CN109402178B - 一种小鼠精原干细胞高效重编程的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种促进小鼠精原干细胞重编程的方法及应用，该方法利用RNA干扰技术敲减小鼠精原干细胞Tet3的基因表达，结果实现促进了多能因子的表达，再进行重编程诱导时，结果显示获得多能干细胞数量显著增加。本发明建立起一套小鼠精原干细胞高效重编程可行性方案，通过该方案可实现小鼠精原干细胞高效重编程，所需时间短，操作简单，且重复性好，成功率高，无需特殊化条件就能达到效果，极大的节省时间和试验材料，相较于以往小鼠精原干细胞重编程诱导方案具有明显优势。

Description

一种小鼠精原干细胞高效重编程的方法及应用

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种小鼠精原干细胞高效重编程的方法及应用。

背景技术

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是一类存在于雄性动物体内生精小管内侧壁基底膜上能够维持自我更新和分化的细胞；通过自我更新维持自身数量恒定，并通过不对称分裂等方式源源不断的分化产生精子，保证雄性动物正常的生殖能力。根据SSCs的独特的生物学性质，，因此它是生殖医学、干细胞工程和发育生物学、动物转基因等方面的重要研究材料，具有极大的科研价值。在体外培养过程中，SSCs可以发生表观重组转变成为具有和胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)类似生物学功能的多能干细胞，成为生殖医学和再生医学最具有应用前景的干细胞。此外，小鼠SSCs体外重编程的分子机制可以为体细胞重编程机制提供理论参考，成为干细胞研究的热点；但由于小鼠SSCs重编程的效率非常低，很难追踪小鼠SSCs重编程过程中基因表达的变化，到目前为止，小鼠SSCs重编程的机制还并不清楚。因此，提高小鼠SSCs重编程效率对于解析小鼠SSCs重编程机制显得十分重要。

因此，现有技术有待于进一步发展和改进。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供了一种小鼠精原干细胞高效重编程的方法，以显著提高小鼠SSCs重编程效率，其技术方案如下。

本发明技术方案如下：

本发明提供一种小鼠精原干细胞高效重编程的方法，其中，利用RNA干扰技术敲减小鼠精原干细胞Tet3的基因表达，再进行重编程诱导，获得多能干细胞。

所述小鼠精原干细胞高效重编程的方法，其中，利用RNA干扰技术敲减小鼠精原干细胞Tet3的基因表达具体为：

取对数生长期小鼠精原干细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞悬液，向其中加入培养液充分混匀细胞，置37℃5％CO₂及饱和湿度的细胞培养箱中培养过夜；

用Opti MEM培养基分别稀释转染试剂Liporectamine2000和Tet3siRNA序列，稀释后的转染试剂Liporectamine2000室温放置5min后与稀释好的Tet3siRNA轻轻混匀，室温放置20min；

将原细胞培养基吸弃并更换为无血清的培养基，将上述混合液加入6孔板培养基内充分混匀细胞液，置37℃5％CO₂及饱和湿度的细胞培养箱中培养4h，换含10％血清的完全培养基继续培养36h，消化终止和收集细胞。

所述小鼠精原干细胞高效重编程的方法，其中，对单个细胞悬液计数并以每组细胞以2.5×10⁵Cell/孔密度于接种于六孔板中，每孔中加入培养液2mL。

所述小鼠精原干细胞高效重编程的方法，其中，用250μL Opti MEM分别稀释转染试剂Liporectamine2000和siRNA，使转染试剂Liporectamine20005μL/孔，siRNA 50nM/孔。

所述小鼠精原干细胞高效重编程的方法，其中，将原细胞培养基弃去并更换为1.5mL Opti MEM培养基。

所述小鼠精原干细胞高效重编程的方法，其中，所述Tet3siRNA序列基于目标基因靶序列设计得到，目标基因靶序列为：GCTCCAACGAGAAGCTATT。

所述小鼠精原干细胞高效重编程的方法，其中，利用收集到部分细胞提取RNA合成cDNA进行定量试验，计算目的基因的相对表达量变化。

所述小鼠精原干细胞高效重编程的方法，其中，将敲减Tet3基因表达后的小鼠精原干细胞接种到饲养层和无饲养层条件进行重编程诱导得到类多能干细胞，其中，饲养层处理：接种小鼠胚胎成纤维细胞Mef细胞，待细胞长至90％左右时，在10％FBS的DMEM完全培养基中加入终浓度10μg/mL丝裂霉素C，黑暗条件下培养4h，然后换用10％FBS的DMEM完全培养基培养；

