KR101811235B1 - Ｔ 세포 및 조혈 세포의 재프로그래밍 - Google Patents

Ｔ 세포 및 조혈 세포의 재프로그래밍 Download PDF

Info

Publication number
KR101811235B1
KR101811235B1 KR1020127000289A KR20127000289A KR101811235B1 KR 101811235 B1 KR101811235 B1 KR 101811235B1 KR 1020127000289 A KR1020127000289 A KR 1020127000289A KR 20127000289 A KR20127000289 A KR 20127000289A KR 101811235 B1 KR101811235 B1 KR 101811235B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
cell
human
reprogramming
ips
Prior art date
Application number
KR1020127000289A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20120026125A (ko
Inventor
매튜 브라운
엘리자베스 론던 도밍게즈
랜디 레어리쉬
에밀 누웨이썰
디피카 라제쉬
아만다 맥
Original Assignee
셀룰러 다이내믹스 인터내셔널, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=42357428&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR101811235(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 셀룰러 다이내믹스 인터내셔널, 인코포레이티드 filed Critical 셀룰러 다이내믹스 인터내셔널, 인코포레이티드
Publication of KR20120026125A publication Critical patent/KR20120026125A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101811235B1 publication Critical patent/KR101811235B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/867—Retroviral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/602—Sox-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/603—Oct-3/4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/604—Klf-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/605—Nanog
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/606—Transcription factors c-Myc
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/608—Lin28
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1114—T cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/20—Vector systems having a special element relevant for transcription transcription of more than one cistron
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E60/00—Enabling technologies; Technologies with a potential or indirect contribution to GHG emissions mitigation
    • Y02E60/10—Energy storage using batteries

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

유도 만능 줄기 세포 (iPS 세포)의 제조와 관련된 방법 및 조성물이 기술되어 있다. 예를 들어, 유도 만능 줄기 세포는 CD34+ 조혈 세포 (예, 사람 CD34+ 혈액 전구 세포) 또는 T 세포로부터 생성될 수 있다. 다양한 iPS 세포주가 또한 제공된다. 특정 양태로서, 본 발명은 T 세포 수용체의 유전자 재배열을 포함한 게놈을 갖는 신규한 유도 만능 줄기 세포를 제공한다.

Description

Ｔ 세포 및 조혈 세포의 재프로그래밍{Reprogramming T cells and hematopoietic cells}
본원은 2009년 6월 5일에 출원된 미국특허원 제61/184,546호 및 2009년 9월 4일에 출원된 미국특허원 제61/240,116호에 대한 우선권을 주장하며, 이들 선출원의 전체 내용은 권리의 포기 없이 본원에 참조로 인용된다.
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 줄기 세포의 분야에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 체세포, 특히 T 세포 및 조혈 세포의 재프로그래밍에 관한 것이다.
일반적으로, 줄기 세포는 성숙한 기능성 세포로 성장할 수 있는 미분화 세포이다. 예를 들어, 조혈모 세포는 최종적으로 분화된 혈액 세포의 상이한 유형중 어느 것으로도 성장할 수 있다. 배아 줄기 (ES) 세포는 배아로부터 유도되며 만능세포이므로 임의의 기관 또는 조직 유형 또는 적어도 잠재적으로 완전한 배아로 발전할 수 있는 능력을 보유하고 있다.
유도 만능 줄기 세포 (흔히 iPS 세포 또는 iPSC로 약칭함)는 비-만능 세포, 전형적으로 성체 체세포로부터 인위적으로 유도된 만능 줄기 세포의 한 유형이다. 유도 만능 줄기 세포는 많은 관점에서, 예를 들면 특정 줄기 세포 유전자 및 단백질의 발현, 염색질 메틸화 패턴, 분열 시간, 배아유사체 형성, 기형종 형성, 생존가능한 키메라 형성 및 효능과 분화능의 측면에서, 배아 줄기 세포와 같은 천연 만능 줄기 세포와 동일한 것으로 믿고 있지만, 이들 유도 만능 줄기 세포의 천연 만능 줄기 세포와의 전체적인 상관성 정도는 여전히 평가되고 있다.
iPS 세포는 2006년에 마우스 세포로부터 (Takahashi et al., 2006), 2007년에 사람 세포로부터 (Takahashi et al., 2007; Yu et al., 2007) 처음으로 생성되었다. 이것은, 배아의 사용에 대하여 논란을 일으키지 않으면서 연구자들이 연구에 중요하며 잠재적으로 치료 용도를 갖는 만능 줄기 세포를 획득할 수 있는 가능성을 부여하는 것이므로, 줄기 세포 연구에서 중요한 도약으로 인용되었다.
사람의 경우 iPS 세포는 흔히 피부 섬유아세포로부터 생성된다. 그러나, iPS 세포는 피부 생검을 해야 하는 선행 요건과 섬유아세포를 수 회의 시험관내 계대를 통해 증식해야 하는 선행 요건으로 인해 환자-특이적 줄기 세포를 생성하는데 다루기 힘든 소스이다. 게다가, 사람 체세포를 재프로그래밍하는 기존 방법은 체세포를 사람 대상자로부터 직접 획득할 필요가 있거나 체세포를 노동-집약적인 세포 배양 시스템에서 유지할 필요가 있기 때문에 불편하다. 따라서, 간단하고 간편하며 쉽게 이용가능한 다른 소스로부터 만능 줄기 세포를 유도하는 방법을 개발할 필요가 있다. 본 발명을 개발함에 있어 본 발명자들은 혈액을 환자 또는 건강한 사람으로부터 채혈하고, 저장하거나, 또는 예를 들면 중앙 관리소에서 분배를 위해 하나 이상의 먼 장소로 이송할 수 있기 때문에 혈액 시료가 상기한 소스일 수 있음을 고려하였다. 그러나, 본 발명자들의 지식이 본원을 통해 출원되기까지 임상적으로 이용가능한 소스를 이용하여 T 세포로부터 만능 줄기 세포를 생성하고 이러한 기술을 개발하려는 실질적인 필요성을 증명하는 것에 관한 보고는 없었다.
본 발명은 T 세포 및/또는 조혈 전구 세포로부터 유도된 유도 만능 줄기 세포를 제공함에 있어 본 분야의 주요 결점을 재프로그래밍에 의해 극복한다. 본 발명의 방법은 T 세포의 임상적으로 이용가능한 소스 (예, 3 ㎖ 전혈 시료)로부터 iPS 세포를 생성할 수 있어 조혈 세포의 가동화 필요성을 회피할 수 있다. 다른 양태로서, 조혈 세포 (예, 사람 또는 포유동물 CD34+ CD45+ CD43+ 조혈 전구 세포)는 혈액 시료로부터 수득하여 iPS 세포로 전환시킬 수 있다. 조혈 전구 세포는, 예를 들어 CD34+ 세포의 증식 또는 비-CD34+ 세포 계통의 제거를 통해, 말초 혈액의 혈액 시료로부터 수득할 수 있다. 특정 양태로서, CD34+ 조혈 세포는 혈액 시료를 수득하기 전에 대상자에서 CD34+ 조혈 전구 세포를 가동화하지 않고서 수득한 혈액 시료 (예, 냉장보존된 혈액 시료 또는 냉동보존된 혈액 시료)로부터 수득할 수 있다. 이러한 방법으로, 혈액 은행에 보존된 말초 혈액 시료를 포함한 다양한 혈액 시료로부터 iPS 세포를 생성할 수 있다.
따라서, 본 발명은 (a) T 세포 및/또는 조혈 전구 세포를 포함한 세포군을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 세포군의 T 세포 및/또는 조혈 전구 세포로부터 유도 만능 줄기 세포를 생성하여 iPS 세포군을 제공하는 단계를 포함하는, T 세포 및/또는 조혈 전구 세포로부터 유도 만능 줄기 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 세포군의 예시적인 소스는 이들로 한정되는 것은 아니지만 혈액 시료, 혈액 성분, 골수, 림프절, 태아 간 또는 제대를 포함할 수 있다. 세포군의 소스는 혈액 시료를 수득하기 전에 (예를 들면, 대상자에게 조혈 성장 인자의 외부 투여를 통해) 대상자의 체외에서 조혈 전구 세포를 가동화하지 않고 대상자로부터 채취된 혈액 시료 또는 이로부터 유래된 세포를 포함할 수 있다.
세포군은 냉동보존된 혈액 시료로부터 수득할 수 있거나, 세포군의 소스 또는 세포군은 냉동보존된 것일 수 있다. 냉동보존된 혈액 시료가 iPS 세포로의 성공적인 재프로그래밍을 위한 T 세포의 소스로서 사용될 수 있음이 실시예에서 입증되었다.
본 발명에 따른 특정 관점의 특별한 장점은 혈액 시료를 소량으로 사용하여 본 발명의 특정 관점을 실시할 수 있는 능력에 있다. 혈액 시료의 적합한 용량은 약 1 내지 약 5 ㎖, 약 1 내지 10 ㎖, 약 1 내지 15 ㎖, 또는 더욱 구체적으로는 약 3 ㎖일 수 있다.
조혈 줄기 세포/조혈 전구 세포 (예, CD34+ 세포)는 외부로부터 적용된 G-CSF로 유도되어 말초 혈액 소스에서의 증식을 위해 말초 혈액으로 가동화할 수 있다. 본 발명의 특정 관점으로서, 비-가동화된 공여자로부터의 말초 혈액 세포가 성공적인 재프로그래밍을 달성할 수 있으며, 이에 따라 외부로부터 적용된 성장 인자에 의한 골수 세포의 가동화가 필요하지 않은 것으로 밝혀졌다. 따라서, 특정 관점에서, 세포군의 소스는 세포가 하나 이상의 외부로부터 적용된 조혈 성장 인자 (예, 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF))로 가동화되지 않은 대상자일 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "외부로부터"는 유기체 내부로부터 기원한 내부 인자에 의해 어느 정도 가동화된 CD34+ 세포의 사용과 대조적으로 유기체의 외부로부터 가동화제를 적용함을 의미한다.
재프로그래밍에 적합한 T 세포군을 제공하기 위해, T 세포군은 시험관내에서 (예, 항-CD3 항체의 존재하에) T 세포를 활성화하는 조건하에서 제조될 수 있거나 생체내에서 T 세포를 활성화하는 조건하에서 제조될 수 있다 (이에 따라 흑색종에 대한 암 항원 (예, GP-100)과 같은 특정 항원에 대해 특이적인 TCR을 갖는다). 또한, 이것은 당해 기술 분야에 공지되어 있는 테트라머, 백신 및/또는 시험관내 펩타이드 자극을 포함한다. 또한, 세포군은 시험관내에서 하나 이상의 사이토카인 (예, IL-2)와 배양하여 T 세포군을 증식할 수 있다. T 세포는 사람 T 세포일 수 있다. 특정 관점으로서, T 세포는 CD4+, CD8+ T 세포 또는 이의 배합일 수 있다. T 세포의 비제한적인 예는 T 보조 1 (TH1) 세포, T 보조 2 (TH2) 세포, TH17 세포, 세포독성 T 세포, 조절 T 세포, 자연살해 T 세포, 미경험 T 세포, 기억 T 세포, 감마 델타 T 세포 및 임의의 T 세포를 포함한다.
특정 관점으로서, 세포군은 약 80% 내지 약 99%, 약 90% 내지 약 99%, 약 97% 내지 약 99% 또는 이의 모든 중간 범위의 T 세포를 포함하며, 이러한 비율은 적어도, 약 또는 대체로 1 x 103, 2 x 103, 3 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103, 1 x 104, 2 x 104, 3 x 104, 4 x 104, 5 x 104, 6 x 104, 7 x 104, 8 x 104, 9 x 104, 1 x 105, 2 x 105, 3 x 105, 4 x 105, 5 x 105, 6 x 105, 7 x 105, 8 x 105, 9 x 105, 1 x 106, 2 x 106 개의 T 세포 또는 이에 속하는 모든 범위의 갯수에 상응할 수 있다. 예를 들면, 본 발명자들은 96 웰 평판에서 웰당 대략 1-5 x 103 개의 T 세포로의 재프로그래밍을 증명하였다 (도 6a 및 도 6b).
조혈 전구 세포군을 제공하기 위해, CD34+ 세포의 농축 또는 증식을 유발하는 조건하에서 조혈 세포를 포함한 세포군을 제조할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 의해, 골수 세포의 가동화는 재프로그래밍을 위해 충분한 CD34+ 세포를 수득하는데 필요하지 않음이 밝혀졌다. 예를 들면, CD34+ 조혈 세포를 농축하기 위해 자기 활성화 세포 분류 (MACS) 또는 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용할 수 있고; 특정 양태로서, MACS와 함께 간접식 CD34 마이크로비드 키트 또는 직접식 CD34 마이크로비드 키트 (둘 다 독일 베르기쉬 글라드바흐 소재 Miltenyi Biotech로부터 입수가능함)를 사용하여 시료 (예, 말초 혈액 시료)로부터 CD34+ 조혈 세포를 농축할 수 있다. 또한, 말초 혈액으로부터 가동화된 CD34+ 조혈 전구 세포를 수득하는 추가의 방법들이 본 분야에 알려져 있으며, Gratwohl et al.(2002)에 기술된 방법을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 특정한 바람직한 양태로서, CD34+ 조혈 전구 세포는 하나 이상의 조혈 성장 인자에 노출되지 않은 대상자로부터 수득될 수 있고; 따라서, 유리하게는 CD34+ 조혈 전구 세포는 전형적으로 혈액 은행에서 입수되는 혈액 시료를 포함하여, 하나 이상의 외부로부터 적용된 성장 인자에 의해 가동화되지 않은 공여자의 혈액 시료로부터 수득될 수 있다. 다른 양태로서, CD34+ 세포는 시료에서 성숙-조혈 세포 (예, T 세포, B 세포, NK 세포, 수지상 세포, 단핵구, 과립구 및/또는 적혈구 세포)의 제거를 통해 농축될 수 있다. 세포 계통의 제거를 위해, 세포 현탁액을 상기된 계통 양성 세포를 제거하는데 사용될 수 있는 항체 칵테일 (예, CD2, CD3, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD56, CD123, CD235a 중의 하나 이상)과 배양할 수 있다 (예, Karanu et al., 2003). 이와 같은 목적을 위해 시판되고 있는 계통 세포 제거 키트 (독일 베르기쉬 글라드바흐 소재 Miltenyi Biotech)가 또한 사용될 수 있다. 특정 양태로서, iPS 세포로 전환시키기 전에 CD34+ 세포를 증폭 및 증식하기 위해 SCF, Flt3L 및/또는 IL-3 사이토카인의 배합을 사용할 수 있으며, 예로서 Akkina et al.(1996)에 기술된 방법 및 StemProTM-34 배지 (미국 캘리포니아 칼스배드 소재 Invitrogen으로부터 입수가능함)의 사용을 들 수 있다.
본 발명자들은 실질적으로 어떠한 조혈 전구 세포 또는 CD34+ 조혈 세포도 본원에 기술된 방법을 통해 iPS 세포로 재프로그래밍될 수 있음을 예상한다. 특정 양태로서, 말초 혈액 시료로부터 수득된 또는 유도된 조혈 전구 세포는 본원에 기술된 방법에 의해 iPS 세포로 전환될 수 있다. 조혈 전구 세포는 CD34와 CD45 둘 다를 발현하거나 CD34, CD45와 CD43을 발현할 수 있다. 특정 예로서, 사람 배아 줄기 세포 (hESC)와 같은 줄기 세포로부터 조혈 전구 세포를 생성하는 것이 바람직할 수 있고; 이들 양태에서, 골수 전구 세포에서 고도로 농축된 CD34+ CD43+ CD45+ 조혈 세포가 예를 들어 Choi et al.(2009)에 기술된 바와 같이 OP9 지지세포와 hESC의 공동배양에 의해 생성될 수 있다. 특정 예에서, 조혈 전구 세포는 CD34에 대해 음성적일 수 있고 (예, Guo et al., 2003); 그럼에도 불구하고, 이들 조혈 전구 세포는 iPS 세포로 분화될 수 있는 것으로 예상된다.
세포군의 T 세포 및/또는 조혈 전구 세포로부터 iPS 세포를 생성하기 위해, 본 발명의 방법은 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 T 세포 및/또는 조혈 전구 세포내로 도입하는 것을 포함할 수 있다. 특정 관점에서, 재프로그래밍 인자는 Sox 계통 단백질 및 Oct 계통 단백질을 포함한 재프로그래밍 단백질일 수 있으며, 이들중 하나 이상 또는 각각은 세포내 유입을 위해 단백질 형질도입 도메인에 작동적으로 연결될 수 있다. 본 발명의 추가의 양태로서, 재프로그래밍 인자는 하나 이상의 발현 카세트에 의해 암호화될 수 있으며, 예를 들면 Sox 계통 단백질 및 Oct 계통 단백질을 포함할 수 있다. Sox 및 Oct는 ES 세포 실체를 특화하는 전사 조절 계층 구조에서 중심에 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, Sox는 Sox 1, Sox2, Sox3, Sox15 또는 Sox18, 특히 Sox2일 수 있고; Oct는 Oct4일 수 있다. Nanog, Lin28, Klf4, c-Myc, SV40 거대 T 항원 또는 Esrrb와 같은 추가의 인자들이 재프로그래밍 효능을 증가시킬 수 있고; 재프로그래밍 인자의 특정 세트는 Sox2, Oct4, Nanog와 임의로 Lin-28을 포함한 세트이거나; Sox2, Oct4, Klf와 임의로 c-Myc를 포함한 세트일 수 있다.
특정 양태로서, 하나 이상의 발현 카세트는 하나 이상의 폴리시스트론 전사 단위를 포함할 수 있다. 폴리시스트론 단위는 작동적으로 연결된 암호 영역의 상이한 조합, 예를 들어 (i) 적어도 2 가지의 재프로그래밍 유전자 (예, Sox-Oct, c-Myc-Klf 또는 Nanog-Lin28); 또는 (ii) 선택 또는 선별 마커와 연결된 재프로그래밍 유전자를 포함할 수 있다. 관점 (i)이 바람직할 수 있는데, 그 이유는 하나의 재프로그래밍 인자 및 형광 마커를 갖는 4개의 독립된 바이시스트론 벡터 (이러한 벡터 지도는 도 10에 나타냄)를 사용하는 대신 어떠한 형광 마커도 갖지 않는 벡터 당 재프로그래밍 인자중 두 가지 (Sox2와 Oct4, cMyc와 Klf4 또는 Nanog와 Lin28)를 갖는 바이시스트론 벡터 (도 11a-11c에 도시된 벡터 지도)로 교체 사용함으로써 이들 이전 벡터 사용의 재프로그램 효율이 상당히 향상되었고 iPS 콜로니가 좀 더 일찍 형성되었음 (20-24일이 아닌 10-14일)을 발견하였기 때문이다.
동일한 폴리시스트론 전사 단위에서 복수의 유전자를 동시-발현시키기 위해, 폴리시스트론 전사 단위는 내부 리보솜 유입 부위 (IRES) 또는 폴리시스트론 전사를 위한 적어도 하나의 프로테아제 절단 부위 및/또는 자가-절단 펩타이드를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 자가-절단 펩타이드는 바이러스 2A 펩타이드이다.
다른 추가의 양태로서, 하나 이상의 발현 카세트는 바이러스 벡터, 에피솜 벡터 또는 트랜스포손으로 이루어진 그룹중에서 선택된 재프로그래밍 벡터에 포함된다. 더욱 구체적으로는, 벡터는 레트로바이러스 벡터 (예, 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV), 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV), Akv-MLV, SL-3-3-MLV 또는 다른 밀접하게 연관된 바이러스)일 수 있다. 바이러스 벡터는 또한 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 특정 관점에서, 전사 조절 요소는 바이러스 유전자의 통합을 중재하기 위해 긴 말단 반복 영역 (LTR)을 포함할 수 있다.
대안의 관점으로서, 벡터는 에피솜 벡터 (예, EBV-기본 벡터) 또는 트랜스포손-기본 벡터일 수 있다.
추가의 양태로서, 재프로그래밍 인자는 리포좀 형질감염, 뉴클레오펙션, 전기천공, 입자충격, 인산칼슘, 폴리양이온 또는 폴리음이온에 의해 도입되거나 외래 요소를 세포내로 도입하는데 적합한 어떠한 방법에 의해서도 도입될 수 있다.
일부 추가의 관점으로서, iPS 세포는 한 가지 이상의 배아 줄기 세포 특징 (예, 미분화된 형태, 배아 줄기 세포-특이적 마커, 부착성, 다능성, 다계통 분화능 또는 본 분야에 알려진 모든 특징)을 기초로 하여 선택될 수 있다. 예를 들면, 자손 세포를 선택하는 것은 미분화된 형태를 기초로 할 때 특히 편리할 수 있다. 배아 줄기 세포-특이적 마커는 SSEA-3, SSEA-4, Tra-1-60 또는 Tra-1-81, Tra-2-49/6E, GDF3, REX1, FGF4, ESG1, DPPA2, DPPA4 및 hTERT로 이루어진 그룹중에서 선택된 하나 이상의 특이적 마커일 수 있다. 이러한 선택 단계는 세포가 다능성 상태에 있고 분화된 상태로 돌아가지 않음을 보장할 수 있도록 재프로그래밍 후 하나 이상의 시점에서 사용할 수 있다. iPS 세포는 또한 이들의 표면 부착성의 측면에서 T 세포 및 조혈 전구 세포와 다른데, 이러한 특성은 편리한 분리 방법에서 이용될 수 있다.
특정 관점으로서, 재프로그래밍된 세포는 세포가 다능성이 되면서 외래에서 도입된 물질을 비활성화시킬 수 있기 때문에, iPS 세포는 발현 카세트에 포함된 벡터 유전 요소 또는 리포터 유전자와 같은 도입된 외래 요소의 발현이 본질적으로 일어나지 않음을 기초로 하여 선택할 수 있다. 따라서, 통합 벡터 유전 요소 또는 리포터 발현 (예, 형광)의 본질적인 손실은 형태적 특징에 추가하여 세포가 재프로그래밍되었음을 표시하는 지표가 된다. 예를 들면, 리포터 발현의 비활성화는 형광 활성화 세포 분류 (FACS), CAT 검정 또는 도입된 리포터 유전자를 기초로 하는 발광 검정에 의해 선택될 수 있다. 외래 요소의 "본질적인 손실" 또는 "본질적으로 함유하지 않는"은 iPS 세포군의 세포중에 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 미만 또는 이들 수치 사이의 모든 퍼센트로 외래 요소가 포함되어 있음을 의미한다. iPS 세포군은 통합된 외래 바이러스 요소를 본질적으로 함유하지 않을 수 있다.
iPS 세포의 임상 적용을 위해, 본 발명의 방법은 추가적으로 iPS 세포를 분화된 세포 (예, 심근세포, 조혈세포, 근세포, 신경세포, 섬유아세포, 췌장세포, 간세포 또는 상피세포)로 분화시키는 것을 포함할 수 있다. 추가의 관점으로서, 상기된 바와 같이 iPS 세포군으로부터 분화된 분화 세포, 조직 또는 기관이 제시될 수 있다. 상기 조직은 신경, 뼈, 소화관, 상피, 근육, 연골 또는 신장 조직을 포함할 수 있고; 상기 기관은 뇌, 척수, 심장, 간, 콩팥, 위장, 내장 또는 췌장을 포함할 수 있다. 특정 관점으로서, 분화된 세포, 조직 또는 기관은 배아 줄기 세포를 대체하는 조직 이식, 약물 선별 또는 발생 연구에서 사용할 수 있다.
다른 추가의 관점에서, 상기 방법에 따라 생성된 유도 만능 줄기 세포가 또한 제공될 수 있다. 또한, 사람 세포일 수 있는 배아 줄기 세포와 비교하여 T 세포 수용체 유전자의 V, D 및 J 단편의 불완전한 세트를 포함한 게놈을 포함하는 유도 만능 줄기 세포가 제공될 수 있다. 특정 관점으로서, 유도 만능 줄기 세포는 통합된 외래 바이러스 요소를 본질적으로 함유하지 않을 수 있다.
본 발명의 방법 및/또는 조성물과 관련하여 논의된 양태는 본원에 기술된 어떠한 다른 방법 또는 조성물과 관련하여서도 사용될 수 있다. 따라서, 한 가지 방법 또는 조성물에 속하는 양태는 또한 본 발명의 다른 방법 및 조성물에 적용될 수 있다.
핵산과 관련하여 본원에 사용된 용어 "암호화한" 또는 " 암호화하는"은 본 분야의 전문가가 본 발명을 용이하게 이해할 수 있도록 하기 위해 사용된 것이나, 이들 용어는 각각 "포함한" 또는 "포함하는"과 상호교환하여 사용될 수 있다.
본원 명세서에 사용된 단수 표현은 하나 이상을 의미할 수 있다. 청구범위에서 단어 "포함하는"과 병행하여 사용되는 단수 표현은 하나 이상을 의미할 수 있다.
청구범위에서 사용된 용어 "또는"은 비록 본 명세서가 단지 대안만을 가리키는 정의를 지지할지라도, 단지 대안만을 가리키기 위해 특별히 언급되지 않았거나 대안이 상호 배척하지 않는 한, "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 본원에 사용된 "다른"은 적어도 제2의 또는 그 이상의 것을 의미할 수 있다.
본원 전반에 걸쳐 사용된 용어 "약"은 해당 값에 이 값을 결정하기 위해 사용된 장치 및 방법의 고유 편차 또는 연구 대상자 사이에 존재하는 편차가 포함되어 있음을 가리킨다.
본 발명의 기타 목적, 특징 및 이점은 아래의 상세한 설명으로부터 명백하다. 그러나, 이러한 상세한 설명으로부터 본 발명의 정신 및 범위내에 있는 다양한 변화 및 변형은 본 분야의 전문가에게 자명한 것이기 때문에, 본원의 상세한 설명 및 특정 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 나타내기 위한 것으로서 단지 예시적인 목적으로 제시되고 있음을 이해해야 한다.
아래 도면은 본원 명세서의 일부를 구성하며 본 발명의 특정 관점을 증명하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 특정 양태에 대한 상세한 설명과 함께 이들 도면중 하나 이상을 참조함으로써 보다 더 잘 이해될 수 있다.
도 1은 활성화된 T-세포로부터 시작하여 hESC-유사 형태를 갖는 iPSC 콜로니의 생성까지에 해당하는 T-세포 재프로그래밍 과정의 개요를 보여준다. T-세포 및 iPSC 콜로니 이미지는 각각 10배 및 20배 대물렌즈가 설치된 올림푸스 IX71 현미경으로 획득한 것이다.
도 2a-2c는 사람 T-세포로부터 유도 만능 줄기 세포의 유도 및 성상확인을 보여준다. (도 2a) 투입 세포 소스 CD3 표면 발현의 유세포 분석이다. (i) 대표적인 공여자의 PBMC 군으로부터 -3일 비활성화된 PBMC상의 CD3 표면 발현 및 0일 활성화된 T-세포상의 CD3 표면 발현. (ii) CD3+ 세포의 우선적 형질도입을 증명하는 것으로서 대표적인 공여자의 형질도입 72시간 후 형질도입된 (GFP+) 세포군에 게이팅된 CD3+ 발현. (iii) 10개 공여자 Vacutainer-유도된 시료의 평균으로서 나타낸 상기 메트릭스 (i-ii)의 막대표. (도 2b) 대표적인 백혈구성분채집-유도된 TiPS 세포주 ("TiPS L-2") 및 Vacutainerⓒ-유도된 TiPS 세포주 ("TiPS V-1")에서 hESC 만능성 마커 OCT4, Tra-1-81, SSEA-3 및 SSEA-4의 유세포 분석이다. (도 2c) TCR β 유전자좌의 V-J 영역에 속하는 보존 영역을 표적으로 하는 다중 PCR 프라이머를 사용한 T-세포 수용체 (TCR) β 쇄 재배열 분석이다. 폴리클로날 개시 T-세포군은 전기영동도의 유효 절편 크기 범위내에서 앰플리콘 피크의 종 모양 곡선으로 나타난다. 섬유아세포 (비-T-세포) iPS 세포 ("Fib-iPS")는 TCR β 유전자좌에서 유전자 재배열이 없고 음성 대조군으로서 작용한다. 클론에 의해 유도된 TiPS 세포주 (두 개의 백혈구성분채집 세포주 ("TiPS L-1" 및 "TiPS L-2") 및 한 개의 Vacutainerⓒ 세포주 ("TiPS V-2)로 부터의 대표적인 데이터)는 명확한 크기의 뚜렷한 피크 하나를 보여준다. DNA 절편 분석은 ABI 3730 DNA 분석기로 실시하였다.
