CN108642083A - 一种将t细胞高效诱导成多能干细胞的重编程方法 - Google Patents

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Abstract

一种将T细胞高效诱导成多能干细胞的重编程方法，包括如下步骤：S1、从血液标本中抽提单核细胞，将单核细胞加入含激活剂的扩增培养体系中进行选择性T细胞激活培养；S2、将含有至少一种潜能性决定因子的游离型载体导入S1中获取的T细胞；S3、将S2中获取的含有游离型载体的T细胞经多能干细胞诱导培养基培养，在无饲养层体系中诱导成重编程中间态细胞；S4、待完全诱导后，更换S3中所述的多能干细胞诱导培养基为多能干细胞培养基维持培养，获得潜能性决定因子表达消失且内源多能性基因POU5F1、NANOG、TRA‑1‑60与TRA‑1‑81表达激活的细胞，该细胞即为诱导多能干细胞。本发明的有益效果是可以简单、方便规模化的制备T细胞来源的诱导多能干细胞。

Description

一种将T细胞高效诱导成多能干细胞的重编程方法
技术领域
本发明属于细胞领域，具体涉及一种将T细胞高效诱导成多能干细胞的重编程方法。
背景技术
一般而言，干细胞是未分化的细胞，其能够产生成熟的功能性细胞的演替。例如胚胎干细胞(ESC)源自胚胎，其是多能的，因此具有发育成成体任意器官或组织类型的能力。造血干细胞可以产生任意的不同类型的末端分化的血液细胞。诱导多能干细胞(inducedpluripotent stem cell)，通常简称为iPS细胞或iPSC，是一类人工地从非多能细胞(通常为成体细胞)衍生而来的多能干细胞。iPSC首先于2006年从小鼠细胞中产生(Takahashi等人，2006年)，于2007年从人类细胞中产生(Takahashi等人，2007年；Yu等人，2007年)。iPSC的研究是一项具有开创性治疗性的基础研究，避开了长期以来胚胎干细胞难以获取且极易引发伦理争议的问题，为干细胞医学应用开辟了一条新的途径，被认为是干细胞领域乃至整个生物学领域的重大发现。包括英国爱丁堡大学Ian Wilmut教授在内的许多科学家均认为诱导多能干细胞才是干细胞未来的研究方向。iPSC不仅对于干细胞研究具有重要的理论意义，而且在细胞治疗、组织器官再生、药物筛选与评价等领域极具应用价值。
2009年7月，中国科学家高绍荣和周琪等研究小组通过慢病毒和逆转录病毒导入OSKM基因诱导得到的iPSC，通过四倍体囊胚互补实验得到了能够发育至性成熟的并且可以繁衍后代的iPSC小鼠。与嵌合体小鼠所不同的是，这一类小鼠体内所有的细胞均来自iPSC，因此这一类小鼠也被称为全iPSC小鼠(all-iPSC mice)，证明了iPSC具有与胚胎干细胞同样的发育潜能(Boland,et al.2009；Kang,et al.2009；Zhao,et al.2009)。
Boland,M.J.,et al.Adult mice generated from induced pluripotent stemcells.Nature 2009；461(7260):91-4.
Kang,L.,et al.iPS cells can support full-term development oftetraploid blastocyst-complemented embryos.Cell Stem Cell 2009；5(2):135-8.
Zhao,X.Y.,et al.iPS cells produce viable mice through tetraploidcomplementation.Nature 2009；461(7260):86-90.
2009年，Yu等人利用OriP/EBNA1游离载体首次获得了无外源基因污染的人类诱导多能干细胞。此方法只需一次转染，操作简单，而且游离载体在hiPSC扩增时会自动的从细胞内去除。但初始的OriP/EBNA1游离载体重编程方法效率低下，而且需滋养层细胞，不利于hiPSC的规模化制备以及临床级hiPSC的制备。
Yu,J.,et al.Human induced pluripotent stem cells free of vector andtransgene sequences.Science 2009；324(5928):797-801.
