CN117957313A - 从多能干细胞生产免疫细胞群的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生产免疫细胞群的方法、通过本发明的方法可获得或获得的免疫细胞群、通过本发明的方法可获得或获得的非免疫原性T细胞、包含本发明的免疫细胞或非免疫原性T细胞的药物组合物，以及涉及所述免疫细胞群、非免疫原性T细胞或药物组合物用于治疗的方法中或用于细胞疗法中。

Description

从多能干细胞生产免疫细胞群的方法
技术领域
本发明涉及一种生产免疫细胞群的方法、通过本发明的方法可获得或获得的免疫细胞群、通过本发明的方法可获得或获得的非免疫原性T细胞、包含本发明的免疫细胞或非免疫原性T细胞的药物组合物，以及涉及所述免疫细胞群、非免疫原性T细胞或药物组合物用于治疗的方法中或用于细胞疗法中。
背景技术
开发用于诊断和治疗的免疫细胞群，特别是T细胞群是当前的任务。为了能够提供这样的免疫细胞群(比如分化的T细胞群)，干细胞是良好的来源。干细胞的关键特征是它们能够无限地自我更新并分化为多种不同类型的细胞或组织。干细胞的自我更新能力对于它们作为原始未分化细胞库的特征是至关重要的。此外，干细胞的高“柔性”和“可塑性”特征建立在它们转分化为可能不同于它们来源的组织的能力上。多能干细胞(PSC)作为产生T细胞的来源而备受关注。特别地，诱导多能干细胞(iPS)是一种有用的来源，其代表可重编程为多能干细胞的非胚胎细胞。目前，最常用的多能细胞是胚胎干细胞(ESC)或诱导多能干细胞(iPSC)。人ESC系首先由Thomson及其同事建立(Thomson等，(1998),Science 282:1145-1147)。最近，人ESC研究使得开发一种将机体细胞重编程为ES样细胞的新技术成为可能。该技术由Yamanaka及其同事在2006年开创(Takahashi&Yamanaka(2006),Cell,126:663-676)。所得到的诱导多能干细胞(iPSC)显示出与ESC非常相似的行为，并且重要的是，它们还能够分化成身体的每种细胞。此外，据报道，孤雌生殖干细胞也适合于小鼠模型中的EHM生产(Didié等，(2013),J Clin Invest.,123:1285-1298)。例如，Wang等，NatureBiomedical Engineering,Vol.5,May 2021,429-440描述了从遗传工程化的异源人诱导多能干细胞产生低免疫原性T细胞。单独工程化的T细胞是用于需要定向免疫应答的疾病(如癌症)的靶向治疗的有力工具。已经显示可以将T细胞体外培养和增殖，以用于过继性细胞免疫疗法或癌症疗法中，其中已经证实这种T细胞在肿瘤患者中具有抗肿瘤活性。
用于生产源自PSC的T细胞的方法是本领域已知的，参见Wang等，2021，见上文。此外，Montel-Hagen等(Montel-Hagen等，2019,Cell Stem Cell24,376–389,2019年3月7日)公开了一种从多能干细胞生产T细胞的方法。根据该公开，通过在气液界面环境中培养细胞聚集体来实现免疫细胞分化。因此，Montel-Hagen描述的方法包括从PSC产生T细胞的复杂且耗时的细胞培养技术。此外，Iriguchi等(Iriguchi等，2021,Nature Communications,12:430Jan 18；12(1):430.doi:10.1038/s41467-020-20658-3)等公开了一种从iPSC生产T细胞的方法。Iriguchi等描述了一种方法，该方法预测了在添加其它因子的涂覆DLL4的平板上的T细胞分化。这种方法需要一定的细胞培养能力，这使得该方法难以产生更高数量的分化T细胞。这些方法的缺点是这些方法相当费力并且不适合以经济高效的方式生产免疫细胞。此外，这些现有技术方法仅允许生产T细胞。
因此，需要提供一种方法，该方法允许产生免疫细胞群，比如T细胞样细胞，但理想地还包含NK细胞样细胞。该方法还应该适于以大规模方法(例如在生物反应器中)进行，从而以有效的方式实现期望免疫细胞的更大收率。
因此，本发明的目的是提供这种满足所述需求的用于生产免疫细胞群的方法。上述目的通过独立权利要求的主题，特别是通过用于生产免疫细胞群的方法、通过所述方法可获得或获得的免疫细胞群、通过所述方法可获得或获得的T细胞、药物组合物以及用于治疗方法中的免疫细胞群来解决。提供如本文所述的免疫细胞群具有额外的优点，即可以根据所需应用选择性生产免疫细胞群的不同亚群，特别是T细胞样细胞和/或NK细胞样细胞。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种从多能干细胞(PSC)生产免疫细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：(i)通过以下步骤诱导3D细胞聚集体形成和造血分化(a)在无血清培养基中，在适于形成3D细胞聚集体的固体支持物上，在Notch-配体Delta-样配体4(DLL4)信号传导活性的存在下，在合适的条件下培养已经经历间充质分化的PSC，从而允许形成3D细胞聚集体；(b)收集所述3D细胞聚集体并在无血清培养基中以悬浮培养在合适的条件下培养约3至6天；以及(c)在无血清培养基中在合适的条件下将所述3D细胞聚集体培养约另外的4至7天；(ii)通过在无血清培养基中、以悬浮培养在合适的条件下培养(i)的所述3D细胞聚集体达合适的时间来诱导免疫细胞分化；从而提供免疫细胞群。
本发明的第二方面涉及一种通过本发明的方法可获得的免疫细胞群。
本发明的第三方面涉及一种通过本发明的方法获得的免疫细胞群。
本发明的第四方面涉及一种通过本发明的方法可获得的非免疫原性T细胞。
本发明的第五方面涉及一种通过本发明的方法获得的非免疫原性T细胞。
本发明的第六方面涉及一种通过本发明的方法可获得的非免疫原性T细胞，其中所述T细胞缺乏在T细胞的细胞表面上呈递(present)的内源性MHC I类分子，并且所述T细胞在其表面上包含免疫调节蛋白。
本发明的第七方面涉及一种药物组合物，其包含本发明的免疫细胞群或本发明的非免疫原性T细胞。
本发明的第八方面涉及本发明的免疫细胞群、本发明的非免疫原性T细胞或本发明的药物组合物，其用于治疗方法中。
最后，本发明的第九方面涉及本发明的免疫细胞群、本发明的非免疫原性T细胞或本发明的药物组合物，其用于细胞疗法中。
附图说明
图1示出了本发明方法的说明性实施方案的时间线的示意性概览。
图2示出了在通过本文所述的方法分化为免疫细胞群之前，接种到AggreWellTM8006-孔板中的细胞在第0天(图2A)和第3天(图2B)的显微图像。
图3示出了通过本发明的方法生产的包含T细胞样细胞和NK细胞样细胞的免疫细胞群的流式细胞术分析。根据侧向和前向散射，在单个活的淋巴细胞样细胞群上预门控祖细胞。为了从饲养细胞(feeders)分离祖细胞，根据CD29/CD45特征门控细胞。将所有CD29-CD45+细胞表征为CD3+CD56-(T细胞谱系标志物)、CD3-CD56+CD8+/-(NK细胞谱系标志物)和CD19+(B细胞谱系标志物)的表型。此外，进一步表征了CD3+CD56-T细胞样细胞的CD4和CD8标志物的表达。这些细胞表现出与CD4-CD8-、CD4+CD8+、CD4-CD8+和CD4+CD8-的经典胸腺细胞分布相似的表达模式。
图4示出了在用抗-人CD3抗体刺激后本文获得的免疫细胞群的细胞的流式细胞术分析。根据侧向和前向散射，在单个活的淋巴细胞样细胞群上预门控祖细胞。为了从饲养细胞分离祖细胞，根据CD29/CD45特征门控细胞。将所有CD29-CD45+细胞表征为CD3+CD56-(T细胞谱系标志物)或CD3-CD56+(NK细胞谱系标志物)的表型。
图5示出了两幅示意图。上方的示意图示出了已经经历了本发明的(分化)方法并在扩增的第0天(扩增开始)和第13天进一步扩增的绝对CD45+CD56+NK样细胞的细胞计数。下方的示意图示出了CD45+CD56+NK样细胞从第0天至第13天扩增了19倍。
图6示出了分化的免疫细胞的乳酸脱氢酶(LDH)活性分析的结果。图6上方的示意图代表本发明的K562靶细胞和分化的免疫细胞的一式三份培养物的平均值+/-SD。在图6的下方，示出了该LDH分析中使用的对照组和本发明的K562细胞和分化的免疫细胞的共培养组的显微分析。
具体实施方式
本发明的第一方面涉及一种从多能干细胞(PSC)生产免疫细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：(i)通过以下步骤诱导3D细胞聚集体形成和造血分化(a)在无血清培养基中，在适于形成3D细胞聚集体的固体支持物上，在Notch-配体Delta-样配体4(DLL4)信号传导活性的存在下，在合适的条件下培养已经经历间充质分化的PSC，从而允许形成3D细胞聚集体；(b)收集所述3D细胞聚集体并在无血清培养基中以悬浮培养在合适的条件下培养约3至6天；以及(c)在无血清培养基中在合适的条件下将所述3D细胞聚集体培养约另外的4至7天；(ii)通过在无血清培养基中、以悬浮培养在合适的条件下培养(i)的所述3D细胞聚集体达合适的时间来诱导免疫细胞分化；从而提供免疫细胞群。在本上下文中，注意到在本发明中已经令人惊奇地发现，这种方法不仅提供了如Montel-Hagen等，2019，同上文或Iriguchi等，2021，同上文所述的T细胞，而且允许简单地根据所得免疫细胞的预期用途生产免疫细胞群的不同亚群，特别是T细胞样细胞和/或NK细胞样细胞。