도 3a-3d는 사람 T-세포로부터 유도된 만능 줄기 세포의 성상확인을 보여준다. (도 3a) hES 세포-마커 유전자 DNMT38, LEFTB, NODAL, REX1, ESG1, TERT, GDF3 및 UTF1의 발현에 대한 대표적인 백혈구성분채집 유도된 TiPS 세포주 ("TiPS L-1" 및 "TiPS L-2") 및 Vacutainerⓒ 유도된 TiPS 세포주 ("TiPS V-2")의 RT-PCR 분석이다. GAPDH는 각 시료에 대한 양성 부하 대조군으로서 사용되었다. 도 3B는 게놈 DNA의 PCR 분석으로서 전이 유전자의 통합을 증명한다. (도 3b) 해당 재프로그래밍 유전자 ("RG")를 위해 정방향 프라이머, IRES를 위해 역방향 프라이머가 사용되었다. 벡터 지도에서 보는 바와 같이 PCR 반응 양성 대조군으로서 OCT4 정방향 및 역방향 프라이머가 사용되었다. (도 3c) TiPS 세포주의 RT-PCR 분석은 외래 전이 유전자의 비활성화를 보여주며, GAPDH는 각 시료에 대해 양성 대조군으로 사용되었다. hESC 세포주 H1 및 섬유아세포 유도된 iPSC 세포주 (Fib-iPS)는 양성 세포 대조군으로서 작용하고 활성화된 공여자 T-세포는 음성 세포 대조군으로서 작용하였다. (도 3d) 유세포분석에 의해 나타난 바와 같이 TiPS 클론이 사람 배아 줄기 세포-특이적 만능성 마커를 발현하였다.
도 4a-4e는 TiPS 세포주의 시험관내 및 생체내 분화 잠재성을 보여준다. (도 4a) 기형종 형성은 생체내 분화 잠재성을 보여준다. SCID/베이지 마우스에 주사된 TiPS 세포는 5 내지 12주경에 기형종을 형성하였다. 헤마톡실린 및 에오신 염색은 위장 또는 호흡기 조직 (내배엽), 연골 (중배엽) 및 망막 색소 상피 (외배엽)을 나타내는 술잔 세포가 있는 단순 상피를 포함한 세 가지 일차배엽cmd으로부터의 유도와 일치하는 조직을 보여준다. TiPS L-2 세포주로부터의 대표적인 이미지는 40배 대물렌즈를 사용한 올림푸스 IX71 현미경을 이용하여 얻은 것이다. (도 4b) 신경세포로의 시험관내 분화를 보여준다. TiPS L-2 세포는 응집체로서 신경 분화로 유도되었고 그런 다음 신경 마커 베타 III-튜불린에 대해 Alexa Fluor 594 이차 항체로 염색되었으며; 세포핵은 Hoechst 염색에 의해 대조염색되었다. 이미지는 20배 대물렌즈를 사용하여 얻었다. Image J 소프트웨어를 사용하여 대비를 조절하고 이미지를 병합하였다. (도 4c) 세포 응집 방법을 통한 TiPS 세포의 심장 유도를 보여준다. 세포 응집체는 14 내지 15일째에 박동 심장 트로포닌 T (cTNT)-양성 심근세포를 함유한다. 대표적인 시료로부터의 유세포분석 데이터가 제시되고 있다. 이미지는 10배 대물렌즈를 사용하여 얻었다. (도 4d) 조혈 전구 세포로의 시험관내 분화를 보여준다. 두 가지 TiPS 세포주에서는 hESC 세포주 (H1)와 섬유아세포 유도된 iPSC 세포주 (Fib-iPS)에 비하여 12일 동안 무혈청 배아유사체 (EB) 분화 프로토콜을 통해 조혈 전구 세포 (HPC)가 생성되었다. EB를 단일 세포로 분리시키고 CD34, CD45, CD43, CD31, CD41 및 CD235a에 대한 형광색소-결합된 모노클로날 항체로 염색함으로서 유세포분석을 통해 HPC를 정량하였다. (도 4e) 조혈 집락형성(CFU) 검정은 EB 분화되고 개별화된 세포를 사이토카인 (SCF, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-6 및 EPO)을 함유한 무혈청 MethoCult 배지에 도말함으로써 실시하였다. 형태학적 기준에 따라 14일간의 배양 후 콜로니를 적혈구 (CFU-E/BFU-E), 대식세포 (CFU-M, 데이터 제시되지 않음), 과립구 (CFU-G, 데이터 제시되지 않음), 과립구-대식세포 (CFU-GM) 및 과립구-적혈구-대식세포-거핵세포(CFU-GEMM)로서 계수하였다. CFU 총수가 또한 나타나 있다 (CFU). 이미지는 2배 대물렌즈가 설치된 올림푸스 CKX41 현미경으로 사용하여 얻었다.
도 5는 iPSC 클론 추적을 보여준다. 게놈 DNA를 기형종 시료로부터 분리하고, 이들의 모 세포주와 TCR β 쇄 재배열에 대해 비교하였다. 세포주 TiPS V-1으로부터의 대표적인 데이터가 제시되고 있다. 유도 기형종은 모 세포주의 클론 재배열을 보유한다. PCR 분석은 TCR β 유전자좌의 V-J 영역에 속하는 보존 영역을 표적으로 하는 다중 프라이머를 사용하여 실시하였다. DNA 분석은 ABI 3730 DNA 분석기로 실시하였다. 배경≤1000 RFU.
도 6a-6b는 96-웰 포맷에서 T 세포의 재프로그래밍을 보여준다. (도 6a) 공여자 A의 T 세포는 바이시스트론 벡터 SO (Sox2 및 Oct4) 및 CK (c-Myc 및 Klf4)로 감염되고 MEF에 도말되었다. 생 세포 항-Tra1-60 표지를 실시하여 iPS 세포 콜로니를 검출하였다. (도 6b) 공여자 A의 T 세포는 바이시스트론 벡터 SO (Sox2 및 Oct4) 및 NL (Nanog 및 Lin28)로 감염되고 MEF에 도말되었다. 생 세포 항-Tra1-60 표지를 실시하여 iPS 세포 콜로니를 검출하였다. 출발 재료에서 T 세포의 수를 표시하는 투입 세포 수는 "투입 #"로 나타나 있다.
도 7은 DNA 지문분석을 보여준다. 단기 연쇄 반복 분석은 분석된 8개 STR 유전자좌를 따라 탐지된 모든 대립유전자 다형성에 대해 TiPS 세포주가 모 활성화된 T-세포와 동일함을 보여준다. 두 가지 TiPS 세포주 (TiPS L-1 및 TiPS L-2)로부터의 대표적인 데이터가 제시되어 있다.
도 8은 알카리성 포스파타제 (AP) 염색을 보여준다. TiPS 세포주 TiPS L-1 및 TiPS L-2는 AP 양성이다. 이미지는 HP 스캔제트 G3110 컴퓨터 스캐너로 얻었다.
도 9는 TiPS 세포주가 정상적인 핵형을 나타내고 있음을 보여준다. TiPS 세포주 "TiPS L-1" 및 "TiPS L-2"는 MEF에서 6 계대 성장되었고 세포주 "TiPS V-1" 및 "TiPS V-2"는 매트리젤상에서 각각 총 18 계대중 8 계대 및 총 34 계대중 30 계대 성장되었다. 세포는 G 분염법으로 분석되었으며 클론 기형은 전혀 검출되지 않았다.
도 10은 재프로그래밍 실험에 사용된 MMLV 레트로바이러스 작제물의 벡터 지도이다. "RG"는 재프로그래밍 유전자를 가리킨다.
도 11a-11c는 향상된 재프로그래밍으로 재프로그래밍 실험에 사용된 바이시스트론 MMLV 레트로바이러스 작제물의 벡터 지도이다. (도 11a) MMLV-Oct4-IRES-Sox2 ("Oct4-Sox2"로 약칭)의 벡터 지도이다. (도 11b) MMLV-cMyc-IRES-Klf4 ("cMyc-Klf4"로 약칭)의 벡터 지도이다. (도 11c) MMLV-Nanog-IRES-Lin28 ("Nanog-Lin28"로 약칭)의 벡터 지도이다.
I. 도입
SOX2, OCT4, NANOG와 LIN28 또는 SOX2, OCT4, c- Myc와 KLF4와 같은 규명된 인자의 바이러스 전달에 의한 체세포의 미분화된 만능 상태로의 시험관내 재프로그래밍(Yu et al., 2007; Takahashi et al., 2007b)은 복수의 세포 유형을 이용하여 환자-특이적 사람 iPSC를 생성하는 방안을 열었다 (Loh et al., 2009; Aasen et al., 2008). 이러한 전제는 유전자의 일시적 발현을 통한 iPSC의 유도에 의해 또는 적절한 전사 인자의 단백질 형질도입을 사용함으로써 더욱 진보되었다 (Yu et al., 2009; Zhou et al., 2009). 지금까지 사람을 대상으로 한 iPSC 연구의 대부분은 세포 소스로서 섬유아세포에 집중해 왔다. 섬유아세포는 상업적 이용성 및 유전자 전달의 편리성으로 인해 출발 재료로서 특정 이점을 제공하는 한편, 침습 피부 생검의 필요성 및 원발성 조직으로부터 안정한 세포주를 설정하는 것의 곤란성으로 인해 iPSC 세포주의 대규모 임상 유도에는 차선에 불과하다. 아마도, 비가동화된 말초 혈액이 환자 시료를 취득하는 간편함으로 인해 재프로그래밍을 위한 이상적인 세포 소스이다 (Maherali and Hochedlinger, 2008). 추가로, 생존 공여자 및 사망 공여자로부터 채취된 다수의 동결된 혈액 시료가 전세계의 검체 은행에 보관되어 있다 (Kleeberger et al., 1999).
본 발명은 T 세포 및/또는 조혈 전구 세포로부터 유도된 만능 줄기 세포를 생성함으로써 현재 재프로그래밍 기술의 몇 가지 주요 문제를 극복한다. 본 발명에 의해 개발된 바에 따르면, 보다 풍부하고 다루기 간편한 혈액 세포 소스인 T 림프구로부터 iPSC의 유도는 1 ㎖ 전혈의 균등물로부터 수득될 수 있었다. 이들 T-세포 유도된 iPSC ("TiPS)는 hESC뿐만 아니라 섬유아세포-유도된 iPSC 세포주와 본질적인 특징을 공유한다. 추가로, TiPS는 예를 들면 유전자 추적 마커로서 또는 사람 T-세포 발생을 연구하는 재분화 실험에서 탐구될 수 있는 특징인 그들의 특징적인 T-세포 수용체 (TCR) 유전자 재배열을 유지한다.
본 발명 이전에, 본 발명자들은 몇 가지 이유 때문에 T 세포 또는 조혈 전구 세포의 재프로그래밍이 성공할 수 있다는 가능성에 대해 상당한 불확실성을 가졌다. 첫째, 혈액 시료중에 T 세포 및/또는 조혈 전구 세포가 재프로그래밍을 위해 충분한 양으로 존재하는지의 여부가 불확실하였다. 둘째, 재프로그래밍에서 T-세포 수용체 유전자의 V(D)J 재조합으로부터 유전자 손실의 가능한 효과가 연구된 바 없다. 셋째, 지금까지 프로그래밍된 세포 유형중 대부분은 부착성 세포 유형이다. T 세포는 비부착성이며 현탁액에서 배양된다. 본 발명 이전까지는 재프로그래밍을 겪은 T 세포가 부착성 iPS 세포에 적합한 부착성 배양 조건으로 변환시킬 수 있음은 명백하지 않았다. 따라서, 본 발명의 방법은 T 세포 또는 조혈 전구 세포로부터 iPS 세포의 생성을 가능하게 하는 것은 최초이다. T 세포는 소량의 혈액 시료와 같은 다양한 소스로부터 쉽게 얻을 수 있다. 마찬가지로, 조혈 전구 세포, 예를 들면 (CD34+/CD43+/CD45+/CD38-) 또는 (CD34-, CD133+/CD38-) 조혈 전구 세포는 말초 혈액 시료로부터 농축될 수 있다.
본 발명의 특정 이점은 재프로그래밍된 자손 세포에서 유지될 수 있는 T-세포 수용체의 재배열되고 감소된 V, D, J 유전자 단편에 있다. 이것은 T 세포-유도된 iPS 세포의 상이한 클론 집단의 특정한 특징 또는 "바 코드"로서 작용하며, 또한 V(D)J 재조합을 겪지 않은 만능 줄기 세포로부터 iPS 세포로 분화하는데 기여한다. 추가로, 부착성에 있어서 T 세포와 iPS 세포 사이의 차이는 자동 분리시 이점을 제공한다. 유사하게, 조혈 전구 세포와 iPS 세포간의 부착성 차이는 분리에 이용될 수 있다. 재프로그래밍된 T 세포 또는 조혈 전구 세포를 부착에 적합한 배양 조건으로 옮김으로써, 예를 들어 T 세포를 위한 배양 용기 바닥에 방사선 조사된 마우스 배아 섬유아세포 (MEF)를 적용함으로써, T 세포 또는 조혈 전구 세포로부터 유도된 iPS 세포는 바닥에 부착하는 반면, T 세포 및/또는 조혈 전구 세포는 현탁액에 남아 있을 수 있었다. 본 발명의 추가적인 양태 및 장점은 아래에 기술된다.
II. 정의
"재프로그래밍"은 세포에 재프로그래밍이 없이 동일한 조건하에서 갖고 있는 것에 비하여 세포가 배양에 의해 또는 생체내에서 하나 이상의 새로운 세포 유형의 자손을 형성하는 능력을 측정가능하게 증가된 정도로 제공하는 과정이다. 보다 구체적으로, 재프로그래밍은 체세포에 만능 잠재성을 부여하는 과정이다. 이것은 새로운 세포 유형의 표현형 특징을 갖는 자손이, 비록 재프로그래밍 이전에는 본질적으로 그러한 자손이 형성될 수 없지만, 충분한 증식 후 측정가능한 비율로 형성할 수 있음을 의미하고; 다시 말해서, 새로운 세포 유형의 특징을 갖는 비율은 재프로그래밍 이전보다 측정가능할 정도로 더 높다. 특정 조건하에서 새로운 세포 유형의 특징을 갖는 자손의 비율은 적어도 약 1%, 5%, 25% 또는 그 이상일 수 있으며, 비율이 높을수록 바람직하다.
T 세포의 "활성화제" 또는 T 세포를 활성화하는 조건은 T 세포를 활성화하는 자극을 가리키며, 항원 제시 세포 상에 또는 다른 표면 상에 존재할 수 있는 항원; 특이성과 무관하게 많은 T 세포 수용체 (TCR) 복합체에 결합하고 렉틴 (예, 콘카나발린-A (Con-A) 및 파이토헤마글루티닌 (PHA)) 및 TCR 또는 CD3 단백질 상의 불변 골격 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체와 같은 물질을 포함하는 폴리클로날 활성화제; 및 상당한 수의 T 세포를 자극하고 예를 들어 장독소 (예, 스태필로코커스 장독소)를 포함하는 초항원을 포함한다.
용어 "T 림프구"와 "T 세포"는 상호교환적으로 사용되며, 하나 이상의 MHC 분자 또는 하나 이상의 비-전형적 MHC 분자와 함께 항원 제시 세포의 표면 또는 매트릭스 상에 나타낼 때 항원을 인식할 수 있는 T 세포 항원 수용체 (TCR)를 발현하는 세포를 가리킨다.
"CD4+ T 세포"는 이들의 표면상에 CD4를 발현하고 세포-매개 면역 반응과 연관이 있는 T 세포의 아집단을 가리킨다. 이들은 자극에 의한 분비 프로필에 특징이 있으며, IFN-감마, TNF-알파, IL-2, IL-4 및 IL-10과 같은 사이토카인의 분비를 포함할 수 있다. "CD4"는 최초에 T-림프구상에서 분화 항원으로서 규명된 55-kD 당단백질이나, 또한 단핵세포/대식세포를 포함한 다른 세포 상에서도 발견된다. CD4 항원은 면역글로불린 초유전자 계통의 일원이며 MHC (주 조직적합성 복합체) 부류 II-제한된 면역 반응에서 연상 인식 요소로서 연루되어 있다.
"CD8+ T 세포"는 이들의 표면상에 CD8을 발현하는 T 세포의 아집단을 나타내며, MHC 부류 I-제한적이고, 세포독성 T 세포로 작용한다. "CD8" 분자는 흉선세포상에서 및 세포독성 및 억제 T-림프구상에서 발견된 분화 항원이다. CD8 항원은 면역글로불린 초유전자 계통의 일원이며 주 조직적합성 복합체 부류 I-제한된 상호작용에서 연상 인식 요소이다.
"조혈 전구 세포"는 조혈 계통에 수임되지만 추가로 조혈 분화를 할 수 있는 세포를 나타내고, 조혈 줄기 세포, 다능성 조혈 줄기 세포 (혈구모세포), 골수계 전구세포, 거핵세포 전구세포, 적혈구 전구세포 및 림프계 전구세포를 포함한다. 조혈 줄기 세포 (HSC)는 골수계 계통 (단핵세포 및 대식세포, 호중구, 호염구, 호산구, 적혈구, 거핵세포/혈소판, 수지상 세포) 및 림프계 계통 (T-세포, B-세포, NK-세포)를 포함한 모든 혈액 세포 유형을 발생하는 다능성 줄기 세포이다. 조혈 전구 세포는 CD34를 발현할 수 있다. 조혈 전구 세포는 CD133을 동시 발현할 수 있으며 CD38 발현에 대해 음성이다. 특정 양태로서, 특정 사람 조혈 전구 세포는 CD34를 발현하지 않지만 그럼에도 불구하고 본원에 기술된 방법을 통해 iPS 세포로 전환될 수 있다. 조혈 전구 세포는 CD34+/CD45+ 조혈 전구 세포 및 CD34+/CD43+/CD45+ 조혈 전구 세포를 포함한다. CD34+/CD43+/CD45+ 조혈 전구 세포는 골수계 전구 세포에 대해 고도로 농축될 수 있다. CD34+/CD43+/CD45+ 조혈 전구 세포와 같은 조혈 세포의 다양한 계통이 본원에 기술된 방법을 통해 iPS 세포로 전환될 수 있다. 조혈 세포는 또한 원시 조혈 세포의 여러 가지 아집단을 포함하며, CD34-/CD133+/CD38- (원시 조혈 전구 세포), CD43(+)CD235a(+)CD41a(+/-)(적혈구-거핵세포형성), lin(-)CD34(+)CD43(+)CD45
(-)(다능성) 및 lin(-)CD34(+)CD43(+)CD45(+)(골수계-편중) 세포, CD133+/ALDH+ (알데하이드데하이드로게나제)를 포함한다 (예, Hess et al., 2004; Christ et al., 2007). 이들 원시 조혈 세포 유형 또는 조혈 전구 세포의 어떠한 것도 본원에 기술된 바와 같이 iPS 세포로 전환될 수 있을 것으로 기대된다.
"벡터" 또는 "작제물" (때때로 유전자 전달 또는 유전자 전이 "비히클"로도 언급됨)은 시험관내 또는 생체내에서 숙주 세포에 전달될 폴리뉴클레오타이드를 포함한 거대분자 또는 분자들의 복합체를 가리킨다. 벡터는 직선형 또는 원형 분자일 수 있다.
벡터의 흔한 유형인 "플라스미드"는 염색체 DNA와 분리되어 있고 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있는 염색체외 DNA 분자이다. 특정한 경우로서 플라스미드는 원형이고 이중가닥이다.
"발현 작제물" 또는 "발현 카세트"는 전사를 유도할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 발현 작제물은 적어도 프로모터 또는 이와 기능적으로 균등한 구조를 포함한다. 추가로, 인핸서 및/또는 전사 종결 신호와 같은 요소가 포함될 수 있다.
용어 "외래"는 세포 또는 유기체 내의 단백질, 유전자, 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드와 연관되어 사용될 경우 인위적 또는 자연적 수단에 의해 세포 또는 유기체내로 도입된 단백질, 유전자, 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드를 가리키며, 세포와 관련하여 사용된 경우엔 인위적 또는 자연적 수단에 의해 분리되고 이어서 다른 세포로 또는 유기체로 도입된 세포를 가리킨다. 외래 핵산은 다른 유기체 또는 세포로부터 유래한 것일 수 있거나 그 유기체 또는 세포에 자연적으로 존재하는 핵산의 하나 이상의 추가적인 복제물일 수 있다. 외래 세포는 다른 유기체로부터 유래된 것일 수 있거나 동일한 유기체로부터 유래된 것일 수 있다. 비제한적인 실시예에서, 외래 핵산은 천연 세포의 것과 상이한 염색체상의 위치에 존재하거나 자연에서 발견되는 것과 상이한 핵산 서열에 인접되어 있다.
본원에서 용어 "에 상응하는"은 폴리뉴클레오타이드 서열이 참조 폴리뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부와 상동성 (즉, 동일하고, 엄밀하게 진화적으로 관련이 없음)이거나 폴리펩타이드 서열이 참조 폴리펩타이드 서열과 동일함을 의미하기 위해 사용된다. 대비하여, 본원에서 용어 "에 상보적인"은 상보적인 서열이 참조 폴리뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부와 상동성임을 의미하기 위해 사용된다. 구체적으로 설명하면, 뉴클레오타이드 서열 "TATAC"는 참조 서열 "TATAC"에 상응하며 참조 서열 "GTATA"에 상보적이다.
특정 단백질을 "암호화하는" "유전자", "폴리뉴클레오타이드", "암호화 영역", "서열", "단편", "절편" 또는 "전이 유전자"는 적절한 조절 서열의 통제하에 배치되었을 때 시험관내 또는 생체내에서 유전자 산물 (예, 폴리펩타이드)로 전사되고 임의로 또한 번역되는 핵산 분자이다. 암호화 영역은 cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA 형태로 존재할 수 있다. DNA 형태로 존재할 경우, 핵산 분자는 단일가닥 (즉, 센스 가닥) 또는 이중가닥일 수 있다. 암호화 영역의 경계는 5' (아미노) 말단의 개시 코돈과 3' (카르복시) 말단의 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 유전자는 이로써 한정되는 것은 아니지만 원핵 또는 진핵 mRNA로부터의 cDNA, 원핵 또는 진핵 DNA로부터의 게놈 DNA 서열 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있다. 전사 종결 서열은 보통 유전자 서열의 3'에 위치한다.
본원에서 용어 "세포"는 본 분야에서 가장 넓은 의미로 사용되며, 다세포 유기체의 조직의 구조 단위이고 자신을 외부로부터 격리해 주는 막 구조에 의해 둘러싸여 있으며 자가 복제능을 갖고 있고 유전 정보와 이를 발현하는 기전을 보유하고 있는 생명체를 가리킨다. 본원에 사용된 세포는 천연 세포이거나 인위적으로 변형된 세포 (예, 융합 세포, 유전적으로 변형된 세포 등)일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "줄기 세포"는 자가 복제능과 다능성을 갖는 세포를 가리킨다. 전형적으로, 줄기 세포는 손상된 조직을 재생할 수 있다. 본원에서 줄기 세포는 이들로 한정하는 것은 아니지만 배아 줄기 (ES) 세포 또는 조직 줄기 세포 (또한 조직-특이적 줄기 세포 또는 체세포 줄기 세포라고도 한다)일 수 있다. 상기된 능력을 가질 수 있는 어떠한 인위적으로 생성된 세포 (예, 융합 세포, 재프로그래밍된 세포, 본원에 사용된 것 등)도 줄기 세포일 수 있다.
"배아 줄기 (ES) 세포"는 초기 배아로부터 유도된 다능성 줄기 세포이다. ES 세포는 1981년 최초로 확립되었고 1989년 이후로 유전자결손 마우스의 생산에 적용되어 왔다. 1998년에 사람 ES 세포가 확립되었으며 현재 재생 의학에 이용되고 있다.
ES 세포와 다르게, 조직 줄기 세포는 한정된 분화 잠재성을 갖는다. 조직 줄기 세포는 조직의 특정 부위에 존재하며 미분화된 세포내 구조를 갖는다. 따라서, 조직 줄기 세포의 다능성은 전형적으로 낮다. 조직 줄기 세포는 더 높은 핵/세포질 비율을 가지며 적은 수의 세포내 세포소기관을 갖는다. 대부분의 조직 줄기 세포는 낮은 다능성, 긴 세포 주기 및 개인의 평생에 걸친 증식능을 갖는다. 조직 줄기 세포는 세포가 유도되는 부위 (예, 피부 계통, 소화기 계통, 골수 계통, 신경 계통 등)를 기초로 하여 카테고리별로 분류된다. 피부 계통의 조직 줄기 세포는 진피 줄기 세포, 모낭 줄기 세포 등을 포함한다. 소화기 계통의 조직 줄기 세포는 췌장(보통) 줄기 세포, 간 줄기 세포 등을 포함한다. 골수 계통의 조직 줄기 세포는 조혈 줄기 세포, 간엽 줄기 세포 등을 포함한다. 신경 계통의 조직 줄기 세포는 신경 줄기 세포, 망막 줄기 세포 등을 포함한다.
"유도 만능 줄기 세포"는 흔히 iPS 세포 또는 iPSC로 약칭되며 비만능 세포 (전형적으로 성체 체세포) 또는 최종 분화 세포 (예, 섬유아세포, 조혈세포, 근세포, 신경세포, 진피세포 등)로부터 재프로그래밍 인자라고 하는 특정 인자를 투입함으로서 인위적으로 제조된 만능 줄기 세포의 한 유형을 가리킨다.
"다능성"은 하나 이상의 조직 또는 기관 또는 특히 세 가지 배엽층, 즉 내배엽 (위내벽, 위장관, 폐), 중배엽 (근육, 뼈, 혈액, 비뇨생식기) 또는 외배엽 (진피 조직 및 신경계)을 구성하는 모든 세포로 분화하는 잠재성을 갖는 줄기 세포를 가리킨다. 본원에 사용된 "만능 줄기 세포"는 세 가지 배엽층중 어느 것으로부터 유래된 세포로 분화할 수 있는 세포 (예, 전능 세포의 직접적인 자손 또는 유도 만능 세포)를 가리킨다.
핵산 분자와 관련하여 "작동적으로 연결된"은 둘 이상의 핵산 분자 (예, 전사될 핵산 분자, 프로모터 및 인핸서 요소)가 핵산 분자의 전사를 허용하는 방식으로 연결되어 있음을 의미한다. 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드 분자와 관련하여 "작동적으로 연결된"은 두 개 이상의 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드 분자가 융합 성분인 각각의 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드의 하나 이상의 특성을 갖는 단일 폴리펩타이드 쇄, 즉 융합 폴리펩타이드를 생성하도록 하는 방식으로 연결되어 있음을 의미한다. 융합 폴리펩타이드는 특히 키메라이며, 다시 말해서 이종 분자로 구성된다.
"상동성"은 두 폴리뉴클레오타이드 또는 두 폴리펩타이드 사이의 동일성 비율(%)을 가리킨다. 하나의 서열과 다른 하나의 서열 사이의 유사성은 본 분야에 알려진 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열 정보의 정렬 및 쉽게 이용가능한 컴퓨터 프로그램의 사용에 의해 두 폴리펩타이드 분자 사이의 서열 정보를 직접 비교함으로써 결정될 수 있다. 상동성을 결정하는 다른 방법은 상동 영역 사이에서 안정한 이중가닥을 형성하는 조건하에서 폴리뉴클레오타이드를 하이브리드화한 후 단일 가닥-특이적 뉴클레아제(들)로 분해하고 생성된 절편의 크기를 결정함으로써 달성할 수 있다. 두 DNA 서열 또는 두 폴리펩타이드 서열은 상기된 방법을 이용하여 결정되었을 때 적어도 약 80%, 특히 적어도 약 90%, 가장 특별하게는 적어도 약 95%의 뉴클레오타이드 또는 아미노산이 정해진 길이의 분자 상에서 정합하는 경우 서로에 대해 "실질적으로 상동적"이다.
III. 줄기 세포에 대한 일반적인 배경
본 발명의 특정 양태로서, 체세포내로 재프로그래밍 인자를 도입함으로써 체세포, 특히 T 세포를 재프로그래밍하는 방법이 기술된다. 이들 세포의 자손은 아래 기술된 바와 같이 여러 관점에서 배아 줄기 세포와 동일하지만 외래 유전 요소를 본질적으로 함유하지 않을 수 있었다. 배아 줄기 세포 특징의 이해는 유도 만능 줄기 세포를 선택하는데 도움을 줄 수 있다. 줄기 세포 재프로그래밍 연구로부터 알려진 재프로그래밍 인자는 이들의 신규한 방법에 사용될 수 있다. 또한, 이러한 유도 만능 줄기 세포는 치료요법 및 연구에 응용하는데 윤리적 걸림돌이 되는 배아 줄기 세포를 잠재적으로 대체 사용될 수 있다.