抗原特异性T淋巴细胞是一种潜在的癌症治疗方法，然而抗原特异性T细胞的耗竭是这种途径的重大挑战，2012年京东大学的Hiromitsu Nakauchi等研究人员利用来自HIV感染患者的CD8+T细胞来进行重编程扩增，再将T细胞来源的诱导多能干细胞分化为CD8+T细胞，这些再分化的细胞具有高增殖能力和端粒延长。这些细胞具有特异性抗原杀伤活性，并且具有和原始T细胞克隆相同的TCR基因重排模式，这种方法也能针对其他病理相关性抗原产生有效特异性T细胞。综上，由T细胞来源的iPSC生成的抗原特异性T淋巴细胞将在癌症和病毒性疾病的治疗中有广泛应用。
Generation of Rejuvenated Antigen-Specific T Cells by Reprogrammingto Pluripotency and Redifferentiation.
2012年，RIKEN变态反应和免疫学研究中心Hiroshi Kawamoto等研究人员从靶向黑色素瘤表位MART-1的成熟毒性T细胞中制备iPSC。当与OP9/DLL1细胞共培养时，这些iPSC能有效产生表达MART-1表位TCR的TCRb+CD4+CD8+双阳性细胞。采用CD3+抗体刺激这些双阳性细胞产生大量的CD8+T细胞。这些细胞中的90％具有原始MART-1表位的特异性。刺激这些CD8+T细胞能够分泌IFNγ，表明它们的特异性反应。这些研究表明由抗原特异性T细胞重编程而来的iPSC可以再分化为有效针对相应肿瘤抗原的杀伤性T细胞，从而避免了成体抗原特异性T细胞的耗竭，说明了T细胞来源的iPSC在肿瘤免疫治疗中的潜在价值。
Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCsDerived from Mature CD8+ T Cells.
这些研究结果表明，采用iPSC技术操控T细胞，对于未来开发出更有效的免疫疗法可能是非常有用的，但目前这些临床应用的iPSC制备技术未能实现规模化制备。
因此，本发明提供一种简单、方便和易达的重编程方法，便于从外周血T细胞规模化制备iPSC。这种方法是最小侵入性的，只需要少量的血，并且不需要延长细胞培养，使产生的iPSC更加安全有效，且适用于临床前研究和临床应用。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种将T细胞高效诱导成多能干细胞的重编程方法，可以简单、方便规模化的制备T细胞来源的诱导的多能干细胞。
本发明提供了如下的技术方案：
一种将T细胞高效诱导成多能干细胞的重编程方法，包括如下步骤：
S1、从血液标本中抽提单核细胞，将单核细胞加入含激活剂的扩增培养体系中进行选择性T细胞激活培养；
S2、将含有至少一种潜能性决定因子的游离型载体导入S1中获取的T细胞；
S3、将S2中获取的含有游离型载体的T细胞经多能干细胞诱导培养基培养，在无饲养层体系中诱导成重编程中间态细胞；
S4、待完全诱导后，更换S3中所述的多能干细胞诱导培养基为多能干细胞培养基维持培养，获得潜能性决定因子表达消失且内源多能性基因POU5F1、NANOG、TRA-1-60与TRA-1-81表达激活的细胞，该细胞即为诱导多能干细胞。
优选的，所述血液标本来源于脊椎动物。
优选的，所述血液标本为人类血细胞。
优选的，所述人类血细胞取自人外周血、新生儿脐带血、人骨髓血中的任意一种。
优选的，所述游离型载体为含有一个或多个潜能性决定因子的非染色体整合的DNA游离型载体。
优选的，所述非染色体整合的DNA游离型载体包含DNA复制启动子和作用于上述DNA复制启动子的反式作用因子；
所述DNA复制启动子来源于EB病毒、Kaposi，s肉瘤疱疹病毒、松鼠猴疱疹病毒、马立克式病毒的oriP；
所述的反式作用因子为一种EBV nuclear antigen 1。
优选的，所述潜能性决定因子选自POU5F1、NANOG、SOX2、LIN28A、KLF4、MYCL、MYCN、MYC、p53knockdown、MIR302/367cluster、ESRRB、REX1、GBX2、DLX4、ZSCAN10、ZSCAN4、TBX3、GLIS1、NR5A1/2、RARG、BMI1、KDM2B、TET1和SV40LT转录因子中的任意一种或者任意多种的组合。
