JP6930778B2 - 抗ヒトインターロイキン１７ａモノクローナル抗体およびその使用 - Google Patents

Description

本発明は抗体医薬の分野に関する。具体的には、本発明は、ヒトインターロイキン１７Ａに対する抗体およびその使用に関する。

インターロイキン１７（ＩＬ−１７）は、ＣＴＬＡ−８またはＩＬ−１７Ａとも呼ばれる炎症誘発性サイトカインであり、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞及び内皮細胞、滑膜細胞などの非免疫細胞を刺激してＩＬ−６、ＩＬ−８、ＰＧＥ２、ＭＣＰ−１、ＣＸＣＬ−１およびＧ−ＣＳＦなど複数のサイトカインを分泌させ、ＩＣＡＭ−１の表面発現、Ｔ細胞の増殖を誘導するなどの生物学的効果もある。ＩＬ−１７Ａは主に、活性化された、Ｔｈ１７と呼ばれるＣＤ４＋Ｔ細胞によって生成され、ＩＬ−１７ＲＡとＩＬ−１７ＲＣの複合体に結合することによって作用する（Ｔｏｙ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７（１１）；３６−３９）。

今まで、ＩＬ−１７ファミリーの６つのメンバー、すなわち、ＩＬ−１７Ａ（ＩＬ−１７）、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７Ｅ（ＩＬ−２５）、ＩＬ−１７Ｆが発見された。これらのインターロイキン−１７サイトカインは、対応する受容体に結合して様々な炎症反応を媒介することができる。

その中で、ＩＬ−１７Ａは、１５５アミノ酸の２本の鎖がジスルフィド結合で接続してなるホモダイマーであり、分子量が３５ｋＤａである。ＩＬ−１７の構造は、２３アミノ酸からなるシグナルペプチド（ＡＡ）と１３２アミノ酸鎖領域とからなる。

ＩＬ−１７Ａの過剰発現は、多くの炎症疾患を引き起こす可能性がある。例えば、ＩＬ−１７Ａはマクロファージ、ＤＣ細胞に作用し、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ、ＣＲＰの高発現を誘導し、炎症反応を引き起こし、乾癬と移植拒絶の病理学的プロセスに関与する。ＩＬ−１７Ａは内皮細胞に作用し、ＩＬ−６、ＭＭＰ、および凝固因子の高発現を誘導し、血管の活性化を引き起こし、再灌流障害、血栓症、およびアテローム性動脈硬化症の病理学的プロセスに関与する。ＩＬ−１７Ａは線維芽細胞に作用し、ＩＬ−６、ケモカイン、成長因子、ＭＭＰの高発現を誘導し、マトリックス破壊を引き起こし、多発性硬化症およびクローン病の病理学的プロセスに関与する。ＩＬ−１７Ａは骨芽細胞及び軟骨細胞に作用し、ＲＡＮＫＬ、ＭＭＰ、破骨細胞の生成を誘導し、骨びらん、軟骨損傷を引き起こし、関節リウマチおよび歯周病の病理学的プロセスに関与する（Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００９ Ａｕｇ ２７；３６１（９）：８８８−９８．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． ２０１２ Ｏｃｔ；１１（１０）：７６３−７６．Ｓｅｍｉｎ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．２０１３ Ｏｃｔ；４３（２）：１５８−７０．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１６ Ｍａｒ；２２（３）：２３０−４１．）。

ＩＬ−１７Ａ中和抗体は、自己免疫疾患の患者におけるＩＬ−１７Ａの高発現を阻害し、重要な炎症性因子ＩＬ−６の生成を低下させることができる（Ｃｈａｂａｕｄ Ｍ，Ｄｕｒａｎｄ ＪＭ，Ｂｕｃｈｓ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．１９９９，４２：９６３−７０）。多くの自己免疫疾患の動物モデル実験は、抗体を使用してＩＬ−１７Ａを中和することで、炎症の病理学的発達を効果的に阻害できることを証明した（Ｌｕｂｂｅｒｔｓ Ｅ，Ｋｏｅｎｄｅｒｓ ＭＩ，Ｏｐｐｅｒｓ−Ｗａｌｇｒｅｅｎ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，２００４，５０：６５０−６５９）。

現在、ＩＬ−１７Ａの関連抗体医薬の市販はすでに承認されており、それぞれ、尋常性乾癬、強直性脊椎炎、および乾癬性関節炎を治療するためのＳｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ（ＩＬ−１７Ａターゲティング抗体、ＳＥＣ）、尋常性乾癬および乾癬性関節炎を治療するためのＩｘｅｋｉｚｕｍａｂ（ＩＬ−１７Ａターゲティング抗体、ＩＸＥ）である。

