CN110023491A - 多能干细胞定向分化为hla纯合免疫细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了将HLA纯合血细胞衍生的多能干细胞有效体外分化为造血前体细胞，以及将造血前体细胞进一步分化为各种骨髓样或淋巴样谱系的HLA纯合免疫细胞，特别是T细胞、NK细胞和树突细胞的方法。多能细胞可以在确定条件下维持和分化；因此，在某些实施方案中，不需要使用小鼠饲养细胞或血清用于分化造血前体细胞。

Description

多能干细胞定向分化为HLA纯合免疫细胞的方法
本申请要求2016年10月5日提交的美国临时专利申请号62/404,470和2017年4月18日提交的美国临时专利申请号62/486,895的权益，其全部内容通过引用并入本文。
发明背景
1.发明领域
本发明一般地涉及分子生物学领域。更具体地，它涉及从血细胞衍生的诱导多能干细胞(iPSC)产生HLA纯合免疫细胞的方法和组合物。
2.相关技术描述
已经开发了细胞治疗方法以增强对肿瘤、病毒和细菌病原体的宿主免疫应答。细胞治疗方法通常涉及T细胞的离体激活和扩增。这些治疗类型的实例包括使用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)细胞、细胞毒性T细胞、扩增的肿瘤引流淋巴结细胞和各种其他淋巴细胞制备物。由于造血干细胞和祖细胞的显著医学潜力，已经进行了大量工作以试图改进将造血祖细胞分化为免疫细胞(例如T细胞和NK细胞)的方法。
在人类中，诱导多能干(iPS)细胞通常由真皮成纤维细胞生成。然而，对皮肤活组织检查的需求以及对体外扩增成纤维细胞几次传代的需要使其成为生成患者特异性干细胞的缺乏效率的来源。此外，先前用于重新编程人体细胞的方法是不方便的，因为它们需要直接从人受试者获得体细胞，或者将细胞维持在劳动密集型细胞培养系统中。因此，需要开发从简单、方便且易于获得的替代来源诱导多能干细胞的方法。因此，血液样品可以是这样的来源，因为血液可以从患者或健康个体收集，储存或转移，例如，从中央单元收集以分配到一个或多个远程位置。因此，目前明确需要从血细胞重新编程iPS细胞并然后有效地将血细胞衍生的iPS细胞分化为免疫细胞，例如T细胞、NK细胞、T/NK细胞和树突细胞的方法。
发明概述
本公开内容的第一个实施方案提供了产生HLA纯合免疫细胞的方法，包括获得诱导多能干细胞(iPSC)，其中从HLA纯合血细胞群对iPSC进行重新编程，将iPSC分化为造血前体细胞(HPC)，和在促进免疫细胞分化的条件下培养HPC，从而产生HLA纯合免疫细胞。在一些方面，iPSC基本上不含整合的外源病毒元件。
在一些方面，HLA纯合血细胞对于基因座等位基因HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP或HLA-DQ中的一种或多种是纯合的。在特定方面，HLA纯合血细胞对于基因座等位基因HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP或HLA-DQ中的两种是纯合的。在特定方面，HLA纯合血细胞对于HLA-A和HLA-B是纯合的。在一个具体方面，HLA纯合血细胞对于HLA-A、HLA-B和HLA-C是纯合的。
在某些方面，HLA纯合免疫细胞是淋巴样细胞。在特定方面，淋巴样细胞是T细胞、B细胞和/或NK细胞。在一些方面，HLA纯合免疫细胞是骨髓样细胞。在特定方面，骨髓样细胞是树突细胞。
在一些方面，HLA纯合血细胞群是哺乳动物的血细胞群。在特定方面，血细胞群是人的血细胞群。在一些方面，HLA纯合血细胞群未用外部应用的G-CSF进行动员。在某些方面，HLA纯合血细胞群包含T细胞、B细胞和/或NK细胞。在一些方面，HLA纯合血细胞群进一步定义为祖血细胞、外周血单核细胞或淋巴母细胞。在某些方面，HLA纯合血细胞群分离自外周血、脐带血或淋巴样组织。在特定方面，淋巴样组织包括骨髓、淋巴结或胎肝。在特定方面，HLA纯合血细胞群包含T细胞。在一些方面，T细胞在抗CD3抗体和/或抗CD28抗体的存在下培养。在特定方面，T细胞是CD4+或CD8+T细胞。在一些方面，T细胞是T辅助性1(TH1)细胞、T辅助性2(TH2)细胞、TH17细胞、细胞毒性T细胞、调节性T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞、记忆T细胞或γδT细胞。
在某些方面，重新编程包括将重新编程因子引入血细胞群。在一些方面，重新编程包括将RNA、蛋白质或小分子引入HLA纯合血细胞群。
在一些方面，重新编程因子由一个或多个表达盒编码。在某些方面，重新编程因子包括选自Sox2、Oct4、cMyc、Klf4、Nanog、SV40大T抗原和Lin28中的两种或更多种基因。在一些方面，重新编程因子包括选自Sox2、Oct4、cMyc、Klf4、Nanog、SV40大T抗原和Lin28的基因中的3、4、5或6种基因。在某些方面，一个或多个表达盒包含在重新编程载体中，所述重新编程载体选自病毒载体、附加体载体和转座子。在一些方面，病毒载体进一步定义为逆转录病毒载体。在特定方面，附加体载体进一步定义为基于Epstein-Barr病毒(EBV)的附加体载体。在一些方面，重新编程包括在确定的无饲养细胞条件下培养细胞。
在一些方面，HPC分化为每个HPC至少20个HLA纯合免疫细胞，例如每个HPC至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个HLA纯合免疫细胞。在特定方面，HPC分化为每个HPC至少10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200或更多个NK细胞。在一些方面，HPC分化为每个HPC至少5、10、15、20、25、30、40、50或更多个T细胞。
在某些方面，将iPSC分化为HPC包括以下顺序步骤：在包含至少一种生长因子的第一确定培养基中培养iPSC，在不含或基本上不含IL-3、Flt3配体和GM-CSF的第二确定培养基中孵育细胞，在包含BMP4、FGF2和VEGF的第三确定培养基中培养细胞足以在多个细胞中扩增或促进分化，并在包含IL-3和Flt3配体的第四确定培养基中培养细胞足以在多个细胞中扩增或促进分化。在一些方面，多个多能细胞分化为HPC。在一些方面，第二确定培养基包含布雷他汀。在某些方面，第二确定培养基还包含GSK3抑制剂。在一些方面，GSK3抑制剂是CHIR99021。在一些方面，第二确定培养基还包含BMP4、VEGF和FGF2。在某些方面，在将细胞在第二确定培养基中孵育之前，使细胞个体化。在一些方面，使用胺培养平板进行在第二确定培养基中孵育细胞，在第三确定培养基中培养细胞，以及在第四确定培养基中培养细胞。在某些方面，第二确定培养基还包含VEGF和FGF2。在特定方面，第四确定培养基还包含选自IL-3、IL-6、SCF、TPO和BMP4中的一种或多种细胞因子。在一些方面，第四确定培养基包含肝素。在一些方面，该方法包括在小于25％氧气，例如小于24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、10％或5％氧气的大气压下培养细胞。在一些方面，多个多能细胞形成胚状体(EB)。在某些方面，HPC表达CD34。在特定方面，HPC表达CD43、CD34、CD31、CD41、CD235和CD45中的至少两种标志物，例如CD43和CD34。
在一些方面，促进免疫细胞分化的条件进一步定义为促进淋巴样分化的条件。在某些方面，表达CD34和CD43的HPC在促进淋巴样分化的条件下培养。在一些方面，培养细胞以促进淋巴样分化包括在包被有基质和Notch配体的表面上在确定培养基中培养HPC，其中HPC表达选自CD34、CD43、CD7、DLL4、CD144和CD235中的一种或多种细胞表面标志物，和在一种或多种细胞因子存在下维持培养，从而产生淋巴样细胞。在一些方面，HPC表达CD144、CD34、CD45和CD7。在特定方面，HPC表达CD144、CD34、CD45和CD7。
在另外的方面，淋巴样分化的第一步还包括分离表达一种或多种细胞表面标志物的HPC。在一些方面，分离包括磁激活细胞分选(MACS)。在某些方面，细胞在小于5％氧气的大气压下培养。在某些方面，细胞在约5％氧气的大气压下培养。在一些方面，确定培养基包含抗坏血酸和/或烟酰胺。在某些方面，抗坏血酸以50μM至1mM，例如90μM至100μM的浓度存在。在一些方面，烟酰胺以0.1mM至5mM的浓度存在。在一些方面，烟酰胺是烟酸。在一些方面，基质是细胞外基质蛋白。在一些方面，基质是retronectin、胶原蛋白、层粘连蛋白或纤连蛋白。在特定方面，基质是retronectin。在一些方面，Notch配体是DLL4。在某些方面，DLL4是DLL4:Fc嵌合体蛋白。在特定方面，一种或多种细胞因子选自SCF、TPO、IL-7和Flt-3。在一些方面，第二步骤持续1至6周，例如2至4周。在一些方面，淋巴样细胞表达选自CD8、CD7、CD45、CD5、CD4和CD3中的一种或多种标志物。在一些方面，超过5％的淋巴样细胞对于至少两种标志物是阳性的。在特定方面，超过10％的淋巴样细胞对于至少两种标志物是阳性的。
在一些方面，促进免疫细胞分化的条件进一步定义为促进骨髓样分化的条件。在某些方面，在促进骨髓样分化的条件下培养HPC包括在包含TPO、SCF和Flt3配体的第一确定培养基中培养HPC，从而产生骨髓样细胞群，和在基本上不含TPO、SCF和Flt3配体的第二确定培养基中孵育细胞，从而产生骨髓样细胞的富集群。在一些方面，第一确定培养基还包含IL-6和IL-3。在某些方面，第二确定培养基包含GM-CSF。在特定方面，在第一步骤中产生的骨髓样细胞群的至少50％对于CD45、CD43和CD31是阳性的。在一些方面，对于CD45、CD43和CD31是阳性的骨髓细胞群基本上不表达CD34。在特定方面，骨髓样细胞的富集群的至少80％是CD43+、CD45+、CD31+和CD34-。在某些方面，第二步骤持续5至10天。
在某些方面，该方法还包括将骨髓样细胞的富集群分化为树突细胞。在一些方面，将骨髓样细胞的富集群分化为树突细胞包括在包含GM-CSF、IL-4和TNFα的确定培养基中培养骨髓样细胞的富集群，从而产生树突细胞。在一些方面，确定培养基还包含脂蛋白。在某些方面，树突细胞表达选自CD209、CD1a、HLA-DR、CD11c、CD14、CD83和CD86中的一种或多种标志物。在特定方面，树突细胞基本上不表达CD12。
在进一步的实施方案中，提供了HLA纯合免疫细胞文库，其中每个文库成员根据HLA型进行表征。在一些方面，HLA纯合免疫细胞衍生自从超级供体获得的血液样品。在特定方面，超级供体是人。在一些方面，HLA纯合免疫细胞是同种异体的。在一些方面，HLA纯合免疫细胞是自体的。在某些方面，HLA纯合免疫细胞至少对于一种或多种HLA I类基因和/或HLA II类基因是纯合的。在某些方面，HLA纯合免疫细胞对于基因座等位基因HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP或HLA-DQ中的一种或多种是纯合的。在一些方面，HLA纯合免疫细胞对于基因座等位基因HLA-A，HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP或HLA-DQ中的两种是纯合的。在一些方面，HLA纯合免疫细胞对于HLA-A和HLA-B是纯合的。在某些方面，HLA纯合免疫细胞对于HLA-A、HLA-B和HLA-C是纯合的。在一些方面，HLA纯合免疫细胞是淋巴样细胞，例如T细胞、B细胞和/或NK细胞。在某些方面，HLA纯合免疫细胞是骨髓样细胞，例如树突细胞。在特定方面，每个文库成员与潜在受体是HLA匹配的。在一些方面，文库包括冷冻保存的HLA纯合免疫细胞。在特定方面，文库包括至少15个文库成员，其中成员包含不同的HLA单倍型。在一些方面，文库包括至少30个文库成员，例如至少35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多个文库成员。
在另一个实施方案中，提供了产生实施方案的HLA纯合免疫细胞文库的方法，包括对从人类超级供体获得的多个血液样品进行HLA分型，将来自多个血液样品的细胞重新编程为iPSC，将iPSC分化为HPC，和在促进免疫细胞分化的条件下培养HPC，从而产生HLA纯合免疫细胞的文库。
根据以下详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应该理解的是，详细描述和具体实施例虽然表明了本发明的优选实施方案，但是仅以示例说明的方式给出，因为根据本详细描述，在本发明的精神和范围内的多种变化和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。
附图简要说明
以下附图构成本说明书的一部分，并且包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文给出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1A-1D：(A)从iPSC衍生T、NK和NK/T细胞的无饲养细胞方法的示意图。通过3D过程将iPSC分化为具有淋巴样和骨髓样潜力的HPC，然后将第7-10天的祖细胞进行2D分化过程以生成T、NK和NK/T细胞。(B)从iPSC衍生树突细胞的无饲养细胞方法的示意图。通过3D过程将iPSC分化为具有淋巴样和骨髓样潜力的HPC，并且将第12天祖细胞进一步分化以生成骨髓样祖细胞并进行逐步3D分化过程以生成树突细胞。(C)在分化的第12天，从各种血液细胞衍生的iPSC细胞系生成HPC并且显示通过流式细胞术定量的CD43+/CD34+细胞的百分比。(D)从第12天iPSC生成HPC的效率显示为生成的HPC的绝对数量/iPSC的输入数量的比率。
图2：显示流式细胞术散点图，其鉴定在第7-10天HPC的淋巴分化期间的淋巴样和淋巴-骨髓样群。确定前T、NK和NK/T细胞的存在。
图3A-3D：(A)代表性染色谱以检测来自病毒和附加体重新编程的iPSC的淋巴样细胞的出现，所述病毒和附加体重新编程的iPSC包括脐带血衍生的的iPSC、病毒重新编程的T细胞iPSC(TiPSC)和附加体重新编程的祖血细胞iPSC(01279.107.3908)。针对包括CD5、CD7、CD45、CD3、CD56和CD8的各种标志物的表面表达对细胞进行染色。在FSC-SSC和淋巴样散点门下通过流式细胞术定量细胞百分比。(EB7＝第7天，EB8＝第8天，EB9＝第9天，EB10＝第10天，EB11＝第11天。(B)将从TiPSC分化的第7-11天HPC(顶部：总HPC；底部：CD43+CD34+HPC)进一步分化为淋巴样细胞并针对CD45、CD7和CD5的表面表达进行染色。在FSC-SSC和淋巴样散点门下通过流式细胞术定量细胞百分比。(C)将从TiPSC生成的第7-11天HPC(顶部：总HPC；底部：CD43+CD34+HPC)在缺氧条件下分化并针对CD56、CD8和CD3的表面表达进行染色。(D)显示从TiPSC生成淋巴样细胞的效率(左：总HPC；右：CD43+CD34+HPC)。
图4：在从第7天到第11天的HPC分化不同天数，针对CD43/CD34、CD34、Dll4、Dll4/CD144、CD31/CD144和CD235的表达分析从TiPSC(例如，病毒重新编程的TiPSCs1E或附加体重新编程的01279.107.3902)分化的第7-11天HPC。显示针对每组标志物是阳性的细胞百分比。CD43/CD34表达显示在左栏，CD34在右栏，DLL4/CD144在底线，CD31/CD144在中线并且CD235在顶线。
图5：在HPC分化期间检测淋巴样祖细胞的磁性分选策略的示意图。目的标志物包括CD31、CD34、CD144、CD43、CD45、CD7、CD235、FLK1(也称为KDR、VEGFR2、CD309)和DLL4。在分化的第8天，基于目的标志物将细胞分选为多个级分，并然后进行淋巴样分化过程。
图6A-6B：(A)显示了来自图5磁性分选策略的细胞的每个阳性和阴性级分中CD3阳性细胞的百分比，未分选的细胞作为对照。(B)对于来自图5磁性分选策略的阳性和阴性级分，显示了从HPC生成的T细胞的倍数富集，未分选的细胞作为对照。
图7A-7B：(A)显示了从TiPSC的淋巴样分化4周后，来自图5磁性分选的细胞的每个阳性级分的CD3阳性细胞的百分比。(B)从TiPSC 1E细胞分化5周的FACS图。用于表达的CD3阳性细胞的流式细胞术分析，出现的淋巴样细胞是CD7+、CD5+、CD3+、CD8+、CD56+CD335+、CD161+、TCRαβ+和TCRγδ-。
图8A-8B：(A)显示了来自阳性和阴性磁性分选级分的第16天HPC的TiPC淋巴样分化过程的效率，为输入HPC与输出淋巴样细胞的比率。(B)从正磁性分选级分开始，在4周结束时的分化过程的累积效率。
图9A-9B：(A)在分化的第42天，衍生自iPSC 02179(MeCP2WT)的树突细胞的表型分析。针对骨髓样树突标志物CD205、CD209、HLA-DR、CD1a、CD1c、CD80、CD11c、CD80、CD86和CD83的细胞表面表达对细胞进行染色。(B)用于定量在树突细胞上表达的多种细胞表面标志物的表达的代表性FACS图直方图。
图10：将DQ TM卵清蛋白(DQ-OVA，Invitrogen)以1mg/ml溶解在PBS中，并以100ug/ml加入到iPSC衍生的DC中。将细胞在37℃或4℃孵育，用FACS缓冲液洗涤两次并在Accuri流式细胞仪上分析。与在4℃的非特异性OVA摄取相比，iPSC衍生的DC在37℃证明了OVA的特异性摄取。
图11：表示hPCS的无饲养细胞和无血清T和NK细胞分化的图。在9天期间通过聚集体形成、中胚层诱导和HPC分化的连续步骤，PSC首先分化为悬浮(3D)胚胎体(EB)培养物中的CD34+造血祖细胞(HPC)。使用直接CD34顺磁珠(Miltenyi Biotec)通过MACS分离CD34+细胞，并在2周期间转移至包被DLL4+retronectin的平板用于T/NK分化。在T-EM(ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基(Stem Cell Technologies))中，在包被抗CD3mAb(OKT3)+retronectin(均0.5μg/cm2)的平板上，在单独补充IL2或与其他T细胞生长促进细胞因子(IL7、IL15、IL21)组合的T-EM(ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基(Stem CellTechnologies))中，在培养的2周期间，进一步扩增T细胞。缩写：SFDM，无血清分化培养基；TCDM，T细胞分化培养基；TCEM，T细胞扩增培养基；MACS，磁激活细胞分选。
图12：T/NK分化培养物的流式细胞术分析。在T/NK分化条件下2周后，PSC(1CTiPSC)衍生的CD34+细胞发育由低FSC/SSC参数定义的典型淋巴样细胞群(左点图)。该淋巴样群主要包含CD3+T和CD56+CD3-NK细胞(中点图)。T细胞群包含CD4+和CD8+单阳性和双阳性细胞以及显著比例的双阴性细胞(右点图)。
图13：整个分化中不同细胞群的产率。每个相应细胞类型的产率表示为图中描绘的细胞衍生的每个阶段的输出与输入绝对细胞数量的比率。例如，1.5的CD34+细胞产率表明从1个(输入)PSC细胞平均能够衍生1.5个(输出)CD34+细胞。因此，102的T细胞产率表明从1个(输入)CD34+细胞能够衍生102个(输出)T细胞。
