MX2011003184A - Anticuerpos contra il17 humana y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo, que se une a la IL-17, caracterizado porque se une al mismo epítopo de la IL-17 al que se une el anticuerpo monoclonal 3C1 y porque es del isotipo de la IgG1 humano modificado en la región bisagra en la posición de aminoácidos 216-240, con preferencia en la posición de aminoácidos 220-240, entre CH1 y CH2 y/o en la segunda región interdominios en la posición de aminoácidos 327-331 entre CH2 y CH3, tiene propiedades ventajosas para el tratamiento de enfermedades inflamatorias.

Description

ANTICUERPOS CONTRA IL17 HUMANA Y USOS DE LOS MISMOS Campo de la Invención La presente invención se refiere a anticuerpos contra la IL17A (anticuerpos IL17) , a métodos para su producción, composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos y a los usos de los mismos.

Antecedentes de la Invención La IL-17A humana (CTLA-8, Swiss Prot Q16552, también llamada IL-17) es una citocina pro- inflamatoria producida por un subcon unto de células T de memoria (llamadas Thl7) , que interviene en la patogénesis de la A. La IL-17A desempeña un papel en la inducción de otras citocinas inflamatorias, quimiocinas y moléculas de adhesión. El tratamiento de animales con anticuerpos que neutralicen la IL-17A disminuye la incidencia de la enfermedad y la severidad de la encefalomielitis autoinmunitaria (Komiyama, Y. y col., J. Immunol. 177 , 566-573, 2006). La IL-17A se sobre expresa en el líquido cerebroespinal de los pacientes de MS (Hellings, P.W. y col., Am. J. Resp. Cell. Mol. Biol. 28 , 42-50, 2003; Matusevicius , D. y col., Múltiple Sclerosis 5, 101-104, 1999; WO 2005/051422) . Además, los anticuerpos que neutralizan la IL-17A reducen la severidad y la incidencia del modelo de artritis inducida con colágeno RA en el ratón y se han podido detectar niveles altos de IL-17A en Ref.218323 el líquido sinovial de articulaciones inflamadas de pacientes de RA (Ziolkowska, . y col., J. Immunol . 164 , 2832-2838, 2000; Kotake, S. y col., J. Clin. Invest. 103 , 1345-1352, 1999; Hellings, P.W. y col., Am. J. Resp. Cell. Mol. Biol . 28, 42-50, 2003) .

Los documentos WO 96/17939, US 5,716,623; WO 95/18826; WO 97/15320; WO 99/35276 y WO 00/69436; WO 95/18826 US 6,274,711, US 6,274,711, WO 97/15320, US 6,063,372, WO 2006/013107 y WO 2008/02115 se refieren a la IL-17A y anticuerpos contra la IL-17A.

Breve Descripción de la Invención La invención se refiere a un anticuerpo que se une a la IL-17, caracterizado porque el dominio variable de cadena pesada contiene una región CDR3 de la SEC ID NO: 1, una región CDR2 de la SEC ID NO: 2 ó 9 y una región CDR1 de la SEC ID NO: 3 y porque el dominio variable de cadena ligera contiene una región CDR3 de la SEC ID NO: 4, una región CDR2 de la SEC ID NO: 5 y una región CDR1 de la SEC ID NO: 6. Con preferencia, el anticuerpo se caracteriza porque el dominio variable de cadena pesada contiene la SEC ID NO: 7 ó 10. Con preferencia, el anticuerpo se caracteriza porque el dominio variable de cadena pesada contiene la SEC ID NO: 7 ó 10 y el dominio variable de cadena ligera contiene la SEC ID NO: 8. Con preferencia, el anticuerpo que se une a la IL-17 y está caracterizado por las secuencias de aminoácidos y los fragmentos de secuencia de aminoácidos recién mencionados es del isotipo IgGl humano modificado en la región bisagra de la posición de aminoácidos 216-240, con preferencia en la posición de aminoácidos 220-240, entre CH1 y CH2 y/o en la segunda región interdominios en la posición de los aminoácidos 327-331 entre CH2 y CH3. Con preferencia, el anticuerpo contiene mutaciones L234A (alanina en lugar de leucina en la posición de aminoácidos 234) y L235A. Una región constante de cadena pesada preferida, que incluye las mutaciones L234A y L235A, es la que se representa en la SEC ID NO: 11.

Una línea celular de hibridomas preferida según la invención, <hIL-17>lAl .3C1 (anticuerpo 3C1) , se ha depositado en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ, Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares) , Braunschweig, Alemania.

Un anticuerpo que pueda obtenerse a partir de las líneas celulares (anticuerpo 3C1) constituye una modalidad preferida de la invención. Otra modalidad de la invención es una variante de anticuerpo 3C1 quimérico, humanizado o desprovisto de epítopo de célula T (DSM ACC 2941) . El anticuerpo se une específicamente a la IL17 con un valor IC50 de 1 nM o menor. Las versiones humanizadas preferidas del 3C1 son el Mab 106 y ab 107 (Mab = anticuerpo monoclonal) .

La invención se refiere además a un anticuerpo que se une a la IL-17 y se caracteriza por unirse al mismo epítopo de la IL-17 al que se une el anticuerpo monoclonal 3C1. El anticuerpo se une a la IL-17 con una afinidad por lo menos de 10"8 M"1 a 10"12 M"1 y es del isotipo IgGl humano modificado en la región bisagra en la posición de los aminoácidos 216-240, con preferencia en la posición de los aminoácidos 220-240, entre CH1 y CH2 y/o en la segunda región interdominios en la posición de los aminoácidos 327-331 entre CH2 y CH3. Con preferencia, el anticuerpo es del isotipo IgGl humano que contiene las mutaciones L234A (alanina en lugar de leucina en la posición de los aminoácidos 234) y L235A.

Con preferencia, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o humano. Con preferencia, el anticuerpo según la invención en una concentración de 100 ng/ml inhibe la producción de la IL-6 e IL-8 inducida por la IL-17A de cinomolgo en un ensayo de liberación de citocina con un valor IC50 de 1.5 nM o menos, empleando fibroblastos dérmicos de cinomolgo .

Otra modalidad de la invención es una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo según la invención. Con preferencia, la composición farmacéutica contiene un anticuerpo caracterizado por unirse al mismo epítopo de la IL-17 con el que se une el anticuerpo monoclonal 3C1. Con preferencia, el anticuerpo de la composición farmacéutica se une a la IL-17 con una afinidad por lo menos de 10"8 M"1 a 10~12 M"1, es del isotipo de la IgGl humana modificado en la región bisagra en la posición de aminoácidos 216-240, con preferencia en la posición de aminoácidos 220-240, entre CH1 y CH2 y/o en la segunda región interdominios en la posición de aminoácidos 327-331 entre CH2 y CH3. Con preferencia, el anticuerpo es del isotipo de la IgGl humana que contiene las mutaciones L234A (alanina en lugar de leucina en la posición de aminoácidos 234) y L235A.

Otra modalidad de la invención es el uso de un anticuerpo según la invención para la fabricación de una composición farmacéutica. Con preferencia, la' composición farmacéutica contiene un anticuerpo caracterizado por unirse al mismo epítopo de la ' IL-17 al que se une el anticuerpo monoclonal 3C1. Con preferencia, el anticuerpo de la composición farmacéutica se une a la IL-17 con una afinidad por lo menos de 10~8 M"1 a 10"12 "1, es del isotipo de la IgGl humana modificado en la región bisagra en la posición de aminoácidos 216-240, con preferencia en la posición de aminoácidos 220-240, entre CH1 y CH2 y/o en la segunda región interdominios en la posición de aminoácidos 327-331 entre CH2 y CH3. Con preferencia, el anticuerpo es del isotipo de la IgGl humana que contiene las mutaciones L234A (alanina en lugar de leucina en la posición de aminoácidos 234) y L235A.

Otra modalidad de la invención consiste en el uso de un anticuerpo según la invención para el tratamiento de esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad de Crohn, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD, por sus siglas en inglés) , asma y rechazo de trasplante. Otra modalidad de la invención consiste en un método para la fabricación de una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo según la invención. Con preferencia, la composición farmacéutica contiene un anticuerpo caracterizado por unirse al mismo epítopo de la IL-17 al que se une el anticuerpo monoclonal 3C1. Con preferencia, el anticuerpo de la composición farmacéutica se une a la IL-17 con una afinidad por lo menos de 10"8 M"1 a 10" 1 M"1, y es del isotipo de la IgGl humana modificado en la región bisagra en la posición de aminoácidos 216-240, con preferencia en la posición de aminoácidos 220-240, entre CH1 y CH2 y/o en la segunda región interdominios en la posición de aminoácidos 327-331 entre CH2 y CH3. Con preferencia, el anticuerpo es del isotipo de la IgGl humana que contiene las mutaciones L234A (alanina en lugar de leucina en la posición de aminoácidos 234) y L235A.

