CN107075548B - 在细菌中产生双链蛋白质的方法 - Google Patents

在细菌中产生双链蛋白质的方法 Download PDF

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Abstract

本文提供产生含有两条链的重组多肽诸如包含α链和β链的抗癌免疫动员单克隆T细胞受体(ImmTAC)蛋白的方法。特定来说，提供用于通过利用优化表达载体和培养方法来在细菌中产生异源性分泌蛋白的方法。

Description

在细菌中产生双链蛋白质的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年11月5日提交的美国临时申请号62/075,798的权益，所述美国临时申请以引用的方式整体并入本文。
采用ASCII文本文件进行的序列表提交
采用ASCII文本文件进行的以下提交的内容以引用的方式整体并入本文：计算机可读格式(CRF)的序列表(文件名称：146392035140SEQLIST.TXT，记录日期：2015年11月5日，大小：2KB)。
领域
本公开涉及产生重组多肽诸如抗癌免疫动员单克隆T细胞受体(ImmTAC)蛋白的方法。更具体来说，本公开涉及通过利用优化表达载体和培养方法来在细菌中产生异源性分泌蛋白的方法。
发明背景
自从在1978年在大肠杆菌(E.coli)中产生人胰岛素以来，在原核宿主细胞中产生重组蛋白已成为许多重要治疗剂的来源。因为分子生物学工具和知识已进展，所以重组治疗剂的复杂性也已增加。产生这些重组蛋白要求产物展现诸如适当翻译、折叠、装配、二硫键合以及向周质中转运的性质。已知许多重组蛋白，特别是具有二硫键的那些(例如双链蛋白质，包括不限于抗体和抗体片段)的表达导致在原核宿主细胞中形成包涵体(Spadiut等,Trends in Biotechnology,32:54,2014)。因此，对用于在工业规模上在原核宿主细胞中重组产生适当折叠和装配的双链蛋白质的表达系统和方法存在需求。
单克隆抗体代表一种最快速增长类型的重组治疗剂，其中众多单克隆抗体已被核准或处于审查中来用于治疗各种疾病(Nelson等,Nature Review Drug Discovery,9:767,2010)。传统单克隆抗体结合单一靶标抗原。对于许多疾病，可能有利的是采用结合超过一种靶标抗原的抗体，即多特异性抗体。此类抗体可用于针对多种治疗靶标的组合方法中(参见例如Bostrom等,Science 323:1610,2009；以及Wu等,Nature Biotechnology,25:1290,2007)。举例来说，可产生同时结合在癌细胞的表面上表达的表位和在T细胞上表达的表位以诱导T细胞介导的肿瘤细胞杀灭的双特异性抗体(Shalaby等,Clinical Immunology,74:185,1995)。
在临床中使用双特异性抗体要求能够以工业相关量产生双链蛋白质。尽管已描述改进在原核宿主细胞中的重组蛋白产生的载体组分(参见例如Schlapschy等,ProteinEngineering,Design and Selection,19:385,2006；以及Simmons等,Journal ofImmunological Methods 263:133,2002)，但本文所述的结果证明单独修饰表达载体并不解决在制造双链蛋白质期间遭遇的所有产生问题。仍然需要用于在制备规模上高效产生重组双链蛋白质诸如抗体片段和半抗体的最优方法。
本文引用的所有参考文献包括专利申请、专利公布和UniProtKB/Swiss-Prot登记号都以引用的方式整体并入本文，所述引用的程度就好像明确地和个别地指示将各个别参照文献以引用的方式并入一样。
概述
在一个方面，本文提供在原核宿主细胞中产生包含两条链的多肽的方法，所述方法包括：(a)培养所述宿主细胞以表达所述多肽的所述两条链，借此在表达后，所述两条链折叠并装配以在所述宿主细胞中形成生物活性多肽；其中所述宿主细胞包含多核苷酸，所述多核苷酸包含(1)编码所述多肽的第一链的第一翻译单元；(2)编码所述多肽的第二链的第二翻译单元；和(3)编码至少一种选自由肽基-脯氨酰基异构酶、蛋白质二硫化物氧化还原酶及其组合组成的组的伴侣蛋白的第三翻译单元；其中在培养基中在包括以下的条件下培养所述宿主细胞：包括生长温度和生长搅拌速率的生长期，和包括产生温度和产生搅拌速率的产生期，其中所述生长温度高于所述产生温度2至10℃，并且所述生长搅拌速率高于所述产生搅拌速率50至250rpm；和(b)从所述宿主细胞回收所述生物活性多肽。也提供在原核宿主细胞中产生包含T细胞受体(TCR)α链和TCRβ链的抗癌免疫动员单克隆T细胞受体(ImmTAC)的方法，所述方法包括：(a)在培养基中在包括以下的条件下培养所述宿主细胞以表达所述ImmTAC的所述TCRα链和所述TCRβ链：包括生长温度和生长搅拌速率的生长期，和包括产生温度和产生搅拌速率的产生期，借此在表达后，所述TCRα链和所述TCRβ链折叠并装配以在所述宿主细胞中形成生物活性ImmTAC；其中所述宿主细胞包含多核苷酸，所述多核苷酸包含(1)编码所述ImmTAC的所述TCRα链的第一翻译单元；(2)编码所述ImmTAC的所述TCRβ链的第二翻译单元；和(3)编码至少一种选自由肽基-脯氨酰基异构酶、蛋白质二硫化物氧化还原酶及其组合组成的组的伴侣蛋白的第三翻译单元；其中所述生长温度高于所述产生温度2至10℃，并且所述生长搅拌速率高于所述产生搅拌速率50至250rpm；和(b)从所述宿主细胞回收所述生物活性ImmTAC。也提供在原核宿主细胞中产生包含两条链的多肽的方法，所述方法包括：(a)培养所述宿主细胞以表达所述多肽的所述两条链，借此在表达后，所述两条链折叠并装配以在所述宿主细胞中形成生物活性多肽；其中所述宿主细胞包含多核苷酸，所述多核苷酸包含：(1)编码所述多肽的第一链的第一翻译单元；(2)编码所述多肽的第二链的第二翻译单元；(3)编码第一伴侣蛋白的第三翻译单元；(4)编码第二伴侣蛋白的第四翻译单元；和(5)编码第三伴侣蛋白的第五翻译单元，其中所述第一、第二和第三伴侣蛋白选自由肽基-脯氨酰基异构酶、蛋白质二硫化物氧化还原酶及其组合组成的组；其中在培养基中在包括以下的条件下培养所述宿主细胞：包括生长温度和生长搅拌速率的生长期，和包括产生温度和产生搅拌速率的产生期，其中所述生长温度高于所述产生温度2至10℃，并且所述生长搅拌速率高于所述产生搅拌速率50至250rpm；和(b)从所述宿主细胞回收所述生物活性多肽。也提供在原核宿主细胞中产生包含T细胞受体(TCR)α链和TCRβ链的抗癌免疫动员单克隆T细胞受体(ImmTAC)的方法，所述方法包括：(a)在培养基中在包括以下的条件下培养所述宿主细胞以表达所述ImmTAC的所述TCRα链和所述TCRβ链：包括生长温度和生长搅拌速率的生长期，和包括产生温度和产生搅拌速率的产生期，借此在表达后，所述TCRα链和所述TCRβ链折叠并装配以在所述宿主细胞中形成生物活性ImmTAC；其中所述宿主细胞包含多核苷酸，所述多核苷酸包含：(1)编码所述ImmTAC的所述TCRα链的第一翻译单元；(2)编码所述ImmTAC的所述TCRβ链的第二翻译单元；(3)编码第一伴侣蛋白的第三翻译单元；(4)编码第二伴侣蛋白的第四翻译单元；和(5)编码第三伴侣蛋白的第五翻译单元，其中所述第一、第二和第三伴侣蛋白选自由肽基-脯氨酰基异构酶、蛋白质二硫化物氧化还原酶及其组合组成的组；其中所述生长温度高于所述产生温度2至10℃，并且所述生长搅拌速率高于所述产生搅拌速率50至250rpm；和(b)从所述宿主细胞回收所述生物活性ImmTAC。在一些实施方案中，多肽包含三个、四个或五个链。在一些实施方案中，在产生期期间，使培养基的pH维持在6.7与7.3之间的范围内的pH下。在一些实施方案中，多核苷酸进一步包含启动子的三个拷贝，其中第一拷贝与第一翻译单元可操作组合，第二拷贝与第二翻译单元可操作组合，并且第三拷贝与第三翻译单元可操作组合以驱动第一链、第二链和伴侣蛋白的转录。在一些实施方案中，编码三种伴侣蛋白中的两种的两个翻译单元是单一转录单元(双顺反子单元)的一部分。在一些实施方案中，多核苷酸进一步包含与各翻译单元可操作组合的启动子。在一些实施方案中，启动子诱导型启动子。在一些实施方案中，诱导型启动子是在不存在IPTG诱导下驱动第一链、第二链和伴侣蛋白的转录的IPTG诱导型启动子。在一些实施方案中，诱导型启动子是在不存在IPTG诱导下驱动TCRα链、TCRβ链和伴侣蛋白的转录的IPTG诱导型启动子。在一些实施方案中，诱导型启动子是当培养基中的磷酸盐已耗尽时驱动第一链、第二链和伴侣蛋白的转录的Pho启动子。在一些实施方案中，诱导型启动子是当培养基中的磷酸盐已耗尽时驱动TCRα链、TCRβ链和伴侣蛋白的转录的Pho启动子。在一些实施方案中，多核苷酸进一步包含可选择标记，并且培养基包含由单一抗生素组成的选择剂以致使宿主细胞维持多核苷酸。在一些实施方案中，第一翻译单元包含第一翻译起始区(TIR)与第一链的编码区可操作组合，并且第二翻译单元包含第二翻译起始区(TIR)与第二链的编码区可操作组合，其中所述第一TIR和所述第二TIR的相对翻译强度是约1.0至约3.0。在一些实施方案中，第一翻译单元包含第一翻译起始区(TIR)与TCRα链的编码区可操作组合，并且第二翻译单元包含第二翻译起始区(TIR)与TCRβ链的编码区可操作组合，其中所述第一TIR和所述第二TIR的相对翻译强度是约1.0至约3.0。在一些实施方案中，至少一种伴侣蛋白或第一伴侣蛋白包括肽基-脯氨酰基异构酶。在一些实施方案中，肽基-脯氨酰基异构酶是FkpA蛋白。在一些实施方案中，FkpA是大肠杆菌FkpA。在一些实施方案中，至少一种伴侣蛋白进一步包括蛋白质二硫化物氧化还原酶，或第二伴侣蛋白和第三伴侣蛋白中的一者或两者包括蛋白质二硫化物氧化还原酶。在一些实施方案中，蛋白质二硫化物氧化还原酶是DsbA蛋白和DsbC蛋白中的一者或两者。在一些实施方案中，至少一种蛋白质二硫化物氧化还原酶是大肠杆菌DsbA和大肠杆菌DsbC中的一者或两者。在一些实施方案中，原核宿主细胞是革兰氏阴性细菌(gram-negative bacterium)。在一些实施方案中，革兰氏阴性细菌是大肠杆菌。在一些实施方案中，大肠杆菌是缺乏内源性蛋白酶活性的菌株。在一些实施方案中，大肠杆菌是具有degpS210A突变的菌株。在一些实施方案中，大肠杆菌是具有W3110 ΔfhuA ΔphoA ilvG2096(Valr)Δprc spr43H1 ΔdegP ΔmanA lacIQ ΔompT ΔmenE degpS210A的基因型的菌株。在一些实施方案中，多肽对于宿主细胞是异源性的。在一些实施方案中，多肽是异二聚体(例如双特异性抗体)的单体。在一些实施方案中，TCRα链包含TCRα链可变结构域和TCRα链恒定结构域，并且TCRβ链包含TCRβ链可变结构域和TCRβ链恒定结构域。在一些实施方案中，多肽的两条链由至少一个二硫键彼此连接。在一些实施方案中，ImmTAC的两条链由至少一个二硫键彼此连接。在一些实施方案中，ImmTAC进一步包含结合T细胞，并且活化T细胞应答的抗体片段。在一些实施方案中，抗体片段包括抗CD3单链抗体片段。在一些实施方案中，ImmTAC包含经工程化以相较于尚未经工程化的TCR对抗原的亲和力，对所述抗原具有增加的亲和力的TCR。在一些实施方案中，多肽的两条链由多肽接头彼此连接。在一些实施方案中，多肽是单价抗体，其中第一链和第二链包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链是IgG1或IgG4同种型。在一些实施方案中，单价抗体能够特异性结合抗原。在一些实施方案中，抗原是细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子选自由趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子组成的组。在一些实施方案中，生长因子是血管内皮生长因子。在一些实施方案中，抗原选自由IL-4、IL13、IL-14、IL-17、VEGFA和VEGFC组成的组。在一些实施方案中，多肽是从宿主细胞的周质回收的分泌蛋白。在一些实施方案中，从宿主细胞的周质回收ImmTAC。在一些实施方案中，多肽是抗癌免疫动员单克隆T细胞受体(ImmTAC)，其包含可溶性的亲和力增强的T细胞受体融合于抗CD3单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，在生长期期间，生长温度在约30℃至约34℃的范围内，并且在产生期期间，产生温度在约25℃至约29℃的范围内。在一些实施方案中，在生长期期间，生长搅拌速率在约600至800rpm的范围内，并且在产生期期间，产生搅拌速率在约300至约500rpm的范围内。在一些实施方案中，生长搅拌速率足以实现在生长期期间宿主细胞中氧摄取速率高于在产生期期间宿主细胞中峰值氧摄取速率0.5至2.5mmol/L/min。在一些实施方案中，在生长期期间，宿主细胞的峰值氧摄取速率在3.5至4.5mmol/L/min的范围内，并且在产生期期间，宿主细胞的氧摄取速率在1.0至3.0mmol/L/min的范围内。在一些实施方案中，生长搅拌速率比产生搅拌速率高约10％至约40％(rpm/rpm)。
应了解本文所述的各种实施方案的一种、一些或所有性质可加以组合以形成本公开的其它实施方案。本公开的这些和其它方面将变得为本领域技术人员显而易知。本公开的这些和其它实施方案通过随后详细描述来进一步描述。
附图简述
图1A-C显示从xIL13半抗体(hAb)产生载体获得的总体轻链(LC)和重链(HC)亚单位的产生。图1A提供从TIR1,1(黑色棒条)和TIR2,2(条纹化棒条)产生载体产生的总体LC和HC亚单位的图，如通过RP-HPLC所测量。图1B提供从TIR1,1产生载体产生的LC和HC(黑色棒条)或可溶性LC和HC(灰色棒条)的总体亚单位的图。图1C提供从TIR2,2产生载体产生的总体LC和HC(黑色棒条)或可溶性LC和HC(灰色棒条)的总体亚单位的图。
图2显示在使用TIR1,1(黑色棒条)或TIR2,2(条纹化棒条)hAb产生载体的情况下的xIL13 hAb效价，如通过双柱RP-HPLC所测量。
图3A-B说明蛋白质在细菌宿主细胞中的折叠和装配。图3A是描绘细菌蛋白质产生的示意图，其说明在使用伴侣蛋白的情况下蛋白质在周质中的折叠和装配。图3B是伴侣蛋白的清单，其包括肽基-脯氨酰基异构酶(“Ppi酶”)、氧化还原酶和其它伴侣蛋白。
图4A显示用于筛选FkpA变体的可相容系统。图4B显示编码抗体LC、HC和FkpA的单一xIL13质粒(pxIL13.2.2.FkpAc13)的产生。
图5A-B显示在滴定FkpA表达后xVEGF IgG1 hAb的产生。图5A描绘显示在表达不同水平的FkpA后hAb和可溶性单体重链积累的蛋白质印迹，而考马斯染色凝胶显示在各条件下的总体可溶性蛋白质产生。图5B图显示在表达不同水平的FkpA后产生的hAb的效价。
图6A-B显示在表达不同水平的FkpA后xIL13 IgG4 hAb的产生。图6A提供显示使用不同载体系统产生的xIL13 hAb的效价的图，并且伴有显示在各条件下的hAb和可溶性单体重链积累的蛋白质印迹。图6B提供显示使用不同载体系统产生的FkpA的量的图，并且伴有显示在各条件下的FkpA表达的蛋白质印迹。在两个图版中，“内源性FkpA水平”是指细菌宿主细胞不含有编码FkpA的质粒；“可相容FkpA水平”是指从单独(可相容)质粒表达xIL13和FkpA；并且“单一FkpA水平”是指表达xIL13与FkpA两者的单一载体。
图7A-B显示在诱导型表达FkpA后xIL4 IgG4 hAb的产生。图7A描绘显示hAb和可溶性单体重链积累的蛋白质印迹。图7B提供显示使用诱导型FkpA表达产生的xIL4 hAb的效价的图，并且伴有显示FkpA的表达的蛋白质印迹。在两个图版中，样品1使用TIR1,1载体来产生xIL4 hAb，并且不过度表达FkpA；样品2使用TIR2,2载体来产生xIL4 hAb，并且不过度表达FkpA；样品3使用TIR1,1来产生xIL4 hAb，并且使用IPTG来诱导FkpA表达；并且样品4使用TIR2,2来产生xIL4 hAb，并且使用IPTG来诱导FkpA表达。
图8A-C显示在表达FkpA后xVEGFC IgG1 hAb的产生。图8A提供显示使用不同载体系统产生的xVEGFC hAb的效价的图。图8B描绘显示在两种条件下的总体可溶性蛋白质产生的凝胶，其中FkpA条带如所标记。图8C描绘显示xVEGFC hAb和可溶性单体重链的积累的蛋白质印迹。在所有图版中，样品1使用TIR2,2载体来产生xVEGFC hAb，并且不含有用于表达FkpA的质粒；样品2使用TIR2,2载体来产生xIL4 hAb，并且使用IPTG来诱导FkpA表达。
图9显示采用用于表达xIL13 hAb的第一质粒(pxIL13.2.2.FkpAc13)和用于表达DsbA和DsbC的第二质粒(pJJ247)的可相容质粒系统。
图10提供显示使用xIL13.2.2.FkpAc13产生质粒和用于表达DsbA和DsbC的可相容质粒在有和无IPTG诱导下随时间产生xIL13hAb的图。
图11A显示xIL14 hAb可相容质粒系统。图11B显示编码xIL14hAb LC和HC、FkpA、DsbA以及DsbC的单一质粒的产生。
图12A-B显示在TIR1,1或TIR2,2载体的情况下在不存在FkpA、DsbA和DsbC表达下(1和2，如所标记)；在存在IPTG诱导的FkpA表达(3和4，如所标记)下；以及在存在具有FkpA、DsbA和DsbC的质粒下在不存在IPTG下(5和6，如所标记)的xIL4 hAb产生。图12A描绘显示在各种条件下的xIL4 hAb和可溶性单体重链的积累的蛋白质印迹。图12B提供显示在各种条件下产生的xIL4 hAb的效价的图，并且伴有显示FkpA的表达的蛋白质印迹。
图13显示在TIR2,2载体的情况下在不存在FkpA、DsbA和DsbC表达下(柱1)；在存在IPTG诱导的FkpA表达下(柱2)；以及在具有FkpA、DsbA和DsbC的质粒存在下在不存在IPTG下(柱3)的xVEGFC hAb产生。
图14显示在TIR1,1或TIR2,2载体的情况下在不存在FkpA、DsbA和DsbC表达下(1和3，如所标记)；以及在具有FkpA、DsbA和DsbC的质粒存在下在不存在IPTG下(2和4，如所标记)的xVEGFA IgG1 hAb产生。
图15显示在TIR2,2载体的情况下当FkpA、DsbA和DsbC从同一载体表达时(“单一”)以及当FkpA、DsbA和DsbC从第二可相容载体表达时(“可相容”)，连同无抗体表达载体以及无DsbA、DsbC和FkpA过度表达的阴性对照(“对照”)一起的xIL4 hAb产生。蛋白质印迹显示DsbA、DsbC和FkpA的表达。
图16A显示利用先前描述的pxIL13.2.2.FkpAc13产生质粒和可相容氧化还原酶质粒(pJJ247)的xIL13可相容质粒系统。图16B显示并有来自pxIL13.2.2.FkpAc13和pJJ247的开放阅读框(ORF)的单一质粒(MD157)的产生。
图17显示在TIR2,2载体的情况下当FkpA、DsbA和DsbC从同一载体表达时(“单一”)以及当DsbA和DsbC从可相容载体表达，并且FkpA从xIL13.2.2.FkpAc13载体表达时(“可相容”)xIL13 hAb随时间的产生。这些载体使用phoA启动子来驱动FkpA表达。
图18显示携带以下两种载体的细胞在固定搅拌速率下生长的培养物中随时间的平均氧摄取速率(OUR)：表达xIL13 hAb和FkpA的TIR2,2载体，和在IPTG诱导型启动子下表达DsbA和DsbC的载体。显示在存在或不存在IPTG下生长的培养物的OUR。提供用于各条件的样品数(“N”)。
图19显示携带以下两种载体的细胞在固定搅拌速率下生长的培养物随时间的平均同渗重摩：表达xIL13 hAb和FkpA的TIR2,2载体，和在IPTG诱导型启动子下表达DsbA和DsbC的载体。显示在存在或不存在IPTG下生长的培养物的同渗重摩。提供用于各条件的样品数(“N”)。
图20显示由携带以下两种载体的细胞随时间产生的xIL13 hAb的平均效价：表达xIL13 hAb和FkpA的TIR2,2载体，和在IPTG诱导型启动子下表达DsbA和DsbC的载体。显示在存在或不存在IPTG下生长的培养物所产生的抗体效价。提供用于各条件的样品数(“N”)。
图21显示在650rpm下的搅拌下生长26小时，接着变动至足以实现标记的OUR设置点的较低搅拌速率的培养物中随时间的平均OUR。细胞携带两种载体：表达xIL13 hAb和FkpA的TIR2,2载体，和在不存在IPTG下表达DsbA和DsbC的载体。提供用于各条件的样品数(“N”)。
图22显示在650rpm下的搅拌下生长26小时，接着变动至足以实现标记的OUR设置点的较低搅拌速率的培养物中随时间的平均同渗重摩。细胞携带两种载体：表达xIL13 hAb和FkpA的TIR2,2载体，和在不存在IPTG下表达的载体。提供用于各条件的样品数(“N”)。
图23显示在650rpm下的搅拌下生长26小时，接着变动至足以实现标记的OUR设置点的较低搅拌速率的培养物在两个时间点(54和72小时)的平均xIL13 hAb产生效价。细胞携带两种载体：表达xIL13 hAb和FkpA的TIR2,2载体，和在不存在IPTG下表达DsbA和DsbC的载体。提供用于各条件的样品数(“N”)。
图24显示从也编码由phoA启动子驱动的FkpA以及由tacII启动子驱动的DsbA和DsbC的TIR2,2载体在不存在IPTG下产生xIL13hAb的培养物随时间的平均细胞密度(OD550nm)。对于生长与产生(Tg/Tp)两个时期，均使培养物在28℃或30℃的恒定温度下生长。在进入发酵26小时进行搅拌变动。提供用于各条件的样品数(“N”)。
图25显示从也编码由phoA启动子驱动的FkpA以及由tacII启动子驱动的DsbA和DsbC的TIR2,2载体在不存在IPTG下产生xIL13hAb的细胞的培养物随时间的平均OUR。对于生长与产生(Tg/Tp)两个时期，均使培养物在28℃或30℃的恒定温度下生长。提供用于各条件的样品数(“N”)。
图26显示从也编码由phoA启动子驱动的FkpA以及由tacII启动子驱动的DsbA和DsbC的TIR2,2载体在不存在IPTG下产生xIL13hAb的细胞的培养物中随时间的平均磷酸盐浓度。对于生长与产生(Tg/Tp)两个时期，均使培养物在28℃或30℃的恒定温度下生长。提供用于各条件的样品数(“N”)。
图27显示细胞培养物中从也编码由phoA启动子驱动的FkpA以及由tacII启动子驱动的DsbA和DsbC的TIR2,2载体在不存在IPTG下产生的xIL13 hAb的平均效价。对于生长与产生(Tg/Tp)两个时期，均使培养物在28℃或30℃的恒定温度下生长。
图28显示从也编码由phoA启动子驱动的FkpA以及由tacII启动子驱动的DsbA和DsbC的TIR2,2载体在不存在IPTG下产生xIL13hAb的培养物随时间的平均细胞密度(OD550nm)。使培养物在28℃或30℃(分别Tg/Tp 28℃或Tg/Tp 30℃)的恒定温度下生长，或在生长期期间在30℃下生长，接着对于产生期变动至28℃(Tg 30Tp 28)。提供用于各条件的样品数(“N”)。
图29显示从也编码由phoA启动子驱动的FkpA以及由tacII启动子驱动的DsbA和DsbC的TIR2,2载体在不存在IPTG下产生xIL13hAb的细胞的培养物中随时间的平均磷酸盐浓度。使培养物在28℃或30℃(分别Tg/Tp 28℃或Tg/Tp 30℃)的恒定温度下生长，或在生长期期间在30℃下生长，接着对于产生期变动至28℃(Tg 30Tp)。提供用于各条件的样品数(“N”)。
图30显示从也编码由phoA启动子驱动的FkpA以及由tacII启动子驱动的DsbA和DsbC的TIR2,2载体在不存在IPTG下产生xIL13hAb的细胞的培养物随时间的OUR。使培养物在28℃或30℃(分别Tg/Tp 28℃或Tg/Tp 30℃)的恒定温度下生长，或在生长期期间在30℃下生长，接着对于产生期变动至28℃(Tg 30Tp 28)。提供用于各条件的样品数(“N”)。
图31显示从也编码由phoA启动子驱动的FkpA以及由tacII启动子驱动的DsbA和DsbC的TIR2,2载体在不存在IPTG下随时间产生的xIL13 hAb的平均效价。使培养物在如所标记的28℃或30℃(分别Tg/Tp 28℃或Tg/Tp 30℃)的恒定温度下生长，或在生长期期间在30℃下生长，接着对于产生期变动至28℃(Tg 30Tp 28)。
图32显示在单一质粒(MD157)的情况下，在通过附表中的样式标识的不同工艺条件下对xIL13 hAb效价的部分析因实验设计(DoE)分析的结果。
图33显示从也编码由tacII启动子驱动的FkpA、DsbA和DsbC的TIR2,2载体在不存在IPTG下产生的xIL4 hAb的效价。使培养物在30℃(Tg/Tp 30℃)的恒定温度下生长，或在生长期期间在34℃下生长，接着对于产生期变动至25℃(Tg 34Tp 25)。
图34显示在单一质粒(MD341)的情况下，在通过附表中的样式标识的不同工艺条件下对xIL17 hAb效价的部分析因实验设计(DoE)分析的结果。
图35显示首先优化伴侣蛋白共表达，接着优化方法步骤(例如搅拌速率、Tg和Tp)对xIL13 hAb效价的影响。
图36A显示由在66F8和67A6宿主菌株的情况下进行的发酵获得的可溶性xIL13hAb效价。图36B显示在66F8与67A6两种宿主菌株的情况下在72小时的总体xIL13轻链和重链浓度。对于两种条件，N＝2。
图37A显示由在66F8和67A6宿主菌株的情况下在恒定发酵温度下进行的发酵获得的可溶性xIL4 hAb效价。图37B显示由在66F8和67A6宿主菌株的情况下在采用温度变动的发酵条件下进行的发酵获得的总体可溶性xIL4 hAb效价。对于两种条件，N＝2。
图38A显示xIL4轻链效价，并且图38B显示xIL4重链效价，所述效价由在66F8和67A6宿主菌株的情况下在采用温度变动的发酵条件下进行的发酵获得。对于两种条件，N＝2。
图39提供xIL33 hAb分泌质粒的图谱。LC和HC开放阅读框独立地与TIR2可操作组合加以放置。
图40说明在不存在共表达伴侣蛋白DsbA、DsbC、FkpA下在30℃的恒定温度下进行的发酵中(基础情况)，以及在伴侣蛋白DsbA、DsbC和FkpA共表达存在下在相同工艺条件下进行的发酵中(具有伴侣蛋白)xIL33 hAb的积累。
图41显示由用含有伴侣蛋白FkpA、DsbA、DsbC的xIL33 hAb单一质粒进行的实验设计(DoE)获得的aIL33 hAb效价差异。DoE因素包括pH、生长温度(Tg)、产生温度(Tp)和产生期目标氧摄取速率(OUR)。
图42提供TIR1(SEQ ID NO:1)、TIR2(SEQ ID NO:2)和TIR3(SEQ ID NO:3)FkpA信号序列变体的核苷酸序列。在特定密码子的第三位置中进行单一核苷酸取代，并且代表不改变FkpA信号肽序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的同义密码子变化。
图43显示FkpA TIR变体相对于TIR1 FkpA变体(质粒19)的定量强度。
图44显示在用TIR1、TIR2和TIR3 FkpA TIR变体进行的发酵中xIL13 hAb的积累。对于TIR1、TIR2和TIR3变体，在各条件下产生的效价分别是1.5、2.5和4.0g/L。
图45显示在用TIR1、TIR2和TIR3 FkpA TIR变体进行的发酵中xIL33 hAb的积累。
图46显示在用TIR1、TIR2和TIR3 FkpA变体进行的发酵中xIL17 hAb的积累的图。
图47A显示在用FkpA TIR变体进行的发酵中xIL13 hAb的积累的图。图47B显示在发酵结束时由xIL13 hAb方法获得的可溶性部分中存在的FkpA的水平。
图48A显示改变的氧转移速率(OTR)发酵条件和对照发酵条件的氧摄取速率(OUR)。改变的OTR发酵和对照发酵实现约5mmol/L/min的类似峰值OUR和2.75mmol/L/min的类似搅拌变动后目标OUR。图48B显示改变的OTR发酵条件和对照发酵条件的生长图谱。改变的OTR发酵和对照发酵具有类似生长图谱，并且两者均实现峰值OD550 250。xIL13 hAb对照(对照)最佳条件＝1巴背压(BP)，20标准升/分钟(SLPM)，和650至475rpm的搅拌速率变动。xIL13 hAb改变的OTR条件＝0.3巴背压，13SLPM，和880至650rpm的搅拌速率变动。
