TWI393570B - 抗人類ｉｌ１７之抗體及其用途 - Google Patents

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Description

抗人類IL17之抗體及其用途
本發明係關於抗人類IL17A之抗體(IL17抗體)、用以製造該等抗體之方法、含有該等抗體之藥物組合物，及其用途。
人類IL-17A(CTLA-8、Swiss Prot Q16552、又名為IL-17)是種促炎細胞激素，該因子係由與MS之發病有關的記憶T細胞(稱為Th17)的子集細胞產生的。IL-17A在誘導其他炎症性細胞激素、趨化激素與黏附分子會起作用。以IL-17A中和抗體治療動物會降低自身免疫性腦脊髓炎的發病率與嚴重性(Komiyama，Y. et al.，J. Immunol. 177(2006) 566-573)。IL-17A在MS患者的腦脊髓液中會過度表現(Hellings，P.W. et al.，Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 28(2003) 42-50；Matusevicius，D. et al.,Multiple Sclerosis 5(1999) 101-104；WO 2005/051422)。此外，IL-17A中和抗體會降低小鼠RA模型中經以膠原所誘發的關節炎之發病率與嚴重性，且高含量的IL-17會在RA患者之發炎關節的關節液中被檢測到(Ziolkowska，M. et al.,J. Immunol. 164(2000) 2832-2838；Kotake，S. et al.,J. Clin. Invest. 103(1999) 1345-1352；Hellings，P.W. et al.,Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 28(2003) 42-50)。
WO 96/17939、US 5,716,623；WO 95/18826；WO 97/15320；WO 99/35276與WO 00/69436、WO 95/18826、US 6,274,711，US 6,274,711，WO 97/15320、US 6,063,372、WO 2006/013107與WO200802115係涉及IL-17A與抗IL-17A之抗體。
本發明包含結合至IL-17之抗體，其特徵在於重鏈可變域包含SEQ ID NO:1之CDR3區、SEQ ID NO:2或9之CDR2區與SEQ ID NO:3之CDR1區，及輕鏈可變域包含SEQ ID NO:4之CDR3區、SEQ ID NO:5之CDR2區與SEQ ID NO:6之CDR1區。較佳地，該抗體之特徵為重鏈可變域包含SEQ ID NO:7或10。較佳地，該抗體之特徵為重鏈可變域包含SEQ ID NO:7或10且輕鏈可變域包含SEQ ID NO:8。較佳地，該抗體結合至IL-17，且其特徵為上述胺基酸序列與胺基酸序列片段屬於介於CH 1與CH 2之間的胺基酸位置216-240(較佳胺基酸位置220-240)之鉸鏈區及/或介於CH 2與CH 3之間的胺基酸位置327-331之第二域間區的經修改人類IgG1同型抗體。較佳地，該抗體包含突變L234A(丙胺酸替代在胺基酸位置234之白胺酸)與L235A。較佳之重鏈恒定區包括示於SEQ ID NO:11之突變L234A與L235A。
本發明另一具體例係嵌合型的、經人化的或T細胞抗原決定子經移除之抗體3C1之抗體變種。該抗體係以1nM或更低之IC50 值特異性結合至IL17。較佳的經人化3C1變種為Mab 106與Mab 107。
本發明進一步係關於一種結合至IL-17之抗體，且特徵為結合至與單株抗體3C1所結合之相同的IL-17抗原決定子。抗體係以至少10-8 M-1 至10-12 M-1 之親和力結合至IL-17，是種在CH 1與CH 2之間的胺基酸位置216-240(較佳胺基酸位置220-240)之鉸鏈區及/或在CH 2與CH 3之間的胺基酸位置327-331之第二域間區經修改的人類IgG1同型抗體。較佳地，該抗體是包含突變L234A(丙胺酸替代於胺基酸位置234之白胺酸)與L235A之人類IgG1同型抗體。
較佳地，該抗體係經人化或人類抗體。較佳地，本發明抗體使用獼猴皮膚纖維細胞，以1.5nM或更低之IC50 值，於細胞因子釋放檢驗中可抑制濃度為100奈克/毫升之獼猴IL-17A所誘導之IL-6與IL-8的產生。
本發明另一具體例係包含根據本發明抗體的醫藥組合物。較佳地，該醫藥組合物包含特徵為結合至與單株抗體3C1所結合之相同IL-17抗原決定子的抗體。較佳地，該醫藥組合物抗體係以至少10-8 M-1 至10-12 M-1 之親和力結合至IL-17，並屬於在CH 1與CH 2之間的胺基酸位置216-240(較佳胺基酸位置220-240)的鉸鏈區及/或在CH 2與CH 3之間的胺基酸位置327-331的第二域間區之經修改人類IgG1同型抗體。較佳地，該抗體屬於包含突變L234A(丙胺酸替代胺基酸位置234之白胺酸)與L235A的人類IgG1同型抗體。
本發明另一具體例為根據本發明抗體於製造醫藥組合物上之用途。較佳地該醫藥組合物包含特徵為結合至單株抗體3C1所結合之相同IL-17抗原決定子的抗體。較佳地，該醫藥組合物之抗體以至少10-8 M-1 至10-12 M-1 之親和力結合至IL-17，並屬於經由在CH 1與CH 2之間的胺基酸位置216-240(較佳胺基酸位置220-240)的鉸鏈區及/或在CH 2與CH 3之間的胺基酸位置327-331的第二域間區經修改之人類IgG1同型抗體。較佳地，該抗體屬於包含突變L234A(丙胺酸替代於胺基酸位置234之白胺酸)與L235A之人類IgG1同型抗體。
本發明另一具體例為根據本發明抗體於治療多發性硬化症、類風濕性關節炎、牛皮癬、克隆氏(Crohn's)病、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、哮喘、與移植排斥反應上之用途。本發明另一具體例為製造包含根據本發明抗體的醫藥組合物之方法。較佳地，該醫藥組合物包含特徵為結合至單株抗體3C1所結合之相同IL-17抗原決定子的抗體。較佳地，該醫藥組合物之抗體以至少10-8 M-1 至10-12 M-1 之親和力結合至IL-17，並屬於經由在CH 1與CH 2之間的胺基酸位置216-240(較佳胺基酸位置220-240)的鉸鏈區及/或在CH 2與CH 3之間的胺基酸位置327-331的第二域間區經修改的人類IgG1同型抗體。較佳地，該抗體屬於包含突變L234A(丙胺酸替代於胺基酸位置234之白胺酸)與L235A之人類IgG1同型抗體。
本發明另一具體例為編碼結合至IL-17之抗體的重鏈之核酸，該抗體特徵為包含SEQ ID NO:1之重鏈CDR3區及較佳係包含IgG1重鏈恒定域之突變L234A與L235A。較佳地，該抗體額外包含SEQ ID NO:2或9之重鏈CDR2區與SEQ ID NO:3之CDR1區。本發明另一具體例為編碼結合至IL-17之抗體的輕鏈之核酸，該抗體特徵為包含根據本發明之輕鏈CDR3區及較佳係包含IgG1重鏈恒定域之L234A與L235A。較佳地，該抗體額外包含SEQ ID NO:2或9之重鏈CDR2區與SEQ ID NO:3之CDR1區。本發明另一具體例為編碼特徵為包含SEQ ID NO:7或10之重鏈可變域與SEQ ID NO:8之輕鏈可變域與較佳係包含重鏈IgG1恒定域之突變L234A與L235A之根據本發明抗體的核酸。
