da polimerase RH Cadeia pesada recombinante RK Cadeia kappa recombinante TA Temperatura ambiente s Segundo UV Ultravioleta VH Região variável da cadeia pesada de imunoglobulina VL Região variável da cadeia leve de imunoglobulina VK Região variável da cadeia leve kappa de imunoglobulina

Reagentes de imunologia e biologia molecular

Clonagem de genes variáveis de anticorpos quiméricos e humanizados

Foram sintetizados os ADNc da região variável da cadeia pesada e leve do 2c3 e os ADNc da região variável dos anticorpos humanizados (GeneArt AG) . As regiões V da cadeia pesada foram clonadas em pGlD200 por meio dos locais de restrição enzimáticos Hindlll e Apal. Similarmente, as regiões V da cadeia leve foram clonadas em pKNlOO por meio dos locais Hindlll e BamHI. Foi preparado o vetor pGlD200 para ligação digerindo 5 pg de ADN com 20 unidades de Hindlll e Apal em tampão de digestão de restrição multicore (Promega) durante 2 h a 37 °C. Posteriormente, foi adicionada 1 unidade de fosfatase alcalina antártica (NEB) ao ADN e foi incubado entre 15 e 30 minutos seguindo as

instruções do fabricante. A seguir, a preparação do vetor foi purificada numa coluna Qiaquick (Qiagen) seguindo as instruções do fabricante. 0 vetor foi eluido em 50 μΐ. Similarmente, foi preparado o vetor pKNlOO digerindo 5 pg de ADN com 2 0 unidades de Hindlll e BamHI em tampão E

(Promega) durante 1 hora a 37 °C. O ADN foi tratado com fosfatase alcalina antártica e foi purificado como foi descrito anteriormente. Os ADN de inserto de região V (aproximadamente 4 pg) foram digeridos como foi descrito anteriormente e os fragmentos de cadeia pesada e leve foram purificados do vetor por meio de eletroforese em gel. A banda apropriada foi clivada do gel e foi purificada numa coluna Qiaquick (Qiagen) e foi eluido em 50 pl seguindo as instruções do fabricante. Foram levadas a cabo ligações misturando 1 pl de vetor com tanto 1 pl como 3 pl de ADN de

inserto em tampão de ligase Quick lx (NEB) e 1 pl de NEB

Quick Ligase e foi incubado durante 10 minutos a temperatura ambiente (20 °C) . A reação foi utilizada para transformar 50 pl de 100 células competentes (NEB) . As construções do vetor se confirmaram por meio de sequenciamento de ADN e foram levados a cabo por GATC Biotech Ltd (Cambridge). Síntese de genes variáveis e mutagénese dirigida ao local

Foram sintetizados genes variáveis foram sintetizados por GeneArt AG (Regensburg, Alemanha)

Foi realizada mutagénese dirigida ao local utilizando o kit de mutagénese dirigida ao local QuickChange® II XL (Stratagene) seguindo as instruções do fabricante. Excetuando as mutações de RHA, R3Q e L82aS, em que foi utilizada o método do kit de mutagénese dirigida ao local (NEB) Phusion™, foram seguidas as instruções do fabricante. ELISA de IgGl

Foram revestidas placas Maxisorp com 0,4 pg/ml de anticorpo anti-IgG humana de cabra e foram guardadas a 4 °C durante não mais de 1 mês. Antes de utilização, as placas foram lavadas três vezes com PBS/Tween 20 a 0,02 % (v/v), depois foram bloqueadas em PBS/Tween 20 a 0,02 % (v/v)/BSA ao 0,2 % (p/v). As placas foram lavadas como anteriormente e foi adicionado sobrenadante de amostra sobre um intervalo de concentração utilizando diluições duplas e foi incubado a 37 °C durante 1 h. As placas foram lavadas como anteriormente e foram incubadas com conjugado de anti-cadeia leve kappa humana de cabra - peroxidase (Sigma) a uma diluição 1:5000. As placas foram lavadas, como anteriormente, depois foram adicionados 150 μΐ de substrato K Blue One-Step (Neogen). Depois de 10 minutos, a reação foi detida com 50 μΐ de solução Red Stop (Neogen) e foi medida a densidade óptica a 655 nm.

Ensaios de ligação a citocina

Foram revestidas placas Maxisorp foram revestidas com 0,25 pg/ml de IL-25 humana (R&D Systems) em tampão de carbonato-bicarbonato (Sigma) e foram guardadas a 4 °C durante não mais de 1 mês. Antes de utilização, as placas foram lavadas três vezes com PBS/Tween 20 a 0,02 % (v/v), depois foram bloqueadas em PBS/Tween 20 a 0,02 % (v/v)/BSA a 0,5 % (p/v). As placas foram lavadas como anteriormente e foi adicionado sobrenadante de amostra sobre um intervalo de concentração utilizando diluições duplas e foi incubado a 37 °C durante 1 h. As placas foram lavadas como anteriormente e foram incubadas com conjugado de anti-cadeia leve kappa humana de cabra - peroxidase (Sigma) a uma diluição de 1:5000. As placas foram lavadas, como anteriormente, depois foram adicionados 150 μΐ de substrato K Blue One-Step (Neogen). Depois de 10 minutos, a reação foi detida com 50 μΐ de solução Red Stop (Neogen) e foi medida a densidade óptica a 650 nm.