如本文所用，当用于时间间隔或时间段时，术语“约”必须理解为也包括偏离给定间隔的不同值的任何间隔。例如，约3至6天(意指72至144小时)的间隔也包括偏离给定间隔1、2、3、4、5或6小时的间隔，使得给定间隔在间隔开始和/或结束时可以短或长1、2、3、4、5或6小时。
本发明的一个优点是它允许使用所谓的无饲养层培养体系(feeder-freesystem)。这意味着诱导3D细胞聚集体和造血分化可以在不使用基质细胞/无需基质细胞帮助的情况下进行。因此，在优选的实施方案中，Notch-配体Delta-like配体4(DLL4)信号传导活性不是由细胞提供的，而是通过替代的手段/结构提供的。这种替代结构可以是，例如用DLL4涂覆的珠子，如下文更详细描述的。还可以使用可溶形式的DLL4来提供DLL4信号传导活性。鉴于本发明方法的后续步骤，这种无饲养层的方法提供了这样的优点，即当进行本发明的方法时，可以避免可能的污染细胞，并且不无需将其剔除或分选出来。因此，本发明的无饲养层培养体系代表了一种同样有效的纯的系统，其不需要额外的纯化步骤。
在本发明的另一优选实施方案中，该方法包括在步骤(i)之前进行另外的步骤(0i)，包括：(0i)通过以下步骤诱导中胚层分化：(a)在合适的条件下将PSC接种在无血清培养基中；和(b)在无血清培养基中在合适的条件下将所述PSC培养约2至约4天，和(c)用无血清培养基重悬细胞。优选地，本发明的方法在中胚层分化之前不需要任何额外的物质或处理。
在本发明方法的一个实施方案中，无血清培养基可优选包含：在步骤(0i)中，(a)激活素A、骨形态发生蛋白4(BMP4)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和凋亡抑制剂，优选为ROCK抑制剂，其各自的浓度为约10至50ng/mL；(b)BMP4、VEGF和FGF，其各自的浓度为约5至15ng/mL；(c)凋亡抑制剂，优选为ROCK抑制剂；在步骤(i)中，(a)ALK受体抑制剂和ROCK抑制剂，其各自的浓度为约5至15μM，(b)约5至约15ng/mL的ALK受体抑制剂，(c)约5至约15ng/mL的ALK受体抑制剂、约40至约60ng/mL干细胞因子(SCF)、约5至约15ng/mL FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt-3l)和约5至约15ng/mL血小板生成素(TPO)；在步骤(ii)中，约1％至约3％ B27补充剂、约5至约15ng/mL SCF、约5至约15ng/mL Flt-3l、约5至约15ng/mL IL-7和约15至约45mM L-抗坏血酸2-磷酸盐倍半镁盐水合物。
如本文所用，与任何浓度值或浓度范围相关的术语“约”必须理解为也包括偏离给定浓度或浓度范围的不同值的任何浓度或浓度范围。例如，约50ng/mL的浓度还包括40、41、42、43、44、45、46、47、48或49ng/mL的较低浓度，或51、52、53、54、55、56、57、58或59ng/mL的较高浓度。
在本发明的优选实施方案中，ROCK抑制剂可以是Y-27632二盐酸盐，ALK受体抑制剂可以是SB43152。ROCK抑制剂的使用提供了这样的优势，其中细胞凋亡和去分化得到限制/避免。因此，ROCK抑制剂和ALK受体抑制剂的使用避免了由于细胞凋亡而造成的细胞损失，这意味着本发明的方法提供了不同量的细胞。此外，由于细胞保持了所需的分化特性，所以减少了分化的损失。这意味着使用本发明的方法提供了不同质量的细胞。
优选地，步骤(i)和(ii)中的悬浮培养是动态悬浮培养，其意指例如通过在振荡装置上培养而被搅动的悬浮培养。可以使用任何合适的振荡装置/振荡器，例如轨道振荡器、水平振荡器或线性振荡器。可以在任何合适的条件下移动/搅动培养物，所述合适的条件可以由技术人员通过实验确定。例如，诸如轨道振荡器的振荡器可以以约60至约80转/分钟(rpm)的速率运转。与贴壁细胞培养不同，本文所用的悬浮细胞培养提供了一些优点。贴壁细胞培养需要更多的空间，并且需要更复杂的操作，例如细胞传代。悬浮培养是这样一种细胞培养形式，其允许提供可规模化的细胞培养方法，这对于提供较高的细胞数量是有用的。这种较高的细胞数量是细胞产品临床应用所特别需要的。与贴壁细胞培养，比如2D细胞培养或静态细胞培养相比，动态悬浮培养也可以更容易地转移到生物反应器条件，因为动态细胞培养的特征已经非常类似于生物反应器中培养的特征。此外，培养基中存在的生长因子能够在动态细胞培养中循环。这使得每个细胞都可以与这些生长因子紧密接触。这可以正面影响培养过程，特别是细胞的分化过程，并且可以帮助实现更同质和更明确的细胞群。
免疫细胞分化的诱导可以在任何合适的时间内进行。可以例如，通过在一定时间段内采集细胞样品并确定细胞的性质/分化状态，例如，通过分析细胞表面标志物(参见实验部分，其中首先针对CD29/CD45标志物筛选细胞，并且将所有CD29-CD45+细胞表征为CD3+CD56-(T细胞谱系标志物)或CD3-CD56+CD8+/-(NK细胞谱系)和CD19+(B细胞谱系)的表型，从而实验地确定合适的时间。由此可以根据希望获得哪种细胞类型(例如NK细胞样免疫细胞或T细胞样免疫细胞)作为本发明方法的产物来确定用于分化的合适时间。在本发明的优选实施方案中，通过以悬浮培养在合适的条件下培养(i)的3D细胞聚集体来诱导免疫细胞分化的步骤(ii)在无血清培养基中进行约21至约50天。
本文所用的术语“多能干细胞”(PSC)是指能够分化成免疫细胞群的任何此类干细胞类型。在本发明的上下文中，优选不使用涉及改变人生殖系遗传同一性或涉及将人胚胎用于工业或商业目的方法来生产这些多能干细胞。优选地，多能干细胞是灵长类动物来源的，更优选地是人来源的。在本发明的进一步优选的实施方案中，PSC是人诱导多能干(iPS)细胞，优选地为人iPS细胞系TC-1133。细胞系TC-1133已在c-GMP条件下重编程，并可购自Lonza。其它合适的PSC，包括诱导的PSC，可例如获自NIH人胚胎干细胞登记库、欧洲诱导的多能干细胞库(EBiSC)、德国心血管研究中心(DZHK)的干细胞库或ATCC，仅列举几个来源。多能干细胞也可用于商业用途，例如，由美国国家神经疾病和中风研究所(NINDS)运营的NINDS人序列和细胞库(https://stemcells.nindsgenetics.org)将人类细胞资源广泛地分发给学术和行业研究人员。可以在基质胶涂覆的容器上，例如基质胶涂覆的T-烧瓶中培养人iPS细胞。优选在iPS扩增培养基，例如Miltenyi Stem MACS iPS-Brew XF中培养iPS细胞。可用于本发明的其它示例性iPSC细胞系包括、但不限于，GibcoTM的Episomal iPSC细胞系(序号A18945,Thermo Fisher Scientific)，或获自ATTC的iPSC细胞系ATCC ACS-1004、ATCC ACS-1021、ATCC ACS-1025、ATCC ACS-1027或ATCC ACS-1030。或者，重编程领域的任何技术人员可通过已知方案容易地产生合适的iPSC细胞系，所述已知方案比如由Okita等，“A more efficient method to generate integration-free human iPS cells”NatureMethods,Vol.8 No.5,May 2011,pages 409-411或Lu等“A defined xeno-free andfeeder-free culture system for the derivation,expansion and directdifferentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stemcells”,Biomaterials 35(2014)2816e2826描述的方案。本发明中使用的(诱导)多能干细胞可以源自任何合适的细胞类型(例如，源自诸如间充质干细胞或上皮干细胞的干细胞，或诸如成纤维细胞的分化细胞)和源自任何合适的来源(体液或组织)。此类来源(体液或组织)的实例包括脐带血、皮肤、齿龈、尿、血、骨髓、脐带的任何区室(例如，脐带羊膜或华顿氏胶)、脐带-胎盘连接处、胎盘或脂肪组织，仅举几个例子。在一个说明性实例中，例如通过使用特异性针对CD34的抗体的磁性细胞分选自脐带血中CD34-阳性细胞的分离以及随后的如Chou等，(2011),Cell Research,21:518-529.Baghbaderani et al.(2015),Stem CellReports,5(4):647-659所述的重编程表明iPSC的产生过程可以符合良好生产规范的规定，以产生细胞系ND50039。因此，优选地，多能干细胞满足良好生产规范的要求。