优选的，所述潜能性决定因子选自POU5F1、NANOG、SOX2、LIN28A、KLF4、MYC和SV40LT转录因子中的任意一种或者任意多种的组合。
优选的，所述潜能决定因子来源于脊椎动物。
优选的，所述S1中扩增培养体系采用的培养基、S3中的多能干细胞诱导培养基和S4中的多能干细胞培养基均为化学成分明确的培养基。
本发明提供一种将T细胞高效诱导成多能干细胞的重编程方法，通过该重编程方法获取的诱导多能干细胞无外源基因成分，适用于细胞再生医疗的临床前研究和临床应用。
本发明的有益效果是：
1、本发明的方法是从T细胞产生iPSC,T细胞可以容易地从外周血样品富集。如本发明所发现：可以从1ml全血的等量物获得更丰富的和易处理的血液细胞来源T细胞衍生iPSC。血液样品的适当的体积可以是1至5ml，1至10ml，1至15ml，或更具体为2ml。这些T细胞衍生的iPSC(“TiPSC”)与hESC以及成纤维细胞衍生的iPSC具有共同的基本特征。
2、本发明的T细胞受体的重排的和减少的V、D、J基因区段，可以在重编程的子代细胞中保留。这是T细胞衍生的iPSC的克隆的特定特征，也可以使这些iPSC获得较那些未经历V(D)J重组的多能干细胞更高的免疫细胞分化效率。另外，T细胞与iPSC之间的粘附性质的差异带来了自动分离上的优势。例如，通过将重编程的T细胞转移到适合于粘附的培养条件，衍生自T细胞的iPSC可以粘附至底部，而T细胞保留在悬浮液中。获得的iPSC具有包含T细胞受体(TCR)的遗传重排的基因组，该性质可用于例如，作为遗传追踪标志物或用于再分化实验以研究人类T细胞发育。
本发明提供了一种将T细胞高效诱导成多能干细胞的重编程方法，因为每个T细胞中T细胞受体(TCR)位点已完成重排，所以从单个T细胞可重编程产生包含单一T细胞受体(TCR)或抗原特异性TCR的诱导多能干细胞，通过扩增具有再次分化为大量的靶向癌细胞和病毒性感染细胞的功能性T细胞。并且这些淋巴细胞会表达与亲代T细胞一样的抗原受体，这种技术允许我们非常高效地再生抗原特异性的T细胞。
附图说明
图1是T细胞来源的诱导多能干细胞重编程方法流程图。
图2是构建的含有潜能决定因子的游离载体表达系统图。
图3是利用流式细胞术对激活的PBMC的表型鉴定：激活前(A)和激活第2天(B)的PBMC的CD3+的表达情况；激活前(C)和激活第2天(D)的CD3+PBMC的CD4+和CD8+的表达情况。
图4是T细胞来源的hiPSC的形态图示，Day 1、Day 2、Day 3、Day 4分别为培养第1、2、3、4天时显微镜下hiPSC的形态图，其中Scale bar为200μm。
图5是利用PCR检测诱导多能干细胞(第10代)TCR基因的重排，验证诱导多能干细胞为T细胞来源。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文所使用的所有科技术语具有与本发明本领域技术人员通常理解的含义相同的含义。虽然用于实施的方法在下文进行了描述，但也可使用类似于或等同于本文所述材料和方法的为本领域熟知的其它材料和方法。
本发明通过在游离载体上引入编码潜能决定因子而将T细胞重编程多能干细胞，整个操作流程图如附图1所示。所述游离型载体在重编程期间存在但在重编程后细胞内基本消失。如本文所用，“重编程”是指一种遗传过程，其将分化的体细胞转化为去分化细胞，所述去分化细胞比其衍生的细胞具有更高的潜能。
如本文所用，“多能干细胞”是指表达多能干细胞特异性标记、具有未分化细胞的细胞形态特征(即紧密集落、高核质比和明显核仁)并且可以分化为所有三个胚层(例如内胚层、中胚层和外胚层)的细胞群体。当引入免疫受损动物如SCID小鼠中时，所述多能干细胞形成通常包含所有三个胚层的细胞或组织特征的畸胎瘤。本领域普通技术人员可以使用本领域常用技术来评定这些特征。多能干细胞既能够在细胞培养时增殖，也能够分化为显示多潜能特性的各种谱系限制性细胞群体。多能干细胞比体细胞具有更高潜能，本发明的选择性T细胞激活培养是指激活并选择性培养T细胞。