Ratinhos

Foram obtidos ratinhos BALB/c de Harlan UK (Bicester, RU) e foram mantidos nas instalações de Small Animal Barrier Unit and Central Biomedical Services LMB,

Cambridge, em ambientes sem agentes patogénicos específicos. Todas as experiências com animais expostas brevemente neste informe foram realizadas com a aprovação do Departamento de Interior do RU.

Ensaios de linfócitos não B não T

Foram purificados células não B/não T (NBNT) do gânglio linfático mesentérico e foram incubadas durante 72 horas com ou sem 10 ng/ml de rmlL-25 e com isotipo IgGl de ratinho (anti-c-myc) ou 2c3 anti-mIL-25 a concentrações variáveis de tanto controlo de isotipo IgGl humana (anti-malária), anti-hlL-25 RH2.5 R71V, anti-hlL-25 RH2.5 S30T ou anti-hlL-25 RH2.5. A produção de IL-13 foi avaliado a partir do sobrenadante celular, que foi reunido de dois poços duplicados, por meio de ELISA. Foi realizada ELISA de IL-13 utilizando o kit Quantikine Murine IL-13 (R&D Systems).

Projeto experimental do modelo agudo de hipersensibilidade das vias respiratórias (HVR)

Foram sensibilizados ratinhos BALB/c (6-12 semanas) por administração intraperitoneal de albumina de ovo em PBS (20 pg/injeção) complexada com alúmen ou PBS e alúmen unicamente (controlos), os dias 0 e 12. A administração em aerossol de albumina de ovo a 1 % foi realizada os dias 19, 20 e 21 durante 20 minutos ao dia. Os animais de controlo receberam PBS. Duas horas antes de cada exposição pulmonar, os ratinhos também receberam uma administração intraperitoneal de 2c3, controlo de IgGl de ratinho, ou controlo de isotipo IgGl humano (anti-malária) ou anti-hlL-25 RH2.5 R71V. O dia 22, os animais foram analisados utilizando pletismografia restringida para avaliar a albumina de ovo de HVR e os anticorpos foram testados para endotoxina e encontrou-se que era inferior a 0,1 UE/ml, exceto para RH2.5_R71V que era de 1,2 UE/ml.

Medição de HVR

Os animais foram anestesiados, foi realizada a traqueostomia e foram colocados num respirador (respirador Minivent 845, EMMS, RU) a uma velocidade de aproximadamente 150 respirações/min, com um volume corrente de 0,15 ml. Os ratinhos foram monitorizados numa pletismografia restringida de corpo inteiro (EMMS Hants, RU) e foi avaliada a pressão transpulmonar através de um transductor em linha. Depois de registrar a resistência pulmonar de linha basal estável, foram administradas concentrações crescentes de cloreto de acetil-p-metilcolina (metacolina; Sigma, Dorset, Reino Unido) por meio de aerossol durante 10 segundos com um nebulizador ultrassónico e foi resgistada a resistência pulmonar durante um período de 3 minutos. Foi utilizado o programa informático EDaq (EMMS Hants, RU) para analisar a resistência das vias respiratórias, a aderência e os parâmetros pulmonares convencionais.

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Sequências : SEQ ID N°: 1 - Domínio VH humanizado (artificial)

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser

Phe Xal Xa2 Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly

Gin Arg Leu Glu Trp Xa3 Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly

Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu

Thr Xa4 Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn

Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

Glu Xa5 Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser em que:

Xal é Ser ou Thr;

Xa2 é Gly, Asp, Ala, Ser, Val, Asn, Lys, Tyr ou Met;

Xa3 é Met ou lie;

Xa4 é Val ou Arg; e Xa5 é Asp, Asn ou Gly.

SEQ ID N° : 2 - Domínio VH humanizado RH2.5_S30T (artificial)

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro GlyAla Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Gly Tyr Thr Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly

Gin Arg Leu Glu Trp Met Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly

Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe Lys Gly Arg Vai Thr Leu

Thr Vai Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn

Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg

Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp

Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser

SEQ ID N° : 3 - Domínio VH humanizado RH2.5_R71V (artificial)

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro

Gly Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser

Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly

Gin Arg Leu Glu Trp Met Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly

Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe Lys Gly Arg Vai Thr Leu

Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn

Ser Leu Arg Glu Asp Thr Gly Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu

Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly

Gin Gly Thr Leu Vai Vai Ser Ser SEQ ID N°: 4 - Domínio VH humanizado RH2 (artificial)

