RU2020141422A

RU2020141422A - Способы получения двуцепочечных белков в бактериях

Info

Publication number: RU2020141422A
Application number: RU2020141422A
Authority: RU
Inventors: Джеймс ДЖУЛЬЯНОТТИ; Доротея РЕЙЛЛИ; Киран ОРОРИ; Лаура К. СИММОНС
Original assignee: Дженентек, Инк.
Priority date: 2014-11-05
Filing date: 2015-11-05
Publication date: 2021-01-13
Also published as: EP3215525A1; CA2966573A1; WO2016073794A1; HRP20201351T1; EP3215525B1; ES2819256T3; US20190085045A1; AU2021236533B2; CN107075548B; WO2016073794A8; US20220162286A1; CN113699203A; SI3215525T1; EP3753948A1; BR112017009262A2; RU2017119396A; CN107075548A; RU2739500C2; KR20170075014A; US10066002B2

Claims

1. Способ получения иммуномобилизующего моноклонального T-клеточного рецептора против рака (ImmTAC), содержащего альфа-цепь Т-клеточного рецептора (TCR) и бета-цепь TCR, в прокариотической клетке-хозяине, причем способ включает:

(а) культивирование клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, включающих температуру при фазе роста и скорость перемешивания при фазе роста,

(b) культивирование клетки-хозяина в культуральной среде для экспрессии альфа-цепи TCR и бета-цепи TCR ImmTAC в условиях, включающих

температуру при фазе образования продукта и скорость перемешивания при фазе образования продукта,

при этом после экспрессии происходит фолдинг и сборка альфа-цепи TCR и бета-цепи TCR с образованием биологически активного ImmTAC в клетке-хозяине;

при этом клетка-хозяин содержит полинуклеотид, содержащий

(1) первую единицу трансляции, кодирующую альфа-цепь TCR ImmTAC;

(2) вторую единицу трансляции, кодирующую бета-цепь TCR ImmTAC; и

(3) третью единицу трансляции, кодирующую по меньшей мере один белок теплового шока, выбранный из группы, состоящей из пептидил-пролил-изомераз; протеиндисульфидоксидоредуктаз и их комбинаций;

где температура при фазе роста находится в диапазоне от около 30°C до около 34°C в течение фазы роста, а температура при фазе образования продукта находится в диапазоне от около 25°С до около 29°C в течение фазы образования продукта, где скорость перемешивания при росте достаточна для достижения клеткой-хозяином в течение фазы роста пиковой скорости поглощения кислорода, которая находится в диапазоне от 3,5 до 4,5 ммоль/л/мин, а скорость перемешивания в течение фазы образования продукта достаточна для достижения клеткой-хозяином в течение фазы образования продукта скорости поглощения кислорода, которая находится в диапазоне от 1,0 до 3,0 ммоль/л/мин; и

(с) выделение биологически активного ImmTAC из клетки-хозяина.

2. Способ по п. 1, где клетка-хозяин дополнительно содержит ролинуклеотид, содержащий:

(4) четвертую единицу трансляции, кодирующую второй белок теплового шока; и

(5) пятую единицу трансляции, кодирующую третий белок теплового шока.

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что полинуклеотид дополнительно содержит три копии промотора, причем первая копия функциональным образом объединена с первой единицей трансляции, вторая копия функциональным образом объединена со второй единицей трансляции, а третья копия функциональным образом объединена с третьей единицей трансляции для запуска транскрипции первой цепи, второй цепи и белка теплового шока.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что промотор представляет собой индуцибельный промотор.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что индуцибельный промотор представляет собой промотор, индуцируемый IPTG, который запускает транскрипцию альфа-цепи TCR, бета-цепи TCR и белка теплового шока в отсутствие IPTG-индукции.

6. Способ по п. 4, отличающийся тем, что индуцибельный промотор представляет собой Pho-промотор, который запускает транскрипцию альфа-цепи TCR, бета-цепи TCR и белка теплового шока при исчерпании фосфата в культуральной среде.

7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что полинуклеотид дополнительно содержит селективный маркер, а культуральная среда содержит селективный агент, состоящий из одиночного антибиотика, вызывающий сохранение полинуклеотида в клетке-хозяине.

8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что первая единица трансляции содержит первую область инициации трансляции (TIR), которая функциональным образом объединена с кодирующей областью альфа-цепи TCR, а вторая единица трансляции содержит вторую область инициации трансляции (TIR), которая функциональным образом объединена с кодирующей областью бета-цепи TCR, причем относительная интенсивность трансляции первой и второй TIR составляет от около 1,0 до около 3,0.

9. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что по меньшей мере один белок теплового шока или первый белок теплового шока включает пептидил-пролил-изомеразу.

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что пептидил-пролил-изомераза представляет собой белок FkpA.

11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что FkpA представляет собой белок FkpA E. coli.

12. Способ по любому из пп. 9-11, отличающийся тем, что по меньшей мере один белок теплового шока включает или один или оба из второго белка теплового шока и третьего белка теплового шока включает протеиндисульфидоксидоредуктазу.

13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что протеиндисульфидоксидоредуктаза представляет собой один или оба из белка DsbA и белка DsbC.

14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что по меньшей мере одна протеиндисульфидоксидоредуктаза представляет собой одну или обе из E. coli DsbA и E. coli DsbC.

15. Способ по любому из пп. 1-14, отличающийся тем, что прокариотическая клетка-хозяин представляет собой грамотрицательную бактерию.

16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что грамотрицательная бактерия представляет собой E. coli.

17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что E. coli принадлежит к штамму с мутацией degpS210A.

18. Способ по п. 16, отличающийся тем, что E. coli представляет собой штамм с генотипом W3110 ΔfhuA ΔphoA ilvG2096 (Val^r ) Δprc spr43H1 ΔdegP ΔmanA lacI ^Q ΔompT ΔmenE degpS210A.

19. Способ по любому из пп. 1-18, отличающийся тем, что альфа-цепь TCR содержит вариабельный домен альфа-цепи TCR и константный домен альфа-цепи TCR, при этом бета-цепь TCR содержит вариабельный домен бета-цепи TCR и константный домен бета-цепи TCR.

20. Способ по любому из пп. 1-19, отличающийся тем, что две цепи ImmTAC связаны друг с другом по меньшей мере одной дисульфидной связью.

21. Способ по любому из пп. 1-20, отличающийся тем, что ImmTAC дополнительно содержит фрагмент антитела, который связывает Т-клетку и активирует Т-клеточный ответ.

22. Способ по п. 21, отличающийся тем, что фрагмент антитела содержит фрагмент одноцепочечного антитела против CD3.

23. Способ по любому из пп. 1-22, отличающийся тем, что ImmTAC содержит TCR, который модифицирован так, чтобы обладать повышенным сродством к антигену, по сравнению со сродством к антигену TCR, который не был модифицирован.

24. Способ по любому из пп. 1-23, отличающийся тем, что ImmTAC выделяют из периплазмы клетки-хозяина.

25. Способ по любому из пп. 1-24, отличающийся тем, что скорость перемешивания при фазе роста превышает скорость перемешивания при фазе образования продукта на 10-40%.