本发明中使用的PSC可以是多能干细胞，其缺乏在该多能干细胞的细胞表面上呈递的内源性MHC I类分子，并且在其表面上包含免疫调节蛋白。
“缺乏在细胞表面上呈递的内源性MHC I类分子”的细胞或多能干细胞在其表面，即细胞或多能干细胞的表面上不存在功能性MHC I类分子。这种缺陷细胞/多能细胞在其细胞膜中也不包含功能性MHC I类分子。在本上下文中，术语“内源性”涉及任何MHC类蛋白I，其天然地包含在细胞或多能干细胞中，而不是人工引入的。由于细胞表面缺乏MHC I类分子可被免疫系统解译为“丧失自我(missing self)”信号，由此具有内源性MHC I类分子增加了受体免疫系统排斥反应的风险。因此，细胞或多能干细胞在其表面缺乏MHC I类分子的特征不应用于任何被引入至多能干细胞中的免疫调节蛋白和/或重组免疫调节蛋白。在一个实施方案中，细胞表面上MHC I类分子的缺乏可通过破坏多能干细胞中β2-微球蛋白基因的所有拷贝来实现。MHC复合物是α-微球蛋白和β2-微球蛋白的异二聚体。因此，如果β2-微球蛋白缺失，则不能装配功能性MHC I类复合物，并因此在细胞膜和/或细胞表面上不存在MHCI类分子。本领域技术人员已知许多可能的方式来修饰多能干细胞的基因组，使得它们缺乏MHC I类分子并包含免疫调节蛋白。应当注意，本发明的缺乏MHC I类分子的多能干细胞可以表达免疫调节蛋白，即使该免疫调节蛋白是诸如本文所述的HLA-E的MHC I类分子。因此，术语“MHC I类分子的缺失”涉及内源性MHC I类分子，并且不排除(重组)免疫调节蛋白的存在。
在本发明的另一优选实施方案中，免疫调节蛋白是单链融合HLA I类蛋白。
优选地，单链融合HLA I类蛋白可包含与至少部分HLA I类α链共价连接的至少部分B2M，所述HLA I类α链选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G。
在本发明的一个优选实施方案中，多能干细胞进一步表达由所述多能干细胞表面上的单链融合HLA I类蛋白呈递的靶肽抗原。
优选地，靶肽抗原共价连接到单链融合HLA I类蛋白。
在优选的实施方案中，靶肽抗原包含序列VMAPRTLFL(SEQ ID NO:1)。
优选地，在多能干细胞中β-微球蛋白2基因的基本上所有拷贝都被破坏。在本发明的多能干细胞中，B2M基因可被破坏，使得被破坏的基因座不能产生功能性内源B2M蛋白。在一些实施方案中，包括、但不限于截短、缺失、点突变和插入的破坏导致非功能性B2M蛋白的表达。在其它实施方案中，破坏导致B2M基因无蛋白表达。
在优选的实施方案中，多能干细胞选自胚胎干细胞、诱导的多能干细胞和孤雌生殖干细胞。
优选地，多能干细胞是灵长类动物来源的多能干细胞，优选为人多能干细胞。
在优选的实施方案中，产生多能干细胞的CD34-阳性细胞分离自脐带血。
优选地，本发明中使用的多能干细胞是NINDS人细胞和数据库的ND-50039。
在优选的实施方案中，PSC多能干细胞缺乏内源性MHC II类。
优选地，通过破坏C2TA基因-MHC II类反式激活蛋白而使PSC缺乏内源性MHC II类。
在本发明方法的优选实施方案中，在步骤(i)中，通过将PSC与表达DLL4的基质细胞共培养，或通过将PSC与涂覆DLL4的珠子一起温育来提供Notch-配体Delta样配体4(DLL4)信号传导活性。
将PSC与涂覆DLL4的珠子一起温育提供了这样的优点，即在不需要任何另外的细胞(如基质细胞)的情况下提供了DLL4信号转导活性。因此，本发明的方法可以提供无饲养层培养体系。由此避免了任何从本发明方法提供的免疫细胞群中分选或选择表达DLL4的细胞的步骤。如果需要，可以通过本领域技术人员已知的标准方法，例如磁性分离方法或流式细胞术方法分离涂覆DLL4的珠子。本领域技术人员已知适用于DLL4涂覆的不同种类的珠子，例如微珠或具有较大直径的珠子，例如dynabeads(Thermo Fisher Scientific)。
当使用基质细胞时，PSC与基质细胞的比率可在约1:5至约1:40的范围内。这样的范围是有利的，因为与现有技术的方法(例如Montel-Hagen等，2019，见上文)相比，该范围允许使用较少数量的基质细胞。因此，在使用较少数量的基质细胞的情况下，这可能对基质细胞分泌的生长因子的组成和生长因子的浓度具有有益的影响。例如，较低数量的基质细胞将可产生降低量的生长因子，从而导致培养基中生长因子的浓度降低。据信，这种降低的生长因子浓度对多能干细胞的分化具有有利的影响。此外，基质细胞的数量越少，在之后的过程中去除这些基质细胞所需的努力就越少。
在本发明使用基质细胞的优选实施方案中，步骤(i)中使用的基质细胞是骨髓衍生的小鼠基质细胞系MS5。小鼠基质细胞是有利的，原因在于这些细胞能够支持免疫细胞分化。
在另一优选实施方案中，在步骤(i)中，基质细胞是由表达DLL4的PSC分化的基质细胞。此类基质细胞的使用提供了这样的优点，即本发明的方法不需要任何必须在随后的过程中被移除或挑选出的小鼠来源的细胞。因此，可以提供不包括任何非人细胞(如小鼠细胞)的免疫细胞群。
在优选的实施方案中，将在步骤(0i)中的中胚层分化诱导期间的PSC在包含至少一种细胞外基质蛋白的细胞培养基/容器中培养。优选地，将约0.5至约2.0x106个细胞接种在相应的细胞培养容器(如6孔板的孔)中。在该不同的范围内调节PSC的细胞数量可能影响培养基中的生长因子比率，并且也可能影响随后的分化。上述细胞数量的范围允许细胞有益地分化成所期望的免疫细胞群(参见实验部分)。
优选地，所述容器涂覆了至少一种细胞外基质蛋白。
在优选的实施方案中，所述至少一种细胞外基质蛋白选自玻连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、基质胶、含有氨基酸序列RGD的肽、含有氨基酸序列RGD的蛋白及它们的组合。由此为PSC和随后的分化过程提供了最佳的结构和生化环境。技术人员能够经验地选择相应的最佳细胞外基质蛋白或这些细胞外基质蛋白的最佳组合。因此，本发明的方法中也可以使用两种、三种、四种或更多种细胞外基质蛋白的组合。
优选地，在本发明方法的步骤(i)(a)中，固体支持物包含一个或多个孔，其中每个孔包含V形或锥形空腔。
在优选的实施方案中，固体支持物是微孔培养板。可以使用任何合适的微孔培养板，只要其允许产生所需的免疫细胞群即可。合适的微孔培养板的例子包括、但不限于AggreWellTM板(获自StemCell Technologies)、BIOFLOATTM 96-孔板(获自faCellitate)或Nunclon Sphera 3D培养(获自ThermoFisher)。此类细胞培养板是有利的，原因在于它们允许如本文所述的有益的动态悬浮细胞培养。例如，在使用AggreWellTM板的情况下，优选用抗黏附溶液预处理该板。这种抗黏附溶液允许降低表面张力并防止细胞黏附。这提供了一种促进3D–细胞聚集体形成的低黏附表面。可以以允许规模扩大的非常容易且稳健的方式进行3D细胞聚集体的形成。与诸如在描述了不适合于规模扩大的复杂且耗时的细胞培养技术的Montel-Hagen等，2019(见上文)中所述的方法的现有技术方法相比，3D-细胞聚集体的形成是不同的。此外，使用Montel-Hagen等，2019(见上文)的方法获得的3D细胞聚集体似乎比本发明方法的3D细胞聚集体更大。这提供了本发明的另外的优点，即与较大的3D细胞聚集体相比，生长因子可以更容易地扩散到这种较小的3D细胞聚集体中。因此，生长因子可以更有效地到达3D细胞聚集体内部位置的细胞，从而导致3D细胞聚集体的所有细胞均有效且更同质的分化。在这方面参见本申请的实施例1。
在优选的实施方案中，在步骤(ii)之后分离3D细胞聚集体，从而提供单个细胞。
如上所述，已经令人惊讶地发现，在本发明的方法中，免疫细胞群可以包含T细胞样细胞和NK细胞样细胞，免疫细胞群意指一种不同细胞类型的混合物。
因此，如本文所用的术语“免疫细胞群”包括一种包含在该免疫细胞群中的不同免疫细胞的混合物。因此，不应将“免疫细胞群”理解为单一同质免疫细胞群，比如纯的或同质的T细胞群(其中可通过表达或缺乏表达特异性标志物蛋白的细胞的百分比评估同质性)。术语“免疫细胞群”意指不同的免疫细胞或不同类型的免疫细胞，本领域技术人员可以用本领域已知的方法(例如流式细胞术方法)将它们彼此区分并随后将它们彼此分离。因此，以特异性标志物蛋白的表达(模式)为特征的特定且同质细胞群的分离以及随后的扩增确实是本发明的一部分(参见本申请的实施例4，其中分化后扩增了CD45+CD56+NK细胞样细胞)。术语“免疫细胞群”是指任何类型的免疫细胞可以包含在通过本方法获得的细胞群中。免疫细胞包含中性粒细胞、嗜酸性粒细胞(嗜酸细胞)、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞，以及淋巴细胞中的B细胞、T细胞和自然杀伤(NK)细胞。此外，根据本发明的免疫细胞群可被视为这样一种免疫细胞群，其具有任何(想要的)分化水平或任何中间分化水平免疫细胞。免疫细胞群还可包含代表T细胞的前体细胞的细胞，或者T细胞样细胞，或者NK细胞的前体细胞，或者NK细胞样细胞以及代表成熟T细胞的细胞，或者T细胞样细胞，或者成熟NK细胞或者NK细胞样细胞。特别地，根据本发明的免疫细胞群包括具有T细胞样细胞和NK细胞样细胞表型的免疫细胞。