图49显示改变的OTR条件和对照条件的xIL13 hAb积累图谱。改变的条件和对照条件在发酵期间具有类似积累图谱，并且两者均在72小时分别实现最大平均效价4.1和4.2g/L。
图50A-50B说明TIR1,1 ImmTAC 1产生质粒的质粒构型(图50A)以及对TIR1,1的描绘(图50B)。
图51说明用于产生ImmTAC的原始(即未优化)发酵方法。
图52显示在发酵过程结束时积累的经装配ImmTAC的量以及α和β亚单位的总量。
图53提供ImmTAC产生质粒和含有在tac启动子的控制下的FkpA ORF的可相容质粒的质粒图谱。
图54A显示以下条件的可溶性和可溶性还原抗α和抗β蛋白质印迹：无伴侣蛋白(TIR1,1)，具有FkpA(+FkpA)，阴性对照(-)，以及ImmTAC 1阳性对照(ImmTAC DP)。箭号指定经装配ImmTac。图54B显示单独TIR1,1条件以及TIR1,1与FkpA一起的条件的最终效价。
图55说明用于产生ImmTAC的改进发酵工艺条件。
图56A-56B显示以下条件的可溶性和可溶性还原抗α(图56A)和抗β(图56B)蛋白质印迹：无伴侣蛋白(TIR1,1)，具有FkpA(+FkpA)，具有FkpA并使用新工艺条件(新工艺条件+FkpA)，阴性对照(-)，以及ImmTAC 1阳性对照(ImmTAC DP)。
图57显示以下条件的最终效价：TIR1,1；TIR1,1与FkpA一起；以及TIR1,1与FkpA一起并使用新工艺条件。
图58说明并有ImmTACα链和β链ORF以及在phoA启动子的控制下的FkpA ORF的单一质粒的构建。
图59A显示并有FkpA ORF的TIR1,1；TIR1,2；和TIR2,3单一质粒的最终ImmTAC 1效价。图59B显示并有FkpA ORF的TIR1,1；TIR1,2；和TIR2,3单一质粒的αImmTAC链与βImmTAC链两者的最终亚单位积累。
图60A显示针对由用ImmTAC TIR1,1产生质粒和可相容FkpA质粒以及含有FkpAORF的单一TIR1,1质粒进行的发酵获得的FkpA加以探测的蛋白质印迹。图60B显示以下条件的最终效价：仅TIR1,1；TIR1,1与FkpA一起；TIR1,1FkpA可相容质粒系统；以及TIR1,1FkpA单一质粒系统。
图61提供含有FkpA、α链和β链ORF的ImmTAC产生质粒和含有在tac启动子的控制下的氧化还原酶(例如DsbC)的可相容质粒的质粒图谱。
图62显示由用并有FkpA ORF的TIR1,1单一质粒与含有单独DsbA、单独DsbC、或组合DsbA和DsbC的ORF的可相容质粒一起进行的发酵获得的最终效价。
图63显示由用单独TIR1,1单一质粒；TIR1,1单一质粒与DsbC可相容质粒一起；以及TIR2,3单一质粒与DsbC可相容质粒一起进行的发酵获得的最终效价。
图64显示使用以上优化，从初始TIR1,1产生质粒至TIR2,3单一质粒与DsbC可相容质粒一起在最终效价方面的累积增加。
图65A-65B显示在TIR2,3产生质粒与以及不与可相容FkpA质粒一起的情况下；以并有FkpA ORF的单一TIR1,1和TIR2,3质粒形式；以及以并有FkpA ORF的单一TIR1,1和TIR2,3质粒与可相容DsbC质粒一起的形式测试的ImmTAC 2分子。提供显示α(图65A)和β(图65B)链的产生的蛋白质印迹。
详细描述
本文提供的实施例证明与编码多链蛋白质的各链(例如半抗体的轻链和重链)的翻译单元组合共表达一种或多种特异性伴侣蛋白使原核宿主细胞系统中经装配多链蛋白质的产生增加。实施例进一步证明随后方法改进诸如用于某些发酵时期的特定温度和搅拌速率导致超过表达载体改进的在产生和稳健性方面的显著增强。总之，本文所述的方法实现示例性双链多肽(例如半抗体)的产生增加至少10倍。
在一个方面，本文提供通过以下方式来在原核宿主细胞中产生含有两条链的多肽的方法：培养所述宿主细胞以表达所述多肽的所述两条链，其中在表达后，所述两条链折叠并装配以在所述宿主细胞中形成生物活性多肽；其中所述宿主细胞含有多核苷酸，其包括(1)编码所述多肽的第一链的第一翻译单元；(2)编码所述多肽的第二链的第二翻译单元；和(3)编码至少一种选自肽基-脯氨酰基异构酶、蛋白质二硫化物氧化还原酶及其组合的伴侣蛋白的第三翻译单元；其中在培养基中在包括以下的条件下培养所述宿主细胞：包括生长温度和生长搅拌速率的生长期，和包括产生温度和产生搅拌速率的产生期，其中所述生长温度高于所述产生温度2至10℃，并且所述生长搅拌速率高于所述产生搅拌速率50至250rpm；和(b)从所述宿主细胞回收所述生物活性多肽。在一个方面，多肽由两条链组成，而在另一方面，多肽包含三个、四个、五个或更多个链。
在另一方面，本文提供通过以下方式来在原核宿主细胞中产生含有两条链的多肽的方法：培养所述宿主细胞以表达所述多肽的所述两条链，其中在表达后，所述两条链折叠并装配以在所述宿主细胞中形成生物活性多肽；其中所述宿主细胞含有多核苷酸，其包括(1)编码所述多肽的第一链的第一翻译单元；(2)编码所述多肽的第二链的第二翻译单元；(3)编码第一伴侣蛋白的第三翻译单元；(4)编码第二伴侣蛋白的第四翻译单元；和(5)编码第三伴侣蛋白的第五翻译单元，其中所述第一、第二和第三伴侣蛋白选自肽基-脯氨酰基异构酶、蛋白质二硫化物氧化还原酶及其组合；其中在培养基中在包括以下的条件下培养所述宿主细胞：包括生长温度和生长搅拌速率的生长期，和包括产生温度和产生搅拌速率的产生期，其中所述生长温度高于所述产生温度2至10℃，并且所述生长搅拌速率高于所述产生搅拌速率50至250rpm；和(b)从所述宿主细胞回收所述生物活性多肽。在一个方面，多肽由两条链组成，而在另一方面，多肽包含三个、四个、五个或更多个链。
I.定义
在详细描述本公开之前，应了解本公开不限于可当然变化的特定组合物或生物系统。也应了解本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不意图具有限制性。
除非内容另外明确指示，否则如本说明书和随附权利要求中所用，单数形式“一”和“所述”包括复数个指示物。因此，举例来说，提及“一分子”任选包括两种或更多种所述分子的组合等。
如本文所用的术语“约”是指相应值的易于为本技术领域中的熟练人士所知的通常误差范围。在本文中提及“约”某一值或参数包括(并且描述)有关那个值或参数本身的实施方案。在最大限度下，如本文关于某一值所用的术语“约”涵盖那个值的90％至110％(例如第一TIR和第二TIR的约1.0至约3.0的相对翻译强度是指相对翻译强度在0.9与3.3之间的范围内)。
应了解本文所述的本公开的方面和实施方案包括“包含”方面和实施方案，“由方面和实施方案组成”，以及“基本上由方面和实施方案组成”。
如本文所用的术语“包含两条链的多肽”(术语“双链蛋白质”和“双链多肽”也可在本文中可互换使用)意指含有超过一个不同多肽链的任何多肽。在一些实施方案中，双链蛋白质可包括两个或更多个多肽通过一个或多个分子间键包括不限于二硫键连接在一起的大分子复合物。在一些实施方案中，双链蛋白质可包括具有属于两个不同多肽链(例如抗体重链和抗体轻链)的由多肽接头连接的氨基酸序列的单一多肽。在这个情况下，双链蛋白质可在实体上代表单链，但所述单链的两个或更多个部分可在功能上表现得好像它们是两个单独蛋白质链一样。举例来说，单链抗体可包括功能性重链和功能性轻链，其尽管由多肽接头接合，但折叠和装配得好像它们是仅由分子间键(例如一个或多个二硫键)缔合的单独多肽一样。
如本文所用的术语“载体”意指能够转运它已与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指可将额外DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。另一类型的载体是噬菌体载体。另一类型的载体是病毒载体，其中可将额外DNA区段连接至病毒基因组中。某些载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如非游离型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞中后被整合至所述宿主细胞的基因组中，并且由此连同宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们所操作性地连接的基因的表达。所述载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“重组载体”)。一般来说，在重组DNA技术方面具有效用的表达载体常呈质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最通常使用的载体形式。
如本文所用的术语“顺反子”意指大致等效于翻译单元的遗传元件，其包含编码多肽链和邻近控制区的核苷酸序列。“顺反子”可包括例如一个或多个开放阅读框、翻译起始区(TIR；如下文所定义)、信号序列和终止区。
“多顺反子”表达载体是指含有和表达在一个单一启动子的调控控制下的多个顺反子的单一载体。多顺反子载体的一常见实例是“双顺反子”载体，其含有和表达在一个启动子的控制下的两种不同多肽。在表达双顺反子或多顺反子载体后，多个基因首先被转录成单一转录单元，接着分开翻译。
“转录单元”是指被转录成单一RNA转录物的多核苷酸。“翻译单元”是指多核苷酸的编码以及在翻译时产生多肽的区段。如上所述，多顺反子多核苷酸可含有具有多个翻译单元的单一转录单元。
本公开的“单独顺反子”表达载体是指包含至少两对单独启动子-顺反子的单一载体，其中各顺反子在它的自身启动子的控制下。在表达单独顺反子表达载体后，不同基因的转录过程与翻译过程两者均是分开的和独立的。
如本文所用的“伴侣蛋白”是指有助于其它大分子包括不限于双链蛋白质的折叠或装配的任何蛋白质。通常，伴侣蛋白可通过许多不同机理来起促进蛋白质折叠或装配的作用。举例来说，伴侣蛋白可促进蛋白质折叠和/或装配，催化链内二硫键的形成，促进蛋白质展开和/或解散(例如聚集或错误折叠的蛋白质或多蛋白复合物的展开和/或解散)，防止聚集，有助于蛋白质降解等。
如本文所用的“翻译起始区(translation initiation region)”或TIR或翻译起始区(translational initiation region)或翻译起始序列是指提供目标基因的翻译起始的效率的核酸区域。一般来说，特定顺反子内的TIR涵盖核糖体结合位点(RBS)和在RBS的5'和3'的序列。RBS被定义为至少含有Shine-Dalgarno区域和起始密码子(AUG)。因此，TIR也包括至少一部分待翻译的核酸序列。优选地，本公开的TIR包括顺反子内编码信号肽的在编码轻链或重链的序列之前的分泌信号序列。TIR变体含有TIR区域内的改变TIR的性质诸如如下文定义的它的翻译强度的序列变体(特别是取代)。优选地，本公开的TIR变体含有顺反子内分泌信号序列的前2至约14个，优选约4至12个，更优选约6个密码子内的序列取代，所述分泌信号序列在编码轻链或重链的序列之前。
如本文所用的术语“翻译强度”是指在控制系统中对分泌多肽的测量结果，其中TIR的一种或多种变体用于指导多肽的分泌，并且将结果与在相同培养和测定条件下的野生型TIR或某一其它对照进行比较。在不受限于任一理论下，如本文所用的“翻译强度”可包括例如且不限于对mRNA稳定性、核糖体结合核糖体结合位点的效率等的测量结果。
“分泌信号序列”或“信号序列”是指编码短信号肽的核酸序列，所述短信号肽可用于指导新合成的目标蛋白质穿过细胞膜，通常是原核生物的内膜或内膜与外膜两者。因此，目标蛋白质诸如免疫球蛋白轻链或重链多肽被分泌至原核宿主细胞的周质中或培养基中。由分泌信号序列编码的信号肽对于宿主细胞可为内源性的，或它们可为外源性的，包括对于待表达的多肽是天然的信号肽。分泌信号序列通常存在于待表达的多肽的氨基末端，并且通常在生物合成与从细胞质分泌多肽之间被酶促移除。因此，信号肽通常不存在于成熟蛋白质产物中。
“可操作地连接”是指两个或更多个组分的毗邻，其中如此描述的组分处于容许它们以它们的预定方式起作用的关系。举例来说，如果启动子以顺式起控制或调节编码序列的转录的作用，那么它可操作地连接于所连接序列。通常而非必定，“可操作地连接的”DNA序列是连续的，并且当为接合两个蛋白质编码区所必需时或在分泌前导物的情况下，是连续的并处于阅读框中。然而，尽管可操作地连接的启动子通常位于编码序列的上游，但它未必与它连续。可操作地连接的增强子可位于编码序列的上游、编码序列内或编码序列的下游，并且处于与启动子的可观距离下。连接通过本领域中已知的重组方法来实现，例如使用PCR方法，通过退火，或通过在适宜限制位点处进行连接。如果适宜限制位点不存在，那么依照常规规范使用合成寡核苷酸衔接头或接头。
如本文所用的“调控元件”是指以顺式存在，为将编码异源性多肽的多核苷酸转录和翻译成多肽所必需的核苷酸序列。转录调控元件通常包括在待表达的基因序列的5'的启动子、转录起始和终止位点、以及多聚腺苷酸化信号序列。术语“转录起始位点”是指构建体中对应于并入初级转录物即mRNA前体中的第一核酸的核酸；转录起始位点可与启动子序列重叠。
“启动子”是指控制它所可操作地连接的基因或序列的转录的多核苷酸序列。启动子包括用于RNA聚合酶结合和转录起始的信号。所用启动子将在宿主细胞的细胞类型中具有功能性，其中涵盖表达所选序列。来自多种不同来源的许多启动子包括组成型、诱导型和阻遏型启动子在本领域中是熟知的(并且在诸如GenBank的数据库中加以标识)，并且可以经克隆多核苷酸形式或在经克隆多核苷酸内获得(从例如诸如ATCC的寄存处以及其它商业或个体来源)。在诱导型启动子的情况下，启动子的活性响应于信号例如存在IPTG或磷酸盐耗尽而增加或降低。
如本文所用的术语“宿主细胞”(或“重组宿主细胞”)意指通过引入外源性多核苷酸诸如重组质粒或载体而已被遗传改变，或能够被遗传改变的细胞。应了解所述术语意图不仅指代特定主题细胞，而且指代这种细胞的子代。因为某些修饰可由于突变或环境影响而发生在继代中，所以所述子代可能实际上不与亲本细胞相同，但仍然被包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
术语“药物制剂”是指以下制剂：其呈使得容许活性成分的生物活性有效的形式，并且其不含有对制剂所将施用的受试者具有不可接受的毒性的额外组分。所述制剂是无菌的。“药学上可接受的”赋形剂(媒介物、添加剂)是可合理地向主题哺乳动物施用以提供采用的活性成分的有效剂量的那些。
“受试者”或“个体”出于治疗的目的是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家养动物和农场动物、以及动物园动物、运动动物或玩赏动物，诸如狗、马、猫、母牛等。优选地，哺乳动物是人。
术语“抗体”在本文中在最广泛意义上使用，并且明确涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展现所需生物活性即可。
“经分离”抗体是已被鉴定并与它的天然环境的组分分离和/或从所述组分回收的抗体。它的天然环境的污染物组分是将干扰抗体的研究、诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，抗体被纯化(1)以获得大于95重量％的抗体，如通过例如洛利(Lowry)方法所测定，并且在一些实施方案中，以获得大于99重量％；(2)以达到足以通过使用例如旋转杯测序仪获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)以达到使用例如考马斯(Coomassie)蓝或银染色在还原性或非还原性条件下通过SDS-PAGE确定的均质性。经分离抗体包括重组细胞内原位抗体，因为将不存在抗体的天然环境的至少一种组分。然而，通常，将通过至少一个纯化步骤来制备经分离抗体。
“天然抗体”通常是具有约150,000道尔顿(dalton)，由两个相同轻(L)链和两个相同重(H)链组成的异四聚糖蛋白。各轻链通过一个共价二硫键连接于重链，而在不同免疫球蛋白同种型的重链之间，二硫键的数目有变化。各重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫桥。各重链在一端具有可变结构域(VH)，继之以许多恒定结构域。各轻链具有在一端的可变结构域(VL)和在它的另一端的恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对准，而轻链可变结构域与重链的可变结构域对准。据信特定氨基酸残基形成轻链可变结构域与重链可变结构域之间的界面。
术语“恒定结构域”是指免疫球蛋白分子的相对于免疫球蛋白的含有抗原结合位点的其它部分即可变结构域具有更保守氨基酸序列的部分。恒定结构域含有重链的CH1、CH2和CH3结构域(总称为CH)和轻链的CHL(或CL)结构域。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指所述抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变结构域可被称为“VH”。轻链的可变结构域可被称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变部分，并且含有抗原结合位点。
术语“可变”是指以下事实：在抗体之间可变结构域的某些部分在序列方面广泛不同，并且被用于各特定抗体对它的特定抗原的结合性和特异性方面。然而，可变性并非均匀分布在抗体的整个可变结构域中。在轻链可变结构域与重链可变结构域两者中，它均集中在三个称为高变区(HVR)的区段中。可变结构域的更高度保守部分被称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个主要采用β折叠片构型，由三个HVR连接的FR区，所述HVR形成连接β折叠片结构，以及在一些情况下形成β折叠片结构的一部分的环。各链中的HVR通过FR区紧密邻近固持在一起，并且与来自另一链的HVR一起促进形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定结构域不直接涉及抗体结合抗原，但展现各种效应物功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
来自任何哺乳动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”都可基于它们的恒定结构域的氨基酸序列来被指定为两种称为kappa(“κ”)和lambda(“λ”)的明确不同类型中的一种。
如本文所用的术语IgG“同种型”或“子类”意指免疫球蛋白的根据它们的恒定区的化学和抗原特征来定义的任何子类。
视抗体(免疫球蛋白)的重链的恒定结构域的氨基酸序列而定，抗体(免疫球蛋白)可被指定为不同类别。存在五种主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的若干可进一步分成子类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于免疫球蛋白的不同类别的重链恒定结构域被分别称为α、γ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是熟知的，并且一般地描述于例如Abbas等Cellular andMol.Immunology,第4版(W.B.Saunders,Co.,2000)中。抗体可为通过所述抗体与一种或多种其它蛋白质或肽的共价或非共价缔合形成的较大融合分子的一部分。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“完全抗体”在本文中可互换用于指代呈它的大致上完整形式的抗体，而非如下定义的抗体片段。所述术语特别是指具有含有Fc区的重链的抗体。
“裸抗体”出于本文目的是未缀合于细胞毒性部分或放射性标记的抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。在一些实施方案中，本文所述的抗体片段是抗原结合片段。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；微型双功能抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
木瓜蛋白酶消化抗体会产生两个相同抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有单一抗原结合位点；以及残余“Fc”片段，其名称反映它能够易于结晶。胃蛋白酶处理会产生具有两个抗原结合位点，并且仍然能够交联抗原的F(ab')2片段。
“Fv”是含有完全抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域呈紧密非共价缔合的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可由柔性肽接头共价连接以使轻链和重链可以与在双链Fv种类的情况下的结构类似的“二聚”结构缔合。就是在这个构型的情况下，各可变结构域的三个HVR相互作用以在VH-VL二聚体的表面上界定抗原结合位点。总之，六个HVR对抗体赋予抗原结合特异性。然而，即使单一可变结构域(或仅包含三个对抗原具有特异性的HVR的半个Fv)也能够识别和结合抗原，但亲和力低于整个结合位点。
Fab片段含有重链可变结构域和轻链可变结构域，并且也含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段因在重链CH1结构域的羧基末端添加有少许残基而不同，所述残基包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab'-SH是在本文中对Fab'的标号，其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带游离硫醇基团。F(ab')2抗体片段最初以在它们之间具有铰链半胱氨酸的各对Fab'片段形式产生。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH结构域和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。通常，scFv多肽进一步包含在VH结构域与VL结构域之间的使得scFv能够形成为抗原结合所需的结构的多肽接头。对于scFv的综述，参见例如Pluckthün,ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,(Springer-Verlag,New York,1994),第269-315页。
术语“微型双功能抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述片段包含在同一多肽链(VH-VL)中重链可变结构域(VH)连接于轻链可变结构域(VL)。通过使用太短以致不允许在同一链上的两个结构域之间配对的接头，结构域被迫与另一链的互补结构域配对，并且产生两个抗原结合位点。微型双功能抗体可为二价的或双特异性的。微型双功能抗体更充分描述于例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)；以及Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)中。微型三功能抗体和微型四功能抗体也描述于Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)中。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从大致上同质抗体群体获得的抗体，例如构成所述群体的个别抗体是相同的，例外之处是可少量存在的可能突变，例如天然存在的突变。因此，修饰语“单克隆”将抗体的特性指示为不是个别抗体的混合物。在某些实施方案中，这种单克隆抗体通常包括包含结合靶标的多肽序列的抗体，其中靶标结合性多肽序列通过包括从多种多肽序列选择单一靶标结合性多肽序列的方法来获得。举例来说，选择方法可为从多种克隆诸如一池杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆选择独特克隆。应了解可进一步改变所选靶标结合性序列例如以改进对靶标的亲和力，使靶标结合性序列人源化，改进它在细胞培养物中的产生，降低它的体内免疫原性，产生多特异性抗体等，并且包含改变的靶标结合性序列的抗体也是本公开的单克隆抗体。不同于通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂，单克隆抗体制剂的各单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除它们的特异性之外，单克隆抗体制剂在它们通常未受其它免疫球蛋白污染方面也是有利的。
修饰语“单克隆”将抗体的特性指示为从大致上同质抗体群体获得，并且不应解释为需要通过任何特定方法来产生抗体。举例来说，待根据本公开使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括例如在原核宿主细胞中表达，杂交瘤方法(例如Kohler和Milstein,Nature,256:495-97(1975)；Hongo等,Hybridoma,14(3):253-260(1995)，Harlow等,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版1988)；Hammerling等,Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))，重组DNA方法(参见例如美国专利号4,816,567)，噬菌体展示技术(参见例如Clackson等,Nature,352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；以及Lee等,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)，以及用于在具有编码人免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因座或基因的部分或全部的动物中产生人抗体或人样抗体的技术(参见例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等,Year in Immunol.7:33(1993)；美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；Marks等,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996)；以及Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。
本文单克隆抗体明确包括“嵌合”抗体，其中一部分重链和/或轻链与源于特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与源于另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源，以及所述抗体的片段，只要它们展现所需生物活性即可(参见例如美国专利号4,816,567；以及Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。嵌合抗体包括
Figure BDA0001284997960000281
抗体，其中抗体的抗原结合区源于通过例如用目标抗原使猕猴免疫所产生的抗体。