A. 줄기 세포
줄기 세포는 모두가 그러한 것은 아니지만 대부분의 다세포 유기체에서 발견되는 세포이다. 이들은 유사 분열 세포를 통해 스스로를 재생하는 능력과 다양한 범위의 특정 세포 유형으로 분화한다는데 그 특징이 있다. 포유류 줄기 세포는 넓은 유형으로 두 가지가 있다: 한 가지는 포배에서 발견되는 배아 줄기 세포이고, 다른 한 가지는 성체 조직에서 발견되는 성체 줄기 세포이다. 발생하는 배아에서, 줄기 세포는 모든 특정 배아 조직으로 분화할 수 있다. 성숙 유기체에서, 줄기 세포 및 전구 세포는 몸체를 위한 복원 시스템으로 작용하여 특정 세포를 보충하며, 또한 혈액, 피부 또는 창자 조직과 같은 재생 기관의 정상적인 전환을 유지한다.
줄기 세포는 세포 배양을 통해 근육 또는 신경과 같은 여러 조직의 세포와 일치하는 특징을 갖는 특정 세포로 성장되고 형질전환될 수 있음에 따라 이들을 의학적 치료제로 사용하는 것이 제안되어 왔다. 특히, 배아 세포주, 치료 클로닝을 통해 생성된 자가 배아 줄기 세포 및 제대혈 또는 골수로부터의 정밀 성형성 성체 줄기 세포가 유망한 후보 약물로 홍보되고 있다. 가장 최근에는, 유도 만능 줄기 세포로의 성체 세포의 재프로그래밍은 배아 줄기 세포를 대체하기 위한 거대한 잠재성을 갖고 있다.
B. 배아 줄기 세포
배아 줄기 세포주 (ES 세포주)는 포배 또는 초기 상실기 배아의 내세포집단의 배반엽상층 조직으로부터 유도된 세포의 배양물이다. 포배는 사람의 경우 약 4 내지 5일 된 초기 단계 배아이며 50 내지 150개의 세포로 이루어져 있다. ES 세포는 다능성이며 세 가지 일차배엽층(외배엽, 내배엽 및 중배엽)의 모든 유도물로의 발생동안에 생성된다. 다시 말해서, ES 세포는 특정 세포 유형을 위해 충분하고 필요한 자극을 받을 때 성체의 200개 이상의 세포 유형 각각으로 발생할 수 있다. 이들은 배아외 막 또는 태반으로 성장하지 않는다.
지금까지 거의 모든 연구는 마우스 배아 줄기 세포 (mES) 또는 사람 배아 줄기 세포 (hES)를 사용하여 진행되었다. 둘 다 본질적인 줄기 세포 특징을 갖고 있으나, 이들은 미분화 상태를 유지하기 위해 아주 다른 환경을 필요로 한다. 마우스 ES 세포는 젤라틴 층에서 성장할 수 있고 백혈병 억제 인자 (LIF)의 존재를 요구한다. 사람 ES 세포는 마우스 배아 섬유아세포 (MEF)의 영양세포층에서 성장할 수 있고 흔히 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF 또는 FGF-2)의 존재를 요구한다. 최적의 배양 조건 또는 유전자 조작 (Chambers et al., 2003) 없이 배아 줄기 세포는 급속히 분화한다.
사람 배아 줄기 세포는 또한 몇 가지 전사 인자 및 세포 표면 단백질의 존재에 의해 규명될 수 있다. 전사 인자 Oct4, Nanog 및 Sox2는 분화 및 다능성의 유지를 유도하는 유전자의 억제를 보장하는 핵심적인 조절 네트워크를 형성한다 (Boyer et al., 2005). hES 세포를 동정하기 위해 가장 흔히 사용되는 세포 표면 항원은 당지질 SSEA3 및 SSES4 및 케라탄 설페이트 항원 Tra-1-60 및 Tra-1-81을 포함한다.
지난 20년간의 연구 동안에 배아 줄기 세포를 이용하여 승인된 치료법이나 사람에 대한 시험은 없다. 만능 세포인 ES 세포는 정확한 분화를 위해 특정 신호를 필요로 한다-ES 세포는 체내로 직접 주사된다면 많은 다른 유형의 세포로 분화하여 기형종을 유발할 것이다. ES 세포를 이식 거부를 피하면서 사용가능한 세포로 분화시키는 것이 배아 줄기 세포 연구가 여전히 직면하고 있는 약간의 장애물이다. 많은 국가들은 현재 ES 세포 연구 또는 새로운 ES 세포주의 생성에 대해 모라토리움(활동중단)을 선언한 상태이다. 배아 줄기 세포는 무한한 증식 및 다능성의 조합된 능력 때문에 재생 의학 및 상해 또는 질환 후 조직 대체를 위한 이론상 잠재적 소스로 남아 있다. 그러나, 이들 문제를 피해가는 한 가지 방법은 직접적인 재프로그래밍에 의해 체세포의 다능성 상태를 유도하는 것이다.
IV. 재프로그래밍 인자
iPS 세포의 생성에 있어서 유도를 위해 사용되는 재프그래밍 인자는 결정적이다. 본 발명에 기술된 방법에서 다음의 인자 또는 이들의 배합이 사용될 수 있었다. 특정 관점으로서, Sox 및 Oct (특히 Oct3/4)를 암호화한 핵산이 재프로그래밍 벡터내로 포함된다. 예를 들어, 하나 이상의 재프로그래밍 벡터는 Sox2, Oct4, Nanog 및 임의로 Lin28를 암호화한 발현 카세트 또는 Sox2, Oct4, Klf4 및 임의로 Esrrb를 암호화한 발현 카세트 또는 Sox2, Oct4, Nanog, Lin28, Klf4, c-Myc 및 임의로 SV40 거대 T 항원을 암호화한 발현 카세트를 포함할 수 있다. 이들 재프로그래밍 인자를 암호화한 핵산은 동일한 발현 카세트, 상이한 발현 카세트, 동일한 재프로그래밍 벡터 또는 상이한 재프로그래밍 벡터내에 포함될 수 있다.
Oct4 및 Sox 유전자 계통의 특정 일원 (Sox1, Sox2, Sox3 및 Sox15)는 유도 과정에 연루된 결정적인 전사 조절인자로 동정되었고, 이들이 존재하지 않는 경우 유도가 불가능하다. 그러나, Klf 계통의 특정 일원 (Klf1, Klf2, Klf4 및 Klf5), Myc 계통의 특정 일원 (c-Myc, L-Myc 및 N-Myc), Nanog 및 Lin28을 포함한 추가의 유전자들이 유도 효율을 증가시켜 주는 것으로 동정되었다.
Oct4 (Pou5fl)은 옥타머 ("Oct") 전사 인자의 계통 중 하나이며 다능성을 유지하는데 결정적인 역할을 한다. 할구 및 배아 줄기 세포와 같은 Oct4+ 세포에서 Oct4의 부재는 자발적인 영양막 분화를 유도하며, 따라서 Oct4의 존재는 배아 줄기 세포의 다능성 및 분화 잠재성을 생기게 한다. Oct4의 가까운 동족인 Oct1 및 Oct6을 포함한 "Oct" 계통의 여러 가지 다른 유전자는 유도를 발휘하지 못하며, 이 결과는 유도 과정에 Oct-4의 유일성을 증명한다.
Sox 유전자 계통은, 비록 이것이 다능성 줄기 세포에서 유일하게 발현되는 Oct4와 대조적으로 다능성 및 단일분화성 줄기 세포와 연관되어 있지만, Oct4와 유사하게 다능성을 유지하는데 관련이 있다. Sox2는 재프로그래밍 유도를 위해 사용된 최초 유전자인 한편, Sox 계통의 다른 유전자들이 또한 유도 과정에서 작용하는 것으로 밝혀졌다. Sox1은 Sox2와 유사한 효율로 iPS 세포를 생성하며, 유전자 Sox3, Sox15 및 Sox18은 비록 효율이 떨어지긴 하지만 iPS 세포를 생성한다.
배아 줄기 세포에서 Nanog는 Oct4 및 Sox2와 함께 다능성을 촉진하는데 필요하다. 따라서, Yamanaka 등이 Nanog는 비록 Thomson 등이 인자들중 하나인 Nanog로 iPS 세포를 생성하는 것이 가능하다고 발표했지만 유도를 위해 불필요했다고 발표했을 때 놀라운 것이었다.
Lin28은 분화 및 증식과 연관된 배아 줄기 세포 및 배아 암 세포에서 발현된 mRNA 결합 단백질이다. Thomson 등은 Lin28이 비록 불필요하지만 iPS 생성에 연루된 인자임을 증명하였다.
Klf 계통 유전자중 Klf4는 마우스 iPS 세포의 생성을 위한 인자로서 Yamanaka 등에 의해 최초로 동정되고 Jaenisch 등에 의해 검증되었으며, 사람 iPS 세포의 생성을 위한 인자로서 Yamanaka 등에 의해 증명되었다. 그러나, Thompson 등은 Klf4가 사람 iPS 세포의 생성을 위해 불필요하였다고 발표하였고, 실제로 사람 iPS 세포를 생성하는데 실패하였다. Klf2 및 Klf4는 iPS 세포를 생성할 수 있는 인자인 것으로 밝혀졌으며, 연관된 유전자 Klf1 및 Klf5는 비록 효율이 떨어지지만 마찬가지로 iPS 세포를 생성하였다.
Myc 계통 유전자는 암에 연루된 원암 유전자이다. Yamanaka 등 및 Jaenisch 등은 c-Myc가 마우스 iPS 세포의 생성에 연루된 인자임을 증명하였고, Yamanaka 등은 c-Myc가 사람 iPS 세포의 생성에 연루된 인자임을 입증하였다. 그러나, Thomson 등 및 Yamanaka 등은 c-Myc가 사람 iPS 세포의 생성을 위해 불필요하였음을 발표하였다. iPS 세포의 유도에 "Myc" 계통 유전자를 사용하는 것은, c-Myc-유도된 iPS 세포가 이식된 마우스의 25%가 치명적인 기형종을 발생하였기 때문에, 임상 치료제로서 iPS 세포의 예측 불허 사태로 인해 곤란하다. N-Myc 및 L-Myc가 유사한 효율로 c-Myc 대신에 유도하는 것으로 동정되었다. SV40 거대 항원이 c-Myc가 발현될 때 일어날 수 있는 세포독성을 경감시키거나 예방하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 재프로그래밍 단백질은 거의 동일한 재프로그래밍 기능을 갖는 단백질 상동체로 대체될 수 있다. 또한, 이러한 상동체를 암호화한 핵산이 재프로그래밍을 위해 사용될 수 있다. 보존적 아미노산 치환이 바람직하다: 즉, 예를 들면, 극성 산성 아미노산으로서 아스파르트산-글루탐산; 극성 염기성 아미노산으로서 라이신/아르기닌/히스티딘; 비극성 또는 소수성 아미노산으로서 루이신/이소루이신/메티오닌/발린/알라닌/글라이신/프롤린; 극성 또는 비하전된 친수성 아미노산으로서 세린/트레오닌. 보존적 아미노산 치환은 또한 측쇄를 기초로 하여 분류된 그룹을 포함한다. 예를 들면, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 글라이신, 알라닌, 발린, 루이신 및 이소루이신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 세린 및 트레오닌이며; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이며; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 예를 들면, 루이신을 이소루이신 또는 발린으로, 아스파테이트를 글루타메이트로, 트레오닌을 세린으로의 치환 또는 아미노산을 구조적으로 연관된 아미노산으로의 유사한 치환은 생성된 폴리펩타이드의 성질에 중요한 영향을 갖지 않을 것으로 기대하는 것이 합리적이다. 아미노산 변화가 기능성 폴리펩타이드를 생성하는가의 여부는 그 폴리펩타이드의 특이적 활성을 검정함으로써 쉽게 결정될 수 있다.
V. T 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 재프로그래밍
본 분야에서 흔히 사용되는 피부 섬유아세포 이외에 다른 소스로부터 iPS 세포를 제공하기 위하여, T 세포를 포함한 세포군을 재프로그래밍하는 방법이 제공된다. 특정 양태로서, T 세포를 활성화하고 증식하여 재프로그래밍을 위해 상당한 수의 T 세포를 제공한다.
A. T 세포
용어 "T 세포"는 본 분야에 규정된 바와 같은 T 림프구이며 흉선세포, 미성숙 T 림프구, 성숙 T 림프구, 휴지기 T 림프구 또는 활성화 T 림프구를 포함하도록 의도된다. T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4+CD8+ T 세포 또는 CD4-CD8- 세포일 수 있다. T 세포는 또한 T 보조 세포 (예, T 보조 1 (TH1) 또는 T 보조 2 (TH2) 세포 또는 TH17 세포)뿐만 아니라 세포독성 T 세포, 조절 T 세포, 자연살해 T 세포, 미경험 T 세포, 기억 T 세포 또는 감마 델타 T 세포일 수 있다 (Wilson et al., 2009; Wynn, 2005; Ladi et al., 2006). CD4와 같은 하나 이상의 마커에 의해 서로 상이한 T 세포는 본원에서 T 세포의 "아집단"이라 한다.
보조 T 세포 (작동 T 세포 또는 Th 세포)는 적응면역계의 "중개자"이다. 이들은 일단 활성화되면 신속히 분열하고 면역반응을 조절 또는 보조하는 사이토카인이라고 하는 작은 단백질을 분비한다. 보조 T 세포는 크기, 수신된 사이토카인 신호에 따라 TH1, TH2, TH3, TH17, THF 또는 다른 아집단중 하나로 분화하며, 이들은 다른 사이토카인을 분비한다. CD4+ 세포는 MHC 부류 II와 연관되어 있다.
세포독성 T 세포 (TC 세포 또는 CTL)은 바이러스에 감염된 세포 및 종양 세포를 파괴하며 또한 이식 거부에 연루되어 있다. 이들 세포는 이들의 표면에 CD8 당단백질을 발현하기 때문에 CD8+ T 세포로도 알려져 있다. T 조절 CD4+CD25+FoxP3+ 세포와의 SLOB 상호작용을 통해서 이들 세포는 무반응 상태로 불활성화될 수 있으며, 이러한 상태는 실험적 자가면역성 뇌척수염과 같은 자가면역성 질환을 예방한다.
기억 T 세포는 감염이 완치된 후 장기간 유지되는 항원-특이적 T 세포의 아집단이다. 기억 T 세포는 이들의 동족 항원에 재노출될 때 다수의 작동 T 세포로 증식하며, 이에 따라 면역체계에 과거 감염에 대한 "기억"을 제공한다. 기억 T 세포는 두 가지 아형을 포함한다: 중앙 기억 T 세포 (TCM 세포) 및 작동 기억 T 세포 (TEM 세포). 기억 세포는 CD4+이거나 또는 CD8+일 수 있다.
조절 T 세포 (Treg 세포)는 이전엔 억제 T 세포로 알려졌던 것으로 면역내성의 유지에 결정적이다. 조절 T 세포는 전통적인 알파 베타 TCR 발현 CD4 양성 세포와 닮았다. 조절 T 세포는 또한 CD25 단백질과 Foxp3 단백질의 동시발현에 의해 특징지어질 수 있다. 이들의 주요 역할은 면역반응의 종말을 향한 세포매개면역을 정지시키고 흉선에서의 음성 선택 과정을 회피한 자가반응성 T 세포를 억제하는 것이다. CD4+ 조절 T 세포의 두 가지 부류가 공개되어 왔으며 천연 Treg 세포와 적응 Treg 세포를 포함한다. 천연 Treg 세포 (또한 CD4+CD25+FoxP3+ Treg 세포로도 알려져 있음)는 흉선에서 생성되는 반면, 적응 Treg 세포 (또한 Tr1 세포 또는 Th3 세포로도 알려져 있음)는 정상적인 면역 반응 동안에 발생할 수 있다. 천연 Treg 세포는 FoxP3라고 하는 세포내 분자의 존재에 의해 다른 T 세포와 구별될 수 있다. FOXP3 유전자의 돌연변이는 조절 T 세포의 발생을 억제할 수 있으며 치명적인 자가면역 질환 IPEX를 일으킨다.
자연살해 T 세포 (NK T 세포)는 αβ 또는 γδ TCR과 여러 가지 NK 수용체 (CD16, CD56, CD161, CD94, CD158a 및 CD158b를 포함)의 동시 발현에 의해 특징지어진 이종 T 세포군이다. NK T 세포는 활성화 후 다량의 사이토카인을 급속히 분비하는 능력을 갖고 있다. NK T 세포 클론은 Th0 세포의 Th1 또는 Th2 세포로의 분화에 영향을 미칠 수 있는 사이토카인의 1형, 2형 또는 둘 다를 분비한다. NK T 세포는 마우스에서 불변 TCR Valpha14를 발현하고 사람에게서 Valpha24를 발현하는 세포로서 기술되었다. 최근에 다양한 TCR을 발현하는 NK T 세포는 CD3+CD56+ 세포가 NK T 세포군중 하나를 대표하는 것으로 인식되어 왔다. NK T 세포는 CD4+CD8+, CD4-CD8-, CD4-CD8+ 또는 CD4+CD8-일 수 있다.
γδ T 세포 (감마 델타 T 세포)는 표면에 별개의 T 세포 수용체 (TCR)를 보유한 T 세포의 작은 아집단을 나타낸다. 대부분의 T 세포는 α- 및 β-TCR 쇄라고 하는 두 가지 당단백질 쇄로 구성된 TCR을 갖는다. 그러나, γδ T 세포의 경우 TCR은 하나의 γ-쇄와 하나의 δ-쇄로 구성되어 있다. 이러한 T 세포 그룹은 α β T 세포보다 훨씬 적지만 (전체 T 세포중 5%) 장점막에서 상피내 림프구 (IEL)로 알려진 림프구군중에서 가장 많이 존재하는 것으로 발견된다. γδ T 세포를 활성화하는 항원 분자는 여전히 널리 알려져 있지 않다. 그러나, γδ T 세포는 제한된 MHC가 아니고, 항원 제시 세포상의 MHC 분자에 의해 제시될 펩타이드를 필요로 하기보다 전체 단백질을 인식할 수 있는 듯하다. 그렇지만 일부는 MHC 부류 IB 분자를 인식한다. 말초 혈액에서 주요 γδ T 세포군을 차지하는 사람 Vγ9/Vδ2 T 세포는 이들이 작은 비-펩타이드성 미생물 대사물 HMB-PP (이소펜테닐 파이로포스페이트 전구체)에 특이적으로, 신속하게 반응한다는 점에서 독특하다. 건강한 공여자의 말초 혈액에서 발견될 수 있는 T 세포의 추산치(%)는 다음과 같다: CD3+=70.78%±4.71; CD3+CD4=38.97%±5.66; CD3+CD8=28.955%±7.43; CD3+CD56+=5.22%±1.74; CD3-CD56+=10.305%±4.7; CD3+CD45RA=45.00%±7.19; CD3+CD45RO+=27.21%±7.34.
T 세포는 T 세포의 정제된 집단일 수 있거나, 다르게는 T 세포는 다른 유형의 세포 (예, B 세포 및/또는 기타 말초 혈액 세포) 집단내에 있을 수 있다. T 세포는 CD4+ T 세포와 같은 T 세포의 아집단의 정제된 집단일 수 있거나, T 세포의 다른 아집단을 포함한 T 세포군일 수 있다. 본 발명의 다른 양태로서, T 세포는 배양물에서 연장된 기간 동안 유지되어온 T 세포 클론이다. T 세포 클론은 다른 정도로 형질전환될 수 있다. 특정 양태로서, T 세포는 배양물에서 무기한 증식하는 T 세포 클론이다.
본 발명의 바람직한 양태로서, T 세포는 원발성 T 세포이다. 용어 "원발성 T 세포"는 배양물에서 연장된 기간 동안 유지되어온 T 세포와 대조적으로 개체로부터 얻은 T 세포를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 원발성 T 세포는 특히 대상자로부터 얻은 말초 혈액 T 세포이다. 원발성 T 세포군은 대부분 한 가지 아집단의 T 세포로 구성될 수 있다. 다르게는, 원발성 T 세포군은 다른 아집단의 T 세포로 구성될 수 있다.
T 세포는 미리 저장해 둔 혈액 시료, 건강한 개체 또는 한 상태에 처해 있는 개체로부터 얻을 수 있다. 언급된 상태는 바이러스 감염, 세균 감염 또는 임의의 다른 미생물에 의한 감염으로부터 기인한 상태와 같은 감염성 질환 또는 암 (흑색종)과 같은 과다증식성 질환일 수 있다. 특정 양태로서, T 세포는 사람 면역결핍 바이러스 (HIV)로 감염된 사람으로부터 얻을 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태로서, T 세포는 자가면역 질환 또는 T-세포 병리를 앓고 있거나 그에 민감한 대상자로부터 얻을 수 있다. T 세포는 사람 기원, 뮤린 기원 또는 기타 다른 포유류 기원일 수 있다.
B. 조혈 전구 세포
조혈 줄기 세포 및 조혈 전구 세포의 중대한 의학적 잠재성으로 인해, 배아 줄기 세포로부터 조혈 전구 세포를 분화하기 위한 방법을 개선하려는 실질적인 연구가 진행되어 왔다. 성인의 경우, 골수에 주로 존재하는 조혈 줄기 세포는 혈액 계통의 모든 세포로 분화하고 활발하게 분열하는 조혈 (CD34+) 전구 세포의 이종 집단을 생성한다. CD34+ 내피 세포는 iPS 세포로 전환될 수 있을 것으로 예상되는 한편, 특정 양태로서 내피 세포가 아닌 조혈 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있고; 예를 들어, 일부 경우에서 CD31 또는 VE-카드헤린을 발현하지 않는 조혈 전구 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, CD43 및/또는 CD45 마커와 같은 다른 마커들이 조혈 전구 세포를 동정하기 위한 보조 역할로서 사용될 수 있다 (예, Kadaja-Saarepuu et al., 2008; Vodyanik et al., 2006). 조혈 세포는 CD43(+)CD235a(+)CD41a(+/-)(적혈구-거핵세포 형성), lin(-)CD34(+)CD43(+)CD45
(-)(다능성) 및 lin(-)CD34(+)CD43(+)CD45(+)(골수계-편중) 세포를 포함한 원시 조혈 세포의 다양한 아집단을 포함한다. 성인의 경우, 조혈 전구 세포는 매일 증식하고 분화하여 수 천억의 성숙 혈액 세포를 생성한다. 또한, 조혈 전구 세포는 제대혈에 존재한다. 시험관내에서, 인간 배아 줄기 세포는 조혈 전구 세포로 분화할 수 있다. 또한, 조혈 전구 세포는 말초 혈액 시료로부터 증식 또는 농축될 수 있다. 조혈 세포는 기원이 사람, 뮤린 또는 기타 다른 포유류 종일 수 있다.
C. 세포 집단의 소스
조혈 줄기 세포 (HSC)는 정상적으로 골수에 내재하지만, 혈액으로 강제 이송될 수 있는데, 이 과정을 가동화라고 하며 말초 혈액에서 다수의 HSC를 채취하기 위해 임상적으로 사용된다. 한 가지 선택할 수 있는 가동화제는 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF)이다.
말초 혈액에서 순환하는 CD34+ 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포는 무동요 상태에서 또는 G-CSF와 같은 조혈 성장 인자의 외부 투여에 따른 가동화 후 성분채집 기술에 의해 수거될 수 있다. 가동화에 의해 채집된 줄기 세포 또는 전구 세포의 수는 무동요 상태에서 성분채집 후에 수득된 것보다 많다. 본 발명의 특정 관점에서, 세포군의 소스는 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포를 농축할 필요가 없기 때문에 외부로부터 적용된 인자에 의해 세포가 가동화되지 않은 대상자이다.
본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 세포군은 사람 세포, 비-사람 영장류 세포, 설치류 세포 (예, 마우스 또는 랫트), 소 세포, 양 세포, 돼지 세포, 말 세포, 양 세포, 개 세포 및 고양이 세포와 같은 포유류 세포 또는 이의 혼합물일 수 있다. 비-사람 영장류 세포는 히말라야 원숭이 세포를 포함한다. 세포는 동물 (예, 사람 환자)로부터 수득되거나 세포주로부터 수득될 수 있다. 세포가 동물로부터 수득되는 경우, 예를 들면 비분리된 세포 (즉, 혼합된 집단)로 사용될 수 있고; 이들 세포는 예를 들면 형질전환에 의해 일차로 배양물에 설정될 수 있거나; 예비 정제 방법에 적용될 수 있다. 예를 들면, 세포군은 세포 표면 마커의 발현을 기초로 하여 양성 또는 음성 선택에 의해 처리되거나; 시험관내 또는 생체내에서 하나 이상의 항원으로 자극받거나; 하나 이상의 생물학적 조절제로 처리되거나; 이들의 조합에 의해 처리될 수 있다. 예시적 양태로서, 세포군은 비-T 세포 및/또는 특정 T 세포 아집단의 고갈에 대해 음성 선택될 수 있다. 음성 선택은 B 세포 마커 (예, CD19 및 CD20); 단핵구 마커 CD14; 및 NK 세포 마커 CD56을 포함한 여러 분자의 세포 표면 발현을 기초로 하여 실시될 수 있다. 다른 방법으로서, 세포군은 비-CD34+ 조혈 세포 및/또는 특정 조혈 세포 아집단의 고갈에 대해 음성 선택될 수 있다. 음성 선택은 예를 들면 MACS 또는 컬럼 분리를 통해 다른 세포 유형의 분리를 위해 사용될 수 있는 항체의 칵테일 (예, CD2, CD3, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD56, CD123 및 CD235a)와 같은 다양한 분자의 세포 표면 발현을 기초로 하여 실시될 수 있다.
세포군은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 혼합된 세포군을 함유한 전혈 또는 이의 분획, 비장 세포, 골수 세포, 종양 침윤성 림프구, 백혈구성분채집에 의해 수득된 세포, 생검 조직, 림프절 (예, 종양으로부터 유출한 림프절)을 포함한다. 적합한 공여자는 면역화된 공여자, 비면역화된 (미경험) 공여자, 처리된 또는 미처리된 공여자를 포함한다. "처리된" 공여자는 하나 이상의 생물학적 조절제에 노출된 공여자이다. "비처리된" 공여자는 하나 이상의 생물학적 조절제에 노출되지 않았다.
T 세포를 포함한 세포군을 수득하는 방법은 본 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 본 분야에 알려진 방법에 따라 기술된 바와 같이 수득할 수 있다. 이러한 방법의 예는 실시예에 나타내고, Kim et al.(1992); Biswas et al.(1990); Biswas et al.(1991)에 의해 논의된다.
세포군으로부터 조혈 전구 세포를 수득하는 방법도 본 분야에 잘 알려져 있다. 조혈 전구 세포는 hSCF, hFLT3 및/또는 IL-3과 같은 여러 가지 사이토카인을 사용하여 증식할 수 있거나 (Akkina et al., 1996), CD34+ 세포는 MACS 또는 FACS를 사용하여 농축할 수 있다. 상기된 바와 같이 음성 선택 기술을 사용하여 CD34+ 세포를 농축할 수도 있다.
또한, 대상자로부터 세포 시료를 수득한 다음 시료를 목적하는 세포 유형을 위해 농축하는 것이 가능하다. 예를 들면, PBMC 및/또는 CD34+ 조혈 세포는 본원에 기술된 바와 같이 혈액으로부터 분리할 수 있다. 역류 원심분리 (분급법)를 사용하여 PBMC로부터 T 세포를 농축할 수 있다. 또한, 목적하는 세포 유형의 세포 표면상의 에피토프와 결합하는 항체로 분리 및/또는 활성화하는 것과 같은 다양한 기술을 사용하여 세포를 다른 세포로부터 분리할 수 있고, 예를 들어, 일부 T-세포 분리 키트는 항체 결합된 비드를 사용하여 세포를 활성화한 다음 동일한 비드로의 컬럼 분리도 가능하게 한다. 사용될 수 있는 다른 방법은 세포 표면 마커에 대한 항체를 사용하여 수용체 진입에 의한 세포의 활성화 없이 특이적 세포 유형을 선택적으로 농축하는 음성 선택을 포함할 수 있다.
골수 세포는 장골능, 대퇴골, 경골, 척추, 늑골 또는 기타 골수 공간으로부터 수득할 수 있다. 골수는 환자로부터 채취하여 여러 분리 및 세척 절차를 통해 분리할 수 있다. 골수 세포를 분리하는 공지의 방법은 다음의 단계를 포함한다: a) 세가지 분획으로 골수 현탁액의 원심분리 및 중간 분획 또는 버피코트의 수거; b) 단계 a)로부터의 버피코트 분획의 분리액, 흔히 피콜 (파머시아 파인 케미칼즈 AB의 상표)에서의 1회 이상 원심분리 및 골수 세포를 함유한 중간 분획의 수거; c) 재수혈가능한 골수 세포의 회수를 위한 단계 b)로부터 수거된 분획의 세척.
T 세포에 농축된 세포군을 사용하기를 원하는 경우, 이러한 세포군은 백혈구성분채집 및 연속 유동 세포 분리기를 이용한 기계식 성분채집에 의해 혼합 세포군으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, Ficoll-HypaqueTM 구배에서의 분리, Percoll 구배에서의 분리 또는 분급법을 포함한 공지 방법에 의해 버피코트로부터 T 세포를 분리할 수 있다.