本発明は、新しい抗ヒトインターロイキン１７Ａのモノクローナル抗体、当該モノクローナル抗体を含む医薬組成物、および当該モノクローナル抗体の製薬用途を提供することを目的とする。

すなわち、本発明は下記を含む：
１．第７８位のアスパラギン（Ｎ７８）を含むヒトインターロイキン１７Ａのエピトープに結合する、単離された抗ヒトインターロイキン１７Ａモノクローナル抗体。発明者が知っている限り、既存技術における抗ヒトインターロイキン１７Ａモノクローナル抗体が結合するヒトインターロイキン１７Ａのエピトープには第７８位のアスパラギン（Ｎ７８）が含まれていない。
２．Ｇ_７５ＸＸＮ_７８ＸＤ_８０ＸＮ_８２Ｖ_８３Ｄ_８４Ｙ_８５を含むヒトインターロイキン１７Ａのエピトープに結合し、ここで、Ｘは任意のアミノ酸を表す、前記いずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
３．Ｇ_７５Ｃ_７６ＸＮ_７８ＸＤ_８０ＸＮ_８２Ｖ_８３Ｄ_８４Ｙ_８５を含むヒトインターロイキン１７Ａのエピトープに結合し、ここで、Ｘは任意のアミノ酸を表す、前記いずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
４．Ｇ_７５Ｃ_７６Ｉ_７７Ｎ_７８Ａ７９Ｄ_８０Ｇ８１Ｎ_８２Ｖ_８３Ｄ_８４Ｙ_８５を含むヒトインターロイキン１７Ａのエピトープに結合する、前記いずれか１項に記載のモノクローナル抗体。

５．３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３）と、３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３）を含み、その中で、
（ａ）前記ＣＤＲ−Ｈ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸配列、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸配列に１つまたは複数のアミノ酸が欠失、置換、および／または添加されてなるアミノ酸配列、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列である；
（ｂ）ＣＤＲ−Ｈ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列に１つまたは複数のアミノ酸が欠失、置換、および／または添加されてなるアミノ酸配列、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列である；
（ｃ）ＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示すアミノ酸配列、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示すアミノ酸配列に１つまたは複数のアミノ酸が欠失、置換、および／または添加されてなるアミノ酸配列、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示すアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列である；
（ｄ）ＣＤＲ−Ｌ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示すアミノ酸配列、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示すアミノ酸配列に１つまたは複数のアミノ酸が欠失、置換、および／または添加されてなるアミノ酸配列、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示すアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列である；
（ｅ）ＣＤＲ−Ｌ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示すアミノ酸配列、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示すアミノ酸配列に１つまたは複数のアミノ酸が欠失、置換、および／または添加されてなるアミノ酸配列、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示すアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列である；および
（ｆ）ＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示すアミノ酸配列、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示すアミノ酸配列に１つまたは複数のアミノ酸が欠失、置換、および／または添加されてなるアミノ酸配列、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示すアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列である、
前記いずれか１項に記載のモノクローナル抗体。

ここで、「複数のアミノ酸」は、例えば、３０、２０、１５、１０、５、３、または２つのアミノ酸である。

「５０％以上の同一性」は、例えば、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性である。本明細書において、「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、例えば、当業者に公知されている同一性検索プログラムとしてのＦＡＳＴＡ３［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１（１９８５）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，２４４４−２４４８（１９８８）］において、デフォルト（初期設定）パラメータを使用して計算された値を指す。

前記「置換」は好ましくは「保存的置換」であり、すなわち、変異されるアミノ酸残基は、アミノ酸側鎖の特性を保持する別のアミノ酸に変異される（このプロセスは、公知の保存的アミノ酸置換である）ことである。アミノ酸側鎖特性の例として、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、および、脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、ヒドロキシル含有側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸とアミド含有側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基（ｂａｓｅ）含有側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖（Ｆ、Ｙ、Ｗ）などの共有の官能基または特性を有する側鎖が挙げられる。なお、括弧内の文字は、アミノ酸の１文字の記号を表す。

機能的に類似したアミノ酸を与える保存的置換は、本技術分野では公知である。例えば、次の８つのグループのアミノ酸は互いに保存的に置換されるアミノ酸を構成する：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。

６．（ａ）ＣＤＲ−Ｈ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸配列である；
（ｂ）ＣＤＲ−Ｈ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列である；
（ｃ）ＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示すアミノ酸配列である；
（ｄ）ＣＤＲ−Ｌ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示すアミノ酸配列である；
（ｅ）ＣＤＲ−Ｌ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示すアミノ酸配列である；および
（ｆ）ＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示すアミノ酸配列である、
前記いずれか１項に記載のモノクローナル抗体。