图14：PSC衍生的T细胞的表型。在4周期间分化和扩增的PSC衍生的T细胞(CD3+)表达α/βTCR(不是γ/δ或不变的Vα24NKT TCR)和典型的T细胞标志物CD5、CD27、CD7。它们还表达NK相关(CD161、CD94)和激活(CD69)标志物。
图15：PSC衍生的T细胞的扩增。固定化的抗CD3抗体(iCD3)是最低限度需要且足以实现PSC衍生的T细胞的扩增(条形图)。可溶性刺激CD3和CD28mAb(sCD3、sCD28)单独或组合(sCD3+sCD28)或者当加入至iCD3(iCD3+sCD28)时无效。在扩增培养物中增殖的T细胞获得不规则形状的淋巴母细胞的特征形态(照片)。与相对杂合的输入细胞群相反，从2周T细胞扩增中收获的细胞基本上是纯CD3+T细胞，其也表达CD56并获得CD8表达(流式细胞术点图)。
图16A-16H：(A)第8天HPC培养物的代表性照片：HPC从下面的内皮层的HPC出芽。(B)2D HPC分化过程的示意图。(C)在分化的第7-10天从01279.107.3902(MeCP2KO)细胞系生成HPC。(D)在分化的第7-10天从TiPSCs1E细胞系生成HPC。收获细胞并通过流式细胞术定量CD43/CD34细胞的百分比。(E)从iPSC生成HPC的效率。通过将所生成的HPC的绝对数量除以iPSC的输入数量来计算该过程的效率。(F)前T和前NK细胞的分析。在第7-10天收获从iPSC0.1279.107.3902(MeCP2KO)生成的HPC并冷冻保存。将HPC解冻并以25K/cm2的密度铺板在包被Retronectin-DLL4的平板上。将细胞置于含有1％Glutamax、1％青霉素链霉素、95μM L-抗坏血酸2-磷酸、50ng/mL干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、Flt-3配体(Flt-3)和IL-7的无血清确定(SFD)培养基中，以在缺氧和条件下刺激淋巴样分化。每48小时向细胞进料新鲜培养基，并在第14天使用冷PBS收获细胞。针对CD4、CD7、CD5、CD56、CD8和CD3的表面表达对细胞进行染色。在淋巴样散点门下通过流式细胞术定量细胞百分比。定量T、NK和NK/T细胞的存在。(G)前T和前NK细胞的分析。针对CD4、CD7、CD5、CD56、CD8和CD3的表面表达对细胞进行染色。在淋巴样散点门下通过流式细胞术定量细胞百分比。(H)从HPC生成T细胞的效率。通过将生成的T细胞(CD3+)的绝对数量除以HPC(CD43/34+)的输入数量来计算该过程的效率。
图17A-17C：(A)使用iPSC的3D HPC分化过程的示意图，所述iPSC适应在E8培养基存在和缺氧条件下在Matrigel或玻连蛋白上的无饲养细胞生长。HPC分化的第一阶段由BMP4、VEGF和FGF驱动4天，并且分化的第二阶段通过将细胞置于含有肝素、SCF、TPO、Flt-3配体、IL-3和IL-6的培养基中来驱动。(B)工程化改造策略以在雄性iPSC细胞系2.038中生成MeCP2KO从而创建9006(01279.107.003902)。(C)衍生自用MeCP2TALENS和供体质粒p1553转染的01279iPSC的MeCP2变体001、002、005和008的氨基酸比对的描述。所有变体(001、002、005和008)不编码甲基CpG结合结构域。
图18A-18C：前T细胞和前NK细胞的定量在HPC分化的第7-11天收获的iPSC Tips1E并置于包被Ret-DLL4的平板上，以2.5×104/cm2的密度启动淋巴样分化。测定在缺氧条件下(A)和常氧条件下(B)维持的01279(MeCP2WT)细胞以及01279.107.3902细胞(MeCP2K0)(C)中CD8+CD3+(T细胞)、CD56+/CD8+(NK细胞)和CD56+/CD3+(NK/T细胞)的百分比。(A-B)NK细胞具有最高百分比的阳性细胞，其次是NK/T细胞和T细胞。(C)从第7天到第10天，从高到低的阳性细胞百分比是T细胞、NK/T细胞和NK细胞。在第11天，阳性细胞的最高百分比是NK细胞，接着是NK/T细胞和T细胞。
图19A-19C：用于鉴定体外生成的淋巴样细胞的门控策略。(A)来自成人外周血的淋巴细胞的一般散点谱。(B)在分化的第18天淋巴样细胞的散点谱。示例显示了FSC-SSC门和淋巴样门。(C)使用碘化丙锭在FSC-SSC散点和淋巴散点内对活细胞进行门控。
图20：用于鉴定体外生成的淋巴样细胞的门控策略。显示了在分化的第18天淋巴样细胞的散点谱。示例显示了FSC-SSC门和淋巴样门。使用碘化丙啶在FSC-SSC散点和淋巴散点内对活细胞进行门控，然后通过流式细胞术针对CD7和CD5阳性细胞进行染色。
图21A-21B：在HPC分化第7-11天的NK(CD3-/CD56+)细胞的定量，并置于包被Ret-DLL4的平板上，以2.5×104/cm2的密度起始淋巴样分化。对于含有MeCp2WT和MeCp2KO状态的iPSC克隆，测定在所有活FSC-SSC门(A)和淋巴样门(B)下的双阳性CD56+/CD3-的百分比。
图22：PSC衍生的T细胞的1型细胞因子产生谱。将来自TiPSC(1C)衍生的CD34+细胞的2周T/NK分化培养物中生成的T细胞转移至T细胞扩增培养物(固定化的抗CD3mAb、IL2和IL7)。使用LEGENDplex流式细胞术多重细胞因子测定法(CD8/NK组；BioLegend)在培养物上清液中测量细胞因子。相对的细胞因子水平描绘在相应的点图上。
图23A-23B：HLA超级供体PSC的T/NK分化潜力。评估通过无转基因附加体方法衍生的HLA超级供体PSC系H、K、L和O的T/NK分化潜力，并与通过逆转录病毒重新编程的高T/NK生产性1C TiPSC进行比较。(A)点图显示在第9天收获的PSC分化培养物中CD34+HPC的比例。条形图显示CD34+HPC的各自定量产率。(B)衍生自HLA超级供体PSC系的CD34+HPC的T/NK分化证明在所有测试的HPC中具有相对高的T/NK淋巴细胞生成潜力(每1个输入CD34+HPC有100-200个T/NK)。
示例实施方案的详述
在某些实施方案中，本公开内容提供了从诱导多能干细胞生成免疫细胞的高效方法，所述诱导多能干细胞已经从体细胞(例如，血细胞)的起始群体重新编程。通过现有方法产生的免疫细胞能够包括T细胞、NK细胞、T/NK细胞和树突细胞。在一些方面，体细胞的起始群体包含T细胞。T细胞可以分离自各种来源，例如血液样品。
在特定实施方案中，血细胞的起始群体包含HLA纯合细胞(即，对于MHC I类和II类基因是纯合的)。因此，iPSC能够从分离自HLA纯合受试者的细胞产生，HLA纯合受试者在本文中称为HLA超级供体。
可以通过引入重新编程因子，例如通过病毒载体或附加体载体，将血细胞群重新编程为iPSC。然后将这些血细胞衍生的iPSC(例如，T细胞衍生的iPSC(TiPSC))分化为造血前体细胞。在一种方法中，分化过程涉及WNT激活，用造血诱导细胞因子进行培养和CD34+细胞分离。最后，然后将HPC分化为免疫细胞，例如淋巴样细胞(例如T、NK和T/NK细胞)和骨髓样细胞(例如树突细胞)。
分化为淋巴样细胞可以通过使用RetroNectin和DLL-4作为无饲养细胞基质。通过使用抗坏血酸来提高效率和成熟以及通过在缺氧条件下培养，可以进一步增强T细胞分化。有趣的是，发明人已确定HPC分化(例如，第7-11天)期间淋巴样潜力的最佳时间范围。这些具有淋巴样潜力的HPC可以通过CD34和CD43的表达来鉴定。此外，可以通过分选对于标志物CD144、CD34、CD45和CD7中的两种或更多种是阳性的细胞级分来分离具有增强的淋巴样潜力的HPC。在一些方面，用于衍生树突细胞的祖细胞是在HPC分化的第16天左右出现的常见骨髓样祖细胞。
由血细胞衍生的PSC产生的淋巴样细胞可以包括T细胞、NK细胞和T/NK细胞，它们保留其特有的T细胞受体(TCR)基因重排，这种特性可以被利用，例如，作为遗传跟踪标志物或在再分化实验中研究人T细胞发育。本公开内容的一个特别的优点在于T细胞受体的重排的和减少的V、D、J基因区段，其可以保留在分化的T细胞中。这用作T细胞衍生的iPS细胞的不同克隆群体的特定特征或“条形码”，并且还有助于从未经历V(D)J重组的多能干细胞分化那些iPS细胞。
因此，本发明的方法可以提供无限数量的HLA纯合免疫细胞，例如T细胞、NK细胞、T/NK细胞和树突细胞，用于广泛的应用，例如体内稳定移植，体外筛选化合物，和阐明血液疾病和损伤的机制。
I.定义
如本文所用，就特定组分而言，“基本上不含”在本文中用于表示没有特定组分被有目的地配制成组合物和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，组合物的任何无意污染导致的特定组分的总量远低于0.05％、优选地低于0.01％。最优选的是其中用标准分析方法不能检测到任何量的特定组分的组合物。
如本说明书中所使用的，“一个(a)”或“一种(an)”可以表示一个或更多。如本文在权利要求中所使用的，当与词“包括”结合使用时，词“一个”或“一种”可以表示一个或超过一个。
权利要求中术语“或”的使用用于表示“和/或”，除非明确指出仅指替代方案或替代方案是相互排斥的，尽管本公开内容支持仅涉及替代方案的定义和“和/或”。如本文所用，“另一个”可以表示至少第二个或更多。
在整个本申请中，术语“约”用于指示数值包括用于确定值的装置、方法的误差的固有变化，或者研究对象之间存在的变化。
当与细胞或生物体中的蛋白质、基因、核酸或多核苷酸相关使用时，术语“外源的”是指通过人工或自然手段已经引入细胞或生物体中的蛋白质、基因、核酸或多核苷酸；或者当与细胞相关时，该术语是指通过人工或天然方法分离并随后引入其他细胞或生物体中的细胞。外源核酸可以来自不同的生物体或细胞，或者它可以是在生物体或细胞内天然存在的核酸的一个或多个另外的拷贝。外源细胞可以来自不同的生物体，或者它可以来自相同的生物体。作为非限制性实例，外源核酸是在不同于天然细胞中的染色体位置的核酸，或者其侧翼是与天然存在不同的核酸序列。
“表达构建体”或“表达盒”是指能够指导转录的核酸分子。表达构建体至少包括一个或多个转录控制元件(例如启动子、增强子或其功能等同的结构)，指导在一种或多种所需细胞类型、组织或器官中的基因表达。还可以包括其他元件，例如转录终止信号。
“载体”或“构建体”(有时称为基因递送系统或基因转移“媒介物”)是指包含待在体外或体外递送至宿主细胞的多核苷酸的大分子或分子复合物。
“质粒”是常见类型的载体，是与染色体DNA分开的染色体外DNA分子，其能够独立于染色体DNA复制。在某些情况下，它是环形和双链的。
“复制的起点”(“ori”)或“复制起点”是一种DNA序列，例如在淋巴细胞性疱疹病毒中，当存在于细胞中的质粒中时能够维持质粒中的相连序列和/或DNA合成起始处或附近的位点。例如，EBV(Ebstein-Barr病毒)的ori包括FR序列(30bp重复序列的20个不完美拷贝)，优选地是DS序列；然而，EBV中的其他位点结合EBNA-1，例如Rep*序列可以替代DS作为复制的起点(Kirshmaier和Sugden，1998)。因此，EBV的复制起点包括FR、DS或Rep*序列或通过核酸修饰或由其衍生的合成组合的任何功能等同序列。例如，本发明还可以使用EBV的遗传工程化改造的复制起点，例如通过插入或突变单个元件，如Lindner等人，2008中具体描述的。
“编码”特定蛋白质的“基因”、“多核苷酸”、“编码区”、“序列”、“区段”、“片段”或“转基因”是被转录的核酸分子，其当置于合适的调节序列控制下时，任选地还可以在体外或体内翻译成基因产物，例如多肽。编码区可以以cDNA、基因组DNA或RNA形式存在。当以DNA形式存在时，核酸分子可以是单链的(即有义链)或双链的。编码区的边界由5'(氨基)末端的起始密码子和3'(羧基)末端的翻译终止密码子决定。基因能够包括但不限于来自原核或真核mRNA的cDNA、来自原核或真核DNA的基因组DNA序列以及合成的DNA序列。转录终止序列通常位于基因序列的3'。
术语“控制元件”统指启动子区、多腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调节结构域、复制的起点、内部核糖体进入位点(IRES)、增强子、剪接点等，它们共同提供用于受体细胞中编码序列的复制、转录、转录后加工和翻译。并非所有这些控制元件都需要存在，只要所选择的编码序列能够在合适的宿主细胞中复制、转录和翻译即可。
本文使用的术语“启动子”在其通常意义上是指包含DNA调节序列的核苷酸区域，其中调节序列衍生自能够结合RNA聚合酶并起始下游(3'方向)基因编码序列的转录的基因。它可以含有调节蛋白和分子(例如RNA聚合酶和其他转录因子)可以结合其上的遗传元件，以起始核酸序列的特异性转录。短语“可操作地定位”、“可操作地连接”、“控制下”和“转录控制下”意指启动子处于与核酸序列相关的正确功能位置和/或方向以控制该序列的转录起始和/或或表达。
“增强子”是指这样的核酸序列，当其位于启动子附近时，相对于不存在增强子结构域由启动子产生的转录活性，赋予增加的转录活性。
关于核酸分子的“可操作地连接”或“共表达”是指两个或更多个核酸分子(例如，待转录的核酸分子、启动子和增强子元件)以允许转录核酸分子的方式连接。关于肽和/或多肽分子的“可操作地连接”或“共表达”是指两个或更多个肽和/或多肽分子以产生单个多肽链的方式连接，即融合多肽，具有融合的每种肽和/或多肽组分的至少一种性质。融合多肽优选是嵌合的，即由异源分子组成。
“同源性”是指两个多核苷酸或两个多肽之间的同一性百分比。一个序列与另一个序列之间的对应关系可以通过本领域已知的技术确定。例如，可以通过比对序列信息和使用容易获得的计算机程序直接比较两个多肽分子之间的序列信息来确定同源性。或者，可以通过在促进同源区域之间稳定双链体形成的条件下杂交多核苷酸，然后用单链特异性核酸酶进行消化，和消化片段的大小测定来确定同源性。当使用上述方法测定的，在分子的限定长度上至少约80％，优选地至少约90％，最优选地至少约95％的核苷酸或氨基酸分别匹配时，两个DNA或两个多肽序列彼此“基本上同源”。
术语“细胞”在本文中以其在本技术领域内最广泛的含义使用并且是指作为多细胞生物体组织的结构单元的活体，其被将其与外部隔离的膜结构包围，具有自我复制的能力，并具有遗传信息和表达它的机制。本文使用的细胞可以是天然存在的细胞或人工修饰的细胞(例如，融合细胞、遗传修饰的细胞等)。
术语“干细胞”在本文中是指在合适条件下能够分化为广泛多样的特化细胞类型，而在其他合适的条件下能够自我更新并保持在基本上未分化的多能状态的细胞。术语“干细胞”还包括多能细胞(pluripotent cell)、专能细胞(multipotent cell)、前体细胞和祖细胞。示例性人干细胞能够由从骨髓组织获得的造血干细胞或间充质干细胞、从胚胎组织获得的胚胎干细胞或从胎儿的生殖器组织获得的胚胎生殖细胞获得。示例性多能干细胞也能够通过表达与多能性相关的某些转录因子将体细胞重新编程为多能状态而从体细胞产生；这些细胞被称为“诱导多能干细胞”或“iPSC或iPS细胞”。
“胚胎干(ES)细胞”是未分化的多能细胞，其在早期阶段从胚胎获得，例如在胚泡阶段的内细胞团，或通过人工方法(例如核移植)产生和可以在胚胎或成人中产生任何分化的细胞类型，包括生殖细胞(例如精子和卵)。
“诱导多能干细胞(iPSC或iPS细胞)”是通过表达或诱导因子(本文称为重新编程因子)的组合的表达来重新编程体细胞而生成的细胞。使用胎儿、出生后、新生儿、幼年或成年体细胞能够生成iPS细胞。在某些实施方案中，能够用于将体细胞重新编程为多能干细胞的因子包括，例如，Oct4(有时称为Oct 3/4)、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog和Lin28。在一些实施方案中，通过表达至少两种重新编程因子、至少三种重新编程因子、至少四种重新编程因子、至少五种重新编程因子、至少六种重新编程因子或至少七种重新编程因子来重新编程体细胞，从而将体细胞重新编程为多能干细胞。
“造血祖细胞”或“造血前体细胞(HPC)”是指注定成为造血谱系但能够进一步造血分化的细胞，并且包括造血干细胞、专能造血干细胞、常见骨髓祖细胞、巨核细胞祖细胞、红细胞祖细胞和淋巴样祖细胞。造血干细胞(HSC)是专能干细胞，可产生所有血细胞类型，包括骨髓样(如单核细胞和巨噬细胞、粒细胞(如中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞)、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞)和淋巴样谱系(例如T细胞、B细胞和NK细胞)(参见例如，Doulatov等人，2012；Notta等人，2015)。“多淋巴样祖细胞”(MLP)定义为描述产生所有淋巴样谱系(例如B、T和NK细胞)，但可能具有或不具有其他(骨髓样)潜能(Doulatov等人，2010)并且是CD45RA+/CD10+/CD7-的任何祖细胞。任何B、T和NK祖细胞可以是指MLP。“共同骨髓样祖细胞”(CMP)是指共同的骨髓样祖细胞，其通过CD45+/CD31+/CD43+/CD34-细胞的表达定义，可以产生粒细胞、单核细胞、巨核细胞和红细胞。造血祖细胞可以表达CD34。造血祖细胞可以共表达CD133并且对于CD38表达是阴性的。造血前体细胞包括CD34+/CD45+造血前体细胞和CD34+/CD45+/CD43+造血前体细胞。CD34+/CD43+/CD45+造血前体细胞可以高度富集骨髓样祖细胞。造血细胞还包括原始造血细胞的多种亚群，包括：CD34-/CD133+/CD38-(原始造血前体细胞)、CD43(+)CD235a(+)CD41a(+/-)(赤型-巨核细胞)、lin(-)CD34(+)CD43(+)CD45(-)(专能)和lin(-)CD34(+)CD43(+)CD45(+)(骨髓样倾斜)细胞、CD133+/ALDH+(醛氢化酶)(例如，Hess等人，2004；Christ等人，2007)。预期任何这些原始造血细胞类型或造血前体细胞可以如本文所述转化为iPS细胞。在一些方面，细胞可包括肥大细胞、朗格汉氏细胞、破骨细胞、NK细胞、T细胞、CIK T细胞或T细胞、NK细胞和B细胞的其他亚型。
如本文所用，术语“免疫细胞”是指免疫系统的细胞，包括但不限于T细胞、NK细胞、T/NK细胞、树突细胞、巨噬细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性细胞及其任何组合。
T细胞的“激活剂”或将激活T细胞的病症是指激活T细胞并包括抗原的刺激物，其可以存在于抗原呈递细胞上或其他表面上；多克隆激活剂，无论特异性如何都与许多T细胞受体(TCR)复合物结合，并包括凝集素，例如刀豆蛋白-A(Con-A)和植物血凝素(PHA)和例如特异性结合TCR或CD3蛋白上的不变框架表位的抗体的试剂；和超级抗原，其刺激大量的T细胞，并包括例如肠毒素，例如葡萄球菌肠毒素。
术语“T淋巴细胞”和“T细胞”可互换使用，并且是指表达T细胞抗原受体(TCR)的细胞，T细胞抗原受体能够识别当在抗原呈递细胞的表面上展示时的抗原或基质连同一种或多种MHC分子或一种或多种非典型MHC分子。