非人(例如鼠类)抗体的“人源化”形式是含有源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的HVR的残基被来自非人物种(供者抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的HVR的具有所需特异性、亲和力和/或能力的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的FR残基被相应非人残基替换。此外，人源化抗体可包含不见于接受者抗体中或供者抗体中的残基。可进行这些修饰以进一步改善抗体性能。一般来说，人源化抗体将包含大致上全部至少一个，并且通常两个可变结构域，其中全部或大致上全部高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，并且全部或大致上全部FR是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选也将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的至少一部分恒定区。对于进一步细节，参见例如Jones等,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。也参见例如Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions23:1035-1038(1995)；Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；以及美国专利号6,982,321和7,087,409。
“人抗体”是具有对应于由人产生和/或已使用如本文公开的用于制备人抗体的任何技术制备的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列的抗体。对人抗体的这个定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可使用本领域中已知的各种技术包括噬菌体展示文库来产生人抗体。Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。也可用于制备人单克隆抗体的是Cole等,Monoclonal Antibodies andCancer Therapy,Alan R.Liss,第77页(1985)；Boerner等,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)中所述的方法。也参见van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。可通过向转基因动物施用抗原来制备人抗体，所述转基因动物已被修饰来应答于抗原激发产生所述抗体，但其内源性基因座已被失能，例如经免疫异种小鼠(关于XENOMOUSETM技术，参见例如美国专利号6,075,181和6,150,584)。关于通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体，也参见例如Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。
“物种依赖性抗体”是对来自第一哺乳动物物种的抗原具有的结合亲和力比它对那个抗原的来自第二哺乳动物物种的同源物具有的结合亲和力强烈的抗体。通常，物种依赖性抗体“特异性结合”人抗原(例如具有至多约1x10-7M，优选至多约1x10-8M，并且优选至多约1x10-9M的结合亲和力(Kd)值)，但对所述抗原的来自第二非人哺乳动物物种的同源物具有比它对所述人抗原的结合亲和力弱至少约50倍，或至少约500倍，或至少约1000倍的结合亲和力。物种依赖性抗体可为如上定义的各种类型的抗体中的任一种，但优选是人源化抗体或人抗体。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”当在本文中使用时是指抗体可变结构域的在序列方面高度可变和/或形成结构确定的环的区域。通常，抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3显示六个HVR的最大多样性，并且特定来说据信H3在对抗体赋予精细特异性方面起独特作用。参见例如Xu等,Immunity 13:37-45(2000)；Johnson和Wu,Methods in Molecular Biology 248:1-25(Lo编,HumanPress,Totowa,N.J.,2003)。实际上，天然存在的仅由重链组成的骆驼科动物抗体在不存在轻链下具有功能性和稳定性。参见例如Hamers-Casterman等,Nature 363:446-448(1993)；Sheriff等,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。
许多HVR描绘处于使用中，并且涵盖在本文中。Kabat互补决定区(CDR)基于序列可变性，并且被最通常使用(Kabat等,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。Chothia改为涉及结构环的位置(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR代表Kabat HVR与Chothia结构环之间的折中，并且由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。“接触”HVR基于对可用复合物晶体结构的分析。以下指示来自这些HVR各自的残基。
表1a.抗体高变区
Figure BDA0001284997960000311
HVR可包括如下“延伸HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)，以及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义各自，可变结构域残基根据Kabat等(上文)加以编号。
“框架”或“FR”残基是除如本文定义的HVR残基以外的那些可变结构域残基。
术语“如按照Kabat的可变结构域残基编号”或“如按照Kabat的氨基酸位置编号”及其变化形式是指Kabat等(上文)中汇编抗体时用于重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用这个编号系统，实际线性氨基酸序列可含有对应于可变结构域的FR或HVR的缩短或向其中的插入的较少或额外氨基酸。举例来说，重链可变结构域可包括在H2的残基52之后的单一氨基酸插入物(根据Kabat的残基52a)和在重链FR残基82之后的插入残基(例如根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。对于给定抗体，可通过在具有同源性的区域处将抗体序列与“标准”Kabat编号序列进行比对来确定残基的Kabat编号。
Kabat编号系统通常在涉及可变结构域中的残基(近似是轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时使用(例如Kabat等,Sequences of Immunological Interest.第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。“EU编号系统”或“EU索引”通常在涉及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如Kabat等(上文)中报道的EU索引)。“如按照Kabat的EU索引”是指对人IgG1EU抗体的残基编号。
表述“线性抗体”是指Zapata等(1995Protein Eng,8(10):1057-1062)中所述的抗体。简要来说，这些抗体包含一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，其连同互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可为双特异性的或单特异性的。
II.分子优化
本文提供通过以下方式来在原核宿主细胞中产生含有两条链的多肽的方法：培养所述宿主细胞以表达所述多肽的所述两条链，其中在表达后，所述两条链折叠并装配以在所述宿主细胞中形成生物活性多肽；其中所述宿主细胞含有多核苷酸，其包括(1)编码所述多肽的第一链的第一翻译单元；(2)编码所述多肽的第二链的第二翻译单元；和(3)编码至少一种选自肽基-脯氨酰基异构酶、蛋白质二硫化物氧化还原酶及其组合的伴侣蛋白的第三翻译单元。本文也提供通过以下方式来在原核宿主细胞中产生含有两条链的多肽的方法：培养所述宿主细胞以表达所述多肽的所述两条链，其中在表达后，所述两条链折叠并装配以在所述宿主细胞中形成生物活性多肽；其中所述宿主细胞含有多核苷酸，其包括(1)编码所述多肽的第一链的第一翻译单元；(2)编码所述多肽的第二链的第二翻译单元；(3)编码第一伴侣蛋白的第三翻译单元；(4)编码第二伴侣蛋白的第四翻译单元；和(5)编码第三伴侣蛋白的第五翻译单元，其中所述第一、第二和第三伴侣蛋白选自肽基-脯氨酰基异构酶、蛋白质二硫化物氧化还原酶及其组合。
在一些实施方案中，培养宿主细胞以表达多肽的两条链，其中在表达后，两条链折叠并装配以在所述宿主细胞中形成生物活性多肽。如本文所用，双链折叠和装配可指促进最终采用适当三维双链蛋白质构象、双链蛋白质装配或两者的任何或所有步骤。折叠和装配可指各链折叠和装配成它的适当构象和折叠，或它可指两个蛋白质链通过分子间键联所产生的复合物的折叠和装配。类似地，各链可折叠并装配以形成生物活性多肽，或两个蛋白质链通过分子间键联所产生的复合物可折叠并装配以整体形成生物活性多肽。
生物活性多肽可指能够执行归于所述多肽的功能的任何多肽。生物活性多肽的功能可包括不限于适当折叠或装配，与另一大分子结合或其它相互作用，以及酶活性。作为说明，生物活性抗体可指能够执行至少一种归于抗体的功能的抗体，所述功能包括不限于结合表位或具有抗体Fc区的性质，如以下进一步详细所述。
伴侣蛋白
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸含有编码至少一种伴侣蛋白的翻译单元。如上所述，伴侣蛋白可指有助于其它大分子包括不限于双链蛋白质的折叠或装配的任何蛋白质。伴侣蛋白的实例可包括不限于肽基-脯氨酰基异构酶、蛋白质二硫化物氧化还原酶和热休克蛋白(诸如Hsp60、Hsp70、Hsp90和Hsp100蛋白)。伴侣蛋白也可有助于跨膜转运蛋白质，例如使多肽链跨越质膜或内质网膜进行易位。
在一些实施方案中，伴侣蛋白可为肽基-脯氨酰基异构酶。肽基-脯氨酰基异构酶(术语“脯氨酰基异构酶”、“旋转异构酶”和“PPi酶”可在本文中可互换使用)可指催化脯氨酸或脯氨酰基-亚氨基肽键的顺式和反式异构体的相互转化的任何酶。这个反应的EC编号是EC5.2.1.8。已知或预测会催化由这个EC编号描述的反应的任何蛋白质都可为本公开的肽基-脯氨酰基异构酶。肽基-脯氨酰基异构酶活性也可由GO术语标识符GO:0003755描述。已知或预测会具有由这个GO术语标识符描述的分子功能的任何蛋白质都可为本公开的肽基-脯氨酰基异构酶。
在本领域中已知用以促进蛋白质折叠和装配的肽基-脯氨酰基异构酶活性。在一些实施方案中，对于其适当折叠结构包括顺式脯氨酰基键的蛋白质，肽基-脯氨酰基异构酶可通过使反式脯氨酰基键转化成顺式脯氨酰基键来有助于蛋白质折叠和装配。也已知一些肽基-脯氨酰基异构酶会增强缺乏顺式脯氨酰基键的蛋白质的折叠和装配(Bothmann H和Pluckthun A 2000J.Biol.Chem.275:17100)。在一些实施方案中，肽基-脯氨酰基异构酶可有助于缺乏顺式脯氨酰基键的蛋白质的蛋白质折叠和装配。因此，尽管肽基-脯氨酰基异构酶活性可充当用以鉴定适用于本文所述的方法的伴侣蛋白的功能特征，但肽基-脯氨酰基异构酶的效用未必限于它的催化活性本身。
在一些实施方案中，肽基-脯氨酰基异构酶是FkpA蛋白。在一些实施方案中，FkpA蛋白是大肠杆菌FkpA。大肠杆菌FkpA可指由属于大肠杆菌物种的细菌的任何菌株或分离株中的fkpA基因编码的任何多肽。在一些实施方案中，大肠杆菌FkpA是指由用EcoGene登记号EG12900描述的fkpA基因编码的蛋白质。在一些实施方案中，大肠杆菌FkpA是指具有由NCBIRefSeq登记号NP_417806描述的序列的蛋白质。
其它FkpA蛋白在本领域中是已知的。FkpA蛋白的实例可包括不限于鲍氏志贺菌(S.boydii)肽基-脯氨酰基异构酶(NCBI RefSeq编号WP_000838252)、杨氏柠檬酸杆菌(C.youngae)肽基-脯氨酰基异构酶(NCBI RefSeq编号WP_006687366)、奥克西托克雷白杆菌(K.oxytoca)肽基-脯氨酰基异构酶(NCBI RefSeq编号WP_004125943)、肠道沙门菌(S.enterica)肽基-脯氨酰基异构酶(NCBI RefSeq编号WP_000838233)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)肽基-脯氨酰基异构酶(NCBI RefSeq编号WP_019704642)、酿酒酵母(S.cerevisiae)FPR3p(NCBI RefSeq编号NP_013637)、小家鼠(M.musculus)Fkpb1a(NCBIRefSeq编号NP_032045)、小家鼠Fkpb2(NCBI RefSeq编号NP_032046)、智人(H.sapiens)FKBP2(NCBI RefSeq编号NP_001128680)和黑腹果蝇(D.melanogaster)CG14715(NCBIRefSeq编号NP_650101)。在一些实施方案中，本公开的FkpA蛋白与大肠杆菌FkpA具有至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性。
在一些实施方案中，伴侣蛋白可为蛋白质二硫化物氧化还原酶。蛋白质二硫化物氧化还原酶(术语“蛋白质二硫化物异构酶”和“硫醇-二硫化物异构酶”可在本文中可互换使用)可指催化蛋白质中二硫键的重排的任何酶。举例来说，蛋白质二硫化物氧化还原酶可催化半胱氨酸的氧化以在蛋白质中形成二硫键。蛋白质二硫化物氧化还原酶也可催化蛋白质中错误配对的二硫键的异构化。这个反应的EC编号是EC 5.3.4.1。已知或预测会催化由这个EC编号描述的反应的任何蛋白质都可为本公开的蛋白质二硫化物氧化还原酶。蛋白质二硫化物氧化还原酶活性也可由GO术语标识符GO:0015035描述。已知或预测会具有由这个GO术语标识符描述的分子功能的任何蛋白质都可为本公开的蛋白质二硫化物氧化还原酶。
在本领域中已知用以促进蛋白质折叠和装配的蛋白质二硫化物氧化还原酶活性。举例来说，蛋白质二硫化物氧化还原酶活性促进在蛋白质折叠和装配期间形成适当分子内和分子间二硫键。特定来说，蛋白质二硫化物氧化还原酶活性对于在原核细胞的周质中表达的具有二硫键的蛋白质是重要的。
在一些实施方案中，蛋白质二硫化物氧化还原酶是DsbA蛋白。在一些实施方案中，DsbA蛋白是大肠杆菌DsbA。大肠杆菌DsbA可指由属于大肠杆菌物种的细菌的任何菌株或分离株中的dsbA基因编码的任何多肽。在一些实施方案中，大肠杆菌DsbA是指由用EcoGene登记号EG11297描述的dsbA基因编码的蛋白质。在一些实施方案中，大肠杆菌DsbA是指具有由NCBI RefSeq登记号NP_418297描述的序列的蛋白质。
其它DsbA蛋白在本领域中是已知的。DsbA蛋白的实例可包括不限于福氏志贺菌(S.flexneri)硫醇-二硫化物异构酶(NCBI RefSeq编号WP_000725335)、痢疾志贺菌(S.dysenteriae)硫醇-二硫化物异构酶(NCBI RefSeq编号WP_000725348)、杨氏柠檬酸杆菌硫醇-二硫化物异构酶(NCBI RefSeq编号WP_006686108)和肠道沙门菌硫醇-二硫化物异构酶(NCBI RefSeq编号WP_023240584)。在一些实施方案中，本公开的DsbA蛋白与大肠杆菌DsbA具有至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性。
在一些实施方案中，蛋白质二硫化物氧化还原酶是DsbC蛋白。在一些实施方案中，DsbC蛋白是大肠杆菌DsbC。大肠杆菌DsbC可指由属于大肠杆菌物种的细菌的任何菌株或分离株中的dsbC基因编码的任何多肽。在一些实施方案中，大肠杆菌DsbC是指由用EcoGene登记号EG11070描述的dsbC基因编码的蛋白质。在一些实施方案中，大肠杆菌DsbC是指具有由NCBI RefSeq登记号NP_417369描述的序列的蛋白质。
其它DsbC蛋白在本领域中是已知的。DsbC蛋白的实例可包括不限于宋内志贺菌(S.sonnei)蛋白质二硫化物异构酶(NCBI RefSeq编号WP_000715206)、痢疾志贺菌蛋白质二硫化物异构酶(NCBI RefSeq编号WP_000715209)、费格森埃希氏菌(E.fergusonii)蛋白质二硫化物异构酶(NCBI RefSeq编号WP_000715225)、邦戈沙门菌(S.bongori)硫醇:二硫化物互换蛋白质DsbC(NCBI RefSeq编号WP_020845161)和肠道沙门菌蛋白质二硫化物异构酶DsbC(NCBI RefSeq编号WP_023183515)。在一些实施方案中，本公开的DsbC蛋白与大肠杆菌DsbC具有至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性。
为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，出于最优比较目的来比对序列(例如可在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一者或两者中引入空位以达成最优比对，并且可出于比较目的来忽视非同源性序列)。在一个实施方案中，参照序列的出于比较目的加以比对的长度是所述参照序列的长度的至少50％，通常是至少75％，并且甚至更通常是至少80％、85％、90％、95％或100％。接着比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，那么分子在那个位置处是同一的(如本文所用，氨基酸或核酸“同一性”等效于氨基酸或核酸“同源性”)。
两个序列之间的同一性百分比是在考虑需要被引入以达成两个序列的最优比对的空位的数目和各空位的长度的情况下，由序列共有的同一位置的数目的函数。对于序列比较，通常一个序列充当测试序列与其进行比较的参照序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参照序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可使用缺省程序参数，或可指定替代性参数。序列比较算法接着基于程序参数计算测试序列相对于参照序列的序列同一性百分比。当比较两个序列以获得同一性时，并不需要序列是连续的，但任何空位都将携带与它相伴的将降低总体同一性百分比的罚分。对于blastn，缺省参数是空位开放罚分＝5以及空位延伸罚分＝2。对于blastp，缺省参数是空位开放罚分＝11以及空位延伸罚分＝1。
如本文所用的“比较窗”包括提及具有选自由20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150组成的组的任一数目的连续位置的区段，其中在最优对准两个序列之后，可将序列与具有相同数目的连续位置的参照序列进行比较。比对供比较的序列的方法在本领域中是熟知的。可使用已知算法进行供比较的序列的最优比对(例如通过Smith和Waterman,Adv Appl Math,2:482,1981的局部同源性算法；通过Needleman和Wunsch,J MolBiol,48:443,1970的同源性比对算法；通过Pearson和Lipman,Proc Natl Acad Sci USA,85:2444,1988的类似性搜索方法；通过Wisconsin Genetics软件包(Genetics ComputerGroup,Madison,WI)中这些算法的计算机化执行程序FASTDB(Intelligenetics)、BLAST(National Center for Biomedical Information)、GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，或通过手动比对和目视检查)。
适于确定序列同一性百分比和序列类似性百分比的的算法的一优选实例是FASTA算法(Pearson和Lipman,Proc Natl Acad Sci USA,85:2444,1988；以及Pearson,MethodsEnzymol,266:227-258,1996)。在DNA序列的FASTA比对中用于计算同一性百分比的优选参数是优化的，BL50矩阵15:-5，k元组＝2；接合罚分＝40，优化＝28；空位罚分-12，空位长度罚分＝-2；以及宽度＝16。
适于确定序列同一性百分比和序列类似性百分比的算法的另一优选实例是BLAST和BLAST 2.0算法(分别Altschul等,Nuc Acids Res,25:3389-3402,1977；以及Altschul等,J Mol Biol,215:403-410,1990)。以本文所述的参数使用BLAST和BLAST 2.0以确定本公开的核酸和蛋白质的序列同一性百分比。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)网站公开获得。这个算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度是W的短字符来鉴定高分序列对(HSP)，所述短字符在与数据库序列中具有相同长度的字符比对时匹配或满足某一正值阈值评分T。T被称为邻近字符评分阈值。这些初始邻近字符命中物充当用于引发搜索以发现含有它们的较长HSP的种子。字符命中物在两个方向上沿各序列延伸直至累积比对评分可得以增加。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励评分；始终>0)和N(错配残基的惩罚评分；始终<0)来计算累积评分。对于氨基酸序列，评分矩阵用于计算累积评分。在以下情况时停止字符命中物在各方向上的延伸：累积比对评分从它的最大实现值减少了数量X；由于一个或多个负评分残基比对的积累，累积评分达到零或低于零；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(针对核苷酸序列)使用字长(W)11、预期值(E)10、M＝5、N＝-4以及比较两条链作为缺省值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长3和预期值(E)10、以及BLOSUM62评分矩阵(Henikoff和Henikoff,Proc Natl Acad Sci USA,89:10915,1989)比对值(B)50、预期值(E)10、M＝5、N＝-4和比较两条链作为缺省值。
BLAST算法也进行两个序列之间的类似性的统计分析(参见例如Karlin和Altschul,Proc Natl Acad Sci USA,90:5873-5787,1993)。由BLAST算法提供的一种类似性量度是最小总和概率(P(N))，其提供对在两个核苷酸或氨基酸序列之间将偶然发生匹配所具有的概率的指示。举例来说，如果在测试核酸与参照核酸比较时的最小总和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，并且最优选小于约0.001，那么核酸被视为与参照序列类似。
适用算法的另一实例是PILEUP。PILEUP使用进行性成对比对由一组相关序列产生多序列比对以显示关系和序列同一性百分比。它也绘制显示用于产生比对的群集关系的树或树形图。PILEUP使用进行性比对方法(Feng和Doolittle,J Mol Evol,35:351-360,1987)的简化形式，采用与公开方法(Higgins和Sharp,CABIOS 5:151-153,1989)类似的方法。程序可比对多达300个序列，各自具有5,000个核苷酸或氨基酸的最大长度。多重比对程序以两个最类似序列的成对比对开始，从而产生两个经比对序列的集群。接着使这个集群与下一最相关序列或经比对序列的集群比对。通过简单延伸两个个别序列的成对比对来比对两个序列集群。通过一系列进行性成对比对来实现最终比对。通过指定序列比较区域的特定序列和它们的氨基酸或核苷酸坐标，以及通过指定程序参数来运行程序。使用PILEUP，利用以下参数将参照序列与其它测试序列进行比较以确定序列同一性百分比关系：缺省空位权重(3.00)，缺省空位长度权重(0.10)，和加权末端空位。PILEUP可从例如7.0版GCG序列分析软件包(Devereaux等,Nuc Acids Res,12:387-395,1984)获得。
适于多重DNA和氨基酸序列比对的算法的另一优选实例是CLUSTALW程序(Thompson等,Nucl Acids.Res,22:4673-4680,1994)。ClustalW在各组序列之间进行多重成对比较，并且基于同源性将它们汇编成多重比对。空位开放罚分和空位延伸罚分分别是10和0.05。对于氨基酸比对，BLOSUM算法可用作蛋白质权重矩阵(Henikoff和Henikoff,Proc Natl Acad Sci USA,89:10915-10919,1992)。
表达盒和载体
在一些实施方案中，宿主细胞含有多核苷酸，其包括(1)编码多肽的第一链的第一翻译单元；(2)编码多肽的第二链的第二翻译单元；和(3)编码至少一种选自肽基-脯氨酰基异构酶、蛋白质二硫化物氧化还原酶及其组合的伴侣蛋白的第三翻译单元。在一些实施方案中，宿主细胞含有多核苷酸，其包括(1)编码多肽的第一链的第一翻译单元；(2)编码多肽的第二链的第二翻译单元；(3)编码第一伴侣蛋白的第三翻译单元；(4)编码第二伴侣蛋白的第四翻译单元；和(5)编码第三伴侣蛋白的第五翻译单元，其中所述第一、第二和第三伴侣蛋白选自肽基-脯氨酰基异构酶、蛋白质二硫化物氧化还原酶及其组合。本公开发现可使用单一质粒系统(即含有编码双链蛋白质的各链的翻译单元和一个或多个编码一种或多种伴侣蛋白的翻译单元的单一多核苷酸)或可相容质粒系统(即含有编码双链蛋白质的各链的翻译单元的第一多核苷酸和含有一个或多个编码一种或多种伴侣蛋白的翻译单元的第二多核苷酸)实现适当折叠和装配的双链蛋白质的产生增加。
在一些实施方案中，多核苷酸进一步含有启动子的三个拷贝，其中第一拷贝与第一翻译单元可操作组合，第二拷贝与第二翻译单元可操作组合，并且第三拷贝与第三翻译单元可操作组合以驱动第一链、第二链和伴侣蛋白的转录。在一些实施方案中，编码三种伴侣蛋白中的两种的两个翻译单元是单一翻译单元的一部分。在一些实施方案中，多核苷酸进一步含有与各翻译单元可操作组合的启动子。
在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子。如上所述，诱导型启动子的活性响应于信号而增加或降低。举例来说，诱导型启动子可响应于存在信号诸如IPTG而促进转录。诱导型启动子可响应于不存在信号诸如磷酸盐而促进转录。在这些方案中的任一个中，转录的量可或可不与信号的量或其缺乏度成比例。适于原核宿主细胞的诱导型启动子的众多实例在本领域中是已知的。这些可包括不限于lac、tac、trc、trp、pho、recA、tetA、nar、噬菌体PL、cspA、T7和PBAD启动子(对于更详细描述，参见Terpe K.2006Appl.Microbiol.Biotechnol.72:211)。在一些实施方案中，诱导型启动子的三个拷贝用于以协调方式驱动单独翻译单元例如双链蛋白质的两条链和伴侣蛋白的表达。
在一些实施方案中，诱导型启动子是IPTG诱导型启动子。IPTG诱导型启动子可指以对异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)或能够促进从lac操纵元转录的任何其它乳糖衍生物(例如异乳糖)起响应的方式促进转录的任何多核苷酸序列。IPTG诱导型启动子的许多实例在本领域中是已知的，包括不限于tac(例如tacI、tacII等)启动子、lac启动子及其衍生物(例如lacUV5、taclac等)。
在一些实施方案中，诱导型启动子是驱动第一链、第二链和伴侣蛋白的转录的IPTG诱导型启动子。本公开惊人地发现调控伴侣蛋白的表达的IPTG诱导型启动子可在不通过IPTG来诱导下，在相较于所述伴侣蛋白在通过IPTG来诱导所述IPTG诱导型启动子时的表达，促进更高产物效价的水平下促进所述伴侣蛋白的表达。