根據本發明抗體之特徵為恒定鏈來源於人類。該等恒定鏈係相關技藝習知且例如為Kabat所論述(見於，例如Johnson，G. and Wu,T.T.，Nucleic Acids Res. 28(2000) 214-218)。例如，適用之人類重鏈恒定區包含具有突變L234A與L235A之SEQ ID NO:11的胺基酸序列。例如，適用之人類輕鏈恒定區包含SEQ ID NO:12之κ-輕鏈恒定區之胺基酸序列。亦較佳為該抗體係源自小鼠及包含根據Kabat文獻之小鼠抗體的抗體可變序列片段(見於，例如Johnson，G. and Wu，T.T.，Nucleic Acids Res. 28(2000) 214-218)。
根據本發明抗體特別之特徵為可抑制CCD25-SK細胞釋放白細胞介素-8(IL-8)。根據本發明抗體以0.5nM(16ng/ml)或更低之IC50 值特異性地中和經IL-17調節之細胞活化作用。根據本發明抗體以1nM或更低之IC50 值特異性結合IL-17。
本發明抗體較佳屬於人類IgG1同型抗體。較佳之γ1重鏈恒定區示於SEQ ID NO:11與沒有突變L234A與L235A之SEQ ID NO:11中。
本發明抗體較佳之特徵為其不會結合至人類補體因子C1q，並因此避免CDC效應子作用。
本發明抗體較佳係屬於經由在CH 1與CH 2之間的胺基酸位置216-240(較佳胺基酸位置220-240)的鉸鏈區及/或在CH 2與CH 3之間的胺基酸位置327-331的第二域間區經修改之人類IgG1同型抗體。本發明抗體較佳之特徵為其屬於人類IgG1同型抗體，且含有至少一個於L234(於胺基酸位置234之白胺酸)、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、與/或P329(根據EU索引編號)之突變。較佳地，該抗體屬於包含突變L234A(丙胺酸替代於胺基酸位置234之白胺酸)與L235A之人類IgG1同型抗體。
本發明進一步提供能在原核或真核宿主細胞中表現含有本發明核酸之核酸的表現載體，及含有用於重組生產此抗體之彼等載體的宿主細胞。本發明進一步包括包含本發明載體的原核或真核宿主細胞。本發明進一步包含用於製造重組人類或經人化之本發明抗體之方法，其特徵為在原核或真核宿主細胞中表現本發明核酸並回收該細胞或細胞培養上清液中之該抗體。本發明進一步包含藉由此重組方法獲得之抗體。
本發明抗體顯示對有IL-17靶向治療需求的患者具有益處。本發明抗體具有為身受免疫性疾病、尤其遭受多發性硬化症、類風濕性關節炎、牛皮癬、克隆氏(Crohn's)病、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、哮喘、或移植排斥反應之苦的患者帶來益處之新穎且具創造性之特點。本發明抗體不會導致接受治療之患者對金黃色葡萄球菌與腸道細菌之易感性。本發明進一步提供用於治療遭受多發性硬化症、類風濕性關節炎、牛皮癬、克隆氏(Crohn's)病、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、哮喘、或移植排斥反應之患者及對確診具有此疾病(並因此需求此療法)之患者投與結合至本發明之IL-17之抗體的有效劑量的方法。該抗體較佳以醫藥組合物投與。本發明另一具體例為用於治療遭受多發性硬化症、類風濕性關節炎、牛皮癬、克隆氏(Crohn's)病、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、哮喘、或移植排斥反應患者的方法，其特徵為對患者投與本發明抗體。本發明進一步包含用於治療遭受多發性硬化症、類風濕性關節炎、牛皮癬、克隆氏(Crohn's)病、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、哮喘、或移植排斥反應患者及製造本發明醫藥組合物的抗體的用途。此外，本發明還包含用於製造本發明醫藥組合物之方法。
本發明進一步包括含有本發明抗體之醫藥組合物，視情況併與可用於為醫藥目的調配抗體的載劑與/或輔助劑。本發明進一步提供包含於醫藥可接受載體中的本發明抗體的醫藥組合物。於一個具體例中，該醫藥組合物可含括於製造物件或套組內。
術語「抗體」包括包含但不僅限於整個抗體與抗體片段之抗體構造物的不同形式。本發明抗體較佳為經人化、抗體、嵌合型抗體、或進一步經由基因工程並保留本發明之特徵特性的抗體。「抗體片段」包含完整長度之抗體(較佳其可變域)之一部分，或包含至少其抗原之結合位點。抗體片段之實例包括微型雙功能抗體、單鏈抗體分子、與由抗體片段形成之多特異性抗體。scFv抗體，例如，已論述於Huston，J.S.，Methods in Enzymol. 203(1991) 46-52。此外，抗體片段包含單鏈多胜肽類，其具有VH 域，即能與VL 域組合一起、或與IL-17結合之VL 域，即能與VH 域組合一起結合至功能抗原結合位點之特徵，並藉此提供本發明抗體的特性。本文所使用之術語「單株抗體」或「單株抗體組合物」係指單一胺基酸組合物之抗體分子之製劑。術語「經人化之抗體」係指抗體中之框架與/或「互補決定區」(CDR)業已藉由修改以包含相對於親本免疫球蛋白之不同種屬的免疫球蛋白之CDR。於一較佳具體例中，將小鼠CDR嫁接入人類抗體之框架區內以製備「經人化之抗體」。見，例如，Riechmann，L.，et al.，Nature 332(1988) 323-327，及Neuberger，M.S.，et al.，Nature 314(1985) 268-270。
本文所使用之術語「結合至IL-17」意為在ELISA結合試驗中將抗體結合至人類IL-17。若抗體在抗體濃度為1μg/ml下會導致7:1或更高之S/N(信號/噪音)比率，結合便將形成。本發明抗體特異性地以結合至人類IL-17A且其IC50 值為1nM(0.15μg/ml)或更低。抗體不會特異性結合至IL-17B、C、D、E、與F(S/N(信號/噪音)比率低於7:1)並因此會特異性結合至IL-17A。使用經固定化之IL-17或變種藉由ELISA方法進行IL-17A及變種之結合。
術語「抗原決定子」表示決定能特異性結合至抗體之蛋白決定子。抗原決定子通常係由如胺基酸分子或糖側鏈之化學活性表面組群所組成，且抗原決定子一般具有特異三維結構特徵以及特異電荷特性。結構性與非結構性抗原決定子的區別在於變性溶劑存在下，前者而非後者之結合會喪失。較佳地，本發明抗體係特異性結合至原生而非變性之IL-17。本發明IL-17抗體係結合至抗體Mab317所結合之IL-17上的相同抗原決定子。本發明IL-17抗體之抗原決定子結合特性可藉由利用熟識於現有技術之技術來確定。藉由活體外交叉阻礙結合分析法檢測IL-17抗體可確定待試驗抗體對阻礙抗體Mab317結合至IL-17之能力。若抗體Mab317替代至少15%之待試驗抗體，則該抗原決定子接近相似。