７．３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３）と、３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３）を含み、その中で、
（ａ）ＣＤＲ−Ｈ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸配列である；
（ｂ）ＣＤＲ−Ｈ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列である；
（ｃ）ＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示すアミノ酸配列である；
（ｄ）ＣＤＲ−Ｌ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示すアミノ酸配列である；
（ｅ）ＣＤＲ−Ｌ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示すアミノ酸配列である；および
（ｆ）ＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示すアミノ酸配列である、
単離された抗ヒトインターロイキン１７Ａモノクローナル抗体。

８．ヒトインターロイキン１７Ａへの結合について項７に記載のモノクローナル抗体と競合する、単離された抗ヒトインターロイキン１７Ａモノクローナル抗体。
９．項７に記載のモノクローナル抗体と同じヒトインターロイキン１７Ａのエピトープに結合する、単離された抗ヒトインターロイキン１７Ａモノクローナル抗体。
１０．前記いずれか１項に記載のモノクローナル抗体をコードする、単離された核酸。
１１．項１０に記載の核酸を含む、宿主細胞。

前記核酸はベクター上に存在することができる。ベクターは、任意のタイプ、例えば、発現ベクターなどの組換えベクターであってもよい。複数の宿主細胞のいずれかを使用できる。一実施形態では、宿主細胞は、原核細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。別の実施形態では、宿主細胞は真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞である。

１２．項１１に記載の宿主細胞を培養して前記いずれか１項に記載のモノクローナル抗体を製造することを含む、モノクローナル抗体を製造する方法。
１３．前記いずれか１項に記載のモノクローナル抗体および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。前記医薬組成物は、別の治療剤（例えば、異なる抗ヒトインターロイキン１７Ａ抗体）をさらに含むことができる。
１４．関節リウマチ、乾癬、クローン病、多発性硬化症、乾癬性関節炎、尋常性乾癬および/または強直性脊椎炎などの自己免疫疾患を治療するための項１３に記載の医薬組成物。
１５．関節リウマチ、乾癬、クローン病、多発性硬化症、乾癬性関節炎、尋常性乾癬および/または強直性脊椎炎などの自己免疫疾患を治療するための薬剤の調製における、前記いずれか１項に記載のモノクローナル抗体の使用。
１６．項１〜９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または項１３に記載の医薬組成物を、それを必要とする被験者に投与することを含む、
自己免疫疾患を治療する方法。
１７．前記自己免疫疾患は、関節リウマチ(rheumatoid arthritis)、乾癬(psoriasis)、クローン病(Crohn’s disease)、多発性硬化症(multiple sclerosis)、乾癬性関節炎(psoriatic arthritis)、尋常性乾癬(plaque psoriasis)および/または強直性脊椎炎(ankylosing spondylitis)である、項１６に記載の方法。

本発明は、既存の抗ヒトインターロイキン１７Ａモノクローナル抗体と同等またはそれ以上のＩＬ−１７Ａへの結合親和性を有する、新しい抗ヒトインターロイキン１７Ａモノクローナル抗体を提供する。

図１は、核酸電気泳動の結果を示す図である。その中で、Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ；バンド１：ｐＨＺＤＣＨ、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｈｅＩ；バンド２：ｐＵＣ５７−３７ＶＨ−Ｈｕ５、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｈｅＩ；バンド３：ｐＨＺＤＣＫ、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｉＷＩ；バンド４：ｐＵＣ５７−３７ＶＨ−Ｈｕ２、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｉＷＩ。 図２は、一過性発現のフローチャートである。 図３は、タンパク質電気泳動検出図である。 図４は、ＱＸ００２ＮがｈＩＬ−１７Ａ、ｈＩＬ−１７Ａ変異体（Ｎ７８Ａ）によって誘発されたＳＥＡＰ放出を阻害した結果を示す図である。 図５は、ヒト、アカゲザル、およびカニクイザルのＩＬ−１７Ａアミノ酸配列アラインメントの結果を示す図である。 図６は、ＩＬ−１７Ａとその受容体との複合体の結晶構造における、ＱＸ００２ＮとＩＸＥによって認識されるエピトープの位置を示す図である。ＱＸ００２ＮとＩＸＥによって認識されるＩＬ−１７Ａ上のエピトープは四角で囲まれている。左側のホモダイマーはＩＬ−１７Ａの構造であり、右側はＩＬ−１７Ａ受容体の構造である。 図７は、図６の四角内の部分拡大図である。 図８は、ＱＸ００２Ｎが、ＩＬ−１７Ａによって誘発されたマウス体内のＫＣの放出を阻害する実験結果を示す図である。

発明の詳細

本明細書に記載されている科学技術用語は、当業者が一般に理解している用語と同じ意味を有するが、矛盾する場合には、本明細書の定義に準ずる。

一般的にいえば、本明細書で使用されている用語は、以下の意味を有する。

本明細書において、「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から分離された抗体をいう。ある一部の実施形態では、抗体を９５％または９９％を超える純度に精製し、前記純度は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等電集束（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）によって確定される。抗体の純度を評価する方法について、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ８４８：７９−８７（２００７）を参照されたい。