D. T 세포 활성화
특정 관점에서, T 세포 수용체와 결합하여 T 세포 활성화에 대한 신호전달을 유발시키는 물질에 의해 T 세포를 활성화시킨다. 예를 들어, CD3 항체가 사용될 수 있다. T 세포를 상당한 수로 증식하고 재프로그래밍을 위한 증식 상태로 유도하기 위해 IL-2와 같은 사이토카인을 또한 사용할 수 있다.
미경험 T 세포는 분열하지 않고 수년 동안 살 수 있다. 이러한 작은 휴면 세포는 염색질과 소량의 세포질을 농축하고 RNA 또는 단백질을 거의 합성하지 않는다. 활성시에 이들 휴면 세포는 세포 주기로 재진입하고 신속히 분열하여 다수의 자손을 생성해야 하고, 자손은 무장된 작동 T 세포로 분화할 것이다. 이들의 증식 및 분화는 활성화된 T 세포 자신에 의해 생성되는 인터류킨 (IL-2)이라고 하는 사이토카인에 의해 가동된다.
필요한 동시 자극 신호의 존재하에 특이적 항원과의 최초 접촉은 T 세포가 세포주기의 G1 단계로 진입하게 하고; 동시에, 이는 또한 IL-2 수용체의 α 쇄와 함께 IL-2의 합성을 유도한다. IL-2 수용체는 세 가지 쇄를 갖는다: α, β 및 γ. 휴면 T 세포는 β와 γ 쇄로 구성된 수용체 형태를 발현하고, 이 수용체는 중간 정도의 친화성으로 IL-2와 결합하여 휴면 T 세포가 아주 고 농도의 IL-2에 반응할 수 있도록 한다. α쇄와 β 및 γ 쇄의 결합은 IL-2에 대해 훨씬 더 고도의 친화성을 갖는 수용체를 생성하여 T 세포가 아주 낮은 농도의 IL-2에 반응할 수 있도록 한다. 이어서, 고도의 친화성 수용체에의 IL-2의 결합은 세포 주기의 휴지기를 통한 진행을 유도한다. 이러한 방식으로 활성화된 T 세포는 하루에 2 내지 3회 수일간 분열하여 한 개의 세포가 수천 개의 자손으로 구성된 클론이 생성되도록 하고, 자손은 모두 항원에 대해 동일한 수용체를 생성한다. IL-2는 또한 이들 세포가 무장 작동 T 세포로 분화하는 것을 촉진한다.
비록 활성화의 특이적 기전이 T 세포의 상이한 유형 간에 약간 다르지만, CD4+ T 세포의 "두 개-신호 모델"이 대체로 진리로 인정되고 있다. CD4+ T 세포의 활성화는 APC 상의 주요 조직적합성 복합체 펩타이드와 B7 계통 일원에 의해 각각 T 세포 상에 T 세포 수용체와 CD28 둘 다의 진입을 통해 일어난다. 둘 다는 효과적인 면역 반응의 생성을 위해 필요하고; CD28 동시 자극의 부재하에 T 세포 수용체 신호전달은 단지 무반응을 초래한다. 신호전달 경로는 CD28 둘 다로부터 후속되며 T 세포 수용체는 많은 단백질이 연루되어 있다.
첫 번째 신호는 다른 세포 상의 주요 조직적합성 복합체 (MHC)에 의해 제시된 짧은 펩타이드에의 T 세포 수용체의 결합에 의해 제공된다. 이것은 그 펩타이드에 특이적인 TCR을 갖는 T 세포만이 활성화된다는 것을 보장한다. 그 파트너 세포는, 비록 B 세포 및 대식세포가 중요한 APC일 수 있지만, 보통 전문적인 항원 제시 세포 (APC)이며, 대개 미경험 반응의 경우 수지상 세포이다. MHC 부류 I 분자에 의해 CD8+ T 세포에 제시된 펩타이드는 길이가 8 또는 9 개의 아미노산이고; MHC 부류 II 분자에 의해 CD4+ 세포에 제시된 펩타이드는, MHC 부류 II 분자의 결합 홈의 말단에 열려있기 때문에 좀 더 길다.
이차 신호는 동시 자극으로 발생하며, APC 상의 표면 수용체가 비교적 소수의 자극, 보통 병원체 생성물에 의해 유도되지만 때때로 괴사체 또는 열충격 단백질과 같은 세포의 분해물을 파손시킨다. 미경험 T 세포에 의해 항시 발현된 유일한 동시-자극 수용체는 CD28이며, 이에 따라 이들 세포에 대한 동시 자극은 APC 상의 CD80과 CD86으로부터 발생한다. 다른 수용체는 OX40 및 ICOS와 같은 T 세포의 활성화시 발현되지만, 이들의 발현은 CD28에 의해 크게 좌우된다. 이차 신호는 T 세포가 항원에 반응하도록 승인한다. 이것 없이 T 세포는 무반응성이 되며 장래에 활성화하는 것이 더 어렵게 된다. 이 기전은, 자가 펩타이드가 보통 적합한 동시 자극으로 제시되지 않기 때문에, 부적절한 반응을 방지한다.
특정한 관점으로서, 항-CD3과 항-CD28 둘 다는 동시 자극이 관련이 되어 있는 T 세포 활성화를 위해 사용될 수 있다. 대안적인 관점으로서, 평판-결합된 항-CD3과 같은, 항-CD3의 교차 연결이 적용될 수 있다. 만일 PBMC중의 T 세포를 활성화하기 위해 가용성 항-CD3를 사용하는 경우, 가용성 항-CD3 항체는 PBMC중의 APC와 결합할 수 있고, 이어서 T 세포에 항원을 제시한다. 만일 가용성 항-CD3 항체가 단독으로 정제된 T-세포군에 사용되는 경우, 상기된 이유로 인해 무반응이 일어난다. 본 발명의 특정 양태는 T 세포를 항-CD3 (OKT3) 및 IL-2의 존재하에 배양하는 것을 포함하며, 이것은 값비싸고 다루기 힘든 비드 또는 평판-결합된 항체를 사용할 필요가 없기 때문에 유리하고 편리하고; OKT3 및 IL-2를 첨가한 후 PBMC의 세포 환경은 T 세포의 활성화를 보조한다. 이어서, T 세포는 우선적인 증식으로 인해 PBMC 배양물중에서 다른 세포 유형보다 다량 존재한다.
T 세포 수용체는 몇 가지 단백질의 복합체로서 존재한다. 실제 T 세포 수용체는 독립적인 T 세포 수용체 알파 및 베타 (TCRα 및 TCRβ) 유전자로부터 생성된 두 개의 별개 펩타이드 쇄로 구성된다. 복합체중의 다른 단백질은 CD3 단백질: CD3εγ 및 CD3εδ 이종이량체 및 가장 중요한 CD3ξ 단독이량체이고, CD3ξ 단독이량체는 총 6개의 ITAM 모티프를 갖는다. CD3ξ상의 ITAM 모티프는 Lck에 의해 인산화될 수 있으며 차례로 ZAP-70을 소집한다. Lck 및/또는 ZAP-70은 또한 많은 다른 분자, 특히 CD28, LAT 및 SLP-76상의 티로신을 인산화할 수 있으며, 그 결과로 이들 단백질 주변에 신호전달 복합체의 응집이 발생한다.
인산화된 LAT는 SLP-76을 막으로 소집하고 그런 다음 막에 PLCγ, VAV1, Itk 및 잠재적으로 PI3K를 유치할 수 있다. PLCγ와 PI3K 둘 다는 막의 내엽상의 PI(4,5)P2에 작용하여 활성 중간체 디아실글리세롤 (DAG), 이노시톨-1,4,5-트리포스페이트 (IP3) 및 포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리포스페이트 (PIP3)를 형성한다. DAG는 T 세포에서 일부 PKC (예, PKCθ)와 결합하고 활성화시키며, 이 과정은 전사 인자 NF-kB 및 AP-1을 활성화시키는데 중요하다. IP3은 PLCγ에 의해 막으로부터 방출되고 급속히 확산하여 ER상의 수용체를 활성화시키고 칼슘의 방출을 유도한다. 그런 다음 방출된 칼슘은 칼시뉴린을 활성화시키고, 칼시뉴린은 NFAT를 활성화시키며, 이어서 NFAT는 핵으로 전위한다. NFAT는 전사인자로서 다면발현성 유전자 세트, 특히 활성화된 T 세포의 장기간 증식을 촉진하는 사이토카인, IL-2의 전사를 활성화한다.
본 발명의 방법에 따라, 핵산 분자는 활발하게 증식하는 T 세포내로 도입된다. T 세포는 다양한 물질, 예를 들면 일차 활성화 신호 및 동시 자극 신호를 T 세포에 제공하는 물질의 배합물과 접촉하여 자극되어 증식할 수 있다. T 세포가 증식하도록 T 세포를 자극하기 위해 사용할 수 있는 물질은 본 분야에 잘 알려져 있으며 아래에 기술된다. 자극받아 증식하는 T 세포는 세포 확대, 세포 군집 및 배양 배지의 산성화로 특징이 나타난다. 따라서, T 세포 증식은 예를 들면 쿨터 계수기와 같은 것으로 T 세포의 크기를 검사하거나 T 세포의 부피를 측정함으로써 검증할 수 있다. 휴면 T 세포의 평균 직경은 약 6.8 미크론이다. 초기 활성화 및 자극 후 T 세포의 평균 직경은 4일까지 12 미크론 초과로 커지고 이후 약 6일까지 감소하기 시작한다. 게다가, T 세포 증식은 본 분야에 알려진 표준 기술, 예를 들면 삼중수소 티미딘 흡수에 의해 평가될 수 있다.
본 발명의 방법은 증식하는 T 세포내로 핵산 분자를 도입하기 이전에 증식하는 T 세포를 하나 이상의 자극제와 접촉시키는 것을 포함한다. 용어 "자극제"는 T 세포내로 형질감염된 핵산 분자에 포함된 유전자의 발현 수준이, T 세포내로 핵산 분자가 도입되기 이전에 T 세포가 자극제와 접촉되었을 때, 핵산 분자가 도입되기 이전에 T 세포가 자극제와 접촉되지 않은 경우보다 더 높아지도록 T 세포에 신호를 제공하는 물질을 포함하도록 의도된다.
본 발명의 특정 양태로서, 자극제는 T 세포에 일차 활성화 신호를 제공하는 물질이다. 용어 "일차 활성화 신호"는 전형적으로 TCR/CD3 복합체를 통해 유발되어 T 세포의 활성화를 유도하는 신호를 포함하도록 의도된다. T 세포의 활성화는 동시 자극 신호와 같은 이차 신호를 받았을 때 T 세포가 유도되어 증식 및 분화하도록 하는 T 세포의 변형을 포함하도록 의도된다. 특정 양태로서, 일차 활성화 신호는 T 세포 수용체 또는 이와 결합된 CD3 복합체와 접촉하는 물질에 의해 제공된다. 바람직한 양태로서, 그 물질은 CD3에 반응하는 항체, 예를 들면 모노클로날 항체 OKT3 (미국 메릴랜드 록빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션의 등록번호 CRL 8001로 입수가능함)이다. 본 발명의 다른 양태로서, 자극제는 T 세포상의 CD2 복합체를 자극하는 물질, 예를 들면 항체의 배합물 (예, T11.3+T11.1 또는 T11.3+T11.2)를 포함한다 (참조예: Meuer et al., 1984).
본 발명 방법의 다른 양태로서, 자극제는 IL-2와 같은 림포카인이다. 림포카인은 특히 T 세포를 자극하기 위한 다른 물질 (예, T 세포에 일차 활성화 신호를 제공하는 물질)과 배합하여 사용한다. 따라서, 본 발명의 바람직한 양태로서, T 세포에서 핵산이 발현되도록 T 세포를 핵산 분자로 형질감염시키기 전에, T 세포는 T 세포에 일차 활성화 신호를 제공하는 물질 (예, 항-CD3 항체)과 유효량의 IL-2의 배합물과 접촉된다.
본 발명의 바람직한 양태로서, T 세포는 일차 활성화 신호와 동시 자극 신호 둘 다를 T 세포에서 자극하는 물질의 배합물로 활성화된다. 용어 "동시 자극 물질"은 일차 활성화 신호를 받은 T 세포 (예, 활성화된 T 세포)가 자극받아 증식하거나 사이토카인 (예, IL-2, IL-4 또는 인터페론-γ)을 분비하도록 T 세포에 동시 자극 신호를 제공하는 물질을 포함하도록 의도된다. 특정 양태로서, 동시 자극 물질은 T 세포 표면상의 CD28 또는 CTLA4 분자와 상호작용한다. 훨씬 더 특정한 양태로서, 동시 자극 신호는 CD28 또는 CTLA4 (예, B-림프구 항원 B7-1 또는 B7-2)의 리간드이다. 용어 "CD28의 천연 리간드의 자극 형태"는 T 세포에 동시 자극 신호를 제공할 수 있는 B7-1 및 B7-2 분자, 이의 절편 또는 이의 변형체를 포함하도록 의도된다. CD28의 천연 리간드의 자극 형태는 예를 들어 활성화된 말초 혈액 림프구를 CD28의 천연 리간드의 형태와 접촉하고 표준 T 세포 증식 검정을 실시함으로써 동정할 수 있다. 따라서, CD28의 천연 리간드의 자극 형태는 T 세포의 증식을 자극할 수 있다. CD28/CTLA4의 천연 리간드의 자극 형태는 예를 들어 PCT 공개번호 WO95/03408에 기술되어 있다.
핵산 분자를 T 세포내로 도입하기 전에 T 세포를 활성화하기 위해 사용될 수 있는 다른 물질은 T 세포 활성화 및/또는 동시 자극에 연루된 하나 이상의 세포내 신호 전달 경로를 자극하는 물질을 포함한다. 본 발명의 특정 양태로서, 자극제는 이노마이신 또는 A23187과 같은 칼슘 이온운반체이다. 또 다른 자극제는 포르볼 에스테르와 같이 단백질 키나제 C를 자극하는 물질일 수 있다. 바람직한 포르볼 에스테르는 포르볼-12,13-디부티레이트이다. 본 발명의 훨씬 더 바람직한 양태로서, T 세포는 핵산 분자로 형질감염되기 전에 칼슘 이온운반체와 포르볼 에스테르의 배합물과 접촉된다. 자극제는 또한 단백질 티로신 키나제를 활성화하는 물질일 수 있다. 단백질 티로신 키나제를 자극하는 바람직한 물질은 퍼바나데이트이다 (O'Shea et al., 1992).
본 발명의 다른 양태로서, 자극제는 폴리클로날 활성화제이다. 폴리클로날 활성화제는 T 세포의 원형질 막상에 발현된 당단백질과 결합하는 물질을 포함하며 파이토헤마글루티닌 (PHA), 콘카나발린 (Con A) 및 포크위드 미토겐 (PWM)과 같은 렉틴을 포함한다.
클론에 특이적 활성화 신호를 제공함으로써, T 세포군에서 특정 T 세포 클론만을 선택적으로 형질감염시킬 수 있다. T 세포 클론의 특이적 활성화는 예를 들어 항원-제시 세포에 의해 제시된 특이적 항원을 사용하여 달성할 수 있다.
사용될 수 있는 다른 자극제는 초항원을 포함한다. 본원에 정의된 용어 "초항원"은 세균 장독소 또는 T 세포의 증식을 자극할 수 있는 다른 세균 단백질을 포함하도록 의도된다. 초항원은 SEA, SEB, SEC, SED 및 SEE와 같은 스태필로코커스 장독소 (SE)를 포함한다. 초항원은 또한 레트로바이러스 초항원과 같이 바이러스 기원일 수 있다.
단독으로 또는 본 분야에 알려진 또는 본원에 기술된 바와 같이 T 세포 자극 검정을 사용하여 동정할 수 있는 다른 물질과 배합하여 T 세포를 자극할 수 있는 추가의 물질이 또한 본 발명의 범위에 속한다. 핵산 분자를 T 세포내로 도입하기 전에 T 세포를 자극하기 위해서는 상기된 물질중 어떠한 배합물도 사용될 수 있다.
자극제는 용액으로 사용될 수 있거나 고체 표면에 결합될 수 있다. 고체 표면은 예를 들어 조직 배양 접시 또는 비드의 표면일 수 있다. 자극제의 성질에 따라, 고체 표면으로의 결합은 본 분야에 잘 알려진 방법에 의해 실시될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 시판되고 있는 가교제 (일리노이 락포드 소재 피어스)를 사용하여 세포 표면에 화학적으로 가교시키거나, 4℃에서 밤새 배양하여 플라스틱 상에 고정시킬 수 있다. 만일 T 세포의 자극을 위해 몇 가지 물질이 사용되는 경우, 일부 물질은 용액일 수 있고 다른 일부 물질은 고체 지지체에 결합시킬 수 있다. 바람직한 양태로서, T 세포는 고체 상-결합된 항-CD3 항체와 가용성 항-CD28 항체의 배합으로 자극된다.
T 세포에 첨가될 자극제의 특정 용량은 자극제의 유형에 따라 다양할 수 있다. 전형적으로, 자극제는 본원에 기술된 바와 같이 T 세포가 증식하고 사이토카인을 분비하도록 T 세포를 자극하는데 사용되는 것과 동일한 용량으로 사용된다.
본 발명의 바람직한 양태로서, 본 발명의 방법은 추가로 T 세포의 형질감염 후 시험관내에서 T 세포를 자극하여 증식시키는 것을 포함한다. T 세포는 IL-2의 존재하에 실시예에 기술된 바와 같이 시험관내에서 자극하여 증식시킬 수 있다. 특정 양태로서, T 세포는 일차 활성화 신호를 제공하는 물질 (예, 항-CD3) 및 동시 자극 신호를 제공하는 물질 (예, 항-CD28 항체)과 함께 배양할 수 있다.
훨씬 더 바람직한 양태로서, T 세포는 원발성 세포이다. 따라서, T 세포는 대상자로부터 수득하고, 본 발명의 방법에 따라 형질감염시키며, 시험관내에서 증식시킬 수 있다. 본 발명의 다른 양태로서, 형질감염되고 증식된 T 세포는 대상자에게 재투여된다. T 세포는 대상자에게 투여하기 전에 예를 들면 구배 원심분리에 의해 추가로 정제되는 것이 바람직할 수 있다.
E. V(D)J 재조합
발명자들은 T 세포 수용체에서의 V(D)J 재조합이 T 세포 재프로그래밍을 억제하지 않음을 발견하였다. T 세포로부터 유도된 iPS 세포의 특이적 재배열은 특정 관점에서 iPS 세포를 추적하고 iPS 세포의 상이한 집단을 동정하는 고유의 "바코드"로서 작용할 수 있다. 추가의 관점에서, V, D, J 유전자 단편의 최초 세트를 갖는 배아 줄기 세포와 비교하여 V, D, J 유전자 단편의 불완전한 세트를 갖는 iPS 세포가 또한 제공될 수 있다. 이들 iPS 세포의 V, D, J 유전자 단편의 재배열은 클론 집단내에서 동일할 수 있지만, 상이한 클론 집단사이에서는 상이할 수 있다. 특정 관점에서, 감마/델타 TCR+ T-세포가 또한 본 발명의 방법에 의해 재프로그래밍될 수 있다. 이러한 T-세포군중 하나로부터 기원하는 iPS 클론은 예를 들면, 생식 세포 계열 구성과 밀접하게 닮은 게놈을 가질 수 있고 이에 따라 T 세포 또는 다른 분화된 세포의 보다 확고한 레퍼토리로 재분화할 수 있기 때문에 유리할 수 있다.
V(D)J 재조합은 척추동물에서 발생하는 유전자 재조합의 기전으로서 면역계에서 중요한 역할을 하는 특이적 단백질을 암호화하는 유전자의 단편을 무작위로 선택하고 집결시킨다. 이러한 부위-특이적 재조합 반응은 세균, 바이러스 및 기생충 침입자 또는 기형 세포 (예, 종양 세포)로부터의 다양한 항원을 인식하는데 필요한 T 세포 수용체 (TCR)와 면역글로불린 (Ig) 분자의 다양한 레퍼토리를 생성한다.
대부분의 T 세포는 알파 쇄와 베타 쇄로 구성된다. T 세포 수용체 유전자는 림프구의 발생 동안 재배열하여 림프구 세포에 특정적인 항원 수용체를 제공하는 다수의 V, D와 J 유전자를 베타 쇄에 (및 V와 J 유전자를 알파 쇄에) 함유한다는 점에서 면역글로불린 유전자와 유사하다.
T 세포 발생 동안에, T 세포 수용체 (TCR) 쇄는 면역글로불린에 대해 기술된 것과 실질적으로 동일한 일련의 지령된 재조합 과정을 겪는다. D에서 J로의 재조합은 TCR의 β 쇄에서 처음으로 일어난다. 이 과정은 6개 Jβ1 단편중 하나에 Dβ1 유전자 단편의 결합 또는 6개 Jβ2 단편중 하나에 Dβ2 유전자 단편의 결합을 포함할 수 있다. DJ 재조합은 Vβ에서 DβJβ로의 재배열에 후속으로 진행된다. 새로이 형성된 복합체에서 Vβ-Dβ-Jβ 유전자 사이의 모든 유전자는 결실되고 불변 도메인 유전자 (Vβ-Dβ-Jβ-Cβ)를 포함한 일차 전사물이 합성된다. mRNA 전사는 모든 개재 서열을 잘라내고 TCR Cβ 쇄를 위한 전체 길이 단백질의 번역을 허용한다.
TCR의 알파(α) 쇄의 재배열은 β 쇄 재배열의 후속으로 진행되며 Ig 경쇄에 대해 기술된 V에서 J로의 재배열과 흡사하다(상기 참조). β-쇄와 α-쇄의 결집은 대부분의 T 세포에서 발현되는 αβ-TCR을 형성한다.
VI. 재프로그래밍 인자의 발현 및 전달
본 발명의 특정 관점으로서, 재프로그래밍 인자는 삽입성 벡터 또는 에피솜 벡터와 같은 하나 이상의 벡터로 구성된 발현 카세트로부터 발현된다. 추가의 관점으로서, 재프로그래밍 단백질은 단백질 형질도입에 의해 체세포내로 직접 도입될 수 있다 (참조: 미국특허원 제61/172,079호-이의 내용은 본원에 참조로 인용된다).
A. 삽입성 벡터
iPS 세포는 재프로그래밍 단백질을 암호화하는 특정 핵산 또는 유전자를 비-다능성 세포, 본 발명에 있어서 예를 들면 T 세포 또는 조혈 전구 세포내로 형질감염시킴으로써 유도될 수 있다. 전형적으로 형질감염은 통상의 방법에 따라 레트로바이러스와 같은 삽입성 바이러스 벡터를 통해 달성된다. 형질감염된 유전자는, 비록 다른 유전자들이 유도의 효율을 높여주는 것으로 제시되고 있으나, 마스터 전사 조절 유전자 Oct4 (Pouf51) 및 Sox2를 포함할 수 있다. 임계기 후에, 소수의 형질감염 세포는 형태학적으로 및 생화학적으로 만능 줄기 세포와 유사해지기 시작할 수 있으며 형태적 선택, 배가 시간을 통해서거나 리포터 유전자 및 항생물질 감염을 통해서 분리할 수 있다.
2007년 11월에 독립적인 두 연구팀의 연구 (Yu et al., 2007; Yamanaka et al., 2007)에 의해 성인 섬유아세포로부터 iPS를 생성함으로써 획기적인 업적이 이루어졌다. 좀 더 일찍이 마우스 모델에서 사용한 것과 동일한 원리로서, 야마나카는 레트로바이러스 시스템과 함께 동일한 4개의 핵심적인 유전자 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc를 사용하여 사람 섬유아세포를 만능 줄기 세포로 형질전환시키는데 성공하였지만, c-Myc는 발암성 유전자이다. 톰슨과 동료들은 c-Myc의 사용을 피하기 위해 렌티바이러스 시스템을 사용하여 Oct4, Sox2, NANOG 및 다른 유전자 LIN28을 사용하였다. 보다 최근에, iPS 세포로부터 생식력 있는 마우스가 생성되었으며, 따라서 iPS 세포가 본질적으로 어떠한 또는 모든 분화된 세포 유형도 형성하는 능력이 있음이 증명된 것이다 (Boland et al., 2009).
상기된 바와 같이 사람 피부 섬유아세포로부터의 만능 줄기 세포의 유도는 재프로그래밍 유전자의 이소성 발현을 위한 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 달성되어 왔다. 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스와 같은 재조합 레트로바이러스는 안정한 양상으로 숙주 게놈내로 삽입되는 능력을 지니고 있다. 이들 바이러스는 숙주 게놈내로 삽입되도록 해 주는 역전사효소를 함유한다. 레티바이러스는 레트로바이러스의 아부류이다. 이들 바이러스는 비분열 세포뿐만 아니라 분열 세포의 게놈내로 삽입되는 능력 덕택에 벡터로서 폭 넓게 응용되고 있다. RNA 형태의 바이러스 게놈은 이 바이러스가 세포내로 들어가 역전사하여 DNA를 생성한 다음 바이러스 인테그라제 효소에 의해 임의의 위치에서 게놈내로 삽입된다. 따라서, T 세포의 성공적인 재프로그래밍은 아래 실시예에서 보는 바와 같이 삽입-기반 바이러스 방식을 이용할 수 있다.
B. 에피솜 벡터
또한, 이들 재프로그래밍 방법은 외래 벡터 또는 바이러스 요소를 iPS 세포가 본질적으로 함유하지 않도록 에피솜 복제능을 갖는 벡터인 염색체외 복제 벡터 (즉, 에피솜 벡터)를 이용할 수 있다 (참조: 미국특허원 제61/058,858-이의 내용은 본원에 참조로 인용된다; Yu et al., 2009). 많은 DNA 바이러스 (예, 아데노바이러스, 원숭이 액포형성 바이러스 40 (SV40) 또는 소 유두종 바이러스 (BPV)) 또는 출아 효모 ARS (자가 복제 서열)-함유 플라스미드는 포유동물 세포에서 염색체외 또는 에피솜 복제한다. 이들 에피솜 플라스미드는 삽입성 벡터와 연관된 모든 단점 (Bode et al., 2001)과 본질적으로 거리가 멀다. 예를 들어, 엡스타인 바 바이러스 (EBV)를 포함한 림프영양성 헤르페스 바이러스 또는 EBV는 염색체외에서 복제하고 재프로그래밍 유전자가 체세포로 전달하는 것을 보조할 수 있다.
예를 들면, 본 발명에 사용된 플라스미드-기본 방법은 EBV 요소-기본 시스템의 성공적인 복제 및 유지를 위해 필요한 강력한 요소를, 아래에 상세히 기술된 바와 같이 임상 세팅에서 그 시스템의 편의성을 저해하지 않으면서, 추출할 수 있다. 본질적인 EBV 요소는 OriP와 EBNA-1 또는 이의 변이체 또는 기능적 균등체이다. 이 시스템의 추가적인 장점은 이들 외래 요소가 세포내로 도입된 후 시간이 경과하면서 소실되어 외래 요소를 전혀 함유하지 않아 결과적으로 자가-지속되는 iPS 세포가 생성된다는 것이다.
플라스미드- 또는 리포좀-기본 염색체외 벡터 (예, oriP-기본 벡터) 및/또는 EBNA-1의 유도체를 암호화하는 벡터의 사용은 거대 DNA 절편이 세포로 도입되고, 염색체외 유지되며, 세포주기당 1회 복제하고, 딸세포로 효율적으로 분배되도록 해 주며 실질적으로 면역 반응을 나타내지 않는다. 특히, oriP-기본 발현 벡터의 복제에 필요한 유일한 바이러스 단백질인 EBNA-1은 MHC 부류 I 분자상에 항원의 제시를 위해 필요한 과정을 우회하기에 효율적인 기전을 개발해 왔기 때문에 세포성 면역 반응을 나타내지 않는다 (Levitskaya et al., 1997). 또한, EBNA-1은 트랜스로 작용하여 클로닝된 유전자의 발현을 증가시킬 수 있으며, 일부 세포주에서 클로닝된 유전자의 발현을 100배까지 유도한다 (Langle-Rouault et al., 1998; Evans et al., 1997). 마지막으로, 그러한 oriP-기본 발현 벡터의 제조는 저렴하다.
다른 염색체외 벡터는 다른 림프영양성 헤르페스 바이러스-기본 벡터를 포함한다. 림프영양성 헤르페스 바이러스는 림프아구 (예, 사람 B 림프아구)에서 복제하는 헤르페스 바이러스이며 자연 생활 사이클의 일부 동안 플라스미드가 된다. 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV)는 "림프영양성" 헤르페스 바이러스가 아니다. 림프영양성 헤르페스 바이러스의 예는 이들로 한정되는 것은 아니지만 EBV, 카포시육종 헤르페스 바이러스 (KSHV); 헤르페스 바이러스 사이미리 (HS) 및 마렉병 바이러스 (MDV)를 포함한다. 또한, 에피솜-기본 벡터의 다른 소스(효모 ARS, SV40 또는 BPV)도 고려된다.