本文所使用之「可變域」(輕鏈之可變域(VL )、重鏈之可變域(VH ))表示與將抗體結合至抗原直接相關之輕鏈與重鏈對中之任一條。輕鏈與重鏈之可變域具有相同之結構且任一域包含序列得到廣泛保留且由三個「高變異區」(或互補決定區，CDR)連結之四個框架(FR)區。框架區採用β-片式結構及CDR可形成連結β-片式結構的環。藉由框架區將於任一鏈中之CDR置於其等三維結構內並與來自另一鏈之CDR一起形成抗原結合位點。抗體之重鏈與輕鏈CDR3區於本發明抗體的結合特異性/親和力中起著特別重要的作用，並因此提供本發明進一步目的。
本文所使用之術語「抗體之抗原結合部分」係關於負責抗原結構之抗體的胺基酸殘基。抗體之抗原結合位點包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基。「框架」或「FR」區為除本文所定義之高可變區殘基之外的彼等可變域區。因此，抗體之輕鏈與重鏈可變域包含自N-末端至C-末端之域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、與FR4。特別地，重鏈之CDR3係對抗原結合貢獻最大且決定抗體特性之區。CDR與FR區係根據Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th ed.，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)與/或來自「高可變環」之彼等殘基的標準定義來確定。
本文所使用之術語「胺基酸」表示包含丙胺酸(三字母編號ala、一字母編號A)、精胺酸(arg、R)、天冬醯胺(asn、N)、天門冬胺酸(asp、D)、半胱胺酸(cys、C)、穀胺醯胺(gln、Q)、穀胺酸(glu、E)、甘胺酸(gly、G)、組胺酸(his、H)、異白胺酸(ile、I)、白胺酸(leu、L)、離胺酸(lys、K)、甲硫胺酸(met、M)、苯丙胺酸(phe、F)、脯胺酸(pro、P)、絲胺酸(ser、S)、蘇胺酸(thr、T)、色胺酸(trp、W)、酪胺酸(tyr、Y)、與纈胺酸(val、V)之天然性羧基α-胺基酸之群組。
本文所使用之術語「核酸」或「核酸分子」旨在包括DNA分子或RNA分子。核酸分子可為單鏈或雙鏈，但較佳為雙鏈DNA。當將其與另外核酸被放置在具有功能性的關係時，核酸就是「操作性的連結」。例如，如果係作為參與多胜肽分泌之前軀體蛋白表現時，則將用於導肽或分泌引導子之DNA可操作性的連結於用於多胜肽之DNA；如果係要影響該序列之轉錄作用，則將啟動子或增強子係可操作性的連結於編碼序列；或如果其位置係要幫助轉譯作用，則將核糖體結合位點可操作性的連結於編碼序列。通常上，「可操作性的連結」意為所連結之DNA序列呈線性對應，且在分泌引導子的情況下，係相鄰及於讀碼框內。但是，增強子不必然會相鄰。藉由在附近之酶切位點之連結反應可完成連結。若此等位點不存在，則依照習知做法使用合成寡核苷酸接受子或連結子。如本文所使用術語「細胞」、「細胞株」、與「細胞培養物」可交替使用，且所有此等命名包括子代。因此，術語「轉化細胞」與「經轉化細胞」包括主要從屬細胞與以此衍生出之培養物而不考慮轉移之次數。咸亦理解，由於刻意的或無意的突變作用，因此所有子代在DNA內容尚可能不會完全相同。當篩選經親本轉化細胞中具有相同功能或生物活性之變體子代包含在本發明內。
抗體之「Fc部分」與抗體對抗原之結合沒有直接關聯，但呈現各種效應子的功能。「抗體之Fc部分」係為熟練技術者所熟知之術語，且係基於抗體之木瓜蛋白酶裂解來定義。依據其等重鏈恒定區之胺基酸序列，將抗體或免疫球蛋白分為以下類型：IgA、IgD、IgE、IgG與IgM、及可將此等之數種進一步分成子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、與IgG4、IgA1、與IgA2。根據重鏈恒定區將免疫球蛋白之不同種類分別稱為α、δ、ε、γ、與μ。抗體之Fc部分與ADCC(抗體依賴性經細胞介導細胞毒性)和基於補體活化之CDC(補體依賴性細胞毒性)、C1q結合及Fc受體結合具有直接關聯性。補體活化作用(CDC)係因補體因子C1q結合至大多數IgG抗體子類之Fc部分而觸發啟動的。儘管抗體對補體系統之影響係基於某些特定條件，但結合至C1q係由Fc部分所界定之結合位點所觸發啟動的。此等結合位點已知於本技藝之說明中及描述於，例如，Boakle，R.J. et al.，Nature 282(1979) 742-743、Lukas，T.J. et al.,J. Immunol. 127(1981) 2555-2560、Brunhouse，R.與Cebra，J.J.，Mol. Immunol. 16(1979) 907-917、Burton，D.R. et al.，Nature 288(1980) 338-344、Thommesen，J.E. et al.，Mol. Immunol. 37(2000) 995-1004、Idusogie，E.E. et al.，J. Immunol.164(2000) 4178-4184、Hezareh,M. et aI.，J. Virology 75(2001) 12161-12168、Morgan，A. et al.，Immunology 86(1995) 319-324、EP 0307434。此等結合位點為，例如L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、與P329(依照Kabat之EU索引編號，見於以下)。子類IgG1、IgG2與IgG3之抗體通常會顯現出補體活化作用及C1q結合，然而IgG4則不會活化補體系統且不會結合C1q。
本發明抗體包含源自人類母本之Fc部分，該Fc部分為子類IgG1之人類抗體的Fc部分。以本發明抗體的Fc部分而言，較佳者，是沒有檢測出根據下文所界定之C1q結合。
本發明因此包含本發明抗體，其特徵為該抗體可結合IL-17，並含有源自人類母本之Fc部分及不會結合人類補體因子C1q，而因此避免CDC效應子起作用。
較佳地，本發明抗體係與人類IgG1或IgG2子類之Fcγ結合有關，並具有於L234、L235、及/或D265之突變，且/或含有PVA236突變。其較佳者為突變L234A、L235A、及/或PVA236(PVA236意為來自IgG4之IgG1或EFLG之胺基酸位置233至236的胺基酸序列ELLG(以一字母胺基酸編碼定義)由PVA置換)。本發明因此提供如本發明之抗體，其特徵為該抗體係人類子類IgG1之抗體，其含有於L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331與/或P329上之至少一個突變。於一具體例中抗體係人類抗體。於另一具體例中抗體係經人化抗體。於一具體例中本發明提供如本發明抗體，其含有衍生自人類母本之Fc部分，且其特徵為該抗體係人類子類IgG1之抗體，其含有於L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331上之至少一個突變及其中該抗體在BIA核試驗中以低於10-8 M之KD 值結合至IL-17。於另一具體例中KD 範圍為10-11 至10-9 M。
可依據Idusogie，E.E.，et al.，J. Immunol. 164(2000) 4178-4184檢測C1q結合。若在經不同濃度之抗體塗佈ELISA板的試驗中添加人類C1q，本發明之特徵係沒有C1q結合。藉由抗人類C1q之抗體，接著進行以過氧化酶受質ABTS(2,2'-次偶氮基-二-[3-乙苯噻唑啉磺酸鹽])偵測過氧化酶標記之共軛物來檢測C1q結合。若在10微克/毫升抗體濃度下，待測試抗體於405奈米所得光密度(OD)低於0.05，則表示沒有發現如本發明之C1q結合。