本明細書において、「モノクローナル抗体」とは、実質的に相同な抗体の群から得られた抗体のことであり、すなわち、該群を構成する各抗体は同一であり、および／または同じエピトープに結合する。可能な変異体抗体（例えば、自然に存在する突然変異またはモノクローナル抗体の製品の製造過程において発生するもの）を除き、このような変異体は一般に微量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む典型的なポリクローナル抗体製品と違って、モノクローナル抗体製品における各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対する。よって、修飾語「モノクローナル」とは、実質的に相同な抗体群から得られる特徴を示し、いずれか特定の方法で調製する必要のある抗体と解釈すべきではない。例えば、本発明のモノクローナル抗体は複数の技術によって製造することができ、前記技術は、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むが、これらに限られていない。本文は、このような方法、およびモノクローナル抗体を調製するその他の例示的な方法を記載している。

本明細書において、「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合サイトとその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の合計の強度を指す。別途説明する場合を除き、本明細書で使用されている「結合親和性」とは、結合対メンバー（例えば、抗体と抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。パートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般的に平衡解離定数（ＫＤ）で表すことができる。親和性は、本分野で既知の常用方法によって測定することができる。

本明細書において、ヒトインターロイキン１７Ａ（Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７Ａ、ｈＩＬ−１７Ａ）は、ヒト由来タンパク質を表し、そのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示され、下線部分は、シグナルペプチドを表す。

ＩＬ−１７Ａは、Ｔｈ１７細胞によって生成される炎症誘発性サイトカインであり、その受容体ＩＬ−１７ＲＡおよびＩＬ−１７ＲＣに結合することにより、角化細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、関節滑膜細胞などを刺激してＩＬ−６、ＩＬ−８、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ−１、ＣＸＣＬ−２、ＣＣＬ−８、ＣＣＬ−２、ＣＣＬ−７等のサイトカインを生成し、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、乾癬性関節炎、尋常性乾癬、強直性脊椎炎など、異常な免疫反応によって媒介される複数の疾患に関与し、それらを促進する。

本発明のモノクローナル抗体は、ＩＬ−１７Ａを特異的に認識する中和抗体であり、ＩＬ−１７Ａに結合することにより、ＩＬ−１７Ａがその受容体を通してシグナルを伝達して生物学的効果を媒介することを阻害し、それにより、ＩＬ−１７Ａによって媒介される自己免疫疾患を予防及び治療する。

本明細書において、「抗ヒトインターロイキン１７Ａモノクローナル抗体」とは、ヒトインターロイキン１７Ａを標的とする診断薬および／または治療薬として使用できるように、十分な親和性でヒトインターロイキン１７Ａに結合できるモノクローナル抗体を意味する。

一実施形態では、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で測定した場合、無関係な非ヒトインターロイキン１７Ａタンパク質への抗ヒトインターロイキン１７Ａモノクローナル抗体の結合度は、ヒトインターロイキン１７Ａタンパク質への前記モノクローナル抗体の結合度の約１０％よりも低い。

ある一部の実施形態では、ヒトインターロイキン１７Ａに結合するモノクローナル抗体は、１μＭ以下（≦１μＭ）、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭ、または０．００１ｎＭ以下（例えば、１０^−８Ｍ以下、１０^−８Ｍ〜１０^−１３Ｍ、１０^−９Ｍ〜１０^−１３Ｍ）の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を有する。

一実施形態では、本発明の抗ヒトインターロイキン１７Ａモノクローナル抗体の重鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示され、軽鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示される。

その中で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０と１１はいずれもヒト化された配列である。

本明細書において、「単離された」核酸とは、その自然環境の成分から分離された核酸分子を意味する。単離された核酸は、通常は核酸分子を含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、前記核酸分子は、染色体外、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。

本明細書において、「抗ヒトインターロイキン１７Ａモノクローナル抗体をコードする単離された核酸」とは、抗体の重鎖および軽鎖をコードする１つまたは複数の核酸分子を意味し、単一のベクターまたは別個のベクター中のそのような核酸分子、および宿主細胞に存在する１つまたは複数の位置に存在するそのような核酸分子を含む。

本明細書において、「ベクター」とは、それに結合した別の核酸を増幅することができる核酸分子を意味する。この用語には、自己複製核酸構造であるベクター、およびそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターが含まれる。ある一部のベクターは、それらに操作可能に連結されている核酸の発現を指導することができる。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。