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro

Gly Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser

Phe Ser Gly Tyr Thr Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly

Gin Arg Leu Glu Trp Met Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly

Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe Lys Gly Arg Vai Thr Leu

Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn

Ser Léu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg

Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp

Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser SEQ ID N°: 5 - Domínio VH humanizado (artificial)

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser

Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly

Gin Arg Leu Glu Trp Met Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly

Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu

Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn

Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp

Gly Gin Gly Thr Leu val Thr Val Ser Ser SEQ ID N°: 6 - Domínio VH humanizado (artificial)

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser

Phe Ser Asp Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly

Gin Arg Leu Glu Trp Met Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly

Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu

Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn

Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser SEQ ID N°: 7 - Domínio VH humanizado (artificial)

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser

Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly

Gin Arg Leu Glu Trp Met Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly

Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu

Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn

Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser SEQ ID N°: 8 - Domínio VH humanizado (artificial)

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser

Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly

Gin Arg Leu Glu Trp Met Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly

Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu

Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn

Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser SEQ ID N°: 9 - Domínio VH humanizado (artificial)

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser

Phe Ser Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly

Gin Arg Leu Glu Trp lie Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly

Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu

Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn

Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser SEQ ID N°: 10 - Domínio VH humanizado (artificial)

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser

Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly

Gin Arg Leu Glu Trp lie Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly

Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu

Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn

Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser SEQ ID N°: 11 - Domínio VH humanizado (artificial)

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser

Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly

Gin Arg Leu Glu Trp lie Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly

Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu

Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn

Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser SEQ ID N°: 12 - Domínio VH humanizado (artificial)

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser

Phe Ser Asp Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly

Gin Arg Leu Glu Trp lie Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly

Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu

Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn

Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser SEQ ID N°: 13 - Domínio VH humanizado (artificial)

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser

Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly

Gin Arg Leu Glu Trp lie Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly

Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu

Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn

Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser SEQ ID N°: 14 - Domínio VH humanizado (artificial)

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser

Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly

Gin Arg Leu Glu Trp lie Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly

Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu

Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn

Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser SEQ ID N°: 15 - Domínio VK de 2c3 (murino)

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKADGTVELLIYYTSS

LHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEI

K SEQ ID N°: 16 - Ácido nucleico que codifica o domínio VK de 2c3

GACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCG

ACCGGGTGACCATCAGCTGCAGCGCCTCCCAGGGCATCAGCAACTACCT

GAACTGGTATCAGCAGAAGGCCGACGGCACCGTCGAGCTGCTGATGTAC

TACACCAGCAGCCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTTAGCGGCAGCG

GCTCCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCTCCAACCTGGAACCCGAGGA

TAT CGCC ACCT ACT ACTGCC AGC AGTAC AGC AAGCTGCCCTAC ACCTTTG

GCGGCGGAACAAAGCTGGAAATCAAG SEQ ID N° : 17 - Domínio VH de 2c3 com sequência líder (murina)

MVLSLLYLLTALPGILSEVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTDYTMN

WVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTSYNQNFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSL

TSEDSAVYYCAREGYDGYLYFAMDYWGQGTSVTVSS SEQ ID N°: 18 - Ácido nucleico que codifica o domínio VH de 2c3

ATGGTGCTGTCCCTGCTGTACCTGCTGACCGCCCTGCCCGGCATCCTGAG

CGAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCTGAGCTGGTGAAGCCTGGCGCC

AGCATGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGCTTCACCGACTACA

CCATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCACGGCAAGAACCTGGAATGGATCG

GCCTGATCAACCCCTACAACGGCGGCACCAGCTACAACCAGAACTTCAA

GGGCAAGGCCACCCTGACCGTGGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATG

G AACTGCTGTCTCTGACC AGCGAGG AC AGCGCCGTGT ACT ACTGCGCC A G AG AGGGCTACG ACGGCT ACCT GTACTTCGCC ATGG ACTACT GGGGCC A

GGGCACCAGCGTGACCGTGAGCAGC SEQ ID N°: 19 - Domínio VH AY393094 (humano)

LLLAVLQGVCAEVRLVQSGAEVKKPGESLKISCKASGYSFTSNWIGWVRQM

PGKGLEWIGIIFPGDSDTIYSPSFQGQVT1SVDKSINTAYLQWSSLKATDTAM

YYCARQNPPEYSGAYHDGWFDPWGQGTLVIVSS SEQ ID N°: 20 - Ácido nucleico que codifica o domínio VH de AY393094

CTCCTCCTGGCTGTTCTCCAAGGAGTCTGTGCCGAGGTGCGCCTTGTGCA

GTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCGGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGT

AAGGCTTCTGGATACAGTTTTACCAGTAACTGGATCGGCTGGGTGCGCC

AGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATTGGGATCATCTTTCCTGGTGA

CTCTGATACCATATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATTTCAG

TCGACAAGTCCATCAATACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGC

CACGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGACAGAACCCCCCCGAGTAT

AGTGGCGCATATCATGATGGGTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCC

TGGTCATCGTCTCCTCA SEQ ID N°: 21 - Domínio VH de RHA (artificial)