Otra modalidad de la invención es un ácido nucleico que codifica una cadena pesada de un anticuerpo que se une a la IL-17, caracterizado por contener una región CDR3 de cadena pesada de la SEC ID NO: 1 y contener con preferencia las mutaciones L234A y L235A en el dominio constante de cadena pesada de la IgGl . Con preferencia, el anticuerpo contiene además una región CDR2 de cadena pesada de la SEC ID NO: 2 ó 9 y una región CDR1 de la SEC ID NO: 3. Otra modalidad de la invención es un ácido nucleico que codifica una cadena ligera de un anticuerpo que se une a la IL-17, caracterizado por contener una región CDR3 de cadena ligera según la invención y con preferencia las mutaciones L234A y L235A en el dominio 'constante de cadena pesada de la IgGl. Con preferencia, el anticuerpo contiene además una región CDR2 de cadena pesada de la SEC ID NO: 2 ó 9 y una región CDR1 de la SEC ID NO: 3. Otra modalidad de la invención es un ácido nucleico que codifica a un anticuerpo según la invención caracterizado por contener un dominio variable de cadena pesada de la SEC ID NO: 7 ó 10 y un dominio variable de cadena ligera de la SEC ID NO: 8 y con preferencia las mutaciones L234A y L235A en el dominio constante de cadena pesada de la IgGl.

El anticuerpo según la invención se caracteriza porque las cadenas constantes son de origen humano. Estas cadenas constantes son bien conocidas en el estado de la técnica y - se han descrito por ejemplo en Kabat (véase por ejemplo Johnson, G. y u, T.T., Nucleic Acids Res. 28_, 214-218, 2000) . Por ejemplo, una región constante de cadena pesada humana útil contiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 11 con mutaciones L234A y L235A. Por ejemplo, una región constante de cadena ligera humana útil contiene una secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena ligera-kappa de la SEC ID NO: 12. Es preferido además que el anticuerpo sea de origen murino y contenga el marco de secuencia variable de anticuerpo de ratón según Kabat (véase por ejemplo Johnson, G. y Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 , 214-218 , 2000) .

El anticuerpo según la invención se caracteriza en especial por inhibir la liberación de la interleucina-8 (IL-8) en las células CCD25-SK. El anticuerpo según la invención neutraliza específicamente la activación celular mediada por la IL17 con un valor IC50 de 0.5 nM (16 ng/ml) o menor. El anticuerpo según la invención se une específicamente a la IL17 con un valor IC50 de 1 nM o menor.

El anticuerpo según la invención es con preferencia del isotipo humano de la IgGl . Las regiones constantes de cadena pesada ?? preferidas se representan en la SEC ID NO: 11 y en la SEC ID NO: 11 sin las mutaciones L234A y L235A.

El anticuerpo según la invención se caracteriza con preferencia por no unirse al factor de complemento humano Clq y, de este modo, evita la función efectora de la activación de complemento CDC.

El anticuerpo según la invención es con preferencia del isotipo de la IgGl humana modificado en la región bisagra en la posición de aminoácidos 216-240, con preferencia en la posición de aminoácidos 220-240, entre CH1 y CH2 y/o en la segunda región interdominios en la posición de aminoácidos 327-331 entre CH2 y CH3. El anticuerpo según la invención se caracteriza con preferencia por ser del isotipo de la IgGl humana, que contiene por lo menos una mutación en L234 (leucina en la posición de aminoácidos 234), L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y/o P329 (numeración según el índice EU) . Con preferencia, el anticuerpo es del isotipo de la IgGl humana que contiene las mutaciones L234A (alanina en lugar de leucina en la posición de aminoácidos 234) y L235A.

La invención proporciona además vectores de expresión que contienen el ácido nucleico según la invención, capaces de expresar el ácido nucleico en una célula hospedera procariota o eucariota y células hospederas que contienen tales vectores para la producción recombinante de tal anticuerpo. La invención se refiere además a una célula hospedera procariota o eucariota que contiene un vector según la invención. La invención se refiere además a un método para la producción de un anticuerpo recombinante humano o humanizado según la invención, caracterizado por expresar un ácido nucleico según la invención en una célula hospedera procariota o eucariota y para la recuperación del anticuerpo de la célula o el líquido sobrenadante del cultivo celular. La invención se refiere además al anticuerpo que puede obtenerse por el método recombinante .

Los anticuerpos según la invención aportan beneficios a los pacientes que necesitan una terapia dirigida contra la IL-17. Los anticuerpos según la invención tienen propiedades nuevas e innovadoras que aportan beneficios a un paciente que sufra tal enfermedad inmunológica, en especial que sufra una esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad de Crohn, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , asma o rechazo de trasplante. Los anticuerpos según la invención no provocan sensibilización a infecciones bacterianas entéricas o de estafilococos del paciente tratado. La invención proporciona además un método para tratar un paciente que sufra una esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad de Crohn, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , asma o rechazo de trasplante, que consiste en administrar a un paciente al que se haya diagnosticado una enfermedad (y, por tanto, que tenga necesidad de terapia) una cantidad eficaz de un anticuerpo que se una a la IL-17 según la invención. El anticuerpo se administra con preferencia en una composición farmacéutica. Otra modalidad de la invención es un método para el tratamiento de un paciente que sufra una esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad de Crohn, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , asma o rechazo de trasplante, caracterizado por administrar al paciente un anticuerpo según la invención. La invención se refiere además al uso de un anticuerpo según la invención para el tratamiento de un paciente que sufra de esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad de Crohn, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), asma o rechazo de trasplante y para la fabricación de una composición farmacéutica según la invención. Además, la invención se refiere a un método para la fabricación de una composición farmacéutica según la invención.

La invención proporciona además una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo según la invención, opcionalmente junto con un regulador de pH y/o un adyuvante útil para la formulación de anticuerpos con finalidad farmacéutica. La invención proporciona además composiciones farmacéuticas que contienen un anticuerpo según la invención en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, la composición farmacéutica puede incorporarse a un artículo fabricado o a un kit.

Descripción Detallada de la Invención El término "anticuerpo" abarca las diversas formas de estructuras de anticuerpo, incluyendo, pero sin limitarse a anticuerpos enteros y fragmentos de anticuerpo. El anticuerpo según la invención es con preferencia un anticuerpo humanizado, anticuerpo quimérico, o incluso un anticuerpo de ingeniería genética en el supuesto de que se conserven las propiedades características según la invención. Los "fragmentos de anticuerpo" incluyen una porción de un anticuerpo de longitud completa, con preferencia el dominio variable del mismo, o por lo menos su sitio de unión sobre el antígeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los diacuerpos, las moléculas de anticuerpo de cadena simple y los anticuerpos multiespecífieos formados con fragmentos de anticuerpo. Los anticuerpos scFv se han descrito, por ejemplo, en Huston, J.S., Methods in Enzymol . 203 , 46-52, 1991. Los fragmentos de anticuerpo abarcan además a los polipéptidos de cadena simple que tienen las características de un dominio VH, particularmente, que sean capaces de unirse a un dominio VL, o de un dominio VL para unirse a la IL-17, particularmente, que sean capaces de unirse a un dominio VH para formar un sitio funcional de unión a un antígeno, proporcionando de este modo las propiedades de un anticuerpo según la invención. Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" se emplean aquí para indicar una preparación de moléculas de anticuerpo de una composición de aminoácido único. El término "anticuerpo 'humanizado" indica anticuerpos, cuyo armazón y/o "regiones determinantes de complementariedad" (CDR, por sus siglas en inglés) se ha modificado para incluir las CDR de una inmunoglobulina de especies diferentes, si se comparan con las de la inmunoglobulina progenitor. En una modalidad preferida, se injerta una CDR de ratón en la región de armazón de un anticuerpo humano para obtener el "anticuerpo humanizado", véase, por ejemplo, Riechmann, L. y col., Nature 332 , 323-327, 1988; y Neuberger, M.S. y col., Nature 314 , 268-270, 1985.

El término "unión con la IL-17" se emplea aquí para indicar la unión del anticuerpo sobre IL-17 humana en un ensayo de unión ELISA. La unión se detecta si el anticuerpo produce una relación S/N (señal/ruido) de 7:1 o más en una concentración de anticuerpo de 1 g/ml. El anticuerpo según la invención se une específicamente a una IL-17A humana con un valor IC50 de 1 nM (0.15 g/ml) o menor. El anticuerpo no se une a la IL-17 B, C, D, E ni F (relación S/N (señal/ruido) menor que 7:1) y por consiguiente se une específicamente a la IL-17A. La unión sobre la IL-17A y sus variantes se realiza en un ensayo ELISA empleando una IL-17 inmovilizada o una variante de la misma. Él término "epítopo" indica una proteína determinante, capaz de unirse específicamente a un anticuerpo. Los epítopos están formados normalmente por grupos de moléculas de superficie químicamente activas, por ejemplo aminoácidos o cadenas laterales de tipo azúcar y por lo general los epítopos tienen características estructurales tridimensionales especificas, así como características específicas de carga. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque la unión con los primeros, pero no con los últimos, se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes. Con preferencia, un anticuerpo según la invención se une específicamente a una IL-17 nativa, pero no a una desnaturalizada. El anticuerpo de la IL-17 de la invención se une al mismo epítopo de la IL-17 con el que se une también el anticuerpo Mab317. La propiedad de unirse a un epítopo que tiene un anticuerpo de la IL-17 de la presente invención puede determinarse por métodos ya conocidos de la técnica. Se comprueba el anticuerpo de la IL-17 mediante un ensayo de unión con bloqueo cruzado in vi tro para determinar la capacidad del anticuerpo ensayado de obstaculizar la unión del anticuerpo Mab317 con la IL-17. Si hay un desplazamiento del anticuerpo ensayado, provocado por el anticuerpo Mab317, por lo menos del 15%, entonces los epítopos se hallan en proximidad inmediata.