术语“T细胞”是指如本领域所定义的T淋巴细胞，并且旨在包括胸腺细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或激活的T淋巴细胞。T细胞可以是CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+CD8+T细胞或CD4-CD8-细胞。T细胞也可以是T辅助性细胞，如T辅助性1(TH1)、或T辅助性2(TH2)细胞、或TH17细胞，以及细胞毒性T细胞、调节性T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞、记忆T细胞或γδT细胞(Wilson等人，2009；Wynn，2005；Ladi等人，2006)。以至少一种标志物(例如CD4)彼此不同的T细胞在本文中称为T细胞的“亚群”。
“CD4+T细胞”是指在其表面上表达CD4并与细胞介导的免疫应答相关的T细胞亚群。它们的特征在于刺激后的分泌谱，其可包括细胞因子，例如IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4和IL-10的分泌。“CD4”是最初定义为T淋巴细胞上的分化抗原的55-kD糖蛋白，但也发现在包括单核细胞/巨噬细胞的其他细胞上。CD4抗原是免疫球蛋白超基因家族的成员，并且涉及MHC(主要组织相容性复合物)II类限制性免疫应答中的缔合识别元件。在T淋巴细胞上，它们定义了辅助性/诱导性亚群。
“CD8+T细胞”是指在其表面上表达CD8的T细胞亚群，是MHC I类限制的，并且起细胞毒性T细胞的作用。“CD8”分子是在胸腺细胞上以及在细胞毒性和抑制性T淋巴细胞上发现的分化抗原。CD8抗原是免疫球蛋白超基因家族的成员，并且是主要组织相容性复合物I类限制性相互作用中的缔合识别元件。
“多能干细胞”是指具有分化为构成一种或多种组织或器官，或优选地，三种胚层中的任何一种：内胚层(例如内部胃内膜、胃肠道、肺)、中胚层(例如肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖器)或外胚层(例如表皮组织和神经系统)的所有细胞的潜力的干细胞。
如本文所用，术语“体细胞”是指生殖细胞以外的任何细胞，例如卵子、精子等，其不直接将它的DNA转移至下一代。通常，体细胞具有有限的多能性或没有多能性。本文使用的体细胞可以是天然存在的或遗传修饰的。
“编程”是改变细胞可以产生的后代类型的过程。例如，细胞已经被编程，当它被改变时，它能够形成至少一种新细胞类型的后代，无论是在培养中还是在体内，与它在相同条件下没有编程能够形成的相比。这意味着在充分增殖后，如果在编程之前基本上不形成这样的后代，则观察到具有新细胞类型的表型特征的可测量比例的后代；或者，具有新细胞类型的特征的比例可测量地大于编程之前的比例。该过程包括分化、去分化和转分化。
“分化”是较不特化的细胞变成更特化的细胞类型的过程。“去分化”是这样的细胞过程，其中部分或终末分化的细胞恢复到早期发育阶段，例如多能性或专能性。“转分化”是将一种分化的细胞类型转化为另一种分化的细胞类型的过程。通常，通过编程的转分化发生而细胞不经过中间多能性阶段——即，细胞直接从一种分化的细胞类型编程为另一种分化的细胞类型。在某些条件下，具有新细胞类型的特征的后代的比例可以按优先级增加的顺序为至少约1％、5％、25％或更多。
“重新编程”是与在没有重新编程的相同条件下相比，赋予细胞在培养或体内形成至少一种新细胞类型的后代的能力的可测量增加的过程。更具体地，重新编程是赋予体细胞以多能潜力的过程。这意味着如果在重新编程之前基本上不形成这样的后代，则在充分增殖后，可测量比例的后代具有新细胞类型的表型特征；否则，具有新细胞类型的特征的比例可测量地大于重新编程之前的比例。在某些条件下，具有新细胞类型特征的后代的比例可以按优先级增加的顺序为至少约1％、5％、25％或更多。
术语“正向编程”是指通过向专能或多能细胞提供一种或多种特定谱系决定基因或基因产物来编程专能或多能细胞，与不具有多能性的分化的体细胞相反。例如，正向编程可以描述将ESC或iPSC编程为造血前体细胞或其他前体细胞，或造血细胞或其他分化的体细胞的过程。
如本文所用，术语“受试者”或“有此需要的受试者”是指需要细胞或组织移植的在任何年龄的哺乳动物，优选地人，男性或女性。通常，受试者由于对于通过细胞或组织移植的治疗可愈的病症或病理或不希望的病况、状态或综合征，或者身体、形态或生理失常而需要细胞或组织移植(在本文中也是指受体)。
如本文所用，基因的“破坏”是指与缺乏破坏的基因产物的表达水平相比，消除或减少细胞中受试基因编码的一种或多种基因产物的表达。示例性基因产物包括由该基因编码的mRNA和蛋白质产物。在某些情况下，破坏是瞬时的或可逆的，并且在其他情况下是永久的。尽管事实上可能产生截短的或无功能的产品，但在某些情况下的破坏是有功能的或全长的蛋白质或mRNA。在本文的一些实施方案中，与表达相反，基因活性或功能被破坏。基因破坏通常通过人工方法诱导，即通过添加或引入化合物、分子、复合物或组合物，和/或通过破坏基因的核酸或与基因相关的核酸，例如在DNA水平。用于基因破坏的示例性方法包括基因沉默、敲低、敲除和/或基因破坏技术，例如基因编辑。实例包括反义技术，例如RNAi、siRNA、shRNA和/或核酶，其通常导致表达的瞬时减少，以及导致靶基因失活或破坏的基因编辑技术，例如通过诱导断裂和/或或同源重组。实例包括插入、突变和缺失。破坏通常导致抑制和/或完全缺少由该基因编码的正常或“野生型”产物的表达。这种基因破坏的实例是基因或基因部分的插入、移码和错义突变、缺失、敲入和敲除，包括整个基因的缺失。这种破坏可以在编码区中发生，例如在一个或多个外显子中，导致不能产生全长产物、功能产物或任何产物，例如通过插入终止密码子。这种破坏也可以通过在启动子或增强子或影响转录激活的其它区域中的破坏而发生，从而阻止基因的转录。基因破坏包括基因靶向，包括通过同源重组的靶向基因失活。
“Notch配体”是能够结合在许多不同哺乳动物细胞(例如造血干细胞)的膜中存在的Notch受体多肽的蛋白质。已在人细胞中鉴定的Notch受体包括Notch-1、Notch-2、Notch-3和Notch-4。Notch配体通常具有诊断性DSL结构域(D-Delta、S-Serrate和L-Lag2)，其在氨基末端包含20至22个氨基酸和在细胞外表面上的3至8个EGF样重复序列(Furie和Furie，1988；Knust等人，1987；Suzuki等人，1987)。
“超级供体”在本文中是指对于某些MHC I类和II类基因是纯合的个体。这些纯合个体可以作为超级供体和它们的细胞，包括组织和包含其细胞的其他材料，能够移植到对于该单倍型是纯合的或杂合的个体中。超级供体可分别对于HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP或HLA-DQ基因座/基因座等位基因是纯合的。
II.体细胞衍生的iPSC
A.体细胞的起始群体
本公开内容的实施方案涉及重新编程为iPSC的体细胞(例如，血细胞或皮肤细胞)的起始群体。血细胞群可包括外周血单核细胞(PBMC)、含有混合群体的全血或其级分、脾细胞、骨髓细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、通过白细胞分离术获得的细胞、活组织检查组织和淋巴结，例如从肿瘤中排出的淋巴结。合适的供体包括免疫的供体、未免疫的(幼稚)供体、经处理的或未处理的供体。“经处理的”供体是已经暴露于一种或多种生物改性剂的供体。“未处理的”供体尚未暴露于一种或多种生物改性剂。
在一些方面，血细胞群包含T细胞。T细胞能够为纯化的T细胞群，或者备选地T细胞可以在具有不同类型细胞的群体中，例如B细胞和/或其他外周血细胞。T细胞能够为T细胞亚群的纯化群，例如CD4+T细胞，或者它们能够为包含T细胞的不同亚群的T细胞群。在另一个实施方案中，T细胞是已在培养物中维持延长的时间段的T细胞克隆。T细胞克隆可以转化到不同程度。在一个具体实施方案中，T细胞是在培养中无限增殖的T细胞克隆。
在一些方面，T细胞是原代T细胞。术语“原代T细胞”旨在包括从个体获得的T细胞，与已经培养维持延长的时间段的T细胞相反。因此，原代T细胞特别是从受试者获得的外周血T细胞。原代T细胞群能够主要由T细胞的一个亚群组成。或者，原代T细胞群能够由T细胞的不同亚群组成。
T细胞能够来自先前存储的血液样品，来自健康个体，或者备选地来自受病症影响的个体。病症能够为传染病，例如由病毒感染、细菌感染或任何其他微生物感染引起的病症，或者是过度增殖性疾病，例如癌症如黑素瘤。在一个具体实施方案中，T细胞来自感染人免疫缺陷病毒(HIV)的个体。在另一个实施方案中，T细胞来自患有或易患自身免疫疾病或T细胞病变的受试者。T细胞能够具有人类起源、鼠类起源或为任何其他哺乳动物物种。
获得包含T细胞的细胞群的方法是本领域熟知的。例如，根据本领域已知的方法所述能够获得外周血单核细胞(PBMC)。这些方法的实例在实施例中列出，并由Kim等人(1992)；Biswas等人(1990)；Biswas等人(1991)讨论。
在一些方面，血细胞的起始群体包括造血干细胞(HSC)。HSC通常存在于骨髓中但能够被迫进入血液，这一过程在临床使用上称为动员，用于在外周血中收获大量HSC。选择的一种动员剂是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。在外周血中循环的CD34+造血干细胞或祖细胞能够通过血液成分单采术技术收集，无论是在未受干扰的状态下，还是在外部施用造血生长因子如G-CSF之后的动员之后。动员后收集的干细胞或祖细胞的数量大于未受干扰状态下血液成分单采术后获得的数量。在一些方面，细胞群的来源是其细胞未被外部应用的因子动员的受试者，因为不需要富集造血干细胞或祖细胞。
从细胞群获得造血前体细胞的方法也是本领域熟知的。可以使用各种细胞因子例如hSCF、hFLT3和/或IL-3(Akkina等人，1996)扩增造血前体细胞，或者可以使用MACS或FACS富集CD34+细胞。如上所述，阴性选择技术也可用于富集CD34+细胞。
用于本文所述方法的细胞群可以是哺乳动物细胞，例如人细胞、非人灵长类动物细胞、啮齿动物细胞(例如小鼠或大鼠)、牛细胞、羊细胞、猪细胞、马细胞、绵羊细胞、犬细胞和猫细胞或其混合物。非人灵长类动物细胞包括恒河猴猕猴细胞。细胞可以从动物(例如人类患者)获得，或者它们可以来自细胞系。如果细胞是从动物中获得的，它们可以原样使用，例如，作为未分离的细胞(即混合群体)；它们可以首先在培养物中建立，例如通过转化；或者它们可能已经过初步纯化方法。例如，细胞群可以通过基于细胞表面标志物表达的阳性或阴性选择来操作；在体外或体内用一种或多种抗原进行刺激；在体外或体内用一种或多种生物改性剂进行处理；或这些中的任何一个或全部的组合。在示例说明性实施方案中，对细胞群进行负选择以消耗非T细胞和/或特定T细胞亚群。能够基于各种分子的细胞表面表达进行阴性选择，包括B细胞标志物如CD19和CD20；单核细胞标志物CD14；NK细胞标志物CD56。或者，可以对细胞群进行负选择以消耗非CD34+造血细胞和/或特定的造血细胞亚群。能够基于各种分子的细胞表面表达进行阴性选择，例如抗体的混合物(例如，CD2、CD3、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD56、CD123、CD235a和CD41(例如，对于巨核细胞谱系的细胞)，其可用于分离其他细胞类型，例如通过MACS或柱分离。
还能够从受试者获得细胞样品，然后将其针对所需的细胞类型进行富集。例如，如本文所述，能够从血液中分离PBMC和/或CD34+造血细胞。逆流离心(淘洗)能够用于从PBMC富集T细胞。还能够使用多种技术从其他细胞中分离细胞，例如用与所需细胞类型的细胞表面上的表位结合的抗体进行分离和/或激活，例如，一些T细胞分离试剂盒使用缀合抗体的珠子来激活细胞并然后用相同的珠子进行柱分离。能够使用的另一种方法包括使用针对细胞表面标志物的抗体进行阴性选择，以选择性地富集特定细胞类型而不通过受体结合来激活细胞。
骨髓细胞可以从髂嵴、股骨、胫骨、脊柱、肋骨或其他髓质空间获得。骨髓可以从患者体内取出并通过多种分离和洗涤程序而分离。分离骨髓细胞的已知方法包括以下步骤：a)将骨髓悬浮液离心分离为三个级分并收集中间级分，或血沉棕黄层；b)将来自步骤(a)的血沉棕黄层级分在分离液，通常是Ficoll(Pharmacia Fine Chemicals AB的商标)中再离心一次，并收集含有骨髓细胞的中间级分；c)洗涤来自步骤(b)的收集的级分，用于回收可再输入的骨髓细胞。
如果需要使用富含T细胞的细胞群，能够使用连续流动细胞分离器通过白细胞分离术和机械血液成分单采术从细胞的混合群中获得这样的细胞群。例如，能够通过任何已知方法从血沉棕黄层中分离T细胞，包括通过Ficoll-HypaqueTM梯度的分离，通过Percoll梯度的分离或淘洗。
在某些方面，T细胞被结合T细胞受体的试剂激活，以触发用于T细胞激活的信号级联。例如，可以使用CD3抗体。对于T细胞扩增至显著数量和用于重新编程的增殖状态，也可以使用细胞因子，例如IL-2。在某一方面，抗CD3和抗CD28均可用于涉及共刺激的T细胞激活。在备选的方面，可以应用抗CD3的交联，例如平板结合的抗CD3。如果可溶性抗CD3用于激活PBMC中的T细胞，则可溶性抗CD3抗体可以结合PBMC中的APC，然后PBMC将抗体呈递给T细胞。如果单独的可溶性抗CD3抗体用于纯化的T细胞群中，由于上述原因会产生无反应性。某一实施方案包括在抗CD3(OKT3)和IL2存在下培养T细胞，这是有利和方便的，因为不需要使用昂贵且缺乏效率的珠子或平板结合的抗体；加入OKT3和IL2后，PBMC的细胞环境将有助于激活T细胞。然后，由于优先扩增，T细胞过度多于(overcrowd)在PBMC培养物中的其他细胞类型。
在某些方面，血细胞的起始群体包括淋巴母细胞样细胞，例如来自淋巴母细胞样细胞系(LCL)。LCL的生成在本领域是已知的，例如，通过用Epstein-Barr病毒(EBV)感染B细胞(Frisan等人，Epstein-Barr Virus Protocols，Part III，125-127,2001)。
B.MHC单倍型匹配
主要组织相容性复合物是同种异体器官移植物免疫排斥的主要原因。有三种主要的I类MHC单倍型(A、B和C)和三种主要的MHC II类单倍型(DR、DP和DQ)。HLA基因座具有高度多态性，并在6号染色体上分布超过4Mb。该区域内HLA基因进行单倍型的能力具有临床意义，因为该区域与自身免疫和感染性疾病相关，并且供体和受体之间HLA单倍型的相容性可以影响移植的临床结果。对应于MHC I类的HLA呈递来自细胞内的肽和对应于MHC II类的HLA呈递来自细胞外的抗原至T-淋巴细胞。移植物和宿主之间MHC单倍型的不相容性触发针对移植物的免疫应答并导致其排斥。因此，能够用免疫抑制剂治疗患者以防止排斥。HLA匹配的干细胞系可克服免疫排斥的风险。
由于HLA在移植中的重要性，HLA基因座通常通过血清学和PCR进行分型以鉴定有利的供体-受体对。HLA I类和II类抗原的血清学检测可以使用补体介导的淋巴细胞毒性试验用纯化的T或B淋巴细胞来完成。该程序主要用于匹配HLA-A和-B基因座。基于分子的组织分型通常比血清学测试更准确。低分辨率分子方法，如SSOP(序列特异性寡核苷酸探针)方法，其中针对一系列寡核苷酸探针测试PCR产物，可用于鉴定HLA抗原，并且目前这些方法是用于II类HLA分型的最常用方法。利用等位基因特异性引物进行PCR扩增的高分辨率技术如SSP(序列特异性引物)方法能够鉴定特定的MHC等位基因。
如果供体细胞是HLA纯合的，即含有每个抗原呈递蛋白的相同等位基因，则供体和受体之间的MHC相容性显著增加。大多数个体对于MHC I类和II类基因是杂合的，但某些个体对于这些基因是纯合的。这些纯合个体能够作为超级供体，并且能够将从它们的细胞生成的移植物移植到对于该单倍型是纯合的或杂合的所有个体中。此外，如果纯合供体细胞具有在群体中高频率发现的单倍型，则这些细胞可以在大量个体的移植疗法中应用。
因此，在一些实施方案中，本方法的iPSC可以从待治疗的受试者的体细胞产生，或者从与患者的HLA类型相同或基本上相同的另一个受试者产生。在一种情况下，供体的主要HLA(例如，三个主要基因座HLA-A、HLA-B和HLA-DR)与受体的主要HLA相同。在某些情况下，体细胞供体可以是超级供体；因此，衍生自MHC纯合超级供体的iPSC可用于生成HPC，并且随后生成免疫细胞，例如T细胞。因此，衍生自超级供体的免疫细胞可以移植到对于该单倍型是纯合的或杂合的受试者中。例如，免疫细胞可以在两个HLA等位基因如HLA-A和HLA-B上是纯合的。因此，由超级供体产生的免疫细胞能够用于本文公开的方法中，以产生可能“匹配”大量潜在受体的免疫细胞。
因此，本公开内容的某些实施方案提供HLA纯合免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞和树突细胞)的储存库(例如，文库)。在主题文库中表示的HLA单倍型能够反映在人群中发现的最常见的HLA单倍型，例如，常见的高加索人HLA单倍型，在非洲血统的个体中发现的常见HLA单倍型，常见的亚洲HLA单倍型，常见的西班牙人HLA单倍型，常见的美洲原住民HLA单倍型等。例如，单个丰富的单倍型可以存在于显著比例的群体中，允许单个HLA纯合细胞系用作显著百分比患者的组织相容性供体。文库包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-15、15-20、20-25、25-30或30种以上不同类型的HLA纯合细胞。主题文库能够包括对于第一HLA单倍型纯合的第一HLA纯合细胞；和对于第二HLA纯合的至少第二HLA单倍型纯合。主题文库能够包括单个细胞类型或可以包括两种或更多种不同的细胞类型。能够例如通过可搜索的计算机数据库对主题文库进行编目，在所述计算机数据库中存储并且可以搜索关于HLA单倍型的信息，以及任选的附加信息，例如细胞表面标记、核型信息等。
本文所述的HLA纯合免疫细胞可用于涉及细胞和/或组织移植的广泛临床应用。HLA纯合免疫细胞与受体是HLA相容，并因此可以在不需要免疫抑制疗法的情况下引入受体，或至少减少对免疫抑制治疗的需要。标准的免疫抑制药物治疗方案每月花费数千美元，并且可能具有不良副作用，包括通常危及生命且治疗费用昂贵的感染和癌症。因此，本发明的HLA纯合免疫细胞克服了目前限制人细胞用于临床应用的一些障碍。
C.重新编程因子
在某些实施方案中，通过引入重编程因子将体细胞的起始群体重新编程为iPS细胞。iPS细胞的生成对于用于诱导的重编程因子是至关重要的。以下因子或其组合可用于本公开内容中公开的方法中。在某些方面，编码Sox和Oct(特别是Oct3/4)的核酸将包括在重新编程载体中。例如，一种或多种重编程载体可包含编码Sox2、Oct4、Nanog和任选的Lin28的表达盒，或编码Sox2、Oct4、Klf4和任选的c-Myc的表达盒，或编码Sox2、Oct4和任选的Esrrb的表达盒，或编码Sox2、Oct4、Nanog、Lin28、Klf4、c-Myc和任选的SV40大T抗原的表达盒。编码这些重新编程因子的核酸可包含在相同的表达盒、不同的表达盒、相同的重新编程载体或不同的重新编程载体中。
Oct4和Sox基因家族的某些成员(Sox1、Sox2、Sox3和Sox15)已被鉴定为参与诱导过程的关键转录调节因子，其缺失使得诱导不可能。然而，其他基因，包括Klf家族的某些成员(Klf1、Klf2、Klf4和Klf5)、Myc家族(c-Myc、L-Myc和N-Myc)、Nanog和Lin28，已被鉴定为提高诱导效率。
Oct4(Pou5f1)是八聚体(“Oct”)转录因子家族中的一员，并且在维持多能性中起关键作用。在Oct4+细胞(例如卵裂球和胚胎干细胞)中Oct4的缺失导致自发的滋养层分化，并因此Oct4的存在引起胚胎干细胞的多能性和分化潜力。“Oct”家族中的各种其他基因，包括Oct4的近亲，Oct1和Oct6，都不引发诱导，从而证明了Oct-4对诱导过程的排他性。