本發明抗體較佳特徵為恒定鏈係屬於人類母本。此等恒定鏈已熟知於本技藝之說明並描述於，例如，Kabat(見於，例如，Johnson，G.，與Wu，T.T.，Nucleic Acids Res. 28(2000) 214-218)。例如，有用之人類重鏈恒定區包含SEQ ID NO:23。例如，有用之人類輕鏈恒定區包含SEQ ID NO:12之κ-輕鏈恒定區之胺基酸序列。
本發明另一具體例為編碼本發明重鏈與輕鏈之核酸。
本發明包含用於治療需求此療法之患者的方法，其特徵為對患者投與醫療上有效量之本發明抗體。本發明包含本發明抗體於治療上之用途。本發明包含本發明抗體於製備用以預防及治療炎症性疾病與血栓性障礙之藥劑的用途。本發明包含本發明抗體於治療炎症性疾病、較佳於治療慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、多發性硬化症、與類風濕性關節炎上之用途。
本發明抗體包括，另外地，具有「保守性序列修飾」之抗體(變異抗體)、具有不影響或變更本發明抗體的上述特徵之核苷酸與胺基酸序列修飾之抗體。可藉由本技藝已知之標準技術引入修飾，如定向誘變與PCR-介導誘變。保留性胺基酸取代包括以具有相似側鏈之胺基酸殘基置換原胺基酸殘基等。具有相似側鏈之胺基酸殘基家族已為本技藝所確定。此等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如，天冬胺酸、谷胺酸)、具有不帶電的極性側鏈之胺基酸(例如，甘胺酸、天冬醯胺、谷胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、具有β-支化側鏈之胺基酸(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)與具有芳系側鏈之胺基酸(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，人類抗IL-17抗體中預料為非必需胺基酸殘基較佳係經來自相同側鏈家族之另一胺基酸殘基置換。本發明「變異」抗IL17抗體係指一分子，其在胺基酸序列上與「親本」抗IL-17抗體胺基酸序列具有不同處多達10(較佳約2至約5)，此外，還有在親本抗體之一或多處可變區之缺失與/或取代。如Riechmann，L.，et al.，Nature 332(1988) 323-327與Queen，C.，et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(1989) 10029-10033所描述可藉由基於分子模型上之誘變進行胺基酸取代。
本發明進一步具體例係用於產生不會結合Fcγ受體及/或C1q之抗IL-17抗體的方法，其特徵係將編碼結合至IL-17之人類IgG1型抗體之重鏈的核酸以一種方式修改，其中該經修飾抗體不會結合C1q及/或Fcγ受體，及將該經修飾核酸與編碼該抗體輕鏈之核酸插入至表現載體中、將該表現載體插入真核宿主細胞中，隨後表現該經編碼蛋白並從宿主細胞或上清液獲得經編碼蛋白。
關於序列之一致度或同源度於本文中係以胺基酸殘基在候選序列中之百分比來定義，其中該候選序列與親本序列一致，且若有需要，在調整序列及引入缺口後，以獲得最大百分比之序列一致度。於N-末端、C-末端、或內部之延伸、刪除、或對抗體序列之插入中之任一者均不應理解為對序列一致度或同源度之影響。變異體仍保留結合人類IL-17之能力且較佳具有優於親本抗體之特性。例如，變異體可於治療期間降低副作用。
「親本」抗體包含抗體3C1之CDR區並較佳係用於製備變異體。較佳地，親本抗體具有人類框架區及，若存在，具有人類抗體恒定區或人類抗體恒定域。例如，親本抗體可為經人化或人類抗體。
本發明抗體較佳係藉由重組方法製得。此等方法在本技藝之說明中廣泛已知及包含在在原核與真核細胞中表現蛋白，並隨後分離抗體多胜肽，及通常係純化至醫藥可接受之純淨度。就表現蛋白而言，藉由標準方法將編碼輕鏈與重鏈或其片段之核酸插入至表現載體中。表現係在適合之原核或真核宿主細胞中進行，如CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、酵母、或大腸桿菌細胞，並從細胞中(從上清液或在細胞溶解後)獲得抗體。重組製造抗體已於本技藝之說明中熟知並描述於，例如，Makrides，S.C.，Protein Expr. Purif. 17(1999) 183-202、Geisse,S.，et al.，Protein Expr. Purif. 8(1996) 271-282、Kaufman,R.J.，Mol. Biotechnol. 16(2000) 151-160、Werner，R.G.,Drug Res. 48(1998) 870-880之綜述性論文中。抗體可存在於全部細胞、細胞溶解液、或經部分純化、或實質上純化之形式中。藉由標準技術，包括柱層析法與其他於本技藝已知之方法進行純化以去除其他細胞成分或其他污染物，例如，其他細胞核酸或蛋白。見於Ausubel、F.、et al.、ed. Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing與Wiley Interscience，New York(1987)。於NS0細胞中之表現描述於，例如，Barnes，L.M.，et al.，Cytotechnology 32(2000) 109-123、Barnes，L.M.，et al.，Biotech. Bioeng. 73(2001) 261-270。暫時性表現描述於，例如，Durocher，Y.，et al.，Nucl. Acids. Res. 30(2002) E9。可變域之選殖體描述於Orlandi，R.，et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(1989) 3833-3837、Carter,P.，et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(1992) 4285-4289、Norderhaug，L.，et al.，J. Immunol. Methods 204(1997) 77-87。較佳暫時性表現系統(HEK293)描述於Schlaeger，E.-J. and Christensen,，K.，in Cytotechnology 30(1999) 71-83，與Schlaeger，E.-J.，in J. Immunol. Methods 194(1996) 191-199。單株抗體藉由習知免疫球蛋白純化方法(例如蛋白A-瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石層析法、凝膠電泳、透析、或親和層析法)可適當性地從培養基中分離出來。利用習知方法可輕易地分離並定序編碼單株抗體之DNA與RNA。融合瘤細胞可作為此DNA與RNA之來源。一經分離，便可將DNA插入至表現載體中，隨後將其轉染至宿主細胞(諸如不會另外產生免疫球蛋白之HEK293、CHO細胞、或骨髓瘤細胞)，以便於宿主細胞中獲得重組單株抗體之合成物。