提供免疫细胞群的优点是可以在所得T细胞样细胞和NK细胞样细胞之间进行选择。因此，与只能提供T细胞或T细胞样细胞的现有技术的方法不同，本发明的方法能够提供T细胞样细胞以及NK细胞样细胞。因此，根据所需的应用，可以在T细胞样细胞或NK细胞样细胞之间进行选择。可以，特别是在流式细胞分析中显示了这些T细胞样细胞和NK细胞样细胞的收率(参见实施例2和图3)。细胞计数分析显示，本发明方法提供的免疫细胞群包含特征在于表达不同的标志物的不同的亚群，如T细胞样细胞和NK细胞样细胞。T细胞样细胞和NK细胞样细胞的特征将在下文详细讨论。
在本发明的优选实施方案中，在步骤(ii)之后，进行另外的步骤(iii)。该步骤(iii)包括诱导，选择性扩增和活化T细胞样细胞和NK细胞样细胞。
优选地，在本发明方法的一个实施方案中，在步骤(iii)中在合适的条件下诱导、选择性扩增和活化T细胞样细胞，这种用于T细胞样细胞的合适条件是用诸如抗体OKT3抗体的CD3活化抗体和/或用白细胞介素2(IL-2)扩增细胞。抗体OKT3和IL-2活化细胞，在细胞活化后，可通过在细胞培养物中增殖这些细胞而将其扩增。可以通过例如测定细胞内或分泌的IFN-g、TNF-a和/或IL-2中的任何一种或多种的水平来监测细胞的扩增。
在本发明的一个优选实施方案中，在步骤(iii)中，在包含B27补充剂、SCF、Flt-3l、IL-7、IL-2、IL-15和CD3刺激性结合分子的培养基中诱导、选择性扩增并活化T细胞样细胞。
在该实施方案中，步骤(iii)中的培养基可包含约1至约3％的B27补充剂、约5至约15ng/mL SCF、约2至约7ng/mL Flt-l3、约5至约15ng/mL IL-7、约5至约15ng/mL IL-2、约5至约15ng/mL IL-15。CD3刺激性结合分子选自抗-CD3抗体，比如OKT-3抗体，优选地浓度为约250至约750ng/mL，或携带抗体OKT-3的抗原片段(例如抗体OKT-3的Fab片段)的多聚化试剂。可以将这种多聚化试剂定义为一种多聚化试剂，其中该多聚化试剂具有可逆固定(结合)于其上的第一试剂，该第一试剂为细胞提供初级活化信号；其中该多聚化试剂包含至少一个用于所述第一试剂的可逆结合的结合位点Z1，其中所述第一试剂包含至少一个结合配偶体C1，其中所述结合配偶体C1能够可逆地结合至所述多聚化试剂的结合位点Z1，其中所述第一试剂通过在所述结合配偶体C1和所述结合位点Z1之间形成的可逆键与所述多聚化试剂结合，并且其中所述第一试剂结合至所述细胞表面上的受体分子，从而为所述细胞提供初级活化信号并由此活化所述细胞。国际专利申请WO2015/158868中详细描述了一般以及同样负载了CD3结合刺激抗体(如抗体OKT-3)的Fab片段的此类多聚化试剂。这种多聚化试剂也称为“Expamer”。在本发明的一个说明性实施方案中，步骤(iii)进行约2至约5天，优选进行约3至约4天。
在优选的实施方案中，在步骤(iii)之后进行另外的步骤(iv)，所述另外的步骤(iv)包括通过在合适的条件下培养所述免疫细胞来进一步扩增。在一个说明性实例中，该扩增可在包含B27补充剂和IL-2的无血清培养基中进行。
优选地，步骤(iv)的无血清培养基包含约1％至约3％的B27补充剂和约30至约70单位/mL的IL-2。在本发明的优选实施方案中，步骤(iv)进行约2至10天，优选进行约7天。优选地，步骤(iii)和步骤(iv)不需要在涂覆DLL4的板上进行任何温育，参见本申请的实施例2和3。
在本发明方法的优选实施方案中，由表面蛋白CD4、CD8、CD56、CD3和CD45的表达来表征免疫细胞群。这种表征允许将免疫细胞群分为T细胞样细胞和NK细胞样细胞的不同亚群。例如，可以进行免疫细胞群的流式细胞术分析以进行这样的表征。本领域技术人员能够使用标志物CD4、CD8、CD56、CD3和CD45来定义T细胞样细胞和NK细胞样细胞的不同亚群。因此，优选地，通过CD45、CD3，CD4或CD8的表达以及CD56表达的缺失来表征本发明方法可获得的T细胞样细胞，从而优选地，该T细胞样细胞为CD45+、CD3+、CD56-和CD4+；或CD45+、CD3+、CD56-和CD8+。优选地，通过CD45和CD56的表达以及CD3表达的缺失来表征本发明的方法可获得的NK细胞样细胞，从而优选地，该NK细胞样细胞为CD45+、CD56+和CD3-。可以使用允许这种区分的其它合适的标志物和/或方法，并且本领域技术人员可以容易地进行这类基于标志物表达谱的细胞选择。
本发明的方法适于通过在步骤(ii)、(iii)和/或(iv)中的任一个或全部步骤中使用生物反应器条件来生产具有高细胞数的免疫细胞群。生物反应器的使用提供了这样的优点，即由于使用大规模生物反应器形式，可以实现更高的细胞产量。生物反应器的使用允许优化不同因子的浓度，同时产生更高的细胞数量。因此，由于生物反应器的使用，通过本发明的方法提供的免疫细胞群的细胞数量可以按比例增加。因此，这样做允许提供临床应用所需的免疫细胞群的细胞数目。此外，这样做允许提供高度标准化和经济高效的方法。此外，生物反应器的使用简化了程序，原因在于生物反应器的使用提供了可以容易地实施的省力方法。
本发明的第二方面涉及一种通过本发明的方法可获得的免疫细胞群。
本发明的第三方面涉及一种通过本发明的方法获得的免疫细胞群。
本发明的第四方面涉及一种通过本发明的方法可获得的非免疫原性T细胞。
本发明的第五方面涉及一种通过本发明的方法获得的非免疫原性T细胞。
本发明的第六方面涉及一种通过本发明的方法可获得的非免疫原性T细胞，其中所述T细胞缺乏在T细胞的细胞表面上呈递的内源性MHC I类分子，并且所述T细胞在其表面上包含免疫调节蛋白。
优选地，非免疫原性T细胞在其表面上表达嵌合抗原受体(CAR)或外源性T细胞受体(TCR)。CAR蛋白可以包含对特定肿瘤相关抗原具有结合能力的抗体单链可变片段(scFv)，其通过跨膜肽与胞内共刺激结构域(比如CD28、OX40和CD137)连接。这些肽随后与激活CAR T细胞的TCRζ链的信号结构域融合，如果它与肿瘤细胞上的表位结合的话。随后粒酶和穿孔素的释放导致肿瘤细胞裂解(June CH,O'Connor RS,Kawalekar OU,Ghassemi S,Milone MC.CAR T cell immunotherapy for human cancer.Science(New York,N.Y.)2018；359:1361–65)。这些合成的受体分子允许与通过TCR复合物的常见反应不同的MHC非依赖性T细胞活化(Gideon Gross,Tova Waks和Zelig Eshhar.Expression ofimmunoglobulin-T-cell receptor chimeric molecules as functional receptorswith antibody-type specificity.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989:10024–28；KuwanaYea.Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived Vregions and T-cell receptor-derived C regions.Biochemical and biophysicalresearch communications 1987:960–68)。这代表了肿瘤细胞识别中的重要益处，因为MHC相关抗原呈递的丧失是恶性细胞的主要免疫逃避策略(Garrido F,Aptsiauri N,Doorduijn EM,Garcia Lora AM,van Hall T.The urgent need to recover MHC class Iin cancers for effective immunotherapy.Current opinion in immunology 2016；39:44–51)。
在本发明的另一优选实施方案中，T细胞中β-微球蛋白2基因的基本上所有拷贝都被破坏，从而使T细胞在细胞表面上缺乏内源性MHC I类分子。在本发明的T细胞中，可破坏B2M基因，以便从破坏的基因座不产生功能性内源B2M蛋白。在一些实施方案中，包括、但不限于截短、缺失、点突变和插入的破坏导致非功能性B2M蛋白的表达。在其它实施方案中，破坏导致B2M基因无蛋白表达。
优选地，免疫调节蛋白是单链融合HLA I类蛋白。
在另一优选实施方案中，单链融合HLA I类蛋白包含与至少部分HLA I类α链共价连接的至少部分B2M，所述HLA I类α链选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G。
优选地，单链融合HLA I类蛋白包含至少部分B2M和至少部分HLA-A。
在进一步优选的实施方案中，单链融合HLA I类蛋白包含至少部分B2M和至少部分HLA-A0201。
优选地，单链融合HLA I类蛋白包含至少部分B2M和至少部分HLA-E。
在优选的实施方案中，单链融合HLA I类蛋白包含至少部分B2M和至少部分HLA-G。