MGSTAILGLLLAVLQGVCAEVRLVQSGAEVKKPGESLKISCKASGYSFTDYT

MNWVRQMPGKGLEWIGLINPYNGGTSYNQNFKGQVTISVDKSINTAYLQW

SSLKATDTAMYYCAREGYDGYLYFAMDYWGQGTLVIVSS SEQ ID N°: 22 - Ácido nucleico que codifica o domínio VH de RHA (artificial)

ATGGGGTCAACCGCCATCCTTGGCCTCCTCCTGGCTGTTCTCCAAGGAGT

CTGTGCCGAAGTGCGCCTTGTGCAGTCTGGAGCAGAAGTGAAAAAGCCG

GGGGAGTCTCTGAAGATCTCTTGCAAGGCTTCTGGATACAGTTTTACCGA

CTACACCATGAACTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGG

ATTGGGCTTATTAATCCTTACAATGGTGGTACTAGCTACAACCAGAATTT

CAAGGGCCAAGTCACCATTTCAGTCGACAAGTCCATCAATACCGCCTAC

CTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCACGGACACCGCCATGTATTACTGTG

CGAGAGAGGGCTATGATGGTTACCTTTACTTTGCTATGGACTACTGGGGC

CAGGGAACCCTGGTCATCGTCTCCTCAG SEQ ID N°: 23 - Domínio VK de AY510106 (humano)

MRVPAQLLGLLLLWLPDTRCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNY

LAWYQQKPGKVPKLLIYAASTLQSGVPSRPSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVAT

YYCQKYNSAPYTFGQGTKLEIK SEQ ID N° : 24 - Ácido nucleico que codifica domínio VK de AY510106

ATGAGGGTCCCTGCTCAGCTCCTGGGACTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGA

TACCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCAT

CTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCGAGTCAGGGCATTAG

C AATTATTT AGCCTGGT ATC AGC AGAA ACC AGGG AAAGTT CCTAAACTC

CTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAATCAGGGGTCCCATCTCGGTTCAG

CGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAG

CCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAAAAGTATAACAGTGCCCCGTA

CACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA

SEQ ID N°: 25 - Domínio VK de 2c3 humanizado RKA (artificial)

MRVPAQLLGLLLLWLPDTRCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNY LNWYQQKPGKVPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVAT Y Y CQQ Y SKLP YTF GQGTKLEIK SEQ ID N°: 26 - Ácido nucleico que codifica o domínio VK de

2c3 humanizado RKA

ATGAGGGTCCCTGCTCAGCTCCTGGGACTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGA

TACCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCAT

CTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAGTGCATCCCAGGGCATTAG

C AATT ATCTG AATTGGT ATC AGC AG AA ACCAGGGAAAGTTCCT AAACT C

CTGATCTATTACACATCAAGTTTACACTCAGGGGTCCCATCTCGGTTCAG

CGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAG

CCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAGCAGTATAGCAAGCTGCCGTA

CACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA SEQ ID N°: 27 - Domínio VH de AJ399823 (humano)

EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFSSYGIHWVRQAPGQRLEWMG

WINGGTGFTKYSQNFQGRVTLTRDTSASTAYLELNSLRSEDTGVYYCARDP

YNNYAAELDYWGQGTLVTVSS SEQ ID N°: 28 - Ácido nucleico que codifica o domínio VH de AJ399823 (humano)

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCT CAGTGAAAGTTTCGTGCAAGGCTTCTGGATACTCCTTCAGTAGTTATGGT ATACATTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGACAAAGGCTTGAGTGGATGGGAT GG ATC AACGGT GGC ACTGGTTTTAC AAA AT ATTC AC AG AATTTT C AGGG C AG AGTC ACCCT AACCAGGGACACTTCCGCGAGCACAGCCT ACTTGG AA CTGAACAGCCTGAGATCTGAAGACACGGGTGTATATTACTGTGCGAGGG ATCCCTACAATAACTACGCGGCGGAACTTGACTACTGGGGCCAGGGAAC CCTGGTCACCGTCTCCTCA SEQ ID N°: 29 - CDR1 da cadeia leve (murina)

SASQGISNYLN SEQ ID N°: 30 - CDR2 da cadeia leve (murina)

YTSSLHS SEQ ID N°: 31 - CDR3 da cadeia leve (murina)

QQYSKLPYT SEQ ID N°: 32 - CDR1 da cadeia pesada (murina)

DYTMN SEQ ID N°: 33 - CDR3 da cadeia pesada (murina)

EGYDGYLYFAMDY SEQ ID N°: 34 - CDR1 da cadeia pesada (artificial)