人類IL-17抗體之胺基酸序列變異係藉由將合適核苷酸改變引入至編碼抗體之DNA中，或藉由多胜肽合成製備。此等修飾雖然可以進行，但僅限於十分有限之範圍(例如上述)。例如，該修飾不會改變上述抗體特徵(諸如IgG同型抗體與抗原決定子結合)，但可改良重組生產之產量、蛋白穩定性，或幫助純化過程。與保留抗IL-17抗體之正確結構無關的任何半胱胺酸殘基亦可經取代，通常係由絲胺酸取代，以便改善分子之氧化穩定性及防止異常交聯。相反地，可將半胱胺酸鍵添加至抗體，以便改善其穩定性(特別於抗體為抗體片段如Fv片段之處)。抗體之胺基酸變異的另一類型係改變抗體原有的糖基化型式。藉由「改變」係意指移除發現於抗體之一或多個碳水化合物基團及/或添加不存在於抗體之一或多個糖基化位點。抗體之糖基化作用典型上為N聯。N聯係關於碳水化合物基團對天冬醯胺殘基之連接。三胜肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸與天冬醯胺-X-蘇胺酸，其中X為除脯胺酸外之任何胺基酸，為用於碳水化合物基團對天冬醯胺側鏈之酶連接的識別序列。因此，此等三胜肽序列之任一者存在於多胜肽中將建立一潛在糖基化位點。藉由改變胺基酸序列以使其含有一或多個上述三胜肽序列(用於N聯糖基化位點)可方便性地實現將糖基化位點添加至抗體。
藉由本技藝已知之多種方法製備編碼抗IL-17抗體之胺基酸序列變異體之核酸分子。此等方法包括，但不僅限於，從天然來源(在自然發生胺基酸序列變異之情況下)之分離或藉由寡核苷酸介導(或定向)之誘變、PCR誘變、與對經人化抗IL-17抗體之預先製備之變異或非變異類型的誘變之製備。
抗體之共價修飾之另一類型包含以闡明於美國專利第4,640,835號、第4,496,689號、第4,301,144號、第4,670,417號、第4,791,192號、第4,179,337號之方式將抗體連接於不同之非蛋白聚合物上，例如，聚乙二醇、聚丙二醇、或聚羥烯烴。
本發明之重鏈與輕鏈可變域係與啟動子序列、轉譯起始序列、恒定區序列、3'非編碼區序列、聚腺苷酸化序列，及轉錄終止序列等組合，以便形成表現載體構築體。可將重鏈與輕鏈表現構築體組合至單一載體、共轉染、連續轉染、或分別轉染至宿主細胞中，並隨後將其融合以形成表現兩種鏈之單一宿主細胞。
於另一方面，本發明提供一種組合物，例如醫藥組合物，其含有本發明之一種單株抗體或一組單株抗體、或其抗原結合部分，並與醫藥可接受載劑一起調配。文中所使用之「醫藥可接受載劑」包括任一或所有之溶劑、分散介質、塗料、抗細菌與抗真菌劑、等滲與吸收/重吸收延遲劑、及生理上可共存之物質。較佳地，載劑係適於注射或輸注。本發明組合物可以本技藝已知之不同方法投與。為熟練技術者所識知的係投與之途徑與/或模式將因所要結果而有所不同。醫藥可接受載劑包括無菌水溶液或分散液及用於製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。此等介質與藥劑於醫藥活性物質之用途於本技藝已知。除水外，載劑可為，例如，等滲緩衝鹽溶液。不論經選擇之投與途徑為何，可以合適之水合形式使用本發明化合物，及/或藉由為本技藝技術者已知之方法將其調配成醫藥可接受劑量形式。於本發明醫藥組合物中的活性成分之實際投與量可不同，以獲得有效地實現對特殊患者之所欲治療反應的活性成分、組合物、與投與模式，而不致毒害患者之量(有效量)。選擇之投與量將依賴於各種藥物動力學因素，包括本發明使用之特殊組合物、其鹽或胺基化合物之活性、投與途徑、投與時間、所使用之特殊化合物的分泌物之比例、用於與所使用之特殊組合物組合之其他藥物、化合物與/或材料、接受治療之患者的年齡、性別、體重、病況、總體狀況與前病史、及於醫療技藝已知之類似因素。
本發明包含本發明抗體於治療遭受多發性硬化症、類風濕性關節炎(RA)、牛皮癬、克隆氏病、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、哮喘、與移植排斥反應之患者的用途。
本發明進一步具體例係抗IL-17抗體(較佳本發明抗體)於治療遭受類風濕性關節炎之患者的用途，該患者對以TNF抗劑、抗CD20抗體、CTLA4Ig或抗IL-6抗體之治療會適度反應或不會反應。本發明進一步具體例係抗IL-17抗體(較佳本發明抗體)於製造用於治療遭受類風濕性關節炎之患者的藥劑之用途，該患者對以TNF抗劑、抗CD20抗體、CTLA4Ig或抗IL-6抗體之治療會適度反應或不會反應。用於治療RA之TNF抗劑，例如，英夫利普單抗(IFX，Remicade)、依那西普(ETA，Enbrel)，與阿達木單抗(ADA，Humira)。較佳將抗IL-17抗體投與對以TNF抗劑、抗CD20抗體、CTLA4Ig或抗IL-6抗體之治療適度反應或不會反應之患者至少3個月，較佳至少6個月。
本發明進一步提供用於製造醫藥組合物之方法，其包含與醫藥可接受載劑一起之本發明抗體之有效量及本發明抗體對於此方法之用途。本發明進一步提供以有效量之本發明抗體於製造醫藥劑，較佳與醫藥可接受載劑一起，以治療遭受多發性硬化症、類風濕性關節炎(RA)、牛皮癬、克隆氏病、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、哮喘、與移植排斥反應之患者的用途。本發明亦提供以有效量之本發明抗體於製造醫藥劑，較佳與醫藥可接受載劑一起，以治療遭受多發性硬化症、類風濕性關節炎(RA)、牛皮癬、克隆氏病、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、哮喘、與移植排斥反應之患者的用途。
序列說明
SEQ ID NO:1　重鏈CDR3，Mab 106與Mab 107
SEQ ID NO:2　重鏈CDR2，Mab 106
SEQ ID NO:3　重鏈CDR1，Mab 106與Mab 107
SEQ ID NO:4　輕鏈CDR3，Mab 106與Mab 107
SEQ ID NO:5　輕鏈CDR2，Mab 106與Mab 107
SEQ ID NO:6　輕鏈CDR1，Mab 106與Mab 107
SEQ ID NO:7　重鏈可變域，Mab 106
SEQ ID NO:8　輕鏈可變域，Mab 106與Mab 107
SEQ ID NO:9　重鏈CDR2，Mab 107
SEQ ID NO:10　重鏈可變域，Mab 106
SEQ ID NO:11　γ1重鏈恒定區
SEQ ID NO:12　κ輕鏈恒定區
實例 實例1 接種說明
在20週內用來自Peprotech之250(1x)及100微克(3x)重組人類IL17(http://www.peprotech.com;Cat.Nr.:200-17 in 1% PBS with 1% Albumin)對5隻雌性Balb/c小鼠之每隻小鼠進行接種。
實例2 藉由ELISA測量對IL-17之結合