优选地，单链融合HLA I类蛋白包含至少部分B2M和至少部分HLA-B。
在优选实施方案中，单链融合HLA I类蛋白包含至少部分B2M和至少部分HLA-C。
优选地，单链融合HLA I类蛋白包含至少部分B2M和至少部分HLA-F。
在一优选实施方案中，非免疫原T细胞进一步表达由多能干细胞表面上的单链融合HLA I类蛋白呈递的靶肽抗原。
优选地，靶肽抗原共价连接到单链融合HLA I类蛋白。
在优选的实施方案中，靶肽抗原包含序列VMAPRTLFL(SEQ ID NO:1)。
优选地，将免疫调节蛋白的基因整合到T细胞基因组的(内源)B2M基因座中。
在优选的实施方案中，将CAR或外源性TCR整合到内源TCR-α基因中，整合到内源TCR-β基因中，或整合到内源TCR-α基因和内源TCR-β基因两者中。
优选地，CAR或外源性TCR结合靶细胞表面上呈递的抗原。
在优选的实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原、病毒抗原或细菌抗原，优选为肿瘤相关抗原。
优选地，抗原是CD19或CMV衍生抗原。
在一个优选的实施方案中，T细胞是灵长类动物来源的T细胞，优选为人T细胞。
本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明方法的免疫细胞群或本发明方法的非免疫原性T细胞。
本发明的另一方面涉及本发明的免疫细胞群、本发明的非免疫原性T细胞或本发明的药物组合物，其用于治疗方法中。
本文所用的术语“治疗/处理(“treat”、“treating”或“treatment”)”是指减轻(减缓(减轻))、稳定或抑制或至少部分缓解或消除与相应疾病相关的症状的进展。因此，其包括将所述免疫系统的细胞，优选以药物或药物组合物的形式，施用于本文其它地方定义的受试者。需要治疗的那些受试者包括已经患有疾病(本文指癌症)的那些受试者。优选地，治疗减轻(减缓(减轻))、稳定、或抑制或至少部分缓解或消除与疾病或病理状况的存在和/或进展相关的症状的进展。因此，“治疗/处理”是指治疗性治疗。特别地，在本发明的上下文中，治疗或处理是指与如本文其它地方定义的癌症相关的症状的改善。当在本文中使用时，术语“受试者”包括哺乳动物受试者。优选地，本发明的受试者是包括人的哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是小鼠。受试者还包括人的和兽医的患者。在受试者是可以接受本文所述疾病或病症治疗的活人时，其也称为“患者”。需要治疗的患者包括那些已经患有该疾病的患者。
本发明的另一方面涉及本发明的免疫细胞群(例如本发明的(非免疫原性)T细胞群或NK细胞群)，或本发明的药物组合物，其用于(基于)细胞的疗法中。该医学用途包括向有此需要的受试者施用本发明的免疫细胞群或源自本发明的免疫细胞群的细胞群。受试者通常是哺乳动物，比如人、猴、猫、啮齿动物(小鼠、大鼠)、狗或诸如马或牛的另外的动物。
通常，本发明涉及根据本发明的免疫细胞群或非免疫原性T细胞群或NK细胞群，其根据本发明应用，其中所述治疗或疗法是针对癌症。这意味着，免疫细胞群通常是针对癌症治疗或免疫治疗的受试者。可以将诸如本发明的T细胞或NK细胞的免疫细胞群用于过继性T细胞转移或类似的治疗方法。在诸如T细胞免疫疗法的不同免疫细胞疗法中，过继性细胞疗法在过去几年中已经引起了很大关注和兴趣。过继性细胞疗法是一种个性化疗法，其中将患者自身的免疫细胞移出，体外扩增至大量，并且再输注回患者体内以消除肿瘤。Guedan等,Rev Immunol.2019April 26；37:145–171.doi:10.1146/annurev-immunol-042718-041407给出了过继性细胞疗法进展的概述。
诸如(非免疫原性)T细胞群的免疫细胞群可用于治疗基本上所有癌症。可以用本发明获得的细胞群治疗的癌症的实例是肺癌、前列腺癌、卵巢癌、睾丸癌、脑癌、皮肤癌、黑素瘤、结肠癌、直肠癌、胃癌、食道癌、气管癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、包括淋巴瘤和多发性骨髓瘤的淋巴癌、白血病、骨或软组织肉瘤、宫颈癌或外阴癌。
除非另有说明，否则本文(包括说明书和权利要求书)中所使用的以下术语具有以下给出的定义。
本领域技术人员仅采用常规实验即能认识到或确定许多与本文描述的本发明具体实施方案等效的情况。本发明旨在涵盖此类等效情况。
必须注意的是，如本文中所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述(the)”包括复数所指物。因此，例如，提及“一种试剂”包括此类不同试剂的一种或多种，提及“该方法”包括提到本领域普通技术人员已知的能够修改或取代本文所述的方法的等效步骤和方法。
除非另有说明，否则一系列要素前的术语“至少”应理解为是指这一系列的每个要素。本领域技术人员仅采用常规实验即能认识到或确定许多与本文描述的本发明具体实施方案等效的情况。本发明旨在涵盖此类等效情况。
本文中任何地方使用的术语“和/或”包括“和”、“或”和“由所述术语连接的元素的全部或任何其它组合”的含义。
术语“约(about)”或“大约(approximately)”意指由本领域普通技术人员确定的特定值在可接受的误差范围之内，这将部分地取决于该值是怎样测定或确定的，即，受到测量系统的限制。例如，“约”可以意指根据本领域的实践在1个或大于1个标准差之内。或者，“约”可以表示给定值的至多20％，优选至多10％，更优选至多5％，甚至更优选至多1％的范围。或者本文所用的“约”意指在给定值或范围的20％，优选10％和更优选5％内。然而，该术语也包括具体的数值，例如，约20包括20。或者，特别是对于生物系统或过程，该术语可以指在某一值的一个数量级内，优选在5倍内，更优选在2倍内。在本申请和权利要求中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则应当假设术语“约”表示在特定值的可接受误差范围内。
在整个本说明书和随后的权利要求中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”以及诸如“包括”和“含有”的变型将被理解为意指包含所述的整体或步骤或者整体或步骤的组，但不排除任何其它整体或步骤或者整体或步骤的组。当在本文中使用时，术语“含有”可用术语“包含”或“包括”代替，或者当在本文中使用时有时用术语“具有”代替。
当在本文中使用时，“由......组成”排除权利要求元素中未指定的任何元素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由......组成”不排除不实质上影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。
在本文的每种情况下，术语“含有”、“基本上由...组成”和“由......组成”中的任何一个可以用另外两个术语中的任一个来代替。
应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案、材料、试剂和物质等，因为它们是可以改变的。本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书限定。
本说明书全文中引用的所有出版物和专利(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指导书等)均以其全文通过引用并入本文。本文中没有任何内容被解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于这种公开。在通过引用并入的材料与本说明书矛盾或不一致的程度上，本说明书将取代任何这样的材料。
实施例
以下实施例说明本发明。这些实施例不应被解释为限制本发明的范围。包括这些实施例是为了说明的目的，本发明仅由权利要求书限定。
实施例1：从多能干细胞(PSC)生产免疫细胞群。
在c-GMP条件下重编程的人诱导多能干(iPS)细胞系TC-1133购自Lonza。将人iPS细胞维持涂覆了基质胶的T烧瓶的iPS扩增培养基(Miltenyi StemMACS iPS-Brew XF)中。已证明小鼠基质细胞支持免疫细胞分化。为了用在分化方案中，发明人产生了表达Notch-配体Delta-样配体4(DLL4)的小鼠基质细胞系。骨髓衍生的小鼠基质细胞系(MS5)购自German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH。构建了携带CAG启动子、全长人DLL4和嘌呤霉素抗性基因以及位于左和右piggybac转座酶特异性序列臂之间的牛生长激素聚腺苷酸化信号序列的质粒。用Piggybac转座酶和携带DLL4的质粒转染细胞。在含有嘌呤霉素的培养基中选择合格的转染子并扩增。将MS5-DLL4细胞维持在由DMEM(Gibco 42430025)、10％ FBS、1％青霉素/链霉素、1x Glutamax(Gibco 35050061)和1mM丙酮酸钠(Gibco11360039)组成的培养基中。