El "dominio variable" (dominio variable de una cadena ligera (VL) , dominio variable de una cadena pesada (VH) ) se emplea aquí para indicar cada uno de los pares de dominios de cadena ligera y de cadena pesada que intervienen directamente en la unión del anticuerpo con el antígeno. Los dominios variables de cadena ligera y de cadena pesada tienen la misma estructura general y cada dominio consta de cuatro regiones de armazón (FR, por sus siglas en inglés) , cuyas secuencias están muy conservadas, conectadas a tres "regiones hipervariables" (o regiones determinantes de complementariedad, CDR) . Las regiones de armazón adoptan la conformación de lámina ß y las CDR pueden ' formar bucles que conecten la estructura de lámina ß. Las CDR de cada cadena se mantienen en su estructura tridimensional mediante las regiones de armazón y junto con las CDR de la otra cadena forman el sitio de unión con el antígeno. Las regiones CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo desempeñan un papel especialmente importante en la especificidad/afinidad de unión de los anticuerpos según la invención y por ello constituyen otro objeto de la invención.

El término "porción de un anticuerpo que se une al antígeno" se emplea aquí para indicar los residuos de aminoácido de un anticuerpo que permiten que este se una al antígeno. La porción de un anticuerpo que se une al antígeno consta de residuos de aminoácido de las "regiones determinantes de complementariedad" o. "CDR" . Las regiones de "armazón" o "FR" son aquellas regiones de dominio variable distintas de los residuos de la región hipervariable aquí definidos. Por lo tanto, los dominios variables de cadena ligera y larga de un anticuerpo abarcan desde los extremos N a los extremos C de los dominios FR1 , CDR1, FR2 , CDR2 , FR3 , CDR3 y FR4. En especial, la CDR3 de la cadena pesada es la región que contribuye en mayor medida a la unión con el antígeno y la que define las propiedades del anticuerpo. Las regiones CDR y FR se determinan de acuerdo a la definición estándar de Kabat y col . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. , Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) y/o los residuos de un "bucle hipervariable" .

El término "aminoácido" se emplea en esta solicitud para indicar el grupo de OÍ-carboxi-aminoácidos de origen natural, formado por la alanina (código de tres letras: ala, código de una letra: A), arginina (arg, R) , asparagina (asn, N) , ácido aspártico (asp, D) , cisteína (cys, C) , glutamina (gln, Q) , ácido glutámico (glu, E) , glicina (gly, G) , histidina (his, H) , isoleucina (ile, I), leucina (leu, L) , lisina (lys, K) , metionina (met, M) , fenilalanina (phe, F) , prolina (pro, P) , serina (ser, S) , treonina (thr, T) , triptófano (trp, W) , tirosina (tyr, Y) y valina (val, V) .

Los términos "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" , se emplean aquí para indicar moléculas de ADN y moléculas de AR . Una molécula de ácido nucleico puede ser de estructura de cadena simple o de estructura de cadena doble, pero será con preferencia un ADN de estructura de cadena doble. Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando ha establecido una relación funcional con otro ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una pre- secuencia o líder secretorio está unido operativamente con el ADN de un polipéptido si se expresa en forma de pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador está unido operativamente con una secuencia codificadora si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a un ribosoma está unido operativamente con una secuencia codificadora si está posicionado de manera que facilita la traducción. En general, "unido operativamente" indica que las secuencias de ADN que se van a unir son colineales y, en el caso de un líder secretorio, contiguas y dentro del marco de lectura. Sin embargo, los intensificadores no es necesario que ocupen posiciones contiguas. La unión se lleva a cabo por ligación en los sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, entonces se emplearán adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo a la práctica convencional. Tal como se emplean aquí, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se emplean indistintamente y estas denominaciones incluyen a la progenie. Por consiguiente, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen a la célula primaria en cuestión y a los cultivos derivados de la misma, con independencia del número de transferencias. Se da también por supuesto que toda la progenie no tiene que ser exactamente idéntica en su contenido de ADN, como consecuencia de mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluyen las progenies variantes que tienen la misma función o la misma actividad biológica, que se ha detectado en la célula transformada progenitor.

La "parte Fe" de un anticuerpo no interviene directamente en la unión de un anticuerpo con un antígeno, pero posee varias funciones efectoras. Una "parte Fe de un anticuerpo" es un término que los expertos conocen bien y que se -define en base a la descomposición de anticuerpos provocada por la papaína. En función de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas largas, los anticuerpos o inmunoglobulinas se dividen en los grupos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varios de ellos pueden dividirse a su vez en subgrupos (isotipos) , por ejemplo IgGl , IgG2, IgG3 e IgG4 , IgAl e IgA2. Según las regiones constantes de cadena pesada, los diferentes grupos de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, ? y µ, respectivamente. La parte Fe de un anticuerpo interviene directamente en la ADCC (citotoxicidad mediada por la célula dependiente de anticuerpo) y la CDC (citotoxicidad dependiente del complemento) basada en la activación del complemento, unión con el Clq y unión con el receptor de la Fe. La activación del complemento (CDC) se inicia con la unión del factor de complemento Clq con la parte Fe de la mayor parte de los subgrupos de anticuerpos IgG. La influencia de un anticuerpo en el sistema de complemento depende de ciertas condiciones, mientras que la unión con el Clq viene causada por sitios de unión definidos de la parte Fe. Tales sitios de unión ya son conocidos en la técnica y se han descrito, por ejemplo, en Boakle, R.J. y col., Nature 282, 742-743, 1979; Lukas, T.J. y col., J. Immunol. 127, 2555-2560, 1981; Brunhouse, R . y Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16, 907-917, 1979; Burton, D.R. y col., Nature 288 , 338-344, 1980; Thommesen, J.E. y col., Mol. Immunol. 3_7, 995-1004, 2000; Idusogie, E.E. y col., J. Immunol. 164, 4178-4184, 2000; Hezareh, M. y col., J. Virology 75_, 12161-12168, 2001; Morgan, A. y col., Immunology 8_6, 319-324, 1995; EP 0307434. Los sitios de unión son, por ejemplo, los siguientes: L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (numeración según el índice EU de Kabat, ver más abajo) . Los anticuerpos de los subgrupos IgGl, IgG2 e IgG3 normalmente producen la activación de complemento y la unión con el Clq, mientras que el IgG4 no activa el sistema de complemento y no se une con el Clq.

El anticuerpo según la invención contiene una parte Fe de origen humano, que es la parte Fe de un anticuerpo humano del subgrupo IgGl . En lo que respecta a la parte Fe de un anticuerpo según la invención, con preferencia no puede detectarse unión con el Clq, según la definición dada más abaj o .

La invención se refiere, pues, a un anticuerpo según la invención, caracterizado porque el anticuerpo se une a la IL-17, contiene una -parte Fe ' de origen humano y no se une al factor de complemento humano Clq y, de este modo, impide la función efectora de la CDC.

Un anticuerpo según la invención en lo que respecta a la unión con el receptor Fcy es con preferencia del subgrupo de la IgGl o de la IgG2 humanas, con una mutación en L234, L235, y/o D265 y/o contiene la mutación PVA236. Son preferidas las mutaciones L234A, L235A, L235E y/o PVA236 (la PVA236 significa que la secuencia de aminoácidos ELLG (indicada en el código de aminoácidos de una letra) de la posición de aminoácidos de 233 a 236 de la IgGl o EFLG de la IgG4 se ha reemplazado por la PVA) . La presente invención proporciona, pues, un anticuerpo según la invención caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo del subgrupo humano IgGl, que contiene por lo menos una mutación en L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y/o P329. En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En una modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo según la invención, que contiene una parte Fe derivada de origen humano y caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo del subgrupo humano IgGl, que contiene por lo menos una mutación en L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y el anticuerpo se une a la IL-17 con un valor KD inferior a 10 M en un ensayo BIAcore. En otra modalidad, el valor D está comprendido entre 10"11 y 10"9 M.

La unión con el Clq puede medirse según Idusogie, E.E. y col.( J. Immunol. 164 , 4178-4184, 2000. La ausencia de unión con el Clq se caracteriza según la invención porque si en un ensayo en el que se recubre una placa ELISA con diferentes concentraciones del anticuerpo, se añade el Clq humano. La unión con el Clq se detecta con un anticuerpo dirigido contra el Clq humano y después se detecta el conjugado marcado con el sustrato de peroxidasa ABTS (sulfonato de la 2 , 2 ' -azino-di- [3 -etilbenzotiazolina] ) . Se detecta que no hay unión con el Clq según la invención si la densidad óptica (OD) a 405 nm del anticuerpo ensayado es inferior a 0.05 para una concentración de anticuerpo de 10 g/ml.