GYTMN

SEQ ID N°: 35 - CDR2 da cadeia pesada (murina) LINPYNGGTSYNQNFKG

SEQ ID N°: 36 - CDR3 da cadeia pesada (artificial) EDYDGYLYFAMDY

SEQ ID N°: 37 Sequência lider do domínio VH: MGSTAILGLLLAVLQGVCA

SEQ ID N°: 38 - Sequência lider do domínio VK de 2C3: MRVPAQLLGLLLLWLPDTRC

SEQ ID N°: 39 - Sequência lider de VL humano: MDMRVPAQLLGLLLLWLPDTRC

SEQ ID N° : 40 - Ácido nucleico que codifica RH2.5 R71 V (artificial)

ATGGGCAGCACAGCCATTCTGGGCCTGCTGCTGGCCGTGCTGCAGGGCG

TGTGCGCCGAGGTGCAGCTGGTCGAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGC

CAGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGCTTCTC

CGGCTACACCATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGAGGCTGGAA TP.n a ΤΑΛΛηητη a to a λ oooot a oa a ooooooo a on a oot a /“i a a on aoa i vjvjoi. 1 vjvj vj\_/i ua ι ι i Λ^ΛΛυυηυΛ

ACTTCAAGGGCAGGGTGACACTGACCGTGGATACCAGCGCCAGCACCGC

CTACCTGGAACTGAACAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGGCGTGTACTAC

TGCGCCAGAGAGGACTACGACGGCTACCTGTACTTCGCCATGGACTACT

GGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC SEQ ID N°: 41 - Sequência consenso de Kozak (artificial)

AAGCTTGCCGCCACC

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Medical Research Council Matthews, David Barlow, Jillian McKenzie, Andrew <120> Anticorpos Contra IL-25 <130> 4433.1001002 <150> US 61/101.293 <151> 30-09-2008 <150> GB 0817891.5 <151> 30-09-2008 <160> 41 <170> Patentln versão 3.3

<210> 1 <211> 122 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência sintética: Domínio VH Humanizado <22 0> <221> VARIANTE <222> (30) . . (30) <223> Xaa é Ser ou Thr <22 0> <221> VARIANTE <222> (31) . . (31) <223> Xaa é Gly, Asp, Ala, Ser, Vai, Asn, Lys, Tyr ou Met <22 0> <221> VARIANTE <222> (48) . . (48) <223> Xaa é Met ou Ile <22 0> <221> VARIANTE <222> (72) . . (72) <223> Xaa é Vai ou Arg <22 0> <221> VARIANTE <222> (100) .. (100) <223> Xaa é Asp, Asn ou Gly <4 0 0> 1

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Vai Lya Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Xaa Xaa Tyr 20 25 30

Thr Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Xaa 35 40 45

Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Vai Thr Leu Thr Xaa Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Xaa Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>

<223> Sequência sintética: Domínio VH Humanizado RH2.5_S30T <400> 2

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30

Thr Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe 50 55 . 50

Lys Gly Arg Vai Thr Leu Thr Vai Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 β0

Leú Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>

<223> Sequência sintética: Domínio VH Humanizado RH2.5_R7IV <400> 3

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30

Thr Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Vai Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Glu Asp Thr Gly Vai Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Vai Ser Ser 115 120

<210> 4 <211> 122 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência sintética: Domínio VH Humanizado RH2 <400> 4

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30

Thr Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Vai Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 ' 70 75 80

Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 5 <211> 122 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência sintética: Domínio VH Humanizado <400> 5

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 IS

Ser vai Lys vai ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30

Thr Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr phe Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 6 <211> 122 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência sintética: Domínio VH Humanizado <400> 6

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Tyr 20 25 30

Thr Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Vai Thr Leu Thr Vai Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai.Ser Ser 115 120

<210> 7 <211> 122 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência sintética: Domínio VH Humanizado <400> 7

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 1 S 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Thr Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Vai Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr vai Ser Ser 115 120

<210> 8 <211> 122 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência sintética: Domínio VH Humanizado <400> 8

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Thr Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Leu He Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe 50 55 60

Lys Gly Arg vai Thr Leu Thr Vai Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 9 <211> 122 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência sintética: Domínio VH Humanizado <400> 9

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30

Thr Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Vai Thr Leu Thr Vai Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 10 <211> 122 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência sintética: Domínio VH Humanizado <4 0 0> 10

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30

Thr Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Vai Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80'

Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Leu vai Thr vai Ser Ser 115 120

<210> 11 <211> 122 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência sintética: Domínio VH Humanizado <4 0 0> 11

Glu val Gin Leu Vai Glu Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly T^r 20 25 10

Thr Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Leu val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 12 <211> 122 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência sintética: Domínio VH Humanizado <4 0 0> 12

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Tyr 20 25 30

Thr Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Vai Thr Leu Thr Vai Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Glu Leu Asn ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp 1Ó0 105 110

Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 13 <211> 122 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência sintética: Domínio VH Humanizado <4 0 0> 13

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser vai Lys vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Thr Met Asn Trp vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Vai Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 14 <211> 122 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência sintética: Domínio VH Humanizado <4 0 0> 14

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Thr Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Vai Thr Leu Thr Vai Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 15 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 15