바이러스 유전자 전달로부터 잠재적 문제점을 피해가기 위해, 두 그룹이 공동 연구하여 올해 트랜스포손-기본 방법으로 바이러스 벡터를 사용하지 않으면서 사람 세포에서 다능성을 생성하는데 성공하였다고 발표하였다 (Woltjen et al., 2009; Kaji et al., 2009). 바이러스-유도된 2A 펩타이드 서열을 사용하여 재프로그래밍 인자를 포함한 다중시스트론 벡터를 형성하고 piggyBac 트랜스포손 벡터에 의해 세포로 전달하여 사람 및 마우스 섬유아세포 모두에서 안정한 iPS 세포가 생성되었다. 그런 다음, 설정된 iPS 세포주에서 필요하지 않은 2A-연결된 재프로그래밍 인자는 제거되었다. 이러한 전략들은 마찬가지로 본 발명의 특정 관점에서 T 세포 또는 조혈 전구 세포를 재프로그래밍하는데 응용할 수 있다.
C. 단백질 형질도입
외래 유전자 변형이 표적 세포로 도입되는 것을 피할 수 있는 한 가지 방법은 전달된 유전자로부터의 전사에 의존하기 보다 세포내로 직접 재프로그래밍 단백질을 전달하는 것이다. 이전 연구들은 다양한 단백질을 단백질 형질도입을 조정하는 짧은 펩타이드 (예, HIV tat 및 폴리-아르기닌)와 결합시켜 시험관내 및 생체내에서 세포내로 그 단백질을 전달할 수 있음을 증명하였다. 최근의 연구는 재조합 재프로그래밍 단백질의 직접적인 전달에 의해 뮤린 섬유아세포가 만능 줄기 세포내로 완전히 재프로그래밍될 수 있음을 증명하였다 (Zhou et al., 2009). 세포를 단백질 형질도입으로 재프로그래밍하는 방법에 대해 보다 세부적인 것은 미국특허원 제61/172,079에 기술되어 있고, 이 특허원의 내용은 본원에 참조로 인용된다.
본 발명의 특정 관점으로서, T 세포내로 재프로그래밍 단백질을 직접 도입하기 위해 단백질 형질도입 도메인을 사용할 수 있다. 단백질을 형질도입을 사용하여 세포내로 재프로그래밍 단백질의 전달을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, HIV Tat 단백질로부터 유도된 TAT 단백질의 영역을 표적 단백질과 융합시켜 그 표적 단백질이 세포내로 유입되도록 할 수 있다. 이들 형질도입 도메인의 융합을 이용하는 장점은 단백질 유입이 신속하고 농도-의존적이며 다른 세포 유형과 작동한다는데 있다.
본 발명의 추가의 관점으로서, 또한 핵 위치 서열을 사용하여 재프로그래밍 단백질의 핵 유입을 촉진할 수 있다. 여러 단백질을 위한 핵 위치 신호 (NLS)가 공개되어 있다. 핵으로 단백질의 이송 기전은 카리오페린의 알파 아단위에의 핵 위치 신호를 함유한 표적 단백질의 결합을 통한 것이다. 이 결합의 후속으로 표적 단백질:카리오페린 복합체가 핵공을 통해 핵내로 이송된다. 그러나, 재프로그래밍 단백질은 흔히 내인성 핵 위치 서열을 가질 수 있는 전사 인자이다. 따라서, 핵 위치 서열은 필요하지 않을 수 있다.
체세포내로 재프로그래밍 단백질의 직접적인 도입이 본 발명에서 사용될 수 있으며, 재프로그래밍 단백질은 단백질 형질도입 도메인 (PTD)에, 이러한 도메인을 포함한 융합 단백질을 형성함으로써 또는 재프로그래밍 단백질과 PTD를 각 분자상의 작용기를 통해 화학적으로 가교시킴으로써, 작동적으로 연결된다.
본원에 사용된 하나 이상의 전달성 재프로그래밍 단백질을 발현하는데 표준 재조합 핵산 방법을 사용할 수 있다. 한 가지 양태로서, 전도성 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 예를 들면 전사 및 번역을 위해 적절한 신호 및 프로세싱 서열과 조절 서열을 갖는 핵산 발현 벡터내로 클로닝한다. 다른 양태로서, 자동 유기 합성 방법을 이용하여 단백질을 합성할 수 있다.
추가로, 세포내로 단백질의 이송을 보조할 수 있는 몇 가지 방법이 있고, 이 가운데 한 가지 또는 둘 이상의 방법은 단독으로 사용되거나, 단백질 형질도입 도메인을 사용한 방법 (이들로 한정되는 것은 아니지만 미세주입법, 전기천공 및 리포좀의 이용을 포함함)과 조합하여 사용될 수 있다. 이들 방법의 대부분은 단백질의 정제된 제조를 필요로 할 수 있다. 재조합 단백질의 정제는 흔히 친화성 태그를 발현 작제물내로 삽입하여 정제 단계를 신속하고 효율적으로 진행함으로써 촉진된다.
VII. 벡터 작제 및 전달
특정 양태로서, 재프로그래밍 벡터는 상기된 재프로그래밍 인자를 암호화한 핵산 서열 이외에 추가의 요소를 세포에 포함하도록 작제될 수 있다. 이들 벡터의 성분 및 전달 방법에 대해 세부적인 것은 아래에 기술되어 있다.
A. 벡터
본 분야의 전문가는 표준 재조합 기술을 통해 벡터를 용이하게 작제할 수 있다 (참조 예: Maniatis et al., 1988 및 Ausubel et al., 1994-이들의 내용은 본원에 참조로 인용된다).
또한, 벡터는 유전자 전달 및/또는 유전자 발현을 추가로 조절하거나 표적 세포에 유익한 성질을 제공하는 다른 성분 또는 작용기를 포함할 수 있다. 이러한 성분은 예를 들면 세포에 결합하거나 세포를 표적화하는 것에 영향을 미치는 성분 (세포 유형 또는 조직 특이적 결합을 조정하는 성분을 포함함), 세포에 의한 벡터 핵산의 흡수에 영향을 미치는 성분, 흡수 후 세포내 폴리뉴클레오타이드의 위치에 영향을 미치는 성분 (예, 핵 위치 조절제) 및 폴리뉴클레오타이드의 발현에 영향을 미치는 성분을 포함한다.
이러한 성분은 또한 벡터에 의해 전달된 핵산을 흡수하고 발현하는 세포를 탐지 또는 선택하는데 사용될 수 있는 탐지 마커 및/또는 선택 마커와 같은 마커를 포함할 수 있다. 이러한 성분은 벡터의 자연적 특징 (예, 결합 및 흡수를 조정하는 성분 또는 작용기를 가질 수 있는 특정 바이러스 벡터의 이용)으로서 제공될 수 있거나, 벡터는 그러한 작용기를 제공하도록 변형될 수 있다. 이러한 벡터들은 아주 다양하게 본 분야에 알려져 있으며 일반적으로 이용가능하다. 벡터가 숙주 세포내에서 유지될 때, 이 벡터는 숙주 세포의 게놈내에 혼입된 자율적 구조로서 유사분열 동안에 세포에 의해 안정하게 복제될 수 있거나 숙주 세포의 핵 또는 세포질에서 유지될 수 있다.
B. 조절 요소
벡터에 포함된 진핵 발현 카세트는 특히 단백질-암호화 서열에 작동적으로 연결된 진핵 전사 프로모터, 개재 서열을 포함한 스플라이스 신호 및 전사 종결/폴리아데닐화 서열을 (5'에서 3' 방향으로) 함유한다.
i. 프로모터/인핸서
"프로모터"는 전사 개시 및 전사 속도를 조절하는 핵산 서열의 영역이다. 프로모터는 RNA 폴리머라제 및 다른 전사 인자와 같은 조절 단백질 및 분자가 결합하여 핵산 서열의 특정 전사를 개시할 수 있는 유전 요소를 함유할 수 있다. 용어 "작동적으로 위치한", "작동적으로 연결된", "조절하에" 및 "전사 조절하에"는 프로모터가 핵산 서열과 관련하여 작용상 정확한 위치 및/또는 배치되어 그 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 조절한다는 것을 의미한다.
본 발명의 EBNA 1-암호화 벡터에 사용하기에 적합한 프로모터는 EBNA 1 단백질을 암호화하는 발현 카세트의 발현을 지시하여 충분히 항상 상태 수준의 EBNA 1 단백질을 생성하여 EBV oriP-함유 벡터를 안정하게 유지하는 것이다. 또한, 프로모터는 재프로그래밍 인자를 암호화하는 발현 카세트의 효율적인 발현을 위해 사용된다.
프로모터는 일반적으로 RNA 합성을 위한 개시 부위의 위치를 잡아 주는 작용을 하는 서열을 포함한다. 이러한 서열로 가장 잘 알려진 예는 TATA 박스이지만, 일부 프로모터, 예를 들면 포유동물 말단 데옥시뉴클레오타이딜 트로스퍼라제 유전자의 프로모터 및 SV40 후기 유전자의 프로모터의 경우 TATA 박스가 없고, 특별한 요소가 출발 부위에 중첩하여 개시 장소가 고정되도록 협력한다. 추가의 프로모터 요소는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 비록 많은 프로모터들이 출발 부위로부터 하향한 위치에 작용 요소를 함유하는 것으로 밝혀졌지만, 전형적으로, 이들 요소는 출발 부위로부터 30-110 bp 상향한 영역에 위치한다. 암호 서열을 프로모터의 "조절하에" 두기 위해, 선택된 프로모터의 "하향"에 (즉, 3'에) 전사 번역 프레임의 전사 개시 부위의 5' 말단이 위치한다. "상향" 프로모터는 DNA의 전사를 자극하고 암호화된 RNA의 발현을 촉진한다.
프로모터 요소 사이의 공간은 흔히 유동적이므로 프로모터 기능은 요소들이 서로 역위되거나 이동될 때 보존된다. tk 프로모터의 경우, 프로모터 요소 사이의 공간은 활성이 감소하기 시작하기 전에 50 bp까지 증가할 수 있다. 프로모터에 따라, 개개 요소는 상호협력하여 또는 독립적으로 작용하여 전사를 활성화할 수 있는 것으로 나타난다. 프로모터는 핵산 서열의 전사 활성화에 연루된 시스-작동성 조절 서열을 가리키는 "인핸서"와 협력하여 사용될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다.
프로모터는 암호화 단편 및/또는 엑손의 상향에 위치한 5' 비-암호화 서열을 분리함으로써 수득할 수 있는 것처럼 핵산 서열과 천연적으로 결합된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"이라고 언급될 수 있다. 마찬가지로, 인핸서는 핵산 서열의 하향 또는 상향에 위치하여 그 핵산 서열과 천연적으로 결합된 것일 수 있다. 다르게는, 암호화 핵산 서열을 재조합 또는 이종 프로모터의 조절하에 배치함으로써 특정한 이점을 얻을 수 있고, 그러한 프로모터는 이의 천연 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 결합되지 않은 프로모터를 나타낸다. 재조합 또는 이종 인핸서 또한 이의 천연 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 결합되지 않은 인핸서를 가리킨다. 이와 같은 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자들의 프로모터 또는 인핸서, 다른 바이러스 또는 원핵 또는 진핵 세포로부터 분리된 프로모터 또는 인핸서 및 "천연적으로 존재"하지 않는, 즉 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소 및/또는 발현에 변경을 주는 돌연변이를 함유한 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 작제에서 가장 흔히 사용되는 프로모터는 β-락타마제 (페니실리나제), 락토즈 및 트립토판 (trp) 프로모터 시스템을 포함한다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 제조하는 것 이외에, 이들 서열은 본원에 기술된 조성과 관련하여, 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술 (PCRTM을 포함)을 사용하여 생성할 수 있다 (참조: 미국특허 제4,683,202호 및 제5,928,906호-이들의 내용은 본원에 참조로 인용된다). 또한, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비-핵 세포소기관내에서 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 조절 서열이 사용될 수 있음이 고려된다.
당연히, 발현을 위해 선택된 세포소기관, 세포 유형, 조직, 기관 또는 유기체에서 DNA 단편의 발현을 효과적으로 지시하는 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하는 것은 중요하다. 분자 생물학 분야의 전문가는 일반적으로 단백질의 발현을 위해 조합적으로 프로모터, 인핸서 및 세포 유형을 사용하는 것에 대해 알고 있다 (참조예: Sambrook et al., 1989-이의 내용은 본원에 참조로 인용된다). 사용된 프로모터는 도입된 DNA 단편의 고 수준 발현을 지시하기에 적절한 조건하에서 구성적, 조직-특이적, 유도적이고/이거나 유용할 수 있으며, 예를 들면 재조합 단백질 및/또는 펩타이드의 대량 생성에 유리하다. 프로모터는 이종 또는 내인성일 수 있다.
추가로, 어떠한 프로모터/인핸서 조합도 (예, www.epd.isb-sib.ch/을 통한 진핵세포 프로모터 데이터 베이스 EPDB) 발현을 가동하기 위해 사용될 수 있다. T3, T7 또는 SP6 세포질 발현 시스템의 사용은 또 다른 가능한 양태이다. 진핵세포는 전달 복합체의 일부로서 또는 추가의 유전자 발현 작제물로서 적절한 세균 폴리머라제가 제공되는 경우 특정 세균 프로모터로부터 세포질 전사를 진행할 수 있다.
프로모터의 비한정적인 예는 초기 또는 후기 바이러스 프로모터 (예, SV40 초기 또는 후기 프로모터, 사이토메갈로 바이러스 (CMV) 즉시 초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 초기 프로모터), 진핵세포 프로모터 (예, 베타 액틴 프로모터 (Ng, 1989; Quitsche et al., 1989), GADPH 프로모터 (Alexander et al., 1988, Ercolani et al., 1988), 메탈로티오네인 프로모터 (Karin et al., 1989; Richards et al., 1984) 및 연쇄적 반응 요소 프로모터 (예, 사이클릭 AMP 반응 요소 프모모터 (cre), 혈청 반응 요소 프로모터 (sre), 포르볼 에스테르 프로모터 (TPA) 및 최소 TATA 박스에 근접한 반응 요소 프로모터 (tre))를 포함한다. 또한, 사람 성장 호르몬 프로모터 서열 (예, Genbank 등록번호 X05244에서 기술된 사람 성장 호르몬 최소 프로모터, 뉴클레오타이드 283-341) 또는 마우스 유방암 프로모터 (ATCC 45007로서 입수가능함)를 사용하는 것도 가능하다. 특정 예는 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터일 수 있다.
ii. 프로테아제 절단 부위/자가-절단 펩타이드 및 내부 리보솜 결합 부위
특정 관점으로서, 본 발명에 따라 마커 또는 재프로그래밍 단백질을 암호화하는 유전자가 프로테아제 절단 부위 (즉, 프로테아제의 인식 부위를 포함한 서열) 또는 하나 이상의 자가-절단 펩타이드를 암호화하는 서열 (하나 이상일 수 있다)에 의해 서로 연결될 수 있다.
본 발명의 특정 양태에 따라, 폴리시스트론 메시지를 구성하는 유전자를 연결하는 서열(들)에 의해 암호화된 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된다. 특히, 프로테아제(들)를 암호화하는 유전자(들)는 폴리시스트론 메시지중 적어도 하나의 일부이다.
적합한 프로테아제 절단 부위 및 자가-절단 펩타이드는 전문가에게 알려져 있다 (참조예: Ryan et al., 1997; Scymczak et al., 2004). 프로테아제 절단 부위의 바람직한 예는 포티바이러스 NIa 프로테아제 (예, 담배 식각 바이러스 프로테아제), 포티바이러스 HC 프로테아제, 포티바이러스 P1 (P35) 프로테아제, 바이오바이러스 Nla 프로테아제, 바이오바이러스 RNA-2-암호화된 프로테아제, 아프토바이러스 L 프로테아제, 엔테로바이러스 2A 프로테아제, 리노바이러스 2A 프로테아제, 피코르나 3C 프로테아제, 코모바이러스 24K 프로테아제, 네포바이러스 24K 프로테아제, RTSV (벼 퉁그로 구형 바이러스) 3C-유사 프로테아제, PY/IF (파스닙 옐로우 플렉 바이러스) 3C-유사 프로테아제, 트롬빈, 인자 Xa 및 엔테로키나제의 절단 부위이다. TEV (담배 식각 바이러스) 프로테아제 절단 부위는 이의 높은 절단 엄밀도로 인해 사용될 수 있다.
예시적인 자가-절단 펩타이드 (또한, "시스-작용성 가수분해 요소" (CHYSEL)라고도 한다: 참조-deFelipe (2002))는 포티바이러스 및 카디오바이러스 2A 펩타이드로부터 유도된다. 특정 자가-절단 펩타이드는 FMDV (구제역 바이러스), 말 비염 A 바이러스, 토세아 아사인아 바이러스 및 돼지 테스코바이러스로부터 유도된 2A 펩타이드중에서 선택될 수 있다.
특정 개시 신호는 또한 다중시스트론 메시지에서 암호 서열의 효율적인 번역을 위해 사용될 수 있다. 이들 신호는 ATG 개시 코돈 또는 인접 서열을 포함한다. ATG 개시 코돈을 포함한 외래 번역 조절 신호가 제공될 필요가 있을 수 있다. 본 분야에 통상의 지식을 가진 자는 이것을 결정하고 필요한 신호를 제공할 수 있다. 개시 코돈은 목적하는 암호화 서열의 판독 프레임과 함께 이 전체 삽입체의 번역을 보장할 수 있도록 "프레임내"에 있어야 하는 것은 잘 알려져 있다. 외래 번역 조절 신호 및 개시 코돈은 천연 또는 합성일 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소의 삽입에 의해 증가될 수 있다.
본 발명의 특정 양태로서, 내부 리보솜 유입 부위 (IRES) 요소를 사용하여 다유전자 또는 다중시스트론 메시지를 생성한다. IRES 요소는 5' 메틸화 Cap 의존성 번역의 리보솜 스캐닝 모델을 우회하고 내부 부위에서 번역을 개시할 수 있다 (Pelletier and Sonenberg, 1988). 피코르나바이러스 과의 두 일원 (폴리오 및 뇌심근염)으로부터의 IRES 요소 (Pelletier and Sonenberg, 1988)뿐만 아니라 포유동물 메시지로부터의 IRES (Macejak and Sarnow, 1991)가 공개되어 있다. IRES 요소는 이종 개방 판독 프레임에 연결될 수 있다. 복수의 개방 판독 프레임은 각각 IRES에 의해 격리되어 있으면서 함께 전사되어 다중시스트론 메시지를 생성할 수 있다. IRES 요소로 인해, 각 개방 판독 프레임은 효율적인 번역을 위해 리보솜에 접근이 용이하다. 다수의 유전자들은 단일 프로모터/인핸서를 사용하여 단일 메시지를 전사하여 효율적으로 발현될 수 있다 (참조예: 미국특허 제5,925,565호 및 제5,935,819호-이의 내용은 본원에 참조로 인용된다).
iii. 다수 클로닝 부위
벡터는 다수의 제한 효소 부위를 함유한 핵산 영역인 다수 클로닝 부위 (MCS)를 포함할 수 있고, 그들 중 어떠한 것도 표준 재조합 기술과 함께 사용하여 그 벡터를 분해할 수 있다 (참조예: Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998 및 Cocea, 1997-이들의 내용은 본원에 참조로 인용된다). "제한 효소 분해"는 핵산 분자의 특정 위치에서만 작용하는 효소에 의한 핵산 분자의 촉매적 절단을 가리킨다. 이들 제한 효소중 많은 것들이 시판되고 있다. 이러한 효소의 사용은 본 분야의 전문가에게 널리 이해되고 있다. 흔히, 벡터는 외래 서열이 이 벡터에 연결되도록 MCS내에서 절단하는 제한 효소를 사용하여 직선형으로 되거나 절편된다. "연결"은 서로 인접할 수 있거나 인접하지 않을 수 있는 두 핵산 절편사이의 포스포디에스테르 결합을 형성하는 과정을 가리킨다. 제한 효소 및 연결 반응과 관련된 기술은 재조합 기술의 분야에 속하는 전문가에게 잘 알려져 있다.
iv. 스플라이싱 부위
대부분의 전사된 진핵세포 RNA 분자는 RNA 스플라이싱이 진행되어 일차 전사물로부터 인트론을 제거한다. 게놈 진핵 서열을 함유한 벡터는 단백질 발현을 위해 적절한 전사물 프로세싱을 보장하기 위해 공여 및/또는 수용 스플라이싱 부위를 필요로 할 수 있다 (참조예: Chandler et al., 1997-이의 내용은 본원에 참조로 인용된다).
v. 종결 신호
본 발명의 벡터 또는 작제물은 일반적으로 하나 이상의 종결 신호를 포함한다. "종결 신호" 또는 "종결자"는 RNA 폴리머라제에 의한 RNA 전사물의 특이적 종결에 연루된 DNA 서열로 구성된다. 따라서, 특정 양태로서, RNA 전사물의 생성을 종결시키는 종결 신호가 고려된다. 종결자는 원하는 메시지 수준을 달성하기 위해 생체내에서 필요할 수 있다.
진핵세포 시스템에서, 종결자 영역은 또한 폴리아데닐화 부위가 노출되도록 새로운 전사물의 부위-특정 절단을 허용하는 특이적 DNA 서열을 포함할 수 있다. 이것은 특화된 내인성 폴리머라제에 신호를 전달하여 전사물의 3' 말단에 약 200개 A 잔기의 연쇄 (폴리 A)를 부가한다. 이 폴리A 꼬리로 변형된 RNA 분자는 보다 안정화하고 더욱 효율적으로 번역된다. 따라서, 진핵세포와 연관된 다른 양태에서, 종결자는 RNA의 절단을 위한 신호를 포함하는 것이 바람직하며, 종결자 신호가 메시지의 폴리아데닐화를 촉진하는 것이 더욱 바람직하다. 종결자 및/또는 폴리아데닐화 부위 요소는 메시지 수준을 증가시키고 카세트로부터 다른 서열로의 판독을 최소화하는 역할을 한다.
본 발명에 사용하기 위해 고려되는 종결자는 본원에 기술되어 있거나 본 분야의 전문가에게 알려진 모든 종결자를 포함하며, 이들로 한정되는 것은 아니지만 예로는 소 성장 호르몬 종결자와 같은 유전자의 종결 서열 또는 SV40 종결자와 같은 바이러스 종결 서열을 들 수 있다. 특정 양태로서, 종결 신호는 예를 들어 서열 절단으로 인해 전사가능한 서열 또는 번역가능한 서열이 결손될 수 있다.
vi. 폴리아데닐화 신호
발현, 특히 진핵세포 발현에서, 전형적으로 전사물의 적절한 폴리아데닐화를 유도하는 폴리아데닐화 신호가 포함된다. 폴리아데닐화 신호의 성질은 본 발명의 성공적인 실시를 위해 중요한 것은 아니며, 어떠한 그러한 서열도 사용될 수 있다. 바람직한 양태는 다양한 표적 세포에서 편리하고 잘 작용하는 것으로 알려진 SV40 폴리아데닐화 신호 또는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 폴리아데닐화는 전사물의 안정성을 증가시킬 수 있거나 세포질 이송을 촉진할 수 있다.
vii. 복제원
벡터를 숙주 세포에서 증식시키기 위해, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 하나 이상의 복제원 부위 (흔히 "ori"라고 한다), 예를 들어 상기된 EBV의 oriP에 상응하는 핵산 서열 또는 유전자조작되어 분화 프로그래밍에서 유사하거나 향상된 기능을 갖는 oriP가 벡터에 함유될 수 있다. 대안으로서, 상기된 염색체외 복제 바이러스 또는 자가 복제 서열 (ARS)의 복제원이 사용될 수 있다.
viii. 선택 및 선별 마커
본 발명의 특정 양태로서, 본 발명의 핵산 작제물을 함유한 세포는 발현 벡터에 마커를 포함시킴으로써 시험관내에서 또는 생체내에서 동정할 수 있다. 이러한 마커는 세포에 동정가능한 변화를 부여하여 발현 벡터를 함유한 세포의 간편한 동정을 가능케 한다. 일반적으로, 선택 마커는 선택을 가능케 하는 성질을 부여하는 것이다. 양성 선택 마커는 마커의 존재가 선택을 허용하는 것인 반면, 음성 선택 마커는 마커의 존재가 선택을 억제하는 것이다. 양성 선택 마커의 예는 약물 내성 마커이다.
보통 약물 선택 마커의 삽입은 형질전환체의 클로닝 및 동정을 보조하며, 예로서 네오마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티디놀에 대해 내성을 부여하는 유전자가 유용한 선택 마커이다. 조건의 이행을 기초로 한 형질전환체의 분별을 허용하는 표현형을 부여하는 마커이외에, 색도 분석을 기초로 하는 GFP와 같은 선별 마커를 포함한 다른 유형의 마커들도 고려된다. 다르게는, 음성 선택 마커로서 선별 효소, 예를 들어 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제 (tk) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT)가 사용될 수 있다. 본 분야의 전문가는 또한 면역학적 마커를 가능한 FACS 분석과 함께 사용하는 방법을 알고 있다. 사용된 마커는 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 동시에 발현될 수 있는 한 중요한 것은 아니다. 선택 및 선별 마커의 추가적인 예는 본 분야의 전문가에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 한 가지 특징은 선택 및 선별 마커를 사용하여, 분화 프로그래밍 인자가 세포에서 목적하는 변화된 분화 상태에 영향을 미친 후, 무벡터 세포를 선택하는 것을 포함한다.
C. 벡터 전달
본 발명에 따라 체세포내로 재프로그래밍 벡터의 도입은, 본원에 기술된 바와 같은 또는 본 분야에 통상의 지식을 가진자에게 알려져 있는 바와 같이, 세포의 형질전환을 위해 핵산을 전달하는데 적합한 어떠한 방법도 사용할 수 있다. 이러한 방법은 이들로 한정되는 것은 아니지만 생체외 형질감염 (Wilson et al., 1989, Nabel et al., 1989)에 의한, 미세주입 (Harland and Weinstraub, 1985, 미국특허 제5,789,215호-각 내용은 본원에 참조로 인용된다)을 포함한 주입 (미국특허 제5,994,624호, 제5,981,274호, 5,945,100호, 제5,780,448호, 제5,736,524호, 제5,702,932호, 제5,656,610호, 제5,589,466호 및 제5,580,859호-각 내용은 본원에 참조로 인용된다)에 의한, 전기천공 (미국특허 제5,384,253호-이의 내용은 본원에 참조로 인용된다; Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984)에 의한, 인산칼슘 침전 (Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990)에 의한, DEAE-덱스트란에 이어서 폴리에틸렌 글리콜 (Gopal, 1985)을 사용함으로써, 직접적인 음파 부하 (Fechheimer et al., 1987)에 의한, 리포좀 조절된 형질감염 (Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991) 및 수용체-조절된 형질감염 (Wu and Wu, 1987; Wu and Wu, 1988)에 의한, 미세입자투사 (PCT 특허원 WO 94/09699 및 WO 95/06128; 미국 특허원 제5,610,042호, 제5,322,783호, 제5,563,055호, 제5,550,318호, 제5,538,877호 및 제5,538,880호-각 내용은 본원에 참조로 인용된다)에 의한, 탄화규소 섬유와의 교반(Kaeppler et al., 1990; 미국특허 5,302,523호 및 5,464,765호-각 내용은 본원에 참조로 인용된다)에 의한, 아그로박테리움-조절된 형질전환 (미국특허 제5,591,616호 및 제5,563,055호-각 내용은 본원에 참조로 인용된다)에 의한, 원형질체의 PEG-조절된 형질전환 (Omirulleh et al., 1993; 미국특허 제4,684,611호 및 제4,952,500호-각 내용은 본원에 참조로 인용됨)에 의한, 건조/억제-조절된 DNA 흡수 (Potrykus et al., 1985)에 의한, 상기 방법의 조합에 의한 DNA의 직접적인 전달을 포함한다. 이와 같은 기술의 응용을 통해, 세포소기관(들), 세포(들), 조직(들) 또는 유기체(들)은 안정하게 또는 일시적으로 형질전환될 수 있다.
i. 리포솜-조절된 형질감염
본 발명의 특정 양태로서, 핵산은 예를 들어 리포솜과 같은 지질 복합체내에 포획될 수 있다. 리포솜은 인지질 이층 막과 내부의 수성 매질로 특징되는 액포 구조일 수 있다. 다층 리포솜은 수성 매질로 격리된 다중 지질층을 갖는다. 이들은 인지질이 다량의 수용액중에 현탁될 때 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 밀폐 구조의 형성전에 자가-재배열을 이루고 물과 용해된 용질을 지질 이층 사이에 포획한다 (Ghosh and Bachhawat, 1991). 또한, 리포펙타민 (Gibco BRL) 또는 슈퍼펙트 (Qiagen)와의 핵산 복합체가 고려된다. 리포솜의 사용량은 리포솜의 성질뿐만 아니라 사용된 세포에 따라 다양할 수 있으며, 예를 들어 세포 한개 내지 천만개 당 약 5 내지 약 20 ㎍의 벡터 DNA가 고려될 수 있다.
