ES2905917T3 - Anticuerpo que se une específicamente a IL-17A y fragmento funcional del mismo - Google Patents

Anticuerpo que se une específicamente a IL-17A y fragmento funcional del mismo Download PDF

Info

Publication number
ES2905917T3
ES2905917T3 ES17850230T ES17850230T ES2905917T3 ES 2905917 T3 ES2905917 T3 ES 2905917T3 ES 17850230 T ES17850230 T ES 17850230T ES 17850230 T ES17850230 T ES 17850230T ES 2905917 T3 ES2905917 T3 ES 2905917T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antibody
seq
functional fragment
set forth
disease
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES17850230T
Other languages
English (en)
Inventor
Nanmeng Song
Jiawang Liu
Yaping Yang
Yang Yang
Dongge Yang
Hongjuan Zhang
Mengxie Jin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Beijing Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Hanmi Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Beijing Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2905917T3 publication Critical patent/ES2905917T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0058—Antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/14—Peptides, e.g. proteins
    • A61K49/16—Antibodies; Immunoglobulins; Fragments thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/22—Echographic preparations; Ultrasound imaging preparations ; Optoacoustic imaging preparations
    • A61K49/221—Echographic preparations; Ultrasound imaging preparations ; Optoacoustic imaging preparations characterised by the targeting agent or modifying agent linked to the acoustically-active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1021—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against cytokines, e.g. growth factors, VEGF, TNF, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/02—Non-specific cardiovascular stimulants, e.g. drugs for syncope, antihypotensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)