El anticuerpo según la invención se caracteriza con preferencia porque las cadenas constantes son de origen humano. Las cadenas constantes son bien conocidas en el estado de la técnica y se han descrito, por ejemplo, en Kabat (ver por ejemplo Johnson, G. y Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 , 214-218, 2000). Por ejemplo, una región constante de cadena pesada humana útil contiene la SEC ID NO: 23. Por ejemplo, una región constante de cadena ligera humana útil contiene una secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena ligera-kappa de la SEC ID NO: 12.

Otra modalidad de la invención consiste en un ácido nucleico que codifica una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo según la invención.

La invención se refiere a un método para el tratamiento de un paciente que necesite una terapia, caracterizado porque se administra al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo según la invención. La invención se refiere al uso de un anticuerpo según la invención para la terapia. La invención se refiere al uso de un anticuerpo según la invención para la fabricación de un medicamento destinado a la profilaxis y al tratamiento de trastornos inflamatorios y trombóticos . La invención se refiere al uso de un anticuerpo según la invención para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, con preferencia para el tratamiento del trastorno pulmonar obstructivo crónico (COPD) , esclerosis múltiple y artritis reumatoide.

Los anticuerpos según la invención incluyen, además, a los anticuerpos que tienen "modificaciones conservadoras de secuencia" (anticuerpos variantes) , modificaciones de la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos que no afectan o no alteran las características antes mencionadas del anticuerpo según la invención. Las modificaciones pueden introducirse por métodos estándar ya conocidos en la técnica, como son la mutagénesis dirigida a un sitio y la mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen a aquellas, en las que el residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tenga una cadena lateral similar. En la técnica ya se han definido grupos de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares. Estos grupos incluyen a los aminoácidos de cadenas laterales básicas (por ejemplo lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (por ejemplo ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano) , cadenas laterales no polares (por ejemplo alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina) , cadenas laterales con ramificación beta (por ejemplo treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) . Por lo tanto, un residuo de aminoácido esencial previsto de un anticuerpo anti-IL-17 humano puede haberse reemplazado con preferencia por otro residuo de aminoácido del mismo grupo de cadenas laterales. Un anticuerpo anti-IL-17 "variante" indica, pues, una molécula que difiere en la secuencia de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-IL-17 "progenitor" por un máximo de diez adiciones, eliminaciones y/o sustituciones, con preferencia por un total de dos a cinco, en una o más regiones variables del anticuerpo progenitor. Las sustituciones de aminoácidos pueden efectuarse por mutagénesis basado en el modelado molecular descrito por Riechmann, L. y col., Nature 332 , 323-327, 1988 y Queen, C. y col., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 8_6, 10029-10033, 1989.

Otra modalidad de la invención consiste en un método para la. producción de un anticuerpo contra la IL-17 que no se une al receptor Fcy y/o Clq, caracterizado porque la secuencia de un ácido nucleico, que codifica a la cadena pesada de un anticuerpo de tipo IgGl humano que se une a la IL-17, se modifica de tal manera que el anticuerpo modificado no se une con el receptor Clq y/o Fcy, el ácido nucleico modificado y el ácido nucleico que codifica a la cadena ligera del anticuerpo se insertan en un vector de expresión, el vector se inserta en una célula hospedera eucariota, la proteína codificada se expresa y se recupera de la célula hospedera o el líquido sobrenadante.

La identidad u homología con respecto a una secuencia se define aquí como el porcentaje de residuos de aminoácido de la secuencia candidato o propuesta que son idénticos con los de la secuencia progenitor, después de alinear las secuencias e introducir lagunas, si fuera necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia. No deberá construirse ninguna extensión, eliminación ni inserción N-terminal, C-terminal ni interna dentro de la secuencia del anticuerpo que pueda afectar la identidad o la homología de secuencia. La variante conserva la capacidad de unirse a la IL-17 humana y con preferencia tiene propiedades, que son mejores que las del anticuerpo progenitor. Por ejemplo, la variante puede tener efectos secundarios reducidos durante el tratamiento.

El anticuerpo "progenitor" contiene las regiones CDR del anticuerpo 3C1 y se emplea con preferencia para la obtención de la variante. Con preferencia, el anticuerpo progenitor tiene una región de armazón humana y, si está presente, tiene una región constante de o dominios constantes de anticuerpo humano. Por ejemplo, el anticuerpo progenitor puede ser un anticuerpo humano o humanizado.

Los anticuerpos según la invención se producen con preferencia por medios recombinantes . Estos métodos son muy conocidos en el estado de la técnica y consisten en la expresión de proteínas células procariotas o eucariotas, el posterior aislamiento del polipéptido del anticuerpo y normalmente la purificación hasta una pureza farmacéuticamente aceptable. Para la expresión de las proteínas, los ácidos nucleicos, que codifican las cadenas cortas y largas o fragmentos de las mismas, se insertan en vectores de expresión por métodos estándar. La expresión se realiza en células hospederas eucariotas o procariotas apropiadas, como son las células CHO, células NSO, células SP2/0, células HEK293, células COS, levadura o células de E. coli y el anticuerpo se recupera de las células (del líquido sobrenadante o después de la lisis celular) . La producción recombinante de anticuerpos es muy conocida en el estado de la técnica y se ha descrito, por ejemplo, en los artículos de revisión de Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17, 183-202, 1999; Geisse, S. y col., Protein Expr. Purif. 8^, 271-282, 1996; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 1_6, 151-160, 2000; Werner, R.G., Drug Res. <48, 870-880, 1998. Los anticuerpos pueden estar presentes en las células enteras, en un lisado celular o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. La purificación se lleva a cabo con el fin de eliminar otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, por técnicas estándar, incluida la cromatografía de columna y otros métodos bien conocidos de la técnica, véase Ausubel, F. y col., coord. , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley Interscience, Nueva York, 1987. La expresión en células NSO se ha descrito, por ejemplo, en Barnes, L.M. y col., Cytotechnology 32, 109-123, 2000; Barnes, L.M. y col., Biotech. Bioeng. 73, 261-270, 2001. La expresión transitoria se ha descrito, por ejemplo, en Durocher, Y. y col., Nucí. Acids Res. 30, E9 , 2002. La clonación de dominios variables se ha descrito en Orlandi, R. y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86, 3833-3837, 1989; Cárter, P. y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89, 4285-4289, 1992; Norderhaug, L. y col., J. Immunol . Methods 204 , 77-87, 1997. Un sistema preferido de expresión transitoria (HEK 293) se ha descrito en Schlaeger, E.-J. y Christensen, . , en Cytotechnology 3_0, 71-83, 1999 y en Schlaeger, E.-J., en J. Immunol . Methods 19 , 191-199, 1996. Los anticuerpos monoclonales se separan de modo conveniente del medio de cultivo por procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulina por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis a través de gel, diálisis o cromatografía de afinidad. El ADN y el ARN que codifican a los. anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y se secuencia aplicando procedimientos convencionales.. Las células de hibridoma pueden servir de fuente de tales ADN y ARN. Una vez aislado, el ADN puede insertarse en vectores de expresión, que después se transfectan a células hospederas, por ejemplo células HEK 293, células CHO o células de mieloma, que de otro modo no producirían proteína de inmunoglobulina, para conseguir la síntesis de anticuerpos recombinantes monoclonales en las células hospederas.

Las variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo de IL-17 humano se obtienen introduciendo los cambios apropiados de nucleótidos en el ADN que codifica al anticuerpo, o por síntesis de péptidos . Sin embargo, tales modificaciones solo pueden realizarse en una medida muy limitada, por ejemplo del modo antes descrito. Por ejemplo, las modificaciones no alteran las características del anticuerpo antes mencionado, como son el isotipo de IgG ni la unión del epítopo, pero pueden modificar el rendimiento de la producción recombinante , la estabilidad de las proteínas o facilitar la purificación. Todos los residuos de cisteína que no intervienen en mantener la conformación correcta del anticuerpo anti-IL-17 pueden sustituirse en general por serina, para mejorar la estabilidad de la molécula a la oxidación e impedir enlaces cruzados aberrantes. Y viceversa, el o los enlaces de cisteína pueden añadirse al anticuerpo para mejorar su estabilidad (en particular cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo un fragmento Fv) . Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el modelo progenitor de glicosilación del anticuerpo. Se entiende por "alterar" la eliminación de uno o más residuos de hidrato de carbono existentes en el anticuerpo y/o la adición de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo. La · glicosilación de anticuerpos está unida típicamente sobre N. Unida sobre N indica la unión del resto hidrato de carbono a la cadena lateral de un resto asparagina. Las secuencias de tripéptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento de la unión enzimática del resto de hidrato de carbono con la cadena lateral de la asparagina. Por lo tanto, la presencia de una de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido da lugar a un sitio de glicosilación potencial. La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se lleva a cabo de modo conveniente alterando la secuencia de aminoácidos para que contenga una o más secuencias de tripéptido recién descritas (para el caso de sitios de glicosilación unidos sobre N) .

Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican las variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-IL-17 se obtienen por numerosos métodos ya conocidos de la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, el aislamiento a partir de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos de origen natural) o la obtención por mutagénesis mediada por oligonucleótido (o dirigida a un sitio) , mutagénesis de PCR y mutagénesis de cásete de una variante preparada previamente o una versión no variante de un anticuerpo anti-IL-17 humanizado.

Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo consiste en unir el anticuerpo a uno de los muchos polímeros no proteínicos, por ejemplo, polietilenglicol , polipropilenglicol , o polioxialquilenos , del modo descrito en las patentes US N° 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; 4,179,337.

Los dominios variables de cadena pesada y ligera según la invención se combinan con secuencias de promotor, inicio de traducción, región constante, región 3' sin traducir, poliadenilación y terminación de transcripción para formar los constructos de vectores de expresión. Los constructos de expresión de cadena pesada y ligera pueden combinarse en un solo vector, co-transfectarse , transfectarse en serie o transfectarse por separado a las células hospederas, que entonces se fusionan para formar una sola célula hospedera que expresa a las dos cadenas .

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que contiene un anticuerpo monoclonal o una combinación de anticuerpos monoclonales , o la porción de los mismos que se une con el antígeno, de la presente invención, formulado junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal como se emplea aquí, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye a todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes isotónicos y de retardo de la absorción/resorción y similares, que sean fisiológicamente compatibles. Con preferencia, el vehículo será adecuado para la inyección o. para la infusión. Una composición de la presente invención puede administrarse por muchos métodos ya .conocidos de la técnica. Los expertos podrán apreciar que la vía y/o el modo de administración pueden variar en función de los resultados deseados. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen las soluciones o dispersiones acuosas estériles y los polvos estériles para la fabricación de soluciones o dispersiones estériles inyectables . El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas ya es conocido en la técnica. Además del agua, el vehículo puede ser, por ejemplo, una solución salina regulada en pH isotónica. Con independencia de la vía de administración elegida, los compuestos de la presente invención, que pueden utilizarse en una forma hidratada conveniente, y/o las composiciones f rmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables por métodos convencionales , que los expertos ya conocen. Los niveles actuales de dosificación de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse con el fin de obtener una cantidad de ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada en un paciente, composición y modo de administración concretos, sin ser tóxico para el paciente (cantidad eficaz) . El nivel de dosificación elegido dependerá de muchos factores farmacocinéticos , incluyendo la actividad de las composiciones concretas de la presente invención que se empleen, o del éster, de la sal o de la amida de las mismas, la vía de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto que se emplee, de otros fármacos, compuestos y/o materiales que se empleen en combinación con las composiciones concretas elegidas, la edad, sexo, peso, enfermedad, estado general de salud e historial médico del paciente a tratar y factores similares, que los médicos ya conocen.

La invención contempla el uso de los anticuerpos según la invención para el tratamiento de un paciente que sufra de esclerosis múltiple, artritis reumatoide (RA) , psoriasis, enfermedad de Crohn, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , asma y rechazo de trasplante.

Otra modalidad de la invención consiste en el uso de un anticuerpo anti-IL-17, con preferencia un anticuerpo según la invención, para el tratamiento de un paciente que sufra una artritis reumatoide (RA) , el paciente responde de forma moderada o no responde al tratamiento con un antagonista de TNF, un anticuerpo anti-CD20, CTLA4Ig o anticuerpo anti-IL6. Otra modalidad de la invención es el uso de un anticuerpo anti-IL-17, con preferencia un anticuerpo según la invención, para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de un paciente que sufra una artritis reumatoide, el paciente responde de forma moderada o no responde al tratamiento con un antagonista de TNF, un anticuerpo anti-CD20, CTLA4Ig o anticuerpo anti-IL6. Los antagonistas de TNF para el tratamiento de la RA son, por ® ejemplo, el infliximab (IFX, Remicade ) , etanercept (ETA, Enbrel ) y adalimumab (ADA, Humira ) . El anticuerpo anti-IL-17 se administra con preferencia al paciente que responde de forma moderada o no responde al tratamiento con un antagonista de TNF, un anticuerpo anti-CD20, CTLA4Ig o anticuerpo anti-IL6 por lo menos durante 3 meses, con preferencia durante 6 meses.

La invención proporciona también un método para la fabricación de una composición farmacéutica que contiene una cantidad eficaz de un anticuerpo según la invención junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable y el uso del anticuerpo según la invención para tal método. La invención proporciona además el uso de un anticuerpo según la invención en una cantidad eficaz para la fabricación de un agente farmacéutico, con preferencia junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, para el tratamiento de un paciente que sufra de esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad de Crohn, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , asma o rechazo de trasplante. La invención proporciona también el uso de un anticuerpo según la invención en una cantidad eficaz para la fabricación de un agente farmacéutico, con preferencia junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, para el tratamiento de un paciente que sufra una esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad de Crohn, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , asma o rechazo de trasplante .

Descripción de las secuencias SEC ID NO: 1 CDR3 de cadena pesada, Mab 106 y Mab 107 SEC ID NO: 2 CDR2 de cadena pesada, Mab 106 SEC ID NO: 3 CDR1 de cadena pesada, Mab 106 y Mab 107 SEC ID NO: 4 CDR3 de cadena ligera, Mab 106 y Mab 107 SEC ID NO: 5 CDR2 de cadena ligera, Mab 106 y Mab 107 SEC ID NO: 6 CDR1 de cadena ligera, Mab 106 y Mab 107 SEC ID NO: 7 dominio variable de cadena pesada, Mab 106 SEC ID NO: 8 dominio variable de cadena ligera, Mab 106 y Mab 107 SEC ID NO: 9 CDR2 de cadena pesada, Mab 107 SEC ID NO: 10 dominio variable de cadena pesada, Mab 106 SEC ID NO: 11 región constante de cadena pesada ?? SEC ID NO: 12 región constante de cadena ligera ? Ej emplos Ej emplo 1 Descripción de la inmunización La inmunización se consigue en 20 semanas empleando 5 ratones Balb/c hembra y 250 (1 x) y 100 pg (3 x) de IL17 recombinante humana de Peprotech (http://www.peprotech.com; N° de cat. 200-17, en 1% de PBS con 1% de albúmina) por ratón.

Ejemplo 2 Unión con la IL-17 determinada por ELISA ® Se recubren placas NUNC Maxisorp (96 cavidades) con IL-17 recombinante humana (Peprotech No. 200-17, www.peprotech.com) en una concentración de 0.5 pg/ml en PBS (100 ml/cavidad) . Se incuban las placas a 37°C en un agitador orbital con agitación durante 2 horas. Después se elimina la solución de recubrimiento y se añaden 100 µ?/cavidad de PBSTC ® (solución salina regulada en pH con fosfato, 0.05% Tween 20, 2% de suero de pollo) . Se incuban las placas a temperatura ambiente durante 1 hora. Se elimina la solución de bloqueo y se agregan a la placa las muestras (en blanco: PBSTC, muestras (10 g/ml en PBS) : anticuerpos 3C1 anti-IL-17 humana y Mab 106 según la invención; Mab 16-7178-85 de eBioscience (www.ebioscience.com); Mab 317 de R&D Systems (www.rndsystems.com), NVP-AIN-497 (WO 2006/013107) (100 µ?/cavidad) . Se incuban las placas a temperatura ambiente con agitación. Se eliminan las muestras, se lavan las placas tres veces con 200 µ?/cavidad de PBST (solución salina regulada en ® pH con fosfato, 0.05% Tween 20) y se añade el segundo anticuerpo (IgG de cabra anti-ratón, Fe gamma, conjugado con HRP; Chemícon AP127P, www.millipore.com) para la detección de anticuerpos de ratón o IgG de cabra anti-humano, Fc-gamma, conjugado con HRP (Chemicon AP113P) para la detección de los anticuerpos humanizados. Se diluye el segundo anticuerpo a razón de 1:10000 en PBSTC y se incuban las placas a temperatura ambiente con agitación durante 1 hora. Se elimina el segundo anticuerpo, se lavan las placas tres veces con 200 µ?/cavidad de PBST (solución salina regulada en pH con fosfato, 0.05% Tween® 20) y se añaden 100 µ?/cavidad de ABTS® (Roche Diagnostics GmbH) . Se mide la densidad óptica a 405/492 nm en relación a la unión sobre la IL-17A (tomada como el 100%) . Se realiza la unión sobre todos subtipos de IL-17 humana (IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E y IL-17F) con el mismo formato de ensayo. Los resultados se presentan en la tabla 1.

Tabla 1 Anticuerpo Unión (tomando la unión sobre IL-17A como 100) IL17A IL17B IL17C IL17D IL17E IL17F 3C1 100 0 1 0 0 0 106 100 0 0 0 1 0 Mab 317 100 0 0 0 0 0 16-7178-85 100 7 97 6 5 5 NVP-AIN-497 100 2 2 0 3 62 Ejemplo 3 Preparación de un plásmido de expresión para una inmunoglobulina del grupo IgGl .. . .