中胚层诱导(分化第-18天至第-14天，在这方面还参见图1)。进行了以下步骤：
1、用5mL Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水(DPBS；Gibco 14190136)洗涤人iPS细胞。
2、加入3mL accutase(Gibco A 1110501)，将细胞在37℃的培养箱中温育4分钟。
3、通过轻敲烧瓶分离细胞，随后用5mL DPBS洗涤细胞。
4、将细胞转移到falcon，以300g离心4分钟。
5、弃去上清液，将细胞重悬于1mL StemPro34-SFM培养基(Gibco10639011)中并计数。
6、将1.0×106个细胞接种到涂覆基质胶的6孔板的每个孔的中胚层诱导培养基中，所述中胚层诱导培养基由补充了激活素A(10ng/mL)、BMP4(10ng/mL)、VEGF(10ng/mL)、FGF(10ng/mL)和ROCK抑制剂Y-27632二盐酸盐(10μM)的StemPro34-SFM培养基组成。
7、在第1天、第2天和第3天每天用补充了BMP4(10ng/mL)、VEGF(10ng/mL)、FGF(10ng/mL)的StemPro34-SFM培养基更换培养基。
8、在第4天，用DPBS洗涤细胞3次。
9、将1mL accutase添加到细胞上，并在37℃的培养箱中温育10分钟。
10、通过上下移液将细胞从平板上轻轻分离，并将其转移到falcon管中。
11、在300g下进行离心步骤达4分钟。
12、将细胞重悬于补充有Y-27632的StemPro34-SFM培养基中并计数。
3D-聚集体形成和造血诱导(分化第-14天至第0天，再次参见图1)。进行了以下步骤：
1、用2mL抗黏附冲洗液(Stemcell Technologies,07010)/孔预处理AggreWellTM800 6-孔板(Stemcell Technologies,34821)。
2、从孔中吸出抗黏附冲洗液。
3、用温热的DPBS冲洗每个孔，并在室温下保存直至使用。
4、通过胰蛋白酶消化(TrypL Express,Gibco 12604013)收获MS5-DLL4细胞，并将其重悬于StemPro34-SFM培养基(Lonza CC-4176)中并计数。
5、在5mL造血诱导培养基中，用0.5×106的在中胚层诱导阶段结束时获得的中胚层细胞重悬浮5.0×106MS5-DLL4细胞(每孔1:10的比例)，所述造血诱导培养基由补充了10μm SB431542和10μm Y-27632的StemPro34-SFM培养基组成。将细胞轻轻上下移液以实现均匀分布。
6、将DPBS从AggreWellTM800 6-孔板的孔中吸出。
7、将细胞接种到孔中，小心避免气泡形成。
8、将板以100g离心3分钟以捕获微孔中的细胞(见图2A)。
9、将平板在37℃、5％ CO2和95％湿度的培养箱中温育3天。
10、在第3天，可以在显微镜下观察到聚集体的形成(图2B)。
11、为了从板上收集3D-聚集体，轻轻敲击板，并使聚集体脱落。通过旋转，聚集体被收集在孔的中心。使用血清移液管从平板上收集聚集体并转移到falcon管中。
12、在所有聚集体均沉淀/下沉在falcon底部后，小心地弃去培养基而不扰动聚集体。
13、将聚集体重悬于2.5mL造血诱导培养基中并转移到超低附着悬浮培养板中，所述造血诱导培养基由添补充了10μm SB431542的StemPro34-SFM培养基组成。
14、将平板放置在轨道振荡器上，通过以80rpm旋转振荡器来维持聚集体处于动态悬浮培养中。
15、从分化第-13天到分化第-7天，每2-3天用补充有10μm SB431542的新鲜StemPro34-SFM培养基更换培养基。
16、从分化第-7天至分化第0天，通过每2-3天更新培养基来使聚集体维持在补充了10μm SB431542、50ng/mL SCF、5ng/ml Flt-3l和5ng/mL TPO的StemPro34-SFM培养基中。
免疫细胞分化(分化第0天至第50天)。进行了以下步骤：
从分化第0天至分化第50天，将聚集体以动态悬浮培养保持在免疫细胞分化培养基中，所述免疫细胞分化培养基由RPMI 1640(Gibco 618736)、2％B27(Gibco,17504044)、10ng/mL SCF,5ng/mL Flt-3l、5ng/mL IL-7、30mM L-抗坏血酸2-磷酸盐倍半镁盐水合物和1％青霉素/链霉素组成。
实施例2：分化细胞的活化和流式细胞术分析。进行了以下步骤：
1、在分化第50天，从培养板上收集聚集体，并用DPBS洗涤一次。
2、在37℃下，通过在由1mg/mL胶原蛋白酶类型、1mg/mL胶原蛋白酶/分散酶和5000单位/mL组成的解离溶液中达1小时以使聚集体解离成单个细胞。
3、将解离的细胞离心，重悬于由RPMI 1640(Gibco 618736)、2％ B27(Gibco,17504044)和50单位/mL IL-2组成的活化培养基中。
4、将细胞接种到细胞培养瓶中，并在37℃、5％ CO2和95％湿度的培养箱中培养一周。
5、一周后，从细胞培养瓶中收集细胞，并使其通过100μm无菌滤器。
6、通过离心使单个化的(singularized)细胞沉淀，用PBS洗涤一次，并重新悬浮于由PBS和0.5％人血清白蛋白组成的染色缓冲液中。
7、在4℃下，在Fc-阻断的存在下，用抗-小鼠抗-CD29和抗-人抗-CD45、抗-CD3、抗-CD4、抗-CD8、抗-CD19和抗-CD56将细胞染色20分钟。
8、将细胞用PBS洗涤，并重悬浮于含有活/死染料(PI)的染色缓冲液中。
9、在Cytoflex LX流式细胞仪上根据制造商的说明分析细胞。
该实验的结果示于图3，应用了以下门控策略。根据侧向和前向散射，在单个活的淋巴细胞样细胞群上预门控祖细胞(cell progenitors)。为了从饲养细胞分离祖细胞，根据CD29/CD45特征门控细胞。将所有CD29-CD45+细胞表征为CD3+CD56-(T细胞谱系标志物)、CD3-CD56+CD8+/-(NK细胞谱系)和CD19+(B细胞谱系)的表型。此外，进一步表征了CD3+CD56-T细胞样细胞的CD4和CD8标志物的表达。这些细胞表现出与CD4-CD8-、CD4+CD8+、CD4-CD8+和CD4+CD8-的经典胸腺细胞分布相似的表达模式。
实施例3：用抗-CD3抗体刺激使免疫细胞群的细胞更早成熟。
为了实现免疫细胞群的细胞的较早成熟，进行了以下步骤：
1、在分化第3周(免疫细胞分化阶段)，从培养板上收集聚集体，并将其用DPBS洗涤一次。
2、在由1mg/ml II型胶原蛋白酶组成的解离溶液中将聚集体解离成单个细胞。
3、将解离的细胞离心，并重悬浮于成熟培养基中，所述成熟培养基由RPMI 1640(Gibco 618736)、2％ B27(Gibco,17504044)、10ng/mL SCF、5ng/mL Flt-3l和10ng/mL IL-7、10ng/mL IL-2、10ng/mL IL-15和500ng/ml单克隆抗-人抗-CD3抗体(Biolegend 317347)组成。
4、将细胞接种到细胞培养瓶中，并在37℃下在具有5％ CO2和95％湿度的培养箱中培养一周。
5、一周后，从细胞培养瓶中收集细胞，并使其通过100μm无菌过滤器。
6、通过离心使单个化的(singularized)细胞沉淀，用PBS洗涤一次，并重新悬浮于由PBS和0.5％人血清白蛋白组成的染色缓冲液中。
7、在4℃下，在Fc-阻断的存在下，用抗-小鼠抗-CD29和抗-人抗-CD45、抗-CD3和抗-CD56将细胞染色20分钟。
8、将细胞用PBS洗涤，并重悬浮于含有活/死染料(PI)的染色缓冲液中。
9、在Cytoflex LX流式细胞仪上根据制造商的说明分析细胞。
结果示于图4。有以下门控策略。根据侧向和前向散射，在单个活的淋巴细胞样细胞群上预门控祖细胞。为了从饲养细胞分离祖细胞，根据CD29/CD45特征门控细胞。将所有CD29-CD45+细胞表征为CD3+CD56-(T细胞谱系标志物)或CD3-CD56+(NK细胞谱系)的表型。
实施例4：分化为NK样细胞。
进行了以下步骤：
1、在分化第50天，从培养板上收集聚集体并用DPBS洗涤一次。
2、在37℃下，通过在由1mg/mL胶原蛋白酶类型、1mg/mL胶原蛋白酶/分散酶和5000单位/mL组成的解离溶液中达1小时以使聚集体解离成单哥细胞。
3、分析解离的细胞并选择CD45+CD56+NK细胞样细胞。
4、将这些CD45+CD56+NK细胞样细胞离心，并重悬浮于由RPMI 1640(Gibco618736)、2％ B27(Gibco,17504044)和50单位/mL IL-2和IL-15组成的培养基中。
5、将细胞接种到细胞培养瓶中，并在37℃、5％ CO2和95％湿度的培养箱中培养13天。
结果示于图5。发现IL-2和IL-15细胞因子刺激13天后，CD45+CD56+NK细胞样细胞进一步扩增了19倍。
实施例5：分化的免疫细胞的细胞毒性活性的测量。