Asp Tie Gin Met Thr Gin Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gin Gly Tie Ser Asn Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Ala Asp Gly Thr Val Glu Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr He Ser Asn Leu Glu Pro 65 " 70 75 80

Glu Asp Ilè Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105

<210> 16 <211> 321 <212> ADN <213> Mus musculus <4 0 0> 16 gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60 atcagctgca gcgoctccca gggcatcagc aactacctga actggtatca gcagaaggcc 120 gacggcaccg tcgagctgct gatctactac accagcagcc Cgcacagcgg cgtgcccagc 180 cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaaccc 240 gaggatatcg ccacctacta ctgccagcag tacagcaagc tgccctacac ctttggcggc 300 ggaacaaagc tggaaatcaa g 321

<210> 17 <211> 139 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 17

Met vai Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala Leu Pro Gly lie Leu 15 10 15

Ser Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 20 25 30

Ala Ser Met Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp 35 40 45

Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp 50 55 60 lie Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn 65 70 75 80

Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 85 90 95

Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala val Tyr Tyr 100 105 110

Cys Ala Arg Glu Gly Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr 115 120 125

Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr val Ser Ser 130 135

<210> 18 <211> 417 <212> ADN <213> Mus musculus <4 0 0> 18 atggtgctgt ccctgctgta cctgctgacc gccctgcccg gcatcctgag cgaggtgcag 60 ctgcagcaga gcggccctga gctggtgaag cctggcgcca gcatgaagat cagctgcaag 120 gccagcggct acagcttcac cgactacacc atgaactggg tgaagcagag ccacggcaag 180 aacctggaat ggatcggcct gatcaacccc Cacaacggcg gcaccagcta caaccagaac 240 ttcaagggca aggccaccct gaccgtggac aagagcagca gcaccgcçta catggaactg 300 ctgtctctga ccagcgagga cagcgccgtg tactactgcg ccagagaggg ctacgacggc 360 tacctgtact tcgccatgga ctactggggc cagggcacca gcgtgaccgt gagcagc 417

<210> 19 <211> 137 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 19

Leu Leu Leu Ala Val Leu Gin Gly Val Cys Ala Glu Val Arg Leu Val 1 5 10 15

Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys lie Ser 20 25 30

Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Asn Trp He Gly Trp Val 35 40 45

Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Gly lie He Phe Pro 50 55 60

Gly Asp Ser Asp-Thr He Tyr Ser Pro Ser Phe Gin Gly Gin Val Thr 65 70 75 80

He Ser Val Asp Lys Ser He Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Trp Ser Ser 85 90 95

Leu Lys Ala Thr Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gin Asn Pro 100 105 110

Pro Glu Tyr Ser Gly Ala Tyr His Asp Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly 115 120 125

Gin Gly Thr Leu Val He Val Ser Ser 130 135

<210> 20 <211> 411 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 20 ctcctcctgg ctgttctcca aggagtctgt gccgaggtgc gccttgtgca gtctggagca 60 gaggtgaaaa agccggggga gtctctgaag atctcctgta aggcttctgg atacagtttt 120 accagtaact ggatcggctg ggtgcgccag atgcccggga aaggcctgga gtggattggg 180 atcatctttc ctggtgactc tgataccata tacagcccgt ccttccaagg ccaggtcacc 240 atttcagtcg acaagtccat caataccgcc tacctgcagt ggagcagcct gaaggccacg 300 gacaccgcca tgtattactg tgcgagacag aacccccccg agtatagtgg cgcatatcat 360 gatgggtggt tcgacccctg gggccaggga accctggtca tcgtctcctc a 411

<210> 21 <211> 141 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência sintética: Domínio VH RHA <400> 21

Met Gly Ser Thr Ala lie Leu Gly Leu Leu Leu Ala Val Leu Gin Gly IS 10 15

Val Cys Ala Glu Val Arg Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30

Pro Gly Glu Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45

Thr Asp Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu 1 50 55 60

Glu Trp lie Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80

Gin Asn Phe Lys Gly Gin Val Thr He Ser Val Asp Lys Ser lie Asn 85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Thr Asp Thr Ala Met 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met 115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val lie Val Ser Ser 130 135 140

<210> 22 <211> 424 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência sintética: Domínio VH RHA de codificação de ácido nucleico <400> 22 atggggtcaa ccgccatcct tggcctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 60 gtgcgccttg tgcagtctgg agcagaagtg aaaaagccgg gggagtctct gaagatctct 120

tgcaaggctt ctggatacag ttttaccgac tacaccatga actgggtgcg ccagatgccc ISO gggaaaggcc tggagtggat tgggcttatt aatccttaca atggtggtac tagctacaac 240 cagaatttca agggccaagt caccattCca gtcgacaagt ccatcaatac cgcctacctg 300 cagtggagca gcctgaaggc cacggacacc gccatgtatt actgtgcgag agagggctat 360 gatggttacc tttactttgc tatggactac tggggccagg gaaccctggt catcgtctcc 420 tcag 424