NUNCMaxisorp平板(96孔)經以於PBS中濃度為0.5微克/毫升的重組人類IL-17(Peprotech # 200-17,www.peprotech.com)填塗(100微升/孔)。將此等平板在37℃下於定軌搖床上搖動培養2小時。此後將塡塗溶液移除並添加100微升/孔之PBSTC(磷酸緩衝鹽液，0.05% Tween20，2%雞血清)。將此等平板於室溫下培養1小時。將阻斷液移除並取樣(空白組：PBSTC，取樣(於PBS中10μg/ml)：將本發明抗人類IL-17抗體3C1與Mab 106；eBioscience之Mab 16-7178-85(www.ebioscience.com)；R＆D Systems之MAB 317(www.rndsystems.com)、NVP-AIN-497(WO 2006013107)添加至平板(100微升/孔)。平板於室溫下搖動培養。將樣本移除，以200微升/孔之PBST(磷酸緩衝鹽液，0.05% Tween20)清洗平板三次並添加用於偵測小鼠抗體之第二抗體(山羊抗小鼠IgG，Fcγ,HRP共軛物；Chemicon AP127P,www.millipore.com)或用於偵測經人化抗體之山羊抗人類IgG，Fcγ，HRP共軛物(Chemicon AP113P)。第二抗體以1:10000稀釋於PBSTC及將平板於室溫下搖動培養1小時。移除第二抗體，以200微升/孔之PBST(磷酸緩衝鹽液，0.05% Tween20)清洗平板三次並添加100微升/孔之ABTS(Roche Diagnostics GmbH)。在與IL-17A之結合相關之405/492奈米(設定為100%)下測定光密度。以相同之試驗型式進行對其他人類IL-17子型(IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E與IL-17F)之結合。結果顯示於表1。
實例3 製備用於IgG1類之免疫球蛋白的表現質體
質體6454(以下稱作p6454)係用於在真核細胞內表現抗IL-17抗體的表現質體(具有經保留之外顯子-內含子結構的經基因組構成之表現框)。其包含以下功能單元：
-　複製起點(pUC起點)，其衍生自載體pUC18之，
-　β-內醯胺酶基因(Amp)，其賦予大腸桿菌胺芐西林抗藥性，
-　用於表現γ1-重鏈之表現框，其包含以下單元：
-　來自人類巨細胞病毒之主要立即早期啟動子與加強子(hCMV IE1啟動子)，
-　含有Kozak序列之合成5'UTR，
-　含有信號序列內含子之小鼠免疫球蛋白重鏈信號序列(L1_內含子_L2)，
-　用於重鏈可變區(VH)且於3'末端安排有剪切供位的cDNA，
-　小鼠免疫球蛋白μ-加強子區，
-　人類免疫球蛋白重鏈γ1-基因(IGHG1)，其包括外顯子CH1、樞紐、CH2與CH3、間插內含子及含有聚腺苷酸信號序列之3'UTR，
-　用於表現κ-輕鏈之表現框，其包含以下單元：
-　來自人類巨細胞病毒之主要立即早期啟動子與加強子(hCMV IE1啟動子)，
-　含有Kozak序列之合成5'UTR，
-　含有信號序列內含子之小鼠免疫球蛋白重鏈信號序列(L1_內含子_L2)，
-　用於輕鏈可變區(VL)且於3'末端安排有剪切供位的cDNA，
-　內含小鼠Ig-κ加強子區，
-　人類免疫球蛋白κ基因(IGK)，其包括IGKC外顯子與含有聚腺苷酸信號序列之IGK 3'UTR，
-　用於表現適合在真核細胞中選擇營養缺陷型之小鼠二氫葉酸還原酶(DHFR)的表現框，其包括
- SV40早期啟動子之縮短版與起始點，
-　用於小鼠DHFR之編碼序列
- SV40早期聚腺苷酸信號。
將p6454轉染至CHO-K1細胞，並經以甲胺蝶呤(MTX)挑選後分離出及篩查出穩定細胞株，以產生人類抗體(藉由針對人類IgG之ELESA分析)。
實例4 補體系統之活化作用的調查(C1q結合ELISA)
為研究本發明抗體之C1q結合，所使用的是ELISA方法。C1q係適應性免疫系統之部分，且當結合至免疫複合物，其會觸發數種酵素原體之連續活化作用。該等酵素會依序觸發C3分子之裂解，其可導致炎症反應的發生、對外來或異常顆粒之調理及細胞膜溶解。
MTP(Nunc牌)經以溶於PBS-緩衝液中之7個濃度的欲測試抗體(介於10微克/毫升與0.156微克/毫升之間)在4℃隔夜塡塗(100微升/孔)。在RT下於1小時內，以溶於PBS中的3% BPLA(羅氏)阻斷自由結合位點(200微升/孔)。該MTP以溶於3% BPLA(溶於PBS)之2微克/毫升的C1q(Quiddel)培養(100微克/毫升)。MTP在RT下以溶於PBS之0.1% Tween20清洗3次。在RT下於1小時內添加溶於3%BPLA中之0.25微克/毫升多株兔類抗C1q抗體(DAKO)、溶於PBS中之0.1%Tween20(100微克/孔)來偵測結合情況。在RT下於1小時內添加溶於PBS中並溶有3% Tween20之0.1微克/毫升之第二抗體羊抗兔IgG POD(Jackson Immuno Research)(100微升/孔)。在RT下於1小時內以溶於PBS之0.1% Tween20清洗MTP 3次後，將MTP以ABTS溶液(羅氏)培養，及參考490奈米波長測量在405奈米波長之吸收。測量未經抗體填塗但以相同偵測方法處理之孔內的背景信號。若於10微克/毫升之抗體濃度下，當待測試抗體在405奈米下之光密度(OD)低於0.05，則表示沒有發現C1q之結合。
實 例5 經由BIAcore交聯實驗定出抗原決定子區
所有測量皆係經由使用BIAcore 3000儀器於25℃下進行。系統與樣本緩衝液為HBS-EP(10mM HEPES、150mM NaCl、3.4mM EDTA、0.005%聚山梨醇酯20(體積比))。BIAcore CM5感應晶片經受預處理程序。順序地於30秒內注入0.1% SDS、50mM NaOH、10mM HCl與100mM H3 PO4 以覆蓋流動細胞FC1、FC2、FC3與FC4。依照生產商說明使用BIAcore 3000魔法4.1版進行胺偶聯步驟。
為進行具有嵌合或經人化之抗體的交聯實驗，在感應器表面進行EDC/NHS活化後將多株羊抗人IgG抗體(Jackson)固定於所有感應器流動細胞(FCs)上。於10微升/分鐘下使用溶於10mM NaAc pH 5.0之30微克/毫升多株羊抗人類IgG抗體7分鐘以固定抗體捕獲系統之10.000 RU。藉由以乙醇胺飽和來鈍化表面。以huIgG分析物於10微升/分鐘下在2分鐘內偱環5次處理人類捕獲系統傳感器並以10mM甘胺酸(Bayer) pH 1.7於30微升/分鐘下在3分鐘內使其再生。
於10微升/分鐘流動速率下將對FC1至FC4注入主要mAb 3分鐘。利用在10微升/分鐘下對FC1至FC4注入來自溶於HBS-EP緩衝液之50微克/毫升huIgG(Bayer)的混合物來封阻傳感器捕獲系統之自由結合能力。隨後，於10微升/分鐘下對FC1至FC4注入抗原rhuIL17-A 3分鐘來飽和主要抗體結合能力。在30微升/分鐘下對FC1至FC4進行第二次注射3分鐘後於30微升/分鐘下對流動細胞FC1、FC2、FC3與FC4分別注入第二抗體3分鐘。於30微升/分鐘下使用10mM甘胺酸pH 1.75 3分鐘使傳感器再生。
首先，為校正主要抗體自多株羊抗人類IgG捕獲系統的離解作用從所有感應譜中減去0nM分析物注射。藉由第二抗體與第一抗體之反饋信號得到一商。該商命名為莫爾比(MR)且表示抗原決定子區之可及性。
莫爾比值已列於一矩陣中。同源mAb組合物作為對照，以示此等封阻過程是否成功進行。藉由同源mAb組合物確定截止值。
將交聯實驗中之截止值設置為Mab106同源試驗格式(9%)。於MR=15%以上之莫爾比值與接近獨立抗原決定子有關。