类似于Oct4，Sox基因家族与维持多能性相关，尽管与Oct4相反，它与专能和单能干细胞相关，而Oct4专门在多能干细胞中表达。虽然Sox2是用于重新编程诱导的初始基因，但已发现Sox家族中的其他基因在诱导过程中也起作用。Sox1产生具有与Sox2相似效率的iPS细胞，并且基因Sox3、Sox15和Sox18也生成iPS细胞，但是效率降低。
在胚胎干细胞中，Nanog与Oct4和Sox2一起是促进多能性所必需的。因此，虽然Thomson等人已经报道有可能使用Nanog作为因子之一来生成iPS细胞，但当Yamanaka等人报道Nanog不是诱导所必需的时候，这是令人惊讶的。
Lin28是在与分化和增殖相关的胚胎干细胞和胚胎癌细胞中表达的mRNA结合蛋白。Thomson等人证明它是iPS生成中的一个因子，但是它不是必需的。
Klf基因家族的Klf4最初由Yamanaka等人，2007鉴定，并由Jaenisch等人，1988证实为用于生成小鼠iPS细胞的因子，并且由Yamanaka等人，2007证实为用于生成人类iPS细胞的因子。但是，Thompson等人报道了Klf4对于生成人iPS细胞不是必需的，并且实际上不能生成人iPS细胞。发现Klf2和Klf4是能够生成iPS细胞的因子，并且相关基因Klf1和Klf5也起作用，但是效率降低。
Myc基因家族是与癌症有关的原癌基因。Yamanaka等人，2007和Jaenisch等人，1988证明c-Myc是与小鼠iPS细胞的生成有关的因子，并且Yamanaka等人，2007证明它是与人iPS细胞的生成有关的因子。但是，Thomson等人和Yamanaka等人报道c-Myc对于生成人iPS细胞不是必需的。SV40大抗原可用于减少或预防c-Myc表达时可能发生的细胞毒性。
本公开内容中使用的重新编程蛋白质可以被具有大约相同重新编程功能的蛋白质同源物取代。编码这些同源物的核酸也可用于重新编程。保守氨基酸取代可包括，例如，天冬氨酸-谷氨酸作为极性酸性氨基酸；赖氨酸/精氨酸/组氨酸作为极性碱性氨基酸；亮氨酸/异亮氨酸/蛋氨酸/缬氨酸/丙氨酸/甘氨酸/脯氨酸作为非极性或疏水性氨基酸；丝氨酸/苏氨酸作为极性或不带电荷的亲水性氨基酸。保守氨基酸取代还包括基于侧链的分组。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，可以合理地预期用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，用丝氨酸取代苏氨酸，或用结构相关氨基酸的相似取代氨基酸对所得多肽的性质不具有严重的影响。通过测定多肽的比活性，能够容易地确定氨基酸改变是否得到功能性多肽。
D.重新编程血细胞
在一些实施方案中，通过美国专利公开号2014/0315304中描述的方法将血细胞的起始群体重新编程为iPSC；该文献通过引用整体并入本文。在本公开内容的某些方面，重新编程因子由包含在一种或多种载体中的表达盒表达，例如整合载体或附加体载体。在另一方面，可通过蛋白质转导将重新编程蛋白质直接引入体细胞中。
本领域技术人员将能够通过标准重组技术很好地构建载体(参见，例如，Sambrook等人，2001和Ausubel等人，1996，两者均通过引用并入本文)。载体包括但不限于质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如YAC)，例如逆转录病毒载体(例如衍生自莫洛尼鼠白血病病毒载体(MoMLV)、MSCV、SFFV、MPSV、SNV等)、慢病毒载体(例如衍生自HIV-1、HIV-2、SIV、BIV、FIV等)、腺病毒(Ad)载体(包括复制能力、复制缺陷型和无肠形式)、腺病毒相关病毒(AAV)载体、猿猴病毒40(SV-40)载体、牛乳头瘤病毒载体、Epstein-Barr病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、Harvey鼠肉瘤病毒载体、鼠乳腺肿瘤病毒载体、Rous肉瘤病毒载体。1.病毒载体
可以在本公开内容的某些方面提供病毒载体。在生成重组病毒载体时，非必需基因通常被异源(或非天然)蛋白质的基因或编码序列取代。病毒载体是一种表达构建体，其利用病毒序列将核酸和可能的蛋白质引入细胞中。某些病毒通过受体介导的内吞作用感染细胞或进入细胞，并且整合到宿主细胞基因组中并稳定有效地表达病毒基因的能力使它们成为将外来核酸转移到细胞(如哺乳动物细胞)中的有吸引力的候选者。可用于递送本公开内容的某些方面的核酸的病毒载体的非限制性实例描述如下。
逆转录病毒具有作为基因递送载体的前景，因为它们能够将其基因整合到宿主基因组中，转移大量外来遗传物质，感染广谱的物种和细胞类型，并包装在特殊细胞系中(Miller，1992)。
为了构建逆转录病毒载体，将核酸插入病毒基因组中代替某些病毒序列以产生复制缺陷的病毒。为了产生病毒粒子，构建了含有gag、pol和env基因但不含LTR和包装组分的包装细胞系(Mann等人，1983)。当含有cDNA与逆转录病毒LTR和包装序列一起的重组质粒被引入特殊细胞系(例如，通过磷酸钙沉淀)时，包装序列允许将重组质粒的RNA转录物包装到病毒颗粒中，然后分泌到培养基中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等人，1983)。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选地浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染多种细胞类型。然而，整合和稳定表达需要宿主细胞的分裂(Paskind等人，1975)。
慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，还含有具有调节或结构功能的其他基因。慢病毒载体是本领域熟知的(参见，例如，Naldini等人，1996；Zufferey等人，1997；Blomer等人，1997；美国专利6,013,516和5,994,136)。
重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞，并且能够用于体内和离体基因转移和核酸序列的表达。例如，能够感染非分裂细胞的重组慢病毒(其中用两种或更多种携带包装功能的载体转染合适的宿主细胞，即gag、pol和env，以及rev和tat)在美国专利5,994,136中有描述，其通过引用并入本文。
2.附加体载体
在本公开内容的某些方面，还可以提供基于质粒-或基于脂质体-的染色体外(即附加体)载体的用途。此类附加体载体可包括例如基于oriP的载体，和/或编码EBNA-1衍生物的载体。这些载体可以允许DNA的大片段被引入细胞并在染色体外维持，每个细胞周期复制一次，有效分配到子细胞，并且基本上不引起免疫应答。
特别地，EBNA-1(基于oriP的表达载体的复制所需的唯一病毒蛋白)不引发细胞免疫应答，因为它已经发展出一种有效的机制来绕过呈递其抗原在MHC I类分子上所需的加工(Levitskaya等人，1997)。此外，EBNA-1能够反式起作用以增强克隆基因的表达，在一些细胞系中诱导克隆基因的表达高达100倍(Langle-Rouault等人，1998；Evans等人，1997)。最后，这种基于oriP的表达载体的制造是便宜的。
其他染色体外载体包括其他基于淋巴细胞性疱疹病毒的载体。淋巴细胞性疱疹病毒是一种疱疹病毒，其在淋巴母细胞(例如人B淋巴母细胞)中复制并成为其天然生命周期的一部分的质粒。单纯疱疹病毒(HSV)不是“淋巴细胞性”疱疹病毒。示例性淋巴细胞性疱疹病毒包括但不限于EBV、卡波西氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)；松鼠猴属疱疹病毒(HS)和马立克氏病病毒(MDV)。还考虑了附加体基载体的其他来源，例如酵母ARS、腺病毒、SV40或BPV。
本领域技术人员将能够通过标准重组技术很好地构建载体(参见，例如，Maniatis等人，1988和Ausubel等人，1994，两者均通过引用并入本文)。
载体还能够包含其他组分或功能，其进一步调节基因递送和/或基因表达，或者以其他方式为靶细胞提供有益特性。这些其他组分包括，例如，影响结合或靶向细胞的组分(包括介导细胞类型或组织特异性结合的组分)；影响细胞摄取载体核酸的组分；影响摄取后细胞内多核苷酸定位的组分(如介导核定位的试剂)；和影响多核苷酸表达的组分。
此类组分还可包括标志物，例如可检测和/或选择标志物，其能够用于检测或选择已经摄取并表达由载体递送的核酸的细胞。这些组分能够作为载体的天然特征提供(例如使用具有介导结合和摄取的组分或功能的某些病毒载体)，或者能够修饰载体以提供这些功能性。大量这样的载体是本领域已知的并且通常是可获得的。当在宿主细胞中维持载体时，载体能够在有丝分裂期间作为自主结构而被细胞稳定复制，掺入宿主细胞的基因组中，或维持在宿主细胞的细胞核或细胞质中。
3.基于转座子的系统
在某些方面，能够使用转座子-转座酶系统递送编程因子。例如，转座子-转座酶系统可以是众所周知的Sleeping Beauty、Frog Prince转座子-转座酶系统(关于后者的描述，参见例如EP1507865)或TTAA特异性转座子PiggyBac系统。
转座子是能够在单个细胞的基因组内移动到不同位置的DNA序列，这一过程称为转座。在这个过程中，它们能够引起突变并改变基因组中DNA的数量。转座子也曾被称为跳跃基因，并且是移动遗传元件的例子。
存在各种各样的移动遗传元件，并且能够基于它们的转座机制对它们进行分组。I类移动遗传元件或反转录转座子通过首先转录为RNA复制自身，然后通过逆转录酶而逆转录回DNA，并且然后插入基因组中的另一个位置。II类移动遗传元件使用转座酶直接从一个位置移动到另一个位置，以在基因组内“剪切并粘贴”它们。
在具体的实施方案中，本公开内容提供的构建体(例如，多谱系构建体)使用PiggyBac表达系统。PiggyBac(PB)DNA转座子通过“剪切并粘贴”机制进行动员，由此由转座子本身编码的转座酶(PB转座酶)切除转座子并在基因组内的其他位点重新整合转座子。PB转座酶特异性识别位于转座子侧翼的PB反向末端重复(ITR)；它与这些序列结合并催化转座子的切除。然后PB以相对随机的方式整合到整个基因组中的TTAA位点。为了产生基因陷阱突变(或适于生成转基因动物)，转座酶在一个质粒上反式提供，并与含有供体转座子的质粒共转染，所述供体转座子是包含侧翼为转座酶(ITRs)的结合位点的基因陷阱的重组转座子。转座酶将催化从质粒中切除转座子并随后整合到基因组中。编码区内的整合将捕获基因陷阱表达所需的元件。PB具有几个理想的特性：(1)它优先插入基因内(50％至67％的插入命中基因)(2)它没有表现出局部跳跃(广泛的基因组覆盖)(3)它对过量产生抑制不敏感，其中转座酶水平升高导致转座减少(4)它从供体位点干净地切除，不像SleepingBeauty那样留下“足迹”。
4.调控元件
包含在本发明中有用的重新编程载体中的表达盒优选地含有(以5'至3'方向)与蛋白质编码序列可操作连接的真核转录启动子，包含插入序列的剪接信号和转录、终止/聚腺苷酸化序列。
a.启动子/增强子
本文提供的表达构建体包括驱动编程基因表达的启动子。启动子通常包括作用于定位RNA合成的起始位点的序列。最著名的例子是TATA框，但在一些缺乏TATA框的启动子中，例如，哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子，覆盖起始位点本身的离散元件帮助固定起始的位置。另外的启动子元件调节转录起始的频率。通常，这些位于起始位点上游30-110bp的区域中，但是已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。为了使编码序列“在”启动子“的控制下”，将转录阅读框的转录起始位点的5'末端定位在所选启动子的“下游”(即3')。“上游”启动子刺激DNA的转录并促进编码的RNA的表达。
启动子元件之间的间隔通常是柔性的，从而当元件相对于彼此反转或移动时保持启动子功能。在tk启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间隔能够增加到相隔50bp。取决于启动子，似乎单个元件能够协同地或独立地起作用以激活转录。启动子可以与或可以不与“增强子”结合使用，“增强子”是指参与核酸序列转录激活的顺式作用调控序列。
启动子可以是与核酸序列天然相关的启动子，可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5'非编码序列而获得。这种启动子可以称为“内源的”。类似地，增强子可以是与核酸序列天然相关的增强子，位于该序列的下游或上游。或者，通过将编码核酸区段定位在重组或异源启动子的控制下，将获得某些优点，所述重组或异源启动子是指在其天然环境中通常不与核酸序列相关的启动子。重组或异源增强子还指在其天然环境中通常不与核酸序列相关的增强子。此类启动子或增强子可包括其他基因的启动子或增强子，以及从任何其他病毒或者原核或真核细胞分离的启动子或增强子，以及不“天然存在”的启动子或增强子，即含有不同转录调节区的不同元件，和/或改变表达的突变。例如，最常用于重组DNA构建的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨酸(trp)启动子系统。除了合成地产生启动子和增强子的核酸序列之外，可以使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCRTM)与本文公开的组合物一起生产序列(参见美国专利号4,683,202和5,928,906，各自通过引用并入本文)。此外，还考虑了能够使用指导序列在非核细胞器如线粒体、叶绿体等中的转录和/或表达的对照序列。
自然而然地，使用有效地指导DNA区段在选择用于表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物体中表达的启动子和/或增强子是重要的。分子生物学领域的技术人员通常知道用于蛋白质表达的启动子、增强子和细胞类型组合的使用(参见例如Sambrook等人，1989，通过引用并入本文)。所用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、可诱导的和/或在适当条件下有用的，以指导引入的DNA区段的高水平表达，例如在大规模生产重组蛋白和/或肽中是有利的。启动子可以是异源的或内源的。
另外，任何启动子/增强子组合(例如，真核启动子数据库EPDB)也可用于驱动表达。使用T3、T7或SP6细胞质表达系统是另一种可能的实施方案。如果提供合适的细菌聚合酶，真核细胞可以支持来自某些细菌启动子的细胞质转录，作为递送复合物的一部分或作为另外的遗传表达构建体。
启动子的非限制性实例包括早期或晚期病毒启动子，例如SV40早期或晚期启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)早期启动子；真核细胞启动子，例如β肌动蛋白启动子(Ng，1989；Quitsche等人，1989)、GADPH启动子(Alexander等人，1988，Ercolani等人，1988)、金属硫蛋白启动子(Karin等人，1989；Richards等人，1984)；和连锁响应元件启动子例如环AMP响应元件启动子(cre)、血清响应元件启动子(sre)、佛波醇酯启动子(TPA)和最小TATA框附近的响应元件启动子(tre)。还可以使用人生长激素启动子序列(例如，Genbank描述的人生长激素最小启动子，登录号X05244，核苷酸283-341)或小鼠乳腺肿瘤启动子(可从ATCC目录号ATCC45007获得)。
组织特异性转基因表达，特别是对于衍生自编程的造血细胞和造血细胞前体中的报告基因表达，可能是鉴定衍生的造血细胞和前体所需的方法。为了增加特异性和活性，已经考虑使用顺式作用调节元件。例如，可以使用造血细胞特异性启动子。许多这样的造血细胞特异性启动子是本领域已知的。
在某些方面，本公开内容的方法还涉及增强子序列，即增加启动子活性并且具有顺式作用潜力的核酸序列，并且无论其方向如何，即使在相对长的距离上也是如此(直至离靶启动子几千碱基)。然而，增强子功能不一定限于这样的长距离，因为它们也可以在给定启动子附近起作用。
已经鉴定了许多造血细胞启动子和增强子序列，并且可以在本方法中使用。参见，例如，美国专利5,556,954；美国专利申请20020055144；美国专利申请20090148425。
b.起始信号和连接的表达
特定的起始信号也可以用在本公开内容中提供的表达构建体中，用于编码序列的有效翻译。这些信号包括ATG起始密码子或相邻序列。可能需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域普通技术人员将能够容易地确定这一点并提供必要的信号。众所周知，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框是“同框”的，以确保整个插入物的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可为天然的或合成的。通过包含合适的转录增强子元件可以提高表达效率。
在某些实施方案中，内部核糖体进入位点(IRES)元件用于创建多基因或多顺反子信息。IRES元件能够绕过5’甲基化的Cap依赖性翻译的核糖体扫描模型并在内部位点开始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。已经描述了来自小核糖核酸病毒家族的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)，以及来自哺乳动物信息的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。IRES元件可以与异源开放阅读框相连。多重开放阅读框可以一起转录，每个都由IRES分隔，创建多顺反子信息。凭借IRES元件，每个开放阅读框接近核糖体以进行有效翻译。使用单个启动子/增强子以转录单个信息可以有效表达多个基因(参见美国专利号5,925,565和5,935,819，各自通过引用并入本文)。
另外，某些2A序列元件可用于在本公开内容提供的构建体中创建编程基因的连接的表达或共表达。例如，切割序列可用于通过连接开放阅读框以形成单个顺反子来共表达基因。示例性切割序列是F2A(口蹄疫病毒2A)或“2A样”序列(例如，Thosea asigna病毒2A；T2A)(Minskaia和Ryan，2013)。在特定的实施方案中，F2A-切割肽用于连接多谱系构建体中基因的表达。
c.复制的起点
为了在宿主细胞中繁殖载体，它可以含有复制位点的一个或多个起点(通常称为“ori”)，例如，对应于如上所述的EBV的oriP或具有相似或升高的编程功能的遗传工程化改造的oriP的核酸序列，其是启动复制的特定核酸序列。或者，可以使用如上所述的其他染色体外复制病毒的复制起点或自主复制序列(ARS)。
d.选择和可筛选标志物
在某些实施方案中，可以通过在表达载体中包括标志物在体外或体内鉴定含有核酸构建体的细胞。这些标志物将赋予细胞可识别的变化，从而允许容易地鉴定含有表达载体的细胞。通常，选择标志物是赋予允许选择的属性的标志物。阳性选择标志物是其中标志物的存在允许其选择的标志物，而阴性选择标志物是其存在阻止其选择的标志物。阳性选择标志物的实例是抗药性标志物。