El plásmido 6454 (a continuación se indica con p6454) es el plásmido para la expresión de un anticuerpo anti-IL-17 (cásete de expresión organizado genómicamente, conservando la organización exón-intrón) en células eucariotas . Consta de los siguientes elementos funcionales: un origen de replicación derivado del vector pUC18 (origen pUC) , un gen de ß (beta) -lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina en E. coli (Amp) , un cásete para la expresión de la cadena pesada gamma- 1 que consta de los elementos siguientes: - el principal promotor y intensificador inmediatamente anterior del citomegalovirus humano (promotor hCMV IE1) , un 5'UTR sintético que incluye una secuencia de Kozak, - una secuencia de señal de cadena pesada de inmunoglobulina murina que incluye el intrón de secuencia de señal (Ll_Intron_L2) , el ADNc de la región variable de cadena pesada (VH) que dispone de un sitio donador de empalme en el extremo 3' , la región de intensificador µ de inmunoglobulina de ratón, el gen gamma-1 de cadena pesada de inmunoglobulina humana (IGHG1) incluyendo los exones CH1, bisagra, CH2 y CH3 , los intrones interventores y el 3 ' UTR que lleva la secuencia de señal de poliadenilación, un cásete para la expresión de la cadena ligera kappa, que contiene los elementos siguientes: el principal promotor y intensificador inmediatamente anterior del citomegalovirus humano (promotor hCMV IE1) , un 5 'UTR sintético que incluye una secuencia de Kozak, una secuencia de señal de cadena pesada de inmunoglobulina murina que incluye el intrón de secuencia de i señal (Ll_Intron_L2) , el ADNc de la región variable de cadena ligera provista de un sitio donador de empalme en el extremo 3' (VL) , - la región de intensificador Ig-kappa de ratón intrónica, el gen de la inmunoglobulina kappa humana (IGK) incluyendo al exón IGKC y la IGK 3 ' UTR que lleva la secuencia de señal de poliadenilación, - un cásete para la expresión de la dihidrofolato-reductasa murina (DHFR) idóneo para la selección auxotrófica en células eucariotas que incluye una versión reducida del promotor temprano y origen del SV40, la secuencia codificadora de la DHFR murina, la señal de poliadenilación temprana del SV40. Se transfecta el P6454 a células CH0-K1, se aislan lineas celulares estables después de la selección con metotrexato (MTX) y se exploran para la producción del anticuerpo humano por ELISA para la IgG humana.

Ejemplo 4 Investigación de la activación del sistema de complemento (ELISA de unión sobre Clq) Para investigar la unión de un anticuerpo según la invención sobre el Clq se aplica la estrategia ELISA. El Clq forma parte de un sistema inmune de adaptación y, después de unirse sobre complejos inmunes, desencadena la activación sucesiva de varios cimógenos. Las enzimas provocan a su vez la descomposición de las moléculas C3 , lo cual da pie al inicio de reacciones inflamatorias, la opsonización de partículas ajenas o aberrantes y la lisis de membranas celulares .

Se recubre una MTP (Nunc) con los anticuerpos a ensayar en un regulador de pH PBS a 4°C durante una noche en 7 concentraciones entre 10 g/ml y 0.156 g/ml, a razón de 100 µ?/cavidad. Se efectúa el bloqueo de los sitios de unión libres con BPLA (Roche) al 3% en PBS a temperatura ambiente durante 1 h, a razón de 200 µ?/cavidad. Se incuba la MTP con 2 pg/ml de Clq (Quiddel) en BPLA al 3% en PBS, 100 g/ml . Se ® lava la MTP 3 veces a temperatura ambiente con Tween 20 al 0.1% en PBS. Se detecta la unión (unión) añadiendo anticuerpo policlonal de conejo anti-Clq (DAKO) a razón de 0-25 g/ml en BPLA del -3%, Tween® 20 al 0.1% en PBS, 100 µ?/cavidad a temperatura ambiente durante 1 h. Se lava la MTP 3 veces a temperatura ambiente con Tween 20 al 0.1% en PBS. Se añade el anticuerpo de cabra anti-conejo IgG POD secundario (Jackson Immuno Research) a razón de 0.1 en Tween 20 al 3% en PBS a temperatura ambiente durante 1 h, 100 µ?/cavidad. Después dé lavar la MTP 3 veces con Tween 20 al 0.1% en PBS se incuba la MTP a temperatura ambiente con una solución de ABTS (Roche) y se mide la absorción en una longitud de onda de 405 nm tomando como referencia la longitud de onda de 490 nm. Se determinan las señales de base en cavidades no recubiertos con anticuerpos, pero tratado por un procedimiento de detección idéntico. No se observa unión sobre el Clq si la densidad óptica (OD) a 405 nm para el anticuerpo ensayado es menor que 0.05 para una concentración de anticuerpo de 10 Ejemplo 5 Mapeo de la región de epítopo con ensayos de 4 bloqueo cruzado de BIAcore Todas las mediciones se realizan empleando un instrumento BIAcore 3000 a 25°C. El regulador de pH de sistema y ensayo es el HBS-EP (10 mM de HEPES , 150 mM de NaCl, 3.4 de mM EDTA, 0.005% de Polisorbato 20 (v/v) ) . Se somete un chip sensor de BIAcore CM5 a un procedimiento de acondicionamiento previo. Se inyectan sucesivamente 0.1% de SDS, 50 mM de NaOH, 10 mM de HC1 y 100 mM de H3P04 durante 30 segundos sobre las células en flujo FC1, FC2 , FC3 y FC4. Se aplica el procedimiento de condensación de amina según las instrucciones del fabricante empleando el programa BIAcore 3000 Wizard v. 4.1.

Con el fin de realizar los ensayos de bloqueo cruzado con anticuerpos quiméricos o humanizados, después de una activación EDC/NHS de la superficie del sensor, se inmoviliza un anticuerpo IgG policlonal de cabra anti-humano (Jackson) sobre todas las células de flujo del sensor (FC) . Se emplean 30 g/ml de anticuerpo IgG policlonal de cabra anti-humano en 10 mM de NaAc, pH 5.0 a razón de 10 µ?/min durante 7 min para inmovilizar 10,000 RU del sistema de captura del anticuerpo. Se desactiva la superficie por saturación con etanolamina. Se acondiciona el sensor del sistema de captura humano en 5 ciclos de unión del analito huIgG (Bayer) a razón de 10 µ?/min durante 2 min y regeneración con 10 mM de glicina, de pH 1.7 a razón de 30 µ?/min durante 3 rain.

Con un caudal de 10 µ?/min se inyecta el Mab primario durante 3 min a las FC1 - FC4. Se bloquea la capacidad libre de unión del sistema de captura del sensor efectuando una inyección de 3 min a las FC1-FC4 a razón de 10 µ?/min de un cóctel de 50 µg/ml de huIgG (Bayer) en regulador de pH HBS-EP. A continuación se inyecta el antígeno rhuIL17-A a razón de 10 µ?/min durante 3 min a las FC1-FC4 para saturar la capacidad de unión de los anticuerpos primarios. Se realiza una segunda inyección a las FC1-FC4 a razón de 30 µ?/min durante 3 min antes de inyectar por separado los anticuerpos secundarios a razón de 30 µ?/min durante 3 min a las células de flujo FC1, FC2 , FC3 y FC4. Se regenera el sensor empleando 10 mM de glicina, de pH 1.75 a razón de 30 µ?/min durante 3 min.

En primer lugar, la inyección de 0 nM analito se resta de todos los gramos de sensor con el fin de corregir la disociación de los anticuerpos primarios del sistema de captura de IgG policlonal de cabra anti-humano. Se forma el cociente entre la señal de respuesta del anticuerpo secundario y la del anticuerpo primario. Este cociente se denomina relación molar (MR, por sus siglas en inglés) e indica la accesibilidad de la región del epítopo.

Los valores de la relación molar se enlistan en una matriz. Las combinaciones de Mab homólogos se toman como control, si los procedimientos de bloqueo se han realizado con éxito. El corte se define mediante combinaciones de Mab homólogos .

El corte en los ensayos de bloqueo cruzado se ha establecido para el formato de ensayo de Mabl06 homogéneo (9%) . Los anteriores valores de relación molar MR = 15% se refieren al acceso a epítopos independientes.

Los resultados del mapeo del epítopo (ver tabla 2) indican que el Mab K106 y su derivado Mabl07 se unen sobre una región de epítopo distinta a la NVP-AIN-497. Además, el Mab K106 se une a un epítopo diferente del eBio64CAP17 y a la misma región de epítopo que el Mab317.

Tabla 2 Resultados de mapeo de epítopo El corte del análisis se define mediante combinaciones homogéneas de ensayo: (106, 9%); (AIN-457, 6%); (eBio64CAP17 , 7%) ; ( ab317, 0%) . Aquí el corte se define en un ensayo de Mabl06 homogéneo.

Ejemplo 6 Ensayo de liberación de citocina, inhibición de la liberación de la hIL-8 inducida por la IL-17A Se efectúa este ensayo para detectar la de producción de la hIL-8 en células CCD-25SK después de la estimulación con IL-17A y TNF-alfa con pre- incubación de anticuerpos anti-IL-17. Las células CCD-25SK tienen el receptor de IL-17. La IL-17A se fija sobre este receptor de la IL-17. Los anticuerpos contra la IL-17A se fijan sobre la IL-17A. El mecanismo solo funciona en presencia del TNF-alfa. Gracias a la unión del IL-17A sobre el receptor de IL-17, las células producen la hIL-8 que pueden detectarse con un ensayo ELISA en forma de lectura final. La hIL-8 medida da información sobre las concentraciones de anticuerpos anti-IL-17 que inhiben la estimulación de células CCD-25SK por acción del IL-17.