Abstract

Un anticuerpo capaz de unirse específicamente a IL-17A, o a un fragmento funcional del mismo capaz de unirse específicamente a IL-17A, en donde el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo comprenden una cadena ligera y una cadena pesada; la cadena ligera comprende una CDR de cadena ligera que consiste en CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3; la cadena pesada comprende una CDR de cadena pesada que consiste en CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3; las secuencias de aminoácidos de las CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 se exponen respectivamente en los SEQ ID NO: 1, 2 y 3; las secuencias de aminoácidos de las CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 se exponen respectivamente en los SEQ ID NO: 4, 5 y 6; preferentemente, el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo incluyen un anticuerpo quimérico de IL-17A o un fragmento funcional del mismo, y un anticuerpo humanizado de IL-17A o un fragmento funcional del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpo que se une específicamente a IL-17A y fragmento funcional del mismo
La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente china n.° CN201610827097.2, presentada el 14 de septiembre de 2016, en la State Intellectual Property Office y titulada “ANTIBODY SPECIFICALLY BINDING TO IL-17A AND FUNCTIONAL FRAGMENT THEREOF”, cuyo contenido íntegro se incorpora al presente documento por referencia.
Campo
La presente divulgación se refiere al campo de la biotecnología médica y a la investigación de ingeniería de anticuerpos humanizados y, en particular, a un anticuerpo que se une específicamente a IL-17A y fragmentos funcionales del mismo.
Antecedentes
La interleleuquina-17A (IL-17 o IL-17A) es una citoquina proinflamatoria producida principalmente mediante las células Th17 y es el miembro más representativo de la familia IL-17 (Miossec P, Kolls JK. Nat. Rev. Drug. Discov., 2012,11: 763-776). Tras su unión al receptor de IL-17A (IL-17RA), IL-17A puede inducir la expresión de citoquinas y quimioquinas inflamatorias en varias células (tales como fibroblastos, células epiteliales y células endoteliales), que tienen un papel importante en la defensa inmunitaria corporal (Lin Y, Ritchea S, Logar A. Immunity, 2009, 31:799-810).
Sin embargo, cuando la IL-17A se sobreexpresa puede producir enfermedades inflamatorias. Por ejemplo, la IL-17A tiene efectos sobre los macrófagos y la células DC, lo que induce una expresión elevada de IL-1, IL-6, TNF y CRP, dando como resultado una reacción inflamatoria, y está implicado en procesos patológicos como psoriasis y rechazo de trasplante. IL-17A tiene efectos sobre las células endoteliales, lo que induce una expresión elevada de IL-6, MMP y factores de coagulación, dando como resultado la activación vascular, y está implicado en procesos patológicos de lesión por reperfusión, trombosis y ateroesclerosis. IL-17A tiene efectos sobre los fibroblastos, lo que induce una expresión elevada de IL-6, quimiocinas, factores de crecimiento y MMP, dando como resultado la destrucción de la matriz y está implicado en los procesos patológicos de la esclerosis múltiple y la enfermedad de Crohn. IL-17A tiene efectos sobre los osteoblastos y los condrocitos, lo que induce RANKL, MMP y la génesis de osteoclastos, dando como resultado la erosión ósea y el daño al cartílago, que están implicados en el proceso patológico de la artritis reumatoide y la enfermedad periodontal (N Engl J Med. 27 Ago 2009; 361(9):888-98. Nat Rev Drug Discov. octubre de 2012; 11(10):763-76. Semin Arthritis Rheum. octubre de 2013; 43(2):158-70. Trends Mol Med. mar 2016; 22(3):230-41).
Los anticuerpos neutralizantes de IL-17A pueden inhibir la alta expresión de IL-17a en el tejido sinovial de pacientes con artritis reumatoide y reducir la producción del importante factor inflamatorio IL-6 (Chabaud M, Durand JM, Buchs N, et al. Arthritis Rheum. 1999,42: 963-70). Se ha demostrado por numerosos experimentos con modelos animales de enfermedades autoinmunes que el uso de anticuerpos para neutralizar IL-17a eficazmente puede inhibir eficazmente el desarrollo patológico de la inflamación (Lubberts E, Koenders MI, Oppers-Walgreen B, et al. Arthritis Rheum., 2004, 50: 650-659).
Karle et al. enseñan un nuevo anticuerpo anti-IL-17A, Secukinumab, que ha demostrado ser muy eficaz en el tratamiento de la psoriasis en placas de moderada a grave, a partir de los primeros momentos, con un efecto sostenido y un perfil de seguridad favorable (Karle A. et al. MAbs. 2016;8(3):536-50). En el mismo sentido, en Liu L. et al (Liu L. et al. J Inflamm Res. 19 de abril de 2016:39-50) y en las solicitudes de patente internacional W02010/034443 Al, W02013/177101 A2 y WO2011/053763 A2, también se desvelan anticuerpos que se unen específicamente a la IL-17A.
En la actualidad, los fármacos de anticuerpos relacionados con IL-17A, Secukinumab (anticuerpo dirigido a IL-17A) e Ixekizumab (anticuerpo dirigido a IL-17A), se han aprobado para su comercialización, y ambos pueden utilizarse para el tratamiento de la psoriasis. Sin embargo, los resultados del ensayo clínico con los fármacos han demostrado que estos fármacos no muestran el efecto terapéutico previsto para algunas enfermedades inflamatorias crónicas tal como la artritis reumatoide (Kellner H,Ther Adv Musculoskelet Dis., 2013, 5: 141-152).
En vista de esto, se ha propuesto específicamente la presente divulgación.
Sumario
La presente divulgación se basa en un anticuerpo monoclonal murino precursor dirigido contra IL-17A humano que tiene la capacidad de unirse específicamente a la proteína IL-17A humana, mediante clonación, identificación y análisis de la estructura génica para determinar su región CDR, construcciones correspondientes a los anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados, establecimiento del correspondiente sistema de expresión en células eucariotas y producción y purificación del anticuerpo quimérico y del anticuerpo humanizado.
Para alcanzar el objetivos de la presente divulgación anteriormente divulgado, se han adoptado especialmente las siguientes soluciones técnicas:
Un anticuerpo capaz de unirse específicamente a IL-17A y a un fragmento funcional del mismo, en donde el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo comprende una cadena ligera y una cadena pesada;
la cadena ligera comprende una CDR de cadena ligera que consiste de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3; la cadena pesada comprende una CDR de cadena pesada que consiste de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3;
las secuencias de aminoácidos de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 se definen respectivamente en el SEQ ID NO: 1, 2 y 3; las secuencias de aminoácidos de CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3 se definen respectivamente en el SEQ ID NO: 4, 5 y 6.
Preferentemente, el anticuerpo o fragmento funcional del mismo incluye un anticuerpo quimérico de IL-17A y un fragmento funcional del mismo, y un anticuerpo humanizado de IL-17A y un fragmento funcional del mismo.
Preferentemente, el anticuerpo o fragmento funcional del mismo incluye un anticuerpo quimérico de IL-17A y un fragmento funcional del mismo, y un anticuerpo humanizado de IL-17A y un fragmento funcional del mismo.
Es decir, el anticuerpo o fragmento funcional del mismo incluye un anticuerpo quimérico de IL-17A y un fragmento funcional del mismo, o el anticuerpo o fragmento funcional del mismo incluye un anticuerpo humanizado de IL-17A y un fragmento funcional del mismo.
Es bien sabido en la técnica que tanto la especificidad y afinidad de unión de un anticuerpo están principalmente determinados por la CDR, y las secuencia de aminoácidos de la región no CDR se puede cambiar fácilmente según técnicas existentes bien conocidas para obtener una variante con similares actividades biológicas. En la presente divulgación, las variantes de anticuerpo monoclonal tienen secuencias de CDR idénticas a las secuencias de CDR de los anticuerpos humanizados anteriormente mencionados, por lo tanto, tienen similares actividades biológicas. Preferentemente, el anticuerpo y el fragmento funcional del mismo como se ha descrito anteriormente, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de región constante de uno cualquiera seleccionado del grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE e IgD humanas.
Preferentemente, el anticuerpo y el fragmento funcional del mismo como se ha descrito anteriormente, en donde el fragmento funcional es uno o más seleccionado del grupo que consiste de F(ab')2, Fab', Fab, Fv, scFv, anticuerpo biespecífico y unidad de reconocimiento de anticuerpo mínimo.
El "fragmento funcional" de la presente divulgación se refiere específicamente a un fragmento de anticuerpo que tiene la misma especificidad respecto de IL-17A que el del anticuerpo precursor. Además de los fragmentos funcionales anteriormente mencionados, también se puede incluir cualquier fragmento cuya semivida se haya aumentado.
scFv (sc = monocatenario), anticuerpo biespecífico (diacuerpos).
Estos fragmentos funcionales tienen de forma típica la misma especificidad de unión que el anticuerpo del que se han derivado. Un experto en la materia puede aprender a partir de lo que se describe en la memoria descriptiva de la presente divulgación que el fragmento de anticuerpo de la presente divulgación y cómo obtener el fragmento funcional anteriormente descrito por un método tal como digestión enzimática (incluidas pepsina o papaína) y/o un método para reducir enlaces disulfuro divididos.
Los fragmentos de anticuerpos también se pueden obtener mediante síntesis peptídica según técnicas genéticas recombinantes, que también son conocidas del experto en la materia, o mediante sintetizadores automatizados de péptidos, tales como el sintetizador automatizado de péptidos comercializado por Applied BioSystems.
Preferentemente, el anticuerpo y el fragmento funcional del mismo como se ha descrito anteriormente, en donde las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada del anticuerpo quimérico IL-17A y el fragmento funcional del mismo se definen respectivamente en el SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO:8;
Además, preferentemente, el anticuerpo y el fragmento funcional del mismo como se ha descrito anteriormente, en donde la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena ligera y la región constante de cadena pesada del anticuerpo quimérico IL-17A y el fragmento funcional del mismo se definen respectivamente en el SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO:10.
Preferentemente, el anticuerpo y el fragmento funcional del mismo como se ha descrito anteriormente, en donde el marco de la cadena ligera del anticuerpo humanizado IL-17A y el fragmento funcional del mismo comprende FR-L1, FR-L2, FR-L3 y FR-L4, y el marco de la región de cadena pesada del anticuerpo humanizado IL-17A y el fragmento funcional del mismo comprende FR-H1, FR-H2, FR-H3 y fR-H4.
Las secuencias de aminoácidos de FR-L1, FR-L2, FR-L3 y FR-L4 se definen en el SEQ ID NO: 11 a 14 respectivamente.
Las secuencias de aminoácidos de FR-H1, FR-H2, FR-H3 y FR-H4 se definen en el SEQ ID NO: 15 a 18 respectivamente.
Normalmente, cuando se trasplantan las CDR de un anticuerpo murino a un marco humano, la selección de un marco humano con alta homología de secuencia tendrá cierta tasa de éxito. Sin embargo, los estudios han demostrado que muchos injertos de CDR requieren una retromutación para restaurar cierta actividad del anticuerpo. Cómo seleccionar el marco correcto de origen humano es un punto fundamental del proceso.
La CDR es el principal sitio relevante para la unión con el antígeno, pero en la mayoría de los casos, la FR (región marco) tiene una influencia significativa sobre la conformación del sitio de unión. Para obtener un anticuerpo humanizado de alta afinidad, en la presente divulgación, una región FR adecuada se selecciona y el resto FR relevante se revierte al aminoácido murino original o a un aminoácido presente en la versión humana y que tiene la misma función.
Preferentemente, el FR-L1 se selecciona entre la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO:11 y la secuencia de aminoácidos que tiene la siguiente sustitución o una combinación de las mismas:
el 1er aminoácido D se sustituye por I;
el 2° aminoácido V es sustituye por I;
el FR-L2 se selecciona entre la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO:12 y la secuencia de aminoácidos que tiene la siguiente sustitución o una combinación de las mismas:
el 4° aminoácido D se sustituye por I;
el 14° aminoácido D se sustituye por I;
el FR-L3 se selecciona entre la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO:13 y la secuencia de aminoácidos que tiene la siguiente sustitución o una combinación de las mismas:
el 35° aminoácido Y se sustituye por F;
el FR-L4 se selecciona entre la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 14;
el FR-H1 se selecciona entre la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO:15 y la secuencia de aminoácidos que tiene la siguiente sustitución o una combinación de las mismas:
el 4° aminoácido L se sustituye por V;
el FR-H2 se selecciona entre la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO:16 y la secuencia de aminoácidos que tiene la siguiente sustitución o una combinación de las mismas:
el 15° aminoácido I se sustituye por M;
el FR-H3 se selecciona entre la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO:17 y la secuencia de aminoácidos que tiene la siguiente sustitución o una combinación de las mismas:
el 2° aminoácido V es sustituye por I;
el 6° aminoácido V se sustituye por R;
el FR-H4 se selecciona entre la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 18;
preferentemente, la secuencia de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo humanizado IL-17A y el fragmento funcional del mismo es uno seleccionado del SEQ ID NO: 19-26;
preferentemente, la secuencia de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo humanizado IL-17A y el fragmento funcional del mismo es uno seleccionado del SEQ ID NO: 27-34;
más preferentemente, la secuencia de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo humanizado IL-17A y el fragmento funcional del mismo se expone en el SEQ ID NO: 19; la correspondiente secuencia de la región variable de la cadena pesada se expone en el SEQ ID NO: 27;
como alternativa, la secuencia de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo humanizado IL-17A y el fragmento funcional del mismo se expone en el SEQ ID NO: 20; la correspondiente secuencia de la región variable de la cadena pesada se expone en el SEQ ID NO: 28;
como alternativa, la secuencia de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo humanizado IL-17A y el fragmento funcional del mismo se expone en el SEQ ID NO: 21; la correspondiente secuencia de la región variable de la cadena pesada se expone en el SEQ ID NO: 29;
como alternativa, la secuencia de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo humanizado IL-17A y el fragmento funcional del mismo se expone en el SEQ ID NO: 22; la correspondiente secuencia de la región variable de la cadena pesada se expone en el SEQ ID NO: 30;
como alternativa, la secuencia de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo humanizado IL-17A y el fragmento funcional del mismo se expone en el SEQ ID NO: 22; la correspondiente secuencia de la región variable de la cadena pesada se expone en el SEQ ID NO: 31;