通常，包含药物选择标志物有助于克隆和鉴定转化体，例如赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、吉欧霉素和组氨醇的抗性的基因是有用的选择标志物。除了赋予允许基于条件的实施来区分转化体的表型的标志物之外，还考虑了其他类型的标志物，包括可筛选的标志物，例如GFP，其基础是比色分析。或者，可以使用可筛选的酶作为阴性选择标志物，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员还将知道如何使用免疫标志物，可能结合FACS分析。不认为所使用的标志物是重要的，只要它能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。选择和可筛选标志物的其他实例是本领域技术人员所熟知的。
如本文所述，利用本公开内容将核酸(例如DNA或RNA)引入待编程为造血前体细胞的多能干细胞中可以使用任何合适的核酸递送方法来转化细胞，如本文所述或如本领域普通技术人员所知。这些方法包括但不限于直接递送DNA，例如通过离体转染(Wilson等人，1989，Nabel等人，1989)，通过注射(美国专利号5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，各自通过引用并入本文)，包括显微注射(Harland和Weintraub，1985；美国专利号5,789,215，通过引用并入本文)；通过电穿孔(美国专利号5,384,253，通过引用并入本文；Tur-Kaspa等人，1986；Potter等人，1984)；通过磷酸钙沉淀(Graham和Van Der Eb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等人，1990)；通过使用DEAE-葡聚糖然后使用聚乙二醇(Gopal，1985)；通过直接声波加载(Fechheimer等人，1987)；通过脂质体介导的转染(Nicolau和Sene，1982；Fraley等人，1979；Nicolau等人，1987；Wong等人，1980；Kaneda等人，1989；Kato等人，1991)和受体介导的转染(Wu和Wu，1987；Wu和Wu，1988)；通过微粒轰击(PCT申请号WO 94/09699和95/06128；美国专利号5,610,042；5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880，各自通过引用并入本文)；通过用碳化硅纤维的搅拌(Kaeppler等人，1990；美国专利号5,302,523和5,464,765，各自通过引用并入本文)；通过土壤杆菌介导的转化(美国专利号5,591,616和5,563,055，各自通过引用并入本文)；通过干燥/抑制介导的DNA摄取(Potrykus等人，1985)，以及这些方法的任何组合。通过应用诸如这些技术，可以稳定地或瞬时地转化细胞器、细胞、组织或生物体。
III.免疫细胞的产生
A.HPC的产生
本公开内容的某些实施方案涉及体细胞衍生的iPSC分化为HPC。体细胞衍生的iPSC可通过本领域已知的方法分化为HPC，如美国专利号8,372,642中所述，其通过引用并入本文中。例如，BMP4、VEGF、Flt3配体、IL-3和GM-CSF的组合可用于促进造血分化。在某些实施方案中，将细胞培养物顺序暴露于第一培养基以制备PSC用于分化，包含BMP4、VEGF和FGF的第二培养基，然后通过在包含Flt3配体、SCF、TPO、IL-3和IL-6的第三培养基中培养，可以将多能细胞分化为造血前体细胞和造血细胞。第二确定培养基也能够包含肝素。此外，在含有BMP4和VEGF的培养基中包含FGF-2(50ng/ml)可以增强从多能细胞生成造血前体细胞的效率。另外，在第一确定培养基中包含糖原合成酶激酶3(GSK3)抑制剂(例如，CHIR99021、BIO和SB-216763)可以进一步增强HPC的生产。
可以使用确定的或不确定的条件进行多能细胞向造血前体细胞的分化。通常，应当理解，旨在将所得细胞施用给人受试者的实施方案中，确定的条件通常是优选的。造血干细胞可以在确定的条件下从多能干细胞衍生(例如，使用TeSR培养基)，并且可以从衍生自多能细胞的胚状体生成造血细胞。在其他实施方案中，多能细胞可以在OP9细胞或小鼠胚胎成纤维细胞上共培养并随后分化。
可以允许多能细胞形成胚状体或聚集体作为分化过程的部分。形成“胚状体”(EB)或生长细胞簇以诱导分化通常涉及人多能干细胞体外聚集成EB并允许人多能干细胞自发和随机分化为多个组织类型，代表内胚层、外胚层和中胚层起源。因此，三维EB能够用于产生一定比例的造血细胞和内皮细胞。
可以使用以下方案形成EB。可以在汇合时，在室温使用0.5M EDTA处理约8-10分钟来收获适于在包被MatrigelTM的平板上无饲养细胞生长的未分化的iPSC。孵育后吸出EDTA，可以通过在含有rock抑制剂或布雷他汀的SFD培养基中收集细胞来形成EB。第二天可以将培养基更换为含有不同细胞因子制剂的EB1分化培养基。将细胞以25-50万个细胞/ml的密度铺板以促进聚集体形成。
为了促进聚集体形成，可以将细胞转移至低贴壁平板，在无血清分化(SFD)培养基中过夜孵育，所述培养基由75％IMDM(Gibco)、补充有0.05％N2和不含RA补充剂的B-27的25％Ham's Modified F12(Cellgro)、200mM 1-谷氨酰胺、0.05mg/ml抗坏血酸-2-磷酸镁盐(Asc2-P)(WAKO)和4.5x 10-4MTG组成。第二天，可以从每个孔收集细胞并离心。然后在分化的前四天，将细胞重悬于由补充有约50ng/ml骨形态发生因子(BMP-4)、约50ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)和50ng/ml zb FGF的SFD基础培养基组成的“EB分化培养基”中。每48小时将细胞半进料。在分化的第五天，将培养基替换为由补充有50ng/ml干细胞因子(SCF)、约50ng/ml Flt-3配体(Flt-3L)、50ng/ml白细胞介素-6(IL-6)、50ng/ml白细胞介素-3(IL-3)、50ng/ml血小板生成素(TPO)的SFD培养基组成的第二培养基。每48小时用新鲜的分化培养基将细胞半进料。通过将分化培养物以300g旋转5分钟并从分化培养物中吸出一半体积并用新鲜培养基补充它来进行培养基更换。在某些实施方案中，EB分化培养基可包括约BMP4(例如，约50ng/ml)、VEGF(例如，约50ng/ml)和任选的FGF-2(例如，约25-75ng/ml或约50ng/ml)。可以吸出上清液并用新鲜的分化培养基替换。或者，可以每两天用新鲜培养基将细胞半进料。可以在分化过程中的不同时间点收获细胞。
可以使用确定培养基从多能干细胞培养造血前体细胞。使用确定培养基将多能细胞分化为造血CD34+干细胞的方法描述于例如美国申请12/715,136中，其通过引用整体并入，无排除。预期这些方法可以与本公开内容一起使用。
例如，确定培养基可用于诱导造血CD34+分化。确定培养基可含有生长因子BMP-4、VEGF、Flt3配体、IL-3和/或GMCSF。多能细胞可以在包含BMP4、VEGF和任选的FGF-2的第一确定培养基中培养，然后在包含(Flt3配体、IL-3和GMCSF)或(Flt3配体、IL-3、IL-6和TPO)的第二培养基中培养。第一和第二培养基还可包含SCF、IL-6、G-CSF、EPO、FGF-2和/或TPO中的一种或多种。基本上缺氧的条件(例如，小于20％的O2)可以进一步促进造血或内皮分化。
细胞可以通过机械或酶促手段(例如，使用胰蛋白酶或TrypLETM)而基本上个体化。ROCK抑制剂(例如，H1152或Y-27632)也可包含在培养基中。预期这些方法可以使用例如机器人自动化来自动化。
在某些实施方案中，基本上缺氧的条件可用于促进多能细胞分化为造血祖细胞。如本领域技术人员所认识到的，小于约20.8％的大气氧含量将被认为是缺氧的。培养中的人细胞可以在与环境空气相比具有降低的氧含量的大气条件下生长。这种相对缺氧可以通过减少暴露于培养基的大气氧来实现。胚胎细胞通常在减氧条件下体内发育，通常在约1％至约6％的大气氧气下，在环境水平下具有二氧化碳。不希望受理论束缚，预期缺氧条件可以模拟某些胚胎发育条件的一个方面。如以下实施例中所示，在某些实施方案中可以使用缺氧条件来促进多能细胞(例如iPSC或hESC)进一步分化为更分化的细胞类型，例如造血前体细胞。
以下缺氧条件可用于促进多能细胞分化为造血祖细胞。在某些实施方案中，可以使用小于约20％、小于约19％、小于约18％、小于约17％、小于约16％、小于约15％、小于约14％、小于约13％、小于约12％、小于约11％、小于约10％、小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％的大气氧含量来促进分化为造血前体细胞。在某些实施方案中，缺氧气氛包含约5％的氧气。
无论在任何给定的造血祖细胞扩增中使用何种特定培养基，所用培养基优选地补充有至少一种细胞因子，浓度为约0.1ng/mL至约500ng/mL，更通常为10ng/mL至100ng/mL。合适的细胞因子包括但不限于c-kit配体(KL)(也称为钢因子(StI)、肥大细胞生长因子(MGF)和干细胞因子(SCF))、IL-6、G-CSF、IL-3、GM-CSF、IL-1α、IL-11、MIP-1α、LIF、c-mpl配体/TPO和flk2/flk3配体(Flt2L或Flt3L)(Nicola等人，1979；Golde等人，1980；Lusis，1981；Abboud等人，1981；Okabe，1982；Fauser等人，1981)。特别地，培养物将包括SCF、Flt3L和TPO中的至少一种。更特别地，培养物将包括SCF、Flt3L和TPO。
在一个实施方案中，细胞因子包含在培养基中并通过培养基灌注来补充。或者，当使用生物反应器系统时，细胞因子可以在没有培养基灌注的情况下单独添加，作为通过单独的入口端口的浓缩溶液。当在没有灌注的情况下添加细胞因子时，它们通常以10x至100x的溶液添加，其量等于生物反应器中体积的十分之一至1/100，并且大约每2至4天添加新鲜的细胞因子。此外，除了在灌注培养基中的细胞因子外，还可以单独地加入新鲜浓缩的细胞因子。
在一些实施方案中，HPC表现出破坏的甲基-CpG结合蛋白2(MeCP2)，并在促进骨髓样分化或淋巴样分化的条件下培养。在一些方面，HPC表达无功能的MeCP2，其基本上不与甲基化的DNA结合。在某些方面，HPC不以足以影响MeCP2DNA结合活性的水平表达MeCP2。在特定方面，MeCP2由于MeCP2基因中的截短或突变而是无功能的。在一些方面，获得表现出破坏的MeCP2的HPC包括使HPC与MeCP2的siRNA、shRNA或小分子抑制剂接触。
(i)示例性3D分化方法
用于PSC向HPC分化的示例性方法包括在无饲养细胞条件下维持，例如在Essential 8(E8)培养基中在包被MatrigelTM或包被玻连蛋白的平板上。聚集体由PSC制成，特别是亚汇合，例如<80％汇合)，密度为50-100万个细胞/ml，存在FGF2、VEGF、布雷他汀和GSK-3抑制剂。例如，细胞在Essential 3(E3)培养基(例如，仅含有E8培养基的8种组分中的3种：DMEM/F12基础培养基、抗坏血酸2-磷酸镁和亚硒酸钠)，补充有50ng/ml FGF2、50ng/mlVEGF、2μM CHIR99021(GSK-3抑制剂)和10μM布雷他汀(肌球蛋白-II抑制剂))中培养。特别地，聚集体形成和随后的步骤可以在连续搅拌下在超低贴壁(ULA)培养瓶中进行24小时培养期间进行。
将形成的细胞聚集体(即，胚状体-EB)进一步转移至补充有造血中胚层诱导细胞因子——25ng/ml BMP4、50mg/ml VEGF和50ng/ml FGF2的，包含BMP4、VEGF和FGF2的无血清分化培养基中(例如，50％IMDM、50％Hams F12培养基、100μg/ml聚乙烯酒精、100μg/ml重组人血清白蛋白、1x非必需氨基酸补充剂(Invitrogen)、0.1x化学成分确定的脂质补充剂(Invitrogen)、125μM抗坏血酸2-磷酸镁、0.25μM亚油酸、痕量元素补充剂A(0.3x)、B(0.2x)和C(0.1x)(Corning)、5mM氯化钠、100μM硫代甘油、20μM乙醇胺、100ng/ml肝素和10ng/mlIGF1)。继续培养，例如持续4天，第二天完全培养基更换。
为了支持造血CD34+祖细胞的分化和扩增，将细胞聚集体进一步转移至补充有造血支持细胞因子，例如50ng/ml SCF、20mg/ml TPO、10ng/ml FLT3L、20ng/ml IL-3和25ng/ml BMP4的无血清分化培养基(如上)。继续培养，例如持续4天，第二天完全培养基更换。
在分化过程后收获培养物，例如9天。通过消化分化的细胞聚集体(例如在Accutase中)获得单细胞悬浮液。然后将分离的CD34+细胞(例如通过MACS分离)铺板到T/NK分化培养物中或冷冻保存以在分离后1小时内使用。
(ii)示例性2D分化方法
在替代的示例性方法中，使PSC经受2D分化方案以产生HPC。首先，PSC适应缺氧条件，例如5-10次传代，在无饲养细胞条件下，例如在包被MatrigelTM或包被玻连蛋白上在Essential 8(E8)培养基中。将PSC个体化并在布雷他汀(例如，1-10μM，例如5μM)存在下，在包被胺的平板例如包被PureCoat Amine的6孔平板(Corning Inc.)上铺板。在BMP-4、VEGF和bFGF存在下培养细胞。例如，培养基可以是含有75％IMDM(Invitrogen 12200-069)(含谷氨酰胺和25mM HEPES+P/S)、25％Hams F12(Mediatech 10-080-CV)、0.5％N2-补充剂(Invitrogen 17502-048)、不含视黄酸的1％B27补充剂(Invitrogen12587-010)、0.05％BSA、50μg/ml抗坏血酸和4.5×10-4M硫代甘油，补充有50ng/ml BMP-4、VEGF和bFGF的SFD基础培养基。
通过在BMP-4、VEGF和bFGF存在下培养，在第1天起始对造血分化的诱导。例如，细胞在含有75％IMDM(Invitrogen 12200-069)(含谷氨酰胺和25mM HEPES+P/S)、25％HamsF12(Mediatech 10-080-CV)、0.5％N2补充剂(Invitrogen 17502-048)、不含视黄酸的1％B27补充剂(Invitrogen 12587-010)、0.05％BSA、50ug/ml抗坏血酸和4.5×10-4M硫代甘油，补充有50ng/ml BMP-4、VEGF和bFGF的SFD基础培养基中培养。在第2天，吸出培养基并将细胞置于新鲜的EB1培养基中(例如，含有75％IMDM(Invitrogen 12200-069)(含谷氨酰胺和25mM HEPES+P/S)、25％Hams F12(Mediatech 10-080-CV)、0.5％N2补充剂(Invitrogen17502-048)、不含视黄酸的1％B27补充剂(Invitrogen 12587-010)、0.05％BSA、50ug/ml抗坏血酸和4.5×10-4M硫代甘油，补充有50ng/ml BMP-4、VEGF和bFGF的SFD基础培养基)另外的48小时。
在第5-10天，吸出培养基并将细胞置于包含Flt-3配体、IL3、IL6、SCF、TPO和肝素的培养基中，例如持续接下来的48小时。例如，EB2培养基可包含含有75％IMDM(Invitrogen12200-069)(含谷氨酰胺和25mM HEPES+P/S)、25％Hams F12(Mediatech 10-080-CV)、0.5％N2补充剂(Invitrogen 17502-048)、不含视黄酸的1％B27补充剂(Invitrogen12587-010)、0.05％BSA、50μg/ml抗坏血酸和4.5×10-4M硫代甘油，补充有50ng/ml的Flt-3配体、IL3、IL6、SCF和TPO各自为50ng/ml和5000U/ml肝素的新鲜SFD基础培养基。使用TrypLE在分化的第7、8、9、10天收获细胞，并针对HPC标志物和淋巴祖细胞的存在进行染色。
B.淋巴样细胞分化
然后能够将从体细胞衍生的PSC分化的HPC进一步分化为淋巴谱系细胞，包括T细胞、NK细胞和T/NK细胞。在一些方面，分化期间的HPC在第7-12天(例如第8-11天)分离，用于分化为淋巴样细胞。可以通过CD34和CD43的表达来鉴定该阶段的HPC。此外，具有淋巴样潜力的HPC能够低水平表达CD144、DLL4、CD7和CD235，其在第11天下降，这意味着这些标志物表达的某些阈值水平对于在DLL4存在下引发细胞向淋巴样分化是必需的。
在一些方面，在分化过程的第7-11天，例如第7天、第8天、第9天、第10天或第11天分离的HPC可以分化为淋巴样细胞，例如T细胞和NK细胞。在一些方面，淋巴样祖细胞起源的时间与HPC分化期间血管内皮祖细胞的减少和红细胞祖细胞的出现一致。在特定方面，第9天HPC可以在生成T细胞方面具有增加的效率。能够淋巴样分化的HPC可以通过特定标志物的表达来分离和/或鉴定。例如，可以选择具有CD34和/或CD43的表面表达的细胞用于淋巴样细胞分化。用于检测淋巴样祖细胞的其他标志物包括DLL4、CD144、CD31、CD34、CD43lo、CD45lo/-、CD235、CD7、Flk-1、APNLR。在特定方面，CD34/CD7、CD235/CD7、DLL4/CD34、DLL4/CD31、DLL4/CD144或CD34/CD43lo双阳性群体的存在用于鉴定淋巴样祖细胞。HPC上的CD144表达与CD31、CD34和DLL4共染色。HPC上的CD7表达与CD235、CD34和CD43共染色。因此，共表达CD144和CD7的HPC显示出表达膜结合notch配体(DLL4)的淋巴样潜在捕获前体以及血液内皮标志物，并为能够在体外生成确定性造血谱系的出现的淋巴祖细胞创建表型特征。在特定方面，通过分选包括CD31、CD34、CD144、CD43、CD45、CD6、CD335、Flk-1和DLL4的表面标志物，可以将HPC进一步分选成具有增强的淋巴样潜力的细胞。在一些方面，将HPC的CD114/CD34、CD144/CD45、CD144/CD7和CD144/CD34/CD45/CD7的阳性级分分化为淋巴样细胞。在特定方面，HPC的CD144/CD7阳性部分分化为淋巴样细胞。
可以在确定的无饲养细胞条件下培养HPC用于淋巴样分化。培养基可含有一种或多种基质组分，例如RetroNectin、纤连蛋白或RGD肽。不希望受任何理论束缚，基质组分可为胚胎干细胞的生长提供固体支持。在某些实施方案中，可以将基质组分施加于培养表面并在将细胞接种到培养基中之前与培养基接触。例如，细胞可以在确定的培养基(例如TeSR培养基)中在包被纤连蛋白或MatrigelTM的平板上培养，然后将细胞机械分离成团块或个体化细胞并诱导分化为造血前体细胞。
各种基质组分可用于培养多能细胞，包括胶原蛋白(例如，胶原蛋白IV)、层粘连蛋白、玻连蛋白、MatrigelTM、明胶、聚赖氨酸、血小板反应蛋白(例如，TSP-1、-2、-3、-4和/或-5)和/或ProNectin-FTM。在某些实施方案中，由于可能对细胞活力的不利影响，可以避免仅使用MatrigelTM、胶原IV或层粘连蛋白与先前使用TeSR培养的细胞；尽管如此，这些组合物可以有利地与其他基质组分组合使用。这些基质组分的组合可以为促进细胞生长和细胞活力提供额外的益处。在某些实施方案中，1、2、3、4、5、6或更多种上述基质组分可用于培养细胞，例如，在造血分化之前。