在一些实施方案中，诱导型启动子是当培养基中的磷酸盐已耗尽时驱动第一链、第二链和伴侣蛋白的转录的pho启动子。pho启动子可指以对细胞外磷酸盐(例如无机磷酸盐)起响应的方式促进转录的任何多核苷酸序列。举例来说，大肠杆菌中的磷酸盐(Pho)调控元包括感应细胞外磷酸盐，并且响应于磷酸盐水平来通过Pho启动子调控众多下游基因的表达的蛋白质组分(对于更详细描述，参见Hsieh YJ和Wanner BL2010Curr.Opin.Microbiol.13(2):198)。当使细菌在培养基中生长时，已知这个Pho调控元的表达在培养基中有磷酸盐(例如无机磷酸盐Pi)可用时被阻遏，并且在磷酸盐已耗尽时被诱导。用于本文所述的方法中的pho启动子的一个非限制性实例是大肠杆菌phoA启动子。这个启动子在本领域中被广泛知晓和使用来以依赖于细胞培养基中磷酸盐的浓度的方式调控原核宿主细胞中的重组蛋白表达(对于更详细描述，参见Lubke C等1995EnzymeMicrob.Technol.17(10):923)。
在一些实施方案中，多核苷酸进一步含有可选择标记，并且培养基包括使用单一抗生素的选择剂以致使宿主细胞维持多核苷酸。有利的是，本文所述的方法允许在共表达一种或多种伴侣蛋白以使编码这些组分各自的翻译单元全都包括在单一多核苷酸(例如如本文所述的表达质粒或单一质粒系统)中的情况下产生双链蛋白质的各链。这种系统的优势是因为这些组分都由同一质粒编码，所以仅需要一种可选择标记来在原核宿主细胞中维持这些多核苷酸。
可选择标记可指编码在细胞经受选择时促进宿主细胞的存活的蛋白质的任何多核苷酸，所述选择即用于相对于缺乏可选择标记的细胞的丰度，优先增加携带可选择标记的细胞的丰度的任何条件。可选择标记的实例是在抗生素存在下促进宿主细胞存活的基因。众多可选择标记和使用单一抗生素的相应选择剂在本领域中是已知的。举例且不加限制地来说，许多可选择标记和相应抗生素被描述和引用于Jang CW和Magnuson T 2013PLoSONE 8(2):e57075中。在一些实施方案中，可选择标记可指弥补宿主细胞的基因组内存在的基因缺失的基因(例如从质粒表达的基因)。在这些实例的情况下，当细胞经受选择(即在需要从宿主基因组缺失的基因的活性的条件下生长)时，由质粒供给的基因的拷贝弥补宿主基因组的缺陷，由此选择携带外源性弥补基因的细胞。所述基因可包括为产生细胞培养基中缺乏的特定营养物所需的营养缺陷标记或基因，其实例进一步描述于本文中。以下进一步描述若干示例性可选择标记和抗生素。
在一些实施方案中，第一翻译单元包括第一翻译起始区(TIR)与第一链的编码区可操作组合，并且第二翻译单元包括第二翻译起始区(TIR)与第二链的编码区可操作组合。已知翻译起始区(TIR)对于重组蛋白在原核宿主细胞中的翻译是重要的(参见例如SimmonsLC和Yansura DG 1996Nat.Biotechnol.14:629以及Vimberg V等2007BMC Mol.Biol.8:100)。TIR可决定翻译单元的翻译效率。TIR通常包括翻译单元特征物诸如起始密码子、Shine-Dalgarno(SD)序列和翻译增强子。TIR可进一步包括编码信号肽的分泌信号序列。TIR的特征物之间的序列和间隔可调控翻译起始效率。
在一些实施方案中，第一TIR和第二TIR的相对翻译强度是约1.0至约3.0。本文描述包括编码双链蛋白质的各链的翻译单元的载体，并且各翻译单元可包括TIR。如本文所用，“翻译强度”可指通过使翻译单元翻译所达成的多肽的产生。这个产生可取决于许多特征，包括不限于mRNA翻译、mRNA稳定性、核糖体结合mRNA的效率、以及由此编码的多肽的折叠、装配和/或易位。相对翻译强度可指相较于由具有野生型或对照TIR的翻译单元编码的多肽的产生，由具有特定或实验TIR的翻译单元编码的多肽的产生，此时所述实验TIR与所述对照TIR两者均由在相同条件下培养的类似原核宿主细胞(例如相同属和种)表达。对TIR的进一步描述可见于美国专利号8,361,744中。
重组多肽
本公开的某些方面涉及产生具有两条链的多肽的方法。有利的是，本文所述的方法可适用于促进许多不同类型的蛋白质，特别是具有二硫键的那些，诸如如上所述的双链蛋白质的表达、折叠和装配。以下描述特定双链蛋白质，但本文所述的方法不限于这些特定实施方案。如本文所用，双链蛋白质可包括含有超过一个不同多肽链的蛋白质。尽管本文所述的许多实施方案涉及具有两个多肽链的双链蛋白质，但涵盖具有超过两个多肽链(例如三个或更多个多肽)的双链蛋白质，并且可通过本文所述的方法产生。如上所述，也涵盖由单一多肽链构成的双链蛋白质(例如单链抗体、单链可变片段等)，并且可通过本文所述的方法产生，所述双链蛋白质以另外方式如同如果它们是不同多肽链那么它们将表现的那样进行缔合。
在一些实施方案中，本公开的双链多肽的两条链由至少一个二硫键彼此连接。二硫键可指连接两个硫醇基团的任何共价键。多肽中的二硫键通常在半胱氨酸残基的硫醇基团之间形成。本领域中已知多肽二硫键对于许多多肽诸如本公开的双链蛋白质的折叠和装配是重要的。多肽二硫键可包括单一多肽链中半胱氨酸残基之间的二硫键(即分子内或链内二硫键)。多肽二硫键也可包括见于单独多肽链上的半胱氨酸残基之间的二硫键(即分子间或链间二硫键)。因此，在一些实施方案中，双链多肽的两条链由至少一个二硫键彼此连接。
本领域中已知二硫键对于抗体和抗体片段的折叠和装配是重要的。已知不同抗体同种型和同种型内的不同子类具有不同二硫键样式。举例来说，IgG抗体可含有12个链内二硫键，在各轻链和它的相应重链之间的1个链间二硫键，以及视特定IgG子类而定在重链之间的2个与11个之间的链间二硫键(对于更详细描述，参见Liu H和May K 2012MAbs.4(1):17)。也已知IgM(参见例如Wiersma EJ和Shulman MJ 1995J.Immunol.154(10):5265)、IgE(参见例如Helm BA等1991Eur.J.Immunol.21(6):1543)、IgA(参见例如ChintalacharuvuKR等2002J.Immunol.169(9):5072)和IgD(参见例如Shin SU等1992Hum.AntibodiesHybridomas 3(2):65)在折叠和装配期间形成二硫键。
在一些实施方案中，本公开的双链多肽对于宿主细胞是异源性的。如本文所用，异源性多肽在关于宿主细胞使用时可指并不在所述宿主细胞中，即并不在从自然界分离所述宿主细胞时内源性表达的任何多肽。异源性多肽也可指可由宿主细胞内源性表达，但在不同于从自然界分离宿主细胞时的调控下表达的多肽。不同调控的实例可包括不限于不同表达量、响应于不同刺激而表达、或任何其它改变的表达情形，诸如通过使用异源性启动子诸如诱导型启动子。
在一些实施方案中，本公开的双链多肽是异二聚体的单体。如本文所用，异二聚体可指含有两个呈可操作连接的不同多肽或多肽复合物的任何多肽复合物。异二聚体的一非限制性实例是由两个不同抗体单体(即呈可操作连接的轻链-重链对)组成的双特异性或二价抗体。在这个实例的情况下，识别第一抗原的第一重链-轻链对的折叠和装配产生第一抗体单体。识别第二抗原的第二重链-轻链对的折叠和装配产生第二抗体单体。这些单体可通过本领域中已知的任何手段(以下关于双特异性抗体更详细描述)来装配以形成异二聚体。对于有关异二聚抗体形成的说明性实例的更多细节，参见Ridgway JBB等1996ProteinEng.9(7):617。
在一些实施方案中，本公开的双链多肽是单价抗体，其中第一链和第二链代表免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链。如本文所用，单价抗体可指由可操作地连接在一起以形成重链-轻链对的抗体重链和抗体轻链构成的任何多肽复合物，其中所述重链-轻链对并不可操作地连接于第二重链-轻链对。术语“半抗体(hAb)”可在本文中可互换使用。
在一些实施方案中，本公开的单价抗体能够特异性结合抗原。如本文所用，术语“结合”、“特异性结合”或“对…具有特异性”是指可测量和可重现的相互作用，诸如靶标(即)与抗体之间的结合，所述结合确定在包括生物分子的分子的异质群体存在下存在所述靶标。举例来说，结合或特异性结合靶标(其可为表位)的抗体是相比于它结合其它靶标，以更大亲和力、亲合力，更易于和/或以更久持续时间结合这个靶标的抗体。在一个实施方案中，抗体结合无关靶标的程度小于所述抗体与靶标的结合的约10％，如例如通过放射免疫测定(RIA)所测量。在某些实施方案中，特异性结合靶标的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗体特异性结合蛋白质上在来自不同物种的蛋白质之间保守的表位。在另一个实施方案中，特异性结合可包括但不要求排它性结合。
在一些实施方案中，本公开的双链多肽是分泌蛋白。如本文所用，分泌蛋白可指由宿主细胞分泌至宿主细胞周质或细胞外环境中的任何蛋白质。分泌蛋白可为由宿主细胞内源性分泌的蛋白质，或分泌蛋白可为不由宿主细胞内源性分泌，但以促进它的分泌的方式加以修饰的蛋白质。举例来说，存在通常见于多肽的N末端的信号序列可将多肽引导至分泌路径中以达成分泌。众多信号序列在本领域中是已知的，并且可适用于促进分泌蛋白的分泌或允许不天然地由宿主细胞分泌的蛋白质的分泌；参见例如Picken等,Infect.Immun.42:269-275(1983)；Simmons和Yansura,Nature Biotechnology 14:629-634(1996)；以及Humphreys DP等2000Protein Expr.Purif.20(2):252。信号序列的一个非限制性实例是热稳定肠毒素(enterotoxin)II(STII)信号序列。
在一些实施方案中，本公开的双链多肽是抗癌免疫动员单克隆T细胞受体(ImmTAC)。ImmTAC可指组合抗CD3单链抗体片段(或结合T细胞，并且活化T细胞应答的类似抗体片段)与可溶性单克隆T细胞受体(TCR)的融合蛋白。在一些实施方案中，ImmTAC的可溶性单克隆TCR可经工程化以相较于尚未工程改造的TCR(例如天然存在的TCR)对特定抗原的亲和力，对所述抗原具有增加的亲和力。Im mTAC可用于许多应用，包括不限于活化针对呈现由ImmTAC识别的同源抗原的细胞诸如肿瘤细胞的T细胞应答。在一些实施方案中，可溶性单克隆TCR包含TCRα链可变结构域和TCRβ链可变结构域。在一些实施方案中，可溶性单克隆TCR进一步包含由天然或非天然二硫键连接的TCRα链恒定结构域和TCRβ链恒定结构域。对于ImmTAC的更详细描述，参见例如美国专利号7,569,664；Liddy等,Nat.Med.18:908-7(2012)；以及Oates和Jakobsen,OncoI mmunology 2:e22891(2013)。
在一些实施方案中，从宿主细胞的周质回收本公开的分泌蛋白。本领域中已知周质用以指代革兰氏阴性细菌细胞的内膜或细胞质膜与外膜之间的间隔。在不希望束缚于理论下，据认为周质是有利于形成二硫键的氧化环境。因此，可有利的是使具有二硫键作为它的适当折叠和装配结构的一部分的多肽(例如本公开的双链蛋白质)定位于周质(对于更详细描述，参见Schlapschy M等2006Protein Eng.Des.Sel.19(8):385)。
用于回收周质蛋白质的众多方法在本领域中是已知的。大规模纯化周质蛋白质的一个非限制性实例描述于欧洲专利号EP1356052B1(参见例如实施例4)中。可通过从原生质球制备物提取周质部分来回收周质蛋白质(参见例如Schlapschy M等2006ProteinEng.Des.Sel.19(8):385)。一旦已产生周质提取物，即可通过本领域中已知的任何标准蛋白质纯化技术诸如亲和纯化、色谱法等来纯化周质蛋白质。
抗体
本文所述的双链蛋白质可通过本领域中已知的任何适合技术制备。一个示例性类别的双链蛋白质是抗体。如下所述，使用本领域中可用于产生抗体的技术制备抗体，所述技术的示例性方法更详细描述于以下章节中。本领域技术人员将认识到许多下述方法可应用于除抗体以外的双链蛋白质。
抗体针对目标抗原(例如且不限于PD-L1(诸如人PD-L1)、HER2、或CD3(诸如人CD3)、IL13、IL4、VEGFC、VEGFA和VEGF)。优选地，抗原是生物重要多肽，并且向罹患病症的哺乳动物施用抗体可在那个哺乳动物中产生治疗益处。
在某些实施方案中，本文提供的抗体具有≤1μM、≤150nM、≤100nM、≤50nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
在一个实施方案中，通过如由以下测定所述，用目标抗体的Fab形式和它的抗原进行的放射性标记抗原结合测定(RIA)来测量Kd。通过以下方式来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力：在一滴定系列的未标记抗原存在下，用最小浓度的(125I)标记抗原使Fab平衡，接着用抗Fab抗体涂布板捕集结合的抗原(参见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为建立用于测定的条件，将
Figure BDA0001284997960000481
多孔板(Thermo Scientific)用含5μg/ml捕集抗Fab抗体(Cappel Labs)的50mM碳酸钠(pH 9.6)涂布过夜，并且随后在室温(约23℃)下用含2％(w/v)牛血清白蛋白的PBS阻断2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，使100pM或26pM[125I]-抗原与连续稀释度的目标Fab混合。接着将目标Fab孵育隔夜；然而，孵育可持续较长时期(例如约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕集板中以在室温下孵育(例如1小时)。接着移除溶液，并且用含0.1％聚山梨醇酯20
Figure BDA0001284997960000482
的PBS将板洗涤8次。当板已干燥时，每孔添加150μl闪烁体(MICROSCINT-20TM；Packard)，并且在TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上对板进行计数10分钟。选择各Fab的赋予小于或等于最大结合的20％的浓度用于竞争性结合测定中。
根据另一个实施方案，使用
Figure BDA0001284997960000491
或
Figure BDA0001284997960000492
(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，用固定抗原CM5芯片在约10响应单位(RU)下在25℃下利用表面等离子体共振测定来测量Kd。简要来说，根据供应商说明书用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIACORE,Inc.)。用10mM乙酸钠(pH 4.8)将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM)，随后在5μl/分钟的流速下注射以获得约10响应单位(RU)的偶联蛋白质。在注射抗原之后，注射1M乙醇胺以封阻未反应基团。对于动力学测量，在25℃下，在约25μL/min的流速下注射Fab于含0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)。通过同时拟合缔合传感图和解离传感图，使用简单一对一朗缪尔(Langmuir)结合模型(3.2版
Figure BDA0001284997960000493
评估软件)计算缔合速率(k缔合)和离解速率(k解离)。将平衡解离常数(Kd)计算为比率k解离/k缔合。参见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果根据以上表面等离子体共振测定的缔合速率超过106M-1s-1，那么可通过使用荧光淬灭技术来测定缔合速率，所述技术测量在如在分光计(诸如停流配备分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌比色皿的8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic))中测量的递增浓度的抗原存在下，在25℃下于PBS(pH 7.2)中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或降低。
(i)抗原制备
任选缀合于其它分子的可溶性抗原或其片段可用作用于产生抗体的免疫原。对于诸如受体的跨膜分子，这些分子的片段(例如受体的细胞外结构域)可用作免疫原。或者，表达跨膜分子的细胞可用作免疫原。所述细胞可源于天然来源(例如癌细胞系)，或可为已通过重组技术来转化以表达跨膜分子的细胞。适用于制备抗体的其它抗原及其各种形式将为本领域中的人士显而易知。
(ii)某些基于抗体的方法
优选通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来在动物中产生多克隆抗体。可适用的是使用双官能试剂或衍生化试剂例如顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基磺基丁二酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基来缀合)、N-羟基丁二酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、丁二酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR(其中R和R1是不同烷基)来使相关抗原缀合于在待免疫的物种中具有免疫原性的蛋白质，例如钥孔虫戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。
通过组合例如100μg或5μg蛋白质或缀合物(分别对于兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant)，以及在多个部位处真皮内注射溶液来使动物针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物免疫。1个月后，通过在多个部位处皮下注射来用含1/5至1/10原始量的肽或缀合物的弗氏完全佐剂使动物加强免疫。7至14天后，将动物放血，并且测定血清的抗体效价。使动物加强免疫直至效价平稳。优选地，用具有相同抗原，但缀合于不同蛋白质和/或通过不同交联试剂所获得的缀合物来使动物加强免疫。也可在重组细胞培养物中以蛋白质融合物形式制备缀合物。此外，诸如明矾的聚集剂适合地用于增强免疫应答。
可使用首先由Kohler等,Nature,256:495(1975)所述，并且例如在Hongo等,Hybridoma,14(3):253-260(1995)，Harlow等,Antibodies:A Laboratory Manual,(ColdSpring Harbor Laboratory Press,第2版1988)；Hammerling等,Monoclonal Antibodiesand T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)以及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(关于人-人杂交瘤)中进一步描述的杂交瘤方法制备本公开的单克隆抗体。额外方法包括例如在美国专利号7,189,826中描述的关于从杂交瘤细胞系产生单克隆人天然IgM抗体的那些。人杂交瘤技术(三源杂交瘤技术)描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)中。一旦已从杂交瘤分离所需单克隆抗体，即可将编码它们的多核苷酸亚克隆至原核表达载体中，并且可通过任何本文所述的方法在原核宿主细胞中表达来产生抗体。
(iii)文库源性抗体
可通过筛选组合文库中具有一种或多种所需活性的抗体来分离本公开的抗体。举例来说，本领域中已知多种用于产生噬菌体展示文库以及筛选所述文库中具有所需结合特征的抗体的方法，诸如实施例3中所述的方法。额外方法例如在Hoogenboom等,Methods inMolecular Biology 178:1-37(O’Brien等编,Human Press,Totowa,NJ,2001)中综述，并且例如在McCafferty等,Nature 348:552-554；Clackson等,Nature 352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,Methods in MolecularBiology 248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；以及Lee等,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)中进一步描述。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链式反应(PCR)来分别克隆VH和VL基因的谱系，并且随机重组于噬菌体文库中，可接着筛选所述文库中的抗原结合性噬菌体，如Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。噬菌体通常展示呈单链Fv(scFv)片段形式或呈Fab片段形式的抗体片段。来自经免疫来源的文库提供对免疫原具有高亲和力的抗体而无需构建杂交瘤。或者，可克隆(例如从人克隆)天然谱系以提供单一来源的针对广泛范围的非自身抗原以及自身抗原的抗体而不进行任何免疫，如由Griffiths等,EMBOJ,12:725-734(1993)所述。最后，天然文库也可通过以下方式合成制备：从干细胞克隆未重排V基因区段，以及使用含有随机序列的PCR引物来编码高变CDR3区并且实现体外重排，如由Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公布包括例如美国专利号5,750,373以及美国专利公布号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中被视为人抗体或人抗体片段。
(iv)嵌合抗体、人源化抗体和人抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体例如描述于美国专利号4,816,567；以及Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物诸如猴的可变区)和人恒定区。在另一实例中，嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中类别或子类已从亲本抗体的类别或子类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，使非人抗体人源化以降低在人中的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个其中HVR例如CDR(或其部分)源于非人抗体，而FR(或其部分)源于人抗体序列的可变结构域。人源化抗体任选也将包含至少一部分人恒定区。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如HVR残基所源于的抗体)的相应残基替代例如以恢复或改进抗体特异性或亲和力。
人源化抗体和制备它们的方法例如在Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中综述，并且例如在Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；Queen等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等,Methods 36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall’Acqua等,Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；以及Osbourn等,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述用以FR改组的“引导选择”方法)中进一步描述。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳配合”方法选择的框架区(参见例如Sims等J.Immunol.151:2296(1993))；源于具有特定子组的轻链或重链可变区的人抗体的共有序列的框架区(参见例如Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；以及Presta等J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和由筛选FR文库获得的框架区(参见例如Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)以及Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。可使用本领域中已知的各种技术来产生人抗体。人抗体一般地描述于van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)以及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中。人抗体可例如且不限于通过任何本文所述的方法在原核宿主细胞中由原核表达载体表达来制备。
人抗体也可通过分离选自人源性噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生。所述可变结构域序列可接着与所需人恒定结构域组合。以下描述用于从抗体文库选择人抗体的技术。
(v)抗体片段
可通过传统手段诸如酶促消化，或通过重组技术来产生抗体片段。在某些情况下，使用抗体片段而非完全抗体存在优势。片段的较小尺寸允许快速清除，并且可导致到达实体肿瘤得以改进。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson等(2003)Nat.Med.9:129-134。
已开发用于产生抗体片段的各种技术。在传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来获得这些片段(参见例如Morimoto等,Journal of Biochemical and BiophysicalMethods 24:107-117(1992)；以及Brennan等,Science,229:81(1985))。然而，这些片段现时可以由重组宿主细胞直接产生。Fab、Fv和ScFv抗体片段全都可在大肠杆菌中表达并从大肠杆菌分泌，由此允许轻易产生大量的这些片段。可从以上讨论的抗体噬菌体文库分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab'-SH片段，并且化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter等,Bio/Technology 10:163-167(1992))。根据另一方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab')2片段。包含补救受体结合表位残基，具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段描述于美国专利号5,869,046中。用于产生抗体片段的其它技术将为熟练从业者显而易知。在某些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利号5,571,894；和5,587,458。Fv和scFv是仅有的具有完整结合位点，缺乏恒定区的种类；因此，它们可适于在体内使用期间达成非特异性结合降低。可构建scFv融合蛋白以在scFv的氨基或羧基末端产生效应蛋白融合。参见Antibody Engineering,Borrebaeck编(上文)。抗体片段也可为“线性抗体”，例如如例如美国专利号5,641,870中所述。所述线性抗体可为单特异性的或双特异性的。