<210> 23 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23

Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 15 10 15

Asp Thr Arg Cys Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly 35 40 45 lie Ser Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Val Pro 50 55 60

Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 85 90 95

Ser Leu Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Lys Tyr Asn 100 105 110

Ser Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 115 120 125

<210> 24 <211> 381 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 24 atgagggtcc ctgctcagct cctgggactc ctgctgctct ggctcccaga taccagatgt 60 gacatceaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120 atcacttgcc gggcgagtca gggcattagc aattatttag cctggtatca gcagaaacca 180 gggaaagttc ctaaactcet gatctatgctgcatccactt tgcaatcagg ggtcccatct 240 cggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 300 gaagatgttg caacttatta ctgtcaaaag tataacagtg ccccgtacac ttttggccag 360 gggaccaagc tggagaCcaa a 3B1

<210> 25 <211> 127 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>

<223> Sequência sintética: Domínio 2c3 VK humanizado RKA <400> 25

Met Arg val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro IS 10 15

Asp Thr Arg Cys Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Léu Ser 20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Ser Ala Ser Gin Gly 35 40 45 lie Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Val Pro 50 55 60

Lys Leu Leu lie Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 85 90 95

Ser Leu Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser 100 105 110

Lys Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 115 120 125

<210> 26 <211> 381 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>

<223> Sequência sintética: Domínio 2c3 VK humanizado de codificação de ácido nucleico RKA <400> 26 atgagggtcc ctgctcagct cctgggactc ctgctgctct ggctcccaga taccagatgt 60 gacatccaga tgacceagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120 atcacttgca gtgcatccca gggcattagc aattatctga attggtatca gcagaaacca 180 gggaaagttc ctaaactcct gatctattac acatcaagtt tacactcagg ggtcccatct 240 cggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactccca ccatcagcag cctgcagcct 300 gaagatgttg caacttatta ctgtcagcag tatagcaagc tgccgtacac gtttggccag 360 gggaccaagc tggagatcaa a 381

<210> 27 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala IS 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Trp lie Asn Gly Gly Thr Gly Phe Thr Lys Tyr Ser Gin Asn Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Pro Tyr Asn Asn Tyr Ala Ala Glu Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 28 <211> 363

<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 28 gaggtgcagc tggtggagtc. tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaagtt 60 tcgtgcaagg cttctggata ctccttcagt agttatggta tacattgggt gcgccaggcc 120

cccggacaaa ggcttgagtg gatgggatgg atcaacggtg gcactggttt tacaaaatat ISO tcacagaatt ttcagggcag agtcacccta accagggaca cttccgcgag cacagcctac 240 ttggaactga acagcctgag atctgaagac acgggtgtat attactgtgc gagggatccc 300 tacaataact acgcggcgga acttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tea 363

<210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29

Ser Ala Ser Gin Gly lie Ser Asn Tyr Leu Asn 15 10

<210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30

Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser 1 5 <210> 31 <211> 9

<212> PRT <213> Mus musculus <400> 31

Gin Gin Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr Thr 1 S

<210> 32 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32

Asp Tyr Thr Met Asn 1 5

<210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 33

Glu Gly Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 34 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência sintética: Cadeia pesada CDR1 <4Ο0> 34

Gly Tyr Thr Met Asn 1 5

<210> 35 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 35

Leu lie Asn. Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Ash Phe Lys IS 10 15

Gly

<210> 36 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência sintética: Cadeia pesada CDR3 <400> 36

Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr 15 10

<210> 37 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37

Met Gly Ser Thr Ala lie Leu Gly Leu Leu Leu Ala Val Leu Gin Gly 15 10 15

Val Cys Ala

<210> 38 <211> 20 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 38

Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15

Asp Thr Arg Cys 20

<210> 39 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15

Leu Pro Asp Thr Arg Cys 20

<210> 40 <211> 423 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência sintética: Codificação de ácido nucleico RH2.5 R71V <400> 40 atgggcagca cagccattct gggcccgctg ctggccgtgc tgcagggcgt gtgcgccgag 60 gtgcagctgg tcgagagcgg agccgaggtg aagaagccag gcgccagcgt caaggtgtcc 120 tgcaaggcca gcggctacag cttctccggc tacaccatga actgggtgcg gcaggcccca 180 ggccagaggc tggaatggat gggcctgatc aacccctaca acggcggcac cagctacaac 240 cagaacttca agggcagggt gacactgacc gtggatacca gcgccagcac cgcctacctg 300 gaactgaaca gcctgagaag cgaggacacc ggcgtgtact actgcgccag agaggactac 360 gacggctacc tgtacbtcgc catggactac tggggccagg gcaccctggt gaccgtgagc 420 age 423

<210> 41 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência sintética: Sequência consenso KozaK <400> 41 aagcttgccg ccacc 15