在实施例4中公开了用于淋巴样分化的示例性无饲养细胞基质。在特定方面，非组织培养物处理的平板可以用DLL4:Fc嵌合蛋白和RetroNectin(纤连蛋白片段CH-296；Takara Shuzo，Japan)包被，用于HPC的淋巴样分化。
在一些实施方案中，抗坏血酸可用于增强淋巴样分化。确定的培养基可以补充有约10μM至约1mM的抗坏血酸，例如约50μM至约100μM，例如约95μM。抗坏血酸可选自各种抗坏血酸盐，例如抗坏血酸磷酸镁。在一些实施方案中，烟酰胺(例如烟酸)可用于增强淋巴样分化，例如浓度为约0.1mM至约5mM。
在一些方面，通过施用增加受试者中Notch配体产生的物质而通过改变Notch配体的内源活性来将HPC分化为淋巴样细胞，例如T细胞。该方法还包括在培养基中培养细胞，其中培养基包含有效量的notch配体和选自IL-7、IL-15、SCF、Flt-3和IL-3中的一种或多种细胞因子。在一些特定实施方案中，培养基能够进一步包括IL-6。在一些实施方案中，notch配体是Δ4notch配体(DLL4)，例如DLL4:Fc嵌合体。
选择促进和维持T细胞谱系细胞的分化和增殖的Notch配体。Notch配体可以起源于人，或者可以衍生自其他物种，包括哺乳动物物种，例如啮齿动物、狗、猫、猪、绵羊、牛、山羊和灵长类动物。Notch配体的具体实例包括Delta家族。Delta家族包括Delta-1(Genbank登录号AF003522，智人(Homo sapiens))、Delta-3(Genbank登录号AF084576，褐家鼠(Rattus norvegicus))、Delta样1(Genbank登录号NM-005618和NP-005609，智人；Genbank登录号X80903、I48324，小鼠(M.musculus))、Delta样3(Genbank登录号NM-053666、N-446118，褐家鼠)，Delta-4(Genbank登录号AF273454、BAB18580，小鼠；Genbank登录号AF279305、AAF81912，智人)和Delta样4(Genbank登录号Q9NR61、AAF76427、AF253468、NM-019074，智人；Genbank登录号NM-019454，小鼠)。Notch配体可商购获得或可通过重组DNA技术生产并纯化至不同程度。
该方法还包括将HPC细胞维持在上述培养物中足以产生分化的NK细胞的持续时间的步骤。在一些实施方案中，分化的NK细胞与T细胞一起在培养物中出现，然而NK细胞可在第6周后停止增殖。通常，确定NK细胞数量的增加和/或其分化状态是使用本领域普通技术人员已知的常规方法评估。例如，可以通过流式细胞术针对NK细胞的发育监测培养的细胞，其中通过用抗CD56和抗CD3抗体对细胞进行染色。CD56+/CD3-的细胞将指示分化的NK细胞。
C.骨髓样分化
由体细胞衍生的PSC产生的HPC可以使用例如骨髓样分化培养基分化为骨髓样细胞。骨髓样分化培养基可以是无血清培养基或确定培养基，并且培养基可以含有SCF、EPO、TPO、胰岛素、地塞米松或氢化可的松和/或转铁蛋白。骨髓样细胞可以是树突细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞和/或嗜酸性细胞。在特定方面，骨髓样细胞是树突细胞。示例性的骨髓样分化和扩增培养基描述于例如表4-6中。
在一个示例性方法中，将HPC转移至低贴壁平板中在含有SFEM(Stem CellTechnologies)、肝素(例如，1至10U/mL，例如5U/mL，Sigma)、TPO(例如，50至150ng/mL，例如100ng/mL)、人重组SCF(例如，50至150ng/mL，例如100ng/mL)、FLT3L(例如，50至150ng/mL，例如，100ng/mL)、IL-3(例如，1至20ng/mL，例如10ng/mL)和IL-6(例如，1至20ng/mL，例如10ng/mL)的培养基中。约5-15天，例如8天后，骨髓样细胞在含有GM-CSF(例如，25至150ng/mL，例如100ng/mL)的SFEM培养基中扩增。最后，在含有SFEM(Stem Cell Technologies)、Excyte(例如，0.1％至2％，例如1％)、GM-CSF(25至150ng/mL，例如100ng/mL)、IL-4(10至30ng/mL，如20ng/mL)和TNFα(0.5至5ng/mL，如2.5ng/mL)的培养基中培养细胞另外的1-2周，以产生树突细胞。能够通过选自CD209+、CD1a+、HLA-DR+、CD11c+、CD14+、CD83+和CD86+中的一种或多种标志物的表达表征树突细胞。这些标志物主要染色骨髓样DC而不是浆细胞样DC(CD123+)。可对细胞离心涂片样品进行Wright染色以确认树突细胞的典型形态。
D.细胞培养
在某些实施方案中，基本上缺氧的条件可用于促进HPC向骨髓样或淋巴样谱系的分化。在某些实施方案中，可以使用大气氧含量小于约20％、小于约19％、小于约18％、小于约17％、小于约16％、小于约15％、小于约14％、小于约13％、小于约12％、小于约11％、小于约10％、小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％来促进分化为造血前体细胞。在某些实施方案中，缺氧气氛包含约5％的氧气。
如本文所述，一种或多种确定培养基可以有利地用于促进HPC分化为骨髓样和淋巴样谱系；特别地，消除诸如血清和小鼠饲养层的动物产品可以降低与细胞暴露于动物产品相关的风险，并且允许生成可以更安全地施用给人类受试者的细胞。由于传统的干细胞培养开发依赖于血清产品和小鼠饲养层用于将干细胞分化为多种细胞类型，这些传统方法限制了能够进行分化的规模，增加的生物变异性和潜在的污染，并严重受到阻碍ES细胞在翻译疗法中的应用，否则它们可能会被证明是有用的。
通常，本发明的细胞在培养基中培养，所述培养基是能够维持细胞生长的富含营养物的缓冲溶液。适用于根据本文所述方法分离、扩增和分化多能干细胞为造血前体细胞和造血细胞的培养基包括但不限于高葡萄糖Dulbecco's Modified Eagle's培养基(DMEM)、DMEM/F-15、RPMI 1640、Iscove's modified Dubelcco's培养基(IMDM)和Opti-MEMSFM(Invitrogen Inc.)。化学确定培养基包含最低必需培养基，如Iscove's ModifiedDulbecco's培养基(IMDM)(Gibco)，补充有人血清白蛋白、人ExCyte脂蛋白、转铁蛋白、胰岛素、维生素、必需和非必需氨基酸、丙酮酸钠、谷氨酰胺和有丝分裂原也是合适的。如本文所用，促分裂原是指刺激细胞分裂的试剂。试剂可为化学物质，通常为某种形式的蛋白质，其促使细胞开始细胞分裂，触发有丝分裂。在一个实施方案中，无血清培养基，例如美国序列号08/464,599和WO 96/39487中描述的那些，以及在美国专利号5,486,359中描述的“完全培养基”预期与本文所述的方法一起使用。在一些实施方案中，培养基补充有10％胎牛血清(FBS)、人自体血清、人AB血清或补充有肝素(2U/ml)的富含血小板的血浆。
通过在增加足以促进细胞分化为骨髓样或淋巴样谱系的因子的细胞内水平的条件下，在培养基中培养多能干细胞或造血前体细胞，可以生成免疫细胞。培养基还可含有一种或多种造血细胞分化和成熟试剂，如各种生长因子。这些试剂可以帮助诱导细胞决定为更成熟的表型(或者优先地促进成熟细胞的存活)或者具有这两种效应的组合。分化和成熟试剂可包括能够促进造血细胞谱系细胞生长的可溶性生长因子(肽激素、细胞因子、配体-受体复合物和其他化合物)。此类试剂的非限制性实例包括但不限于造血或内皮生长因子，例如成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、FLT-3配体(FLT3L)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-9(IL-9)或粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，或者其同种型或变体。
IV.免疫细胞的用途
通过某些方面的方法和组合物提供的免疫细胞能够用于多种应用中。这些包括但不限于在体内移植或植入细胞；在体外筛选细胞毒性化合物、致癌物、诱变生长/调节因子、药物化合物等；阐明血液疾病和损伤的机制；研究药物和/或生长因子的运作机制；诊断和监测患者的癌症；基因疗法；以及生物活性产品的生产，仅举几例。
A.测试化合物筛选
本公开内容的免疫细胞能够用于筛选影响本文提供的淋巴样细胞的特征的因子(例如溶剂、小分子药物、肽和多核苷酸)或环境条件(例如培养条件或操作)。
本公开内容的特定筛选应用涉及在药物研究中药物化合物的测试。读者通常参考标准教科书In vitro Methods in Pharmaceutical Research，Academic Press，1997和美国专利号5,030,015。在某些方面，骨髓样和淋巴样细胞起用于标准药物筛选和毒性测定法的测试细胞的作用，如同以前曾在短期培养中对造血细胞和前体进行的。对候选药物化合物的活性的评估通常涉及将某些方面中提供的造血细胞或前体与候选化合物组合，限定可归因于该化合物的细胞的形态、标志物表型或代谢活性中的任何变化(与未处理的细胞或用惰性化合物处理的细胞相比)，然后将化合物的效果与观察到的变化相关联。筛选可以是因为化合物被设计为对造血细胞或前体具有药理学作用，或者因为设计为在其他地方具有作用的化合物可能对造血细胞或前体具有非预期的作用。可以组合测试两种或更多种药物(通过同时或依次与细胞组合)，以检测可能的药物-药物相互作用效应。
B.造血细胞疗法
本公开内容还提供了本文提供的免疫细胞恢复可能是由于血液疾病或病症或损伤而需要这种疗法的受试者的功能程度的用途。例如，通过本文公开的方法衍生的免疫细胞可用于治疗血液疾病和病症，例如血红蛋白病、贫血等。此类细胞可用于治疗由细胞抑制疗法(例如化学疗法)引起的造血细胞缺陷。
为了限定本文提供的细胞对治疗应用的适合性，可首先在合适的动物模型中测试细胞。在一个水平上，评估细胞在体内存活和维持其表型的能力。将本文提供的细胞施用给免疫缺陷动物(例如NOG小鼠，或者化学上或通过辐射而免疫缺陷的动物)在适于进一步观察的位点，例如在肾囊下、进入脾脏、进入肝小叶或进入骨髓。在几天至几周或更长时间后收获组织，并评估是否仍存在起始细胞类型如红细胞。这能够通过向施用的细胞提供可检测的标签(例如绿色荧光蛋白或β-半乳糖苷酶)；或者通过测量对施用的人细胞特异的组成型标志物来进行。当在啮齿动物模型中测试本文提供的细胞时，能够评估施用的细胞的存在和表型，通过使用人特异性抗体的免疫组织化学或ELISA或者使用引物和杂交条件的RT-PCR分析，所述引物和杂交条件使得扩增对于人多核苷酸序列具有特异性。用于评估mRNA或蛋白质水平的基因表达的合适标志物在本公开内容的其他地方提供。
通过本公开内容的方法提供的免疫细胞可以在多种动物模型中测试它们治疗血液病症和损伤的能力。例如，镰状细胞贫血小鼠模型或T/B细胞缺陷型Rag-2敲除小鼠可以是用于测试本文公开的骨髓样和淋巴样细胞的特别有用的动物模型。
在本公开内容的某些方面中提供的免疫细胞在动物模型中显示出所需的功能特征或功效，也可适用于直接施用给有此需要的人类受试者。出于止血的目的，可在能够充分进入循环的任何位点施用细胞。造血细胞或其前体也可以在损伤或疾病的位点递送。
在本公开内容的某些方面中提供的细胞可以用于任何有此需要的受试者的疗法。可能适合于这种疗法的人类病症包括多种贫血和血红蛋白病，以及以造血细胞数量减少为特征的疾病(例如，骨髓增生异常综合征、骨髓纤维化、中性粒细胞减少症、粒细胞缺乏症、格兰兹曼氏血小板减少症、血小板减少症和获得性免疫缺陷综合症)。对于人类治疗，剂量通常在约109和1012个细胞之间，并且通常在约5×109和5×1010个细胞之间，针对受试者的体重、痛苦的性质和严重程度以及所施用细胞的复制能力进行调整。限定治疗方式和适当剂量的最终责任在于管理临床医生。
C.商业、治疗和研究目的的分布
出于制造、分配和使用的目的，本公开内容的免疫细胞通常以细胞培养物或悬浮液的形式在等渗赋形剂或培养基中提供，任选冷冻至便于运输或储存。
本文还提供的是不同的试剂系统，其包括在制造、分配或使用过程中的任何时间存在的一组细胞或细胞组合。细胞组包含本公开内容中描述的两种或更多种细胞群的任何组合，例示但不限于编程衍生的细胞(造血谱系细胞、它们的前体和亚型)，与未分化的干细胞组合，体细胞衍生的造血细胞，或其他分化的细胞类型。组中的细胞群有时共享相同的基因组或其遗传修饰形式。在相同实体或共享业务关系的不同实体的控制下，组中的每个细胞类型可以被包装在一起，或者在相同设施中的不同容器中，或者在相同或不同时间在不同位置。
V.实施例
包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中很好地起作用的技术，因此能够认为是构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对所公开的具体实施方案进行许多改变并仍然获得相同或相似的结果。
实施例1-产生T细胞衍生的PSC(TiPSC)
为了产生iPS细胞，从血液样品中分离T细胞并激活，然后逆转录病毒重新编程为iPSC。首先，外周血单核细胞(PBMC)在新鲜制备的AIM-V培养基+pen/strep/谷氨酰胺(AIV-V/ps/s/g培养基)(Invitrogen)加300IU/ml rhIL2(Peprotech)和10ng/ml可溶性抗CD3抗体(OKT3克隆，eBiosciences)和抗CD28抗体中扩增。激活后数天，通过CEDEX细胞计数来验证指数生长。培养3天后，测定细胞的T细胞表型，然后用重新编程因子进行转导。
如前所述构建逆转录病毒载体Nanog RFP、Lin28RFP、Oct4eGFP和Sox2eGFP(参见美国申请号61/088,054，通过引用并入本文)。类似地构建逆转录病毒载体c-Myc RFP、Klf4RFP、Oct4eGFP和Sox2eGFP。
在包含含有2％人AB血清和10ng/mL IL-2的AIM-V培养基的T细胞培养基中培养CD3-和CD28-活化的外周单核细胞。在第6天，使用Amaxa U-014程序(1-5x106个细胞/转染，Amaxa T细胞转染溶液)通过电穿孔用6种重新编程因子转染T细胞。转染后第25天，细胞在包被retronectin(0.3μg/cm2)和包被玻连蛋白(0.2μg/cm2)的6孔平板的孔中培养，每孔一个转染，并从第14天开始从T细胞逐渐过渡到E8PSC培养基。
活化和扩增的T细胞显示出特征性细胞形态和聚集行为。在初始转导后72小时通过GFP和RFP表达确定逆转录病毒转导效率的检测，在约3周的过程中转基因沉默并显示hES细胞表型。明确定义的iPS细胞集落在第23天开始出现。通过荧光显微镜验证GFP和RFP沉默，并使用移液管尖端在解剖罩中挑取集落。然后将集落片转移到新鲜的6孔平板中。计数集落数以估计重新编程效率，给出输入的铺板细胞数量。从这一点开始，每天给克隆集落进料并再次手动传代，然后扩增以产生TiPSC系。
实施例2-TiPSC分化为造血前体细胞(HPC)
将多种附加体和病毒重新编码的iPSC(表1)包括实施例1的TiPSC进行3D分化方案以产生HPC(图1)。首先，iPSCs适应缺氧条件，在Essential 8(E8)培养基中在包被MatrigelTM或包被玻连蛋白的超低贴壁(ULA)平板上无饲养细胞条件下5-10次传代。在补充有5μM布雷他汀的无血清确定(SFD)培养基存在下，以25-50万个细胞/ml的密度，从亚汇合的iPSC制备聚集体。该过程在含有75％IMDM(Invitrogen 12200-069)(含谷氨酰胺和25mMHEPES+P/S)、25％Hams F12(Mediatech 10-080-CV)、0.5％N2补充剂(Invitrogen 17502-048)、不含视黄酸的1％B27补充剂(Invitrogen 12587-010)、0.05％BSA、50ug/ml抗坏血酸和4.5×10-4M硫代甘油的SFD基础培养基中在超低贴壁(ULA)平板或旋转瓶中进行。
一旦形成EB，通过在前4天用50ng/ml的BMP-4、VEGF和FGF2补充SFD基础培养基来起始分化。在分化EB的第五天，将培养物置于各自50ng/ml的Flt-3配体、IL3、IL6、SCF和TPO以及5000单位的肝素存在下。在分化过程中每2天向EB培养物补充一半体积的含有细胞因子的新鲜分化培养基，直至在缺氧条件下分化的第12-16天。在分化过程后收获细胞，并通过流式细胞术评估表型，并使用CFU测定法评估功能性能力。收获细胞并通过流式细胞术定量CD43/CD34细胞的百分比(图1B)。通过将生成的HPC的绝对数量除以iPS细胞的输入数量来计算该过程的效率(图1C)。
表1：使用多个iPSC系的过程验证
细胞系 重新编程方法 用于重新编程方法的来源材料
01501.102 附加体 祖细胞血液 雄性
TiPSCs1E 病毒 T细胞 雄性
1.025T 病毒 T细胞 雌性
2.022B 附加体 LCL 雄性
2.0224B 附加体 LCL 雌性
01279.107.3902 附加体 祖细胞血液 雄性
01279.107.3908 附加体 祖细胞血液 雄性
01279.107.3904 附加体 祖细胞血液 雄性
01279 附加体 祖细胞血液 雄性
01629 附加体 祖细胞血液 雄性
对于流式细胞术分析，收集细胞并用培养基洗涤一次。使用TrypLETM或0.5％胰蛋白酶在37℃培养箱中消化细胞沉淀5-10分钟，然后用培养基洗涤并通过70-μm细胞过滤器传代。将细胞重悬于含有FACS缓冲液的PBS-FBS中，计数以估计细胞活力并用荧光染料缀合的单克隆抗体进行染色：抗人CD43(1G10)、抗人CD31(WM-59)、抗人CD41(HIP8)；抗人CD45(HI30)；抗人CD34(581，8G12)(BD Biosciences San Jose，CA)；和抗人CD235。用7-氨基放线菌素D(7-AAD，BD Biosciences)排除非活细胞。在FACS CaliburTM或Accuri流式细胞仪上和Cell Quest软件进行活细胞分析。
对于克隆形成造血祖细胞测定法(CFU测定法)，使用TrypLE或0.5％胰蛋白酶/EDTA将EB分散到单细胞悬浮液中。对活细胞进行定量，铺板(50,000-300,000个细胞/mL)，并使用含有干细胞因子(SCF)50ng/mL、促红细胞生成素(EPO)3U/mL、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)10ng/mL、白细胞介素-3(IL-3)10ng/mL的人甲基纤维素完全培养基(R&DSystems，Minneapolis，MN)在加湿室中测定造血CFC。14天后，根据它们的形态对集落进行评分，并定量每铺板105个细胞的集落。
实施例3-修饰的iPSC分化为造血前体细胞(HPC)
通过聚集悬浮(3D)培养将1C T细胞衍生的iPSC(通过逆转录病毒重新编程衍生的TiPSC)分化为CD34+造血祖细胞。在Essential 8(E8)培养基中在包被MatrigelTM或包被玻连蛋白的6孔平板上将1C细胞维持在无饲养细胞条件下。在补充有50ng/ml FGF2、50ng/mlVEGF、2μM CHIR99021(GSK-3抑制剂)和10μM布雷他汀(肌球蛋白-II抑制剂)的Essential 3(E3)培养基(仅含有E8培养基的8种组分中的3种：DMEM/F12基础培养基、抗坏血酸2-磷酸镁和亚硒酸钠)中，以50-100万个细胞/ml的密度，从亚汇合的1C细胞(<80％汇合)制备聚集体。在摇动平台上以15rpm连续搅拌(包括所有后续培养步骤)，在ULA培养瓶中培养24小时期间进行聚集体形成。