(vi)多特异性抗体
多特异性抗体对至少两种不同表位具有结合特异性，其中所述表位通常来自不同抗原。尽管所述分子通常将仅结合两种不同表位(即双特异性抗体BsAb)，但是当在本文中使用时，具有额外特异性的抗体诸如三特异性抗体由这个表述所涵盖。双特异性抗体可被制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab')2双特异性抗体)。
用于制备双特异性抗体的方法在本领域中是已知的。全长双特异性抗体的传统产生是基于共表达两个免疫球蛋白重链-轻链对，其中两条链具有不同特异性(Millstein等,Nature,305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤)产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一种具有正确双特异性结构。通常通过亲和色谱法步骤进行的对正确分子的纯化是相当麻烦的，并且产物产率低下。类似程序公开于WO 93/08829中以及Traunecker等,EMBO J.,10:3655-3659(1991)中。
本领域中已知的一种用于制备双特异性抗体的方法是“钮入孔(knobs-into-holes)”或“突起入空腔(protuberance-into-cavity)”方法(参见例如美国专利号5,731,168)。在这个方法中，两种免疫球蛋白多肽(例如重链多肽)各自包含界面。一种免疫球蛋白多肽的界面与另一免疫球蛋白多肽上的相应界面相互作用，由此允许两种免疫球蛋白多肽缔合。这些界面可经工程化以使位于一种免疫球蛋白多肽的界面中的“钮”或“突起”(这些术语可在本文中可互换使用)与位于另一免疫球蛋白多肽的界面中的“孔”或“空腔”(这些术语可在本文中可互换使用)对应。在一些实施方案中，孔与钮具有相同或类似尺寸，并且被适合地定位以使当两个界面相互作用时，一个界面的钮可位于另一界面的相应孔中。在不希望束缚于理论下，这被认为使异多聚体稳定，并且有利于超过其它种类例如同多聚体来形成异多聚体。在一些实施方案中，这个方法可用于促进两种不同免疫球蛋白多肽的异多聚化，从而产生包含两种对不同表位具有结合特异性的免疫球蛋白多肽的双特异性抗体。
在一些实施方案中，钮可通过用较大侧链替换小氨基酸侧链来构建。在一些实施方案中，孔可通过用较小侧链替换大氨基酸侧链来构建。钮或孔可存在于原始界面中，或它们可被合成引入。举例来说，钮或孔可通过改变编码界面的核酸序列以用至少一个“输入”氨基酸残基替换至少一个“原始”氨基酸残基来合成引入。用于改变核酸序列的方法可包括本领域中熟知的标准分子生物学技术。各种氨基酸残基的侧链体积显示于下表中。在一些实施方案中，原始残基具有小侧链体积(例如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸)，并且用于形成钮的输入残基是天然存在的氨基酸，且可包括精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。在一些实施方案中，原始残基具有大侧链体积(例如精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)，并且用于形成孔的输入残基是天然存在的氨基酸，且可包括丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。
表1b.氨基酸残基的性质
Figure BDA0001284997960000561
Figure BDA0001284997960000571
a氨基酸的分子量减去水的分子量。数值来自Handbook of Chemistry andPhysics,第43版Cleveland,Chemical Rubber Publishing Co.,1961。
b数值来自A.A.Zamyatnin,Prog.Biophys.Mol.Biol.24:107-123,1972。
c数值来自C.Chothia,J.Mol.Biol.105:1-14,1975。可及表面积在这个参考文献的图6-20中加以确定。
在一些实施方案中，基于异多聚体的三维结构鉴定用于形成钮或孔的原始残基。本领域中已知用于获得三维结构的技术可包括X射线晶体分析法和NMR。在一些实施方案中，界面是免疫球蛋白恒定结构域的CH3结构域。在这些实施方案中，人IgG1的CH3/CH3界面涉及在各结构域上位于4个反平行β链上的16个残基。在不希望束缚于理论下，突变的残基优选位于2个中心反平行β链上以使钮可被周围溶剂而非配偶体CH3结构域中的补偿性孔容纳的风险最小。在一些实施方案中，两种免疫球蛋白多肽中形成相应钮和孔的突变对应于下表中提供的一对或多对。
表2.示例性的各组相应钮和孔形成突变
Figure BDA0001284997960000572
Figure BDA0001284997960000581
突变通过以下方式来表示：原始残基，继之以使用Kabat编号系统的位置，接着是输入残基(所有残基都以单字母氨基酸代码给出)。多个突变由冒号分隔。
在一些实施方案中，免疫球蛋白多肽包含含有一个或多个列于上表2中的氨基酸取代的CH3结构域。在一些实施方案中，双特异性抗体包含第一免疫球蛋白多肽，所述第一免疫球蛋白多肽包含含有一个或多个列于表2的左列中的氨基酸取代的CH3结构域；和第二免疫球蛋白多肽，所述第二免疫球蛋白多肽包含含有一个或多个列于表2的右列中的相应氨基酸取代的CH3结构域。
在如上所讨论使DNA突变之后，编码具有一个或多个相应钮或孔形成突变的经修饰免疫球蛋白多肽的多核苷酸可使用本领域中已知的标准重组技术和细胞系统来表达和纯化。参见例如美国专利号5,731,168；5,807,706；5,821,333；7,642,228；7,695,936；8,216,805；美国公布号2013/0089553；以及Spiess等,Nature Biotechnology 31:753-758,2013。经修饰免疫球蛋白多肽可使用原核宿主细胞诸如大肠杆菌来产生。可以共培养方式在宿主细胞中表达相应钮和孔携带性免疫球蛋白多肽，并且以异多聚体形式一起纯化，或它们可以单培养方式表达，分别纯化，并且在体外装配。在一些实施方案中，使用本领域中已知的标准细菌培养技术共培养两种细菌宿主细胞菌株(一种表达具有钮的免疫球蛋白多肽，并且另一种表达具有孔的免疫球蛋白多肽)。在一些实施方案中，两种菌株可以特定比率混合例如以便在培养时实现相等表达水平。在一些实施方案中，两种菌株可以50:50、60:40或70:30比率混合。在多肽表达之后，可使细胞一起溶解，并且可提取蛋白质。本领域中已知的允许测量同多聚种类相对于异多聚种类的丰度的标准技术可包括尺寸排阻色谱法。在一些实施方案中，使用标准重组技术分别表达各经修饰免疫球蛋白多肽，并且它们可在体外一起装配。装配可例如通过以下方式来实现：纯化各经修饰免疫球蛋白多肽，以相等质量一起混合和孵育它们，使二硫化物还原(例如通过用二硫苏糖醇处理)，浓缩，以及使多肽再氧化。形成的双特异性抗体可使用标准技术包括阳离子交换色谱法纯化，并且使用标准技术包括尺寸排阻色谱法测量。对于这些方法的更详细描述，参见Speiss等,Nat Biotechnol31:753-8,2013。在一些实施方案中，经修饰免疫球蛋白多肽可分别在CHO细胞中表达，并且使用上述方法在体外装配。
根据一种不同方法，使具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变结构域融合于免疫球蛋白恒定结构域序列。优选地，融合是与包含至少一部分铰链区、CH2区和CH3区的免疫球蛋白重链恒定结构域融合。典型的是具有存在于至少一种融合物中的含有为轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物以及必要时免疫球蛋白轻链的DNA插入单独表达载体中，并且共同转染至适合宿主生物体中。这提供在用于构建的不等比率的三个多肽链提供最优产率时的实施方案中，调整三种多肽片段的相互比例的极大灵活性。然而，当以相等比率表达至少两个多肽链会产生高产率时或当比率不具有特定重要性时，有可能在一个表达载体中插入两个或所有三个多肽链的编码序列。
在这个方法的一个实施方案中，双特异性抗体由一个臂中的具有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链、以及另一臂中的杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。发现这个不对称结构有助于使所需双特异性化合物与非所要免疫球蛋白链组合分离，因为仅在双特异性分子的一半中存在免疫球蛋白轻链提供一种轻易分离方式。这个方法公开于WO 94/04690中。对于产生双特异性抗体的进一步细节，参见例如Suresh等,Methods in Enzymology,121:210(1986)。
根据WO96/27011中所述的另一方法，一对抗体分子之间的界面可经工程化以使从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大。一个界面包含抗体恒定结构域的至少一部分CH 3结构域。在这个方法中，一个或多个来自第一抗体分子的界面的小氨基酸侧链被较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链来在第二抗体分子的界面上产生尺寸与大侧链相同或类似的补偿性“空腔”。这提供一种用于使异二聚体的产率增加超过其它非所要最终产物诸如同二聚体的机理。
双特异性抗体包括交联抗体或“异源缀合物”抗体。举例来说，可使异源缀合物中的一种抗体偶联于抗生蛋白，另一种偶联于生物素。所述抗体已例如被提出以使免疫系统细胞靶向非所要细胞(美国专利号4,676,980)，以及用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO92/200373和EP 03089)。可使用任何适宜交联方法制备异源缀合物抗体。适合交联剂在本领域中是熟知的，并且连同许多交联技术一起公开于美国专利号4,676,980中。
用于从抗体片段产生双特异性抗体的技术也已描述于文献中。举例来说，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等,Science,229:81(1985)描述其中将完整抗体蛋白水解裂解以产生F(ab')2片段的程序。在二硫醇复合剂亚砷酸钠存在下还原这些片段以使邻近二硫醇稳定，并且防止分子间二硫化物形成。接着使产生的Fab'片段转化成硫硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。接着通过用巯基乙胺还原使一种Fab'-TNB衍生物再转化成Fab'-硫醇，并且与等摩尔量的另一Fab'-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。所产生的双特异性抗体可用作用于选择性固定酶的试剂。
新近进展已有助于从大肠杆菌直接回收Fab'-SH片段，其可被化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等,J.Exp.Med.,175:217-225(1992)描述完全人源化双特异性抗体F(ab')2分子的产生。各Fab'片段分别从大肠杆菌分泌，并且经受体外定向化学偶联以形成双特异性抗体。
也已描述用于直接从重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体片段的各种技术。举例来说，已使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体。Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)。通过基因融合使来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽连接于两种不同抗的Fab'部分。在铰链区处还原抗体同二聚体以形成单体，接着再氧化以形成抗体异二聚体。这个方法也可用于产生抗体同二聚体。由Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)所述的“微型双功能抗体”技术已提供一种用于制备双特异性抗体片段的替代性机理。片段包含重链可变结构域(VH)由接头连接于轻链可变结构域(VL)，所述接头太短以致不允许在同一链上的两个结构域之间配对。因此，一个片段的VH结构域和VL结构域被迫与另一片段的互补VL结构域和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。也已报道用于通过使用单链Fv(sFv)二聚体来制备双特异性抗体片段的另一策略。参见Gruber等,J.Immunol,152:5368(1994)。
用于制备双特异性抗体片段的另一技术是“双特异性T细胞衔接物”或
Figure BDA0001284997960000611
方法(参见例如WO2004/106381、WO2005/061547、WO2007/042261和WO2008/119567)。这个方法利用安置在单一多肽上的两个抗体可变结构域。举例来说，单一多肽链包括两个单链Fv(scFv)片段，各自具有由长度足以允许在两个结构域之间进行分子内缔合的多肽接头分隔的可变重链(VH)和可变轻链(VL)结构域。这个单一多肽进一步在两个scFv片段之间包括多肽间隔体序列。各scFv识别不同表位，并且这些表位可为不同细胞类型所特有，以致两种不同细胞类型的细胞在各scFv与它的同源表位衔接时被致使紧密邻近或栓系。这个方法的一个特定实施方案包括识别由免疫细胞表达的细胞表面抗原例如T细胞上的CD3多肽的scFv连接于识别由靶标细胞诸如恶性或肿瘤细胞表达的细胞表面抗原的另一scFv。
因为双特异性T细胞衔接物是单一多肽，所以它可使用本领域中已知的任何原核细胞表达系统来表达。然而，特定纯化技术(参见例如EP1691833)可为使单体双特异性T细胞衔接物与可具有除单体的预定活性以外的生物活性的其它多聚种类分离所必需。在一种示例性纯化流程中，首先使含有分泌多肽的溶液经受金属亲和色谱法，并且用某一咪唑浓度梯度洗脱多肽。使用阴离子交换色谱法进一步纯化这个洗脱物，并且使用某一氯化钠浓度梯度洗脱多肽。最后，使这个洗脱物经受尺寸排阻色谱法以使单体与多聚种类分离。
涵盖具有超过两价的抗体。举例来说，可制备三特异性抗体。Tuft等J.Immunol.147:60(1991)。
在一些实施方案中，双链蛋白质是多特异性抗体或双特异性抗体的一部分。多特异性抗体或双特异性抗体可含有两种或更多种本公开的单价抗体。
在一些实施方案中，双特异性抗体的第一抗原结合结构域包含一个或多个重链恒定结构域，其中所述一个或多个重链恒定结构域选自第一CH1(CH11)结构域、第一CH2(CH21)结构域、第一CH3(CH31)结构域；并且双特异性抗体的第二抗原结合结构域包含一个或多个重链恒定结构域，其中所述一个或多个重链恒定结构域选自第二CH1(CH12)结构域、第二CH2(CH22)结构域和第二CH3(CH32)结构域。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域的一个或多个重链恒定结构域中的至少一个与第二抗原结合结构域的另一重链恒定结构域配对。在一些实施方案中，CH31结构域和CH32结构域各自包含突起或空腔，并且其中CH31结构域中的突起或空腔可分别位于CH32结构域中的空腔或突起中。在一些实施方案中，CH31结构域和CH32结构域在所述突起与空腔之间的界面处相遇。CH31结构域和CH32结构域中的示例性的各组氨基酸取代显示于本文表2中。在一些实施方案中，CH21结构域和CH22结构域各自包含突起或空腔，并且其中CH21结构域中的突起或空腔可分别位于CH22结构域中的空腔或突起中。在一些实施方案中，CH21结构域和CH22结构域在所述突起与空腔之间的界面处相遇。在一些实施方案中，IgG的CH31结构域和/或CH32结构域在选自由以下组成的组的残基处含有一个或多个氨基酸取代：347、349、350、351、366、368、370、392、394、395、398、399、405、407和409，根据如美国专利号8,216,805的图5中所示的氨基酸编号。在一些实施方案中，突起包含一个或多个选自由以下组成的组的引入残基：精氨酸(R)残基、苯丙氨酸(F)残基、酪氨酸(Y)残基和色氨酸(W)残基。在一些实施方案中，空腔包含一个或多个选自由以下组成的组的引入残基：丙氨酸(A)残基、丝氨酸(S)残基、苏氨酸(T)残基和缬氨酸(V)残基。在一些实施方案中，CH3结构域和/或CH2结构域来自IgG(例如IgG1亚型、IgG2亚型、IgG2A亚型、IgG2B亚型、IgG3亚型或IgG4亚型)。在一些实施方案中，双特异性抗体的一个CH3结构域包含氨基酸取代T366Y，并且另一CH3结构域包含氨基酸取代Y407T。在一些实施方案中，一个CH3结构域包含氨基酸取代T366W，并且另一CH3结构域包含氨基酸取代Y407A。在一些实施方案中，一个CH3结构域包含氨基酸取代F405A，并且另一CH3结构域包含氨基酸取代T394W。在一些实施方案中，一个CH3结构域包含氨基酸取代T366Y和F405A，并且另一CH3结构域包含氨基酸取代T394W和Y407T。在一些实施方案中，一个CH3结构域包含氨基酸取代T366W和F405W，并且另一CH3结构域包含氨基酸取代T394S和Y407A。在一些实施方案中，一个CH3结构域包含氨基酸取代F405W和Y407A，并且另一CH3结构域包含氨基酸取代T366W和T394S。在一些实施方案中，一个CH3结构域包含氨基酸取代F405W，并且另一CH3结构域包含氨基酸取代T394S。突变通过以下方式来表示：原始残基，继之以使用Kabat编号系统的位置，接着是输入残基。也参见美国专利号8,216,805的图5中的编号。
(vii)单结构域抗体
在一些实施方案中，本公开的抗体是单结构域抗体。单结构域抗体是包含抗体的重链可变结构域的全部或部分或轻链可变结构域的全部或部分的单一多肽链。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,Mass.；参见例如美国专利号6,248,516B1)。在一个实施方案中，单结构域抗体由抗体的重链可变结构域的全部或部分组成。
(viii)抗体变体
在一些实施方案中，涵盖本文所述的抗体的氨基酸序列修饰。举例来说，可合乎需要的是改进抗体的结合亲和力和/或其它生物性质。可通过将适当变化引入编码抗体的核苷酸序列中，或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。所述修饰包括例如抗体的氨基酸序列内的残基缺失和/或插入和/或取代。可对缺失、插入和取代进行任何组合以获得最终构建体，前提是最终构建体具有所需特征。氨基酸改变可在产生序列时引入主题抗体氨基酸序列中。
(ix)取代、插入和缺失变体
在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。用于取代性诱变的目标位点包括HVR和FR。保守性取代以标题“保守性取代”显示于表1中。更实质性变化以标题“示例性取代”提供于表1中，并且如以下关于氨基酸侧链类别进一步所述。可将氨基酸取代引入目标抗体中，并且筛选具有所需活性例如维持/改进的抗原结合性、降低的免疫原性或改进的ADCC或CDC的产物。
表3.示例性取代。
Figure BDA0001284997960000641
Figure BDA0001284997960000651
可根据共同侧链性质将氨基酸分组：
a.疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
b.中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
c.酸性：Asp、Glu；
d.碱性：His、Lys、Arg；
e.影响链定向的残基：Gly、Pro；
f.芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将必须伴有将这些类别中的一个的成员更换成另一类别。
一种类型的取代性变体涉及取代亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗体将在某些生物性质方面具有改变(例如改进)(例如亲和力增加、免疫原性降低)和/或将具有亲本抗体的大致上得以保留的某些生物性质。一示例性取代性变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文所述的那些来便利地产生。简要来说，使一个或多个HVR残基突变，并且使变体抗体展示在噬菌体上并针对特定生物活性(例如结合亲和力)加以筛选。
可在HVR中进行改变(例如取代)例如以改进抗体亲和力。可在HVR“热点”(即由在体细胞成熟过程期间在高频率下经受突变的密码子编码的残基)(参见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)中进行所述改变，并且测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建次级文库并从其进行再选择来达成亲和力成熟已例如描述于Hoogenboom等,Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等编,HumanPress,Totowa,NJ,(2001).)中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易出错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任一种将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。接着产生次级文库。接着筛选文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。用以引入多样性的另一方法涉及HVR定向方法，其中使若干HVR残基(例如一次4-6个残基)随机化。可例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定抗原结合中涉及的HVR残基。特定来说，CDR-H3和CDR-L3常常被靶向。
在某些实施方案中，取代、插入或缺失可发生在一个或多个HVR内，只要所述改变不实质上降低抗体结合抗原的能力即可。举例来说，可在HVR中进行不实质上降低结合亲和力的保守性改变(例如如本文提供的保守性取代)。所述改变可处于HVR“热点”或SDR外部。在以上提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，各HVR未被改变，或含有至多一个、两个或三个氨基酸取代。
一种适用于鉴定抗体的可被靶向来诱变的残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在这个方法中，鉴定某一残基或一组靶标残基(例如带电荷残基，诸如arg、asp、his、lys和glu)，并且用中性或带负电荷氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受影响。可在对初始取代显示功能性敏感性的氨基酸位置处引入进一步取代。或者或另外，抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴定抗体与抗原之间的接触点。所述接触残基和邻近残基可作为取代候选物被靶向或消除。可筛选变体以确定它们是否含有所需性质。
氨基酸序列插入物包括长度在一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的范围内的氨基末端和/或羧基末端融合物，以及具有单一或多个氨基酸残基的序列内插入物。末端插入物的实例包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入性变体包括抗体与增加抗体的血清半衰期的酶(例如用于ADEPT)或多肽的N末端或C末端融合物。
(x)Fc区变体
在某些实施方案中，可将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区中，由此产生Fc区变体。Fc区变体可包含在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中，本公开涵盖具有一些而非所有效应物功能的抗体变体，此使得所述抗体变体成为合乎各种应用需要的候选物，在所述应用中，抗体在体内的半衰期是重要的，但某些效应物功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。举例来说，可进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合性(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的初级细胞NK细胞仅表达Fc(RIII，而单核细胞表达Fc(RI、Fc(RII和Fc(RIII。FcR在造血细胞上的表达概述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中。用以评估目标分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))以及Hellstrom,I等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中。或者，可采用非放射性测定方法，参见例如用于流式细胞计量术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox
Figure BDA0001284997960000681
非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI)。适用于所述测定的效应细胞包括外周血液单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者或另外，可在体内，例如在诸如Clynes等Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中公开的动物模型中评估目标分子的ADCC活性。也可进行C1q结合测定以确认抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为评估补体活化，可进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等,Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。也可使用本领域中已知的方法进行FcRn结合和体内清除率/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.等,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
效应物功能降低的抗体包括Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个被取代的那些(美国专利号6,737,056)。所述Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括残基265和297被取代成丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述与FcR的结合得以改进或减弱的某些抗体变体。(参见例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312以及Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001).)