本发明涉及的激活T细胞的条件是指在添加激活T细胞的刺激物(也称激活剂)的无血清培养基中，使T细胞扩增为大量的数目和增殖性状态以用于重编程，例如所述的激活剂为抗人CD3抗体和抗人CD28抗体，也可以包括使用本领域已知的四聚体、疫苗和/或体外刺激。也可以在体外以一种或多种细胞因子(例如IL-2)培养细胞群体以扩增其中的T细胞群体(并因此具有针对特定抗原的特定TCR，例如黑色素瘤的癌症抗原，例如GP-100，其可以呈递于抗原呈递细胞上或其它的表面)。
术语“T淋巴细胞”和“T细胞”相互替换地使用，是指：表达T细胞抗原受体(TCR)的细胞，所述受体能够识别抗原呈递细胞表面或基质上存在的与一种或多种MHC分子或一种或多种非经典的MHC分子一起显示的，抗原。T细胞可以是人类T细胞，在具体的方面，T细胞可以是辅助/诱导T淋巴细胞(CD3+CD4+)，抑制/细胞毒T淋巴细胞(CD3+CD8+)，CD3+CD4+T细胞纯真亚群(CD3+CD4+CD45RA+/CD3+CD4+CD45RA+62L+)和CD3+CD8+T细胞纯真亚群(CD3+CD8+CD45RA+/CD3+CD8+CD45RA+62L+)或其组合。T细胞的非限制性实例包括T辅助1(TH1)细胞、T辅助2(TH2)细胞、TH17细胞、细胞毒性T细胞、调节性T细胞、天然杀伤T细胞、幼稚T细胞、记忆T细胞、γδT细胞和任意T细胞。
“CD3细胞”：存在于外周血T细胞和部分胸腺细胞表面。与TCR形成TCR-CD3复合体分子，将抗原信号传递到细胞内。
“CD4+T细胞”是指在其表面表达CD4并且与细胞介导的免疫应答相关的T细胞子集。它们特征在于刺激之后的分泌谱，其可以包括分泌细胞因子，例如IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4和IL-10。“CD4”是55KD的糖蛋白，其最初定义为T淋巴细胞上的分化抗原，但也存在于其它细胞上，包括单核细胞/巨噬细胞。CD4抗原是免疫球蛋白超基因家族的成员，并且被指是Ⅱ类MHC(主要组织相容性复合体)限制性免疫应答中的联合识别元件。在T淋巴细胞上，它们定义了辅助/诱导子集。
“CD8+T细胞”是指在其表面表达CD8的T细胞子集，是Ι类MHC限制性的，并作为细胞毒性T细胞发挥作用。“CD8”分子是存在于胸腺细胞和细胞毒性和抑制性T淋巴细胞上的分化抗原。CD8抗原是免疫球蛋白超基因家族的成员，并且是Ι类主要组织相容性复合体限制性相互作用中的联合识别元件。
在一些方面，细胞群体包含30％至99％、50％至99％、60％至99％或任何中间范围的T细胞，包含1×103-10×106细胞或其中任意范围。例如，本发明人证明了在6孔板中1-3×106T细胞/孔重编程。
为了提供足够的T细胞，可以在引起CD3+的富集或扩增的条件下制备包含CD4/CD8、CD4/CD45RA/CD62L、CD8/CD45RA/CD52L的T细胞群体。本发明的方法采用T细胞扩增培养基，更有利于获得具有特定分子表达特性的T细胞。随着T细胞培养时间的延长，细胞总数明显增多，培养时间范围在1～5天时，T细胞特异性标志CD3+比例占50％～100％。
此外，本发明的方法所采用的多能干细胞诱导培养基，包含PD0325901、CHR99021、A-83-01其中一种或多种成分，更有利于重编程的发生。相比于现有的诱导多能干细胞的方法，本发明的方法实现了高效诱导多能干细胞的制备，提高了诱导的效率，获得高质量的hiPSC。
本文中的T细胞扩增培养基、多能干细胞诱导培养基和支持多能干细胞生长的多能干细胞培养基，诸如E8或TeSR(来自StemCell Technologies，Inc)均属于确定成分培养基。如本文所用，“确定成分培养基”是指仅含生化明确组分的制剂，可以包括已知化学组成的组分或来源于已知来源的组分。