來自抗原決定子映射之結果(見表2)表明Mab K106與其衍生物Mab107結合至與NVP-AIN-497所結合之不同抗原決定子區。進一步，Mab K106覆蓋不同於eBio64CAP17所結合之抗原決定子，且與Mab317相同之抗原決定子區。
藉由同源試驗組合物確定分析之截止值(106，9%)、(AIN-457，6%)、(eBio64CAP17，7%)、(Mab317，0%)。此處將截止值設為同源Mab106試驗值。
實例6 細 胞激素釋放試驗，對經IL-17A所誘導之hIL-8釋放的抑制
進行此試驗係用於監測將CCD-25SK細胞先經抗IL-17抗體預培養後，以IL-17A及TNF-α刺激後之hIL-8產生情形。CCD-25SK細胞具有IL-17受體，可溶性IL-17A會結合至此等IL-17受體上。對抗IL-17A的抗體會結合至IL-17A。此機制僅會在TNF-α存在下運作。經由IL-17A結合至IL-17受體，該等細胞會產生hIL-8，所產生的hIL-8可以ELISA檢測偵測讀取結果。經測量hIL-8顯示出於何等濃度下抗IL-17抗體抑制IL-17對CCD-25SK細胞刺激的訊息。
CCD-25SK細胞以2.5×104 細胞/孔之細胞密度植入於48-孔平板(體積為0.45毫升/孔)中，並於37℃與5%CO2 下培養24小時。隔夜培養後，該等細胞以終濃度為9000、3000、1000、333.3、111.1、37.03、12.34、及4.11奈克/毫升之抗IL-17抗體處理30分鐘。每一抗體稀釋系列係以培養基製得，50微升/孔(經10×濃縮)。30分鐘後，該等細胞以10奈克/毫升IL-17A與50皮克/毫升TNF-α之混合物刺激。50微升/孔(經10×濃縮)，並於37℃與5%CO2 下培養24小時。隔夜培養後，將上清液轉移至96孔平板並冷凍於-20℃下作為用於hIL-8 ELISA之中間體。
hIL-8 ELISA如以下進行。對每孔添加100微升經稀釋之捕獲抗體並於4℃下培養隔夜。以填塗緩衝液進行稀釋。將平板中培養基吸出、以200微升/孔清洗3次、以200微升/孔檢測稀釋液阻斷反應，及於RT下培養1小時。將平板中培養基吸出並以200微升/孔清洗3次。添加100微升之標準品與樣品並於RT下培養2小時。標準稀釋系列為：400皮克/毫升、200皮克/毫升、100皮克/毫升、50皮克/毫升、25皮克/毫升、12.5皮克/毫升、6.3皮克/毫升，並以檢測稀釋液作為陰對照。樣品以1:200稀釋。將平板中培養基吸出並以250微升/孔清洗4次。對每孔添加100微升結合物。該結合物係由偵測抗體與酵素試劑以1:250比例於檢測稀釋液中稀釋製得。將平板中培養基吸出並以250微升/孔清洗6次。對每孔添加100微升受質並培養12分鐘。培養後，以50微升/孔之1M H2 SO4 終止反應。於450奈米下輔以570奈米之λ校正於30分鐘內進行讀取。結果列於表3(經測量之IC50 值與80%之最大抑制作用有關)。
實例7 滑膜細胞激素釋放試驗，經IL-17A所誘導之hIL-6與hIL-8之抑制作用
原始人類纖維母細胞類滑膜(HFLS)細胞會對IL-17A刺激作出反應而產生hIL-6與hIL-8。進行此試驗係為了測量在以刺激前之抗IL-17抗體來預培養細胞過程中經此IL-17A刺激後對HFLS細胞製造hIL-6與hIL-8的抑制。
將HFLS細胞以4×105 細胞/毫升之細胞密度在48孔平板中植入0.5毫升，並在37℃與5%CO2 下培養隔夜以便黏附。隔夜培養後，以400微升新鮮培養基置換培養基，並以一系列抗體濃度範圍(10000、3000、1000、300、100、30、10、3、0ng/ml)的抗IL-17抗體處理此等細胞30分鐘。使用50微升/孔(經10×濃縮)之培養基將每一抗體進行稀釋系列。30分鐘後，以100奈克/毫升IL-17A(50微升1000奈克/毫升10×濃度)刺激此等細胞，並於37℃與5%CO2 下培養隔夜(18小時)。培養期後，將上清液轉移至乾淨試管中，及立即以ELISA分析，或儲存於-80℃下直至分析。就hIL-6與hIL-8 ELISA而言，對每孔添加100微升經稀釋之捕獲抗體並於4℃下培養隔夜。以填塗緩衝液進行稀釋。將平板中培養基吸出、以200微升/孔清洗3次、以200微升/孔檢測稀釋液阻斷反應，並於RT下培養1小時。將平板中培養基吸出並以200微升/孔清洗3次。依照生產商說明添加100微升標準品與樣品並於RT下培養2小時。將平板中培養基吸出並以250微升/孔清洗至少3次。對每孔添加100微升結合物。該結合物係由偵測抗體與酵素試劑以1:250比例在檢測稀釋劑中稀釋製得的。將平板中培養基吸出並以250微升/孔清洗至少3次。對每孔添加100微升受質並培養直至形成足以讀取之顏色。培養後以50微升/孔之1M H2 SO4 終止反應及在30分鐘內於平板讀取儀上以450奈米波長讀取。結果列於表4。
實例8 與獼猴IL-17A之交叉反應性(結合試驗)
根據實例2進行結合試驗。結果列於表5。
實例9 食蟹猴(長尾獼猴)細胞激素釋放試驗，經獼猴IL-17A所誘導IL-6與IL-8產生之抑制
獼猴真皮成纖維細胞(CDF)會對人類或獼猴IL-17A之刺激作出反應而產生IL-6與IL-8。進行此試驗係為了測量在經此彌猴IL-17A刺激後IL-6及IL-8產生之抑制作用，其係藉由將CDF細胞在刺激前先用對抗人類IL-17所產生之抗IL-17抗體來預培養此等細胞。
將CDF細胞以2×105 細胞/毫升的細胞密度在48孔平板中植入0.5毫升，並在37℃與5%CO2 下培養隔夜以便黏附。隔夜培養後，以400微升新鮮培養基置換培養基，並以一系列抗體濃度範圍(10000、3000、1000、300、100、30、10、3、0奈克/毫升)的抗IL-17抗體處理此等細胞30分鐘。使用50微升/孔之培養基(經10×濃縮)將每一抗體進行稀釋系列。30分鐘後，以100奈克/毫升IL-17A(50微升1000奈克/毫升10×濃度)刺激細胞並於37℃與5%CO2 下培養隔夜(18小時)。培養期後，將上清液轉移至乾淨試管內，及立即以ELISA分析，或儲存於-80℃下直至分析。hIL-6與hIL-8 ELISA顯示出與其等各自獼猴細胞激素具有交叉反應性，且可用於定量細胞激素的含量。就ELISA而言，對每孔添加100微升經稀釋之捕獲抗體並於4℃下培養隔夜，以填塗緩衝液進行稀釋。將平板中的培養基吸出、以200微升/孔清洗3次、以200微升/孔檢測稀釋液阻斷反應，並於RT下培養1小時。將平板中的培養基吸出，並以200微升/孔清洗3次。根據製造商說明書添加100微升標準品與樣品並於RT下培養2小時。將平板中培養基吸出並以250微升/孔清洗至少3次。對每孔添加100微升結合物。該結合物係由偵測抗體與酵素試劑以1:250比例在檢測稀釋劑中稀釋製得的。將平板中培養基吸出並以250微升/孔清洗至少3次。對每孔添加100微升受質並培養直至形成足以讀取之顏色。培養後，以50微升/孔1M H2 SO4 終止反應，並在30分鐘內於平板讀取儀上以450奈米波長讀取讀數。結果列於表6。
實例10 以銪為基礎之ADCC試驗
利用Ficoll Paque Plus Gradient離心法分離PBL。用PBS將肝素化血液樣本稀釋1:1。將8毫升經稀釋血液覆蓋於Ficoll上並於800g下離心30分鐘。收集此等細胞(PBL)，以RPMI1640/10% FCS清洗，並使其懸浮於細胞培養基內。將細胞稀釋至2.5×106 細胞/毫升。(當每孔使用5×103 靶細胞時，此將得到25:1之效應子/標靶比例)。