como alternativa, la secuencia de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo humanizado IL-17A y el fragmento funcional del mismo se expone en el SEQ ID NO: 23; la correspondiente secuencia de la región variable de la cadena pesada se expone en el SEQ ID NO: 32;
como alternativa, la secuencia de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo humanizado IL-17A y el fragmento funcional del mismo se expone en el SEQ ID NO: 24; la correspondiente secuencia de la región variable de la cadena pesada se expone en el SEQ ID NO: 33;
como alternativa, la secuencia de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo humanizado IL-17A y el fragmento funcional del mismo se expone en el SEQ ID NO: 25; la correspondiente secuencia de la región variable de la cadena pesada se expone en el SEQ ID NO: 32;
como alternativa, la secuencia de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo humanizado IL-17A y el fragmento funcional del mismo se expone en el SEQ ID NO: 26; la correspondiente secuencia de la región variable de la cadena pesada se expone en el SEQ ID NO: 34;
más preferentemente, las secuencias de aminoácidos de la región constante de la cadena ligera y la región constante de la cadena pesada del anticuerpo humanizado IL-17A y el fragmento funcional del mismo se exponen respectivamente en el SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10.
La región constante de cadena ligera del anticuerpo humanizado IL-17A y el fragmento funcional del mismo se selecciona de la región constante de cadena ligera del anticuerpo Kappa humano, cuya secuencia de aminoácidos se expone en el SEQ ID NO: 9.
La región constante de cadena pesada del anticuerpo humanizado IL-17A y el fragmento funcional del mismo se seleccionan de la región constante de cadena pesada del anticuerpo IgG1 humano, cuya secuencia de aminoácidos se expone en el SEQ ID NO: 10.
Debería observarse que, además de las secuencias de aminoácidos anteriormente mencionadas en la presente solicitud, la producción de anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados se puede conseguir por cualquier método conocido por el experto en la materia, tal como por el diseño de anticuerpos recombinantes humanizados basados en las CDR secuenciadas de los anticuerpos murinos, el anticuerpo murino se secretada por las células de mieloma de ratones inmunizados o por las células de mieloma fusionadas con esplenocitos de otras especies que se fusionan con células de mieloma. El animal inmunizado puede incluir un ratón transgénico que tiene un locus de inmunoglobulina humana que puede producir directamente un anticuerpo humano. Otra posible realización puede incluir el cribado de una biblioteca usando tecnología de expresión en fagos.
Una molécula de ácido nucleico aislada se selecciona de:
A) ADN o ARN, que codifican el anticuerpo y el fragmento funcional del mismo como se ha descrito anteriormente; y
B) un ácido nucleico complementario del ácido nucleico que se ha definido en A).
Un vector, que contiene una molécula de ácido nucleico como se ha descrito anteriormente.
La presente divulgación presenta además al menos una construcción nuclear que codifica una molécula de ácido nucleico como se ha descrito anteriormente, preferentemente un vector, más preferentemente un vector de expresión, tal como un plásmido, que se describe en una realización de la presente solicitud.
Una célula hospedadora, que se transforma con un vector como se ha descrito anteriormente.
La célula hospedadora es una célula eucariota, tal como una célula de mamífero.
Un método para producir un anticuerpo capaz de unirse específicamente a IL-17A y un fragmento funcional del mismo incluye las siguientes etapas:
cultivar células hospedadoras como se ha descrito anteriormente en un medio y en condiciones de cultivo adecuadas; y
recuperar el anticuerpo producido y sus fragmentos funcionales del medio de cultivo o de las células hospedadoras cultivadas.
Una composición, que comprende el anticuerpo y/o fragmento funcional del mismo, o un compuesto del anticuerpo y/o el fragmento funcional del mismo junto con otros componentes, como principio activo.
Preferentemente, la composición como se ha descrito anteriormente, el anticuerpo y el fragmento funcional del mismo se acoplan en al menos un agente de diagnóstico y/o un agente terapéutico para formar un inmunoconjugado.
Preferentemente, el agente de diagnóstico es uno o más de los seleccionados entre el grupo que consiste en un polipéptido, un agente de contraste radioactivo, un ion paramagnético, un metal, una marca fluorescente, una marca quimioluminiscente, un agente de contraste de ultrasonidos, y un fotosensibilizador.
Preferentemente, el radionúclido es uno o más de los seleccionados entre el grupo que consiste de 110In, 111In, 177Lu, 18F, 52Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 86Y, 90Y, 89Zr, 94mTc, 94Tc, 99mTc, 120I, 123I, 124I, 125I, 131I, 154-158Gd, 32P, 11C, 13N, 15O, 186Re, 188Re, 51Mn, 52mMn, 55Co, 72As, 75Br, 76Br, 82mRb y 83Sr.
Preferentemente, el ion paramagnético es uno o más de los seleccionados entre el grupo que consiste de cromo (III), manganeso (II), hierro (III), hierro (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (III), samario (III), iterbio (III), gadolinio (III), vanadio (II), terbio (III), disprosio (III), holmio (III) y erbio (III).
Preferentemente, la marca fluorescente es una o más de las seleccionadas entre el grupo que consiste en Alexa 350, Alexa 405, Alexa 430, Alexa 488, Alexa 555, Alexa 647, AMCA, aminoacridina, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, 5-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína, 5-carboxi-2',4',5',7'-tetraclorofluoresceína, 5-carboxifluoresceína, 5-carboxirrodamina, 6-carboxirrodamina, 6-carboxitetrametilrrodamina, Cascade Blue, Cy2, Cy3, Cy5, Cy7, 6-FAM, cloruro de dansilo, fluoresceína, HEX, 6-JOE, NBD (7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole), Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, ácido ftálico, ácido tereftálico, ácidos isoftálico, violeta de cresol rápido, violeta de cresilo, azul de cresilo brillante, ácido 4-aminobenzoico, eritrosina, ftalocianina, azometina, cianina, xantina, succinil fluoresceína, criptato de metal de tierras raras, tri-bipiridildiamina oxima, compuesto o quelato de criptato de europio, diamina, dicianina, colorante azul La Joya, aloficocianina, alococianina B, ficocianina C, ficocianina R, tiamina, R-ficoeritrina, C-ficoeritrina, ficoeritrina R, REG, verde de rodamina, isotiocianato de rodamina, rojo de rodamina, ROX, TAMRA, TET, TRIT (tetrametilrrodamina isotiol), tetrametilrrodamina y Texas Red.
Preferentemente, el agente terapéutico es uno o más de los seleccionados entre el grupo que consiste en un anticuerpo desnudo, un agente citotóxico, un fármaco, un radionúclido, un átomo de boro, un inmunomodulador, un agente antiapoptótico, un agente terapéutico fotosensibilizante, un inmunoconjugado y un oligonucleótido.
Preferentemente, el fármaco es uno o más de los seleccionados entre el grupo que consiste de metotrexato, fluorouracilo, mercaptopurina, hidroxiurea, citarabina, mostaza de nitrógeno, ciclofosfamida, tiotepa, cisplatino, mitomicina, bleomicina, camptotecina, podofilotoxina, actinomicina D, doxorrubicina, daunorrubicina, vinblastina, paclitaxel, alcaloides de cefalotaxus y L-asparaginasa.
Preferentemente, el oligonucleótido es uno o más de los seleccionados entre el grupo que consiste de ARNsh, ARNmi y ARNip.
Preferentemente, el inmunomodulador es uno o más de los seleccionados entre el grupo que consiste de una citoquina, una quimiocina, un factor de crecimiento de citoblastos, una linfotoxina, un factor hematopoyético, un factor estimulante de colonias (CSF), un interferón, una eritropoyetina, una trombopoyetina, una interleuquina (IL), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF) y factor de crecimiento de citoblastos.
En la que, la citoquina es preferentemente una o más de las seleccionadas entre el grupo que consiste de hormona del crecimiento humana, N-metionil hormona del crecimiento humana, hormona del crecimiento bovina, hormona paratiroidea, tiroxina, insulina, proinsulina, relaxina, prorrelaxina, hormona folículo-estimulante (FSH), hormona estimulante tiroidea (TSH), hormona luteinizante (LH), factor de crecimiento hepático, prostaglandina, factor de crecimiento de fibroblastos, prolactina, lactógeno placentario, proteína OB, factor de necrosis tumoral a, factor de necrosis tumoral p, inhibidor mulleriano, péptido relacionado con gonadotropina de ratón, inhibina, activina, factor de crecimiento endotelial vascular, integrina, trombopoyetina (TPO), NGF-p, factor de crecimiento de plaquetas, TGF-a, TGF-p, factor de crecimiento I de tipo insulina, factor de crecimiento II de tipo insulina, eritropoyetina (EPO), factor osteoinductivo, interferón-a, interferón-p, interferón-Y, CSF de macrófagos (M-CSF), IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, IL-25, LIF, FLT-3, angiostatina, trombospondina, endostatina, factor de necrosis tumoral y LT.
La quimioquina es preferentemente una o más de las seleccionadas entre el grupo que consiste de RANTES, MCAF, MIP1-a, MIP1-p, e IP-10.
Preferentemente, el radionúclido es uno o más de los seleccionados entre el grupo que consiste de 111In, 111At, 177Lu, 211Bi, 212Bi, 213Bi, 211At, 62Cu, 67Cu, 90Y, 125I, 131I, 133I, 32P, 33P, 47Sc, 111Ag, 67Ga, 153Sm, 161Tb, 152Dy, 166Dy, 161Ho, 166Ho, 186Re, 188Re, 189Re, 211Pb, 212Pb, 223Ra, 225Ac, 77As, 89Sr, 99Mo, 105Rh, 149Pm, 169Er, 194Ir, 58Co, 80mBr, 99mTc, 103mRh, 109Pt, 119Sb, 189mOs, 192Ir, 219Rn, 215Po, 221Fr, 255Fm, 11C, 13N, 15O, 75Br, 198Au, 199Au, 224Ac, 77Br, 113mIn, 95Ru, 97Ru, 103Ru, 105Ru, 107Hg, 203Hg, 121mTe, 122mTe, 125mTe, 165Tm, 167Tm, 168Tm, 197Pt, 109Pd, 142Pr, 143Pr, 161Tb, 57Co, 58Co, 51Cr, 59Fe, 75Se, 201Tl, 76Br y 169Yb.
Uso de la composición como se ha descrito anteriormente para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad asociada a la sobreexpresión y sobreliberación de IL-17A.
Preferentemente, la enfermedad es una o más de las seleccionadas entre el grupo que consiste de inflamación de las vías respiratorias, asma, asma bronquial, asma alérgica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis pulmonar idiopática, artritis reumatoide, artrosis, espondilitis anquilosante, artritis psoriásica, psoriasis, esclerosis múltiple, esclerosis sistémica, lupus eritematoso sistémico, nefritis por lupus, esclerodermia, colitis ulcerosa, enfermedad inflamatoria del intestino, uveítis, gastritis asociada a Helicobacter pylori, osteoporosis, erosión ósea, abscesos y adhesiones intraperitoneales, enfermedad de Addison, deficiencia de gammaglobulina, alopecia areata, enfermedad celíaca, enfermedad de Chagas, enfermedad de Crohn, rechazo de aloinjertos, enfermedad de Behcet, septicemia, choque séptico o choque por endotoxinas e isquemia.
Uso del anticuerpo capaz de unirse específicamente a IL-17A y el fragmento funcional del mismo como se ha descrito anteriormente para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad asociada a la sobreexpresión y sobreliberación de IL-17A.
Un fármaco para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad asociada a la sobreexpresión y sobreliberación de IL-17A, que comprende el anticuerpo capaz de unirse específicamente a IL-17A y el fragmento funcional del mismo, y un transportador farmacéuticamente aceptable.
Como alternativa, el fármaco comprende la composición como se ha descrito anteriormente y un transportador farmacéuticamente aceptable.
En el presente documento, la expresión ““farmacéuticamente aceptable” significa que el compuesto es fisiológicamente aceptable cuando el compuesto se administra a un ser humano, y no produce una reacción alérgica tal como un trastorno gastrointestinal, mareos, u otras reacciones alérgicas, o una reacción alérgica sistémica similar a dichas reacciones alérgicas.
En la presente divulgación, “transportador farmacéuticamente aceptable” incluye, aunque no de forma limitativa, aglutinantes (tales como celulosa microcristalina, alginatos, gelatina y polivinilpirrolidona), cargas (tales como almidón, sacarosa, glucosa y ácido láctico anhidro), disgregantes (tales como PVP reticulado, carboximetilalmidón sódico reticulado), croscarmelosa de sodio e hidroxipropil celulosa con baja sustitución), lubricantes (estearato de magnesio, estearato de aluminio, talco, polietilenglicol, benzoato de sodio), agente humectante (tal como glicerina), tensioactivos (tal como alcohol cetílico), y potenciadores de la absorción, agentes aromatizantes, edulcorantes, diluyentes, agentes de recubrimiento, etc.
La enfermedad que se ha descrito anteriormente es una o más de las seleccionadas entre el grupo que consiste de inflamación de las vías respiratorias, asma, asma bronquial, asma alérgica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis pulmonar idiopática, artritis reumatoide, artrosis, espondilitis anquilosante, artritis psoriásica, psoriasis, esclerosis múltiple, esclerosis sistémica, lupus eritematoso sistémico, nefritis por lupus, esclerodermia, colitis ulcerosa, enfermedad inflamatoria del intestino, uveítis, gastritis asociada a Helicobacter pylori, osteoporosis, erosión ósea, abscesos y adhesiones intraperitoneales, enfermedad de Addison, deficiencia de gammaglobulina, alopecia areata, enfermedad celíaca, enfermedad de Chagas, enfermedad de Crohn, rechazo de aloinjertos, enfermedad de Behcet, septicemia, choque séptico o choque por endotoxinas e isquemia.
Un método para prevenir y/o tratar una enfermedad asociada a la sobreexpresión y/o sobreliberación de IL-17A, que comprende administrar el fármaco como se ha descrito anteriormente a un paciente que lo necesita.
Preferentemente, el individuo anteriormente mencionado es un ser humano, y además, el individuo anteriormente mencionado es un ser humano que necesita prevención y/o tratamiento de una enfermedad asociada a la sobreexpresión y/o sobreliberación de IL-17A.
La enfermedad que se ha descrito anteriormente es una o más de las seleccionadas entre el grupo que consiste de inflamación de las vías respiratorias, asma, asma bronquial, asma alérgica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis pulmonar idiopática, artritis reumatoide, artrosis, espondilitis anquilosante, artritis psoriásica, psoriasis, esclerosis múltiple, esclerosis sistémica, lupus eritematoso sistémico, nefritis por lupus, esclerodermia, colitis ulcerosa, enfermedad inflamatoria del intestino, uveítis, gastritis asociada a Helicobacter pylori, osteoporosis, erosión ósea, abscesos y adhesiones intraperitoneales, enfermedad de Addison, deficiencia de gammaglobulina, alopecia areata, enfermedad celíaca, enfermedad de Chagas, enfermedad de Crohn, rechazo de aloinjertos, enfermedad de Behcet, septicemia, choque séptico o choque por endotoxinas e isquemia.
Breve descripción de los dibujos
Para ilustrar más claramente las realizaciones específicas de la presente divulgación o las soluciones técnicas de la técnica convencional, los dibujos usados en las realizaciones específicas o en la descripción de la técnica convencional se describirán brevemente a continuación, y es evidente que los dibujos de la siguiente descripción son algunas realizaciones de la presente divulgación, y una persona normalmente experta en la técnica puede obtener otros dibujos basados en estos dibujos sin ningún trabajo creativo.