시험관내 외래 DNA의 리포솜-조절된 핵산 전달 및 발현은 아주 성공적이었다 (Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987). 또한, 배양된 닭 배아, HeLa 및 간암 세포에서 외래 DNA의 리포솜-조절된 전달 및 발현의 가능성이 입증되었다(Wong et al., 1980).
본 발명의 특정 양태로서, 리포솜이 혈구응집 바이러스 (HVJ)와 복합체를 형성할 수 있다. 이것은 세포막과의 융합을 촉진하고 리포솜-캡슐화된 DNA의 세포 유입을 증강시키는 것으로 제시되었다 (Kaneda et al., 1989). 다른 양태로서, 리포솜은 핵 비-히스톤 염색체 단백질 (HMG-1)과 복합체를 형성하거나 그와 함께 사용될 수 있다 (Kato et al., 1991). 추가의 양태로서, 리포솜은 HVJ와 HMG-1 모두와 복합체를 형성하거나 이들과 함께 사용될 수 있다. 다른 양태로서, 전달 비히클은 리간드 및 리포솜을 포함할 수 있다.
ii. 전기천공
본 발명의 특정 양태로서, 전기천공을 통해 핵산이 세포내로 도입된다. 천기천공은 고전압 방전에의 세포와 DNA의 현탁액의 노출을 포함한다. 수용체 세포는 기계적 손상에 의한 형질전환에 더 민감해 질 수 있다. 또한, 벡터의 사용량은 사용된 세포의 성질에 따라 다양할 수 있으며, 예를 들어 세포 한개 내지 천만개 당 약 5 내지 약 20 ㎍의 벡터 DNA가 고려될 수 있다.
전기천공을 이용한 진핵 세포의 형질감염은 아주 성공적이었다. 이 방법으로, 마우스 전-B 림프구가 사람 카파-면역글로불린 유전자로 형질감염되었고 (Potter et al., 1984), 랫트 간세포가 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자로 형질감염되었다 (Tur-Kaspa et al., 1986).
iii. 인산칼슘
본 발명의 다른 양태로서, 인산칼슘 침전을 이용하여 핵산을 세포로 도입한다. 이 기술을 사용하여 사람 KB 세포가 아데노바이러스 5 DNA로 형질감염되었다 (Graham and Van Der Eb, 1973). 또한, 이 방법으로, 마우스 L(A9), 마우스 C127, CHO, CV-1, BHK, NIH3T3 및 HeLa 세포가 네오마이신 마커 유전자로 형질감염되었고 (Chen and Okayama, 1987), 랫트 간세포가 여러 가지 마커 유전자로 형질감염되었다 (Rippe et al., 1990).
iv. DEAE-덱스트란
다른 양태로서, DEAE-덱스트란이 이어서 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 핵산을 세포내로 전달하였다. 이 방법으로, 리포터 플라스미드가 마우스 골수종 및 적백혈병 세포내로 도입되었다 (Gopal, 1985).
v. 음파 부하
본 발명의 추가적인 양태는 직접적인 음파 부하에 의한 핵산의 도입을 포함한다. LTK- 섬유아세포는 음파 부하에 의해 티미딘 키나제 유전자로 형질감염되었다 (Fechheimer et al., 1987).
vi. 수용체-조절된 형질감염
추가적으로, 수용체-조절된 전달 비히클을 통해 핵산이 표적 세포에 전달될 수 있다. 이들은 표적 세포에서 일어나는 수용체-조절된 내포작용에 의한 거대분자의 선택적 흡수를 이용한다. 여러 가지 수용체의 세포 유형-특이적 분배 측면에서, 이 전달 방법은 본 발명에 다른 특이성 정도를 부가한다.
특정한 수용체-조절된 유전자 표적 비히클은 세포 수용체-특이적 리간드 및 핵산-결합제를 포함한다. 다른 비히클은 전달될 핵산이 작동적으로 연결된 세포 수용체-특이적 리간드를 포함한다. 몇 가지 리간드는 이 기술의 작동성을 설정하는 수용체-조절된 유전자 전달 (Wu and Wu, 1987; Wagner et al., 1990; Perales et al., 1994; Myers, EPO 0273085)을 위해 사용되었다. 다른 포유류 세포 유형과 관련하여 특정 전달이 발표되었다 (Wu and Wu, 1993-이의 내용은 본원에 참조로 삽입된다). 본 발명의 특정 관점으로서, 리간드는 표적 세포군에 특이적으로 발현된 수용체에 상응하는 것으로 선택한다.
다른 양태로서, 세포-특이적 핵산 표적 비히클의 핵산 전달 비히클 성분은 리포솜과 조합하여 특이적 결합 리간드를 포함할 수 있다. 전달된 핵산(들)은 리포솜내에 수용되고 특이적 결합 리간드는 작용상 리포솜 막내로 혼입된다. 따라서, 리포솜은 표적 세포의 수용체(들)와 특이적으로 결합하고 내용물을 세포로 전달한다. 이러한 시스템은 예를 들어 상피 성장 인자 (EGF)가 EGF 수용체의 상향조절를 나타내는 세포로 핵산의 수용체-조절된 전달에 사용되는 시스템을 사용하여 작용하는 것으로 제시되었다.
추가의 양태로서, 표적된 전달 비히클의 핵산 전달 비히클 성분은 리포솜 자체일 수 있으며, 이것은 특히 세포-특이적 결합을 지시하는 하나 이상의 지질 또는 당단백질을 포함한다. 예를 들어, 락토실-세라마이드 (갈락토즈-말단 아시알강글리오사이드)가 리포솜내로 혼입되어 간세포에 의한 인슐린 유전자의 흡수가 증가한 것이 관찰되었다 (Nicolau et al., 1987). 유사한 방식으로 본 발명의 조직-특이적 형질전환 작제물을 표적 세포내로 특이적으로 전달할 수 있음이 고려된다.
vii. 미세입자투사
미세입자투사 기술을 사용하여 핵산을 하나 이상의 세포소기관, 세포, 조직 또는 유기체내로 도입할 수 있다 (미국특허 제5,550,318호, 제5,538,880호, 제5,610,042호 및 PCT 특허원 WO 94/09699-이의 각 내용은 본원에 참조로 인용된다). 이 방법은 DNA-피복된 미세입자를 고속으로 가속하여 이들 입자가 세포막을 천공시키고 세포를 사멸시키지 않으면서 세포에 유입하는 능력에 의해 좌우된다 (Klein et al., 1987). 본 분야에 다양한 미세입자투사 기술이 알려져 있으며 이 가운데 많은 것들이 본 발명에 응용가능하다.
미세입자투사에서, 하나 이상의 입자는 적어도 하나의 핵산으로 피복되고 추진력에 의해 세포내로 전달될 수 있다. 작은 입자를 가속시키는 장치가 몇 가지 개발되었다. 이러한 한 가지 장치는 전류를 생성하는 고전압 방전을 기초로 하며, 생성된 전류는 추진력을 제공한다 (Yang et al., 1990). 사용된 미세입자는 텅스텐 또는 금 입자 또는 비드와 같은 생물학적 불활성 물질로 구성된다. 입자의 예는 텅스텐, 백금 및 특히 금으로 이루어진 것을 포함한다. 일부 경우에 금속 입자상에 DNA 침전이 미세입자투사를 이용한 수용체 세포로의 DNA 전달을 위해 필요하지 않을 수 있음이 고려된다. 그러나, 입자는 DNA로 피복되기 보다는 DNA를 함유할 수 있음이 고려된다. DNA-피복된 입자는 입자투사를 통해 DNA 전달의 수준을 증가시킬 수 있지만, 자체적으로는 필요하지 않다.
투사시, 현탁액중의 세포는 필터 또는 고체 배양 배지에서 농축된다. 대안으로서, 미성체 배아 또는 다른 표적 세포는 고체 배양 배지에서 정렬될 수 있다. 투사될 세포는 미세입자 정지판 아래의 적당한 거리에 위치한다.
VIII. iPS 세포의 선택
본 발명의 특정 관점으로서, 하나 이상의 재프로그래밍 인자가 체세포내로 도입된 후, 세포는 증식을 위해 배양된다 (임의로 양성 선택 또는 선택 마커와 같은 벡터 요소의 존재에 대해 선택하여 형질감염된 세포를 농축한다). 재프로그래밍 벡터는 이들 세포에서 재프로그래밍 인자를 발현하고 세포 분열에 따라 복제하고 분배할 수 있다. 대안으로서, 재프로그래밍 단백질을 함유한 배지를 보충함으로써 재프로그래밍 단백질이 이들 세포 및 자손내로 유입될 수 있다. 이들 재프로그래밍 인자는 체세포 게놈을 재프로그래밍하여 자가-지속적인 만능 상태를 설정하고, 벡터의 존재에 대한 양성 선택의 제거 내내 또는 후에 외래 유전자 요소가 점차 소실되거나 재프로그래밍 단백질을 첨가할 필요가 없다.
이들 유도된 만능 줄기 세포는 배아 줄기 세포 특징을 기초로 하여 그들 T 세포 또는 조혈 전구 세포로부터 유도된 자손으로부터 선택될 수 있고, 그 이유는 이들 유도 세포는 만능 배아 줄기 세포와 실질적으로 동일할 것으로 예상되기 때문이다. 또한, 재프로그래밍 벡터 DNA의 부재를 시험하거나 리포터와 같은 선택 마커를 사용함으로써 추가적인 음성 선택 단계를 사용하여 외래 유전자 요소가 실질적으로 없는 iPS 세포의 선택을 가속화하거나 보조할 수 있다.
A. 배아 줄기 세포 특징에 대한 선택
이전 연구로부터 성공적으로 생성된 iPSC는 아래의 관점에서 천연-분리된 만능 줄기 세포 (예, 마우스 배아 줄기 세포 (mESC) 및 인간 배아 줄기 세포 (hESC))와 상당히 유사하였고, 이에 따라 천연-분리된 만능 줄기 세포에 대한 iPSC의 동일성, 진본성 및 다능성을 검증하였다. 따라서, 본 발명에 기술된 방법으로부터 생성된 유도 만능 줄기 세포는 아래의 배아 줄기 세포 특징중 하나 이상을 기초로 하여 선택할 수 있다.
i. 세포학적 생물학적 성질
형태학: iPSC는 형태학적으로 ESC와 유사하다. 각 세포는 둥근 모양을 갖고, 이중 핵 또는 거대 핵을 갖고, 세포질이 빈 상태일 수 있다. 또한, iPSC의 콜로니가 ESC의 콜로니와 유사하다. 사람 iPSC는 hESC와 유사하게 가장자리가 예리하고, 편평하며, 조밀하게 다져진 콜로니를 형성하고, 마우스 iPSC는 mESC와 유사하게 hESC의 것보다 덜 편평하고 더 응집된 콜로니를 형성한다.
성장 특성: 줄기 세포는 이들을 정의하는 일부분으로서 자기-재생해야하기 때문에, 배가 시간 및 유사분열 활성은 ESC의 초석이 된다. iPSC는 ESC와 동일한 속도로 유사분열, 자기-재생, 증식 및 분열이 활발하다.
줄기 세포 마커: iPSC는 ESC상에서 발현된 세포 표면 항원 마커를 발현할 수 있다. 사람 iPSC는 hESC에 특이적인 마커를 발현하였고, 이들로 한정하는 것은 아니지만 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E 및 Nanog를 포함한다. 마우스 iPSC는 mESC와 유사하게 SSEA-1을 발현하였지만 SSEA-3과 SSEA-4는 발현하지 않았다.
줄기 세포 유전자: iPSC는 미분화된 ESC에 발현된 유전자를 발현할 수 있으며 Oct4, Sox2, Nanog, GDF3, REX1, FGF4, ESG1, DPPA2, DPPA4 및 hTERT를 포함한다.
텔로머라제 활성: 텔로머라제는 약 50회 세포 분열의 헤이플릭 분열한계로 제한된 세포 분열을 지속시키는데 필요하다. hESC는 고도의 텔로머라제 활성을 발현하여 자기-재생 및 증식을 지속하며, iPSC 또한 고도의 텔로머라제 활성을 증명하고 텔로머라제 단백질 복합체에 필요한 성분인 hTERT (사람 텔로머라제 역전사효소)를 발현한다.
다능성: iPSC는 ESC와 유사한 양상으로 완전히 분화된 조직으로 분화할 수 있다.
신경세포 분화: iPSC는 신경세포로 분화할 수 있고, βIII-튜불린, 티로신 하이드록실라제, AADC, DAT, ChAT, LMX1B 및 MAP2를 발현한다. 카테콜아민-연관된 효소의 존재는 iPSC가 hESC 처럼 도파민성 신경세포로 분화할 수 있음을 가리킨다. 줄기 세포-연관된 유전자는 분화 후 하향조절된다.
심장 분화: iPSC는 자발적으로 박동하기 시작하는 심근세포로 분화할 수 있다. 심근세포는 cTnT, MEF2C, MYL2A, MYHCβ 및 NKX2.5를 발현한다. 줄기 세포-연관된 유전자는 분화 후 하향조절된다.
기형종 형성: 면역결핍 마우스내로 주사된 iPSC는 특정 시간 후 (예, 9 주) 자발적으로 기형종을 형성할 수 있다. 기형종은 세 가지 배엽층 (내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 유도된 조직을 함유한 다중 계통의 종양이고; 이것은 전형적으로 단지 하나의 세포 유형인 다른 종양과 다르다. 기형종 형성은 다능성을 위한 표지 시험이다.
배아유사체: 배양중의 hESC는 활발히 유사분열하고 분화하는 hESC의 중심과 세 가지 모든 배엽층으로부터 완전히 분화된 세포의 주변으로 구성된 "배아 유사체"라고 하는 공-유사, 배아-유사 구조를 자발적으로 형성한다. iPSC 또한 배아유사체를 형성할 수 있으며 말초 분화 세포를 갖는다.
배반포 주사: hESC는 배반포의 내부 세포 덩어리 (배아모체)에 내재하고 배아로 분화하는 한편 배반포의 외막 (영양막)은 배외조직으로 분화한다. 공동 영양막은 살아있는 배아를 형성할 수 없으며 따라서 배아모체내의 배아 줄기 세포가 분화하여 배아를 형성하는 것이 필요하다. 수혜 암컷에 전달된 배반포를 발생하기 위해 영양막내로 마이크로피펫에 의해 주사된 iPSC는 살아있는 키메라 마우스 새끼로 나타날 수 있다: iPSC 유도체가 10%-90 및 키메리즘으로 몸체 전반에 걸쳐 혼입된 마우스.
ii. 후생적 재프로그래밍
프로모터 탈메틸화: 메틸화는 DNA 염기에 메틸기의 전달, 전형적으로 CpG 부위 (인접한 시토신/구아닌 서열)에서 시토신 분자에의 메틸기의 전달이다. 유전자의 광범위한 메틸화는 발현 단백질의 활성을 억제함으로써 또는 발현을 차단하는 효소를 모집함으로써 발현을 차단한다. 따라서, 유전자의 메틸화는 전사를 억제함으로써 유전자를 효과적으로 발현억제시킨다. Oct4, Rex1 및 Nanog를 포함한 다능성-연관된 유전자의 프로모터가 iPSC에서 탈메틸화될 수 있으며, iPSC에서 그들 유전자의 프로모터 활성 및 다능성-연관된 유전자의 활발한 작동 및 발현을 보여준다.
히스톤 탈메틸화: 히스톤은 다양한 염색질-관련된 변형을 통해 히스톤 단백질의 활성에 영향을 미칠 수 있는 DNA 서열과 구조적으로 결합되어 있는 조밀한 단백질이다. Oct/4, Sox2 및 Nanog와 연관된 H3 히스톤을 탈메틸화하여 Oct4, Sox2 및 Nanog의 발현을 활성화할 수 있다.
IX. iPS 세포의 배양 및 분화
공개된 방법을 사용하여 체세포를 재프로그래밍 인자로 처리한 후, 이들 체세포는 다능성을 유지하기에 충분한 배지에서 배양할 수 있다. 본 발명에서 생성된 유도된 만능 줄기 (iPS) 세포의 배양은 미국특허원 20070238170 및 미국특허원 20030211603에 기술된 바와 같이 영장류 만능 줄기 세포, 특히 배아 줄기 세포를 배양하기 위해 개발된 여러 가지 배지 및 기술을 사용할 수 있다. 본 분야의 전문가에 알려져 있는 바와 같이 사람 만능 줄기 세포의 배양 및 유지를 위한 추가의 방법이 본 발명과 관련하여 이용될 수 있다.
특정 양태로서, 규명되지 못한 조건들이 사용될 수 있고; 예를 들어, 만능 줄기 세포를 미분화 상태로 유지하기 위해 섬유아세포 영양 세포 또는 이러한 세포에 노출된 배지에서 그 만능 줄기 세포를 배양할 수 있다. 다른 방법으로서, 규명된 영양 세포-독립성 배양 시스템, 예를 들어, TeSR 배지 (Ludwig et al., 2006; Ludwig et al., 2006)를 사용하여 근본적으로 미분화된 상태로 만능 세포를 배양하고 유지할 수 있다. 영양 세포-독립성 배양 시스템 및 배지는 만능 세포를 배양하고 유지하는데 사용할 수 있다. 이들 방법은 사람 배아 줄기 세포가 마우스 섬유아세포 "영양 세포 층"에 대한 요구 없이 근본적으로 미분화된 상태로 남아있도록 한다. 본원에 기술된 바와 같이, 이들 방법에 필요에 따라 비용을 줄이기 위해 여러 가지 변형을 가할 수 있다.
예를 들어, 사람 배아 줄기 (hES) 세포처럼 iPS 세포는 80% DMEM (Gibco #10829-018 또는 #11965-092), 열불활성화되지 않은 20% 규명 소태아 혈청 (FBS) (또는 사람 AB 혈청), 1% 비-필수 아미노산, 1 mM L-글루타민 및 0.1 mM β-머캅토에탄올중에 유지될 수 있다. 대안으로서, iPS 세포는 80% 녹아웃 DMEM (Gibco #10829-018), 20% 혈청 대체물 (Gibco #10828-028), 1% 비-필수 아미노산, 1 mM L-글루타민 및 0.1 mM β-머캅토에탄올로 구성된 무혈청 배지에서 유지될 수 있다. 사용하기 직전, 사람 bFGF를 약 4 ng/mL의 최종 농도로 첨가할 수 있거나, 실시예에서와 같이 제브라피쉬 bFGF를 대신 사용할 수 있다.
여러 가지 매트릭스 성분이 사람 만능 줄기 세포를 배양하고 유지하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, Ludwig et al. (2006a; 2006b)에 기술된 바와 같이, 콜라겐 IV, 피브로넥틴, 라미닌 및 비트로넥틴을 조합하여 사용하여 만능 세포 성장을 위한 고체 지지체를 제공하는 수단으로서 배양 표면을 피복할 수 있고, 상기 문헌의 내용은 본원에 참조로 인용된다.
또한, 매트리젤TM을 사용하여 사람 만능 줄기 세포의 세포 배양 및 유지를 위한 기질을 제공할 수 있다. 매트리젤TM은 마우스 종양 세포에 의해 분비된 젤라틴 단백질 혼합물이며 BD Biosciences (미국 뉴저지 소재)로부터 시판되고 있다. 이 혼합물은 많은 조직에서 발견된 복합 세포외 환경과 유사하며 세포 배양을 위한 기질로서 세포 생물학자에 의해 사용된다.
ES 세포처럼 IPS 세포는 SSEA-1, SSEA-3 및 SSEA-4에 대한 항체 (Developmental Studies Hybridoma Bank, National Institute of Child Health and Human Development, Bethesda Md.) 및 TRA-1-60 및 TRA-1-81 (Andrews et al., 1987)를 사용한 면역조직화학 또는 유세포분석에 의해 동정 또는 검증될 수 있는 특징적인 항원을 갖는다. 배아 줄기 세포의 다능성은 약 0.5-10 x 106개 세포를 8-12 주령 숫컷 SCID 마우스의 뒷다리 근육내로 주사함으로써 검증될 수 있다. 기형종이 발생하며 이는 세 가지 배엽층 각각의 세포 유형 하나 이상을 증명한다.
본 발명에서 다양한 방법을 사용하여 iPS 세포를 이들로 한정되는 것은 아니지만 조혈 세포, 근세포 (예, 심근세포), 신경세포, 섬유아세포 및 상피세포를 포함한 세포 계통 및 이로부터 유도된 조직 또는 기관으로 분화시킬 수 있다. iPS 세포의 조혈 분화의 예시적인 방법은 예를 들어 미국특허원 제61/088,054호 및 제61/156,304호 (이들의 전체 내용은 본원에 참조로 인용된다)에 기술된 방법 또는 배아유사체 (EB)-기초한 방법 (Chadwick et al., 2003; Ng et al., 2005)을 포함할 수 있다. 또한, Wang et al., 2007에 예시된 바와 같이 피브로넥틴 분화 방법이 혈액 계통 분화를 위해 사용될 수 있다. iPS 세포의 심장 분화의 예시적인 방법은 배아유사체 (EB) 방법 (Zhang, et al., 2009), OP9 간질 세포 방법 (Narazaki, et al., 2008) 또는 성장 인자/화학적 방법 (참조: 미국특허 공개 20080038820, 20080226558, 20080254003 및 20090047739-이들의 전체 내용은 본원에 참조로 인용된다)을 포함할 수 있다.
X. 실시예
아래 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 증명하기 위해 포함된다. 본 분야의 전문가라면 아래 실시예를 통해 공개된 기술이 본 발명자에 의해 개발된 기술을 대표하여 본 발명을 실시하는데 잘 활용할 수 있음에 따라 본 발명의 실시를 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 고려될 수 있음은 인정할 것이다. 그러나, 본 분의 전문가는 본원에 기술된 내용의 측면에서 기술된 특정 양태에서 많은 변화가 이루어질 수 있으며 이러한 변화는 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 동일하거나 유사한 결과를 제공할 수 있음을 이해할 것이다.
실시예 1.
PBMC 분획으로의 백혈구채집 공정
단핵 세포를 농축하고 적혈구 세포의 양을 약 125 ㎖의 용적으로 한정하기 위해 원심력장을 통해 8 리터의 말초혈액이 순환된 공정으로부터 백혈구채집 시료 (류코팩)가 유도되었다. 추가로 류코팩을 다음과 같이 처리하였다: 류코팩 낭의 한쪽 끝을 알코올 스왑으로 닦고 면도날로 절개하여 플라스크로 따라냈다. 한크 용액으로 용량을 약 500 ㎖로 희석한 다음 50 ㎖ 용량의 튜브 16 내지 29개에 튜브당 30 ㎖로 분취하였다. 튜브를 30분 동안 정지와 가속 없이 400 g로 회전시켰다. 백색 액체를 흡인하고 새로운 50 ㎖ 튜브를 반쯤 채운 다음 25 ㎖ PBS를 넣어 마무리하였다. 이 과정을 총 3회의 세척을 위해 2회 더 반복하였다. 마지막 세척 전에 혈구계수기를 사용하여 세포를 계수하였다. 1x108 세포/튜브로 30 내지 60개 튜브가 수득되었다.
전혈을 처리하기 위해 항응고제를 함유한 튜브 또는 CPT 튜브에 채혈을 모았다. CPT 튜브에 의해 수득된 혈액 시료를 처리하는 과정을 개략적으로 설명하여, 간단하게 상층 (혈장)의 약 7 내지 8 ㎖를 50 ㎖ 멸균 튜브로 옮긴다. 무칼슘 PBS로 50 ㎖로 희석한다. 뒤집어서 혼합한다. 300 RCF로 15분간 원심분리한다. 펠렛을 교란시키지 않으면서 상청액의 약 95%를 제거한다. 상청액을 별도의 50 ㎖ 튜브로 옮긴다. 튜브를 두드려 펠렛을 가볍게 재현탁시킨다. 무칼슘 PBS 20 ㎖를첨가한다. 뒤집어서 혼합시킨다. 절반 (약 10 ㎖)을 15 ㎖ 튜브로 옮긴다. 두 튜브를 300 RCF로 15분간 원심분리한다. 펠렛을 교란시키지 않으면서 가능한 상청액을 많이 제거한다. 50 ㎖ 튜브에서 펠렛을 T 세포에 적합한 배지 (AIM-V 기본 배지) 또는 CD34 배지 (스템 프로 기본 배지) 2 ㎖로 아래 기술된 바와 같이 재현탁시키고 세덱스 세포 계수기를 사용하여 생세포를 계수한다.
혈액 시료가 EDTA와 같은 항응고제를 함유한 튜브에 수집되는 경우, 공정 단계는 적혈구 세포의 용해에 이어 혈액 시료로부터 PBMC의 피콜 구배 분리를 포함하며, 시료를 먼저 동일 용량의 무 칼슘-마그네슘 PBS로 희석한다. 적혈구를 제조업자의 지침에 따라 ACK 완충액 (Invitrogen)을 사용하여 용해시킨다. 적혈구가 없는 세포 현탁액을 세척하고 류코팩 시료에 대해 상기한 바와 같이 피콜 구배로 계층시킨다. 버피코트로부터 PBMC를 수득하고, 무 칼슘-마그네슘 PBS를 사용하여 다시 세척한 다음, T 세포에 적합한 배지 (AIM-V 기본 배지) 또는 CD34 배지 (스템 프로 기본 배지)에 재현탁시킨다.
실시예 2
T 세포 활성화 및 증식
말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 Biological Specialty Corp (Colmar, PA)의 공여자 #33231 ("공여자 A")로부터 획득하였다. 백혈구 팩을 상기된 바와 같이 림프구 분리 배지 (Cellgro)로 처리하여 PBMC를 수득하고, 이를 분획으로 동결한 다음, 액체 질소에 저장하였다. 분획을 해동하고 신선하게 제조된 AIM-V 배지 + pen/strep/글루타민 (AIV-V/ps/s/g 배지) (Invitrogen) + 300 IU/㎖ rhIL2 (Peprotech) 및 10 ng/㎖ 용해성 항-CD3 항체 (OKT3 클론, eBiosciences)중에서 증식시켰다. 활성화 후 7일 경과하여 CEDEX 세포 계수에 의해 지수 성장을 검증하였다. 배양 3일 후 세포를 T-세포 표현형을 검정한 다음 재프로그래밍 인자를 도입하였다. 한 가지 실험에서 평판 배양 이전 또는 도입 후 T-세포 표현형이 확인되지 않았다. 이러한 T-세포 활성화 실험을 수회 반복하였고 결과는 일관되게 동일하였다-활성화 후 및 도입 후 T 세포가 배양물의 90% 이상을 차지하였다. 재프로그래밍 인자(들)가 도입된 것은 T-세포였음이 확인되었다.
표 1은 T-세포 활성화 및 증식 과정의 세부내용을 보여준다. PBMC 바이알을 해동시켜 75 x 106 세포 (약 3개 바이알)을 수집하였다. 각 PBMC 바이알의 내용물을 7 ㎖ AIM-V/p/s/g 배지에 첨가하였다. 세포 현탁액을 1200 rpm으로 4분간 원심분리하였다. 펠렛을 10 ㎖ AIM-V+p/s/g중에 재현탁시켰다. 세포 농도를 총 28 ㎖중의 1x106 세포/㎖ 및 총 25 ㎖중의 2x106 세포/㎖로 조정하였다. IL2 (300 IU/㎖) 및 OKT3 (10 ng/㎖)를 세포 현탁액에 첨가하고 혼합하였다. 각 농도의 세포를 24-웰 조직 배양 평판에 웰당 1.5 ㎖로 적용하고 37℃에서 배양하였다. 1x106 세포/㎖ (1.5 ㎖/웰)의 18개 웰 및 2x106 세포/㎖ (1.5 ㎖/웰)의 16개 웰을 사용하였다. 세포를 계수하고 0일로 기록하였다. 0일 세포 수를 3일째 및 4일째의 세포 수와 비교하여 지수 증식을 확인하였다.
Figure 112012001096283-pct00001

실시예 3
레트로바이러스 제조
레트로바이러스 벡터 Nanog RFP, Lin28 RFP, Oct4 eGFP 및 Sox2 eGFP를 공지된 바와 같이 작제하였다 (참조: 미국특허원 제61/088,054호-이의 내용은 본원에 참조로 인용된다). 유사하게, 레트로바이러스 벡터 c-Myc RFP, Klf4 RFP, Oct4 eGFP 및 Sox2 eGFP를 작제하였다. c-Myc 발현의 가능한 독성 효과를 소멸시키기 위해 레트로바이러스 벡터 SV40 대형 T 유전자 (SV40LT)-RFP를 작제하고 일부 조합으로 사용할 수 있다 (Yu et al., 2009).