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • GB 2008001365 W [0015] • WO 2008129263 A [0015] • US 9209965 W [0055] • WO 9413804 A [0055] [0057] • EP 184187 A [0058] • GB 2188638 A [0058] • EP 239400 A [0058] • WO 9958572 A [0062] [0119] • EP 0120694 A [0063] • EP 0125023 A [0063] • US 5071972 A [0064] • EP 276846 A [0064] • WO 9201047 A [0076] • US 61101293 B [0175] • GB 0817891 A [0175]

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Lisboa, 19 de Maio de 2015

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um membro de ligação a alvo que se liga a IL-25, que compreende um domínio VL de anticorpo que compreende as CDR 1-3 de Rabat como é exposto como os resíduos 24-34 (SEQ ID N°: 29); 50-56 (SEQ ID N° : 30) e 89-97 (SEQ ID N° : 31), respetivamente, de SEQ ID N° : 15 e um domínio VH de anticorpo que compreende SEQ ID N°: 1: Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Xal Xa2 Tyr Thr Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Xa3 Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe Lys Gly Arg Vai Thr Leu Thr Xa4 Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Xa5 Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser em que: Xal é Ser ou Thr; Xa2 é Gly, Asp, Ala, Ser, Vai, Asn, Lys, Tyr ou Met; Xa3 é Met ou Ile; Xa4 é Vai ou Arg; e Xa5 é Asp, Asn ou Gly.
2. 2. O membro de ligação a alvo de acordo com a reivindicação 1, em que (a) Xa2 é Gly e Xa5 é Asp ou Asn; (b) Xa2 é Gly e Xa5 é Asp (c) Xal é Ser; (d) Xal é Thr; (e) Xa3 é Met; (f) Xa3 é Ile; (g) Xa4 é Vai; ou (h) Xa4 é Arg.
3. 3. 0 membro de ligação a alvo de acordo com a reivindicação 1, em que os resíduos Xal - Xa5 estão nas seguintes combinações:
4. 4. 0 membro de ligação a alvo de acordo com a reivindicação 1: (a) em que o domínio VL inclui adicionalmente os resíduos 35-38 de SEQ ID N°: 15 adjacentes a CDR1 (SEQ ID N°: 29); (b) que compreende SEQ ID N°: 15; (c) em que o domínio VL é humanizado; ou (d) em que o domínio VL é humanizado, e a sequência do membro de ligação o alvo compreende os aminoácidos 21-127 de SEQ ID N°: 25.
5. 5. 0 membro de ligação a alvo de acordo com a reivindicação 1, que é um fragmento de anticorpo Fab, F(ab')2f scFv ou Fv.
6. 6. 0 membro de ligação a alvo de acordo com a reivindicação 1, que compreende uma região constante de anticorpo.
7. 7. 0 membro de ligação a alvo de acordo com a reivindicação 6, em que a região constante é uma região constante de IgGl ou IgG4 humana.
8. 8. Um ácido nucleico isolado que compreende uma sequência de nucleótidos que codifica o membro de ligação a alvo de acordo com a reivindicação 1.
9. 9. Um vetor de expressão que compreende o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 8, operativamente ligado a um promotor.
10. 10. Uma célula hospedeira que leva o vetor de expressão de acordo com a reivindicação 9.
11. 11. Um método de produção de um membro de ligação a alvo, compreendendo o método cultivar células hospedeiras de acordo com a reivindicação 10 em condições para a produção do dito membro de ligação a alvo, método que compreende opcionalmente além disso isolar o dito membro de ligação a alvo, e opcionalmente compreende além disso formular o membro de ligação a alvo numa composição que inclui pelo menos um componente adicional.
12. 12. Uma composição que compreende o membro de ligação a alvo de acordo com a reivindicação 1 e um veiculo farmaceuticamente aceitável, composição que está opcionalmente em forma de um pó liofilizado.
13. 13. 0 membro de ligação a alvo de qualquer uma das reivindicações 1 a 7 para utilização no tratamento ou prevenção de: (a) asma; (b) doença inflamatória intestinal; (c) colite ulcerosa; ou (d) doença de Crohn.
14. 14. Um método de produção de um anticorpo contra IL-25 que compreende: (a) proporcionar um domínio VH de anticorpo que compreende SEQ ID N°: 1: Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Xal Xa2 Tyr Thr Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Xa3 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe Lys Gly Arg Vai Thr Leu Thr Xa4 Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Xa5 Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser em que: Xal é Ser ou Thr; Xa2 é Gly, Asp, Ala, Ser, Vai, Asn, Lys, Tyr ou Met; Xa3 é Met ou Ile; Xa4 é Vai ou Arg; e Xa5 é Asp, Asn ou Gly; (b) combinar o dito domínio VH com uma pluralidade de domínios VL de anticorpo para proporcionar moléculas de anticorpo; (c) rastrear as ditas moléculas de anticorpo para se ligar a IL-25; e (d) selecionar uma molécula de anticorpo que se liga a IL-25.
15. 15. 0 membro de ligação a alvo de acordo com a reivindicação 1, que compreende um anticorpo completo. Lisboa, 19 de Maio de 2015