本文使用的术语“潜能性决定因子”表示能够单独地或与其他因子相组合地将细胞诱导成多能性干细胞的因子，例如蛋白质、多肽、编码或非编码RNA等。优选地，所述潜能性决定因子包含一种或几种由POU5F1、NANOG、SOX2、LIN28A、KLF4、MYCL、MYCN、MYC、p53knockdown、MIR302/367cluster、ESRRB、REX1、GBX2、DLX4、ZSCAN10、ZSCAN4、TBX3、GLIS1、NR5A1/2、RARG、BMI1、KDM2B、TET1、和SV40LT的因子组合，优选地，所述因子选自POU5F1、NANOG、SOX2、LIN28A、KLF4、MYCL和SV40LT的组合。各潜能决定因子可被引入体细胞中作为编码可操作地连接到异源启动子的潜能决定因子的多核苷酸转基因，所述异源启动子能驱动多核苷酸在T细胞内表达。表达所述因子的其他充分条件包括在实施例中所述的细胞培养条件。
本文使用的术语“POU5F1”表示八聚体转录因子家族(the family ofoctamertranscription factors)的一个成员，其在维持细胞的多能性上起到关键作用。在文献中，POU5F1也曾被称为Oct3和Oct4。
本文使用的术语“NANOG”属于ANTP类、NK家族基因，是胚胎干细胞内的一个重要转录因子，它对维持胚胎干细胞多能性起关键性作用，能够独立维持ICM和ES细胞的多能性。
本文使用的术语“KLF4”表示Kruppel样转录因子家族(Kruppel-like family oftranscription factors)的一个成员。
本文使用的术语“SOX2”表示SOX转录因子家族成员之一。
本文使用的术语“LIN28A”表示RNA结合蛋白家族成员之一。
本文使用的术语“SV40LT”表示猿猴病毒40大T抗原基因(simian virus large Tantigen SV40LT)，是有效的永生转化基因之一。本身不是潜能决定因子，但其被有利地引入靶细胞，其向细胞提供足以在重编程期间促进细胞存活的条件，同时潜能决定因子被表达。
本文使用的术语“MYCL”表示本领域技术人员熟知的一种转录因子，其调控许多基因的表达，募集组蛋白乙酰基转移酶。
本发明的游离型载体为闭合环状DNA质粒，可以在单一重编程载体上提供一种或多种潜能性决定因子，可将多种重编程载体引入单个体细胞。一种强力的、构成性转录启动子可以向多种潜能性决定因子提供转录启动控制；所述潜能性决定因子可以受独立强力的、构成性启动子的转录控制；所述的启动子可能是多个拷贝的相同启动子，也可能是不同的启动子。各种异源启动子是本领域已知的，并且可根据诸如潜能决定因子的希望表达水平之类的因素来使用。对转录启动子选择的另一考虑为启动子在靶标体细胞内保持沉默的比率。本方法中的启动子可以是人类EF1α延伸因子启动子。熟练的技术人员将理解，通过单一载体而非通过多种载体引入所有因子对效率更有利，但当总的载体大小增加时，则变得越来越难以引入载体。熟练的技术人员还将了解，因子在载体上的位置能影响其瞬时表达，以及所得重编程效率。这样，申请人在多种载体组合上使用了各种因子组合，若干此类组合在此表明支持重编程。
在引入重编程载体之后并当靶细胞正在被重编程时，载体能存留在靶细胞内，而引入的潜能性决定因子则被转录和翻译。在已重编程为多潜能状态的细胞内，可以有利地下调或终止潜能性决定因子基因的表达。重编程载体与受体细胞的基因组协同地复制，可适度地稳定约2～3周，这比不能复制其DNA的游离型载体稳定时间更长。然而，由于载体在细胞分裂时未等分，在缺乏选择性压力时，细胞丢失游离型载体，一旦细胞稳定，则细胞以每代约5-20％的速度继续丢失游离型载体，所以技术人员可以容易地用该方法回收无载体的多潜能细胞。
本文中使用的术语“导入”表示将外源物质(如核酸或蛋白质)引入细胞的过程，例如通过磷酸钙转染、病毒感染、脂质体转染、电穿孔或基因枪等方式进行。
本文中使用的术语“重编程中间态细胞”，即一种处于不完全重编程的细胞状态，是重编程过程中的一种中间态，包括部分多能性基因被激活，在适宜培养条件下可被诱导为iPSC的细胞。