以BADTA(2,2':6',2"-三聯吡啶-6,6"-醋酸甲基二羧酸酯)標記靶細胞：藉由添加AccutaseTM (Millipore)獲得細胞，清洗1次並將細胞稀釋至1×106 細胞/毫升。添加2.5微升BADTA/1×106 細胞，並於37℃/5% CO2 下培養35分鐘。於標記期後，以10毫升培養基稀釋細胞，於200g下離心10分鐘並吸出上清液。以培養基/2mM羧苯磺胺重複此步驟3次，並將樣本稀釋至1×105 細胞/孔，於300g下離心5分鐘，取出上清液及移取50微升至孔內，作為背景對照。
背景：以100微升培養基稀釋50微升分液。自發性細胞溶解：50微升經標記之靶細胞懸浮液；添加100微升培養基，並如剩餘樣本於37℃下培養2小時。最大細胞溶解：50微升/孔之經標記靶細胞懸浮液；添加100μl TritonX-100(0.5%，溶於PBS中)並於37℃下培養2小時。未加抗體之細胞溶解對照：50微升/孔經標記之靶細胞懸浮液；添加50微升培養基；添加50微升效應子細胞，於37℃2小時。未加效應子細胞之細胞溶解對照：50微升/孔經標記之靶細胞懸浮液；添加50微升培養基、添加50毫升所使用之最高濃度抗體溶液並於37℃下培養2小時。
於培養期之終了時，將96孔平板在100rpm下離心。將20微升之每一孔上清液轉移至OptiPlateTM HTRF-96 Packard)中，並添加200微升銪溶液及於搖床上培養15分鐘。利用時間分辨熒光法測量熒光及利用下式計算自發性釋放與特異性釋放：
在添加抗體106後，未測量到明顯特異性釋放(ADCC)。
實例11 CDC試驗
藉由添加胰蛋白酵素獲得細胞，清洗，將細胞稀釋至1×105 細胞/毫升，並將細胞以100微升/孔添加至96孔平底微孔平板中。添加在25微升體積量培養基中具有6倍終濃度的抗體(各自抗體-配體複合物)。經過30分鐘培養時間後，將25微升的新鮮溶解之崽兔補體(Cedarlane CL3441，1ml經凍乾，新鮮稀釋於4ml雙蒸水中)添加至終濃度為1:24的補體。經過20小時培養期後，取出50微升上清液並將100微升Glo細胞滴度試劑(Promega Corp)添加至剩餘之100微升上清液中。於軌道搖床上搖動平板2分鐘，將100微升/孔轉移至黑色熒光微孔平板(Costar)並測量熒光。
對照：培養基對照組(靶細胞+50微升培養基)；最大細胞溶解(靶細胞+50微升0.5% Triton X-100)，補體對照組(靶細胞+25微升培養基+25微升補體)。
結果：以抗IL-17抗體106，無法偵測到補體依賴性細胞毒性(CDC)。

Claims (17)

  1. 一種結合至人類IL-17之抗體，其特徵為重鏈可變域包含SEQ ID NO:1之CDR3區、SEQ ID NO:2或9之CDR2區與SEQ ID NO:3之CDR1區，及輕鏈可變域包含SEQ ID NO:4之CDR3區、SEQ ID NO:5之CDR2區與SEQ ID NO:6之CDR1區。
  2. 如請求項1之抗體，其特徵為該重鏈可變域包含SEQ ID NO:7或10。
  3. 如請求項2之抗體，其特徵為該重鏈可變域包含SEQ ID NO:7或10及該輕鏈可變域包含SEQ ID NO:8。
  4. 一種結合至人類IL-17之抗體，其特徵為其係請求項1之抗體之嵌合型、經人化或T細胞抗原決定子經移除之抗體變體。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗體，其特徵為其屬於胺基酸位置216-240的鉸鏈區及/或在CH 2與CH 3之間的胺基酸位置327-331的第二域間區經修改的人類IgG1同型抗體。
  6. 一種結合至人類IL-17之抗體，其特徵為結合至與抗體結合人類IL-17相同的IL-17抗原決定子，其包含重鏈可變域SEQ ID NO:1之CDR3區、SEQ ID NO:2或9之CDR2區與SEQ ID NO:3之CDR1區，及輕鏈可變域SEQ ID NO:4之CDR3區、SEQ ID NO:5之CDR2區與SEQ ID NO:6之CDR1區，且屬於胺基酸位置216-240的鉸鏈區及/或在CH 2與CH 3之間的胺基酸位置327-331的第二域間區經修改的人類IgG1同型抗體。
  7. 如請求項5之抗體，其特徵為包含突變L234A(在胺基酸位置234處改用丙胺酸替換白胺酸)與L235A。
  8. 如請求項6之抗體，其特徵為包含突變L234A(在胺基酸位置234處改用丙胺酸替換白胺酸)與L235A。
  9. 一種醫藥組合物，其特徵為包含如請求項1至8中任一項之抗體。
  10. 一種醫藥組合物，其特徵為包含一種結合至與抗體結合人類IL-17相同的IL-17抗原決定子之抗體，其包含重鏈可變域SEQ ID NO:1之CDR3區、SEQ ID NO:2或9之CDR2區與SEQ ID NO:3之CDR1區，及輕鏈可變域SEQ ID NO:4之CDR3區、SEQ ID NO:5之CDR2區與SEQ ID NO:6之CDR1區。
  11. 一種如請求項1至8中任一項之抗體之用途，其係用於製造醫藥組合物。
  12. 一種抗體之用途，該抗體的特徵為結合至與抗體結合人類IL-17相同的IL-17抗原決定子，其包含重鏈可變域SEQ ID NO:1之CDR3區、SEQ ID NO:2或9之CDR2區與SEQ ID NO:3之CDR1區，及輕鏈可變域SEQ ID NO:4之CDR3區、SEQ ID NO:5之CDR2區與SEQ ID NO:6之CDR1區，其係用於製造醫藥組合物。
  13. 一種如請求項1至8中任一項之抗體之用途，其係用以製造用於治療多發性硬化症、類風濕性關節炎、牛皮癬、克隆氏病、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、哮喘、與移植排斥反應的醫藥組合物。
  14. 一種抗體之用途，該抗體的特徵為結合至與抗體結合人類IL-17相同的IL-17抗原決定子，其包含重鏈可變域SEQ ID NO:1之CDR3區、SEQ ID NO:2或9之CDR2區與SEQ ID NO:3之CDR1區，及輕鏈可變域SEQ ID NO:4之CDR3區、SEQ ID NO:5之CDR2區與SEQ ID NO:6之CDR1區，其係用以製造用於治療多發性硬化症、類風濕性關節炎、牛皮癬、克隆氏病、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、哮喘、與移植排斥反應的醫藥組合物。
  15. 一種編碼結合至IL-17之抗體重鏈的核酸，其特徵為該抗體包含SEQ ID NO:1之重鏈CDR3區、SEQ ID NO:2或9之重鏈CDR2區、SEQ ID NO:3之重鏈CDR1區、SEQ ID NO:4之輕鏈CDR3區、SEQ ID NO:5之輕鏈CDR2區與SEQ ID NO:6之輕鏈CDR1區。
  16. 一種表現載體，其特徵為包含如請求項15之核酸，以在原核或真核宿主細胞中表現結合至IL-17之抗體。
  17. 一種製造結合至IL-17之重組抗體的方法，其特徵為在原核或真核宿主細胞中表現如請求項15之核酸及回收該細胞或細胞培養上清液中之該抗體。
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