使用乳酸脱氢酶(LDH)活性分析在以下LDH分析中测量分化的免疫细胞的细胞毒性活性。乳酸脱氢酶(LDH)是一种氧化还原酶，其催化丙酮酸和乳酸的相互转化。细胞在组织损伤后释放LDH。由于LDH是相当稳定的酶，因此它可用于评价组织和细胞的损伤和毒性的存在。在如下所述的LDH分析中，将K562细胞(其为分析中的靶细胞)与本发明的分化免疫细胞共培养，其中靶效比为1:1、1:2、1:4和1:8。
进行了以下步骤：
1、在用含有IL-2的免疫细胞分化培养基进行LDH分析之前，将分化的免疫细胞培养三天，所述免疫细胞分化培养基包含以下物质：
Iscove's Modified Dulbecco's培养基(IMDM)(thermo fischer sci CatNo31980030)，
15％ BIT 9500血清替代品(stem cell tech Catalog#09500)，
1％青霉素链霉素，
L-抗坏血酸2-磷酸盐倍半镁盐水合物(30mM)(范围可以为15mM至50mM)，
SCF(10ng/mL)(范围可以为5ng/ml至50ng/mL)，
TPO(10ng/mL)(范围可以为5ng/ml至50ng/mL)，
Flt3l(10ng/mL)(范围可以为5ng/ml至50ng/mL)，
IL-7(10ng/mL)(范围可以为5ng/ml至50ng/mL)，
IL-15(10ng/mL)(范围可以为5ng/ml至50ng/mL)，
IL-2(10ng/mL)(范围可以为5ng/ml至20ng/mL)。
2、通过将K562细胞接种在细胞培养孔板中以便每孔加入3000个细胞来制备K562细胞。作为对照，制备了仅包括K562细胞的孔-因此所述对照孔不用于与分化的免疫细胞共培养。
3、以1:1、1:2、1:4和1:8的相应比例加入分化的免疫细胞。作为进一步的对照，仅包括分化的免疫细胞(不与K562细胞共培养)的不同的孔具有相同数量的分化的免疫细胞，例如在1:8比例的孔中。
4、在37℃下，在5％ CO2中，将共培养物和对照在含有IL-2的免疫细胞分化培养基中培养24小时。
5、24小时后，收集培养基，根据制造商的方案((Sigma Aldrich，目录号MAK066-1KT)进行LDH分析和测量。计算LDH特异性(specific)释放的百分比。数据示于图6。图6中所示的数据代表一式三份培养物的平均值+/-SD。LDH分析的结果表明，与对照组相比，1:4和1:8比例的共培养样品组中，通过LDH活性测量的细胞毒性显著更高。此外，进行了显微分析，同样示于图6。根据显微镜分析，在1:4和1:8混合共培养物中观察到K562细胞非常低或不存在。
总之，可以观察到本发明的分化的免疫细胞的细胞毒性活性。

Claims (70)

1.一种从多能干细胞(PSC)生产免疫细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)通过以下步骤诱导3D细胞聚集体形成和造血分化
(a)在无血清培养基中，在适于形成3D细胞聚集体的固体支持物上，在Notch-配体Delta-样配体4(DLL4)信号传导活性的存在下，在合适的条件下培养已经经历间充质分化的PSC，从而允许形成3D细胞聚集体；
(b)收集所述3D细胞聚集体并在无血清培养基中以悬浮培养在合适的条件下培养约3至6天；以及
(c)在无血清培养基中在合适的条件下将所述3D细胞聚集体培养约另外的4至7天；
(ii)通过在无血清培养基中、以悬浮培养在合适的条件下培养(i)的所述3D细胞聚集体达合适的时间来诱导免疫细胞分化；
从而提供免疫细胞群。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(i)之前，进行另外的步骤(0i)，包括：
(0i)通过以下步骤诱导中胚层分化
(a)在合适的条件下将PSC接种在无血清培养基中；和
(b)在无血清培养基中在合适的条件下将所述PSC培养约2至4天，和
(c)用无血清培养基重悬浮细胞。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述无血清培养基包含：
在步骤(0i)中，(a)激活素A、骨形态发生蛋白4(BMP4)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和凋亡抑制剂，优选为ROCK抑制剂，其各自的浓度为约10至50ng/mL；
(b)BMP4、VEGF和FGF，其各自的浓度为约5至15ng/mL；
(c)凋亡抑制剂，优选为ROCK抑制剂；
在步骤(i)中，(a)ALK受体抑制剂和ROCK抑制剂，其各自的浓度为约5至15μM，
(b)约5至15ng/mL的ALK受体抑制剂，
(c)约5至15ng/mL的ALK受体抑制剂、约40至60ng/mL干细胞因子(SCF)、约5至15ng/mLFMS样酪氨酸激酶3配体(Flt-3l)和约5至15ng/mL血小板生成素(TPO)；
在步骤(ii)中，约1至3％B27补充剂、约5至15ng/mL SCF、约5至15ng/mL Flt-3l、约5至15ng/mL IL-7和约15至45mM L-抗坏血酸2-磷酸盐倍半镁盐水合物。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述ROCK抑制剂是Y-27632二盐酸盐，和所述ALK受体抑制剂是SB43152。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(i)和(ii)中的所述悬浮培养是动态悬浮培养，优选通过以约60至80rpm的旋转在诸如轨道振荡器的振荡器上培养。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述步骤(ii)进行约21至50天。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述PSC是人诱导多能干(iPS)细胞，优选为人iPS细胞系TC-1133。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述PSC是多能干细胞，所述多能干细胞缺乏在所述多能干细胞的细胞表面上呈递的内源性MHC I类分子并且在其表面上包含免疫调节蛋白。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述免疫调节蛋白是单链融合HLA I类蛋白。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述单链融合HLA I类蛋白包含与至少部分HLA I类α链共价连接的至少部分B2M，所述HLA I类α链选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞进一步表达由所述多能干细胞表面上的单链融合HLA I类蛋白呈递的靶肽抗原。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述靶肽抗原共价连接至所述单链融合HLA I类蛋白。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述靶肽抗原包含序列VMAPRTLFL(SEQ IDNO:1)。
14.根据权利要求8至13中任一项所述的方法，其中在所述多能干细胞中的β-微球蛋白2基因的基本上所有拷贝都被破坏。
15.根据权利要求8至14中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞选自胚胎干细胞、诱导的多能干细胞和孤雌生殖干细胞。
16.根据权利要求8至15中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是灵长类动物来源的多能干细胞，优选为人多能干细胞。
17.根据权利要求8至16中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞由自脐带血分离的CD34-阳性细胞产生。
18.根据权利要求8至17中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是NINDS人类细胞和数据库的ND-50039。
19.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述PSC为缺乏内源性MHC II类的多能干细胞。
20.根据权利要求19所述的方法，其中通过破坏C2TA基因-MHC II类反式激活蛋白而使所述PSC缺乏内源性MHC II类。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(i)中，通过将PSC与表达DLL4的基质细胞共培养，或通过将PSC与涂覆DLL4的珠子一起温育来提供Notch-配体Delta样配体4(DLL4)信号传导活性。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中PSC与基质细胞的比率在约1:5至1:40的范围内。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(i)中，所述基质细胞是骨髓衍生的小鼠基质细胞系MS5。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(i)中，所述基质细胞是由表达DLL4的PSC分化的基质细胞。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将在步骤(0i)中的中胚层分化诱导期间的PSC在包含至少一种细胞外基质蛋白的细胞培养容器中培养。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述容器涂覆了所述至少一种细胞外基质蛋白。