本文涉及的T细胞在未分化状态时，TCR基因的胚系形式是V、D、J、C基因从5’端到3’端呈线状不连续排列在DNA单链上；当淋巴细胞发育到一定阶段，在特殊的重组酶作用下，选择性将V、D、J、C区基因按不同顺序连接起来，即发生基因重排。只有发生基因重排才可能形成一个有表达功能的基因，淋巴细胞从母细胞分化到成熟细胞需要经过多次基因重排。正常T淋巴细胞呈多克隆的TCR基因重排而出现大小不同的重排DNA片段。单克隆来源的T细胞TCR基因呈现单克隆性的基因重排.欧洲七国血液病理等组成的专家小组2007年开发了BI0MED-2基因重排引物检测系统,根据TCR基因结构以及淋巴细胞分化过程中TCR基因重排的特点和多样性的事实，来设计涵盖所有可能重排方式的组合型引物体系，扩增大小在150-300bp之间的产物，PCR产物在再次变性和快速复性后，通过高分辨率的聚丙烯凝胶电泳，单克隆来源的样本可以产生泳动速率较快的同源二聚体(homoduplex)，而多克隆样本则只会出现泳动速率更慢的异源二聚体(heteroduplex),从而可以检测样本是否为单克隆的T细胞来源。
本文所获得的hiPSC在遗传上与所述的T细胞供体基本相同，且基本不含所述靶细胞重编程过程中使用的含有编码多潜能决定因子的游离载体的有关成分，适用于当前临床前研究与临床应用的人类诱导多能干细胞的研究和治疗应用中。
下面结合具体实施例对本发明做具体说明。
实施例1：游离型载体表达系统的设计和构建
如图2所示，本实施例构建了三种游离型载体，均是通过直接聚合酶链式反应(PCR)扩增来自多潜能决定因子基因中的一些或所有可读框(ORF)(使用编码区的最初和最后20-22个碱基作为引物)，并将上述ORF插入到市售的哺乳动物表达载体pCEP4中或含有OriP/EBNA1的相关骨架中产生游离载体，三种游离型载体上均包含至少一个内部核糖体进入位点(internal ribosome entry size，IRES)，其中第一个载体为pEP4-E-O2S-E-N2K(图2A)，其依次包含第一启动子、POU5F1、IRES2、SOX2、第二启动子、NANOG、IRES2和KLF4；第二个载体为pEP4-E-O2S-E-T2K(图2B)，其依次包含第三启动子、POU5F1、IRES2、SOX2、第四启动子、SV40LT、IRES2和KLF4；第三个载体为pCEP4-LM-2L(图2C)，其依次包含第五启动子、MYCL、IRES2和LIN28A；其中第一、第二、第三和第四启动子均是延伸因子1α(EF1α)基因启动子，第五启动子是巨细胞病毒(Cytomegalovrus,CMV)启动子。“E-O2S”是指一种具有位于OCT4和SOX2编码区上游且其间有IRES2的EF1α启动子的表达序列。同样地，“E-N2K”是指一种具有位于NANOG和KLF4编码区上游且其间有IRES2的EF1α启动子的表达序列；E-T2K是指一种具有位于SV40LT和KLF4编码区上游且其间有IRES2的EF1α启动子的表达序列；“M-2L”是指一种具有位于MYC和Lin28A编码区上游且其间有IRES2的CMV启动子的表达序列。应当注意的是，本实施例构建了三种类型的游离型载体，但本领域技术人员可根据具体使用情况去构建一种、两种或者三种以上类型的游离型载体。
实施例2：T细胞单核细胞的原代分离与培养、鉴定
1、T细胞单核细胞的原代分离与培养
采集6ml的血样，转移到淋巴细胞分离管中，离心，取单核细胞层，用DPBS离心洗涤两遍，取样计数，并利用流式细胞术检测其表面分子CD3+及CD4+CD8+的表达情况，分别检测其阳性率和平均荧光强度指标(实验结果如图3A所示)，根据计数结果取6×106细胞分3孔接种于包被激活剂的6孔板中，加入T细胞无血清培养基2ml/孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养构成了本发明的扩增培养体系，分别于扩增第1天每孔补加1～2ml新鲜的T细胞无血清培养基。