La Figura 1 muestra la actividad de unión de IL-17A humano al anticuerpo monoclonal secretado por el clon N.° 88 del Ejemplo 1;
la Figura 2 muestra la actividad de neutralización del anticuerpo monoclonal secretado por el clon N.° 88 del Ejemplo 1 contra la secreción estimulada por IL-17A humano de IL-6 por células HFF-1;
la Figura 3 muestra la especificidad de especie del anticuerpo monoclonal quimérico dirigido contra IL-17A humano del Ejemplo 4;
la Figura 4 muestra la especificidad de unión del anticuerpo monoclonal quimérico dirigido contra IL-17A humano del Ejemplo 4;
la Figura 5 muestra la actividad de neutralización in vitro del anticuerpo monoclonal quimérico dirigido contra IL-17A humano del Ejemplo 5;
la Figura 6 muestra la actividad de neutralización in vivo del anticuerpo monoclonal quimérico dirigido contra IL-17A humano del Ejemplo 6;
la Figura 7 muestra la curva de concentración-tiempo después de una sola inyección intravenosa en el Ejemplo 7;
la Figura 8 muestra la actividad de unión al antígeno del anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra IL-17A humano del Ejemplo 9;
la Figura 9 muestra la actividad de neutralización in vitro del anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra IL-17A humano del Ejemplo 10;
la Figura 10 muestra la curva de concentración-tiempo después de una sola inyección subcutánea en el Ejemplo 15.
Descripción detallada
A continuación se describirán las realizaciones de la presente divulgación con detalle en referencia a las realizaciones. Sin embargo, Una persona normalmente experta en la materia entenderá que las siguientes realizaciones son meramente para ilustrar la presente divulgación y no se pretende que limiten el ámbito de la divulgación. Para aquellas realizaciones en las que no se han especificado condiciones concretas, se llevaron a cabo de acuerdo con las condiciones convencionales o las condiciones recomendadas por el fabricante. Para aquellos reactivos o instrumentos en los que no se ha indicado el fabricante, se trata en todos los casos de productos convencionales comerciales.
Ejemplo 1. Preparación del anticuerpo monoclonal de murino dirigido contra IL-17A humano
1.1. Inmunización de animales
Ratones BABL/c hembra, 6 a 8 semanas de edad, adquiridos de Beijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd., se usaron como animales experimentales. Una semana después de que los ratones se aclimataran al entorno, comenzó la inmunización. La proteína IL-17A recombinante humana se expresó en E. coli, y los cuerpos de inclusión se recogieron y se sometieron a tratamiento de desnaturalización y replegado a fin de obtener la proteína IL-17A soluble. Para la inmunización inicial, 100 pg de proteína IL-17A-Fc recombinante humana se mezcló homogéneamente con adyuvante completo de Freun (Sigma-Aldrich, número de catálogo F5881) para formar una emulsión, que se inyectó por vía intraperitoneal en los ratones. Dos semanas después, se iniciaron las inmunizaciones de refuerzo. Para la inmunización de refuerzo, 50 pg de proteína IL-17A-Fc recombinante humana se mezcló completamente con adyuvante incompleto de Freund (Sigma-Aldrich, número de catálogo F5806) para formar una emulsión, que se inyectó por vía intraperitoneal en los ratones. La inmunización se reforzó de la misma forma cada 2 semanas, para un total de 3 veces. El séptimo día después de la última inmunización, se extrajo sangre del plexo venoso retroorbital de los ratones y se centrifugó para separar el suero, y el título de anticuerpos se determinó mediante ELISA. Los ratones con títulos elevados se seleccionaron para fabricar hibridomas. Tres días antes de la hibridación, 50 pg de proteína IL-17A-Fc recombinante humana se inyectó por vía intraperitoneal a ratones sin adyuvante. El día de la hibridación, el bazo se extrajo asépticamente para preparar suspensiones de una sola célula de bazo para su uso.
1.2. Preparación de hibridomas
Las células de mieloma SP2/0 en fase logarítmica de crecimiento se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos, el sobrenadante se descartó, y las células se suspendieron en medio DMEM incompleto (Gibco, n.° cat 11965) y se contaron. Las células necesarias se recogieron, se lavaron dos veces con un medio de cultivo incompleto. Al mismo tiempo, una suspensión de células de bazo preparadas a partir de un ratón después de la inmunización se lavó dos veces con un medio de cultivo incompleto. Las células de mieloma y las células esplénicas se mezclaron en una proporción de 1:10 o 1:5, y se lavaron una vez con un medio de cultivo incompleto en un tubo de centrífuga de 50 ml, y después se centrifugaron a 1200 rpm durante 8 minutos. El sobrenadante se descartó, y se usó una pipeta Pasteur para eliminar el líquido residual. El tubo de centrífuga se golpeó suavemente sobre la palma para hacer que las células precipitadas se soltaran e igualaran, y a continuación, el tubo se introdujo en un baño de agua a 40 °C para precalentar. 1 ml de PEG-4000 al 45 % (pH 8,0, Sigma, n.° cat. P7181) precalentado a 40 °C se añadió con 1 ml de pipeta a aproximadamente 1 minuto (con un tiempo óptimo de 45 segundos) se agitó suavemente con una pipeta al añadir (agitar con pipeta), deberían verse partículas visibles a simple vista. Se añadieron de 20 a 30 ml de medio incompleto precalentado a 37 °C al tubo con una pipeta de 10 ml en un plazo de 90 segundos después de finalizar la acción del PEG, y se dejó reposar de 20 a 37 °C durante 10 minutos. El tubo se centrifugó a 1000 rpm durante 5 minutos y se desechó el sobrenadante. 5 ml de medio HAT (DMEM HAT, Sigma, n.° cat.1 H0262-10VL) se añadieron, y las células precipitadas se mezclaron suavemente (debe recordarse no agitar intensamente para no separar las células fusionadas) para preparar una suspensión bien mezclada. Se añadió medio HAT adicional hasta de 80 a 100 ml (la concentración de esplenocitos pasó a ser de 1 a 2*106/ml). La suspensión se dispensó a una placa de cultivo celular de 96 pocillos, 0,1 ml por pocillo; y una placa de 24 pocillos, 1,0 a 1,5 ml por pocillo. Las placas se incubaron en una incubadora a 37 °C con CO2 al 6 %. En general, se usaron seis placas de 96 pocillos. Después de 5 días, la mitad del medio se sustituyó con medio HAT fresco. Después de 7 a 10 días, el medio HAT se sustituyó por medio HT (DMEM HT, Sigma n.° cat. H0137-10VL). El crecimiento de las células de hibridoma se observó regularmente, y el sobrenadante se recogió para la detección de anticuerpos después de que la confluencia de las células alcanzara 1/10 o más. Las colonias positivas se expandieron y se congelaron.
1.3. Cribado e identificación del clon
Se usó ELISA para cribar el anticuerpo dirigido contra IL-17A humana a partir de los sobrenadantes de cultivo de hibridomas. IL-17A recombinante humana se revistió sobre una placa de 96 pocillos con alta absorción en ELISA con una solución tampón de bicarbonato a pH 9,6, la concentración de revestimiento fue 1 pg/ml, la cantidad de revestimiento fue de 100 pl por pocillo, y el revestimiento se llevó a cabo a 4 °C durante la noche. La placa se lavó cinco veces con PBST, se bloqueó con 300 pl/pocillo de PBST que contenía BSA al 1 %, y después se incubó a 25 °C durante 1 hora. La placa se lavó cinco veces con PBST. 100 pl de muestras de sobrenadante de cultivo y el control de suero positivo se añadieron a cada pocillo respectivamente, y después la placa se incubó a 25 °C durante 1 hora. La placa se lavó cinco veces con PBST. A continuación, 100 pl de anticuerpo dirigido contra IgG de ratón marcado con peroxidasa de rábano picante (Abeam, número de catálogo Ab7068) 1:10000 diluido en PBST que contiene BSA al 1 % se añadieron a cada pocillo, y a continuación la placa se incubó a 25 °C durante 1 hora. La placa se lavó cinco veces con PBST. se añadieron 100 pl/pocillo de sustrato colorimétrico, y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. El desarrollo del color finalizó por adición de 100 pl/pocillo de H2SO4 1 M. Se midió la absorbancia a 450 nm con un lector de microplacas. Los clones positivos capaces de producir el anticuerpo dirigido contra IL-17A humana se seleccionaron según el valor de lectura a una DO 450 nm.
Si el anticuerpo dirigido contra IL-17A humana secretado por los clones positivos era un anticuerpo neutralizante se determinó mediante ensayos con células. La muestra de anticuerpo dirigido contra IL-17A humana se diluyó en medio DMEM completo (GlBCO, número de catálogo 11995-073) que contenía FBS al 10% (Hyclone, número de catálogo SH30084.03). La concentración inicial del anticuerpo fue 160 nM y la concentración final fue 40 nM en el medio. El anticuerpo se sometió a una dilución en serie de 5 veces y después se añadió a una placa de cultivo de células, 50 pl por pocillo. 20 ng/ml de IL-17A humana (concentración final 5 ng/ml) se diluyó con el mismo medio completo y se añadió a la placa de cultivo de células a 50 pl por pocillo. La placa se incubó a 37 °C durante 1 hora en una incubadora con CO2 al 5 %. Las células HFF-1 se resuspendieron en medio completo y se sembraron en una placa de cultivo de células de 96 pocillos a 100 pl por pocillo, 5000 células por pocillo. Las células se incubaron a 37 °C durante 24 horas en una incubadora con CO2 al 5 %. Tras finalizar la incubación, la placa de cultivo de células se centrifugó a 250*g durante 5 minutos y el sobrenadante del cultivo se retiró, y se detectó el nivel de la IL-6 humana usando el kit ELISA para IL-6 human (R&D systems, número de catálogo S6050) de acuerdo con las instrucciones. El anticuerpo capaz de inhibir la secreción estimulada por la IL-17A humana de la IL-6 humana por las células HFF-1 fue un anticuerpo neutralizante dirigido contra IL-17A humana. El clon positivo capaz de secretar el anticuerpo neutralizante dirigido contra IL-17A humana se seleccionan en función de la intensidad de la neutralización.
El resultado se muestra en la Figura 1. El clon n.° 88 tiene una intensa actividad de unión a IL-17A humana. De acuerdo con lo que se muestra en la Figura 2, el clon n.° 88 también tiene una intensa actividad neutralizante de IL-17A humana.
1.4. Secuenciación de anticuerpo monoclonal
Los clones que tienen tanto actividad de unión y actividad de neutralización de antígenos obtenidas mediante el cribado se sometieron a secuenciación de la secuencia de ADN del anticuerpo. El ARNm celular se extrajo en primer lugar usando el RNAprep Pure Kit (Tiangen, DP430). Los etapas eran las siguientes: 1*107 células se centrifugaron a 300 x g durante 5 minutos y se recogieron en un tubo de centrífuga, y el sobrenadante se aspiró cuidadosamente. La etapa de lisis se realizó inmediatamente. El fondo del tubo de centrífuga se sacudió para soltar el aglomerado celular, 600 pl de tampón de lisis RL se añadieron con vortización. Toda la solución se transfirió a una columna de filtración CS (la columna de filtración CS se introdujo en un tubo de recogida), se centrifugó a 12.000 rpm (-13.400* g) durante 2 minutos, y el filtrado se recogió. Un volumen de una vez de etanol al 70 % (habitualmente 350 pl o 600 pl) se añadió al filtrado, se mezcló bien, la solución obtenida y el precipitado se transfirieron a una columna de absorción CR3 (la columna de absorción CR3 se introdujo en un tubo de recogida), se centrifugó a 12.000 rpm (-13.400* g) durante de 30 a 60 segundos, se eliminó el residuo líquido en el tubo de recogida, la columna de absorción CR3 se recolocó en el tubo de recogida. 350 pl de solución RW1 desproteinizada se añadió a la columna de adsorción CR3, se centrifugó a 12.000 rpm (~13.400*g) durante de 30 a 60 segundos, se eliminó el residuo líquido en el tubo de recogida, la columna de absorción CR3 se recolocó en el tubo de recogida. 80 pl de la solución de trabajo de DNasa I en el centro de la columna de adsorción CR3 y la columna CR3 se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos. 350 j l de solución RW1 desproteinizada se añadió a la columna de adsorción CR3, se centrifugó a 12.000 rpm (~13.400*g) durante de 30 a 60 segundos, se eliminó el residuo líquido en el tubo de recogida, la columna de absorción CR3 se recolocó en el tubo de recogida. 500 j l de la solución de aclarado RW se añadió a la columna de adsorción CR3 (comprobar si se ha añadido etanol antes del uso), la columna CR3 se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 minutos, se centrifugó a 12.000 rpm (-13.400* g) durante de 30 a 60 segundos, se eliminó el residuo líquido en el tubo de recogida, la columna de absorción CR3 se recolocó en el tubo de recogida. La columna CR3 se centrifugó a 12.000 rpm (-13.400* g) durante 2 minutos, y el residuo se eliminó. La columna de adsorción CR3 se dejó a temperatura ambiente durante unos minutos para dejar que la solución de enjuagado residual que quedaba en el material adsorbente se secara por completo. La columna de adsorción CR3 se transfirió a un nuevo tubo de centrífuga exento de RNasa, se añadieron de 30 a 100 j l de ddH2O exento de RNasa, el tubo se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 minutos, y después se centrifugó a 12.000 rpm (-13.400* g) durante 2 minutos para obtener una solución de ARN.
La primera hebra de ADNc se sintetizó usando el kit QuantScript RT (Tiangen, KR103). Las etapas fueron las siguientes: el ARN de molde se descongeló sobre hielo; el cebador, mezcla 10*RT (que contiene RNasin y DTT), mezcla Super pure dNTP, ddH2O exenta de RNasa se descongelaron a temperatura ambiente (de 15 a 25 °C, y se colocaron sobre hielo inmediatamente después de la descongelación. Cada solución se mezcló bien mediante vortización antes del uso, el tubo se centrifugó un corto periodo de tiempo para recoger líquido residual en la cara del tubo. La mezcla del sistema para transcripción inversa (Tiangen Bio Quant cDNA First-Strand Synthesis Kit, número de catálogo KR103-04; 2 j l de 10* Tampón de transcriptasa inversa, 2 j l de Ultra-Pure dNTP, 2 j l de cebador aleatorio, 1 j l de enzima de transcripción inversa) se prepararon de acuerdo con la Tabla 1. La mezcla se mezcló minuciosamente, la duración de vórtice no fue más de 5 minutos; y a continuación se centrifugó poco tiempo y se colocó sobre hielo. Por último, el ARN del molde (50 ng a 2 jg ) se añadió a la mezcla, se mezcló minuciosamente, la duración de vórtice no fue más de 5 segundos, se centrifugó poco tiempo para recoger el líquido residual en los lados del tubo, se incubó a 37 °C durante 60 minutos. La primera hebra del ADNc producido por transcripción inversa se utilizó para la posterior reacción de PCR.
Los cebadores usados en la reacción PCR se muestran en la tabla 1.
Tabla 1 Cebadores ara la PCR
Figure imgf000010_0001
Cuando se usaron cebadores, se pudo usar cualquier cebador cadena arriba de los cebadores de VH con cualquier cebador cadena abajo; del mismo modo, también se pudo usar cualquier cebador cadena arriba de los cebadores de VL con cualquier cebador cadena abajo. La banda diana obtenida mediante la amplificación por la PCR se clonó en el vector pGEM-T. Se recogió un solo clon para la secuenciación del ADN.
Ejemplo 2. Preparación de anticuerpo monoclonal quimérico anti-IL-17A humana