将形成的细胞聚集体(即，胚状体-EB)进一步转移至补充有造血中胚层诱导细胞因子-25ng/ml BMP4、50mg/ml VEGF和50ng/ml FGF2的无血清分化培养基(50％IMDM、50％Hams F12培养基、100μg/ml聚乙烯醇、100μg/ml重组人血清白蛋白、1x非必需氨基酸补充剂(Invitrogen)、0.1x化学确定的脂质补充剂(Invitrogen)、125μM抗坏血酸2-磷酸镁、0.25μM亚油酸、痕量元素补充剂A(0.3x)、B(0.2x)和C(0.1x)(Corning)、5mM氯化钠、100μM硫代甘油、20μM乙醇胺、100ng/ml肝素和10ng/ml IGF1)中。培养物继续培养4天，第二天完全更换培养基。
为了支持造血CD34+祖细胞的分化和扩增，将细胞聚集体进一步转移至补充有造血支持细胞因子-50ng/ml SCF、20mg/ml TPO、10ng/ml FLT3L、20ng/ml IL-3和25ng/mlBMP4的无血清分化培养基(如上)。培养物继续培养4天，第二天完全更换培养基。
在分化过程的第7-9天期间收获培养物。通过在Accutase(或Accumax)溶液中在37℃消化分化的细胞聚集体15-20分钟来获得单细胞悬浮液。将细胞在MACS缓冲液(例如，含有5mg/ml BSA和1mM EDTA的PBS)中洗涤，通过70μM细胞过滤器过滤，并在4℃用直接CD34顺磁微珠(Miltenyi Biotec)标记30分钟。根据制造商(Miltenyi Biotec)的推荐，使用MS或LS磁柱，适当的磁体和标准分离程序来分离CD34+细胞。将分离的CD34+细胞铺板到T/NK分化培养物中或冷冻保存以在分离后1小时内使用。
实施例4-HPC的淋巴样分化的影响
为了确定实施例2和实施例3的HPC的淋巴样分化的参数，使细胞系经历用于T细胞和NK细胞分化的培养条件。首先，在基质依赖性方案中针对T细胞分化测试了几个变量。针对基质系上的T细胞潜力测试来自不同细胞系的第12天HPC，所述基质系包括OP9骨髓基质细胞和MS5鼠骨髓基质细胞。将细胞在含有20％FBS、10ng/mL SCF、5ng/mL Flt-3和5ng/mLIL-7的αMEM培养基中培养。每周三次通过半培养基更换来更新细胞。针对T细胞的存在对细胞的分析表明，细胞具有生成骨髓细胞的倾向，并且不能检测到CD3+细胞的存在。此外，基质共培养物在缺氧条件下表现不佳。
表2：用于淋巴样分化的基质的选择。在Retronectin-DLL4上铺板的细胞揭示了前T细胞(CD5+/CD7+)细胞的存在。
表3：缺氧有利于T细胞分化。在缺氧条件下分化的细胞揭示了T细胞和NK细胞的存在。
因此，开发了无饲养细胞T细胞分化方案。将HPC以约5,000至约25,000个细胞/cm2的细胞密度铺板在包被有0.5μg/cm2的Retronectin和Notch DLL4的未处理组织培养平板上。HPC在补充有1％Glutamax、1％青霉素链霉素、95μM抗坏血酸(WAKO labs)以及50ng/mL的IL-7、SCF、Flt-3和TPO(Peprotech)的StemSpan无血清扩增培养基II(SFEM；StemCellTechnologies)培养基中培养。每48小时补充培养基，并且在第2周将细胞分裂成新的包被配体的平板。此外，在2至3周之间，通过细胞表面标志物CD5和CD7针对前T细胞的存在分析细胞。在第4周，通过细胞表面标志物CD3、CD4和CD8针对T细胞的存在分析细胞。在6-8周，使用细胞表面标志物CD4、CD8、CD3、CD94和CD56针对T和NK细胞的存在分析细胞。
测试其对T细胞分化的影响的参数之一是培养平板上基质涂层的选择。通过在铺板后3周使用具有脐带血细胞的Notch DLL4的多种基质组合分析无血清条件下的前T细胞的出现来进行比较。结果显示，与玻连蛋白或肌腱蛋白的组合相比，retronectin与DLL4的组合在将脐带血细胞分化为前T细胞方面更有效(表2)。
令人惊讶的是，发现缺氧条件增强了无饲养细胞的T细胞分化。具体地，观察到与在常氧条件下分化的细胞相比，缺氧导致CD8阳性细胞百分比的增加和CD4阳性细胞百分比的降低(表3)。
通过在实施例2中描述的HPC分化的第5天、第7天、第9天和第11天收获多种细胞系来分析将血细胞衍生的iPSC分化为淋巴样谱系的效率。解冻HPC细胞并铺板在包被Retronectin和DLL4的平板上。每2天给细胞进料新鲜培养基，并在HPC细胞解冻后第2周时分析前T细胞标志物，第4周时分析T细胞标志物，以及第6周时分析T和NK细胞标志物。针对T、NK和NK/T细胞存在的CD7、CD8、CD56(图3A)，CD45、CD7、CD5(图3B)以及CD56、CD8、CD3(图3C)的表面表达对细胞进行染色。观察到TiPSC和附加体重新编程的3908细胞在第7-11天具有增加的淋巴样潜力(图3A)。
为了确定表面标志物是否可用于增加淋巴样分化的效率，在TiPSCs1E系和附加体3902系上进行对CD43/CD34、CD34、DLL4、CD31/CD144和CD235的分析(图4)。发现DLL4的表达和CD235的水平在分化的第11天下降，而随着分化天数的推进CD34表达降低并且CD43表达增加。由于在分化的第11天缺少淋巴样细胞，这意味着这些标志物表达的某些阈值水平对于在DLL4存在下引发细胞向淋巴样分化是必需的。
通过磁性分选表面标志物CD31、CD34、CD144、CD43、CD45、CD6、CD335、Flk-1和DLL4，进行HPC分化期间淋巴样祖细胞的进一步分析。将第8天的HPC分选为CD114/CD34、CD144/CD45、CD144/CD7和CD144/CD34/CD45/CD7阳性和阴性级分以及未分选的对照(图5)。然后将这些级分进行淋巴样分化过程，并在第16天分析CD3+细胞的存在(图6A)。观察到与阴性级分和未分选的对照相比，显示淋巴样潜力的每个阳性级分显著增加。通过从阳性级分磁性分选增加T细胞生成的倍数富集进一步支持了这一点(图6B)。将阳性级分铺板回新鲜的Ret-DLL4表面上再两周。
在淋巴样分化的4周时，第8天的CD144+/CD7+和CD144+/CD45+HPC在体外维持T细胞的产生，如图7A中CD3阳性细胞的百分比所示。CD3细胞是CD335阳性、CD161阳性和不变T细胞受体(6B11)阴性。因此，末期状态培养物具有出现的NK/T细胞表型。此外，显示CD144+/CD7+HPC具有生产T细胞的提高效率，这是通过在第16天HPC的输入与T细胞的输出的比率来测量。然而，显示该过程的累积效率在4周结束时对于CD144/CD34/Cd45/CD7阳性级分最高。
在进一步的研究中，测定TiPSC衍生的T细胞的功能性。将来自TiPSC(1C)衍生的CD34+细胞的2周T/NK分化培养物中生成的T细胞转移至T细胞扩增培养物(固定化的抗CD3mAb、IL2和IL7)。外周血T细胞在平行培养物中扩增。在扩增2周后收获T细胞，洗涤，计数，调节至106/ml浓度并在固定化的抗CD3mAb上培养以再刺激36小时用于激活的细胞因子产生(T细胞+抗CD3)，或没有抗CD3mAb下培养用于自发/组成型细胞因子产生(T细胞)。使用LEGENDplex流式细胞术多重细胞因子测定法(CD8/NK组；BioLegend)在培养物上清液中测量细胞因子。相对细胞因子水平描绘于图22中的相应点图上。外周血衍生的和PSC衍生的T细胞在相同的培养条件下扩增2周，产生了非常相似的1型细胞因子分泌谱，其特征在于高水平的IL2、IFNγ和TNF产生。通过活化的颗粒酶B分泌也揭示了扩增的T细胞的细胞毒性特征。因此，TiPSC衍生的T细胞表现出与通过1型细胞因子分泌谱观察到的原代T细胞相似的功能性。
实施例5-HPC的骨髓样分化
对实施例2和3的CD34+HPC进行骨髓样分化，用于产生相对纯的人树突细胞(DC)群。在低贴壁组织培养平板或培养瓶上培养细胞用于整个过程。将细胞以0.5-1×106个细胞/mL的密度重悬于含有50ng/mL Flt-3配体(Flt-3L)、50ng/mL干细胞因子(SCF)、50ng/mL血小板生成素(TPO)、50ng/mL白细胞介素-3(IL-3)和50ng/mL白细胞介素-6(IL-6)的无血清培养基中。
为了开始骨髓样分化，将细胞以25-50万个细胞/mL的密度接种在髓样祖细胞培养基中(表4)并扩增约2周。在第4和8天监测细胞的活力和CD34+/CD45+/CD43+的表达。观察到CD34+群体下降并且培养物中出现CD45+/CD43+/CD31+群体。该阶段培养物的表型主要是CD43+/CD45+/CD31+/CD34Lo。
表4：骨髓祖细胞培养基
组分 制造商 目录号 浓度
无血清培养基*
GlutaMAX Gibco 35050 1％
Pen/Strep Gibco 15140 1％
SCF Peprotech 300-07 50ng/mL
IL-6 Peprotech 200-06 50ng/mL
TPO Peprotech 300-18 50ng/mL
IL-3 Peprotech 200-06 50ng/mL
Flt-3L Peprotech 300-19 50ng/mL
*StemSpanTM SFEM(Stem Cell Technologies，Cat.09650)，Stem Pro 34(Invitrogen，Cat.10639-011)或Stemline II(Sigma，Cat.S0192)能够用作无血清培养基。
当细胞揭示CD43+/CD45+/CD31+/CD34-细胞表面标志物的超过50％表达时，然后将细胞置于骨髓样扩增培养基(表5)中8天。每隔一天给细胞进料新鲜培养基。在8天结束时，培养的细胞具有骨髓样细胞的富集群，揭示80-90％的CD43+/CD45+/CD31+/CD34-。在该骨髓样扩增阶段结束时，测定细胞数量、活力和纯度。
表5：骨髓样扩增培养基
组分 制造商 目录号 浓度
无血清培养基*
GlutaMAX Gibco 35050 1％
GM-CSF Peprotech 300-03 100ng/mL
*StemSpanTM SFEM(Stem Cell Technologies，Cat.09650)，Stem Pro 34(Invitrogen，Cat.10639-011)或Stemline II(Sigma，Cat.S0192)能够用作无血清培养基。
最后，在培养16天结束时，将培养物置于树突细胞富集培养基中(表6)。将细胞密度维持在50-100万个细胞/mL之间，并且每4天用新鲜培养基喂养细胞而不进行旋转步骤。在这个分化阶段几乎没有观察到增殖。相反，观察到细胞粘附在低贴壁平板上并增加尺寸。在一周结束时，收获样品并通过流式细胞术测试CD209+、CD1a+、HLA-DR+、CD11c+、CD14+、CD83+和CD86+的存在(图9-10)。这些标志物主要染色骨髓样DC而不是浆细胞样DC(CD123+)。将细胞维持在树突细胞富集培养基中并在多个时间点分析以定量产率和纯度。对细胞离心涂片样品进行Wright染色以确认树突细胞的典型形态。
表6：树突细胞富集培养基
组分 制造商 目录号 浓度
无血清培养基*
GlutaMAX Gibco 35050 1％
GM-CSF Peprotech 300-03 100ng/mL
Excyte Millipore 81-129-1 1％
IL-4 Peprotech 200-04 20ng/mL
TNFα Peprotech 300-01A 2.5ng/mL
实施例6-PSC分化和T细胞扩增的方法
PSC分化为CD34+淋巴样造血祖细胞：通过聚集悬浮(3D)培养将1C T细胞衍生的iPSC(通过逆转录病毒重新编程衍生的TiPSC)分化为CD34+造血祖细胞。将1C细胞维持在Essential8(E8)培养基中在包被MatrigelTM或包被玻连蛋白的6孔平板上无饲养细胞条件下。在补充有50ng/ml FGF2、50ng/ml VEGF、2μM CHIR99021(GSK-3抑制剂)和10μM布雷他汀(肌球蛋白-II抑制剂的)的Essential 3(E3)培养基(仅含有E8培养基的8种组分中的3种：DMEM/F12基础培养基、抗坏血酸2-磷酸镁和亚硒酸钠)中，以50-100万个细胞/ml密度，从亚汇合1C细胞(<80％汇合)制备聚集体。在摇床平台上以15rpm连续搅拌(包括所有后续培养步骤)，在超低贴壁(ULA)培养瓶中培养24小时期间进行聚集体形成。
将形成的细胞聚集体(胚状体-EB)进一步转移至补充造血中胚层诱导细胞因子——25ng/ml BMP4、50mg/ml VEGF和50ng/ml FGF2的无血清分化培养基(50％IMDM、50％Hams F12培养基、100μg/ml聚乙烯醇、100μg/ml重组人血清白蛋白、1x非必需氨基酸补充剂(Invitrogen)、0.1x化学成分确定的脂质补充剂(Invitrogen)、125μM抗坏血酸2-磷酸镁、0.25μM亚油酸、痕量元素补充剂A(0.3x)、B(0.2x)和C(0.1x)(Corning)、5mM氯化钠、100μM硫代甘油、20μM乙醇胺、100ng/ml肝素和10ng/ml IGF1)中。培养物继续培养4天，第二天完全更换培养基。
为了支持造血CD34+祖细胞的分化和扩增，将细胞聚集体进一步转移至补充有造血支持细胞因子——50ng/ml SCF、20mg/ml TPO、10ng/ml FLT3L、20ng/ml IL-3和25ng/mlBMP4的无血清分化培养基(如上)。培养物继续培养4天，第二天完全更换培养基。
在1+4+4(总共9天)分化过程后收获培养物。通过在Accutase(或Accumax)溶液中在37℃消化分化的细胞聚集体15-20分钟来获得单细胞悬浮液。在MACS缓冲液(含有5mg/mlBSA和1mM EDTA的PBS)中洗涤细胞，通过70μM细胞过滤器过滤，并在4℃用直接CD34顺磁性微珠(Myltenyi Biotec)标记30分钟。根据制造商(Myltenyi Biotech)的推荐，使用MS或LS磁柱，适当的磁体和标准分离程序分离CD34+细胞。将分离的CD34+细胞铺板到T/NK分化培养物中或冷冻保存以在分离后1小时内使用。
T/NK分化培养：对于T/NK分化，用Notch配体hDLL4-Fc嵌合蛋白和在PBS中稀释的retronectin(每种0.5μg/cm2)包被非组织培养物处理的塑料平板。在细胞铺板之前，吸出包被溶液，用细胞培养基础培养基(DMEM/F12或其他)洗涤平板一次，并填充由StemSpanSFEM(Stem Cell Technologies)、GlumaMax(1/100)、PenStrep(1/200)、抗坏血酸磷酸镁(250μM)、烟酰胺(2mM)和细胞因子SCF、TPO、FLT3L和IL7(各50ng/ml)组成的0.25ml/cm2T细胞分化培养基(TCDM)。将分离的PSC衍生的CD34+细胞以5000个细胞/cm2密度铺板，并在缺氧(5％O2)CO2培养箱中培养2周，在第3天和第6天加入新鲜的TCDM培养物体积，并其后每第3天更换半培养体积。通过温和重悬和收集非贴壁细胞来收获总分化的细胞，然后用PBS-EDTA(0.5mM)处理10-15分钟使贴壁细胞脱离。
T细胞扩增培养：对于T细胞扩增，用在PBS中稀释的抗CD3mAb(克隆OKT3)和retronectin(每个0.5μg/cm2)包被组织培养塑料平板。在细胞铺板之前，吸出包被溶液，用细胞培养基础培养基(DMEM/F12或其他)洗涤平板两次，并填充由ImmunoCult XF培养基(Stem Cell Technologies)、GlumaMax(1/100)、PenStrep(1/200)以及细胞因子IL2和IL7(各10ng/ml)组成的0.2ml/cm2T细胞扩增培养基(TCEM)。还可以添加IL15和/或IL21以改善扩增。将从T/NK分化培养物中收获的细胞以20000个细胞/cm2密度铺板，并在缺氧(5％O2)CO2培养箱中培养2周，在第3天加入新鲜TCEM培养物体积，并其后每第3天更换半培养体积。通过温和重悬和收集非贴壁细胞来收获扩增的T细胞。
实施例7-用于生产HPC的2D方案
01279.107.3902MeCP2敲除和TiPSCs1E细胞进行2D分化方案用于产生HPC(图16)。首先，iPSCs适应缺氧条件，在Essential 8(E8)培养基中在包被MatrigelTM或包被玻连蛋白上无饲养细胞条件下5-10次传代。将iPSC个体化并在补充有5μM布雷他汀的无血清确定(SFD)培养基存在下，以25000/cm2的密度铺板在包被PureCoat Amine的6孔平板(CorningInc.)上。SFD基础培养基含有75％IMDM(Invitrogen12200-069)(含谷氨酰胺和25mM HEPES+P/S)、25％Hams F12(Mediatech 10-080-CV)、0.5％N2补充剂(Invitrogen 17502-048)、不含视黄酸的1％B27补充剂(Invitrogen 12587-010)、0.05％BSA、50μg/ml抗坏血酸和4.5×10-4M硫代甘油，补充有50ng/ml的BMP-4、VEGF和bFGF。
通过在含有75％IMDM(Invitrogen 12200-069)(含谷氨酰胺和25mM HEPES+P/S)、25％Hams F12(Mediatech 10-080-CV)、0.5％N2补充剂(Invitrogen 17502-048)、不含视黄酸的1％B27补充剂(Invitrogen 12587-010)、0.05％BSA、50ug/ml抗坏血酸和4.5×10-4M硫代甘油，补充有50ng/ml的BMP-4、VEGF和bFGF的SFD基础培养基中培养，在第1天起始对造血分化的诱导。在第2天，吸出培养基并将细胞置于新鲜的EB1培养基中。(SFD基础培养基含有75％IMDM(Invitrogen 12200-069)(含谷氨酰胺和25mM HEPES+P/S)、25％Hams F12(Mediatech 10-080-CV)、0.5％N2补充剂(Invitrogen17502-048)、不含视黄酸的1％B27补充剂(Invitrogen 12587-010)、0.05％BSA、50μg/ml抗坏血酸和4.5×10-4M硫代甘油，补充有50ng/ml BMP-4、VEGF和bFGF)另外的48小时。
在第5-10天，吸出培养基并将细胞置于EB2培养基中接下来的48小时。EB2培养基包含新鲜的SFD基础培养基，其含有75％IMDM(Invitrogen 12200-069)(含谷氨酰胺和25mMHEPES+P/S)、25％Hams F12(Mediatech 10-080-CV)、0.5％N2补充剂(Invitrogen17502-048)、不含视黄酸的1％B27补充剂(Invitrogen 12587-010)、0.05％BSA、50μg/ml抗坏血酸和4.5×10-4M硫代甘油，补充有50ng/ml的Flt-3配体、IL3、IL6、SCF和TPO各自为50ng/ml以及5000U/ml的肝素。使用TrypLE在分化的第7、8、9、10天收获细胞，并针对HPC标志物和淋巴祖细胞的存在进行染色。