在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个改进ADCC的氨基酸取代(例如在Fc区的位置298、333和/或334(EU残基编号)处的取代)的Fc区在一个示例性实施方案中，抗体在它的Fc区中包含以下氨基酸取代：S298A、E333A和K334A。
在一些实施方案中，在Fc区中进行导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即改进或减弱)的改变，例如如美国专利号6,194,551、WO 99/51642以及Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。
半衰期增加且与负责将母体IgG转移至胎儿的新生儿Fc受体(FcRn)(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)and Kim等,J.Immunol.24:249(1994))的结合得以改进的抗体描述于US2005/0014934A1(Hinton等)中。那些抗体包含其中具有一个或多个改进Fc区与FcRn的结合的取代的Fc区。所述Fc变体包括在以下一个或多个Fc区残基处具有取代的那些：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。也参见涉及Fc区变体的其它实例的Duncan和Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及WO 94/29351。
(xi)抗体衍生物
本公开的抗体可被进一步修饰以含有本领域中已知且可易于获得的额外非蛋白质部分。在某些实施方案中，适于使抗体衍生的部分是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧杂环戊烷、聚1,3,6-三噁烷、乙烯/顺丁烯二酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、以及右旋糖苷或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚合物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于它在水中的稳定性而可具有制造优势。聚合物可具有任何分子量，并且可为分支的或未分支的。连接于抗体的聚合物的数目可变化，并且如果连接一个以上聚合物，那么它们可为相同或不同分子。一般来说，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可基于包括但不限于以下的考虑事项加以确定：待改进的抗体的特定性质或功能、抗体衍生物是否将在确定条件下用于疗法中等。
(xii)载体、宿主细胞和重组方法
也可使用重组方法产生抗体。对于重组产生抗抗原抗体，将编码所述抗体的核酸分离并插入可复制载体中以进行进一步克隆(扩增DNA)或表达。使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，可易于分离和测序编码抗体的DNA。许多载体是可用的。载体组分通常包括但不限于以下中的一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
(a)信号序列组分
本公开的抗体可不仅直接重组产生，而且也以与异源性多肽的融合多肽形式重组产生，所述异源性多肽优选是在成熟蛋白质或多肽的N末端的信号序列或具有特定裂解位点的其它多肽。所选异源性信号序列优选是由宿主细胞识别和处理(例如由信号肽酶裂解)的信号序列。对于不识别和处理天然抗体信号序列的原核宿主细胞，信号序列用例如选自碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II前导物的组的原核信号序列替代。
(b)复制起点
表达载体与克隆载体两者均含有使得载体能够在一种或多种所选宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，这个序列是使得载体能够独立于宿主染色体DNA进行复制的序列，并且包括复制起点或自主复制序列。用于多种原核宿主细胞的所述序列是熟知的。举例来说，来自质粒pBR322的复制起点适于大多数革兰氏阴性细菌。
(c)选择基因组分
表达载体和克隆载体可含有选择基因，也被称为可选择标记。典型选择基因编码以下蛋白质：其(a)赋予对抗生素或其它毒素例如氨苄青霉素(ampicillin)、新霉素(neomycin)、甲氨蝶呤(methotrexate)或四环素(tetracycline)的抗性；(b)弥补营养缺陷性缺陷；或(c)供给不可从复合培养基获得的关键营养物，例如编码用于杆菌属(Bacilli)的D-丙氨酸外消旋酶的基因。
选择流程的一个实例利用药物来阻滞宿主细胞的生长。用异源性基因成功转化的那些细胞产生赋予药物抗性的蛋白质，并且因此在选择方案的情况下存活。所述显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸(mycophenolic acid)和潮霉素(hygromycin)。
另一选择方案使用具有染色体缺失的原核宿主细胞，所述缺失移除其基因产物为在特定培养基中生长所必需的基因。在这些实例的情况下，当在特定培养基中生长时，用弥补宿主细胞的染色体缺失的异源性基因成功转化的那些细胞将存活。适用于这个流程中的基因的实例可包括营养缺陷标记基因，或为在使宿主细胞在特定培养基中生长时产生必需营养物所需的其它基因。
(d)启动子组分
表达载体和克隆载体通常含有由宿主生物体识别，并且可操作地连接于编码抗体的核酸的启动子。适于与原核宿主一起使用的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子诸如tac启动子。然而，其它已知细菌启动子是适合的。用于细菌系统中的启动子也将含有可操作地连接于编码抗体的DNA的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
(e)翻译起始区组分
如上所述，已知翻译起始区(TIR)对于重组蛋白在原核宿主细胞中的翻译是重要的(参见例如Simmons LC和Yansura DG 1996Nat.Biotechnol.14:629以及Vimberg V等2007BMC Mol.Biol.8:100)。TIR可决定翻译单元的翻译效率。TIR通常包括翻译单元特征物诸如起始密码子、Shine-Dalgarno(SD)序列和翻译增强子。TIR可进一步包括编码信号肽的分泌信号序列。TIR的特征物之间的序列和间隔可调控翻译起始效率。对于在产生蛋白质时使用TIR的进一步描述，参见例如美国专利号5,840,523(Simmons等)，其描述用于使表达和分泌最优化的翻译起始区(TIR)和信号序列。
(f)转录终止组分
用于原核宿主细胞中的表达载体也可含有为终止转录以及使mRNA稳定所必需的序列。在原核细胞中，终止子可包括Rho依赖性或Rho非依赖性终止子。适用于原核宿主细胞中的终止子的一个实例包括不限于λt0终止子(Scholtissek和Grosse,Nucleic AcidsRes.15:3185,1987)。
III.方法优化
本文提供通过以下方式来在原核宿主细胞中产生含有两条链的多肽的方法：培养所述宿主细胞以表达所述多肽的所述两条链，其中在表达后，所述两条链折叠并装配以在所述宿主细胞中形成生物活性多肽，其中在培养基中在包括以下的条件下培养所述宿主细胞：包括生长温度和生长搅拌速率的生长期，和包括产生温度和产生搅拌速率的产生期，其中所述生长温度高于所述产生温度2至10℃，并且所述生长搅拌速率高于所述产生搅拌速率50至250rpm。本公开惊人地发现某些产生方法优化实现在双链蛋白质的产率方面显著增加，如由本文所述的数据所证明。
(g)宿主细胞的选择和转化
本公开的某些方面涉及原核宿主细胞。适于克隆或表达本文载体中的DNA的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)诸如埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans))和志贺氏菌属(Shigella)，以及杆菌纲(诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD 266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P))、假单胞菌属(Pseudomonas)(诸如绿脓假单胞菌(P.aeruginosa))和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，但其它菌株诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)是适合的。这些实例是说明性的而非限制性的。
在一些实施方案中，原核宿主细胞是革兰氏阴性细菌。革兰氏阴性细菌是指含有包围通过革兰氏染色(Gram staining)加以检测的肽聚糖层的外膜的任何细菌。许多革兰氏阴性细菌宿主细胞在本领域中是已知的。举例来说，已知革兰氏阴性细菌包括不限于变形菌门(proteobacteria)，诸如α变形菌纲(Alphaproteobacteria)、β变形菌纲(Betaproteobacteria)、γ变形菌纲(Gammaproteobacteria)、ζ变形菌纲(Zetaproteobacteria)、ε变形菌纲(Epsilonproteobacteria)、δ变形菌纲(Deltaproteobacteria)，以及酸杆菌门(Acidobacteria)；蓝菌门(cyanobacteria)；和螺旋体门(spirochaetes)。熟知革兰氏阴性细菌可包括来自诸如埃希氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、假单胞菌属、螺杆菌属(Heliobacter)、军团菌属(Legionella)、奈瑟菌属(Neisseria)和克雷伯氏菌属的属的种。
在一些实施方案中，本公开的革兰氏阴性细菌是大肠杆菌。如本文所用，大肠杆菌可指属于大肠杆菌种的细菌的任何菌株或分离株。大肠杆菌可包括天然存在的菌株或已诸如通过突变或用如本文所述的质粒转化来遗传修饰的菌株。
在一些实施方案中，本公开的大肠杆菌是缺乏内源性蛋白酶活性的菌株。在不希望束缚于理论下，据认为缺乏内源性蛋白酶活性的菌株可允许增强产生重组蛋白，诸如本公开的周质蛋白质，因为一些内源性蛋白酶针对重组表达的底物具有活性(对于一个所述实例，参见Baneyx F和Georgiu G 1990J.Bacteriol.172(1):491)。缺乏内源性蛋白酶活性的菌株可包括其中编码内源性蛋白酶的基因被突变、缺失或另外失活的菌株。所述基因的实例可包括不限于degP、prc和ompT。用于将突变引入广泛多种原核宿主细胞中(例如以获得缺乏内源性蛋白酶活性的工程改造菌株)的方法在本领域中是熟知的，参见例如SnyderL等2013Molecular Genetics of Bacteria第4版ASM Press)。
可在细菌中产生双链蛋白质诸如全长抗体、抗体融合蛋白和抗体片段，特别是当不需要糖基化和Fc效应物功能时，诸如当使治疗性抗体缀合于本身在破坏肿瘤细胞方面显示有效性的细胞毒性剂(例如毒素)时。全长抗体在循环中具有更久半衰期。在大肠杆细菌中的产生更快，并且更具有成本效率。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如美国专利号5,648,237(Carter等)、美国专利号5,789,199(Joly等)、描述用于使表达和分泌最优化的翻译起始区(TIR)和信号序列的美国专利号5,840,523(Simmons等)。也参见Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,N.J.,2003),第245-254页，其描述在大肠杆菌中表达抗体片段。在表达之后，可将抗体从大肠杆菌细胞糊状物分离于可溶性部分中，并且可视同种型而定通过例如蛋白质A或G管柱来纯化。最终纯化可类似于用于纯化例如在CHO细胞中表达的抗体的方法来进行。
用上述用于产生双链蛋白质的表达或克隆载体转化宿主细胞，并且在如适于诱导启动子，选择转化体，或扩增编码所需序列的基因加以改良的常规营养培养基中培养。
(h)培养宿主细胞
本公开的某些方面涉及在培养基中在包括生长期和产生期的条件下培养宿主细胞。这些时期各自可进一步涉及在特定时期期间使宿主细胞生长所处的条件。举例来说，如本文所用，生长期可包括生长温度和生长搅拌速率，并且产生期可包括产生温度和产生搅拌速率。
生长期可指宿主细胞的培养物以指数方式生长所处的任何时间。如本文所用的生长温度可指含有本公开的宿主细胞的培养基在所述宿主细胞的生长期期间的温度。宿主细胞培养物的生长期可通过本领域中通常已知的方法来确定，例如通过随时间测量培养物的光密度(例如在约550nm、约600nm的波长或两者之间的波长下)以及确定指数生长期何时停止。如果宿主细胞含有具有pho启动子的载体，那么生长期可指宿主细胞的培养物以指数方式生长，并且培养基中磷酸盐的浓度足以防止诱导pho启动子介导的基因转录所处的任何时间。
产生期可指宿主细胞的培养物产生产物所处的任何时间。如本文所用的产生温度可指含有本公开的宿主细胞的培养基在所述宿主细胞的产生期期间的温度。如果宿主细胞含有具有驱动产物的表达的pho启动子的载体，那么生长期可指培养基中磷酸盐的浓度足够低下以诱导pho启动子介导的产物基因转录所处的任何时间。
在一些实施方案中，在高于产生温度2℃至10℃的生长温度下培养本公开的宿主细胞。在一些实施方案中，在高于产生温度2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃的生长温度下培养本公开的宿主细胞。在一些实施方案中，生长温度高于产生温度小于约任何以下量(以℃计)：10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3或2.5。在一些实施方案中，生长温度高于产生温度大于约任何以下量(以℃计)：2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5。也就是说，生长温度高于产生温度具有上限10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3或2.5，和独立选择的下限2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5的任何数量范围，其中所述下限小于所述上限。
在一些实施方案中，在生长期期间，生长温度在约30℃至约34℃的范围内。在一些实施方案中，在生长期期间，生长温度是约30℃、约30.5℃、约31℃、约31.5℃、约32℃、约32.5℃、约33℃、约33.5℃或约34℃。在一些实施方案中，在生长期期间，生长温度小于约任何以下温度(以℃计)：34、33.5、33、32.5、32、31.5、31或30.5。在一些实施方案中，在生长期期间，生长温度大于约任何以下温度(以℃计)：30、30.5、31、31.5、32、32.5、33或33.5。也就是说，在生长期期间，生长温度可为具有上限34、33.5、33、32.5、32、31.5、31或30.5，和独立选择的下限30、30.5、31、31.5、32、32.5、33或33.5的任何温度(以℃计)范围，其中所述下限小于所述上限。
在一些实施方案中，在产生期期间，产生温度在约25℃至约29℃的范围内。在一些实施方案中，在产生期期间，产生温度是约25℃、约25.5℃、约26℃、约26.5℃、约27℃、约27.5℃、约28℃、约28.5℃或约29℃。在一些实施方案中，在产生期期间，产生温度小于约任何以下温度(以℃计)：29、28.5、28、27.5、27、26.5、26或25.5。在一些实施方案中，在产生期期间，产生温度大于约任何以下温度(以℃计)：25、25.5、26、26.5、27、27.5、28或28.5。也就是说，在产生期期间，产生温度可为具有上限29、28.5、28、27.5、27、26.5、26或25.5，和独立选择的下限25、25.5、26、26.5、27、27.5、28或28.5的任何温度(以℃计)范围，其中所述下限小于所述上限。
搅拌速率是指搅拌(例如通过振荡)细胞培养物所处的速率。如本文所用的生长搅拌速率可指在本公开的宿主细胞的生长期期间搅拌含有所述宿主细胞的培养物所处的速率。如本文所用的产生搅拌速率可指在本公开的宿主细胞的产生期期间搅拌含有所述宿主细胞的培养物所处的速率。可搅拌细胞培养物以维持细胞培养物的通气。
在一些实施方案中，在高于产生搅拌速率50至250rpm的生长搅拌速率下培养本公开的宿主细胞。在一些实施方案中，在高于产生搅拌速率50rpm、75rpm、100rpm、125rpm、150rpm、175rpm、200rpm、225rpm或250rpm的生长搅拌速率下培养本公开的宿主细胞。在一些实施方案中，生长搅拌速率高于产生搅拌速率小于约任何以下速率(以rpm计)：250、225、200、175、150、125、100或75。在一些实施方案中，生长搅拌速率低于产生搅拌速率大于约任何以下速率(以rpm计)：50、75、100、125、150、175、200或225。也就是说，生长搅拌速率高于产生搅拌速率具有上限250、225、200、175、150、125、100或75，和独立选择的下限50、75、100、125、150、175、200或225的任何速率(以rpm计)范围，其中所述下限小于所述上限。
在一些实施方案中，在生长期期间，生长搅拌速率在约600至800rpm的范围内。在一些实施方案中，在生长期期间，生长搅拌速率是约600rpm、约625rpm、约650rpm、约675rpm、约700rpm、约725rpm、约750rpm、约775rpm或约800rpm。在一些实施方案中，生长搅拌速率小于约任何以下速率(以rpm计)：800、775、750、725、700、675、650或625。在一些实施方案中，在生长期期间，生长搅拌速率大于约任何以下速率(以rpm计)：600、625、650、675、700、725、750或775。也就是说，在生长期期间，生长搅拌速率是具有上限800、775、750、725、700、675、650或625，和独立选择的下限600、625、650、675、700、725、750或775的任何速率(以rpm计)范围，其中所述下限小于所述上限。
在一些实施方案中，在产生期期间，产生搅拌速率在约300至500rpm的范围内。在一些实施方案中，在产生期期间，产生搅拌速率是约300rpm、约325rpm、约350rpm、约375rpm、约400rpm、约425rpm、约450rpm、约475rpm或约500rpm。在一些实施方案中，在产生期期间，产生搅拌速率小于约任何以下速率(以rpm计)：500、475、450、425、400、375、350或325。在一些实施方案中，在产生期期间，产生搅拌速率大于约任何以下速率(以rpm计)：300、325、350、375、400、425、450或475。也就是说，在产生期期间，产生搅拌速率是具有上限500、475、450、425、400、375、350或325，和独立选择的下限300、325、350、375、400、425、450或475的任何速率(以rpm计)范围，其中所述下限小于所述上限。
在不希望束缚于理论下，据认为当限制氧浓度时，氧转移速率(OTR)等于细胞的氧摄取速率(OUR)或代谢速率。可通过调整搅拌速率来促进对OTR的操纵，由此操纵OUR。对OUR和它与OTR的关系的更详细描述可见于Ochoa-Garcia等,Biotechnol.Adv.27:153,2009中。用于测量细胞培养物的OUR的技术在本领域中是已知的，并且包括不限于使用质谱仪来监测来自细胞培养物的排气的组成，以及计算细胞培养物的氧摄取速率和二氧化碳逸出速率。
在一些实施方案中，在足以实现在生长期期间宿主细胞中氧摄取速率高于在产生期期间宿主细胞中峰值氧摄取速率0.5至2.5mmol/L/min的生长搅拌速率下培养本公开的宿主细胞。本公开发现使在产生期期间细胞培养物的搅拌速率降低至足以实现宿主细胞中氧摄取速率相较于生长期小于约2.5mmol/L/min的速率极大增强产物诸如本公开的双链多肽的产生。
在一些实施方案中，在足以实现在生长期期间宿主细胞中氧摄取速率高于在产生期期间宿主细胞中峰值氧摄取速率0.5mmol/L/min、1.0mmol/L/min、1.5mmol/L/min、2.0mmol/L/min或2.5mmol/L/min的生长搅拌速率下培养本公开的宿主细胞。在一些实施方案中，在足以实现在生长期期间宿主细胞中氧摄取速率高于在产生期期间宿主细胞中峰值氧摄取速率小于约任何以下氧摄取速率(以mmol/L/min计)的生长搅拌速率下培养本公开的宿主细胞：2.5、2.0、1.5或1.0。在一些实施方案中，在足以实现在生长期期间宿主细胞中氧摄取速率高于在产生期期间宿主细胞中峰值氧摄取速率大于约任何以下氧摄取速率(以mmol/L/min计)的生长搅拌速率下培养本公开的宿主细胞：0.5、1.0、1.5、2.0或2.5。也就是说，在足以实现在生长期期间宿主细胞中氧摄取速率高于在产生期期间宿主细胞中峰值氧摄取速率具有上限2.5、2.0、1.5或1.0，和独立选择的下限0.5、1.0、1.5、2.0或2.5的任何氧摄取速率(以mmol/L/min计)范围的生长搅拌速率下培养本公开的宿主细胞。
在一些实施方案中，在生长期期间，宿主细胞的峰值氧摄取速率在3.5mmol/L/min至4.5mmol/L/min的范围内。在一些实施方案中，在生长期期间，宿主细胞的峰值氧摄取速率是3.5mmol/L/min、3.75mmol/L/min、4.0mmol/L/min、4.25mmol/L/min或4.5mmol/L/min。在一些实施方案中，在产生期期间，宿主细胞的氧摄取速率在1.0mmol/L/min至3.0mmol/L/min的范围内。在一些实施方案中，在产生期期间，宿主细胞的氧摄取速率是1.0mmol/L/min、1.25mmol/L/min、1.5mmol/L/min、1.75mmol/L/min、2.0mmol/L/min、2.25mmol/L/min、2.5mmol/L/min、2.75mmol/L/min或3.0mmol/L/min。
在一些实施方案中，在高于产生搅拌速率约10％至约40％(rpm/rpm)的生长搅拌速率下培养本公开的宿主细胞。在一些实施方案中，在具有下限即产生搅拌速率的至少10％、15％、20％、25％、30％或35％(rpm/rpm)，和独立选择的上限即产生搅拌速率的至多40％、35％、30％、25％、20％或15％(rpm/rpm)的生长搅拌速率下培养宿主细胞。在一优选实施方案中，在10L发酵罐中在1巴背压和20L/min的通气速率下培养本公开的宿主细胞。
可在多种培养基中培养本公开的宿主细胞。如本文所用的“培养基”是指支持本公开的细菌的生长的任何组合物或培养液。适合培养基可为液体或固体，并且含有支持细胞的生长和活力的任何营养物、盐、缓冲剂、元素和其它化合物。培养基的常见营养物可包括氮、碳、氨基酸、碳水化合物、微量元素、维生素和矿物质来源。这些营养物可以个别组分形式(如在确定培养基的情况下)或作为复杂提取物(例如酵母提取物)的组分加以添加。培养基可富含营养物以支持快速生长或最低限度地含有营养物以支持较缓慢生长。培养基也可含有用于抑制污染性生物体的生长或杀灭污染性生物体的任何试剂(例如抗生素)。培养基也可含有用于控制诱导型启动子或酶的活性的任何化合物(作为一个实例，可包括IPTG以诱导由lac操纵元或在功能上类似的启动子控制的任何多核苷酸的表达)。适合培养基的许多实例在本领域中是熟知的，并且包括不限于M9培养基、溶原性培养液(LB)、极品培养液(TB)、NZY培养液、SOB培养基和YT培养液。
任何这些培养基必要时都可补充以盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素、抗霉物质、微量元素(定义为通常在微体积摩尔浓度范围内的最终浓度下存在的无机化合物)、葡萄糖和/或适当能量来源。见于原核细胞培养基中的典型成分包括酵母提取物、盐(例如NaCl)、胰蛋白胨、缓冲剂(例如磷酸盐缓冲剂)、甘油等。任何其它必要补充剂也可在将为本领域技术人员所知的适当浓度下加以包括。诸如温度、pH等的培养条件是先前在选择用于表达的原核宿主细胞的情况下使用的那些，并且将为普通熟练技术人员显而易知。
(i)纯化生物活性多肽
本公开的某些方面涉及从宿主细胞回收生物活性多肽。通常，回收(术语“纯化(purifying/purification)可在本文中可互换使用)本公开的生物活性多肽涉及从宿主细胞(或如果多肽被分泌至培养基中，那么从细胞培养基)分离所述多肽，以及从其它相伴大分子例如细胞碎片和其它多肽纯化所述多肽。用于从多种宿主细胞区室纯化多种蛋白质的众多技术在本领域中是已知的(参见例如Evans,Jr.,TC和Xu MQ(编)Heterologous GeneExpression in E.coli(2011)Methods in Molecular Biology第705卷,Humana Press)。以下描述示例性技术，但这些技术仅出于说明性目的而包括以补充熟练技术人员的理解，并且决不意图具有限制性。
当使用重组技术时，双链蛋白质诸如分泌蛋白可在细胞内，在周质间隙中产生，或直接分泌至培养基中。如果分泌蛋白在细胞内产生，那么作为第一步骤，例如通过离心或超滤来移除颗粒碎片，即宿主细胞或经溶解片段。
在一些实施方案中，从宿主细胞的周质回收分泌蛋白。Carter等,Bio/Technology10:163-167(1992)描述用于分离分泌至大肠杆菌的周质间隙中的分泌蛋白的程序。简要来说，在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯基甲基磺酰氟(PMSF)存在下历经约30分钟使细胞糊状物解冻。可通过离心来移除细胞碎片。当分泌蛋白被分泌至培养基中时，通常首先使用可商购获得的蛋白质浓缩过滤器例如Amicon或Millipore Pellicon超滤装置来浓缩来自所述表达系统的上清液。可将蛋白酶抑制剂诸如PMSF包括在任何先前步骤中以抑制蛋白水解，并且可包括抗生素以防止不定污染物的生长。
由细胞制备的分泌蛋白组合物可使用例如羟磷灰石色谱法、疏水性相互作用色谱法、凝胶电泳、透析和亲和色谱法来纯化，其中亲和色谱法属于通常优选的纯化步骤之一。关于抗体，蛋白质A作为亲和配体的适合性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白质A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白质G被推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等,EMBO J.5:15671575(1986))。亲和配体所连接的基质最常是琼脂糖，但其它基质是可用的。相比于可用琼脂糖实现的流速和处理时间，机械稳定基质诸如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允许流速更快以及处理时间更短。当抗体包含CH3结构域时，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)适用于纯化。视待回收的抗体而定，其它蛋白质纯化技术诸如在离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅色谱法、肝素SEPHAROSETM色谱法、阴离子或阳离子交换树脂色谱法(诸如聚天冬氨酸柱)、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀也是可用的。本领域技术人员将认识到适用于抗体回收的许多这些技术可易于应用于回收其它双链蛋白质诸如分泌蛋白。