Se clonaron la secuencia de ácido nucleico que codificaba la cadena ligera (la longitud completa de la cadena ligera fue el SEQ ID NO: 7 unida al SEQ ID NO: 9) y la cadena pesada (la longitud completa de la cadena pesada fue el SEQ ID NO: 8 unida al SEQ ID NO: 10) de anticuerpo anteriormente mencionada en un vector X0GC de expresión en eucariotas (en donde la secuencia de ácido nucleico de longitud completa del anticuerpo se expone en el SEQ ID NO: 23, la secuencia de ácido nucleico de longitud completa de la cadena pesada del anticuerpo se expone en el SEQ ID NO: 24) y después se transfectó el vector de expresión en una línea celular 293F (células FreeStyle™ 293F, número de catálogo R79007, Invitrogen). Se inocularon las células un día antes de la transfección. Las células se recogieron por centrifugación en el día de la transfección. Las células se resuspendieron en medio de expresión FreeStyle™ 293 fresco (Medio de expresión FreeStyle™ 293, número de catálogo 12338001, Gibco), la densidad celular fue de 200 * 105 células/ml. Se añadió plásmido según el volumen de transfección, la concentración final fue de 36,67 |jg/ml, se mezcló cuidadosamente; después, se añadió PEI lineal (polietilenimina, lineal, P.M. 25000, número de catálogo 43896, Alfa Aesar), la concentración final fue de 55 jg/ml, se mezcló cuidadosamente. Posteriormente, se colocaron las células en un agitador a 120 rpm y se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Después, se añadió un volumen de medio fresco de 19 veces el volumen de transfección. Se continuó incubando a 37 °C en un agitador a 120 rpm. El sobrenadante de cultivo celular transfectado durante 5 a 6 días se recogió por centrifugación.
La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo obtenido mediante la amplificación por la PCR se expone en el SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo se expone en el SEQ iD NO: 8. La secuencia de la región determinante de la complementariedad puede obtenerse excluyendo la secuencia de la región marco de la secuencia de la región variable de ratón; en donde las secuencias de aminoácidos de las tres regiones determinantes de la complementariedad, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 de la cadena ligera se exponen en los SEQ ID NO: 1, 2 y 3, respectivamente; las secuencias de aminoácidos de las tres regiones determinantes de la complementariedad, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 de la cadena pesada se exponen en los SEQ ID NO: 4, 5 y 6, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena ligera del anticuerpo se expone en el SEQ ID NO: 9 y la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada del anticuerpo se expone en el SEQ ID NO: 10. Se clonaron la secuencia de ácido nucleico que codificaba la cadena ligera (la longitud completa de la cadena ligera fue el SEQ ID NO: 7 unida al SEQ ID NO: 9) y la cadena pesada (la longitud completa de la cadena pesada fue el SEQ ID NO: 8 unida al SEQ ID NO: 10) de anticuerpo anteriormente mencionada en un vector X0GC de expresión en eucariotas (en donde la secuencia de ácido nucleico de longitud completa del anticuerpo se expone en el SEQ ID NO: 23, la secuencia de ácido nucleico de longitud completa de la cadena pesada del anticuerpo se expone en el SEQ ID NO: 24) y después se transfectó el vector de expresión en una línea celular 293F (células FreeStyle™ 293-F, número de catálogo R79007, Invitrogen). Las células se subcultivaron un día antes de la transfección. En el día de la transfección, las células se recogieron por centrifugación y después se resuspendieron en medio de expresión FreeStyle™ 293 fresco (Medio de expresión FreeStyle™ 293, número de catálogo 12338001, Gibco) a una densidad de 200*105 células/ml. Los plásmidos se añadieron basándose en el volumen de transfección hasta una concentración final de 36,67 jg/ml, se mezclaron cuidadosamente; después, se añadió PEI lineal (polietilenimina, lineal, P.M. 25000, número de catálogo 43896, Alfa Aesar) a una concentración final de 55 jg/ml, se mezcló cuidadosamente. Posteriormente, se colocaron las células en un agitador a 120 rpm y se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Después, se añadió un volumen de medio fresco de 19 veces el volumen de transfección y se continuó cultivando las células a 37 °C en un agitador a 120 rpm. El sobrenadante de cultivo de 5 a 6 días de transfección se recogió por centrifugación.
Ejemplo 3. Cinética de la unión del anticuerpo monoclonal quimérico anti-IL-17A humana a IL-17A humana
La cinética de la unión del anticuerpo monoclonal quimérico anti-IL-17A humana al antígeno de IL-17A humana se detectó usando un instrumento Biacore 3000. El instrumento utiliza una técnica óptica de resonancia de plasmón superficial para detectar la asociación y disociación entre una molécula acoplada a una placa sensora y un analito. Se usaron chips CM5 (GE Healthcare, BR-1000-12). Un breve procedimiento del experimento fue como se expone a continuación: se disolvió IL-17A humana en tampón de acetato de sodio (pH 5,0) y se acopló al chip CM por inyección a una velocidad de 10 jl/min. Se inyectó etanolamina 1 M a una velocidad de 10 jl/min para bloquear. En la fase de asociación, se inyectaron, respectivamente, diferentes concentraciones de anticuerpo monoclonal quimérico anti-IL-17A humana y de control a una velocidad de 30 jl/min durante 180 segundos y durante la fase de disociación, se inyectó tampón PBS a una velocidad de 30 jl/min durante 600 segundos. Para la regeneración, se usó solución de glicina 10 mM (pH 2,0). Se analizaron y calcularon las constantes de velocidad de asociación y de velocidad de disociación mediante el programa de control Biacore 3000. La constante de velocidad de asociación, la constante de velocidad de disociación y la constante de disociación en equilibrio del anticuerpo quimérico anti-IL-17A humana se muestran en la tabla 2. En comparación con secukinumab, el mAb anti-IL-17A humana tiene una menor constante de disociación en equilibrio, una afinidad más fuerte, específicamente tras la unión al antígeno IL-17A, se pudo mantener el estado de unión durante un tiempo más prolongado y no es fácil de disociar, lo que contribuye a sus funciones biológicas.
Tabla 2. Cinética de unión del anticuer o uimérico anti-IL-17A humana a IL-17A humana
Figure imgf000011_0001
continuación
Figure imgf000012_0001
Ejemplo 4. Especificidad de especie y especificidad de unión del anticuerpo monoclonal anti-IL-17A humana Se determinó la especificidad de especie del anticuerpo monoclonal quimérico anti-IL-17A humana mediante ELISA. Se recubrieron IL-17A humana, IL-17A de mono IL-17A de rata e IL-17A de ratón recombinantes (todas adquiridas de Sino Biological, Inc.) en una placad de ELISA de alta absorción de 96 pocillos con una solución de tampón carbonato a pH 9,6, la concentración de recubrimiento fue de 1 jg/ml, la cantidad de recubrimiento fue de 100 j l por pocillo y el recubrimiento se llevó a cabo a 4 °C durante una noche. La placa se lavó cinco veces con PBST y se bloqueó con 300 jl/pocillo de PBST que contenía BSA al 1 % y después se incubó a 25 °C durante 1 hora. La placa se lavó cinco veces con PBST. Se añadieron el control y la muestra de anticuerpo monoclonal quimérico anti-lL-17A humana diluidos en serie en PBST que contenía BSA al 1 %, 100 j l por pocillo, se incubaron a 25 °C durante 1 hora. La placa se lavó cinco veces con PBST. A continuación, se añadió anticuerpo anti-IgG humana marcado con peroxidasa de rábano picante (Chemicon, número de catálogo AP309P) diluido a 1:2000 en PBST que contenía BSA al 1 %, 100 j l por pocillo, se incubaron a 25 °C durante 1 hora. La placa se lavó cinco veces con PBST. se añadieron 100 jl/pocillo de sustrato colorimétrico TMB y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se detuvo el revelado del color añadiendo 100 jl/pocillo de H2SO41 M. Se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector de microplacas.
Se determinó la especificidad de unión del anticuerpo monoclonal quimérico anti-IL-17A humana mediante ELISA. IL-17A recombinante humana, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, IL-17F, IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-21, IL-22, IL-23, IFN-g y TNFa (adquiridos de Sino Biological Inc. o R&D systems) se recubrieron en una placa de ELISA de 96 pocillos de alta absorción con una solución de tampón carbonato a pH 9,6, la concentración de recubrimiento fue de 1 jg/ml, la cantidad de recubrimiento fue de 100 j l por pocillo y el recubrimiento se llevó a cabo a 4 °C durante una noche. La placa se lavó cinco veces con PBST y se bloqueó con 300 jl/pocillo de PBST que contenía BSA al 1 % y se incubó a 25 °C durante 1 hora. La placa se lavó cinco veces con PBSt . Se añadieron el control y la muestra de anticuerpo monoclonal quimérico anti-IL-17A humana diluidos en PBST que contenía BSA al 1%, 100 j l por pocillo, se incubaron a 25 °C durante 1 hora. La placa se lavó cinco veces con PBST. A continuación, se añadió anticuerpo anti-IgG humana marcado con peroxidasa de rábano picante (Chemicon, número de catálogo AP309P) diluido a 1:2000 en PBST que contenía BSA al 1 %, se añadieron 100 pl a cada pocillo, se incubaron a 25 °C durante 1 hora. La placa se lavó cinco veces con PBST. se añadieron 100 jl/pocillo de sustrato colorimétrico TMB y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se detuvo el revelado del color añadiendo 100 jl/pocillo de H2SO41 M. Se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector de microplacas.
Se determinó la especificidad de unión del anticuerpo monoclonal quimérico anti-IL-17A humana mediante ELISA. IL-17A recombinante humana, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, IL-17F, IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-21, IL-22, IL-23, IFN-g y TNFa (adquiridos de Sino Biological Inc. o R&D systems) se recubrieron en una placa de ELISA de 96 pocillos de alta absorción con una solución de tampón carbonato a pH 9,6, la concentración de recubrimiento fue de 1 jg/ml, la cantidad de recubrimiento fue de 100 j l por pocillo y el recubrimiento se llevó a cabo a 4 °C durante una noche. Se lavó cinco veces con PBST. Se bloqueó con 300 jl/pocillo de PBST que contenía BSA al 1 % y se incubó a 25 °C durante 1 hora. Se lavó cinco veces con PBST. Se añadieron el control y la muestra de anticuerpo monoclonal quimérico anti-IL-17A humana diluidos en PBST que contenía BSA al 1 %, se añadieron 100 pl a cada pocillo, se incubaron a 25 °C durante 1 hora. Se lavó cinco veces con PBST. A continuación, se añadió anticuerpo anti-IgG humana marcado con peroxidasa de rábano picante (Chemicon, número de catálogo AP309P) diluido a 1:2000 en PBST que contenía bSa al 1 %, se añadieron 100 pl a cada pocillo, se incubaron a 25 °C durante 1 hora. Se lavó cinco veces con PBST. Se añadieron 100 jl/pocillo de sustrato colorimétrico de TMB, se reveló a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se detuvo el revelado del color añadiendo 100 jl/pocillo de H2SO4 1 M. Se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector de microplacas.
El resultado se muestra en la Figura 3. El anticuerpo monoclonal quimérico anti-IL-17A humana se unión a IL-17A de ser humano y de mono, pero no a IL-17A de rata o ratón, lo que indica que el anticuerpo es específico de especie. Además, como se muestra en la figura 4, el anticuerpo monoclonal quimérico anti-IL-17A humana también tiene una fuerte especificidad de unión, pero solo se unión a IL-17A pero no a otras citocinas de la familia de IL-17 o a citocinas no relacionadas.
Ejemplo 5. Actividad de neutralización del anticuerpo monoclonal quimérico anti-IL-17A humana in vitro Se diluyó la muestra de anticuerpo anti-IL-17A humana en medio DMEM completo (GIBCO, número de catálogo 11995-073) que contenía FBS al 10 % (Hyclone, número de catálogo SH30084.03). La concentración de partida del anticuerpo fue de 160 nM y la concentración final fue de 40 nM en el medio. Se sometió al anticuerpo a una dilución seriada de factor 5 y después se añadió a una placa de cultivo celular, 50 j l por pocillo. Se diluyeron 20 ng/ml de IL-17A humana (concentración final de 5 ng/ml) con el mismo medio completo y se añadió a la placa de cultivo a razón de 50 |jl por pocilio. La placa se incubó a 37 °C durante 1 hora en una incubadora con CO2 al 5 %. Las células HFF-1 se resuspendieron en medio completo y se sembraron en una placa de cultivo celular de 96 pocillos a razón de 100 j l por pocillo, 5000 células por pocillo. Las células se incubaron a 37 °C durante 24 horas en una incubadora con CO2 al 5 %. Tras completarse la incubación, la placa de cultivo celular se centrifugó a 250*g durante 5 minutos y se retiró el sobrenadante de cultivo y se detectó el nivel de IL-6 humana usando un kit ELISA para IL-6 humana (R&D systems, número de catálogo S6050) siguiendo las instrucciones.
El resultado se muestra en la Figura 5. En comparación con secukinumab, el anticuerpo monoclonal quimérico anti-IL-17A humana tiene una actividad de neutralización in vitro de IL-17A humana más fuerte y un mejor efecto en la inhibición de la secreción estimulada por IL-17A de IL-6 humana por células HFF-1.
Ejemplo 6. Actividad de neutralización del anticuerpo monoclonal quimérico anti-IL-17A humana in vivo Como animales experimentales, se usaron ratones BABL/c hembra de 6 a 8 semanas de edad, adquiridos de Beijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd. Una semana después de aclimatar a los ratones al ambiente, se dividió de manera aleatoria a los ratones en grupos, 6 por grupo. Se administró a cada grupo anticuerpo monoclonal quimérico anti-IL-17A humana o el anticuerpo monoclonal de control, Secukinumab, a tres dosis de 0,7 nmol/kg, 7 nmol/kg o 70 nmol/kg, inyección intravenosa, una sola administración. Una hora después de la administración, se inyectó por vía subcutánea IL-17A humana, 10 jg por ratón. Dos horas más tarde, se recogió una muestra de sangre retroorbital sin anticoagulación y se dejó reposar la muestra de sangre a temperatura ambiente durante 30 minutos hasta 1 hora. Tras la coagulación de la sangre, se centrifugó la muestra a 3000 rpm durante 10 minutos para obtener una muestra de suero. La concentración de CXCL1 de ratón (ligando de quimiocina de motivo C-X-C, también conocido como KC) en el suero se determinó de acuerdo con las instrucciones usando un kit ELISA para CXCL1 de ratón (RayBiotech, número de catálogo ELM-KC).
El resultado se muestra en la Figura 6. El anticuerpo monoclonal quimérico anti-IL-17A humana inhibió la secreción de CXCL1 en ratones estimulados con IL-17A humana, mostrando una actividad más fuerte que el anticuerpo monoclonal de control, Secukinumab.