无饲养层处理：培养皿加入0.01％的多聚赖氨酸没过培养皿底部，放入培养箱，超过12h后，弃去多聚赖氨酸液体。

所述小鼠精原干细胞高效重编程的方法，其中，将通过饲养层和无饲养层条件培养得到的类多能干细胞克隆集落消化成单细胞后，以1×10⁴个的数量注射到4周龄裸鼠皮下，待畸胎瘤长到一定程度，手术获得并进行固定，制备石蜡切片，进行HE染色，以分析验证是否得到多能干细胞。

所述小鼠精原干细胞高效重编程的方法，其中，小鼠精原干细胞培养方案为：95％Stro-34培养基+1％ITS+55μMβ-巯基乙醇+2％B27+1％L-谷氨酰胺+20ng/mL GDNF+10ng/mLEGF+10ng/mL bFGF+1000IU/mL LIF+1％双抗；

多能干细胞培养方案为：82％DMEM+15％FBS+1％L-谷氨酰胺+55μMβ-巯基乙醇+1％非必需氨基酸+1％核苷+1000IU/mL LIF+1％双抗。如上所述的小鼠精原干细胞高效重编程方法的应用，其中，该方法应用于多能干细胞机制研究及其临床医学应用的基础细胞模型研究。

有益效果：

本发明建立起一套小鼠精原干细胞高效重编程可行性方案，通过该方案可实现小鼠SSCs高效重编程，所需时间短，操作简单，且重复性好，成功率高，无需特殊化条件就能达到效果，极大的节省时间和试验材料，相较于以往小鼠SSCs重编程诱导方案具有明显优势。

附图说明

图1为本发明小鼠精原干细胞高效重编程的方法技术路线图。

图2为TET3蛋白在小鼠睾丸组织中的表达分析图，其中，A、B、C、D和F分别为出生后1d、3d、5d、1w龄和8w龄雄性鼠睾丸组织TET3蛋白免疫组织学染色显微图。

图3为小鼠精原干细胞中TET3蛋白表达免疫荧光检测结果，其中，A和D：Hochest33342染色结果；B和E：PLZF蛋白染色结果；C和F：TET3蛋白染色结果。

图4为siRNA敲减小鼠SSCs中Tet3表达对重编程因子表达的影响，其中N＝3；*：p<0.05。

图5为利用siRNA敲减小鼠SSCs的Tet3基因表达，把小鼠SSCs接种到小鼠成纤维饲养层和无饲养层条件下培养结果图，其中，A和D：分别干扰和正常Tet3小鼠SSCs接种到饲养层上培养第2d的结果；B和E：敲减Tet3组和正常组小鼠SSCs在饲养层条件下培养第7d结果；C：敲减Tet3组和小鼠SSCs在饲养层条件下培养第10d结果；F和G：敲减Tet3组小鼠SSCs在多能干细胞培养液下培养至14d，出现大量的多能干细胞集落，少量SSCs集落；H和I：敲减Tet3组小鼠SSCs在无饲养层条件下培养结果；J：对照组小鼠SSCs无饲养层培养结果。

图6为小鼠SSCs重编程类多能干细胞检测结果图，其中，A，B和C：OCT4蛋白染色，分别为染核，蛋白染色和Merge结果；D，E和F：畸胎瘤组织切片HE染色；分别为内胚层呼吸管，外胚层神经上皮和中胚层肌肉组织。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

TET家族(包括TET1、TET2和TET3)介导的甲基化调控在多类干细胞维持自我更新和分化中发挥着重要作用，在本发明方法研究过程中，TET3蛋白在小鼠SSCs和睾丸生精小管基底膜处高表达，在各期生精细胞中持续表达，而TET1/2蛋白则低表达，提示TET3蛋白是参与生殖调控的重要表观因子。对Tet3在睾丸组织表达情况进行分析，结果如图2所示，A、B、C、D和F分别代表的1、3、5d龄、1w龄和8w龄雄性鼠睾丸组织TET3蛋白免疫组织学染色结果显示新生小鼠睾丸组织内，TET3蛋白较高水平的表达在生殖母细胞(Gonocytes)和随后出现的SSCs中；在成年小鼠睾丸组织中，TET3蛋白呈现出表达在各类生精细胞中，但处于基底膜处刚分化的SSCs的细胞表达水平最高，随着向精子分化，表达依次降低。