一般来说，用于制备供在研究、测试和临床中使用的抗体的各种方法在本领域中是明确确定的，与上述方法一致和/或如由本领域技术人员视为适于特定目标抗体。
实施例
通过参照以下实施例，本公开将得以更充分了解。然而，它们不应被解释为限制本公开的范围。应了解本文所述的实施例和实施方案仅出于说明目的，并且根据其的各种修改或变化将为本领域技术人员所想起，并将包括在本申请的精神和界限以及随附权利要求的范围内。
缩写：Ab(抗体)、hAb(半抗体)、HC(重链)、ImmTAC(抗癌免疫动员单克隆T细胞受体)、IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷)、LC(轻链)、OD(光密度)、ORF(开放阅读框)、OTR(氧转移速率)、OUR(氧摄取速率)、Tg(生长温度)、Tp(产生温度)、TIR(翻译起始区)、xIL4(抗白介素-4)、xIL13(抗白介素-13)、xIL17(抗白介素-17)和xIL33(抗白介素-33)。
实施例1：伴侣蛋白和氧化还原酶水平对半抗体产生效价的影响
使用重组技术产生异源性分泌蛋白对于许多治疗性分子是重要的。多特异性抗体(例如双特异性抗体)是具有许多重要治疗用途诸如癌症免疫疗法和其它应用的异源性分泌蛋白的一个非限制性实例。产生供治疗使用的多特异性抗体要求能够在工业规模上产生这些抗体诸如半抗体(hAb)的构筑嵌段。为满足这个要求，本文描述超过标准方法在产生方面给予显著增加的优化表达载体和方法步骤。重要的是，发现用于与伴侣蛋白FkpA、DsbA和DsbC组合共表达hAb的重链(HC)和轻链(LC)的单一质粒或可相容质粒系统显著增强经装配hAb的产生。测试这个系统，并且发现其改进多种hAb的产生，从而证明它用于产生许多分泌蛋白的广泛效用。随后对方法步骤(包括例如搅拌速率、pH、FkpA启动子和在不同培养时期的培养温度)的优化导致产物产率甚至进一步显著增加。
材料和方法
半抗体(hAb)载体构建
以与EP1356052中所述的方式类似的那些方式构建载体。特定来说，制备用于表达hAb的各种表达载体。对于各载体，将表达盒在EcoRI位点处克隆至大肠杆菌质粒pBR322的框架中(Sutcliffe,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.43:77-90,1978)。各表达盒含有至少以下组分：(1)用于控制转录的phoA启动子(Kikuchi等,Nucleic Acids Res.9:5671-5678,1981)；(2)用于翻译起始的来自大肠杆菌trp的Shine-Dalgarno序列、热稳定肠毒素II(STII)信号序列或两者组合(Chang等,Gene 55:189-196,1987)；和(3)用以终止转录的λt0终止子(Scholtissek和Grosse,Nucleic Acids Res.15:3185,1987)。另外，STII信号序列或此信号序列的沉默密码子变体位于轻链或重链的编码序列之前。这个序列引导多肽分泌至周质中(Picken等,Infect.Immun.42:269-275,1983；以及Simmons和Yansura,Nature Biotechnology 14:629-634,1996)。
设计具有单独顺反子的载体以提供免疫球蛋白轻链和重链基因的独立表达。在此类载体中，各链的顺反子单元在它的自身PhoA启动子的控制下，并且继之以λt0终止子。此外，各顺反子并有TIR(翻译起始区)以调节轻链与重链两者的表达(Simmons等,J.Immunol.Meth.,263:133-147,2002)。在一个示例性实施方案中，表达盒从5’至3’含有第一PhoA启动子，继之以轻链的顺反子(TIR-L+轻链)和第一λt0终止子，以及第二PhoA启动子，继之以重链的顺反子(TIR-H+重链)和第二λt0终止子。或者，表达盒从5’至3’含有第一PhoA启动子，继之以重链的顺反子(TIR-H+重链)和第一λt0终止子，以及第二PhoA启动子，继之以轻链的顺反子(TIR-L+轻链)和第二λt0终止子。TIR-L与TIR-H两者均含于STII信号序列或其变体内。
对于xIL13和xIL4 IgG4 hAb表达载体，评估1,1和2,2的TIR组合。对于xIL17和xIL33 IgG4 hAb表达载体，评估TIR2,2。第一编号代表轻链的TIR强度，并且第二编号代表重链的TIR强度。除xIL13、xIL4、xIL17和xIL33 IgG4 hAb之外，也构建并测试其它IgG1同种型hAb载体。
伴侣蛋白表达质粒构建
为测定待与上述载体组合以产生xIL13、xIL4、xIL17和xIL33hAb的最高效价的伴侣蛋白表达，提供用于共表达的质粒。测试许多已知伴侣蛋白，包括FkpA蛋白，即具有伴侣蛋白活性的肽基脯氨酰基顺-反异构酶。为此，构建含有FkpA的ORF的可相容质粒(pACYC，Novagen,Madison,WI)，如EP1356 052(参见例如实施例9-10，特别是段落[0207])中所述。
根据当前方法的这个操作进行扩展，类似地产生一组FkpA可相容载体以调节FkpA共表达水平。通过如先前所述优化信号肽来实现对FkpA水平的调节(Simmons和Yansura(上文),1996)。简要来说，FkpA ORF的5’末端含有FkpA信号肽(天然或变体)或STII信号肽。所有FkpA变体基因构建体都在tacII启动子的控制下。
接着将这些质粒与上述hAb表达质粒共转化至菌株66F8中。宿主菌株66F8的基因型是W3110 ΔfhuA ΔphoA ilvG2096(Valr)Δprc spr43H1 ΔdegP ΔmanA lacIQ ΔompTΔmenE。
对于xIL13 hAb，构建编码半抗体的LC和HC以及FkpA的TIR1,1和TIR2,2质粒，并且用于转化66F8。在这些质粒构建体中，FkpA的表达由在LC的ORF的上游的phoA启动子控制。pBR322质粒通常在约30个拷贝/细胞下维持(Bolivar等,Gene,2:95-113,1977)，并且pACYC质粒通常在约15个拷贝/细胞下维持(Chang和Cohen,J.Bacteriol.,134:1141-1156,1978)。在不希望束缚于理论下，据认为当将FkpA移动于Ab表达质粒上时的拷贝数增加可导致制备的FkpA的量增加。
氧化还原酶质粒构建
类似于对于FkpA的共表达所述的可相容质粒系统，可相容质粒与并有一种先前描述的FkpA TIR变体的hAb表达质粒组合用于筛选各种已知氧化还原酶。用标识为pxIL13.2.2.FkpAc13的TIR2,2质粒进行这个操作。此外，可相容质粒与xIL4和其它IgG1hAb组合用于筛选FkpA和氧化还原酶。
原始氧化还原酶可相容质粒的构建如EP 1356052(参见例如实施例9)中所述。对氧化还原酶的筛选包括与hAb表达质粒xIL13.2.2.FkpAc13一起从可相容质粒JJ247进行表达。在xIL13 hAb实例的情况下，将氧化还原酶表达用1mM IPTG诱导或保持不诱导以调节氧化还原酶水平。
也构建编码hAb的LC和HC以及伴侣蛋白FkpA、DsbA和DsbC的单一质粒，并且用于转化66F8。在xIL13 hAb实例的情况下，构建在用于驱动FkpA的表达的启动子方面不同的两种TIR2,2单一质粒。单一质粒MD157含有用于FkpA表达的phoA启动子，并且质粒KA01含有tacII启动子。利用不同启动子允许进一步调节FkpA表达。在xIL17 hAb实例的情况下，构建TIR2,2单一质粒(MD341)，其利用phoA启动子来达成FkpA表达。在所有单一质粒条件下，DsbA和DsbC的表达都以多顺反子方式在tacII启动子的控制下。在xIL4hAb实例的情况下，构建并有下述可相容伴侣蛋白质粒AH8145的ORF的TIR2,2单一质粒，并且标识为CB1。
除上述单一质粒系统之外，也在具有IgG1同种型与IgG4同种型两者的许多hAb的情况下评估三重伴侣蛋白可相容质粒系统。在可相容质粒系统中，将先前描述的FkpA TIR变体之一克隆至多顺反子DsbA和DsbC可相容质粒(JJ247)中，并且标识为AH8145。
发酵方法
大规模产生基本上如EP1356052(参见例如实施例4和段落[0159]-[160])中所述。对于各10升发酵，使0.5mL冷冻储备培养物(含有10-15％DMSO)解冻，并且用于接种含有500ml大豆LB培养基的2L振荡烧瓶，所述培养基补充以0.5ml四环素溶液(5mg/ml)和/或2mL卡那霉素溶液(5mg/mL)以及2.5ml 1M磷酸钠溶液。使这个种子培养物在30℃下在振荡下生长约16小时，并且接着用于接种10升发酵罐。
发酵罐初始含有约7.0升培养基，所述培养基含有1.1g葡萄糖、100ml 1M硫酸镁、10ml微量元素溶液(在最终体积1升中：100ml盐酸、27g氯化铁六水合物、8g硫酸锌七水合物、7g氯化钴六水合物、7g钼酸钠二水合物、8g硫酸铜五水合物、2g硼酸、5g硫酸锰单水合物)、20ml四环素溶液(5mg/ml于乙醇中)或250mL氨苄青霉素溶液(2mg/mL)、1袋HCD盐(37.5g硫酸铵、19.5g磷酸氢二钾、9.75g磷酸二氢钠二水合物、7.5g柠檬酸钠二水合物、11.3g磷酸二氢钾)、200g BL4大豆(一种大豆蛋白水解物)和100克酵母提取物。初始在30℃下在20标准升/分钟(slpm)的空气流的情况下进行发酵，并且控制在7.0±0.2的pH下(尽管在一些情况下发生偶尔偏移超出这个范围)。使发酵罐的背压维持在1巴规格下，并且初始将搅拌速率设置成650rpm。如以下实施例2中所详细讨论，也可改变搅拌速率以操纵发酵罐中的氧转移速率，并且因此控制细胞呼吸速率。此外，如以下实施例3中所详细讨论，可调整在生长期和产生期期间的温度以使产物产率最大化。
在用来自振荡烧瓶的含细胞培养基接种发酵罐之后，通过使用基于计算机的算法来将浓缩葡萄糖溶液馈入发酵罐中，使培养物在发酵罐中生长至高细胞密度。需要时也将氢氧化铵(58％溶液)和硫酸(24％溶液)馈入发酵罐中以控制pH。在一些情况下，也添加L-61消泡剂以控制起泡。
当培养物达到约40OD550的细胞密度时，再添加100ml 1M硫酸镁至发酵罐中。另外，添加浓缩盐馈料(在最终体积1250ml中：12.5g硫酸铵、32.5g磷酸氢二钾、16.25g磷酸二氢钠二水合物、2.5g柠檬酸钠二水合物、18.75g磷酸二氢钾、10ml 2.7％氯化铁和10ml微量元素)至发酵罐中，并且当培养物达到约20OD550时在2.5ml/min的速率下开始，并且持续直至将约1250ml添加至发酵中。通常使发酵持续70-80小时。
用于电泳、免疫印迹和HPLC分析的样品制备
非还原可溶性样品制备类似于EP1356052中所述(参见例如实施例4，特别是段落[0162])。特定来说，如下制备非还原可溶性样品：在室温下使冷冻的在发酵过程期间获取的1mL全培养液样品解冻。添加100μL解冻全培养液至500μL提取缓冲液中。(提取缓冲液：10mM Tris(pH 6.8)、5mM EDTA、新鲜添加的0.2mg/mL母鸡卵溶菌酶和用以达到5-10mM的最终浓度的新鲜制备的碘乙酸。)使全培养液样品加提取缓冲液在冰上孵育5-10分钟，接着超声处理2x10个脉冲，然后在4℃和14,000rpm下离心15-20分钟。将上清液作为可溶性级分加以移除。对于通过SDS-PAGE和免疫印迹进行的分析，将可溶性级分1:10稀释至无还原剂的2X Novex三(羟甲基)甲基甘氨酸样品缓冲液中。将10μL这个制备物上样于10孔Novex 10％Bis-Tris NuPage凝胶上，并且在150V下在MES缓冲液的情况下进行电泳。凝胶接着用于免疫印迹或用考马斯蓝染色。
提交可溶性级分的样品以通过LC-κ/RP测定进行分析。这个测定是2维HPLC测定，其中第一柱是捕集含有κ-轻链的IgG组分的亲和柱，并且第二柱是反相柱。将积分HPLC工作站配置成双柱模式。溶剂储集器是：溶剂1A，亲和上样缓冲液；溶剂1B，亲和洗脱缓冲液，含0.2％TFA的水；溶剂2A，反相水性缓冲液，含0.1％TFA的水；溶剂2B，反相有机洗脱缓冲液，含0.1％TFA的80％乙腈。第一柱是从Life Technologies(Carlsbad,CA)购买的
Figure BDA0001284997960000881
CaptureSelectTM LCκ亲和柱(2.1x30mm)。涉及亲和柱的所有程序都在环境温度下进行。
第二柱是从Life Technologies(Carlsbad,CA)购买的
Figure BDA0001284997960000882
R2 20μm反相柱(2.1x30mm)。使反相柱温度维持在80℃下。
使亲和柱于上样缓冲液中平衡，并且将样品在2ml/min的流速下上样。将流穿物引导至废弃物中。在将样品上样之后，用上样缓冲液(3ml)洗涤亲和柱以减少非特异性结合的组分。接着，通过阀转换，使亲和柱连接于反相柱，并且用洗脱缓冲液(5ml)在2ml/min的流速下洗脱以将亲和捕集组分转移至反相柱中。在这个转移步骤期间，使积分紫外检测器位于亲和柱之后以及反相柱之前，因此监测亲和柱的洗脱物，所述洗脱物变为反相柱的上样物。在洗脱以及从反相柱断开之后，将亲和柱用水(2ml)洗涤，并且随后用上样缓冲液(4ml)再平衡。
将上样反相柱用0.1％TFA水溶液(1.1ml)洗涤。将流速设置成2ml/min，并且将快速梯度(0.25min)操作成35％溶剂2B(0.1％TFA/80％乙腈)，继之以历经3分钟达到50％溶剂2B的平缓梯度。洗脱通过在0.5分钟内达到100％溶剂2B，并且持续1.5分钟的梯度来完成。接着使反相柱在0.05分钟内返回至初始条件，并且持续2分钟以进行再平衡。在280和214nm下监测柱洗脱物。基于由反相柱获得的分离，通过将积分峰面积与已知浓度的标准物的那些积分峰面积比较来进行定量。
也定量在发酵过程期间产生的LC和HC的可溶量和总量。为进行总体RP-HPLC定量，用含100mM DL-二硫苏糖醇(Sigma目录号43816)的6M盐酸胍、360mM TRIS、2mM EDTA(pH8.6)将发酵培养液样品稀释10倍，用200mM。将样品涡旋，在60℃下孵育20分钟，并且在4℃下在13,000RPM下离心15分钟。在于HPLC上注射之前使用0.22um过滤器过滤可溶性级分。所用HPLC系统是Agilent Technologies 1290Infinity系统。将样品注射于Zorbax 300SB-C3快速分离(Rapid Resolution)(4.6x150mm，3.5微米)分析柱(目录号863973-909)上。流动相A由含0.1％三氟乙酸(Thermo目录号28901)的SQH2O组成，并且流动相B是含0.08％三氟乙酸的HPLC级乙腈(Honeywell目录号AH015-4)。
为进行总体可溶性RP-HPLC定量，用Pro-Scientific DPS-20使发酵培养液样品均质化(10,000RPM)并进行超声处理(88％振幅)，持续10秒4次。接着在4℃和14,000rpm下离心样品15-20分钟。将上清液作为可溶性级分加以移除，并且如上所述进行变性以及在RP-HPLC上处理。
结果
FkpA表达对hAb效价的影响
如图1A中所示，从xIL13 hAb TIR1,1载体产生轻链和重链亚单位导致轻链和重链产生的总量分别是2.9g/L和1.2g/L。对于TIR2,2，产生的轻链和重链的总量分别是6.4g/L和4.1g/L。
然而，总体亚单位产生的量不导致显著可溶性亚单位积累。使用xIL13 TIR1,1hAb质粒，产生的轻链和重链的总可溶量分别是0.2g/L和小于0.1g/L(图1B)。对于TIR2,2hAb，产生的轻链和重链的总可溶量分别是0.3g/L和0.3g/L(图1C)。产生的经装配xIL13hAb的效价对于TIR1,1发酵仅是0.1g/L，并且对于TIR2,2发酵，效价小于0.2g/L(图2)。这些结果表明在hAb产物的折叠和/或装配方面存在显著低效。因此，进行评估使用TIR1,1和TIR2,2质粒在伴侣蛋白的共表达的情况下对效价的影响的进一步研究。
已知若干类别的伴侣蛋白会促进蛋白质折叠和装配(图3A-B)。特定目标伴侣蛋白包括FkpA，已知其充当肽基-脯氨酰基顺-反异构酶和伴侣蛋白；以及DsbA和DsbC，已知其充当氧化还原酶。进行实验以测试FkpA、DsbA和DsbC的表达是否影响hAb产生。
特定来说，考查使用单独质粒(可相容质粒系统)或编码hAb HC和LC ORF的同一质粒(单一质粒系统)表达FkpA的影响(图4A-B)。使用单一表达质粒消除对使用多种抗生素或其它选择压力手段来确保质粒保留的需要。在用于xIL13 hAb的单一质粒系统中，使驱动FkpA表达的启动子从IPTG诱导型tacII启动子变为phoA启动子。因此，培养物中磷酸盐耗尽导致HC、LC和FkpA的表达。
对于IgG1同种型hAb(xVEGF)，除经装配hAb增加之外，FkpA伴侣蛋白共表达水平增加也与可溶性单体重链积累量增加相关联(图5A)。在这个实验中，在1mM IPTG诱导的情况下筛选如先前所述的一组FkpA表达变体。在无FkpA共表达的情况下，xVEGF hAb的效价是0.2g/L，并且在FkpA共表达的最高水平的情况(FkpA(wt))下，hAb效价是约0.4g/L(图5B)。
对于xIL13 hAb的产生，测试使用TIR1,1或TIR2,2抗体表达载体的可相容质粒系统(从一种质粒表达xIL13HC和LC，以及从另一质粒表达FkpA，如图4A中所示)。对于用1mMIPTG诱导以驱动FkpA的共表达的可相容质粒系统，对于TIR1,1质粒，效价是0.2g/L，并且对于TIR2,2质粒，效价是0.4g/L(图6A，泳道3和4)。相较于伴有内源性FkpA水平的TIR1,1和TIR2,2条件(图6A，泳道1和2)，这导致效价增加近似两倍。图6B显示相较于内源性表达，在可相容系统的情况下诱导的FkpA表达的量，如通过超高效液相色谱法(UPLC)以毫吸收单位(mAu)以及蛋白质印迹所测量。
也测试图4B中所示的用于FkpA表达和hAb产生的单一质粒系统。对于xIL13 hAb，对于单一质粒TIR1,1和TIR2,2，效价分别是0.4g/L和0.7g/L(图6A)。这代表超过可相容质粒系统在效价方面增加约两倍。FkpA在单一质粒系统中的表达水平也比在诱导可相容质粒系统中高约两倍(图6B)。FkpA表达水平增加与在两种TIR条件下可溶性单体重链积累量均增加相关联。
以TIR1,1与TIR2,2两种条件，在从可相容质粒系统诱导FkpA共表达的情况下测试第三hAb(xIL4 IgG4)。在这个实验中，在两种TIR条件下FkpA(wt)共表达均使可溶性单体重链的量增加(图7A)，但不导致产生的hAb的效价增加(图7B)。
在从可相容质粒系统诱导FkpA共表达的情况下测试第四hAb(xVEGFC IgG1)。在这个实验中，FkpA(wt)共表达使可溶性单体重链的量增加，并且使效价从0.5g/L增加至0.8g/L(图8A)。如通过考马斯染色所测定的FkpA表达增加(图8B)与可溶性单体HC链积累增加(图8C)相关联。总之，这些结果表明FkpA表达使可溶性单体重链的积累增强，但对经装配hAb效价的影响可变。这指示进一步优化是合乎需要的。
DsbA和DsbC表达对hAb效价的影响
通过组合上述pxIL13.2.2.FkpAc13(单一质粒)与用于表达氧化还原酶DsbA和DsbC的可相容质粒(图9)来进一步优化xIL13 hAb产生。表达DsbA与DsbC两者的质粒(JJ247)与pxIL13.2.2.FkpAc13一起使hAb效价增加。图10显示在存在和不存在IPTG诱导DsbA和DsbC下，随时间产生的xIL13 hAb的效价。对于pxIL13.2.2.FkpAc13与JJ247一起，在进入发酵52小时实现最高效价。在这个时间点，在无IPTG的条件(非诱导条件)下，xIL13效价是1.2±0.2g/L，并且在有IPTG的条件(诱导条件)下，xIL13效价是1.0±0.2g/L(图10)。对于两种测试条件，从52至72小时，效价下降均是显著的，并且归因于在发酵过程期间氧摄取速率(OUR)下降和同渗重摩升高，如实施例2中所述。
也在xIL4 TIR1,1和TIR2,2Ab表达质粒的情况下评估用于表达DsbA、DsbC和FkpA的可相容系统(AH8145)(图11A)。所有三种伴侣蛋白的非诱导共表达导致TIR1,1和TIR2,2效价分别是0.8g/L和1.2g/L(图12泳道5和6)。这代表相较于先前描述的FkpA可相容TIR2,2条件(图12泳道3和4)，对于TIR2,2条件，效价增加约六倍。
在另一hAb的情况下进一步评估可相容非诱导AH8145质粒系统。使用用以产生xVEGFC IgG1 hAb的基于TIR2,2的载体，相较于仅FkpA共表达，非诱导可相容AH8145条件使效价从0.8g/L增加至1.0g/L(图13)。在AH8145可相容质粒的情况下，以TIR1,1与TIR2,2两种条件测试第五hAb(xVEGFA IgG1)。在无伴侣蛋白共表达的情况下，对于TIR1,1与TIR2,2两种条件，效价是类似的，约为0.9g/L(图14泳道1和3)。就处于非诱导AH8145条件下的可相容质粒来说，对于TIR1,1和TIR2,2质粒，效价分别是1.2g/L和1.7g/L(图14泳道2和4)。
造成对并有AH8145的伴侣蛋白ORF的xIL4 TIR2,2单一质粒的产生(CB1)，并且说明于图11B中。CB1质粒在不添加IPTG下产生的效价略微高于在可相容质粒系统的情况下观察的效价(图15)。应注意，这个比较中报道的hAb效价由利用如实施例2中所述的优化搅拌策略的发酵产生。根据蛋白质印迹，在CB1的情况下，所有三种伴侣蛋白的水平略微较高(图15)。在不希望束缚于理论下，单一质粒系统可允许达成较高质粒拷贝数，其可导致产率较高。
将xIL13单一质粒系统MD157与未诱导可相容pxIL13.2.2.FkpAc13和JJ247可相容质粒系统进行比较(图16)。相较于在可相容系统中的1.9±0.04g/L，MD157单一质粒条件产生2.1±0.3g/L的效价(图17)。应注意，这个比较中报道的效价由利用如实施例2中所述的优化搅拌策略的发酵产生。
总之，这些结果证明连同DsbA和DsbC一起共表达FkpA使经装配hAb的产生增加，使用多种hAb构建体来确认这些影响。
实施例2：氧摄取对半抗体产生的影响
以上结果证明通过连同hAb HC和LC一起FkpA、DsbA和DsbC的共表达实现hAb产生改进。然而，即使在这个产生增强的情况下，也发现效价在52小时产生之后的时间点达到平稳状态或甚至减小。因此，进行额外实验以进一步优化hAb产生。
如先前所述，初始在30℃下在20标准升/分钟(slpm)的空气流的情况下进行发酵，并且控制在7.0±0.2的pH下。使发酵罐的背压维持在1巴规格下，并且初始将搅拌速率设置成650rpm。所述额外巴规格的背压导致200％的初始溶氧浓度(dO2)。在dO2信号下降低于起始水平的2％(通常是进入产生培养的约两小时)之后馈入浓缩葡萄糖溶液，并且历经发酵过程连续馈入以使葡萄糖是非限制性营养物。
在12小时，培养物中的细胞密度足以维持dO2浓度处于或接近零值百分比。在不希望束缚于理论下，据认为当限制氧浓度时，氧转移速率(OTR)等于细胞的氧摄取速率(OUR)或代谢速率。对OTR的操作通过调整搅拌速率来促进，并且对培养物OUR具有直接影响。质谱仪用于监测来自发酵的排气的组成，并且使得能够计算发酵中的氧摄取速率和二氧化碳逸出速率。
如图18中所示，在上述pxIL13.2.2.FkpAc13与JJ247质粒系统的情况下，诱导TIR2,2培养物与非诱导TIR2,2培养物两者在第12小时均具有4.25mmol/L/min的峰值OUR，在所述时点之后，dO2变得受限制。使这些培养物在处于650rpm的恒定速率下的搅拌下生长。图19显示这些培养物随时间的同渗重摩。总之，图18-19显示在50时间之后，细胞培养物OUR急剧下降，并且同渗重摩升高。
图20显示在这些培养物中随时间产生的xIL13 hAb效价。观察到效价从在52小时时的1.2g/L±0.2g/L下降至在72小时时的0.7±0.04g/L。类似地，在诱导条件下，观察到从在52小时时的1.0±0.2g/L下降至在72小时时的0.5±0.05g/L。引起兴趣的是，在这些培养物中，这个产生下降发生在OUR下降和同渗重摩升高的同时。
为缓和效价下降以及消除同渗重摩升高，在非诱导TIR2,2条件下评估在26小时时的搅拌变动。使搅拌速率从650rpm变动至实现目标OUR设置点的水平。测试四个不同OUR目标设置点：约1.5、1.75、2.0和2.5mmol/L/min。在OUR设置点在约1.5与2.0mmol/L/min之间的情况下的搅拌变动消除OUR下降(图21)和同渗重摩升高(图22)。
重要的是，在所有搅拌变动条件下，在54小时时的效价都高于在非变动条件下(图23)。在近似2.5mmol/L/min条件下，OUR在约60小时时下降(图21)，并且同渗重摩在72小时时升高至1200mOsm的峰值(图22)。在72小时，近似2.5mmol/L/min条件效价(0.7g/L)下降至与非变动条件(0.6±0.1g/L)类似的水平。近似2.0mmol/L/min条件的平均效价是四种测试条件下最高的(2.4±0.6g/L)；然而，在效价方面存在一定可变性，并且似乎在OUR图谱中存在略微下降。近似1.5mmol/L/min条件具有2.1±0.3g/L的再现平均效价，但同样似乎在OUR图谱中在发酵晚期存在一定可变性。近似1.75mmol/L/min条件具有可再现效价(1.8±0.2g/L)，以及一致OUR趋势两者，因此它被选作优选设置点。
这些结果证明变动培养物的搅拌速率会缓和观察到的OUR下降和同渗重摩升高。重要的是，这些搅拌变动也允许hAb产生效价增强，特别是在较晚产生时间点。
实施例3：温度对半抗体产生的影响
尽管先前实施例显示hAb产生显著增加，但进行额外测试以更进一步优化产生方法。因此，对于xIL13 hAb产生，实施例1中所述的高表现性单一质粒系统和实施例2中所述的约1.75mmol/L/min的OUR设置点被用作起始点。更进一步优化方法以产生显著更大产率，如下所述。
本公开的优选实施方案的发酵过程可被分成两个不同节段：生长期和产生期。在生长期中，大多数营养物处于过量，并且培养物密度快速增加。在产生期中，磷酸盐变得受限制，生长停止，并且目标产物的表达开始。对于这些时期的每一个测试温度对hAb产生的影响。
与温度实验组合，评估第二宿主。在这些实验中，将MD157质粒转化至67A6产生宿主中。67A6菌株的基因型是W3110 ΔfhuA ΔphoA ilvG+Δprc spr43H1 ΔdegP ΔmanAlacIQ ΔompT ΔmenE742 degPS210A。
67A6菌株含有编码DegP的degP基因(也称为htrA和ptd)的蛋白酶缺陷等位基因的敲入。DegP(也称为蛋白酶Do)是为在高温下存活所需的周质丝氨酸蛋白酶。另外，DegP充当分子伴侣蛋白。用丙氨酸取代丝氨酸消除了DegP的蛋白水解活性，但不影响它的伴侣蛋白功能(Spiess等,Cell,97:339-347,1999)。
对生长期(Tg)与产生期(Tp)两者进行xIL13 TIR2,2单一质粒系统的温度优化。图24显示以30℃或28℃的恒定Tg/Tp生长的培养物的生长。相较于30℃的恒定Tg/Tp，28℃的恒定Tg/Tp导致生长速率迟滞。图25显示在这些温度下的生长的培养物的OUR。与生长速率类似，相较于30℃，当使培养物在28℃的恒定Tg/Tp下生长时，OUR被延迟。
如图26中所示，使用30℃的恒定Tg/Tp，磷酸盐在22±2小时时被耗尽。当使Tg/Tp向下变动至28℃时，培养物的生长速率如上所述被延缓，并且磷酸盐耗尽被变动至26±2小时。
图27显示这些培养物的xIL13 hAb产生。对于各条件，产物表达都开始于当发生磷酸盐耗尽时。相较于恒定30℃Tg/Tp条件的1.3±0.2g/L，恒定28℃Tg/Tp条件实现2.5±0.2g/L的最终效价。
为试图增加处于产生期的时间量，测试温度变动策略。在这个实验中，将生长期温度设置在30℃下，并且在20小时时，使温度变动至28℃。对于Tg30/Tp28℃变动和恒定Tg/Tp30℃条件，0与20小时之间的生长(图28)、磷酸盐(图29)和OUR(图30)图谱是类似的。