Se siembran las células CCD-25SK células con una densidad de 2.5xl04 células/cavidad en una placa de 48 cavidades (volumen = 0.45 ml/cavidad) y se incuban a 37°C y un 5% de C02 durante 24 h. Después de incubar durante una noche se tratan las células con anticuerpos anti-IL-17 durante 30 minutos en concentraciones finales de 9000; 3000; 1000; 333.3; 111.1; 37.03; 12.34; y 4.11 ng/ml . Cada serie de diluciones de anticuerpo se realiza con medio, 50 µ?/cavidad (concentrado xlO) . Pasados 30 min se estimulan las células con una mezcla de 10 ng/ml de IL-17A y 50 pg/ml de TNF-alfa. 50 µ?/cavidad (concentrado xlO) y se incuban a 37°C y un 5% de C02 durante 24 h. Después de incubar durante una noche se transfieren los líquidos sobrenadantes a placas de 96 cavidades y se congelan a -20 °C como material intermedio • para el ensayo ELISA de la hIL-8.

Se realiza el ensayo ELISA hIL-8 ELISA del modo siguiente. Se añaden a cada cavidad 100 µ? de anticuerpo de captura diluido y se incuba a 4°C durante una noche. Se realizan las diluciones con regulador de pH de recubrimiento. Se aspiran las placas, se lavan con 200 µ?/cavidad por 3 veces, se bloquean con 200 µ?/cavidad de diluyente de ensayo y se incuban a temperatura ambiente durante 1 h. Se aspiran las placas y se lavan con 200 µ?/ cavidad, 3 veces. Se añaden 100 µ? de estándar y de las muestras y se incuban a temperatura ambiente durante 2 h. Serie de dilución del estándar: 400 pg/ml; 200 pg/ml; 100 pg/ml; 50 pg/ml; 25 pg/ml; 12.5 pg/ml; 6.3 pg/ml; empleando el diluyente de ensayo como control negativo. La dilución de la muestra es de 1:200. Se aspiran las placas y se lavan con 250 µ?/cavidad, 4 veces. Se añaden 100 µ? de conjugado a cada cavidad. Se prepara el conjugado con anticuerpo de detección y reactivo enzimático diluido 1:250 en el diluyente de ensayo. Se aspiran las placas y se lavan con 250 µ?/cavidad, G veces. Se añaden 100 µ? de sustrato a cada cavidad y se incuban durante 12 minutos. Después de la incubación se interrumpe la reacción con 50 µ?/cavidad de H2S04 1M. Se realiza la lectura a 450 nm durante 30 min con corrección de ? a 570 nm. Los resultados se recogen en la tabla 3 (valores IC50 medidos en relación a una inhibición máxima del 80%) .

Tabla 3 Ejemplo 7 Ensayo de liberación de citocina de sinoviocito, inhibición de producción de hIL-6 y hIL-8 inducida por IL-17A Los fibroblastos primarios humanos, por ejemplo las células dé sinoviocitos (HFLS) producen hIL-6 y hIL-8 como respuesta a la estimulación con IL-17A. Se realiza el ensayo para medir la inhibición de esta producción de la hIL-6 y de la hIL-8 en las células HFLS estimulada por la IL-17A después de la pre- incubación de las células con anticuerpos anti-IL- 17 antes de la estimulación.

Se siembran las células HFLS con una densidad de 4xl05 células/ml en un volumen de 0.5 mi en una placa de 48 cavidades y se incuban a 37°C y un 5% de C02 durante una noche para que se adhieran. Después de incubar durante una noche se reemplaza el medio por 400 µ? de medio fresco y se tratan las células con anticuerpos anti-IL-17 durante 30 minutos a lo largo de un intervalo de concentraciones de anticuerpo (10000, 3000, 1000, 300, 100, 30, 10, 3, 0 ng/ml) . Cada serie de diluciones de anticuerpo se efectúa con medio, empleando 50 µ?/cavidad (concentrado x 10) . Pasados 30 min se estimulan las células con 100 ng/ml de IL-17A (50 µ? de 1000 ng/ml de concentración xlO) y se incuban a 37°C y un 5% de C02 durante una noche (18 h) . Después del período de incubación se transfieren los líquidos sobrenadantes a tubos frescos y se analizan inmediatamente o bien se almacenan a -80°C hasta el momento del análisis ELISA. Para los análisis ELISA de hIL-6 y hIL-8 se añaden a cada cavidad 100 µ? de anticuerpo de captura diluido y se incuban a 4°C durante una noche. Se realizan las diluciones con - regulador de pH de recubrimiento. Se aspiran las placas, se lavan con 200 µ?/cavidad, veces, se bloquean con 200 µ?/cavidad de diluyente de ensayo y se incuban a temperatura ambiente durante 1 h. Se aspiran las placas y se lavan con 200 µ?/cavidad, 3 veces. Se añaden 100 µ? de estándar y de muestras y se incuban a temperatura ambiente durante 2 h siguiendo las instrucciones del fabricante. Se aspiran las placas y se lavan con 250 µ?/cavidad, por lo menos 3 veces. Se añaden a cada cavidad 100 µ? de conjugado. Se prepara el conjugado con anticuerpo de detección y reactivo enzimático diluido 1:250 en diluyente de ensayo. Se aspiran las placas y se lavan con 250 µ?/cavidad, por lo menos 3 veces. Se añaden a cada cavidad 100 µ? de sustrato y se incuban hasta que se forma un color suficiente para la lectura. Después de la incubación se interrumpe la reacción con 50 µ?/cavidad de 1M H2S04 y se lee en un lector de placas en una longitud de onda de 450 nm durante 30 min. Los resultados se recogen en la tabla 4.

Tabla 4 Ejemplo 8 Reactividad cruzada con IL-17A de cinomolgo (ensayo de unión) El ensayo de unión se realiza de acuerdo al ejemplo 2. Los resultados se muestran en la tabla 5.

Tabla 5 Anticuerpo unión relativa a la IL- unión relativa a la IL-17A 17A humana de cinomolgo 3C1 1 n.d. 106 1 0.37 106 (IgG4) 1 0.87 Anticuerpo unión relativa a la IL- unión relativa a la IL-17A 17A humana de cinomolgo 106 (IgGl-LALA) 1 1.0 .NVP-AIN-497 1 0.6 Ejemplo 9 Ensayo de liberación de citocina en mono cinomolgo {Maccaca fasicularis) , inhibición de la producción de IL-6 y IL-8 inducida por la IL-17A Las células de fibroblastos dermales de cinomolgo (CDF) producen la IL-6 y la IL-8 de cinomolgo como respuesta a la estimulación de la IL-17A humana o de cinomolgo. Se efectúa el ensayo para medir la inhibición de esta producción de IL-6 y de IL-8 estimulada por la IL-17A de cinomolgo en las células CDF después de la pre-incubación de las células con anticuerpos anti-IL-17 que surgen contra la IL-17 humana antes de la estimulación.

Se siembran las células CDF con una densidad de 2xl05 células/ml en un volumen de 0.5 mi en una placa de 48 cavidades y se incuban a 37°C y un 5% de C02 durante una noche para que se adhieran. Después de incubar durante una noche se reemplaza el medio por 400 µ? de medio fresco y se tratan las células con anticuerpos anti-IL-17 durante 30 minutos a lo largo del intervalo de concentraciones de anticuerpo (10000, 3000, 1000, 300, 100, 30, 10, 3, 0 ng/ml) . Cada serie de diluciones de anticuerpo se efectúa con medio, empleando 50 µ?/cavidad (concentrado x 10) . Pasados 30 min se estimulan las células con 100 ng/ml de IL-17A (50 µ? de 1000 ng/ml de concentración x 10) y se incuban a 37°C y un 5% de C02 durante una noche (18 h) . Después del período de incubación, se transfieren los líquidos sobrenadantes a tubos fresco y se analizan inmediatamente o se almacenan a -80°C hasta el momento del análisis ELISA. Se constata en el análisis ELISA que la hIL-6 y la hIL-8 tienen una reacción cruzada con sus correspondientes citocinas de cinomolgo y se utilizan para cuantificar los niveles de citocina. Para el ensayo ELISA se añaden a cada cavidad 100 µ? de anticuerpo de captura diluido y se incuban a 4°C durante una noche. Se realizan las diluciones con regulador de pH de recubrimiento. Se aspiran las placas, se lavan con 200 µ?/cavidad, 3 veces, se bloquean con 200 µ?/cavidad de diluyente de ensayo y se incuban a temperatura ambiente durante 1 h. Se aspiran las placas y se lavan con 200 µ?/cavidad, 3 veces. Se añaden 100 µ? de estándar y de muestras y se incuban a temperatura ambiente durante 2 h de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se aspiran las placas y se lavan con 250 µ?/cavidad, por lo menos 3 veces. Se añaden 100 µ? de conjugado a cada cavidad. Se prepara el conjugado con el anticuerpo de detección y el reactivo enzimático diluido a razón de 1:250 en diluyente de ensayo. Se aspiran las placas y se lavan con 250 µ?/cavidad, por lo menos 3 veces. Se añaden 100 µ? de sustrato a cada cavidad y se incuban hasta que generan un color suficiente para efectuar una lectura. Después de la incubación se interrumpe la reacción con 50 µ?/cavidad de 1M H2S04 y se lee con un lector de placas en una longitud de onda de 450 nm durante 30 min. Los resultados se recogen en la tabla 6.