Ejemplo 7. Estudio farmacocinético del anticuerpo monoclonal quimérico anti-IL-17A humana en ratas Como animales experimentales, se usaron ratas SD hembra de 6 a 8 semanas de edad, adquiridos de Beijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd. Una semana después de aclimatar a las ratas al ambiente, se dividió de manera aleatoria a las ratas en grupos, 3 ratas por grupo. Se administraron, respectivamente, anticuerpo monoclonal quimérico anti-IL-17A humana y anticuerpo monoclonal de control, Secukinumab, a una dosis de 20 nmol/kg mediante inyección intravenosa, una sola dosis. A los 0, 5 minutos, 30 minutos, 1 hora, 4 horas, 8 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 120 horas, 168 horas, 216 horas, 264 horas, 312 horas después de la administración, se recogió la muestra de sangre retroorbital sin anticoagulación y se dejó reposar la muestra de sangre a temperatura ambiente durante 30 minutos hasta 1 hora; tras la coagulación, se centrifugó la muestra de sangre a 3.000 rpm durante 10 minutos, la muestra de suero obtenida se congeló a -80 °C y se almacenó para su ensayo. Se determinaron mediante ELISA las concentraciones del anticuerpo monoclonal quimérico anti-IL-17A humana y del anticuerpo monoclonal de control, Secukinumab. En resumen, se recubrió la proteína IL-17A humana recombinante en una placa de ELISA de alta absorción con una solución de tampón carbonato con pH 9,6 a 4 °C durante una noche. La placa se lavó con PBST. Para prevenir la unión no específica, se bloqueó la placa con PBST que contenía leche en polvo desgrasada al 5 % y después se lavó con PBST. A continuación, se añadió la muestra de suero que se iba a ensayar diluida con PBST que contenía suero de rata mezclado al 10 % y BSA al 1 % y se incubó a 25 °C durante 1 hora y la placa se lavó con PBST. Se añadió anticuerpo anti-IgG humana marcado con peroxidasa de rábano picante (Chemicon, número de catálogo AP309P) en PBST que contenía leche en polvo desnatada al 5 %, se incubó a 25 °C durante 1 hora, después, se lavó la placa con PBST. Por último, el revelado del color se llevó a cabo usando el sustrato colorimétrico TMB a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se detuvo el revelado del color añadiendo 100 jl/pocillo de H2SO4 1 M. Se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector de microplacas.
El resultado se muestra en la Figura 7. Una sola dosis por inyección intravenosa de 20 nmol/kg del anticuerpo monoclonal quimérico anti-IL-17A humana o del anticuerpo monoclonal de control, Secukinumab, mostraron curvas de concentración-tiempo y características farmacocinéticas similares en ratas. Los parámetros farmacocinéticos del anticuerpo monoclonal quimérico anti-IL-17A humana son los siguientes: la semivida t-i/2 fue de 458 horas; el área bajo la curva de concentración-tiempo ABCúltima fue de 44.286 nM.h; la concentración inicial estimada C0 fue de 413 nM; el volumen de distribución aparente Vd fue de 115ml/kg, la velocidad de eliminación CL fue de 0,17 ml/h/kg; el tiempo medio de residencia MRTúltimo fue de 140 horas.
Ejemplo 8. Preparación de anticuerpo monoclonal humanizado anti-IL-17A humana
Se obtuvo la forma humanizada del anticuerpo anti-IL-17 de acuerdo con el método de Leung et al. (1995, Molecule Immunol 32: 1413-27).
Se seleccionó de la base de datos Germline el molde humanizado que coincide mejor con la región no CDR murina. El molde para la región variable de cadena pesada fue IGVH4-59*01 y la secuencia se expone en el SEQ ID NO: 35. El molde para la región variable de cadena ligera fue IGKV2-30*02 y la secuencia se expone en el SEQ ID NO: 36. Se injertó la región CDR del anticuerpo murino en el molde humanizado seleccionado, reemplazando la región CDR del molde humano. La región variable de la cadena pesada del anticuerpo humanizado injertado obtenido tiene una secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 37 y la región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado injertado tiene una secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 38. Se sometieron a retromutación nueve posiciones seleccionadas mediante alineamiento de secuencias, incluyendo 4 posiciones en las cadenas pesadas: L4V, I49M, V68I, V72R y 5 posiciones en las cadenas ligeras: D1I, V2I, F41Y, R51L, Y92F. Se construyeron diferentes secuencias humanizadas reduciendo el número de retromutaciones y las secuencias de cadena pesada y las secuencias de la región variable de cadena ligera se muestran en la tabla 3. La región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 27­ 34) del anticuerpo monoclonal anti-IL-17A humanizado se unió a la región constante de cadena pesada (SEQ ID NO: 10) del anticuerpo IgG1 humano para obtener la secuencia de longitud completa de la cadena pesada. La región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 19-26) del anticuerpo monoclonal anti-IL-17A humanizado se unió a la región constante de cadena ligera (SEQ ID NO: 9) del anticuerpo kappa humano para obtener la secuencia de longitud completa de la cadena ligera. Se combinó la secuencia de longitud completa de la cadena pesada con la secuencia de longitud completa de la cadena ligera para obtener una secuencia de longitud completa del anticuerpo humanizado. La secuencia de longitud completa se digirió con EcoRI y HindIII y después se insertó en el vector X0GC.
Tabla 3. Las secuencias de la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado anti-IL-17A humana
Figure imgf000014_0001
Ejemplo 9. Actividad de unión a antígeno del anticuerpo monoclonal humanizado anti-IL-17A humana
Se determinó mediante ELISA la actividad de unión a antígeno del anticuerpo monoclonal humanizado anti-IL-17A humana. Se recubrió en una placa de ELISA de alta absorción de 96 pocillos IL-17A humana recombinante (adquirida de Sino Biological Inc.) con una solución de tampón carbonato a pH 9,6, la concentración de recubrimiento fue de 1 pg/ml, la cantidad de recubrimiento fue de 100 pl por pocillo y el recubrimiento se llevó a cabo a 4 °C durante una noche. La placa se lavó cinco veces con PBST y se bloqueó con 300 pl/pocillo de PBST que contenía BSA al 1 % y se incubó a 25 °C durante 1 hora. La placa se lavó cinco veces con PBST. Se añadieron el control y la muestra de anticuerpo monoclonal quimérico anti-IL-17A humana diluidos en PBST que contenía BSA al 1 %, 100 pl por pocillo, se incubaron a 25 °C durante 1 hora. La placa se lavó cinco veces con PBST. A continuación, se añadió anticuerpo anti-IgG humana marcado con peroxidasa de rábano picante (Chemicon, número de catálogo AP309P) diluido a 1:2000 en PBST que contenía BSA al 1 %, se añadieron 100 pl a cada pocillo, se incubaron a 25 °C durante 1 hora. La placa se lavó cinco veces con PBST. se añadieron 100 pl/pocillo de sustrato colorimétrico TMB y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se detuvo el revelado del color añadiendo 100 pl/pocillo de H2SO41 M. Se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector de microplacas.
El resultado se muestra en la Figura 8. Todos los anticuerpos monoclonales humanizados anti-IL-17A humana, AS15799, AS15802, AS15803, AS15805, AS15810, AS15815 y AS15820 se pudieron unir a IL-17A humana con una elevada actividad de afinidad.
Ejemplo 10. Actividad de neutralización del anticuerpo monoclonal humanizado anti-IL-17A humana in vitro Se diluyó la muestra de anticuerpo anti-IL-17A humana en medio DMEM completo (GIBCO, número de catálogo 11995-073) que contenía FBS al 10 % (Hyclone, número de catálogo SH30084.03). La concentración de partida del anticuerpo fue de 160 nM y la concentración final fue de 40 nM en el medio. Se sometió al anticuerpo a una dilución seriada de factor 5 y después se añadió a una placa de cultivo celular, 50 pl por pocillo. Se diluyeron 20 ng/ml de IL-17A humana (concentración final de 5 ng/ml) con el mismo medio completo y se añadió a la placa de cultivo a razón de 50 pl por pocillo. La placa se incubó a 37 °C durante 1 hora en una incubadora con CO2 al 5 %. Las células HFF-1 se resuspendieron en medio completo y se sembraron en una placa de cultivo celular de 96 pocillos a razón de 100 pl por pocillo, 5000 células por pocillo. Las células se incubaron a 37 °C durante 24 horas en una incubadora con CO2 al 5 %. Tras completarse la incubación, la placa de cultivo celular se centrifugó a 250*g durante 5 minutos y se retiró el sobrenadante de cultivo y se detectó el nivel de IL-6 humana usando un kit ELISA para IL-6 humana (R&D systems, número de catálogo S6050) siguiendo las instrucciones.
El resultado se muestra en la Figura 9. En comparación con secukinumab, los anticuerpos monoclonales humanizados anti-IL-17A humana, AS15799, AS15802, AS15803, AS15805, AS15810, AS15815 y AS15820 tienen una actividad de neutralización de IL-17A más fuerte y un efecto más fuerte en la inhibición de la secreción de IL-6 humana estimulada por IL-17A humana por células HFF-1 in vitro.
Ejemplo 11. Detección de la pureza y la estabilidad térmica del anticuerpo monoclonal humanizado anti-IL-17a humana mediante cromatografía líquida de alto rendimiento de exclusión por tamaños (SE-HPLC) Se usó una columna de cromatografía TSKgel SuperSW3000 (número de catálogo 0018675). La fase móvil fue 0,1 mol/l de tampón fosfato (NaH2PO4-Na2HPO4), 0,1 mol/l de tampón de sulfato de sodio, pH 6,7; el caudal fue de 0,35 ml/min; la temperatura de la columna fue de 25 °C; la temperatura del conjunto de la muestra fue de 4 °C; la longitud de onda de detección fue de 280 nm. La muestra se diluyó con tampón de muestra a 1 mg/ml y el volumen de inyección fue de 5 pl. El resultado del experimento se procesó mediante un sistema de estación de trabajo Agilent High Performance Liquid Chromatograph 1260 y la pureza se calculó mediante el porcentaje del pico principal usando el método de normalización del área. Se sometió al anticuerpo monoclonal humanizado anti-lL-17A al ensayo de pureza por SE-HPLC. Para determinar la estabilidad térmica de estos anticuerpos monoclonales, se colocaron las muestras en condiciones de alta temperatura de 40 °C y se sometió a las muestras al ensayo de SE-HPLC en la semana 2 y la semana 4, respectivamente, para observar la estabilidad térmica y el resultado se muestra en la tabla 4 a continuación. Todos los anticuerpos humanizados anti-IL-17A mostraron una buena y considerable estabilidad.
Tabla 4. Estabilidad térmica del anticuer o monoclonal humanizado anti-IL-17A humana a 40 °C mediante SE-HPLC
Figure imgf000015_0001
Ejemplo 12. Determinación del valor de Tm del anticuerpo humanizado monoclonal anti-IL-17A humana La temperatura de fusión (Tm) del anticuerpo monoclonal humanizado anti-IL-17A humana se determinó mediante fluorometría diferencial de barrido (DSF). La DSF es un método para detectar el proceso de desnaturalización térmica de las proteínas en una muestra usando el cambio en la intensidad de fluorescencia del indicador fluorescente para determinar la temperatura de desnaturalización de la proteína. El reactivo usado fue el colorante fluorescente de proteínas SYPRO Orange (Sigma-Aldrich, EE.UU, número de catálogo S5692; concentración 5000x, en DMSO). Se adquirió una máquina de PCR en tiempo real AB 7500 de Applied Biosystems, Inc., EE.UU. El colorante fluorescente de proteínas se diluyó a 1:50 con tampón de muestra y se mezcló 1 pl del colorante diluido con 19 pl de solución de proteína, de tal forma que la dilución final del colorante fluorescente fue de 1:1000. Se añadió el colorante fluorescente diluido a una placa de 96 pocillos y se emplearon para cada muestra tres pocillos paralelos. Se selló la placa con una película sellante óptica, se centrifugó a 1000 rpm durante 2 minutos para retirar las burbujas de aire. El programa de la RT-PCR fue como sigue: la curva de fusión se ajustó en modo continuo, el intervalo de temperatura de barrido fue de 25 a 99 °C, la velocidad de calentamiento fue del 1 % (aproximadamente 1 °C/min) y después 25 °C durante 2 min. Los datos se recogieron durante el calentamiento, el grupo indicador se configuró como “ROX”, el grupo de inactivación se configuró como “None” y el volumen de reacción fue de 20 pl. La concentración de la muestra fue de 1 mg/ml y la solución de referencia fue tampón de muestra. Se representaron las curvas de fluorescencia y la primera derivada usando el programa informático Protein Thermal ShiftTM v1.3. En el ensayo de DSF, el punto medio de la temperatura de la primera transición de la proteína se considera normalmente como la temperatura de desnaturalización de la estabilidad térmica de la proteína. Se midieron los valores de Tm del anticuerpo monoclonal humanizado anti-IL-17A humana y el resultado se muestra en la tabla 5 a continuación. Todos los anticuerpos monoclonales humanizados anti-IL-17A humana tienen un valor de Tm bastante bueno.
Tabla 5. Valor de Tm del anticuer o humanizado monoclonal anti-IL-17A humana
Figure imgf000016_0002
Ejemplo 13. Detección de isómeros de carga del anticuerpo monoclonal humanizado anti-IL-17A humana mediante cromatografía de intercambio catiónico (CEX)
Se usó una columna de cromatografía de intercambio catiónico MabPac SCX-10, 4mm * 250 mm (número de catálogo: 78655). Como fase móvil A se usó 20 mmol/l de ácido 2-(N-morfolin)etanosulfónico (MES) (pH 5,6) y 60 mmol/l de cloruro de sodio; como fase móvil B se usó 20 mmol/l de MES (pH 5,6) y 300 mmol/l de cloruro de sodio. El caudal fue de 0,5 ml/min; la temperatura de la columna fue de 25 °C; la temperatura del conjunto de la muestra fue de 4 °C; la longitud de onda de detección fue de 280 nm; el volumen de carga de muestra fue de 50 pl (1 mg/ml); la elución se llevó a cabo con un gradiente lineal del 5 al 50 % a lo largo de 60 minutos. El resultado del experimento se procesó mediante un sistema de estación de trabajo Agilent High Performance Liquid Chromatograph 1260 y el porcentaje del área máxima se calculó mediante el método de normalización del área. Los anticuerpos monoclonales humanizados anti-IL-17A humana se sometieron a detección por CEX. Para determinar la estabilidad química de estos anticuerpos monoclonales, se pusieron las muestras anteriores en condiciones de alta temperatura de 40 °C y se tomaron muestras en la semana 2 y la semana 4, respectivamente, para la detección por CEX y se observaron los cambios en la proporción de variantes de carga. En la Tabla 6 se muestra el resultado. Todos los anticuerpos humanizados anti-IL-17A humana tienen una proporción relativamente baja de variantes de carga.
Tabla 6. Cambios en las variantes de carga del anticuerpo monoclonal humanizado anti-IL-17A humana a 40 °C mediante CEX
Figure imgf000016_0003
Ejemplo 14. Estabilidad del anticuerpo monoclonal humanizado anti-IL-17A humana en condiciones de bajo pH para la inactivación de virus
Se ajustaron 200 pg de la muestra de ensayo a pH 3,4 ± 0,05 con 1 mol/l de solución madre de ácido cítrico y la concentración final de la muestra fue de 1 mg/ml. Se dejó la muestra a temperatura ambiente y se tomaron muestras a las 0, 1, 2, 4 y 6 horas, respectivamente y el pH se ajustó a 7,5 con 2 mol/l de solución madre de Tris-HCl a pH 9,5. Las muestras se analizaron mediante el método SEC anterior y el resultado se muestra en la tabla 7. El anticuerpo humanizado anti-IL-17A humana pudo tolerar las condiciones de bajo pH para la inactivación de virus durante al menos 6 horas, lo que indica una buena estabilidad.
Tabla 7. Estabilidad del anticuerpo monoclonal humanizado anti-IL-17A humana en condiciones de bajo pH detectada mediante SE-HPLC
Figure imgf000016_0001
Ejemplo 15. Estudio farmacocinético del anticuerpo monoclonal humanizado anti-IL-17A humana en ratas
Como animales experimentales, se usaron ratas SD hembra de 6 a 8 semanas de edad, adquiridos de Beijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd. Una semana después de aclimatar a las ratas al ambiente, se dividió de manera aleatoria a las ratas en grupos, 3 ratas por grupo. Se administraron, respectivamente, anticuerpo monoclonal quimérico anti-IL-17A humana y anticuerpo de control, a una dosis de 15 nmol/kg mediante inyección subcutánea, una sola administración. A las 0, 1 hora, 4 horas, 8 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 120 horas,