对小鼠精原干细胞TET3表达情况进行分析，结果如图3所示，通过免疫荧光检测小鼠精原干细胞TET3蛋白表达情况，试验组显示小鼠SSCs克隆集落表达特征性标记PLZF蛋白和TET3蛋白，对照组采用添加兔IgG为阴性对照，显示表达PLZF蛋白，但不表达TET3蛋白，因此证明TET3蛋白高水平表达在小鼠SSCs克隆中。

如图4所示，利用siRNA敲减小鼠SSCs系的Tet3基因表达(下降50％)，发现与重编程相关的重要基因(Oct4、Lin28、c-Myc、Klf4、Esrrb、Prdm14、Klf2和Tet1等)的表达量显著上调。

本发明小鼠精原干细胞高效重编程方法主要是利用RNAi技术敲减小鼠SSCs Tet3表达，再进行重编程诱导，结果显示显著的提高了小鼠SSCs重编程效率，接种到饲养层上和无饲养层培养条件下的小鼠SSCs均呈现出一定比例的类胚胎干细胞的克隆集落，注射裸鼠皮下，产生了畸胎瘤，说明获得了多能干细胞。本发明具体技术路线图如图1所示。利用siRNA敲减小鼠SSCs的Tet3基因表达，然后把小鼠SSCs接种到小鼠成纤维饲养层和无饲养层条件下进行培养，结果如图5所示，和对照组相比，敲减Tet3基因表达的小鼠SSCs重编程效率大大提高。新接种的小鼠SSCs第2d图片，为典型SSCs小集落(图A和D；分别为试验组和对照组)；培养至第7d在试验组中出现了小的类多能干细胞集落(如图B，白色箭头所示)，而对照组只有典型SSCs集落(如图E)；培养至10d出现了典型的类多能干细胞克隆集落(如图C，白色箭头所示)；随后换用多能干细胞培养液，出现了大量类多能干细胞集落和少量SSCs夹杂在其中(如图F和G，白色箭头类多能干细胞集落；白色为SSCs集落)；而对照组并未出现类似的细胞集落；接种在无饲养层培养的条件下，也出现了类多能干细胞形态细胞(如图H和I)；而对照组只有SSCs特征的形态(如图J)，细胞挑取进行传代，维持了类多能干细胞形态。对于小鼠SSCs重编程的类多能干细胞进行检测，如图6所示，从而确认获得了的多能干细胞。

本发明结合SSCs的生物学性质，前期做了大量研究基础上，通过实验探索和不断改进方案，最终建立起一种小鼠SSCs高效重编程的方案；本发明建立的方法，显示小鼠SSCs可以高效的重编程，需要时间短，操作简单。本发明专利建立的方法重复性好、成功率高。无需特殊化条件就能达到效果，可极大的节省时间和试验材料，具有明显优势对比以往建立小鼠SSCs重编程诱导方案，具有明显的优势和创新性。

本发明方案中涉及的主要试验方法包括：

一、组织免疫荧光步骤

石蜡组织切片常规脱蜡，经经梯度酒精脱水；接下来PH 6.0枸橼酸缓冲液微波加热抗原修复15min；PBS洗三次，每次5min；然后3％H₂O₂封闭组织内的过氧化物酶15min；PBS洗三次，每次5min；接下来免疫荧光同于细胞免疫荧光检测(其中TET3一抗(兔源，ab139805)；对应二抗辣根酶标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

二、细胞免疫荧光检测

1)在24孔板中接种小鼠SSCs进行无饲养培养，进行细胞免疫荧光检测；

2)用4％多聚甲醛固定细胞10～30min后，PBS洗3次，每次3min；

3)加入0.5％Triton穿孔破膜处理10min，PBS洗3次，每次3min；

4)加入1％BSA(10％山羊血清)封闭30min(封闭完不用洗)；

5)加入相应的1％BSA稀释的一抗(兔源TET3一抗-ab139805；鼠源PLZF一抗，sc-28319；鼠源OCT4一抗，millipore-MAB360)，置于4℃过夜，PBS洗3次，每次5min；