표 2는 293T 세포 제조 과정의 세부 내용을 보여준다: 세포를 형질감염 약 24시간 전에 파종하였다. 실험의 수행을 위해 적절한 용량의 바이러스 상청액을 획득하기 위해 필요한 세포 수를 계산하였다. 배지를 흡인하고 293T 평판을 5 ㎖ PBS로 세척한 다음, 흡인하였다. 10 cm 평판당 1 ㎖의 0.05% 트립신/EDTA를 첨가하고 균일하게 분배하였다. 평판을 실온에서 2 내지 5분간 배양하고 손으로 또는 후드벽에 확실하게 두드려 세포를 탈리하고 4 ㎖의 D10F를 첨가하였다. 293T 세포를 분쇄 (피펫팅 3-4 회)하여 단세포 현탁액을 확보하고 15 ㎖ 코니칼 튜브로 옮겼다. CEDEX 세포 계수기로 계수하기 위해 300 ㎕의 293T 세포를 제거하였다. 세포 농도를 D10F 배지에서 5x105 세포/㎖로 조정하였다. 10 ㎖의 세포 현탁액을 실험에 필요한 각 10 cm 평판에 적용하였다 (5x106 세포/평판).
Figure 112012001096283-pct00002
레트로바이러스 제조를 위한 일시적 형질감염: 293T 세포를 10 cm 접시당 5x106 세포로 파종하고 밤새 배양하였다. 다음날, PEI (Sigma) 친지질성 시약 및 OptiMEM (Invitrogen)을 사용하여 세포를 10 ㎍의 MMLV 레트로바이러스 벡터, 3 ㎍의 Gag/pol, 1 ㎍의 NFkB 및 1 ㎍의 VSVg로 형질감염시켰다. 500 ㎕의 OptiMEM를 40 ㎕의 PEI와 5분간 배양하였다. 별도의 튜브에서, 10 ㎍의 레트로바이러스 벡터 + 3 ㎍의 Gag/pol + 1 ㎍의 NFkB + 1 ㎍의 VSVg를 500 ㎕의 OptiMEM에 첨가하였다. PEI/OptiMEM 혼합물을 DNA/OptiMEM 혼합물에 첨가하여 총 약 1 ㎖로 만들고 25분간 배양하였다. 배양 동안에 수용체 293T 평판을 10 ㎖ PBS-/-로 세척하고 FBS가 없는 4 ㎖ DMEM을 첨가하였다. DNA/PEI 혼합물을 293T 세포상에 직접 적가하였다. 4시간 후, 배지를 5 ㎖의 DMEM/10% FBS/50 mM HEPES로 교체하고 배양하였다. 형질감염 48시간 후, 293T 세포의 형광이 가시화되어 고효율의 형질감염이 확인되었다. 배지 (5 ㎖/평판)를 바이러스-함유 상청액으로서 수집하였다. 상청액을 0.8 μm 공경 필터를 통해 여과하고 후속 형질도입을 위해 수집하였다.
T-세포 증식 및 표현형의 검증에 대한 상세 (재프로그래밍 약 하루전): T 세포는 사이토카인 및 항체 첨가로 인해 세포군의 대부분을 대표한다. 검증은 항-CD3, 항-CD4 및 항-CD8 유세포분석 항체에 의한 표면 염색으로 실시하였다. 또한, 세포를 계수하였다. 해동 후 증식분비기가 주목되지만 세포 수는 0일부터 증가하였고; 세포 수를 기록하고 다음날 세포 수와 비교하여 배가를 검증하였다.
실시예 4
T-세포의 레트로바이러스 형질감염 (0일)
IL2 및 OKT3 활성화 및 증식의 3일 후, 세포 증식은 97-99% T-세포로 구성되었다. 이들 T-세포는 레트로바이러스-함유 배지와 함께 2 ㎖ DMEM (Invitrogen) + 10% FBS (Hyclone), 300 IU/㎖ rhIL2 (재조합 사람 IL-2) 및 4 ㎍/㎖ 폴리브렌중에 1e106 세포/웰로 재현탁시켰다. 레트로바이러스 함유 배지는 293T 세포를 재프로그래밍에 연루된 것으로 알려진 몇 가지 전사 인자중 하나와 배합하여 MMLV 패키지 요소로 형질감염시킴으로써 제조하였다. 바이러스를 개별적으로 제조한 후, 배지를 두개의 상이한 칵테일에 배합하고 T-세포에 노출시켰고; 세트 1은 전사 인자 Sox2, Oct4, c-Myc 및 Klf-4를 발현하는 바이러스를 포함하고, 세트 2는 Sox2, Oct4, Nanog 및 Lin28을 발현하는 바이러스를 사용하였다. 별도로, 세포를 6개 바이러스중 하나에 노출하여 대조 형질도입으로 이용하였다. 세포 배양 배지를 바이러스 함유 배지로 교환하고 세포를 32℃하에서 1000 g로 1.5시간 동안 원심분리하였다 (스핀펙션). 이어서, 세포를 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 후, 1 ㎖의 배지를 조심스럽게 흡인하고 신선한 DMEM + 10% FBS 세포로 교환하였다. 세포를 부드럽게 연마하여 혼합하고 균일한 재현탁액으로 만들었다. 연마 후 배양액을 스핀펙션 시작 후부터 18시간 동안 배양하였다. 18시간 후 세포를 수거하고 신선한 바이러스 상청액 + DMEM (10% FBS + IL2 + 폴리브렌을 함유)중에 재현탁시킨 다음, 새로운 24 웰 평판에 재적용하고 상기한 바와 같이 이차 스핀펙션하였다.
레트로바이러스의 수확 방법 및 T-세포의 형질도입 (0일)에 대한 상세: 재프로그래밍 인자이외에 각 레트로바이러스는 형광 단백질 표지를 보유하였다. 따라서, 고효율의 형질감염을 확인하기 위해, 형질감염 48시간 후에 형광현미경으로 293T 세포를 가시화하였다. 293T 배지 (평판당 약 5 ㎖)를 수집하고 원심분리하여 파편을 제거한 다음 바이러스-함유 상청액을 0.8 ㎛ 시린지 필터로 여과하고 개별적인 15 또는 50 ㎖ 코니칼 튜브에 넣었다. 바이러스를 0 내지 5일 동안 4℃에서 저장하였다. T-세포를 활성화시키고 매일 계수하여 이들 세포가 감염 시점에서 (3일째) 지수적으로 성장하고 있음을 검증하였다. 세포를 수확하고, 원심분리한 다음, 바이러스 함유 상청액에 재현탁시키고, 24-웰 평판에 1e106 세포/웰로 파종하였다. 각 바이러스 스톡의 웰당 사용량은 표 3에 기술되어 있다 (총 용량은 2 ㎖). 개별적인 6개의 대조 형질도입을 실시하여 개개의 바이러스 스톡의 감염성을 검증하였다. 후자 형질도입의 경우, 1e106 세포를 500 ㎕의 한 개 바이러스 스톡에 재현탁시키고 총 용량을 D10F 및 300 IU/㎖ IL2 + 4 ㎍/㎖ 폴리브렌을 사용하여 2.0 ㎖로 조절하였다. 모든 재프로그래밍 시험은 2회 또는 3회 중복 실시하였다. 비-형질도입된 세포가 음성 대조군으로 사용되었다.
Figure 112012001096283-pct00003
평판을 가속 ∼4 및 브레이크 ∼4로 세팅하고 32℃하에 1.5 시간 동안 1000g로 스핀펙션하였다. 스핀 후 평판을 인큐베이터로 옮겨 4시간 동안 배양하였다. 4시간 배양 후 평판이 흔들리지 않도록 (세포가 웰 바닥에 계속 정착하도록) 조심스럽게 평판을 후드로 옮겼다. 평판을 후드에 5분간 두었다. P1000 피펫을 사용하여 웰의 상층에서 1 ㎖의 배지/바이러스를 조심스럽게 흡인하였다. 1 ㎖의 신선한 D10F 및 300 IU IL2를 첨가한 후 평판을 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 미사용된 모든 바이러스 상청액은 다음 감염 회차에 사용할 수 있도록 4℃에 저장하였다.
T-세포의 이차 형질도입 과정의 상세 (1일째): 최초 스핀펙션 개시 (0일째) 후 24시간 경과하여 모든 웰의 세포를 멸균 캡핑된 FACS 튜브에 개별적으로 수집하고 1200 rpm으로 4분간 원심분리하였다. 상청액을 각 튜브/웰에 대해 글라스 흡인기에서 새로운 10 ㎕ 비-여과된 팁을 사용하여 흡인하였다. 세포를 상기한 바와 같이 적절한 바이러스(들), IL-2 및 폴리브렌에 재현탁시켰다. 세포를 동일한 평판의 미사용 웰 또는 새로운 24웰 평판에서 배양하였다 (일차 형질도입으로부터의 웰은 재사용되지 않았다). 스핀펙션을 실시하고 상기된 바와 같은 단계를 반복하였다.
T-세포의 증식을 검증하기 위한 절차의 상세 (1일째): 미형질도입된 시료의 웰에 남은 것에 대해 CEDEX 세포 계수를 실시하였다. 이 시점에서 세포 수는 0일부터 지수적으로 증가하였다. 세포 수를 기록하고 전날의 세포 수와 비교하여 배가를 검증하였다. 이 웰은 음성 대조군뿐만 아니라 추가의 시험을 위해 보존되었다. 이 웰의 세포에 필요한 대로 배지 절반의 교환과 함께 300 IU IL2/㎖를 급식하였다.
실시예 5
MEF상에서 형질도입된 T-세포의 평판배양
MEF 평판배양: MEF를 젤라틴 피복된 6 웰 평판 또는 10 cm 접시에서 형질도입된 세포 또는 iPS 콜로니를 도입하기 1-3일 전에 평판배양하였다 (형질도입 하루 전에 MEF를 평판배양하는 것이 최적일 수 있다).
T-세포 증식 및 형질도입 효율의 검증: T-세포 실체를 활성화 후 2 내지 3일 경과하여 항-CD3, 항-CD4 및 항-CD8로의 유세포분석 표면 염색에 의해 검증하고, 형질도입 후 성공적으로 도입된 세포군을 검증하였다. CEDEX 세포 계수를 0일, 2일째, 3일째 및 4일째에 실시하여 지수적 증식 및 MMLV 레트로바이러스 감염에 대한 수용성을 검증하였다.
MEF상에서 형질도입된 T-세포의 평판배양: 3일째에 최초 형질도입 성공 및 효율치를 상기된 바와 같이 형광현미경 및 유세포분석에 의해 검증하였다. 형질도입된 세포를 두 가지 세포 농도 (5x106 및 2x106)로 D10F:hES w/o FGF의 50:50 배지 배합을 함유한 (첨가된 IL-2 또는 다른 사이토카인은 없음) 10 cm 접시 MEF 평판에 첨가하였다. 세포를 배양하고 격일로 급식하였다.
조사된 MEF의 평판배양을 위한 절차의 상세: MEF를 형질도입된 세포의 도입 1 내지 3일 전에 평판배양하였다. 필요한 10 cm 평판의 수를 계산하였다 (10 cm 평판당 500 k 형질도입 세포; 전사인자 (세트 1 또는 세트 2), 미형질도입 대조군, c-Myc 단독 대조군, MEF 단독 대조군-5개 평판+). 0.1% 젤라틴을 사용하여 10 cm 평판을 1시간 이상 피복한 다음 흡인하였다. 15 ㎖의 조사된 MEF 세포 현탁액 (∼7.5x104 세포/㎖)을 각 10 cm 평판에 첨가하였다. 세포를 다음날 점검하여 MEF가 부착되었음을 확인하였다.
조사된 MEF로 형질도입된 T-세포의 전달을 위한 절차의 상세 (3일째): 형광 현미경을 사용하여 형질도입을 검증하였다. 유세포분석기를 사용하여 형질도입을 검증하고 형질도입 효율을 결정하였다. 최소 20% 효율은 재프로그래밍을 진행하기 위한 요건인 것으로 고려된다 (MEF상에서의 평판배양 등). GFP/RFP 분석 및 표면 염색을 실시하여 T 세포의 형질도입이 다른 세포군과 독립적임을 검증하였다. 100 ㎕의 세포를 FACS 튜브에 수집하고 4분간 1200 rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 흡인하고 세포를 5 ㎖ FACS 완충액에 재현탁시키고 재차 원심분리하였다. 펠렛을 150 ㎕의 FACS 완충액에 재현탁시키고 항-CD3, 항-CD4 또는 항-CD8 유세포분석 항체로 염색하였다. 세포를 유세포분석기로 분석하여 CD3+ 세포 (T-세포)가 형질도입되어 어떤 것이 형질도입된 서브세트인지를 검증하였다. 조사된 MEF 평판으로부터 배지를 흡인하고 7.5 ㎖ DMEM + 10% FBS를 첨가하였다. 5x105 형질도입된 T-세포를 수집하고 1200 rpm으로 4분간 원심분리한 다음, bFGF가 없는 7.5 ㎖ hES 배지에 재현탁시켰다. T-세포를 조사된 MEF 평판에 적가하였다. IL2 또는 다른 사이토카인은 첨가되지 않았다. 그런 다음 MEF 평판을 37℃에서 배양하였다.
실시예 6
MEF-평판배양된 형질도입 세포의 유지 및 급식
5 내지 9일째: 각 재프로그래밍 10 cm 평판에서 100 ng/㎖의 제브라피쉬 FGF가 보충된 hES 배지 (CM)로 배지 절반을 교환하였다. 새로운 급식 방법을 개발하여 현탁액 세포 손실을 최소화하면서 배지 보충에 따른 양성 효과를 극대화하였다. 간략하게 설명하면, 5개의 10 cm 접시 덮개를 접시를 기울이기 위한 버팀대로 사용하였다 (모든 후속 급식을 위해 재사용되었다). 느슨하게 부착된 세포가 교란되지 않도록 접시를 배양기로부터 주의 깊게 꺼냈다. 평판은 전용 덮개에 올려 일정 각도로 기울여 두었고 이에 MEF/세포는 노출되지 않았다. 세포가 10분간 정착하도록 두었다. 정착 기간 후 각 덮개를 제거하고, 평판 바닥위로 최상 층 배지로부터 7.5 ㎖를 주의깊게/서서히 흡인하였다. 이렇게 제거된 배지를 수집하고, 1200 rpm으로 4분간 원심분리한 다음, 1 ㎖ 배지에 재현탁시키고, CEDEX에서 계수함으로써 1% 미만의 세포 손실을 검증하였다. 이어서, 세포가 교란되지 않도록 순환 방식으로 7.5 ㎖의 신선한 배지를 적가하고 접시를 배양기 안쪽에 넣었다. 이 방법으로 세포 손실을 최소화하면서 규칙적인 배지 교환이 가능하였다. 9일째 내지 30일째: 각 재프로그래밍 10 cm 평판에 100 ng/㎖의 제브라피쉬 bFGF가 보충된 MEF-조건 hES 배지 (MEF-CM)으로 절반-배지 교환을 실시하였다.
유지 및 급식 절차에 대한 일정의 상세 (5 내지 30일째): 각 재프로그래밍 10 cm 평판에 100 ng/㎖의 제브라피쉬 FGF가 보충된 hES 배지 (CM)로 절반-배지 교환을 실시하였다. 5개의 10 cm 접시 덮개를 모아 모든 후속 급식을 위해 접시를 기울이기 위한 버팀대로서 사용하였다. 10 cm 재프로그래밍 접시를 배양기로부터 꺼내고 평판이 일정한 각도로 기울어지도록 접시를 전용 덮개에 올려 놓았으며 이에 MEF/세포는 노출되지 않았다 (배지는 표면 전체를 덮어야 하고 바닥에 깔려있어야 하며 넘치지 않아야 한다). 접시를 10분간 정착해 두었다. 정착 기간 후, 각 덮개를 제거하고 7.5 ㎖ 상청액을 평판 바닥으로부터 최상 층의 배지에서 조심스럽게/서서히 흡인하였다. 상청액 또는 흡인된 배지를 수집하고, 1200 rpm으로 4분간 원심분리한 다음, 1 ㎖ 배지에 재현탁시키고 CEDEX에서 계수하였다. 1% 미만의 세포가 손실되었음이 검증되었다. 세포가 교란되지 않도록 주의 깊게 순환 방식으로 7.5 ㎖의 신선한 배지를 적가하고 배양기 안쪽에 넣었다. 재프로그래밍 평판에 급식은 격일로 행했다. 9 내지 30일째: 각 재프로그래밍 10 cm 평판에 100 ng/㎖의 제브라피쉬 FGF가 보충된 MEF-조건 hES 배지 (MEF-CM)으로 절반-배지 교환을 실시하였다. 이 배지로 5 내지 9일째에서와 같이 급식을 진행하였다.
실시예 7
iPS 콜로니의 동정 및 채집
활성화되고 증식된 T 세포는 특징적인 세포 형태 및 운집 행태를 나타내었다. 레트로바이러스 형질도입 효율의 탐지는 최초 형질도입 후 72시간 경과시 GFP 및 RFP 발현에 의해 결정되었다. 약 3주 기간 내내 전이 유전자는 발현억제되었고 hES 세포 표현형을 나타냈다. 뚜렷한 iPS 세포 콜로니는 23일째에 나타나기 시작하였다. GFP 및 RFP 발현억제는 형광 현미경으로 검증되었고 해부 후드에서 피펫 팁을 사용하여 콜로니를 채집하였다. 이어서, 콜로니 단편을 조사된 MEF의 신선한 6 웰 평판으로 옮겼다. 평판배양시 투입된 세포 수를 기초로 콜로니 수를 계수하여 재프로그래밍 효율을 산정하였다. 이 시점으로부터 아래에 상세히 기술된 바와 같이 콜로니 클론에 매일 급식하고 수동으로 1회 이상 계대한 다음 증식시켰다.
절차의 상세: 형태학적으로, iPS 세포 콜로니는 밀집되어 있고 거대한 핵과 2개의 명확한 소핵체를 갖는 작고 조밀한 세포로 구성된다. 콜로니의 경계는 보통 뚜렷하다. iPS 콜로니는 발현억제된 삽입성 바이러스 DNA로부터 발현된 GFP 및 RFP를 함유하였다. 일부 진성 콜로니는 형질도입 후 약 20일 경과한 즈음에 형광을 소실하였고, 일부는 이들이 채집되어 감염 후 약 35일 내지 40일 경과한 즈음 이전 후 형광을 소실하였다. 관찰된 모든 콜로니는 (비록 일부 발현이 단세포에서 목격되긴 하였지만) GFP 및 RFP 발현이 결실되었다. 이것은 특히 섬유아세포와 비교하여 세포 유형사이에서 다양할 수 있다. 수동으로 채집하기 위해, 피펫 팁으로 "틱 택 토 보드" 양상으로 콜로니를 직접 3 내지 6개의 단편으로 파쇄시켜 줄기 세포가 주변 MEF 및 T-세포로부터 유리될 가능성을 높였다. 총 콜로니의 계수가 혼동되는 것을 피하기 위해 다수의 콜로니가 형성될 때까지 채집은 피했고, 즉, 작은 덩어리의 콜로니가 남아 있으면, 이 콜로니가 재정착하여 새로운 클론으로서 잘못 계수된다. 이어서, 세포를 hES 배지 및 100 ng/㎖ 제브라피쉬 bFGF와 함께 MEF를 함유한 6 웰 평판의 수용 웰내로 직접 옮겼다. 그런 다음 1 내지 2주 동안 증식, 형태 및 형광 소실을 모니터링하여 클론이 완전히 재프로그래밍되었음을 확인하였다. 세포 채집 후 급식이 없는 첫째 날 이후부터 매일 급식하였다. 채집되어 평판배양된 콜로니가 부착하고 특징적인 ES-유사 형태를 나타낸 후 이들 ES-유사 콜로니를 상기된 바와 같이 재차 새로운 한 세트의 6 웰 조사된 MEF 평판상으로 채집해 두고 콜로니에 매일 급식하였다. 웰에 단층이 형성됨에 따라 세포를 1 ㎎/㎖ 콜라게나제로 정상적인 iPS 세포주로서 계대배양하였다 (Yu et al., 2005). iPS 세포를 여러 계대에서 동결하였고 각 세트에 대해 시험 해동을 실시하였다.
iPS 콜로니 클론이 23 내지 30일째에 형성되었고, 즉, 30일째에 세트 1 인자로부터 총 21개 콜로니, 이중에서, 고도의 형질도입된 세포 파종 밀도 (10 cm 접시 당 2x106)로부터 7개 콜로니 및 저밀도 (10 cm 접시 당 5x105)로부터 21개 콜로니. 추가의 콜로니가 성장하지 않는 것으로 결정될 때까지 접시에 급식하였다. iPS 세포주 전체를 획득, 동결, 증식하였다.
실시예 8
사람 말초 혈액 T 림프구로부터 유도 만능 줄기 세포의 유도
1x106 세포를 함유한 활성화된 T-세포 농축 집단에 별개의 4개 벡터로 레트로바이러스 형질도입을 2회 (0일 및 1일째) 실시하였다. 각 벡터는 형광 마커 유전자에 연결된 재프로그래밍 인자 (SOX2, OCT4, c- Myc 또는 KLF4)중 하나를 암호화한다 (대표적인 벡터 지도가 도 10에 도시되어 있다). 3일째에 형광 현미경 및 유세포 분석으로 형질도입 효율을 평가하였다. CD3에 대한 염색은 형질도입 세포군이 99% +/- 1% CD3+임을 보여주었다 (도 2a).
T 세포는 전혈중에 풍부하고 (건강한 성인의 경우 ∼6.5x105-3.1x106/㎖)(Lichtman and Williams, 2006) 잘 설정된 프로토콜을 이용하여 배양이 간편하기 (Johnson et al., 2009; Morgan et al., 2006) 때문에 재프로그래밍을 위한 출발 재료로 아주 적합하다. T-세포 증식 및 효율적인 레트로바이러스 형질도입을 촉진하기 위해, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 백혈구성분채집 또는 표준 정맥천자 (Vacutainerⓒ CPT 튜브)로 분리하여 iPS 세포내로 재프로그래밍하였다 (도 1). 비-가동화 공여자로부터의 PBMC를 항-CD3 항체로 활성화시키고 무혈청 배지에서 IL-2의 존재하에 증식시켰다 (도 2A). 결과적으로 평균 3일째에 90%+/-7%의 CD3+ 순도로 이루어진 성숙한 CD3+ T-세포의 우선적인 증식이 이루어졌다 (도 2a).
이어서 T 세포로 우점적으로 편중된 집단을 재프로그래밍 인자로 형질도입하였다. 형질도입된 T-세포를 함유한 세포군을 100 ng/㎖ 기본 섬유아세포 성장 인자 (bFGF)가 보충된 hESC 배지중의 조사된 마우스 배아 섬유아세포 (MEF)에 적용하였다. 23일째에 iPSC 콜로니가 관찰되었다. hESC-유사 형태를 갖는 콜로니의 수를 유입된 형질도입 세포의 수로 나누어 T-세포의 재프로그래밍 효율을 산출하였으며 공개된 섬유아세포 및 CD34+ 세포 재프로그래밍 효율 (Yu et al., 2007; Loh et al., 2009)과 비슷하게 약 0.01%로 결정되었다.
백혈구성분채집 시료 (히스패닉계 남성 성인으로부터, "TiPS-L"로 표시된 라인) 및 전혈 Vacutainerⓒ 시료 (백인 남성 성인으로부터, "TiPS-V"로 표시된 라인) 모두로부터 TiPS를 생성하였다. 각 경우에, 1 ㎖ 전혈중의 T-세포의 양과 동일한 유입 세포 수를 사용하여 재프로그래밍을 달성하였다. hESC 형태를 나타내는 콜로니는 MEF상에서 증식되었고 클론은 무영양성분 조건하에서 mTeSR 배지 및 매트리겔 피복된 평판을 사용하여 성공적으로 유지되었다.
유세포분석 (도 2b) 및 알카리성 포스파타제 염색 (도 8)를 사용하여 hESC 다능성 마커 SSEA-3, SSEA-4, Tra-1-8 및 OCT4의 발현으로 다능성을 검증하였다.
또한, DNA 지문술을 실시하여 TiPS가 출발 공여자 T-세포군과 유전자 배경을 공유하고 있음을 검증하고 세포주 교차 오염을 배제하였다 (도 7). STR (단기 연쇄 반복) 분석은 iPS 콜로니가 공여자의 유전체로부터 유도되었음을 보여주었다. 공여자 PBMC 및 iPS 세포주는 남성 특이적이고 분석된 8개 STR 유전자좌을 따라 15개의 대립유전자 다형성에서 서로 동일하였다 (아래 표 4).
Figure 112012001096283-pct00004
TiPS 세포주의 T-세포 기원이 TCR β 쇄 재배열의 다중 PCR 검출을 통해 검증되었다 (도 2c). T 세포는 TCR 베타 쇄에서 단일 생성 V-J 재배열을 가지며 TiPS 세포가 된 후 그러한 특징적인 유전자 서열을 유지해야 한다. 가장 공통적인 베타 쇄 재배열을 위한 여러 가지 프라이머를 조합하는 마스터 믹스를 사용하여 PCR 증폭한 결과 ABI 3730 DNA 분석기로 절편 분석 전기영동도로 결정됐을 때 특정 크기 및 서열의 밴드 한 개가 나타났다. 섬유아세포로부터 유도된 iPS 세포 "Fib-iPS"는 음성 대조군으로 사용되었다.
TiPS 클론은 사람 배아 줄기 세포 마커 유전자 DNMT38, LEFT8, NODAL, REX1, ESG1, TERT, GDF3 및 UTF1을 발현하였다 (도 3a). H1 hES 세포, Fib-iPS (섬유아세포로부터 유도됨), 일차 공여자로부터의 T-세포로부터 전체 RNA를 분리하고 RT-PCR을 사용하여 TiPS 클론 TiPS1ee 및 TiPS1b를 분석하였다. 추가의 성상확인은 숙주 게놈내로 전이 유전자의 삽입뿐만 아니라 성공적인 재프로그래밍 후 전이 유전자의 발현억제를 입증하였다 (도 3b-3c). TiPS는 상기 검정 모두에서 hESC 세포주 H1과 섬유아세포-유도된 iPSC 세포주 대조군 둘 다와 유사하였다. 재프로그래밍 유전자의 내인성 및 외인성 (전이 유전자) 발현은 전이 유전자 발현의 발현억제에 의해 입증된 바와 같이 완전한 재프로그래밍을 보였다 (도 3c). GAPDH는 A+B 모두에서 증폭 대조군으로 사용되었다. 게놈 DNA를 분리하고 해당 유전자를 위해 정방향 프라이머를 IRES를 위해 역방향 프라이머를 사용함으로써 PCR 분석하여 재프로그래밍 유전자의 삽입을 검증하였다 (도 3b). OCT4 정방향 및 역방향 프라이머가 PCR 반응 대조군으로 사용되었다.
TiPS 클론은 유세포분석 (도 3d), 알카리성 포스파타제 염색 및 G밴딩 염색체 분석에 의한 핵형 분석에서 나타난 바와 같이 사람 배아 줄기 세포-특이적 다능성 마커를 발현하였다. 세포주는 복수 계대 후 핵형이 정상이었고 30 계대 이상의 배양을 통해 번식하면서 정상적인 핵형을 유지하였다 (도 9).
마지막으로, TiPS 세포주는 이들의 생체내 및 시험관내 분화능을 결정하기 위해 평가되었다. TiPS 클론은 세 가지 모든 일차 배엽로부터의 유도와 일치하는 조직을 함유한 기형종을 형성하였다 (도 4a). 또한, 다양하게 통제된 분화 프로토콜에서 세포주가 내배엽 및 외배엽 계통으로 시험관내 분화하는 능력에 대해 평가되었다. 클론은 신경세포, 박동 심장 트로포닌 T-양성 심근세포 및 다능 과립구-적혈구-대식세포-거핵세포 (GEMM) 조혈 세포를 생성할 수 있었다 (도 4b-4e).
TiPS는 다수의 세포 유형으로 분화하였다. TiPS는 다음의 방법에 의해 심근세포로 분화되었다. TiPS 클론은 배아유사체 (EB)를 형성하였고 HGF/bFGF 조절된 심장 유도를 통해 심근세포로 분화하였다 (도 4c). 박동 심근세포 응집체가 14일째 관찰되었다. 또한, TiPS는 혈액으로 분화하였다 (도 4e). BMP-4, VEGF, Flt-3 리간드, IL-3, GM-CSF 및 FGF-2의 배합을 사용하여 EB로부터 조혈 전구 세포 (HPC)가 유도되었다. 콜로니-형성 단위 (CFU) 검정을 사용하여 TiPSlee-유도된 HPC의 작용 능력을 결정하였다. CFU-GM, BFU-E 및 CFU-GEMM 콜로니가 12일째에 관찰되었다.