Tabla 6 Ejemplo 10 Ensayo ADCC basado en europio Se aislan las células PBL por centrifugación de gradiente de tipo Ficoll Paque Plus: se diluye una muestra de sangre heparinizada en proporción 1:1 con PBS . Se depositan 8 mi de la sangre diluida sobre Ficoll y se centrifuga durante 30 min a 800 g. Se recogen las células (PBL), se lavan con medio RPMI 1640/10% de FCS y se suspenden de nuevo en un medio de cultivo celular. Se diluyen las células hasta 2.5xl06 células/ml (esto se traduce en una proporción efector/obj etico de 25:1, ya que se han empleado 5xl03 células objetivo por cavidad) .

Se marcan las células objetivo con BADTA (2 , 2 ' : 6 ' , 2 ' ' -terpiridina-6 , 6 ' ' -dicarboxilato de acetoximetilo) : se recogen las células añadiendo Accutase™ (Milliporé) , se lavan una vez y se diluyen hasta lxlO6 células/ml. Se añaden 2.5 µ? de BADTA/lxlO6 células y se incuban a 37°C/un 5% de C02 durante 35 min. Después del período de marcado se diluyen las células con 10 mi de medio de cultivó, se centrifugan a 200 g durante 10 min y se aspira el líquido sobrenadante. Se repite este paso 3x con medio de cultivo/2 m probenecida y se diluye la muestra hasta 1x10s células/mi, se centrifuga a 300 g durante 5 min, se elimina el líquido sobrenadante y se miden con pipeta 50 µ? a las cavidades elegidos para el control de base.

Base : se diluye una parte alícuota de 50 µ? con 100 µ? de medio. Lisis espontánea: 50 µ? de la suspensión de células objetivo marcadas,- se les añaden 100 µ? de medio de cultivo y se incuban a 37°C durante 2 h, igual que el resto de las muestras. Lisis máxima: 50 µ?/cavidad de la suspensión ® de células objetivo marcadas; se les añaden 100 µ? de Tritón X-100 (0.5% en PBS) y se incuban a 37°C durante 2 h. Control de lisis sin anticuerpos: 50 µ?/cavidad de la suspensión de células objetivo marcadas; se les añaden 50 µ? de medio de cultivo; se les añaden 50 µ? de células efectoras, a 37°C durante 2 h. Control de lisis sin células efectoras: 50 µ?/cavidad de la suspensión de células objetivo marcadas; se les añaden 50 µ? de medio de cultivo y 50 µ? de solución de anticuerpo de la concentración más elevada que se emplee y se incuban a 37 °C durante 2 h.

Al término del período de incubación se centrifuga la placa de 96 cavidades a 100 rpm. Se transfieren 20 µ? de cada líquido sobrenadante a una placa de tipo OptiPlate™ HTRF-96 (Packard) , se les añaden 200 mi de solución de europio y' se incuban en un agitador durante 15 minutos. Se mide la fluorescencia en forma de fluorescencia resuelta en el tiempo y se calculan la liberación espontánea y la liberación específica de acuerdo a la fórmula siguiente: Lisis específica (cuentas) - lisis espontánea (cuentas) x 100 Liberación específica en % = Lisis máxima (cuentas) -lisis espontánea (cuentas) No se mide una liberación específica (ADCC) significativa después de la adición del anticuerpo 106.

Ejemplo 11 Ensayo CDC Se recogen las células añadiendo tripsina, se lavan, se diluyen hasta lxlO5 células/ml y se añaden 100 µ?/cavidad a una placa de microvaloración de 96 cavidades de fondo plano. Se añade el anticuerpo (o un complejo de anticuerpo- ligando) en una concentración 6 veces mayor que la concentración final, en un volumen de 25 µ? de medio. Después de 30 min de incubación se añaden 25 µ? de complemento de conejo bebé recién disuelto (Cedarlane CL3441, 1 mi liófilizado, recién diluido en 4 mi de agua bidestilada) hasta una concentración final de complemento de 1:24. Después de un período de incubación de 20 h se extraen 50 µ? de líquido sobrenadante y se añaden 100 µ? de reactivo Cell ® Titer Glo (Promega Corp.) a los 100 µ? restantes de líquido sobrenadante. Se agita la placa en un agitador orbital durante 2 min, se transfieren 100 µ?/cavidad a una placa negra de microvaloración por luminiscencia (Costar) y se mide la luminiscencia.

Controles : control de medio (células objetivo + 50 µ? de medio); lisis máxima (células objetivo + 50 µ? de 0.5% de Tritón X-100 ) , control de complemento (células objetivo + 25 µ? de medio + 25 µ? de complemento) .

Resultados : no se detecta citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) con el anticuerpo 106 anti-IL17.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (18)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes J reivindicaciones:
1. ¦I . - Anticuerpo que se une a la IL-17 humana, caracterizado porque el dominio variable de cadena pesada contiene una región CDR3 de la SEC ID NO: 1, una región CDR2 de la SEC ID NO : 2 ó 9 y una región CDR1 de la SEC ID NO: 3 y porque el dominio variable de cadena ligera contiene una región CDR3 de la SEC ID NO: 4, una región CDR2 de la SEC ID NO: 5 y una región CDR1 de la SEC ID NO: 6.
2. 2. - Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio variable de cadena pesada contiene la SEC ID NO: 7 ó 10.
3. 3. - Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el dominio variable de cadena pesada contiene la SEC ID NO: 7 ó 10 y el dominio variable de cadena ligera contiene la SEC ID NO : 8.
4. 4.- Anticuerpo que se une a la IL-17 humana, caracterizado porque puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridomas DSM ACC2941.
5. 5.- Anticuerpo que se une a la IL-17 humana, caracterizado porque es un anticuerpo quimérico, humanizado o es una variante del anticuerpo 3C1 desprovisto del epítopo de célula T (DSM ACC2941) .
6. 6. - Anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones de 1 a 5, caracterizado porque es del isotipo de la IgGl humana modificado en la región bisagra en la posición de aminoácidos 216-240, y/o en la segunda región interdominios en la posición de aminoácidos 327-331 entre CH2 Y CH3.
7. 7. - Anticuerpo que se une a la IL-17 humana, caracterizado porque se une al mismo epítopo de la IL-17 al que se une el anticuerpo monoclonal 3C1 (DSM ACC2941) , por ser del isotipo de la IgGl humana modificado en la región bisagra en la posición de aminoácidos 216-240, y/o en la segunda ; región interdominios en la posición de aminoácidos 327-331 entre CH2 y CH3.
8. 8. - Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, caracterizado porque contiene las mutaciones L234A (alanina en lugar de leucina en la posición de aminoácidos 234) y L235A.
9. 9. - Composición farmacéutica caracterizada porque contiene un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 8.
10. 10. - Composición farmacéutica, caracterizada porque contiene un anticuerpo que se une al mismo epítopo de la IL-17 al que se une el anticuerpo monoclonal 3C1 (DSM ACC2941) .
11. 11.- Uso de un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones de 1 a 8 el cual es para la fabricación de una composición farmacéutica.
12. 12. - Uso de un anticuerpo que se une al mismo epítopo de la IL-17 al que se une el anticuerpo monoclonal 3C1 (DSM ACC2941) , para la fabricación de una composición farmacéutica.
13. 13. - Uso de un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones de 1 a 8 para el tratamiento de la esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad de Crohn, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , asma o rechazo de trasplante.
14. 14. - Uso de un anticuerpo que se une al mismo epítopo de la IL-17 al que se une el anticuerpo monoclonal 3C1 (DSM ACC2941) para el tratamiento de la esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad de Crohn, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , asma o rechazo de trasplante.
15. 15. - Acido nucleico que codifica una cadena pesada de un anticuerpo que se une a la IL-17, caracterizado porque el anticuerpo contiene una región CDR3 de cadena pesada de la SEC ID NO: 1, una región CDR2 de cadena pesada de la SEC ID NO: 2 ó 9, una región CDRl de cadena pesada de la SEC ID NO: 3, una región CDR3 de cadena ligera de la SEC ID NO: 4, una región CDR2 de cadena ligera de la SEC ID NO: 5 y una región CDRl de cadena ligera de la SEC ID NO: 6.
16. 16. - Vector de expresión caracterizado porque contiene un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 15 para la expresión de un anticuerpo que se une a la IL-17 en una célula hospedera procariota o eucariota .
17. 17. - Método para la producción de un anticuerpo recombinante que se une a la IL-17, caracterizado porque expresa un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 15 en una célula hospedera procariota o eucariota y porque recupera el anticuerpo de la célula o del líquido sobrenadante del cultivo celular.
18. 18. - Línea celular de hibridomas caracterizada porque es DSM ACC2941.