6)加入相应的1％BSA稀释的二抗(绿光抗兔二抗Goat Anti-rabbit IgGAlexa488，Invitrogen-A11034；红光抗鼠二抗Donkey Anti-mouse IgG Alexa 568，Invitrogen-A10037)，置于37℃反应1h，PBS洗3次，每次5min；

7)加入终浓度为10μg/mL的Hochest33342(Molecular Probes公司)对细胞核染色5～10min，PBS洗3次，每次3min；

8)抗淬灭剂封片，拍照。

三、Tet3SiRNA干扰试验

取对数期生长期小鼠SSCs细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞悬液计数，以每组细胞以2.5×10⁵Cell/孔密度于接种于六孔板中，加入培养液2mL/孔充分混匀细胞，细胞培养液应无抗生素，置37℃5％CO₂及饱和湿度的细胞培养箱中培养过夜。用250μLOpti MEM(Gibco)分别稀释Liporectamine2000(lipo2000)和siRNA(lipo20005μL/孔；siRNA 50nM/孔)，稀释后的Lipo 2000室温放置5min后与稀释好的siRNA轻轻混匀，避免剧烈吹打或振荡，室温放置20min。将原细胞培养基(2mL)吸弃，更换为1.5mL无血清的培养基(或Opti MEM)，将上述混合液加入6孔板培养基内充分混匀细胞液，置37℃5％CO₂及饱和湿度的细胞培养箱中培养4h，换含10％血清的完全培养基继续培养36h，消化终止和收集细胞，部分提取RNA合成cDNA进行定量试验，部分进行多能性诱导试验。Tet3siRNA序列如下表1：

表1 Tet3siRNA序列

试验结果证明有效片段为Tet3siRNA#3，经检验敲减表达量为50％。

四、qRT-PCR实验

1、细胞总RNA的提取(Qiagen微量抽提试剂盒)

1)微量样品，加入新配好的裂解液80μL(裂解液：1mL的Buffer RLT中含10μL巯基乙醇，使用前配制)；

2)加入80μL 70％的乙醇，用枪头混匀，不要离心；

3)将样品转移至试剂盒中提供的Spin column中，装配2mL收集管，轻轻盖上盖子，8000g离心15s，弃去穿透液，放回收集管；

4)加入350μL buffer RW1，轻轻盖上盖子，8000g离心15s，弃穿透液，放回收集管；

5)将80μL DNaseⅠ直接滴到硅质膜上，室温静置15min，务必直接全部滴上，否则DNA会消化不完全；

6)加入350μL buffer RW1，8000g离心15s，弃穿透液及收集管；

7)更换新的2mL收集管，加入500μL buffer RPE(已按要求加入了无水乙醇)，轻轻盖上盖子，8000g离心15s，弃穿透液；

8)加入500μL buffer RPE，轻轻盖上盖子，8000g离心2min，彻底去除乙醇，弃穿透液及收集管，取下Spin column时避免接触到穿透液，乙醇会影响回收；

9)将Spin column移至新的2mL收集管，并开盖做高速离心2min，弃穿透液和收集管。更换新的1.5mL收集管，直接滴加20～40μL RNase-free water在膜中心，最高转速离心2min。重复洗脱一次可增加回收量，-80℃保存或立即合成cDNA。

2、总RNA浓度测定

2％琼脂糖凝胶电泳跑RNA样品检测RNA是否降解，NANODROP 2000检测RNA的浓度及纯度，纯度控制在OD260/OD280为1.8～2.0之间，根据RNA浓度计算出样本RNA调至1μg的体积。

3、qRT-PCR步骤

逆转录检测1st strand cDNA synthesis采用二步法，第一步：反应体系：样本RNA1μg，Random 6mers primer 1μL，dNTP 1μL，蒸馏水配平至10μL，反应条件为：65℃5min，冰上急冷；第二步：反应体系：将第一步变性、退火后反应液10μL，5×PrimeScript TM Buffer4μL，Rnase Inhibitor(40U/μL)0.5μL，PrimeScript TM Rnase(200U/μL)1μL，蒸馏水4.5μL，总体系20μL，反应条件：30℃10min，42℃60min，70℃15min，4℃1h。

qRT-PCR检测采用20μL体系，体系为：SYBR Premix EX Taq 10μL；混合引物(使用浓度10pM)0.8μL；Rox Reference Dye II(50×)0.4μL；DNA模板2μL；无菌水6.8μL。反应条件为：95℃30sec，95℃5sec、60℃34sec(40个循环)，95℃15sec，60℃1min，95℃15sec。其中β-actin为内参照，所用引物如表2所示。样本中目的基因的相对表达量需用公式计算获得，将对照组目的基因的表达量设定为1，目的基因相对表达量。