如图31中所示，将在Tg30/Tp28℃条件下产生的3.1g/L的最终效价与在恒定Tg/Tp28℃条件下产生的2.5g/L的最终效价进行比较，在产物诱导时使用温度变动至28℃提供效价进一步增加0.6g/L。这些结果证明使培养物在较高温度下生长，接着在产生时降低培养温度可导致产物形成显著增加。
进行部分析因实验设计(DoE)以确定利用67A6宿主菌株，对于xIL13 hAb最优的操作条件。DoE集中于三种操作参数和FkpA的水平。
表3-1.xIL13 hAb参数
Figure BDA0001284997960000971
如表3-1中所示，操作参数包括Tg和Tp以及pH。样式是指特定参数的操作范围；(-)是指低值参数，(+)是指高值参数，并且0001和0002是指中心点参数。Tg在30至34℃的范围内，Tp在25至28℃的范围内，并且pH在6.7与7.0之间的范围内。产生的FkpA的量通过所用启动子来调节。高水平的FkpA由MD157上的phoA启动子产生，并且低水平的FkpA由KA01上的非诱导tac启动子产生。通过操作10个实验来进行部分析因分析。
如图32中所示，这些因素对产生的xIL13 hAb的效价具有显著影响。由表3-1中所述的用于DoE实验的条件产生的hAb的效价在约1.5至约4.5g/L的范围内。
在由xIL13DoE鉴定的最优发酵条件(Tg 34℃，Tp 28℃，pH 7.0)下测试xIL4单一质粒(CB1)。然而，在CB1条件下，tacII启动子在无IPTG诱导下用于驱动FkpA表达。将xIL14hAb效价与其中Tg/Tp保持恒定在30℃下，并且使pH维持在7.0下的发酵条件进行比较。在不添加IPTG的新工艺条件下，xIL4 hAb效价从1.3g/L增加至3.1g/L(图33)。
进行部分析因DoE以确定对于xIL17 hAb最优的操作条件。通过用xIL17LC和HC的ORF替换xIL13 hAb单一质粒(MD157)LC和HC的ORF来构建MD341单一质粒。用于表达抗体片段和伴侣蛋白的启动子与xIL13(MD157)质粒相同。DoE集中于三种操作参数。
表3-2.xIL17 hAb参数
样式 生长温度(Tg) 产生温度(Tp) pH 效价(g/L)
-+- 30 30 6.7 0.38
0001 32 27.5 7.0 2.0
--- 30 25 6.7 2.5
--+ 30 25 7.3 2.6
+-+ 34 25 7.3 2.6
0002 32 27.5 7.0 1.9
++- 34 30 6.7 0.34
+-- 34 25 6.7 2.0
-++ 30 30 7.3 0.2
+++ 34 30 7.3 0.12
如表3-2中所示，操作参数包括Tg和Tp以及pH。Tg在30至34℃的范围内，Tp在25至30℃的范围内，并且pH在6.7与7.3之间的范围内。图34显示在Tp是25℃的条件下实现最显著效价积累。
图35显示首先优化伴侣蛋白共表达、接着优化方法步骤(例如搅拌速率、Tg和Tp)对xIL13 hAb效价的产生的影响。在一个示例性实施方案中，分子优化(例如伴侣蛋白表达和载体特征)提供效价增加约16倍。通过工艺开发(例如搅拌速率、Tg和Tp)，这个产生水平进一步增强约3.5倍。总之，这些结果证明可通过优化包括伴侣蛋白表达、载体系统、搅拌速率、pH和生长/产生温度的变量来实现在产生和稳健性方面的显著增加。最终，确定Tg在34℃下，Tp在25℃下，pH是6.7，并且FkpA水平通过phoA启动子而产生的条件导致最高xIL13hAb效价。
实施例4：宿主菌株对半抗体产生的影响
尽管先前实施例显示hAb产生显著增加，但进行额外测试以表征在宿主菌株66F8与67A6之间在hAb产生方面的潜在差异。因此，对于hAb产生，在两种大肠杆菌宿主菌株：66F8和67A6中评估实施例1中所述的高表现性单一质粒系统、实施例2中所述的OUR变动和实施例3中所述的温度变动。66F8菌株的基因型是W3110 ΔfhuA ΔphoA ilvG+Δprcspr43H1 ΔdegPΔmanA lacIQ ΔompT ΔmenE742。67A6菌株的基因型是W3110 ΔfhuA ΔphoA ilvG+Δprc spr43H1 ΔdegP ΔmanA lacIQ ΔompT ΔmenE742degPS210A。
在66F8宿主菌株与67A6宿主菌株两者中表达xIL13 hAb。在采用如上所述的温度和搅拌速率变动的条件下进行发酵。相较于66F8菌株，使用67A6菌株导致可溶性xIL13 hAb效价(图36A)和LC与HC两者的总体亚单位积累(图36B)的增加。
也在66F8宿主菌株与67A6宿主菌株两者中表达xIL4 hAb。当在30℃的恒定温度下进行xIL4 hAb发酵时，由两种菌株获得约1.5g/L的类似效价(图37A)。然而，在其中使Tg从34℃降低至25℃的Tp的发酵条件下，67A6菌株产生3.0g/L的平均值，并且66F8菌株产生2.0g/L的平均值(图37B)。此外，在采用温度变动的条件下，在67A6发酵中LC与HC两者的总体亚单位积累大于在66F8发酵中(图38A和图38B)。
因此，xIL13 hAb与xIL4 hAb两者是由67A6宿主菌株和相对于生长温度降低产生温度所提供的效价益处的两个实例。在不受理论束缚下，缺乏DegP的宿主菌株中的重组蛋白积累似乎达到平稳状态，而在具有突变DegPS210A的宿主菌株中，重组蛋白似乎积累直至发酵结束。
实施例5：使用优化表达载体和优化培养条件产生xIL33 hAb
通过用xIL33LC和HC的ORF替换xIL13 hAb单一质粒(MD157)LC和HC的ORF来构建xIL33 hAb(MD501质粒)。用于表达抗体片段和伴侣蛋白的启动子与xIL13(MD157)质粒相同(图39)。用仅含有xIL33LC和HC的ORF的xIL33 hAb表达载体(MD481)进行单一发酵。MD481质粒不含有分子伴侣蛋白DsbA、DsbC或FkpA的ORF。发酵在30℃的恒定温度、7.0的pH和650RPM的搅拌速率下进行(图40的基础情况)。接着，用含有xIL33LC和HC的ORF以及分子伴侣蛋白DsbA、DsbC或FkpA的ORF的xIL33 hAb表达载体(MD501)进行单一发酵。与对于MD481发酵相同的操作条件用于MD501发酵。相较于基础情况，使用单一质粒(MD501)导致xIL-33hAb效价增加近似10倍。
进行部分析因DoE以确定对于xIL33 hAb MD501单一质粒最优的培养条件。DoE以分数因子，以在67A6宿主中进行的包括两个中心点平行测定的10个实验集中于四种参数(表5-1)。在OD550是150时进行搅拌速率和温度变动。
表5-1.xIL33 hAb参数
Figure BDA0001284997960001001
如表5-1中所示，Tg在30至34℃的范围内，Tp在25至30℃的范围内，pH在6.7与7.3之间的范围内，并且OUR设置点在1.9至2.8mmol O2/L/min的范围内。图41显示中心点条件对效价提供最重大益处，其中实现的最高效价是4.0±0.05g/L，此相当于相较于基础情况操作条件(图40)，hAb效价进一步增加。最佳培养条件包括7.0的pH、32℃的Tg、27.5℃的Tp(2小时匀变)和约2.3mmol/Lmin的目标OUR(2小时搅拌速率匀变)。
实施例6：FkpA优化
为试图优化FkpA的表达水平，在用于xIL13、xIL17和xIL33 hAb的单一质粒(MD157、MD341和MD501质粒)中测试两种额外FkpA TIR变体。如相较于内源性FkpA信号序列所述来表征FkpA TIR变体(图42)。MD157、MD341和MD501质粒并有FkpAc13的ORF，其与为3的TIR强度相关联(图43)。在MD157、MD341和MD501单一质粒中，FkpAc13ORF被FkpA TIR1或TIR2ORF替换，并且在先前对于各hAb鉴定的优化发酵条件下测试。
FkpA表达水平增加与xIL13 hAb积累增加相关联(图44)。FkpA TIR1和TIR2条件分别导致最终FkpA量是0.5和2.5g/L，并且xIL13hAb效价是1.5和2.5g/L。TIR 3条件产生4g/L的FkpA和3.8g/L的hAb。FkpA表达水平也对产生期OUR图谱具有影响。总之，滴定FkpA使产生的hAb的量增加约3倍。
在xIL33 hAb发酵中，最低效价积累图谱与FkpA TIR1条件相关联，其中操作结束时的效价是2.4g/L(图45)。当相较于TIR1条件时，xIL33 TIR2和TIR3条件导致xIL33 hAb效价增加近似2倍(图45)。数据表明FkpA水平增加有益于hAb产生。
在xIL17 hAb发酵中，最低效价积累图谱与FkpA TIR1条件相关联，其中操作结束时的效价是2.0g/L(图46)。
使用先前对于xIL13 hAb所述的最佳条件测试两种额外FkpA TIR变体(TIR2.3和TIR6)。TIR2.3效价图谱倾向于高于先前测试的TIR2条件，但仍然低于对照TIR3条件(图47A)。TIR6条件导致效价积累图谱类似于TIR 2.3条件，但同样低于TIR3对照。如通过蛋白质印迹分析测定的FkpA积累显示在各TIR变体之间的FkpA滴定(图47B)。数据表明存在与hAb产生相关联的最优FkpA表达量，其在xIL13 hAb(MD157单一质粒)的情况下是TIR3。
实施例7：氧转移速率(OTR)条件的影响
也用第二OTR策略测试在实施例3中鉴定的xIL13 hAb最佳条件。在实验(N＝3)中，使容器背压(BP)和喷射速率分别从1.0降低至0.3巴以及从20降低至13SLPM。为试图弥补归因于背压和喷射速率降低的OTR损失，使生长期和产生期搅拌速率从650增加至880RPM以及从475增加至650RPM。容器背压、喷射速率和搅拌速率的不同组合可用于实现与先前实施例中引用的那些OTR条件类似的OTR条件。
对于整个发酵过程，用恒定BP进行发酵。在改变的OTR条件下，使背压维持在0.3巴(N＝3)下，并且在对照条件下，使背压维持在1.0巴(N＝5)下。对于整个发酵过程，用恒定空气流进行发酵。在改变的OTR条件下，使空气流维持在13SLPM(N＝3)下，并且在对照条件下，使空气流维持在20SLPM(N＝5)下。在改变的OTR条件与对照条件两者下，发酵均在150OD550时实施搅拌变动。在改变的OTR条件下，初始搅拌速率被设置成880RPM，并且变动至650RPM，而在对照条件下，初始搅拌速率被设置成650RPM，并且变动至475RPM。
搅拌速率增加补偿归因于喷射和背压降低的OTR下降。改变的OTR条件导致与对照条件类似的峰值和产生期OUR(图48A)以及生长图谱(图48B)。改变的OTR条件导致与对照条件类似的积累图谱和峰值效价(4.1±0.4g/L)(图49)。
实施例8：优化ImmTAC产生
抗癌免疫动员单克隆T细胞受体(ImmTAC)是本公开的潜在可用于一定范围的抗癌疗法的双链多肽(参见例如Oates和Jakobsen,OncoImmunology 2:e22891,2013以及Liddy等,Nat.Med.18:908-7,2012)。如同多特异性抗体，产生供治疗使用的ImmTAC要求能够在工业规模上产生构筑嵌段诸如α和βTCR链以及融合于其的任何多肽(例如抗CD3效应物诸如scFv)。为满足这个要求，优化表达载体和方法步骤以超过标准方法在产生方面给予显著增加。重要的是，如同以上实施例，发现表达FkpA、工艺变化、TIR优化和DsbC表达提供多种ImmTAC在产生方面的这些增加。
材料和方法
对于ImmTAC表达载体(图50A)，评估1,1；1,2；和2,3的TIR组合。如本文关于ImmTAC产生所用，第一编号代表α链的TIR强度，并且第二编号代表β链的TIR强度(图50B)。
将质粒转化至具有基因型W3110 ΔfhuA ΔphoA ilvG2096(Valr)Δprc spr43H1ΔdegP ΔmanA lacIQΔompT ΔmenE degpS210A的宿主菌株67A6中。
在以下条件下进行初始发酵：恒定30℃和pH 7.0，其中在24小时启始历经4小时过程的搅拌匀变，并且以约1.75mmol/L/min的OUR为目标。
构建含有FkpA的ORF的可相容质粒(pACYC，Novagen,Madison,WI)，如上文和欧洲专利号EP1356052B1中所述。FkpA基因构建体在tacII启动子的控制下。
原始氧化还原酶可相容质粒的构建如欧洲专利号EP1356052B1(参见例如实施例9)中所述。对氧化还原酶的筛选包括与ImmTAC TIR1,1FkpA单一质粒一起从可相容质粒JJ141(DsbC)、JJ142(DsbA)和JJ247(DsbA/C)进行表达。用于驱动氧化还原酶的表达的tac启动子不加以诱导，并且依赖于从启动子的渗漏表达。
对于测定ImmTAC效价，提交可溶性级分的样品以通过蛋白质L/RP测定进行分析。这个测定是二维HPLC测定，其中第一柱是捕集含有可变轻链的IgG组分的亲和柱，并且第二柱是反相柱。将积分HPLC工作站配置成双柱模式。溶剂储集器是：溶剂1A，亲和上样缓冲液，PBS；溶剂1B，亲和洗脱缓冲液，含0.2％TFA的水；溶剂2A，反相水性缓冲液，含0.1％TFA的水；溶剂2B，反相有机洗脱缓冲液，含0.08％TFA的乙腈。亲和柱是利用从Sigma Aldrich(CA,USA)购买的纯化蛋白质L偶联于从Life Technologies(CA,USA)购买的
Figure BDA0001284997960001041
AL活化树脂的内部填充柱。涉及亲和柱的所有程序都在环境温度下进行。
第二柱是从Mac-Mod(CA,USA)购买的HALO C4蛋白质反相柱(2.1x20mm)。使反相柱温度维持在80℃下。
使亲和柱于上样缓冲液中平衡，并且将样品在2ml/min的流速下上样。将流穿物引导至废弃物中。在将样品上样之后，用上样缓冲液洗涤亲和柱以减少非特异性结合的组分。接着，通过阀转换，使亲和柱连接于反相柱，并且用洗脱缓冲液在2ml/min的流速下洗脱以将亲和捕集组分转移至反相柱中。在这个转移步骤期间，使紫外检测器位于亲和柱之后以及反相柱之前，并且因此监测亲和柱的洗脱物(其变为反相柱的上样物)。
在洗脱之后，随后用上样缓冲液再平衡亲和柱。
经上样反相柱用0.1％TFA水溶液洗涤。将流速设置成2ml/min，并且从5％至30％溶剂2B(含0.08％TFA的ACN)操作快速梯度，继之以达到34％溶剂2B的平缓梯度。通过达到100％溶剂2B的梯度来完成洗脱以进行再生。接着使反相柱返回至初始条件以进行再平衡。在280和214nm下监测柱洗脱物。基于由反相柱获得的分离，通过将积分峰面积与已知浓度的标准物的积分峰面积比较来进行定量。这个测定的定量限度(LOQ)是0.0125g/L。
结果
初始发酵评估TIR1,1构建体(图51)。条件如下：30℃，pH 7.0，以及约1.75mmolO2/L/min的OUR。发酵导致10mg/L的效价积累。总体α和β亚单位积累分别是550和800mg/L(图52)。
为确定伴侣蛋白表达对ImmTAC效价的影响，提供用于在使用上述载体的情况下共表达伴侣蛋白的质粒。与ImmTAC表达组合测试许多已知伴侣蛋白，包括FkpA蛋白，即具有伴侣蛋白活性的肽基脯氨酰基顺-反异构酶。
接着将FkpA可相容质粒与上述TIR1,1 ImmTAC 1表达质粒(图53)共同转化至菌株67A6中。发酵条件与用于上述初始发酵中并且显示于图51中的那些相同。当培养物达到200OD550时，用1mM IPTG诱导FkpA tac启动子。抗α和抗β可溶性蛋白质印迹指示除经装配ImmTAC之外，α可溶性亚单位与β可溶性亚单位两者的积累也均增加(可溶性还原印迹；图54A)。效价分析也指示相较于无伴侣蛋白条件，经装配ImmTAC增加2倍，具有20mg/L的最终效价(图54B)。
在随后ImmTAC实验中改变发酵工艺条件(图55)。在所有随后发酵中，搅拌匀变以约2.5mmol O2/L/min的特定OUR设置点为目标。此外，在24小时进行使生长温度从30℃降低至25℃的产生温度的温度变动。
使用上述FkpA可相容系统测试改变的工艺条件，并且所述工艺条件包括在200OD550时添加1mM IPTG。当相较于先前工艺条件时，使用改变的工艺条件导致效价增加近似2倍，具有40mg/L的最终效价(图57)。
对于ImmTAC TIR1,1；TIR1,2；和TIR2,3，构建编码ImmTAC的α链和β链以及FkpA的质粒，并且用于转化67A6(图58)。在这些质粒构建体中，FkpA ORF在αORF的上游，并且phoA启动子控制转录。pBR322质粒通常维持在约30个拷贝/细胞下(Bolivar等,Gene,2:95-113,1977)，并且pACYC质粒通常维持在约15个拷贝/细胞下(Chang和Cohen,J.Bacteriol.,134:1141-1156,1978)。在不希望束缚于理论下，据认为当将FkpA移动于ImmTAC表达质粒上时的拷贝数增加可导致制备的FkpA的量增加。
并有FkpA ORF的三种ImmTAC TIR变体单一质粒导致效价高于先前所述的TIR1,1可相容FkpA系统。TIR1,2和TIR 2,3条件各自导致约50mg/L的效价(图59A)，而TIR1,1条件导致65mg/L的效价(图59A)。对于TIR2,3条件，总体α和β亚单位积累分别是2.5和5.5g/L(图59B)。在TIR1,1条件下，总体α和β亚单位积累分别是1g/L和2.5g/L。在TIR1,2条件下，α和β亚单位积累分别是约0.8g/L和3.2g/L(图59B)。
关于可溶性FkpA表达(通过蛋白质印迹来测定)来比较TIR1,1单一质粒和TIR1,1可相容质粒系统指示单一质粒系统导致产生的FkpA的量增加(图60A)。当相较于先前可相容质粒系统时，可溶性FkpA增加导致效价进一步增加，并且实现65mg/L的最终效价(图60B)。
类似于对于FkpA的共表达所述的可相容质粒系统，可相容质粒与并有先前描述的FkpA ORF的TIR1,1 ImmTAC 1组合用于筛选各种已知的氧化还原酶(图61)。当相较于先前仅FkpA条件时，单独DsbA以及DsbA与DsbC组合的共表达导致20mg/ml的类似效价降低。然而，单独DsbC的共表达导致80mg/L的效价，其对应于经装配ImmTAC产生增加15-20mg/L(图62)。在TIR1,1单一质粒中，经装配效价在DsbC的共表达下增加导致以下假设：在先前FkpA单一TIR2,3条件下所见的亚单位积累增加可对个别亚单位的折叠和装配提供进一步益处，并且可进一步增加效价。在DsbC可相容系统(N＝4)的情况下测试TIR2,3FkpA单一质粒，并且导致110mg/L的平均效价(图63)。
重要的是，与伴侣蛋白FkpA和DsbC的共表达以及上述改进工艺条件(图55)联合来优化α和β亚单位TIR导致ImmTAC 1效价增加10倍(图64)。对ImmTAC 1产生的优化步骤包括FkpA的共表达、工艺变化(增加OUR，更碱性pH、温度变动)、具有FkpA和ImmTAC 1的单一质粒系统、渗漏DsbC表达和增加的TIR强度。
使用ImmTAC 1评估以上优化。使用相同优化来测试第二、不同的ImmTAC ImmTAC2。如图65A(α链印迹)和图65B(β链印迹)中所示，相同ImmTAC TIR和伴侣蛋白条件对经装配ImmTAC 2提供最大益处。
总之，这些结果证明连同DsbC和关键工艺改进一起FkpA的共表达使经装配ImmTAC的产生增加，使用多种ImmTAC构建体来确认这些影响。
序列
除非另外指示，否则所有多肽序列都以N末端至C末端方式呈现。
除非另外指示，否则所有多核苷酸序列都以5’至3’方式呈现。
FkpA TIR1
GAATTATGAA GTCCCTGTTT AAAGTGACGC TGCTGGCGAC CACAATGGCC GTTGCCCTGCATGCACCAAT CACTTTTGCT(SEQ ID NO：1)
FkpA TIR2
GAATTATGAA GTCGCTATTC AAAGTGACGC TGCTGGCGAC CACAATGGCC GTTGCCCTGCATGCACCAAT CACTTTTGCT(SEQ ID NO：2)
FkpA TIR3(c13)
GAATTATGAA GTCGCTGTTT AAAGTTACGC TGCTGGCGAC CACAATGGCC GTTGCCCTGCATGCACCAAT CACTTTTGCT(SEQ ID NO：3)
FkpA信号肽
MKSLFKVTLLATTMAVALHAPITFA
(SEQ ID NO：4)
序列表
<110> 基因泰克公司（Genentech, Inc.）
J·朱利安诺蒂
D·赖利
K·奥罗里
L·C·西蒙斯
<120> 在细菌中产生双链蛋白质的方法
<130> 146392035140
<140> 尚末指定
<141> 与此同时
<150> US 62/075,798
<151> 2014-11-05
<160> 4
<170> 供Windows使用的4.0版FastSEQ
<210> 1
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
gaattatgaa gtccctgttt aaagtgacgc tgctggcgac cacaatggcc gttgccctgc 60
atgcaccaat cacttttgct 80
<210> 2
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
gaattatgaa gtcgctattc aaagtgacgc tgctggcgac cacaatggcc gttgccctgc 60
atgcaccaat cacttttgct 80
<210> 3
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
gaattatgaa gtcgctgttt aaagttacgc tgctggcgac cacaatggcc gttgccctgc 60
atgcaccaat cacttttgct 80
<210> 4
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Met Lys Ser Leu Phe Lys Val Thr Leu Leu Ala Thr Thr Met Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu His Ala Pro Ile Thr Phe Ala
20 25

Claims (18)

1.一种在原核宿主细胞中产生包含T细胞受体(TCR)α链和TCR β链的抗癌免疫动员单克隆T细胞受体(ImmTAC)的方法，所述方法包括：
(a) 在培养基中在如下条件下培养所述宿主细胞以表达所述ImmTAC的TCR α链和TCRβ链：
包括生长温度和生长搅拌速率的生长期，
自所述生长温度至更低产生温度的温度变动，自所述生长搅拌速率至更低产生搅拌速率的搅拌速率变动，和
包括所述产生温度和所述产生搅拌速率的产生期，借此在表达后，所述TCR α链和所述TCR β链折叠并装配以在所述宿主细胞中形成生物活性ImmTAC；
其中所述宿主细胞包含多核苷酸，所述多核苷酸包含
(1) 编码所述ImmTAC的TCR α链的第一翻译单元；
(2) 编码所述ImmTAC的TCR β链的第二翻译单元；
(3) 编码肽基-脯氨酰基异构酶的第三翻译单元，其中所述肽基-脯氨酰基异构酶是FkpA蛋白；和
(4) 编码蛋白质二硫化物氧化还原酶的第四翻译单元，其中所述蛋白质二硫化物氧化还原酶是DsbC蛋白；
其中在所述生长期期间所述生长温度在30℃至34℃的范围内，在所述产生期期间所述产生温度在25℃至29℃的范围内，所述生长搅拌速率足以实现在所述生长期期间所述宿主细胞的峰值氧摄取速率在3.5至4.5 mmol/L/min的范围内，并且所述产生搅拌速率足以实现在所述产生期期间所述宿主细胞的氧摄取速率在1.0至3.0 mmol/L/min的范围内；和
(b) 从所述宿主细胞回收所述生物活性ImmTAC，
其中所述原核宿主细胞是大肠杆菌。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸还包含启动子的三个拷贝，其中第一拷贝与所述第一翻译单元可操作组合，第二拷贝与所述第二翻译单元可操作组合，并且第三拷贝与所述第三翻译单元可操作组合以驱动所述TCR α链、所述TCR β链和所述FkpA蛋白的转录。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述启动子是诱导型启动子。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述诱导型启动子是在不存在IPTG诱导下驱动所述TCR α链、所述TCR β链和所述FkpA蛋白的转录的IPTG诱导型启动子。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述诱导型启动子是当所述培养基中的磷酸盐已耗尽时驱动所述TCR α链、所述TCR β链和所述FkpA蛋白的转录的PhoA启动子。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸还包含可选择标记，并且所述培养基包含由单一抗生素组成的选择剂以致使所述宿主细胞维持所述多核苷酸。
7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述第一翻译单元包含与所述TCR α链的编码区可操作组合的第一翻译起始区(TIR)，并且所述第二翻译单元包含与所述TCR β链的编码区可操作组合的第二翻译起始区(TIR)，其中所述第一和第二TIR的相对翻译强度是1.0至3.0。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述FkpA是大肠杆菌FkpA。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述DsbC蛋白是大肠杆菌DsbC。
10.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述大肠杆菌是具有degpS210A突变的菌株。
11.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述大肠杆菌是具有W3110 ∆fhuA ∆phoA ilvG2096 (Valr ) ∆prc spr43H1 ∆degP ∆manAlacI Q ∆ompT∆menE degpS210A的基因型的菌株。
12.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述TCR α链包含TCR α链可变结构域和TCR α链恒定结构域，并且其中所述TCR β链包含TCR β链可变结构域和TCR β链恒定结构域。
13.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述ImmTAC的两条链由至少一个二硫键彼此连接。
14.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述ImmTAC还包含结合T细胞并且活化T细胞应答的抗体片段。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述抗体片段包括抗CD3单链抗体片段。
16.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述ImmTAC包含经工程化以相较于尚未经工程化的TCR对抗原的亲和力，对所述抗原具有增加的亲和力的TCR。
17.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中从所述宿主细胞的周质回收所述ImmTAC。
18.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述生长搅拌速率比所述产生搅拌速率高10%至40%。
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