本明細書において、「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養」は互いに置き換えて使用することができ、外因性核酸が導入された細胞を表し、そのような細胞の後代を含む。宿主細胞は、「形質転換体」と「形質転換細胞」とを含み、一次形質転換細胞とそれに由来する後代（継代数を問わず）とを含む。後代は、核酸内容物では親細胞と完全に同じでなくてもよく、突然変異を含んでもよい。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングまたは選択された、同じ機能または生物学的活性を有する変異体後代は、本明細書に含まれている。

本明細書において、「医薬組成物」とは、その中に含まれている活性成分の生物学的活性を有効にする形を取っており、製剤が投与される被験者に対して容認できない毒性を持つ追加の成分を含まない組成物のような製品を指す。

本明細書において、「薬学的に許容される担体」とは、活性成分を除き、医薬組成物に含まれる成分が被験者に対して無毒であることを意味する。薬学的に許容される担体は、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または防腐剤を含むが、これらに限られていない。

以下、実施例を通して本発明をより具体的に説明する。本発明はこれらの実施例に限定されていないことを理解されたい。

［実施例１］抗ヒトインターロイキン１７Ａモノクローナル抗体ＱＸ００２Ｎの調製
ウサギの免疫のために、ヒトインターロイキン１７Ａを上海近岸科技有限公司から購入し、Ｂ細胞クローニング技術を使用してヒトインターロイキン１７Ａに対して活性を阻害するモノクローナル抗体をスクリーニングした。まず、ｂｉｎｄｉｎｇ ＥＬＩＳＡを利用して細胞上清を検出し、ｈＩＬ−１７Ａに結合するクローンを選択した後、ｂｌｏｃｋｉｎｇ ＥＬＩＳＡで検出し、ｈＩＬ−１７Ａとその受容体との結合を阻害できるクローンを選択した。上記の免疫およびスクリーニングプロセスは、商業会社に委託されて完成された。
組換え発現のために８つのクローンを選択してシーケンシングした。３７＃クローンに対してヒト化した。ＮＣＢＩ ＩｇＢｌａｓｔを使用してヒトＩｇＧ生殖系列配列（Ｇｅｒｍｌｉｎｅ）の同一性比較を行い、ＩｇＧＨＶ４−５９＊０１を選択して重鎖ＣＤＲ移植のテンプレートとし、３７＃クローン重鎖のＣＤＲ領域（すなわち、ＣＤＲ−Ｈ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、ＣＤＲ−Ｈ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、およびＣＤＲ−Ｈ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３））をＩｇＧＨＶ４−５９＊０１のフレームワーク領域に移植し、ＩＧＫＶ１−１２＊０１を選択して軽鎖ＣＤＲ移植のテンプレートとし、３７＃クローン軽鎖のＣＤＲ領域（すなわち、ＣＤＲ−Ｌ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ＣＤＲ−Ｌ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、およびＣＤＲ−Ｌ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６））をＩＧＫＶ１−１２＊０１のフレームワーク領域に移植した。フレームワーク領域の特定の部位に対して復帰突然変異を行って本発明のモノクローナル抗体ＱＸ００２Ｎ可変領域を得た。最後に、ヒト化された重鎖可変領域の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示され、ヒト化された軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示される。

上記の重鎖可変領域と軽鎖可変領域の遺伝子配列はそれぞれ人工的に合成され、それぞれｐＵＣ５７ベクターに挿入された。ＨｉｎｄＩＩＩとＮｈｅＩを使用して重鎖可変領域遺伝子と重鎖発現プラスミドｐＨＺＤＣＨを二重消化させ、ＨｉｎｄＩＩＩとＢｓｉＷＩを使用して軽鎖可変領域遺伝子と軽鎖発現プラスミドｐＨＺＤＣＨを二重消化させ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して消化させられたフラグメントをそれぞれ対応する発現プラスミドに挿入して、重鎖発現プラスミドｐＨＺＤＣＨ−３７ＶＨ−Ｈｕ５と軽鎖発現プラスミドｐＨＺＤＣＫ−３７ＶＫ−Ｈｕ２を構築した。プラスミドの二重消化を核酸電気泳動で検出した結果を図１に示す。図１の結果から分かるように、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域、および重鎖と軽鎖の発現プラスミドを二重消化させた結果、重鎖と軽鎖のプラスミドのサイズは約１００００ｂｐであり、軽鎖可変領域は約４２０ｂｐであり、重鎖可変領域は約４４１ｂｐである。

配列が正しい重鎖発現プラスミドと軽鎖発現プラスミドをＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ細胞を同時トランスフェクションした。トランスフェクションの前日、トランスフェクション前の継代のために、ＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ細胞を３×１０^６細胞／ｍｌに希釈した。トランスフェクション当日、細胞密度を６×１０^６細胞／ｍｌに希釈し、トランスフェクションのために２５ｍｌの細胞を１２５ｍｌの振とうフラスコに入れた。トランスフェクションと発現のプロセスを図２に示す。