表2 PCR定量PCR及检测引物表

五、培养方案

小鼠SSCs培养方案：95％Stro-34培养基(含添加物，Invitrogen)+1％ITS(Gibco)+55μMβ-巯基乙醇(Gibco)+2％B27(Gibco)+1％L-谷氨酰胺+20ng/mL GDNF(Peprotech)+10ng/mL EGF(Prospec)+10ng/mL bFGF(Peprotech)+1000IU/mL LIF(Millipore)+1％双抗(Gibco)；

多能干细胞培养方案：82％DMEM(Gibco11960)+15％FBS(Gibco)+1％L-谷氨酰胺(Gibco)+55μMβ-巯基乙醇(Gibco)+1％非必需氨基酸(Gibco)+1％核苷(Millipore)+1000IU/mL LIF(Millipore)+1％双抗；

饲养层处理：接种小鼠胚胎成纤维细胞Mef细胞，待细胞长至90％左右时，在10％FBS(Gibco)的DMEM完全培养基中加入终浓度10μg/mL丝裂霉素C(Sigma)，黑暗条件下培养4h，然后换用10％FBS(Gibco)的DMEM完全培养基培养，待接入干细胞；

无饲养层处理：培养皿加入0.01％的多聚赖氨酸没过培养皿底部，放入培养箱，超过12h后，弃去多聚赖氨酸液体，放入培养箱待接入干细胞。

六裸鼠成瘤实验

将新获得类多能干细胞克隆集落消化成单细胞后，以1×10⁴个的数量注射到4w裸鼠皮下，观察，并细心照顾裸鼠，待畸胎瘤长到一定程度，手术获得，并进行固定，制备石蜡切片，进行HE染色，分析是否具有三个胚层组织。

七、畸胎瘤石蜡切片制作与HE染色

1)取材：将畸胎瘤组织，去切成小块，使组织块厚约0.5mm；浸入到4％多聚甲醛中固定24h；

2)修块：把已固定组织修至所需大小，力求小而薄；

3)冲水：把已经修好的块状的组织放入流水中冲洗24h，把固定液洗干净；

4)脱水：50％乙醇+20％正丁醇+30％水，6h；50％乙醇+35％正丁醇+15％水，4h；45％乙醇+45％正丁醇+10％水，3h；40％乙醇+55％正丁醇+5％水，3h；25％乙醇+75％正丁醇，2h；5％乙醇+95％正丁醇，2h；100％正丁醇(i)，5h；100％正丁醇(ii)，3h；二甲苯，10mim；软蜡(i)：15min；软蜡(ii)：20min；75％乙醇12h，80％乙醇2h，90％乙醇1h，95％乙醇两次，每次40min，100％乙醇两次，每次30min，两次，每次30min。软蜡30min，硬蜡30min。

5)包埋：把已经脱水完全的组织样品包埋到石蜡块里；

6)切块：厚度3～5μm的超薄切片，切好后捞到玻片上烤干；

7)HE染色(结构)：脱蜡：二甲苯(i)，5～10min；二甲苯(ii)，5～10min；复水：100％乙醇(i)2～3min；100％乙醇(ii)2～3min；95％的乙醇，1～2min；90％的乙醇，1～2min；80％的乙醇，1～2min；70％的乙醇，1～2min；60％的乙醇，1～2min；蒸馏水水洗，1～2min；染细胞核：苏木精，10～15min；水洗：1～2min；分色：盐酸乙醇，10～30s(1mL浓盐酸，99mL70％乙醇)；蓝化：流水冲洗，5～10min；蒸馏水，1～2min；脱水：60％乙醇，1～2min；70％乙醇，1～2min；80％乙醇，1～2min；染细胞质：95％乙醇伊红，1～2min(1g伊红，100mL 95％乙醇)；分色：95％的乙醇，1～2min；100％乙醇(i)：2～3min；100％乙醇(ii)：2～3min；透明：二甲苯(i)，2～3min；二甲苯(ii)，2～3min；