本实施例的T细胞无血清培养基包括基础培养基和其他添加成分，其中基础培养基由DMEM、F12、IMDM按照体积比为3：3：1混合而成，向基础培养基中加入其他添加成分，使得最终每升无血清培养基包含乙醇胺0.1mmol、硫酸酮1μg、硝酸铁0.5mg、硫酸锌0.3mg、亚硒酸钠20μg、丙酮酸钠150mg、胰岛素10mg、转铁蛋白20mg、谷氨酰胺5ml、人血清白蛋白0.5g、硫代甘油20μmol、L-维生素C 20mg、白介素-2 5×104IU。
所述的激活剂包括抗人CD3抗体和抗人CD28抗体，包被时使用的浓度分别为抗人CD3抗体1mg/L、抗人CD28抗体2mg/L，上述浓度指采用PBS洗液配制的溶液浓度。
上述扩增培养体系，除了本发明涉及的包被激活剂的方法以外，当然本领域技术人员还可以选择其他扩增培养体系，例如激活剂包被的磁珠、包被激活剂的复合材料或者含激活剂成分的培养基等。
2、T细胞的鉴定
培养待上述T细胞培养至第2天时，利用流式细胞术分别检测PBMC及激活培养之后的T细胞表面分子CD3+及CD4+CD8+的表达情况，结果显示相比于PBMC，激活培养之后的T细胞表面分子CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+的表达含量分别上升，分别为CD3+占93.15％，CD3+CD4+占42.41％；CD3+CD8+占53.38％(实验结果如图3所示)，PBMC的中文含义为外周血单个核细胞。
实施例3：游离载体诱导重编程
1.方法
a、取实施例2中的激活培养2天的T细胞0.5～4×106，用实施例1构建的pEP4-E-O2S-E-N2K、pEP4-E-O2S-E-T2K和pCEP4-LM-2L游离型载体电转染靶细胞，之后接种于hiPSC诱导培养基和Matrigel或玻连蛋白或其它细胞基质包被的六孔板中进行培养，各质粒DNA的转染含量分别为pEP4-E-O2S-E-N2K：pEP4-E-O2S-E-T2K：pCEP4-LM-2L＝1:1:1。
b、48小时后半量更换新鲜的hiPSC诱导培养基，继续培养至10天，隔天进行换液，即在无饲养层体系上进行重编程。
多能干细胞诱导培养基具体成分为：
在每升实施例2中T细胞无血清扩增培养基的基础上添加一种或多种以下小分子：CHIR99021 1μmol、A-83-01 0.5μmol和PD0325901 0.1μmol。
实施例4：重编程细胞的维持培养
10天后，将诱导培养基更换为多能干细胞培养基，继续培养。重编程10天后，挑取形态类似于人胚胎干细胞的克隆至新的培养皿中进行扩增。经计数每200万个起始PBMC细胞中可获得150～200个hiPSC克隆。
干细胞培养基：本发明使用实验室常规的干细胞培养基，优选TeSR1或E8培养基。
实施例5：目的hiPSC的鉴定
1.方法
1.1诱导多能干细胞的细胞形态：通过显微镜观察获得的诱导多能干细胞在第1、2、3、4天中形态的变化过程，并对其拍照保存，实验结果如图4所示，显微镜的比例尺(Scalebar)为200μm。
1.2诱导多能干细胞的TCR基因重排检测：采用培养至第10代的诱导多能干细胞，按DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)说明书提取DNA；利用BIOMED-2系统T细胞受体(TCR)β引物组合对T细胞中TCR基因重排进行检测。PCR条件：95℃预变性7min；然后95℃变性45s、60℃退火45s、72℃延伸90s，35个循环，72℃延伸10min。对扩增后产物进行95℃变性5min，再迅速转移至4℃条件下进行复性，通过电泳检测红细胞祖细胞来源的iPSC(EP-iPSC)、激活前的PBMC、激活后的PBMC、及4个不同诱导多能干细胞克隆C1、C2、C3、C4的结果。
2.结果：
诱导多能干细胞克隆挑出来后进行扩增和传代，传代后得到的诱导多能干细胞克隆细胞仍保持高核质比，轮廓清晰、中心紧凑(图4-Day 4)。显微镜(Scale bar：200μm)观察获得的诱导多能干细胞在第1、2、3、4天中形态的变化过程，诱导多能干细胞由梭形转变为圆形，聚集成团，核质比增大，中心部分排列紧密(图4-Day 2)。4d时可见成簇的诱导多能干细胞克隆形成。