トランスフェクション後７日目に、培養上清を採取し、ＰｒｏｔｅｉｎＡでワンステップで精製した。精製された抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で検出し、ＱＸ００２Ｎと名付けた。当該抗体をタンパク質電気泳動で検出した結果を図３に示す。タンパク質電気泳動は変性還元ゲルで検出され、図３に示される結果から分かるように、２つのバンドがあり、２つのバンドのサイズはそれぞれ約５０ｋＤａと２５ｋＤａであり、重鎖（４９．３ｋＤａ）と軽鎖（２３．２ｋＤａ）の理論上の分子量と一致している。

［実施例２］平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）の測定
ＢｉａｃｏｒｅＴ２００を使用してＱＸ００２ＮとｈＩＬ−１７Ａの親和性を検出し、すべてのプロセスを２５℃で行った。ＰｒｏｔｅｉｎＡタンパク質をＣＭ５チップ上に化学的にカップリングし、Ｒｍａｘが５０ＲＵ未満、捕捉流量が１０μｌ／ｍｉｎになるように、捕捉法によって適切な量の抗体を固定した。抗原を段階的に希釈し、機器の流量を３０μｌ／ｍｉｎに切り替え、濃度が低いものから高いものへの順番で参照チャネルと抗体固定チャネルを流し、陰性対照として緩衝液を流した。各結合と解離が完了した後、ｐＨ１．５グリシンでチップを再生した。機器に付属されているソフトウェアを使用して、１：１結合モデルに従って適合させ、抗体の結合速度定数ｋ_ａ、解離速度定数ｋ_ｄ、および平衡解離定数Ｋ_Ｄの値を計算した。

また、ＱＸ００２Ｎと、現在すでに市販されているｈＩＬ−１７Ａに対する抗体、すなわち、Ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ（ＩＸＥ）およびＳｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ（ＳＥＣ）との親和性を比較した。既知の抗体に対する検出方法は、ＱＸ００２Ｎに対する検出方法と同じであった。結果を下記表に示す。
その中で、Ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ（ＩＸＥ）とＳｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ（ＳＥＣ）との２つの抗体はそれぞれ、市販の薬剤を購入することで入手した。

各サンプルを２回検出し、平均値を計算した。

［実施例３］ヒトインターロイキン１７Ａまたはその変異体を発現する細胞の活性に対する、実施例１で調製された抗ヒトインターロイキン１７Ａモノクローナル抗体阻害作用
３．１ ｈＩＬ−１７Ａ変異体の一過性発現上清の希釈倍数の確定
哺乳動物の細胞発現系におけるｈＩＬ−１７Ａ変異体の収量が低いため、精製されず、図２に記載されている一過性発現上清を使用して細胞活性阻害実験を行うが、細胞活性実験を通して一過性発現上清の希釈倍数を確定する必要がある。

ｈＩＬ−１７Ａは、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ^ＴＭＩＬ−１７ Ｃｅｌｌｓを誘導して分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を放出させることができる。異なる濃度のｈＩＬ−１７Ａ標準品によって誘導されて放出されたＳＥＡＰの量を検出し、濃度曲線を描いた。ＳＥＡＰ放出量が最後のプラトー期間に近い標準品濃度３ｎｇ／ｍｌを作業濃度とした。

異なるｈＩＬ−１７Ａ変異体の一過性発現上清を段階的に希釈し、異なる希釈度のｈＩＬ−１７Ａ変異体によって誘導されて放出されたＳＥＡＰの量を検出した。特定の希釈倍数のｈＩＬ−１７Ａ変異体が、３ｎｇ／ｍｌ ｈＩＬ−１７Ａ標準品が誘導されて放出したＳＥＡＰの量に類似する場合、その希釈倍数を選択して、抗体とｈＩＬ−１７Ａ認識エピトープの細胞阻害実験に用いた。

３．２ 細胞活性阻害実験による抗体とｈＩＬ−１７Ａ認識エピトープに関する研究
濃度勾配の異なる抗体をそれぞれ、予め希釈したｈＩＬ−１７Ａ変異体（Ｎ７８Ａ）の一過性発現上清と３ｎｇ／ｍｌ ｈＩＬ−１７Ａ標準品とともに２時間インキュベーションし、２時間後に、インキュベーションしたものを、ＨＥＫ−ＢｌｕｅＴＭ ＩＬ１７ Ｃｅｌｌｓで覆われた９６ウェル細胞培養プレートに移し、２４時間後、細胞内のＳＥＡＰの発現を検出し、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏで４パラメータ曲線分析の結果をフィッティングした（図４参照）。抗体は、ＩＬ−１７Ａによって誘導されたＳＥＡＰの放出量を阻害できる。抗体がｈＩＬ−１７Ａ変異体によって誘導されたＳＥＡＰの放出を阻害できない、またはその阻害が不完全である場合、その抗体がｈＩＬ−１７Ａ変異体に結合できず、突然変異の対応する部位が、抗体が標的とするエピトープであることを意味する。抗体がｈＩＬ−１７Ａ変異体によって誘導されたＳＥＡＰの放出を阻害できる場合、抗体がｈＩＬ−１７Ａ変異体に結合でき、突然変異の対応する部位が、抗体が標的とするエピトープではないことを意味する。