对于T细胞分化，将HPC以约5,000至约25,000个细胞/cm2的细胞密度铺板在包被有0.5μg/cm2的Retronectin和Notch DLL4的未处理组织培养平板上。HPC在补充有1％Glutamax、1％青霉素链霉素、95μM抗坏血酸(WAKO实验室)以及50ng/mL的IL-7、SCF、Flt-3和TPO(Peprotech)的StemSpan无血清扩增培养基II(SFEM；StemCell Technologies)培养基或SFD中培养。每48小时补充培养基，并且在第2周将细胞非酶促地分裂到新的包被配体的平板。此外，在2至3周之间，通过细胞表面标志物CD5和CD7针对前T细胞的存在分析细胞。在第4周，通过细胞表面标志物CD3、CD4和CD8针对T细胞的存在分析细胞。在6-8周时，使用细胞表面标志物CD4、CD8、CD3、CD94和CD56针对T和NK细胞的存在分析细胞。
实施例8-MeCP2破坏对淋巴样分化的影响
为了确定MeCP2在造血分化过程中的作用，生成MeCP2敲除iPSC细胞系。将雄性野生型(WT)01279iPSC细胞系工程化改造以敲除MeCP2从而创建01279.107.3902细胞系。使用TAL核酸酶，通过转染MeCP2TALEN将一系列终止密码子插入在MeCP2的甲基CpG结合结构域之前(图17B)，并且含有终止密码子插入的供体质粒随后反方向插入侧翼为LoxP的PGKp-嘌呤霉素-SV40pA。用MeCP2TALEN和表达野生型EBNA1的供体质粒p1553转染0.1279iPSC。
选择对于插入物针对嘌呤霉素选择是阳性的细胞，然后挑取集落并通过整合PCR进行筛选。在筛选的集落中，通过两次PCR筛选反应96％对于插入是阳性的。将14个克隆扩增并在第3代筛选，发现8个克隆对于主干质粒的整合是阴性的。因此，通过插入物对剩余的三个克隆进行测序，发现两个克隆是多克隆的。选择一个单克隆系0.1279.107.302并进行充分表征用于进一步研究。还获得了另外的克隆并且表征为正确工程化改造的。MeCP2变体001、002、005和008的氨基酸比对描绘于图17C中。变体008不编码MethylCpG结合结构域。
将实施例1的01279.107.3902MeCP2敲除细胞和WT 01279细胞进行3D分化方案用于产生HPC(图17A)。首先，iPSC适应缺氧条件，在Essential 8(E8)培养基中在包被MatrigelTM或包被玻连蛋白上无饲养细胞条件下5-10次传代。在补充有5μM布雷他汀的无血清确定(SFD)培养基存在下，以25-50万个细胞/ml，从亚汇合的iPSC制备聚集体。该过程在含有75％IMDM(Invitrogen 12200-069)(含谷氨酰胺和25mM HEPES+P/S)、25％Hams F12(Mediatech 10-080-CV)、0.5％N2补充剂(Invitrogen 17502-048)、不含视黄酸的1％B27补充剂(Invitrogen 12587-010)、0.05％BSA、50ug/ml抗坏血酸、GlutaMAX、Pen/Strep和4.5×10-4M硫代甘油的SFD基础培养基中在超低贴壁(ULA)平板或旋转瓶中进行。
一旦形成EB，通过在前4天用50ng/ml的BMP-4、VEGF和bFGF补充SFD基础培养基来起始分化。在第五天，将EB培养物置于各自为50ng/ml的Flt-3配体、IL3、IL6、SCF、肝素和TPO的存在下。在分化过程中每2天向EB培养物补充一半体积的含有细胞因子的新鲜分化培养基，直至在缺氧条件下分化的第12-16天。
对于淋巴样分化，将HPC以约5,000至约25,000个细胞/cm2的细胞密度铺板在包被有0.5μg/cm2的Retronectin和Notch DLL4的未处理组织培养平板上。HPC在补充有1％Glutamax、1％青霉素链霉素、95μM抗坏血酸(WAKO实验室)以及50ng/mL的IL-7、SCF、Flt-3和TPO(Peprotech)的StemSpan无血清扩增培养基II(SFEM；StemCell Technologies)培养基中培养。每48小时补充培养基，并且在第2周将细胞非酶促地分裂到新的包被配体的平板。此外，在2至3周之间，通过细胞表面标志物CD5和CD7针对前T细胞的存在分析细胞。在第4周，通过细胞表面标志物CD3、CD4和CD8针对T细胞的存在分析细胞。在6-8周时，使用细胞表面标志物CD4、CD8、CD3、CD94和CD56针对T和NK细胞的存在分析细胞。
通过在HPC分化的第5天、第7天、第9天和第11天收获01279.107.3902、01279.107.3905、01279.107.3906、01279.107.3907和01279.107.3908克隆来分析MeCP2敲除克隆在分化为淋巴谱系中的效率。将在先前描述的时间点冷冻保存的HPC细胞解冻，并铺板在包被Retronectin和DLL4的平板上。每2天向细胞进料新鲜培养基，并针对HPC细胞解冻后第2周的前T细胞标志物(图18A，18B)，第4周的T细胞和NK细胞标志物进行分析。在前T细胞标志物的分析中，除野生型01279.107.3904细胞外的所有细胞都存在被鉴定为CD5+CD7+、CD7+CD45+和CD5+CD45+的前T细胞。针对CD45、CD7和CD5(图19)以及CD56、CD8和CD3(图20)的表面表达对细胞进行染色，并定量T、NK和NK/T细胞的存在。
由于已知细胞的输入数量，测定了T(CD3+/CD8+)、NK(CD3-/CD56+)和NK/T细胞(CD3+/CD56+)的绝对数量。通过细胞类型(T、NK或NK/T)的绝对数量/总细胞的输入数量的比率或通过细胞类型的绝对数量/HPC的输入数量的比率来计算该过程的效率。在FSC-SSC门和淋巴样散点门下通过流式细胞术定量T细胞(CD3+/CD8+)的百分比(图17)和NK细胞(CD3-/CD56+)的百分比(图21)。也测定了出现的NK/T(CD3+/CD56+)、(CD3+/CD8+)、NK/T(CD3+/CD56+)和NK(CD3-/CD56+)细胞的量。进一步分析显示CD235/CD7、CD144+/DLL4+和Flk-1+/CD34+的表达在分化的第11天下降。由于在分化的第11天不存在淋巴样细胞，这可能意味着这些标志物表达的某些阈值水平对于在DLL4存在下引发细胞向淋巴样分化是必需的。
T细胞标志物的分析显示MeCP2KO细胞系而非MeCP2WT细胞系具有淋巴样分化的潜力。来自MeCP2WT细胞的第9天HPC祖细胞基本上没有CD3+CD8+T细胞，而测试的其他HPC祖细胞分化为CD3+CD8+T细胞群。因此，敲除MeCP2的甲基结合结构域增强了HPC祖细胞产生T和NK细胞的潜力。
实施例9-HLA超供体细胞系的分化
如上所述，如果供体细胞是HLA纯合的，即含有每个抗原呈递蛋白的相同等位基因，则供体和受体之间的MHC相容性显著增加。大多数个体对于MHC I类和II类基因是杂合的，但某些个体对于这些基因是纯合的。这些纯合个体可以作为超级供体，并且可以将从它们的细胞生成的移植物移植到对于该单倍型是纯合的或杂合的所有个体中。
因此，确定了HLA超级供体PSC系的T/NK分化潜力。评估使用无转基因附加体方法从PBMC衍生的HLA超供体PSC系H、K、L和O的T/NK分化潜力，并与通过逆转录病毒重新编程的高T/NK生产性1C TiPSC(例如，实施例1-4中所述)进行比较。使用建立的PSC向CD34+T/NK淋巴样造血祖细胞(HPC)分化的方案，将4个HLA超级供体PSC系中的3个(H、K和O)分化为CD34+HPC，与1C TiPSC效率相当(图23A)。衍生自HLA超级供体PSC系的CD34+HPC的T/NK分化显示在所有测试的HPC中具有相对高的T/NK淋巴样潜力(每1输入CD34+HPC有100-200个T/NK)，然而，与1C HPC(主要产生T细胞)相比，HLA超级供体HPC生成比T细胞更多的NK细胞。然而，尽管存在这种趋势，但在4个测试的HLA超供体PSC系中，鉴定了相对有效的T细胞生产性H系(>30T/HPC)(图23A)。
***
根据本公开内容，无需过度实验即可制备和实施本文公开和要求保护的所有方法。虽然已经根据优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员显而易见的是，可以对本文描述的方法和方法的步骤或步骤顺序进行变化，而不脱离本发明的概念、精神和范围。更具体地，显而易见的是，化学和生理学相关的某些试剂可以代替本文所述的试剂，同时可以获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有这些类似的替代和修改都被认为是在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。
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Claims (95)

1.产生HLA纯合免疫细胞的方法，包括：
(a)获得诱导多能干细胞(iPSC)，其中从HLA纯合血细胞群对iPSC进行重新编程；
(b)将iPSC分化为造血前体细胞(HPC)；和
(c)在促进免疫细胞分化的条件下培养HPC，从而产生HLA纯合免疫细胞。
2.权利要求1的方法，其中HLA纯合血细胞对于基因座等位基因HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP或HLA-DQ中的一种或多种是纯合的。
3.权利要求2的方法，其中HLA纯合血细胞对于基因座等位基因HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP或HLA-DQ中的两种是纯合的。
4.权利要求3的方法，其中HLA纯合血细胞对于HLA-A和HLA-B是纯合的。
5.权利要求2的方法，其中HLA纯合血细胞对于HLA-A、HLA-B和HLA-C是纯合的。
6.权利要求1的方法，其中HLA纯合免疫细胞是淋巴样细胞。
7.权利要求6的方法，其中淋巴样细胞是T细胞、B细胞和/或NK细胞。
8.权利要求1的方法，其中HLA纯合免疫细胞是骨髓样细胞。
9.权利要求8的方法，其中骨髓样细胞是树突细胞。
10.权利要求1的方法，其中HLA纯合血细胞群包含T细胞、B细胞和/或NK细胞。
11.权利要求8的方法，其中HLA纯合血细胞群进一步定义为祖血细胞、外周血单核细胞或淋巴母细胞。
12.权利要求1的方法，其中HLA纯合血细胞群是人。
13.权利要求8的方法，其中HLA纯合血细胞群分离自外周血、脐带血或淋巴样组织。
14.权利要求13的方法，其中淋巴样组织包括骨髓、淋巴结或胎肝。
15.权利要求8的方法，其中HLA纯合血细胞群包含T细胞。
16.权利要求15的方法，其中T细胞是CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、T辅助性1(TH1)细胞、T辅助性2(TH2)细胞、TH17细胞、细胞毒性T细胞、调节性T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞、记忆T细胞或γδT细胞。
17.权利要求1的方法，其中重新编程包括将重新编程因子引入HLA纯合血细胞群。
18.权利要求17的方法，其中重新编程因子由包含在重新编程载体中的一个或多个表达盒编码，所述重新编程载体选自病毒载体、附加体载体和转座子。
19.权利要求18的方法，其中病毒载体进一步定义为逆转录病毒载体。
20.权利要求18的方法，其中附加体载体进一步定义为基于Epstein-Barr病毒(EBV)的附加体载体。
21.权利要求1的方法，其中重新编程包括在确定的无饲养细胞条件下培养细胞。
22.权利要求1的方法，其中iPSC基本上不含整合的外源病毒元件。
23.权利要求1的方法，其中HPC分化为每个HPC至少20个HLA纯合免疫细胞。
24.权利要求1的方法，其中HPC分化为每个HPC至少50个HLA纯合免疫细胞。
25.权利要求1的方法，其中HPC分化为每个HSC至少100个HLA纯合免疫细胞。
26.权利要求1的方法，其中将iPSC分化为HPC包括以下顺序步骤：
(a)在包含至少一种生长因子的第一确定培养基中培养iPSC；
(b)在不含或基本上不含IL-3、Flt3配体和GM-CSF的第二确定培养基中孵育细胞；
(c)在包含BMP4、FGF2和VEGF的第三确定培养基中培养细胞，足以在多个细胞中扩增或促进分化；和
(d)在包含IL-3和Flt3配体的第四确定培养基中培养细胞，足以在多个细胞中扩增或促进分化，
其中多个PSC分化为HPC。
27.权利要求26的方法，其中第二确定培养基包含布雷他汀和/或Rock抑制剂。
28.权利要求27的方法，其中第二确定培养基还包含GSK3抑制剂。
29.权利要求28的方法，其中GSK3抑制剂是CHIR99021。
30.权利要求26的方法，其中第二确定培养基还包含BMP4、VEGF和FGF2。
31.权利要求30的方法，其中在步骤(b)之前使细胞个体化。
32.权利要求31的方法，其中使用包被胺的培养平板进行步骤(b)至步骤(d)。
33.权利要求27的方法，其中第二确定培养基还包含VEGF和FGF2。
34.权利要求26的方法，其中第四确定培养基还包含选自IL-3、IL-6、SCF、TPO和BMP4中的一种或多种细胞因子。
35.权利要求26的方法，其中第四确定培养基包含肝素。
36.权利要求26的方法，其中所述方法包括在小于5％氧气的大气压下培养细胞。
37.权利要求26的方法，其中HPC表达CD34。
38.权利要求26的方法，其中HPC表达CD43、CD34、CD31、CD41、CD235和CD45中的至少两种标志物。
39.权利要求1的方法，其中促进免疫细胞分化的条件进一步定义为促进淋巴样分化的条件。
40.权利要求39的方法，其中表达CD34和CD43的HPC在促进淋巴样分化的条件下培养。
41.权利要求1的方法，其中培养细胞以促进淋巴样分化包括：
(i)在包被有基质和Notch配体的表面上在确定培养基中培养HPC，其中HPC表达选自CD34、CD43、CD7、DLL4、CD144和CD235中的一种或多种细胞表面标志物；和
(ii)在一种或多种细胞因子存在下维持培养，从而产生淋巴样细胞。
42.权利要求41的方法，其中基质是细胞外基质蛋白。
43.权利要求41的方法，其中HPC表达CD144、CD34、CD45和/或CD7。
44.权利要求41的方法，其中步骤(i)还包括分离表达一种或多种细胞表面标志物的HPC。
45.权利要求44的方法，其中分离包括磁激活细胞分选(MACS)。
46.权利要求41的方法，其中细胞在小于5％氧气的大气压下培养。
47.权利要求41的方法，其中确定培养基包含抗坏血酸和/或烟酰胺。
48.权利要求47的方法，其中抗坏血酸以50μM至1mM的浓度存在。
49.权利要求47的方法，其中抗坏血酸以90μM至100μM的浓度存在。
50.权利要求47的方法，其中烟酰胺以0.1mM至5mM的浓度存在。
51.权利要求41的方法，其中基质是retronectin。
52.权利要求41的方法，其中Notch配体是DLL4。
53.权利要求52的方法，其中DLL4是DLL4:Fc嵌合蛋白。
54.权利要求41的方法，其中一种或多种细胞因子选自SCF、TPO、IL-7和Flt-3。
55.权利要求41的方法，其中步骤(ii)持续1至6周。
56.权利要求41的方法，其中步骤(ii)持续2至4周。
57.权利要求41的方法，其中淋巴样细胞表达选自CD8、CD7、CD45、CD5、CD4和CD3中的一种或多种标志物。
58.权利要求57的方法，其中超过5％的淋巴样细胞对至少两种标志物是阳性的。
59.权利要求57的方法，其中超过10％的淋巴样细胞对至少两种标志物是阳性的。
60.权利要求57的方法，其中淋巴样细胞是T细胞和/或NK细胞。
61.权利要求60的方法，其中T细胞产生IL-2、IL-4、IL-10、IL-6、IL17A和TNF。
62.权利要求60的方法，其中T细胞产生颗粒酶A、颗粒酶B、穿孔素、颗粒溶素、IFNγ、sFas和sFasL。
63.权利要求1的方法，其中促进免疫细胞分化的条件进一步定义为促进骨髓样分化的条件。
64.权利要求63的方法，其中在促进骨髓样分化的条件下培养HPC包括：
(i)在包含TPO、SCF和Flt3配体的第一确定培养基中培养HPC，从而产生骨髓样细胞群；和
(ii)在基本上不含TPO、SCF和Flt3配体的第二确定培养基中孵育细胞，从而产生骨髓样细胞的富集群。
65.权利要求64的方法，其中第一确定培养基还包含IL-6和IL-3。
66.权利要求64的方法，其中第二确定培养基包含GM-CSF。
67.权利要求64的方法，其中在步骤(i)中产生的骨髓样细胞群的至少50％对于CD45、CD43和CD31是阳性的。
68.权利要求67的方法，其中对于CD45、CD43和CD31为阳性的骨髓样细胞群基本上不表达CD34。
69.权利要求64的方法，其中骨髓样细胞的富集群的至少80％是CD43+、CD45+、CD31+和CD34-。
70.权利要求64的方法，其中步骤(ii)持续5至10天。
71.权利要求64的方法，还包括将骨髓样细胞的富集群分化为树突细胞。
72.权利要求71的方法，其中将骨髓样细胞的富集群分化为树突细胞包括在包含GM-CSF、IL-4和TNFα的确定培养基中培养骨髓样细胞的富集群，从而产生树突细胞。
73.如权利要求72的方法，其中确定培养基还包含脂蛋白。
74.权利要求72的方法，其中树突细胞表达选自CD209、CD1a、HLA-DR、CD11c、CD14、CD83和CD86中的一种或多种标志物。
75.权利要求72的方法，其中树突细胞基本上不表达CD12。
76.HLA纯合免疫细胞文库，其中每个文库成员根据HLA型进行表征。
77.权利要求76的文库，其中HLA纯合免疫细胞衍生自从超级供体获得的血液样品。
78.权利要求77的文库，其中超级供体是人。
79.权利要求76的文库，其中HLA纯合免疫细胞是同种异体的。
80.权利要求76的文库，其中HLA纯合免疫细胞是自体的。
81.权利要求76的文库，其中HLA纯合免疫细胞至少对于一种或多种HLA I类基因和/或HLA II类基因是纯合的。
82.权利要求76的文库，其中HLA纯合免疫细胞对于基因座等位基因HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP或HLA-DQ中的一种或多种是纯合的。
83.权利要求82的文库，其中HLA纯合免疫细胞对于基因座等位基因HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP或HLA-DQ中的两种是纯合的。
84.权利要求83的文库，其中HLA纯合免疫细胞对于HLA-A和HLA-B是纯合的。
85.权利要求82的文库，其中HLA纯合免疫细胞对于HLA-A、HLA-B和HLA-C是纯合的。
86.权利要求76的文库，其中HLA纯合免疫细胞是淋巴样细胞。
87.权利要求86的文库，其中淋巴样细胞是T细胞、B细胞和/或NK细胞。
88.权利要求76的文库，其中HLA纯合免疫细胞是骨髓样细胞。
89.权利要求88的文库，其中骨髓样细胞是树突细胞。
90.权利要求76的文库，其中每个文库成员与潜在受体是HLA匹配的。
91.权利要求76的文库，其中文库包含冷冻保存的HLA纯合免疫细胞。
92.权利要求76的文库，其中文库包括至少15个文库成员，其中成员包含不同的HLA单倍型。
93.权利要求92所述的文库，其中文库包括至少30个文库成员。
94.权利要求92所述的文库，其中文库包括至少50个文库成员。
95.产生根据权利要求76-94中任一项的HLA纯合免疫细胞文库的方法，包括：
(a)对从人类超级供体获得的多个血液样品进行HLA分型；
(b)将来自多个血液样品的细胞重新编程为iPSC；
(c)将iPSC分化为HPC；和
(d)在促进免疫细胞分化的条件下培养HPC，从而产生HLA纯合免疫细胞文库。
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