诱导多能干细胞(第10代)采用BI0MED-2基因重排引物体系进行扩增，PCR产物在再次变性和快速复性后，通过高分辨率的聚丙烯凝胶电泳显示扩增大小在150-300bp之间的产物为泳动速率较快的同源二聚体(homoduplex)，而泳动速率较慢的异源二聚体(heteroduplex),呈现弥撒的条带，从而可以判定诱导多能干细胞克隆C1、C2、C3、C4为T细胞来源(图5)。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种将T细胞高效诱导成多能干细胞的重编程方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、从血液标本中抽提单核细胞，将单核细胞加入含激活剂的扩增培养体系中进行选择性T细胞激活培养；
S2、将含有至少一种潜能性决定因子的游离型载体导入S1中获取的T细胞；
S3、将S2中获取的含有游离型载体的T细胞经多能干细胞诱导培养基培养，在无饲养层体系中诱导成重编程中间态细胞；
S4、待完全诱导后，更换S3中所述的多能干细胞诱导培养基为多能干细胞培养基维持培养，获得潜能性决定因子表达消失且内源多能性基因POU5F1、NANOG、TRA-1-60与TRA-1-81表达激活的细胞，该细胞即为诱导多能干细胞。
2.根据权利要求1所述的一种将T细胞高效诱导成多能干细胞的重编程方法，其特征在于，所述血液标本来源于脊椎动物。
3.根据权利要求1所述的一种将T细胞高效诱导成多能干细胞的重编程方法，其特征在于，所述血液标本为人类血细胞。
4.根据权利要求3所述的一种将T细胞高效诱导成多能干细胞的重编程方法，其特征在于，所述人类血细胞取自人外周血、新生儿脐带血、人骨髓血中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的一种将T细胞高效诱导成多能干细胞的重编程方法，其特征在于，所述游离型载体为含有一个或多个潜能性决定因子的非染色体整合的DNA游离型载体。
6.根据权利要求5所述的一种将T细胞高效诱导成多能干细胞的重编程方法，其特征在于，所述非染色体整合的DNA游离型载体包含DNA复制启动子和作用于上述DNA复制启动子的反式作用因子；
所述DNA复制启动子来源于EB病毒、Kaposi，s肉瘤疱疹病毒、松鼠猴疱疹病毒、马立克式病毒的oriP；
所述的反式作用因子为一种EBV nuclear antigen 1。
7.根据权利要求1所述的一种将T细胞高效诱导成多能干细胞的重编程方法，其特征在于，所述潜能性决定因子选自POU5F1、NANOG、SOX2、LIN28A、KLF4、MYCL、MYCN、MYC、p53knockdown、MIR302/367cluster、ESRRB、REX1、GBX2、DLX4、ZSCAN10、ZSCAN4、TBX3、GLIS1、NR5A1/2、RARG、BMI1、KDM2B、TET1和SV40LT转录因子中的任意一种或者任意多种的组合。
8.根据权利要求1所述的一种将T细胞高效诱导成多能干细胞的重编程方法，其特征在于，所述潜能性决定因子选自POU5F1、NANOG、SOX2、LIN28A、KLF4、MYC和SV40LT转录因子中的任意一种或者任意多种的组合。
9.根据权利要求7所述的一种将T细胞高效诱导成多能干细胞的重编程方法，其特征在于，所述潜能决定因子来源于脊椎动物。
10.根据权利要求1所述的一种将T细胞高效诱导成多能干细胞的重编程方法，其特征在于，所述S1中扩增培养体系采用的培养基、S3中的多能干细胞诱导培养基和S4中的多能干细胞培养基均为化学成分明确的培养基。
11.一种如权利要求1-10中任一项所述的将T细胞高效诱导成多能干细胞的重编程方法，其特征在于，通过该重编程方法获取的诱导多能干细胞无外源基因成分，适用于细胞再生医疗的临床前研究和临床应用。
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