実験の結果、ヒトＩＬ−１７ＡのＮ７８がＡに変異した後、ＱＸ００２ＮはＳＥＡＰの放出への阻害が不完全であることは示された。そして、ＱＸ００２ＮがカニクイザルＩＬ−１７Ａによって誘導されるＳＥＡＰの放出を阻害できないが、アカゲザルＩＬ−１７Ａによって誘導されたＳＥＡＰの放出を阻害できることは、同実験によって示された。したがって、ヒトＩＬ−１７ＡのＮ７８はＱＸ００２Ｎエピトープである。

なお、図５は、ヒト、アカゲザル、およびカニクイザルのＩＬ−１７Ａのアミノ酸配列アラインメントの結果を示す。ヒトとアカゲザルＩＬ−１７Ａの７８位はＮであるが、カニクイザルＩＬ−１７Ａの７８位はＫである。

ＳＥＣ、ＩＸＥについても上記と同じ方法を用いて検出を行った。実験の結果、ＳＥＣとＩＸＥのいずれもｈＩＬ−１７Ａ変異体（Ｎ７８Ａ）、カニクイザルＩＬ−１７Ａに結合できることが示された。したがって、ＱＸ００２Ｎは、ＳＥＣとＩＸＥとは異なるエピトープを有する。

［実施例４］実施例１で調製された抗ヒトインターロイキン１７Ａモノクローナル抗体によって認識されるｈＩＬ−１７Ａエピトープの確定
実験の結果、ヒトＩＬ−１７ＡのＤ８０ＧＮＶＤＹＨ８６がＱＸ００２Ｎのエピトープである可能性があることは示された。

ＱＸ００２Ｎの標的となるエピトープ領域を確定するために、ヒトＩＬ−１７ＡのＤ８０ＧＮＶＤＹＨ８６およびその隣接部位に対して単一点突然変異を行った。抗体がｈＩＬ−１７Ａ変異体によって誘発されたＳＥＡＰの放出を阻害できない、またはその阻害が不完全である場合、抗体がｈＩＬ−１７Ａ変異体に結合できず、突然変異の対応する部位が、抗体が標的とするエピトープであることを意味する。

実験の結果を表１に示す。ＱＸ００２Ｎの標的となるエピトープ領域はＧ７５ＸＸＮ７８ＸＤ８０ＸＮ８２Ｖ８３Ｄ８４Ｙ８５であることが確定できる。その中で、Ｘは任意のアミノ酸を表し、アミノ酸の１文字の記号の後の数字は、ｈＩＬ−１７Ａにおける当該アミノ酸の位置を表す。

［実施例５］細胞活性阻害実験によるＱＸ００２Ｎと既知のモノクローナル抗体ＩＸＥによって認識されるｈＩＬ−１７Ａエピトープの比較研究
ヒトＩＬ−１７Ａの２つの配列、Ｄ８０ＧＮＶＤＹＨ８６とＴ１２５ＰＩＶ１２８について単一点突然変異分析を行って、ＱＸ００２ＮとＩＸＥがＩＬ−１７Ａ変異体によって誘発されるＳＥＡＰ放出を阻害した結果を分析した。
その結果、ＱＸ００２ＮはＤ８０ＧＮＶＤＹＨ８６のみを認識するが、Ｔ１２５ＰＩＶ１２８を認識しなかった。ＩＸＥはこれら２つの配列を認識した。したがって、ＱＸ００２ＮとＩＸＥによって認識されるエピトープは全く異なる。

図６は、ＩＬ−１７Ａとその受容体との複合体の結晶構造における、ＱＸ００２ＮとＩＸＥによって認識されるエピトープの位置を示す図である。図７は、図６の四角内の部分拡大図である。