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo capaz de unirse específicamente a IL-17A, o a un fragmento funcional del mismo capaz de unirse específicamente a IL-17A, en donde el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo comprenden una cadena ligera y una cadena pesada;
la cadena ligera comprende una CDR de cadena ligera que consiste en CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3; la cadena pesada comprende una CDR de cadena pesada que consiste en CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3;
las secuencias de aminoácidos de las CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 se exponen respectivamente en los SEQ ID NO: 1,2 y 3; las secuencias de aminoácidos de las CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 se exponen respectivamente en los SEQ ID NO: 4, 5 y 6;
preferentemente, el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo incluyen un anticuerpo quimérico de IL-17A o un fragmento funcional del mismo, y un anticuerpo humanizado de IL-17A o un fragmento funcional del mismo.
2. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de región constante de una cualquiera seleccionada del grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE y IgD humanas.
3. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según las reivindicaciones 1o 2, en donde el fragmento funcional comprende uno o más seleccionado del grupo que consiste en F(ab')2, Fab', Fab, Fv, scFv, anticuerpo biespecífico y unidad de reconocimiento mínima de anticuerpo.
4. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde las secuencias de aminoácidos de región variable de cadena ligera y de región variable de cadena pesada del anticuerpo quimérico de IL-17A o del fragmento funcional del mismo se exponen respectivamente en los SEQ ID NO: 7 y s Eq ID NO: 8;
preferentemente, la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena ligera y de la región constante de cadena pesada del anticuerpo quimérico de IL-17A y del fragmento funcional del mismo se exponen respectivamente en los SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10.
5. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la región marco de cadena ligera del anticuerpo humanizado de IL-17A o del fragmento funcional del mismo comprende FR-L1, FR-L2, FR-L3 y FR-L4, y la región marco de cadena pesada del anticuerpo humanizado de IL-17A o del fragmento funcional del mismo comprende FR-H1, FR-H2, FR-H3 y FR-H4;
la FR-L1 se selecciona de la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 11 y la secuencia de aminoácidos que tiene la siguiente sustitución o una combinación de las mismas:
el 1er aminoácido D está reemplazado por I;
el 2° aminoácido V está reemplazado por I;
la FR-L2 se selecciona de la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 12 y la secuencia de aminoácidos que tiene la siguiente sustitución o una combinación de las mismas:
el 4° aminoácido F está reemplazado por Y;
el 14° aminoácido R está reemplazado por L;
la FR-L3 se selecciona de la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 13 y la secuencia de aminoácidos que tiene la siguiente sustitución o una combinación de las mismas:
el 35° aminoácido Y está reemplazado por F;
la FR-L4 se selecciona de la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 14;
la FR-H1 se selecciona de la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 15 y la secuencia de aminoácidos que tiene la siguiente sustitución o una combinación de las mismas:
el 4° aminoácido L está reemplazado por V;
la FR-H2 se selecciona de la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 16 y la secuencia de aminoácidos que tiene la siguiente sustitución o una combinación de las mismas:
el 15° aminoácido I está reemplazado por M;
la FR-H3 se selecciona de la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 17 y la secuencia de aminoácidos que tiene la siguiente sustitución o una combinación de las mismas:
el 2° aminoácido V está reemplazado por I;
el 6° aminoácido V está reemplazado por R;
la FR-H4 se selecciona de la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 18;
preferentemente, la secuencia de región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado de IL-17A o del fragmento funcional del mismo es una seleccionada de los SEQ ID NO: 19-26;
preferentemente, la secuencia de región variable de cadena pesada del anticuerpo humanizado de IL-17A o del fragmento funcional del mismo es una seleccionada de los SEQ ID NO: 27-34;
más preferentemente, la secuencia de región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado de IL-17A o del fragmento funcional del mismo se expone en el SEQ ID NO: 19; la secuencia de región variable de cadena pesada correspondiente se expone en el SEQ ID NO: 27;
como alternativa, la secuencia de región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado de IL-17A o del fragmento funcional del mismo se expone en el SEQ ID NO: 20; la secuencia de región variable de cadena pesada correspondiente se expone en el SEQ ID NO: 28;
como alternativa, la secuencia de región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado de IL-17A o del fragmento funcional del mismo se expone en el SEQ ID NO: 21; la secuencia de región variable de cadena pesada correspondiente se expone en el SEQ ID NO: 29;
como alternativa, la secuencia de región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado de IL-17A o del fragmento funcional del mismo se expone en el SEQ ID NO: 22; la secuencia de región variable de cadena pesada correspondiente se expone en el SEQ ID NO: 30;
como alternativa, la secuencia de región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado de IL-17A o del fragmento funcional del mismo se expone en el SEQ ID NO: 22; la secuencia de región variable de cadena pesada correspondiente se expone en el SEQ ID NO: 31;
como alternativa, la secuencia de región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado de IL-17A o del fragmento funcional del mismo se expone en el SEQ ID NO: 23; la secuencia de región variable de cadena pesada correspondiente se expone en el SEQ ID NO: 32;
como alternativa, la secuencia de región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado de IL-17A o del fragmento funcional del mismo se expone en el SEQ ID NO: 24; la secuencia de región variable de cadena pesada correspondiente se expone en el SEQ ID NO: 33;
como alternativa, la secuencia de región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado de IL-17A o del fragmento funcional del mismo se expone en el SEQ ID NO: 25; la secuencia de región variable de cadena pesada correspondiente se expone en el SEQ ID NO: 32;
como alternativa, la secuencia de región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado de IL-17A o del fragmento funcional del mismo se expone en el SEQ ID NO: 26; la secuencia de región variable de cadena pesada correspondiente se expone en el SEQ ID NO: 34;
más preferentemente, las secuencias de aminoácidos de la región constante de cadena ligera y de la región constante de cadena pesada del anticuerpo humanizado de IL-17A o del fragmento funcional del mismo se exponen respectivamente en los SEQ ID n O: 9 y SEQ ID NO: 10.
6. Una molécula de ácido nucleico aislada seleccionada de:
A) ADN o ARN, que codifican el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; y
B) un ácido nucleico complementario al ácido nucleico definido en A).
7. Una composición que comprende el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o un compuesto del anticuerpo o del fragmento funcional del mismo junto con otros componentes, como principio activo.
8. La composición según la reivindicación 7, en donde el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo están acoplados a al menos un agente de diagnóstico y/o un agente terapéutico formando un inmunoconjugado.
9. La composición según la reivindicación 8, en donde el gente de diagnóstico es uno o más seleccionado del grupo que consiste en un radionúclido, un agente de contraste radiactivo, un ion paramagnético, un metal, un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente, un agente de contraste de ultrasonidos y un fotosensibilizador;
preferentemente, el radionúclido es uno o más seleccionado del grupo que consiste en 110In, 111In, 177Lu, 18F, 52Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 86Y, 90Y, 89Zr, 94mTc, 94Tc, 99mTc, 120I, 123I, 124I, 125I, 131I, 154-158Gd, 32P, 11C, 13N, 15O, 186Re, 188Re, 51Mn, 52mMn, 55Co, 72As, 75Br, 76Br, 82mRb y 83Sr;
preferentemente, el ion paramagnético es uno o más seleccionado del grupo que consiste en cromo (III), manganeso (II), hierro (III), hierro (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (III), samario (III), iterbio (III), gadolinio (III), vanadio (II), terbio (III), disprosio (III), holmio (III) y erbio (III);
preferentemente, el marcador fluorescente es uno o más seleccionado del grupo que consiste en Alexa 350, Alexa 405, Alexa 430, Alexa 488, Alexa 555, Alexa 647, AMCA, aminoacridina, Bo DIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, 5-carboxi-4',5'-dicloro-2',7' dimetoxifluoresceína, 5-carboxi-2',4',5',7'-tetraclorofluoresceína, 5-carboxifluoresceína, 5-carboxirrodamina, 6-carboxirrodamina, 6-carboxitetrametilrodamina, Cascade Blue, Cy2, Cy3, Cy5, Cy7, 6-FAM, cloruro de danisilo, fluoresceína, HEX, 6-JOE, NBD (7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol), Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, ácido Itálico, ácido tereftálico, ácido isoftálico, violeta rápido de cresilo, violeta de cresilo, azul brillante de cresilo, ácido 4-aminobenzoico, eritrosina, ftalocianina, azometina, cianina, xantina, succinil fluoresceína, criptato de metal de tierras raras, tri-bipiridildiamina europio, compuesto o quelato de criptato de europio, diamina, dicianina, colorante azul La Jolla, aloficocianina, alococianina B, ficocianina C, ficocianina R, tiamina, R-ficoeritrina, C-ficocianina, ficoeritrina R, REG, verde de rodamina, isotiocianato de rodamina, rojo de rodamina, ROX, TAMRA, TET, TRIT (tetrametilrodamina isotiol), tetrametilrodamina y Texas Red.
10. La composición según las reivindicaciones 8 o 9, en donde el agente terapéutico es uno o más seleccionados del grupo que consiste en un anticuerpo desnudo, un agente citotóxico, un fármaco, un radionúclido, un átomo de boro, un inmunomodulador, un agente antiapoptótico, un agente terapéutico fotosensibilizador, un inmunoconjugado y un oligonucleótido;
preferentemente, el fármaco es uno o más seleccionados del grupo que consiste en dexametasona, diclofenaco, nabumetona, meloxicam, celecoxib, metotrexato, ciclofosfamida, azatioprina, ciclosporina A y vincristina; preferentemente, el oligonucleótido es uno o más seleccionados del grupo que consiste en ARNhc, miARN y ARNip;
preferentemente, el inmunomodulador es uno o más seleccionados del grupo que consiste en una citocina, una quimiocina, un factor de crecimiento de células madre, una linfotoxina, un factor hematopoyético, un factor estimulante de colonias (CSF), un interferón, una eritropoyetina, una trombopoyetina, una interleucina (IL), un factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), un factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y un factor de crecimiento de células madre;
preferentemente, el radionúclido es uno o más seleccionados del grupo que consiste en 111In, 111At, 177Lu, 211Bi, 212Bi, 213Bi, 211At, 62Cu, 67Cu, 90Y, 125I, 131I, 133I, 32P, 33P, 47Sc, 111Ag, 67Ga, 153Sm, 161Tb, 152Dy, 166Dy, 161Ho, 166Ho, 186Re, 188Re, 189Re, 211Pb, 212Pb, 223Ra, 225Ac, 77As, 89Sr, 99Mo, 105Rh, 149Pm, 169Er, 194Ir, 58Co, 80mBr, 99mTc, 103mRh, 109Pt, 119Sb, 189mOs, 192Ir, 219Rn, 215Po, 221Fr, 255Fm, 11C, 13N, 15O, 75Br, 198Au, 199Au, 224Ac, 77Br, 113mIn, 95Ru, 97Ru, 103Ru, 105Ru, 107Hg, 203Hg, 121mTe, 122mTe, 125mTe, 165Tm, 167Tm, 168Tm, 197Pt, 109Pd, 142Pr, 143Pr, 161Tb, 57Co, 58Co, 51Cr, 59Fe, 75Se, 201Tl, 76Br y 169Yb.
11. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad asociada a la sobreexpresión y/o la sobreliberación de IL-17A; en donde la enfermedad es una o más seleccionadas del grupo que consiste en inflamación de las vías respiratorias, asma, asma bronquial, asma alérgica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis pulmonar idiopática, artritis reumatoide, artrosis, espondilitis anquilosante, artritis psoriásica, psoriasis, esclerosis múltiple, esclerosis sistémica, lupus eritematoso sistémico, nefritis por lupus, esclerodermia, colitis ulcerosa, enfermedad inflamatoria del intestino, uveítis, gastritis asociada a Helicobacter pylori, osteoporosis, erosión ósea, absceso y adhesiones intraperitoneales, enfermedad de Addison, deficiencia de gamma globulina, alopecia areata, enfermedad celíaca, enfermedad de Chagas, enfermedad de Crohn, rechazo de aloinjerto, enfermedad de Behcet, septicemia, choque séptico o por endotoxinas e isquemia.
12. El anticuerpo capaz de unirse específicamente a IL-17A o al fragmento funcional de mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad asociada a la sobreexpresión y/o la sobreliberación de IL-17A en donde
la enfermedad es una o más seleccionadas del grupo que consiste en inflamación de las vías respiratorias, asma, asma bronquial, asma alérgica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis pulmonar idiopática, artritis reumatoide, artrosis, espondilitis anquilosante, artritis psoriásica, psoriasis, esclerosis múltiple, esclerosis sistémica, lupus eritematoso sistémico, nefritis por lupus, esclerodermia, colitis ulcerosa, enfermedad inflamatoria del intestino, uveítis, gastritis asociada a Helicobacter pylori, osteoporosis, erosión ósea, absceso y adhesiones intraperitoneales, enfermedad de Addison, deficiencia de gamma globulina, alopecia areata, enfermedad celíaca, enfermedad de Chagas, enfermedad de Crohn, rechazo de aloinjerto, enfermedad de Behcet, septicemia, choque séptico o por endotoxinas e isquemia.
13. Un fármaco, para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad asociada a la sobreexpresión y/o la sobreliberación de IL-17A, que comprende el anticuerpo capaz de unirse específicamente a IL-17Ao el fragmento funcional del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.;
como alternativa, el fármaco comprende la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 7-10 y un vehículo farmacéuticamente aceptable;
en donde, la enfermedad es una o más seleccionadas del grupo que consiste en inflamación de las vías respiratorias, asma, asma bronquial, asma alérgica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis pulmonar idiopática, artritis reumatoide, artrosis, espondilitis anquilosante, artritis psoriásica, psoriasis, esclerosis múltiple, esclerosis sistémica, lupus eritematoso sistémico, nefritis por lupus, esclerodermia, colitis ulcerosa, enfermedad inflamatoria del intestino, uveítis, gastritis asociada a Helicobacter pylori, osteoporosis, erosión ósea, absceso y adhesiones intraperitoneales, enfermedad de Addison, deficiencia de gamma globulina, alopecia areata, enfermedad celíaca, enfermedad de Chagas, enfermedad de Crohn, rechazo de aloinjerto, enfermedad de Behcet, septicemia, choque séptico o por endotoxinas e isquemia.
14. El fármaco según la reivindicación 13, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad asociada a la sobrexpresión y/o la sobreliberación de IL-17A, en donde la enfermedad es una o más seleccionadas del grupo que consiste en inflamación de las vías respiratorias, asma, asma bronquial, asma alérgica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis pulmonar idiopática, artritis reumatoide, artrosis, espondilitis anquilosante, artritis psoriásica, psoriasis, esclerosis múltiple, esclerosis sistémica, lupus eritematoso sistémico, nefritis por lupus, esclerodermia, colitis ulcerosa, enfermedad inflamatoria del intestino, uveítis, gastritis asociada a Helicobacterpylori, osteoporosis, erosión ósea, absceso y adhesiones intraperitoneales, enfermedad de Addison, deficiencia de gamma globulina, alopecia areata, enfermedad celíaca, enfermedad de Chagas, enfermedad de Crohn, rechazo de aloinjerto, enfermedad de Behcet, septicemia, choque séptico o por endotoxinas e isquemia.
ES17850230T 2016-09-14 2017-09-08 Anticuerpo que se une específicamente a IL-17A y fragmento funcional del mismo Active ES2905917T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610827097 2016-09-14
PCT/CN2017/101083 WO2018050028A1 (zh) 2016-09-14 2017-09-08 一种能够特异性地结合il-17a的抗体及其功能片段