8)封片：中性树胶封片，观察拍照。

本发明所建立的方法高效促进了小鼠SSCs重编程为多能干细胞，通过siRNA技术瞬时干扰SSCs Tet3表达，然后进行多能干细胞重编程诱导，极大的提高了小鼠SSCs重编程效率，操作步骤简单，结果容易重复，对于多能干细胞机制研究及其临床医学应用的基础细胞模型研究具有重要意义。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种小鼠精原干细胞高效重编程的方法，其特征在于，利用RNA干扰技术敲减小鼠精原干细胞Tet3基因表达，然后再进行重编程诱导，结果显示获得多能干细胞克隆集落；

利用RNA干扰技术敲减小鼠精原干细胞Tet3基因表达具体为：

取对数生长期小鼠精原干细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞悬液，向其中加入10%血清+DMEM培养液充分混匀细胞，置37℃5％CO₂及饱和湿度的细胞培养箱中培养过夜；

用Opti MEM培养基分别稀释转染试剂Liporectamine2000和Tet3 siRNA序列，稀释后的转染试剂Liporectamine2000室温放置5min后与稀释好的Tet3 siRNA轻轻混匀，室温放置20min；

将原细胞培养基弃去并更换为无血清的培养基，将上述混合液加入6孔板培养基内充分混匀细胞液，置37℃5％CO₂及饱和湿度的细胞培养箱中培养4h，换完全培养基继续培养36h，消化终止和收集细胞；

所述Tet3siRNA序列基于目标基因靶序列设计得到，目标基因靶序列为：GCTCCAACGAGAAGCTATT；

将敲减Tet3基因表达后的小鼠精原干细胞接种到饲养层和无饲养层条件下进行重编程诱导得到类多能干细胞，其中，饲养层条件下处理：接种小鼠胚胎成纤维细胞Mef细胞，待细胞长至90％左右时，在10％FBS的DMEM完全培养基中加入终浓度10μg/mL丝裂霉素C，黑暗条件下培养4h，然后换用10％FBS的DMEM完全培养基培养；

无饲养层条件下处理：培养皿加入0.01％的多聚赖氨酸没过培养皿底部，放入培养箱，超过12h后，弃去多聚赖氨酸液体；

小鼠精原干细胞培养方案为：95％StemPro-34 SFM培养基+1％胰岛素-转铁蛋白-硒+55μMβ-巯基乙醇+2％B-27+1％L-谷氨酰胺+20ng/mL 胶质细胞源性神经营养因子+10ng/mL表皮生长因子+10ng/mL碱性成纤维生长因子+1000IU/mL白血病抑制因子+1％双抗；

多能干细胞培养方案为：82％DMEM+15％FBS+1％L-谷氨酰胺+55μMβ-巯基乙醇+1％非必需氨基酸+1％核苷+1000IU/mL LIF+1％双抗。

2.根据权利要求1所述的小鼠精原干细胞高效重编程的方法，其特征在于，对所述单个细胞悬液计数并以每组细胞以2.5×10⁵ Cell/孔的密度接种于六孔板中，每孔中加入2mL含10%FBS的DMEM培养液。

3.根据权利要求2所述的小鼠精原干细胞高效重编程的方法，其特征在于，用250μLOptiMEM分别稀释转染试剂Liporectamine2000和siRNA，使转染试剂Liporectamine2000为5μL/孔，使siRNA 为50nM/孔。

4.根据权利要求1所述的小鼠精原干细胞高效重编程的方法，其特征在于，利用收集到的部分细胞提取RNA合成cDNA进行定量试验，计算目的基因的相对表达量变化。

5.根据权利要求1所述的小鼠精原干细胞高效重编程的方法，其特征在于，将通过饲养层条件下和无饲养层条件下培养得到的类多能干细胞克隆集落消化成单细胞后，以1×10⁴个的数量注射到4w龄裸鼠皮下，待畸胎瘤长到一定程度，手术获得并进行固定，制备石蜡切片，进行HE染色，以分析验证是否得到多能干细胞。

6.如权利要求1-5任一项所述的小鼠精原干细胞高效重编程方法的应用，其特征在于，将该方法应用于多能干细胞机制研究及其临床医学应用的基础细胞模型研究中，所述应用为非诊断和非治疗目的。

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