［実施例６］ ＱＸ００２Ｎのインビボ活性に関する研究
インターロイキン１７（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７、ＩＬ−１７）は炎症誘発性サイトカインであり、主に活性化された記憶ＣＤ４^＋Ｔリンパ球によって分泌される。ＩＬ−１７が受容体に結合した後、炎症性因子（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ）とケモカイン（ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＩＬ−８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ７）の放出を誘発し、炎症性細胞の浸潤と組織損傷を媒介することができる。また、ＩＬ−１７はその他の炎症性因子（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６など）との相乗効果もあり、その炎症誘発効果を増幅する。研究により、ＩＬ−１７が様々な自己免疫疾患（例えば、乾癬、関節リウマチ、心臓リウマチなど）の発生に関与していることが確認されている。本研究では、ＱＸ００２ＮがＩＬ−１７Ａによって誘発されるマウス体内のＫＣ（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ、すなわち、ケラチノサイト化学誘引物質、ヒトのケモカインＣＸＣＬ−１に相当する）の生成を阻害できることは発見され、ＱＸ００２ＮがインビボでＩＬ−１７Ａの生物学的活性を阻害する機能を有することは示唆された。

実験動物は、６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６メスマウスであった。マウスをランダムに１２群に分け、各群で６匹ずつとし、体重を量った。その中で、２つの群のマウスに２００μｌ ＰＢＳを眼窩静脈叢から注射し、その他の群のマウスに２００μｌの異なる濃度の各群抗体薬剤溶液を眼窩静脈叢から注射した。ＰＢＳまたは抗体薬剤を注射してから１時間後、眼窩静脈叢からＰＢＳを注射した２つの群のマウスのうち、１つの群に２００μｌ ＰＢＳを背中から皮下注射し、もう１つの群およびその他の群のマウスに２００μｌ ＩＬ−１７Ａ（１５μｇ／ｍｌ）を背中から皮下注射した。各群のマウスにＰＢＳまたはＩＬ−１７Ａを注射してから２時間後、眼窩から血液を採取し、全血を室温で２時間静置し、３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、上部血清を吸い取った。ＥＬＩＳＡ法を使用してマウス血清サンプル中のＫＣ含有量を検出した。なお、下記の簡単なフローおよび図８における「３７−５」はすなわち、ＱＸ００２Ｎである。

簡単な実験フローは下記通りである：

実験の結果を図８に示す。これより分かるように、ＱＸ００２Ｎは、ＩＬ−１７Ａによって誘発されるマウス体内のＫＣの放出を阻害でき、しかも一定の抗体濃度依存性を示している。これは、ＱＸ００２ＮがインビボでＩＬ−１７Ａの機能を効果的に阻害でき、インビボでの薬力学的活性を備えることを示唆している。さらに、図８のデータから分かるように、ＱＸ００２Ｎは、現在市販が承認されている薬剤ＳＥＣとＩＸＥと同等またはわずかに優れている効果を持っている。

Claims (15)

1. ３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３）と、３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３）を含み、その中で、
   （ａ）ＣＤＲ−Ｈ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸配列である；
   （ｂ）ＣＤＲ−Ｈ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列である；
   （ｃ）ＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示すアミノ酸配列である；
   （ｄ）ＣＤＲ−Ｌ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示すアミノ酸配列である；
   （ｅ）ＣＤＲ−Ｌ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示すアミノ酸配列である；および
   （ｆ）ＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示すアミノ酸配列である、
   単離された抗ヒトインターロイキン１７Ａモノクローナル抗体。
2. 請求項１に記載のモノクローナル抗体をコードする、単離された核酸。
3. 請求項２に記載の核酸を含む、宿主細胞。
4. 請求項３に記載の宿主細胞を培養して請求項１に記載のモノクローナル抗体を製造することを含む、モノクローナル抗体を製造する方法。
5. 請求項１に記載のモノクローナル抗体および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
6. 自己免疫疾患を治療する薬剤の調製における、請求項１に記載のモノクローナル抗体の使用。
7. 前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、乾癬、クローン病、多発性硬化症、乾癬性関節炎、尋常性乾癬および/または強直性脊椎炎である、請求項６に記載の使用。
8. アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示すアミノ酸配列である重鎖可変領域、アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すアミノ酸配列である軽鎖可変領域を含む、単離された抗ヒトインターロイキン１７Ａモノクローナル抗体。
9. アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すアミノ酸配列である重鎖、アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示すアミノ酸配列である軽鎖を含む、請求項８に記載のモノクローナル抗体。
10. 請求項８に記載のモノクローナル抗体をコードする、単離された核酸。
11. 請求項１０に記載の核酸を含む、宿主細胞。
12. 請求項１０に記載の宿主細胞を培養して請求項８に記載のモノクローナル抗体を製造することを含む、モノクローナル抗体を製造する方法。
13. 請求項８に記載のモノクローナル抗体および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
14. 自己免疫疾患を治療する薬剤の調製における、請求項８に記載のモノクローナル抗体の使用。
15. 前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、乾癬、クローン病、多発性硬化症、乾癬性関節炎、尋常性乾癬および/または強直性脊椎炎である、請求項１４に記載の使用。

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