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2905917T3 true ES2905917T3 (es) 2022-04-12

Family

ID=60980760

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES17850230T Active ES2905917T3 (es) 2016-09-14 2017-09-08 Anticuerpo que se une específicamente a IL-17A y fragmento funcional del mismo

Country Status (22)

Country Link
US (1) US11072651B2 (es)
EP (1) EP3514176B1 (es)
JP (1) JP6802381B2 (es)
KR (1) KR102329490B1 (es)
CN (2) CN109715660A (es)
AU (1) AU2017328310B2 (es)
BR (1) BR112019004990A2 (es)
CA (1) CA3036913C (es)
CL (1) CL2019000659A1 (es)
CO (1) CO2019002370A2 (es)
DO (1) DOP2019000062A (es)
EA (1) EA201990673A1 (es)
EC (1) ECSP19018356A (es)
ES (1) ES2905917T3 (es)
IL (1) IL265350B1 (es)
MX (1) MX2019002970A (es)
MY (1) MY185578A (es)
PE (1) PE20191075A1 (es)
PH (1) PH12019500551A1 (es)
SA (1) SA519401307B1 (es)
TN (1) TN2019000082A1 (es)
WO (1) WO2018050028A1 (es)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2905917T3 (es) * 2016-09-14 2022-04-12 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo que se une específicamente a IL-17A y fragmento funcional del mismo
GB201719447D0 (en) 2017-11-23 2018-01-10 Ucb Biopharma Sprl Pharmaceutical composition
CN110551215A (zh) * 2018-05-30 2019-12-10 中山康方生物医药有限公司 抗白细胞介素-17a抗体、其药物组合物及其用途
EP3878870A4 (en) * 2018-11-05 2022-08-03 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. ANTI-TNFA/ANTI-IL-17A NATURAL ANTIBODY STRUCTURE-LIKE HETERODIMER FORM OF A BISPECIFIC ANTIBODY AND METHODS FOR ITS PRODUCTION
CN109402178B (zh) * 2018-11-16 2021-08-03 佛山科学技术学院 一种小鼠精原干细胞高效重编程的方法及应用
CN111303283A (zh) * 2018-12-12 2020-06-19 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗il-17a抗体及其应用
TW202043268A (zh) * 2018-12-18 2020-12-01 美商健生生物科技公司 產生異二聚體抗體之方法
CN110124030A (zh) * 2019-06-10 2019-08-16 通化东宝生物科技有限公司 一种苏金单抗注射液及其制备方法
WO2021018191A1 (zh) * 2019-07-30 2021-02-04 江苏恒瑞医药股份有限公司 Il-17拮抗剂治疗自身免疫疾病的方法
CN116024212A (zh) * 2022-07-29 2023-04-28 硅羿科技（上海）有限公司 抑制IL-25基因表达的siRNA及其应用

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10140492A1 (de) 2001-08-17 2003-08-14 Gruenenthal Gmbh Hydrate von gegebenenfalls substituierten 2-(2-Pyridinyl)methylthio-1H-benzimidazolen und Verfahren zu ihrer Herstellung
GB0417487D0 (en) 2004-08-05 2004-09-08 Novartis Ag Organic compound
GB0425569D0 (en) 2004-11-19 2004-12-22 Celltech R&D Ltd Biological products
EP2481753B1 (en) 2005-12-13 2018-04-18 Eli Lilly and Company Anti-IL-17 Antibodies
EP2377887A1 (en) 2006-03-10 2011-10-19 Zymogenetics Inc Antibodies that bind both IL-17A and IL-17F and methods of using the same
TW200815469A (en) 2006-06-23 2008-04-01 Astrazeneca Ab Compounds
GB0612928D0 (en) 2006-06-29 2006-08-09 Ucb Sa Biological products
WO2008021156A2 (en) * 2006-08-11 2008-02-21 Schering Corporation Antibodies to il-17a
GB0620729D0 (en) 2006-10-18 2006-11-29 Ucb Sa Biological products
US20090317400A1 (en) 2008-05-05 2009-12-24 Krzysztof Masternak Anti-IL 17A/IL-17F Cross-Reactive Antibodies and Methods of Use Thereof
AU2009296299A1 (en) 2008-09-29 2010-04-01 Roche Glycart Ag Antibodies against human IL 17 and uses thereof
RU2015132478A (ru) 2009-03-05 2015-12-10 Эббви Инк. Связывающие il-17 белки
EP2493506B1 (en) 2009-10-30 2019-04-10 Janssen Biotech, Inc. Il-17a antagonists
CA2823812C (en) 2011-01-14 2017-02-14 Ucb Pharma S.A. Antibody molecules which bind il-17a and il-17f
SI2852615T1 (sl) 2012-05-22 2019-02-28 Bristol-Myers Squibb Company IL-17A/F IL-23 bispecifična protitelesa in njihova uporaba
EP2711016A1 (en) * 2012-09-21 2014-03-26 Covagen AG Novel IL-17A binding molecules and medical uses thereof
SG11201505330QA (en) 2013-02-08 2015-08-28 Novartis Ag Anti-il-17a antibodies and their use in treating autoimmune and inflammatory disorders
CN104231080B (zh) * 2013-03-15 2019-07-02 中国医学科学院药物研究所 全人源抗人白介素17a单链抗体
CN104250302B (zh) 2013-06-26 2017-11-14 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗pd‑1抗体及其应用
EP3072905B1 (en) * 2013-11-18 2020-08-19 Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. Il-17a binding agent and uses thereof
RU2577228C2 (ru) 2014-03-14 2016-03-10 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Анти-il-17-антитела, способ их получения и способ применения
GB201500463D0 (en) * 2015-01-12 2015-02-25 Cresendo Biolog Ltd Therapeutic molecules
CN105315371B (zh) * 2015-03-05 2018-05-29 北京百特美博生物科技有限公司 抗人il-17单克隆抗体
ES2905917T3 (es) * 2016-09-14 2022-04-12 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo que se une específicamente a IL-17A y fragmento funcional del mismo

Also Published As

Publication number Publication date
PH12019500551A1 (en) 2019-11-04
CN107556382B (zh) 2021-04-20
MX2019002970A (es) 2019-09-18
KR102329490B1 (ko) 2021-11-23
AU2017328310A1 (en) 2019-04-18
IL265350B1 (en) 2024-06-01
US11072651B2 (en) 2021-07-27
WO2018050028A1 (zh) 2018-03-22
NZ752189A (en) 2021-10-29
MY185578A (en) 2021-05-22
IL265350A (en) 2019-05-30
KR20190045348A (ko) 2019-05-02
CO2019002370A2 (es) 2019-05-10
ECSP19018356A (es) 2019-05-31
TN2019000082A1 (en) 2020-07-15
CN109715660A (zh) 2019-05-03
AU2017328310A9 (en) 2019-05-30
EA201990673A1 (ru) 2019-08-30
JP2020500206A (ja) 2020-01-09
CL2019000659A1 (es) 2019-07-19
JP6802381B2 (ja) 2020-12-16
EP3514176B1 (en) 2021-12-15
CA3036913A1 (en) 2018-03-22
PE20191075A1 (es) 2019-08-20
EP3514176A4 (en) 2020-04-29
CN107556382A (zh) 2018-01-09
AU2017328310B2 (en) 2020-10-15
US20190256588A1 (en) 2019-08-22
EP3514176A1 (en) 2019-07-24
BR112019004990A2 (pt) 2019-06-04
SA519401307B1 (ar) 2023-11-08
CA3036913C (en) 2023-05-16
DOP2019000062A (es) 2019-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2905917T3 (es) Anticuerpo que se une específicamente a IL-17A y fragmento funcional del mismo
JP6518917B2 (ja) 抗ｃｄ４０抗体およびその使用
CA3036912C (en) Antibody specifically binding to pd-1 and functional fragment thereof
ES2661032T3 (es) Proteínas de unión a interleucina-13
CA2890263C (en) Anti-vegf/dll4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
ES2671506T3 (es) Proteínas de unión al receptor de prolactina y usos de las mismas
ES2912651T3 (es) Anticuerpos anti-CD137
ES2870983T3 (es) Anticuerpos anti-IL-34
US20200277366A1 (en) MULTI-SPECIFIC ANTIBODY MOLECULES HAVING SPECIFICITY FOR TNF-ALPHA, IL-17A and IL-17F
ES2836349T3 (es) Anticuerpos anti-TNF-alfa y fragmentos funcionales de los mismos
ES2822431T3 (es) Polipéptidos de unión a IL-17A
JP7184310B2 (ja) 抗ｉｌ－２５抗体およびその使用
NZ752189B2 (en) Antibody specifically binding to il-17a and functional fragment thereof
EA042457B1 (ru) Антитело, специфически связывающееся с il-17a, композиция и конъюгат на его основе и применение в лечении заболевания, связанного со сверхэкспрессией и/или избыточным высвобождением il-17a
JP2019533423A (ja) ＢＬｙＳ抗体及びその製造方法と応用
NZ752184B2 (en) Antibody specifically binding to pd-1 and functional fragment thereof