27.根据权利要求25或权利要求26所述的方法，其中所述至少一种细胞外基质蛋白选自玻连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、基质胶、含有氨基酸序列RGD的肽、含有氨基酸序列RGD的蛋白及它们的组合。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(i)(a)中，所述固体支持物包含一个或多个孔，其中每个孔包含V形或锥形空腔。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述固体支持物是微孔培养板。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述微孔培养板是AggreWellTM板(获自StemCellTechnologies)、BIOFLOATTM96-孔板(获自faCellitate)或Nunclon Sphera 3D培养(获自ThermoFisher)。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)之后分离所述3D细胞聚集体，从而提供单个细胞。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述免疫细胞群包含T细胞样细胞和NK细胞样细胞。
33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)之后，进行另外的步骤(iii)，所述另外的步骤(iii)包括诱导，并且优选地还选择性扩增和活化T细胞样细胞和NK细胞样细胞。
34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)中，在合适的条件下诱导、选择性扩增和活化T细胞样细胞。
35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)中，在包含B27补充剂、SCF、Flt-3l、IL-7、IL-2、IL-15和CD3刺激性结合分子的培养基中选择性扩增T细胞样细胞。
36.根据权利要求35所述的方法，其中步骤(iii)中的所述培养基包含约1至3％的B27补充剂、约5至15ng/mL SCF、约2至7ng/mL Flt-l3、约5至15ng/mL IL-7、约5至15ng/mL IL-2、约5至15ng/mL IL-15，并且其中所述CD3刺激性结合分子选自抗-CD3抗体，比如OKT-3抗体，优选地浓度为约250至750ng/mL，以及携带OKT-3Fab片段的多聚化试剂。
37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)之后进行另外的步骤(iv)，所述另外的步骤(iv)包括通过在包含B27补充剂和IL-2的无血清培养基中在合适的条件下培养所述免疫细胞来进一步扩增。
38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(iv)的无血清培养基包含1至3％B27补充剂和30至70单位/mL IL-2。
39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞群的特征在于CD4、CD8、CD56、CD3和CD45的表达。
40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法适于通过在步骤(ii)、(iii)和/或(iv)中的任一个或全部步骤中使用生物反应器条件来生产具有高细胞数量的免疫细胞群。
41.一种免疫细胞群，其通过权利要求1至40中任一项所述的方法可获得。
42.一种通过权利要求1至40中任一项所述的方法获得的免疫细胞群。
43.一种非免疫原性T细胞，其通过权利要求1至40中任一项所述的方法可获得。
44.一种通过权利要求1至40中任一项所述的方法获得的非免疫原性T细胞。
45.一种通过权利要求1至40中任一项所述的方法可获得的非免疫原性T细胞，其中所述T细胞缺乏在所述T细胞的细胞表面上呈递的内源性MHC I类分子并且所述T细胞在其表面上包含免疫调节蛋白。
46.根据权利要求45所述的非免疫原性T细胞，其中所述非免疫原性T细胞在其表面上表达嵌合抗原受体(CAR)或外源性T细胞受体(TCR)。
47.根据权利要求45或46所述的非免疫原性T细胞，其中在T细胞中所述β-微球蛋白2基因的基本上所有拷贝都被破坏，从而使所述T细胞在细胞表面上缺乏内源性MHC I类分子。
48.根据权利要求45至47中任一项所述的非免疫原性T细胞，其中所述免疫调节蛋白是单链融合HLA I类蛋白。
49.根据权利要求48所述的非免疫原性T细胞，其中所述单链融合HLA I类蛋白包含与至少部分HLA I类α链共价连接的至少部分B2M，所述HLA I类α链选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G。
50.根据权利要求48或49所述的非免疫原性T细胞，其中，所述单链融合HLA I类蛋白包含至少部分B2M和至少部分HLA-A。
51.根据权利要求45至50中任一项所述的非免疫原性T细胞，其中所述单链融合HLA I类蛋白包含至少部分B2M和至少部分HLA-A0201。
52.根据权利要求48或49所述的非免疫原性T细胞，其中所述单链融合HLA I类蛋白包含至少部分B2M和至少部分HLA-E。
53.根据权利要求48或49所述的非免疫原性T细胞，其中所述单链融合HLA I类蛋白包含至少部分B2M和至少部分HLA-G。
54.根据权利要求48或49所述的非免疫原性T细胞，其中所述单链融合HLA I类蛋白包含至少部分B2M和至少部分HLA-B。
55.根据权利要求48或49所述的非免疫原性T细胞，其中所述单链融合HLA I类蛋白包含至少部分B2M和至少部分HLA-C。
56.根据权利要求48或49所述的非免疫原性T细胞，其中所述单链融合HLA I类蛋白包含至少部分B2M和至少部分HLA-F。
57.根据权利要求45至56中任一项所述的非免疫原性T细胞，其中所述非免疫原性T细胞进一步表达由所述多能细胞表面上的单链融合HLA I类蛋白呈递的靶肽抗原。
58.根据权利要求57所述的非免疫原性T细胞，其中所述靶肽抗原共价连接至所述单链融合HLA I类蛋白。
59.根据权利要求57或58所述的非免疫原性T细胞，其中所述靶肽抗原包含序列VMAPRTLFL(SEQ ID NO:1)。
60.根据权利要求45至59中任一项所述的非免疫原性T细胞，其中将所述免疫调节蛋白的基因整合到所述T细胞基因组的(内源性)B2M基因座中。
61.根据权利要求45至60中任一项的非免疫原性T细胞，其中将所述CAR或所述外源性TCR整合到内源TCR-α基因中、整合到内源TCR-β基因中或整合到内源TCR-α基因和内源TCR-β基因两者中。
62.根据权利要求45至61中任一项所述的非免疫原性T细胞，其中所述CAR或所述外源性TCR结合靶细胞表面上呈递的抗原。
63.根据权利要求62所述的非免疫原性T细胞，其中所述抗原是肿瘤相关抗原、病毒抗原或细菌抗原，优选为肿瘤相关抗原。
64.根据权利要求62或63所述的非免疫原性T细胞，其中所述抗原是CD19或CMV衍生抗原。
65.根据权利要求45至64中任一项所述的非免疫原性T细胞，其中所述T细胞是灵长类动物来源的T细胞，优选为人T细胞。
66.一种药物组合物，其包含权利要求41或42所述的免疫细胞群或权利要求43至65中任一项所述的非免疫原性T细胞。
67.根据权利要求41或42所述的免疫细胞群、根据权利要求43至65中任一项所述的非免疫原性T细胞或根据权利要求66所述的药物组合物，其用于治疗方法中。
68.根据权利要求41或42所述的免疫细胞群、根据权利要求43至65中任一项所述的非免疫原性T细胞或根据权利要求66所述的药物组合物，其用于细胞疗法中。
69.根据权利要求67或68所述应用的免疫细胞或非免疫原性T细胞的群，其中所述治疗或疗法针对癌症。
70.根据权利要求69所述应用的免疫细胞群或非免疫原性T细胞，其中所述癌症选自肺癌、前列腺癌、卵巢癌、睾丸癌、脑癌、皮肤癌、黑素瘤、结肠癌、直肠癌、胃癌、食管癌、气管癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、包括淋巴瘤和多发性骨髓瘤的淋巴癌、白血病、骨或软组织肉瘤、宫颈癌和外阴癌。
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