요약하면, 비-가동화 공여자의 말초 혈액으로부터 유도된 T 세포로부터 iPS 세포가 성공적으로 생성되었다. 출발 재료의 양은 표준 배큐테이너로부터의 출발 재료 1 ㎖에 해당하였다. TiPS는 숙주 물질의 실체를 반영하였다. 또한 TiPS는 정상적인 사람 ES 세포 및 다른 세포원으로부터 유도된 iPS의 전형적인 특징을 갖고 있었다. 게다가, TiPS는 박동 심근세포 응집체 및 혈액 세포를 포함한 다수의 세포 유형으로 분화하였다.
TiPS 클론과 hESC 세포주 또는 섬유아세포-유도된 iPSC 세포주사이에서 분화능의 유의적 차이는 관찰되지 않았다 (도 4d-4e). iPSC 게놈에서 TCR 유전자 재배열의 지속성이 후속 분화에 미치는 잠재적 영향을 시험할 수 있다.
TCR 재배열은 사실 유도 기형종에서 모 세포주 클론 TCR β 쇄 재배열의 탐지에 의해 증명된 바와 같이 iPSC 클론 추적의 경우에서와 같이 특정 상황에서 유익한 것으로 드러날 수 있다 (도 5). 게다가, T-세포로 재분화할 때, TiPS 세포는 사전에 재배열된 TCR 유전자의 발현에 의해 유발된 TCR 대립유전자 형질 배제의 기전으로 인해 표준 흉선 발생 순서에서 핵심 단계를 우회할 수 있다. 이 현상은 T-세포 발생 연구에서 탐구될 수 있었다.
레트로바이러스 재프로그래밍 프로토콜을 사용할 경우 삽입성 돌연변이 및 세포기능의 다른 잠재적 손상이 가능할 수 있음이 주지되어야 한다 (Mirxhwll et al., 2004). 이들 문제는 에피솜 재프로그래밍 방법의 이용에서 최근의 진전으로 다루어질 수 있으며 이러한 대안적인 방법을 통해 T-세포를 재프로그래밍하는 노력이 진행중에 있다 (Yu et al., 2009; Zhou et al., 2009). 또한, 이와 같은 에피솜 재프로그래밍된 TiPS 세포의 잠재적 치료 용도의 흥미로운 예는 종양-관련된 항원에 특이적인 내인성 TCR 유전자를 함유한 비삽입성 조혈모 세포를 분화시키는 소스로서이다 (van Lent et al., 2007).
이전의 보고에 따르면, 마우스에서 마지막으로 분화된 B 림프구의 재프로그래밍은 세포 실체-연관된 전사 인자의 첨가 또는 녹다운을 필요로 하였고 독시사이클린-유도성 발현 시스템을 사용하였다 (Hanna et al., 2008). 최근에, 재프로그래밍 쥐 T-세포가 성공적인 iPSC 생성을 위해 p53 유전자 녹아웃을 필요로 하는 것으로 발표되었다 (Hong et al., 2009). 항증식성 경로의 조작과 연관된 실험 (Li et al., 2009; Marion et al., 2009; Kawamura et al., 2009; Utikal et al., 2009)는 재프로그래밍의 기전에 대한 이해를 도모해 주며 재프로그래밍 효율을 상당히 높여줄 수 있다. 그러나, 상기된 조작중 어느 것도 사람 T-세포의 성공적인 바이러스 재프로그래밍을 위해 필요한 것으로 보이지 않는다. 추가로, 성체 CD34+ 조혈 전구 세포를 재프로그래밍하는데 사용된 방법 (Loh et al., 2009; Ye et al., 2009)과 연결된 우리의 데이터는 현재 유입 세포의 분화 단계를 재프로그래밍 효율과 상관시키는 마우스 시스템 (Eminli et al., 2009)에서의 최근 관찰들을 검사하는 일차 사람 시스템을 제공한다.
적고 임상적으로 유리한 용량의 비-가동화 사람 말초 혈액으로부터 iPSC의 유도가 개발되었다. T-세포는 재프로그래밍을 위해 풍부한 세포 소스를 대표하며 최소의 외과적 방식으로 다수의 공여자로부터 채집되어 잘 설정된 프로토콜을 통해 배양될 수 있다. 실험에서 TiPS는 hESC 세포주 및 섬유아세포-유도된 iPSC 세포주와 유사한 특징 및 분화능을 갖는 것으로 밝혀졌다. 추가로, TiPS는 iPSC 클론 추적, T-세포 발생 및 iPSC 기술의 치료적 응용을 탐구하기 위한 새로운 모델을 제공한다.
재료 및 방법
세포 성장 배지 및 기초 섬유아세포 성장 인자 - iPSC 세포주는 이전에 공개된 방법 (Yu et al., 2007)을 사용하여 유지하였다. 모든 실험에서 이전에 공개된 바와 같이 (Ludwig et al., 2006a) 사람 bFGF 대신에 제브라피쉬 bFGF가 사용되었다.
섬유아세포 iPSC 세포주 - 섬유아세포-유도된 iPSC 세포주 대조군 ("Fib-iPS")는 ATCC (Manassas, VA)에서 입수한 IMR90 세포를 사용하여 이전에 공개된 바와 같이 (Yu et al., 2007) 생성하였다.
T-세포 활성화 및 증식 - 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 림프구 분리 배지 (Cellgro, Manassas, VA)로 처리된 HLA-A2 양성 히스패닉계 남성 성인 공여자 ("공여자 L") 백혈구 팩 (Biological Specialty Corp, Colmar, PA)으로부터 획득하였다. 추가로, 전혈 시료는 배큐테이너ⓒ CPTTM 튜브 (BD Biosciences, San Jose, CA)를 이용한 표준 정맥천자를 통해 미확인 혈청형의 백인 남성 공여자 ("공여자 V")로부터 수집하였고 PBMC는 제조사의 권장에 따라 원심분리로 수집하였다. 혈액 시료는 헬싱키 선언 및 Biological Specialty Corporation (Colmar, PA, USA)의 임상시험심사위원회 승인에 따른 서면고지동의로 획득하였다. T-세포는 pen/strep/글루타민 (Invitrogen) + 300IU/㎖ rhIL2 (Peprotech, Rocky Hill, NJ) 및 10 ng/㎖ 용해성 항-CD3 항체 (eBioscience, OKT3 클론, San Diego, CA)이 보충된 신선하게 제조된 AIM-V 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 증식되었다 (Chatenoud, 2005; Berger et al., 2003). 증식은 T-세포 표현형에 대해 세포를 검정한 다음 재프로그래밍 인자가 형질도입되는 배양 후 3일째 시점에서 CEDEX (Roche Innovatis, Bielefeld, Germany) 세포 계수에 의해 검증되었다.
레트로바이러스 생성을 위한 일시적 형질감염 - 레트로바이러스는 70-80% 세포층의 10 cm 평판에서 폴리에틸렌 이민 ("PEI") 친지질성 시약 (40 ㎍/10 cm 평판)을 사용하여 293T 세포를, 4개 재프로그래밍 유전자 각각 및 형광 마커 유전자 (GFP 또는 RFP)를 암호화한 레트로바이러스 벡터 (몰로니 뮤린 백혈병 바이러스) 백본 10 ㎍, Gag-Pol 3 ㎍, NFkB의 유도체를 암호화한 플라스미드 1 ㎍ 및 수포성 구내염 바이러스 G 단백질 1 ㎍로 형질감염시켜 생성하였다. 4시간 후 배지는 5 ㎖의 DMEM (Invitrogen) + 10% FBS (Hyclone, Waltham, MA) 및 50 mM HEPES (Invitrogen)으로 교환하였다. 바이러스 상청액은 형질감염 48시간 후에 수집하고, 원심분리한 다음, 0.8 ㎛ 기공 크기 필터를 통해 여과되었다.
스핀펙션을 통해 레트로바이러스 형질도입 - 웰 당 백만개의 활성화 공여자 세포가 4개의 레트로바이러스 상청액 + 4 ㎍/㎖ 폴리브렌 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)와 300 IU/㎖ rhIL-2의 혼합물에서 32℃, 1000g로 1.5시간의 원심분리를 통해 스핀펙션하였다. 스핀펙션 후 평판은 절반-배지 교환 처리되었고 밤새 배양되었다. 다음날 세포는 원심분리에 의해 수확되고 이차 스핀펙션되었다.
T-세포 증식 및 형질도입 효율의 검증 - T-세포 실체는 항-CD3 항체 (BD, 클론 HIT3a)에 의한 유세포분석 표면 염색에 의해 활성화 후 3일지나 검증되었고 형질도입 후 어떠한 세포군이 성공적으로 형질도입되었는가 검증되었다. 시료는 Accuri (Ann Arbor, MI) 유세포분석기에 적용되었다. CEDEX 세포 계수는 0일, 3일째 및 4일째에 실시하여 증식 및 MMLV 레트로바이러스 감염에 대한 MMLV 레트로바이러스 감염에 대한 수용성을 검증하였다 (데이터 제시되지 않음).
MEF상에서 형질도입 T-세포의 평판배양 - 최초 형질도입 72시간 후에, 형질도입 성공 및 효율이 상기된 바와 같이 형광 현미경 및 유세포분석에 의해 검증되었다. 5x105 형질도입 세포가 zbFGF (또는 추가의 사이토카인) 없이 50/50 배지 배합 D10F:hESC에서 1 내지 3일전에 MEF 파종된 10 cm 평판에 첨가되었다. 세포를 배양하고 격일로 절반-배지 교환에 의해 hESC 배지 + 100 ng/㎖ zbFGF (첫째 주) 또는 MEF-적응용 배지 + 100 ng/㎖ zbFGF (이후)가 급식되었다. 급식 동안에 세포 손실을 막기 위해 평판을 10분 약간 기울여 세포가 정착하도록 두고 배지는 배지층으로서 서서히 제거하였다.
iPSC 콜로니 동정 및 채집 - 23일째에 즈음하여 경계가 뚜렷하고 전형적인 hESC 형태를 갖는 콜로니가 나타나기 시작하였다. GFP 및 RFP 발현억제는 형광 현미경에 의해 검증되었고 콜로니 수를 계수하여 평판배양 유입 세포의 수를 기초로 재프로그래밍 효율을 산출하였다. 콜로니는 수동으로 수확되어 MEF로 이전된 다음 설정된 프로토콜에 따라 증식되었다 (Maherali and Hochedlinger, 2008; Thomson et al., 1998). 재프로그래밍 효율의 산출은 추정 iPSC 콜로니의 총 수를 형질도입 세포의 유입 수로 나눔으로써 취득하였다. 콜로니 수확 후 (25-30일째)에 이후로 남겨진 위양성 재파종된 콜로니의 산입을 피하기 위해 계수를 중지하였다.
DNA 지문술 - TiPS 세포주 및 공여자 PBMC는 단기 연쇄 반복(STR) 분석을 위해 위스콘신대 조직적합성/분자 진단 연구소 (Madison, WI)에 보냈다. TiPS 세포 시료 DNA로부터 8개 STR 유전자좌에 대한 유전형을 결정하였다.
핵형분석 - G 밴딩 분석이 WiCell Research Institute (Madison, WI)에 의해 실시되었다.
T-세포 수용체 β 쇄 재배열 분석 - 공여자 T-세포, TiPS 세포주 및 음성 대조군으로 사용된 섬유아세포 (비-T-세포) 유도된 iPSC 세포주로부터 게놈 DNA를 제조사의 프로토콜 (Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit를 사용)에 따라 분리하였다. 추가로, 일차로 조직 및 세포 시료를 트리스, NaCl, EDTA, SDS 및 프로테이나제 K (Invitrogen)이 함유된 완충액에 용해시킴으로써 동결된 기형종 시료 및 모 세포주로부터 DNA를 분리하였다. 이어서, DNA를 포화 NaCl 및 에탄올로 침전시키고 PCR 분석을 위해 물에 재현탁시켰다. PCR은 클론 TCR β 쇄 재배열의 대다수에 특이적인 다중 프라이머 키트 (Invivoscribe Technologies, San Diego, CA)를 사용하여 실시하였다 (van Dongen et al., 2003). 모세관 전기영동 및 PCR 생성물 절편 분석은 ABI 3730 DNA 분석기를 사용하여 위스콘신대 Biotechnology Center DNA Sequencing Core Facility (Madison, WI)에서 실시하였다. 데이터는 피크 스캐너 소프트웨어 (ABI, Foster City, CA)를 사용하여 분석하였다.
알카리성 포스파타제 (AP) 염색 - MEF상에서 성장한 단층 세포를 제조사의 프로토콜에 따라 벡터 블루 알카리성 포스파타제 기질 키트 III (Vector Laboratories, SK-5300, Burlingame, CA)로 AP 염색하였다.
전이 유전자 및 hESC 마커 유전자 발현에 대한 RT-PCR - 제조사의 프로토콜에 따라 RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD)를 사용하여 전체 RNA를 분리하였다. 일차 가닥 cDNA 합성은 제품 프로토콜에 따라 슈퍼스크립트 III 퍼스트 스트랜드 합성 키트 (Invitrogen)을 사용하여 올리고-dT 프라이머 (Yu et al., 2009; Takahashi et al., 2007에 기술된 바와 같이)로 실시하였다. cDNA를 1:2로 희석하고 마스터사이클러 (Eppendorf, Hauppauge, NY)를 사용하여 GoTaq Green Master Mix (Promega, Madison, WI)로 PCR 반응을 실시하였다.
바이러스 삽입의 PCR 분석 - 배양 세포에 대한 제조사의 프로토콜에 따라 DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen)을 사용하여 1-5x106 iPSC로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 게놈 DNA (5 ㎕)는 GoTaq Green Master Mix (Promega)를 사용하여 바이러스 삽입을 점검하기 위한 PCR 반응에 사용하였다. 전이 유전자만을 탐지하고 내인성 유전자는 탐지하지 않는 특이적 프라이머 세트가 사용되었다. 내인성 OCT4에 대한 프라이머는 반응에 대한 양성 대조군으로 작용하였다. 반응은 Yu et al., 2009 및 Takahashi et al., 2007에 기술된 바와 같은 프라이머로 실시하였다.
유세포분석: iPSC 세포주 세포내 및 표면 다능성 마커 성상확인 - 매트리젤에서 유지된 TiPS를 수확하고 Tra-1-81 (BD Pharmingen 또는 Stemgent, San Diego, CA, 양 클론 Tra-1-81), SSEA-3(BD Pharmingen, clone MC631) 및 SSEA-4(BD Pharmingen, clone MC813-70)의 존재하에 염색하였다. 세포내 OCT4 (BD, 클론 40/Oct-3) 염색은 2% 파라포름알데하이드로 고정되고 PBS+0.1% 사포닌으로 투과성화된 세포로 실시되었다. 세포는 밤새 염색되었고 다음날 Accuri 유세포분석기로 분석하였다.
조혈 분화 및 콜로니-형성 단위 검정 - 미분화된 TiPS를 매트리젤 피복된 평판에서 무급식 조건에 적응시키고 mTeSR 배지 (Stem Cell Technologies, Vancouver BC, Canada)를 사용하여 유지하였다. TrypLE (Invitrogen)을 사용하여 콜로니를 수확하고 저-부착 평판의 무혈청 배아유사체 (EB) 기본 배지 (IMDM, NEAA, 글루타민 (Invitrogen) 및 20% BIT-9500 (Stem Cell Technologies) 및 ROCK 억제제 H1152를 함유)에 적용하여 응집체 형성을 촉진하였다. 응집체 형성 후 세포를 성장인자 및 사이토카인 (rhBMP-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN), rhVEGF, zbFGF, rhFlt-3 리간드, rhIL-3 및 rhGM-CSF (Invitrogen))이 보충된 EB 기본 배지에 12일간 적용하였다. 세포를 수확하고 각 iPSC 클론에 의해 생성된 표현형을 유세포분석에 의해 CD31, CD34, CD43, CD45, CD41 및 CD235a의 표면 염색으로 평가하였다. 제조사의 지침에 따라 콜로니-형성 단위를 분석하기 위해 MethoCult (Stem Cell Techonologies) 배지에 개별화된 세포를 적용하였다.
기형종 형성에 대한 검정 - MEF상에서 배양되어 성상확인된 iPSC를 SCID/베이지 마우스 (Harlan Laboratories, Madison, WI)의 뒷다리에 근육내 주사하였다. 각각 세포의 6-웰 평판 한 개로 세포주당 3마리 마우스에 주사되었다. 주사 전에 세포 현탁액에 매트리젤 (BD Biosciences)을 1/3 총량으로 첨가하였다. 5 내지 12주에서 종양이 형성되었고 McArdle Laboratory for Center Research (위스콘신대)에서 종양을 헤마톡실린 및 에오신 염색 처리하고 조직 분석하였다. 모든 동물 작업은 Cellular Dynamics International Animal Care and Use Committee의 승인하에 국내 및 국외 관련 지침에 따라 실시하였다.
심장 분화 - 세포 응집 방법을 통해 심장발생을 유도하였다. 간략하게 설명하면, MEF상에서 성장한 TiPS 세포를 콜라게나제 IV (Invitrogen)으로 수확하고 매트리젤상에서 성장한 세포는 나트륨 시트레이트를 사용하여 단세포 현탁액으로 해리하였다. 세포 현탁액은 재조합 사람 간세포 성장 인자 (HGF) 및/또는 zbFGF의 존재하에 초-저 부착 플라스크에서 응집체를 형성하도록 두었다. 추가로, ROCK 억제제 H1152를 매트리젤-기원 세포 현탁액에 첨가하였다. 박동 응집체를 해리시키고 심장 트로포닌 T (cTnT) (Abcam, Cambridge, MA, 클론 1C11)에 대해 14 내지 15일째에 염색하였다.
신경세포 분화 - TiPS 세포의 신경세포 분화는 Ebert et al., 2009에 기술된 바와 같이 실시하였다. 간략히 설명하면, MEF상에서 성장된 TiPS를 콜라게나제 IV로 부분 해리시키고 B27 보충제 (Invitrogen), bFGF (100 ng/㎖) 및 상피 성장 인자 (100 ng/㎖, Chemicon, Billerica, MA)가 보충된 Stemline Neural Stem Cell Expansion Medium (Sigma-Aldrich)에서 응집체로서 현탁 배양하였다. McIlwain 조직 절편기를 사용하여 배양물을 주간으로 계대하였다. 신경세포 분화를 유도하기 위하여, 구체를 1주일간 신경세포 유도 배지 (DMEM/F12 + N2 보충제, Invitrogen)에서 성장시킨 다음, cAMP (1 μM, Sigma-Aldrich), 아스코르브산 (200 ng/㎖, Sigma-Aldrich), 뇌-유도된 신경향성 인자 및 신경교 세포주-유도된 신경향성 인자 (둘 다 10 ng/㎖, R&D Systems)가 보충된 동일한 신경세포 유도 배지중의 폴리-오르니틴/라미닌 (Sigma-Aldrich)-피복된 커버슬립상에서 추가로 3주 동안 평판배양하였다. 신경세포 마커 베타 III-튜불린의 발현을 Zhang et al., 2001에 기술된 바와 같이 면역형광염색에 의해 분석하였다.
실시예 9
냉동보존된 사람 말초 혈액 환자 시료로부터 T-세포의 레트로바이러스 재프로그래밍
본 실시예는 "10 공여자" 실험에서 사용된 프로토콜을 제시한다. 이 실험에서, 재프로그래밍은 10명 환자 시료에 대한 시험으로서 시도되었으며 10명 환자 시료 각각은 성공적으로 재프로그래밍되었다. 도 6a-6b에서 보는 바와 같이, 96웰에서 MEF상의 IPS 콜로니의 Tra-1-60 염색은 적은 수의 유입 T 세포로 가능하다. 이것은 T-세포 방식의 효율을 입증한다.
본 실시예는 사람 말초 혈액 T-림프구의 효율적인 레트로바이러스 재프로그래밍을 위한 일련의 절차 (아래에 상세히 기술된 절차 1-11), 특히 사람 말초 혈액 T-림프구의 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MMLV)-기초로 한 재프로그래밍을 달성하는데 필요한 다단계 및 일정을 기술한 것이다. 이 실시예는 냉동보존된 세포 및 신선하게 제조된 바이러스 상청액 (이중-유전자 MMLV 벡터 Oct4-Sox2 및 c-Myc-Klf4 또는 Nanog-Lin28을 포함)의 사용에 초점을 맞추고 있다. 이 실시예의 절차는 다른 벡터 시스템과의 사용에 적용될 수 있으며 또한 비-냉동보존된 시료에도 사용할 수 있다.
1. 예비 절차:
말초 혈액 시료를 주문 및/또는 접수하기 전에, 활발하게 성장하는 부착성 293T 세포 배양물과 별도의 비-부착성 Jurkat 세포 배양물을 설정하고 유지한다. 293T 세포는 바이러스 생성의 요건을 충족하기 위해 증식시킨다. 바이러스 생성은 아래의 "MMLV 재프로그래밍 바이러스 벡터의 제조"에 기술된 몇 가지 벡터 및 보조 플라스미드의 사용을 필요로 한다. 이 단계를 진행하기에 앞서 이들 DNA 시료를 제조하는 것이 필요하다. 마지막으로, 또한 "MMLV 재프로그래밍 바이러스 벡터의 제조" 이전에 과량의 MEF-적응용 배지를 준비할 것을 권장한다.
2. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 제조 및 냉동보존
다음은 사람 말초 혈액의 백큐테이너® CPTTM 튜브로부터 사람 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 분리하고 PBMC를 냉동보존하는 절차를 기술한다. 이 절차는 iPSC 세포의 유도를 촉진하는데 의도가 있다. 개별 (SST) 튜브로 채혈하고 이 튜브를 감염 질환 시험을 위해 적당한 서비스 연구소로 보냈다. 혈액 시료는 CPT 백큐테이너ⓒ에 수집되어 발명자들에게 돌아왔다. 시료를 받은 발명자들은 적당한 생물봉쇄 용기에 넣어 4℃에 저장하였다. 공여자 정보는 데이터베이스에 기록해 두었고 공여자에 식별 기호 또는 숫자를 지정하였다. 또한, 음성을 증명하는 감염 질환 시험 데이터는 안전 위원회의 규정에 맞춰 문서화하였다.
혈액 시료를 받은 후 CPT 백큐테이너ⓒ로부터 Sorvall Legend RT 원심분리기 (입수가능한 경우 생물봉쇄 어뎁터를 사용)에 의해 4℃, 600xg로 25분간 원심분리하여 PBMC를 분리하고 펠렛을 10 ㎖의 냉 PBS (냉동보존을 위해) 또는 RPMI + P/S (생세포 배양을 위해)에 재현탁시켰다. 세포는 Cedex 장비로 계수하였다. 다른 방법으로는 트립판 블루 및 혈구측정기를 사용하여 중복 계수를 실시한다. 시료를 계수하고 ㎖당 살아있는 세포의 수 및 생존율(%)을 기록한다. 4℃에서 15분간 400xg로 원심분리하고 상청액을 흡인하여 잔여 응고 인자를 제거한다.
분리 후 펠렛을 약 10x106 세포/㎖로 냉동 CryoStor 10에 재현탁시키고 미리 냉동해 둔 냉동바이알에 옮김으로써 PBMC의 냉동보존을 준비하였다. 전형적으로, 8 ㎖ CPT 백큐테이너ⓒ 한 개로부터의 수득량은 천오백만 내지 이천만 개 세포이며 두개의 냉동바이알로 나눈다. 냉동바이알은 미리 냉동해 둔 Mr.Frosty 보관통에 넣고 이어서, 보관통을 -80℃ 냉동고로 옮겨 밤새 둔다. 다음날 장기간 저장을 위해 냉동바이알을 액체질소 저장탱크로 옮긴다.
3. MMLV 재프로그래밍 바이러스 벡터의 제조:
최적의 바이러스 활성을 유지하기 위해, 바이러스 상청액을 사용하기 전에 4일내에서는 4℃에서 저장해 둘 것을 권장한다. 이 프로토콜은 MMLV-기본 재프로그래밍 이중시스트론 벡터 Oct-Sox2, cMyc-Klf4 및 Nanog-Lin28 (벡터 지도는 도 11a-11c에 도시되어 있다)의 일시적 형질감염에 의한 레트로바이러스-함유 배지의 생성을 기술한다. 이들 벡터중 두개 또는 세개의 조합을 사용하여 96-웰에서 사람 T-세포의 레트로바이러스 형질도입에 의한 iPS 세포의 유도를 촉진하고자 한다.
수일 (또는 수주)간의 시간 경과에 따른 293T 세포의 증식. 규모의 확장 정도는 아래에 기술된 일시적 형질감염 방법에서 필요로 하는 세포의 수 및 생성된 바이러스 함유 상청액의 상응하는 용량에 의해 좌우된다. 이들 값을 산정하기 위한 식이 아래에 제시되어 있다.
바이러스 생성을 위한 준비. MMLV 재프로그래밍 벡터는 벡터 플라스미드의 명칭에 상응하게 Oct-Sox2, cMyc-Klf4 또는 Nanog-Lin28로 명명하고 각각 OS, CK 및 NL로 표시한다. 재프로그래밍은 OS+CK, OS+NL 또는 세 개 모든 벡터의 조합 (OS+CK+NL)을 사용하여 달성할 수 있다. 이 프로토콜을 개시하기에 앞서 과량의 각 벡터 플라스미드 DNA뿐만 아니라 아래에 기술된 보조 플라스미드를 준비하여야 한다. 또한, MMLV 플라스미드 (Sox2-GFP) 대조군을 준비할 것을 권장한다.
바이러스를 수용할 표적 세포를 함유한 웰의 수 및 각 웰이 수용할 바이러스의 조합을 결정한다. 예를 들어, 10개의 상이한 공여자 T-세포 시료를 96-웰에서 7개 웰에 한 종류씩 파종하고 아래에 기술된 바와 같이 활성화하였다. 이들은 총 70개 웰을 점유한다. 각 공여자로부터의 2개 웰은 OS+CK 재프로그래밍 바이러스 (nOS+CK=20)를 수용한다. 2개 웰은 OS+NL 재프로그래밍 바이러스 (nOS+NL=20)을 수용한다. 2개 웰은 Sox2-GFP 바이러스 대조군 (nGFP=20)을 수용한다. 나머지 1개 웰은 비-형질도입 대조군을 대표한다.
다음의 등식을 사용하여 각 벡터로부터 상청액 배지 (V)의 용량을 계산한다: V=(n) x (용량) x F (여기서, 용량은 각 웰에 적용된 바이러스 양 ㎖ (전형적으로 0.05 ㎖)이고 F는 상청액의 침전 후 달성된 인자의 농도 (전형적으로 50배)(아래의 바이러스 농축 단계)를 나타낸다). 상기 실시예의 이행 결과, OS 바이러스를 수용하는 웰의 총 수 nOS + CK + nOS + NL는 40이다. 추정 용량 = 0.05 ㎖이고 F=50이다. VOS = (nOS + CK + nOS + NL) x (용량) x F에 대입하여 계산하면 40 x (0.05) x 50 = 100 ㎖이다. VCK = (nOS + CK) x (용량) x F에 대입하여 계산하면 20 x (0.05) x 50 = 50 ㎖이다. VNL = (nOS + NL) x (용량) x F에 대입하여 계산하면 20 x (0.05) x 50 = 50 ㎖이다. VGFP = (nGFP) x (용량) x F에 대입하여 계산하면 20 x (0.05) x 50 = 50 ㎖이다.
등식 POS = VOS ÷ (Y)를 푼다. 상기 실시예의 경우, VOS = 100 ㎖이고, 평판당 좀더 많은 양을 수득하기 위해 15 cm 평판을 선택하므로, Y = 14.5. POS = 100 ÷ 14.5 = 6.8개 평판이다. 반올림하면 POS = 7개 평판이다. VCK = VNL = VGFP = 50 ㎖. 따라서 PCK, PNL 또는 PGFP에 대한 등식을 풀면 50 ÷ 14.5 = 3.4개 평판이다. 반올림하면 각각 PCK = PNL = PGFP = 4개 평판이다.
Figure 112012001096283-pct00005
293T 세포를 PBS로 세척하고 단층을 덮기에 충분한 트립신을 첨가한다. 실온에서 10분간 배양한 다음, 접시 측면을 두드려 세포를 떼어낸다. 세포를 50 튜브에 수집한다. 각 평판을 소량의 D10F로 세척한다. 세척 배지와 세포를 수집하고 합친다. 완전히 혼합시키고 300 ㎕ 분획을 Cedex 컵에 옮겨 세포를 계수한다. 다른 방법으로서, 트립판 블루 및 혈구계수기를 사용한다. 350 x g로 10분간 원심분리한다. 상청액을 흡인하고 펠렛을 신선한 D10F에 재현탁시킨다. 각 바이러스를 위해 필요한 293T 세포의 평판(P) 수를 산정한 단계로부터 평판 총 수를 계산한다 (POS + PCK + PNL + PGFP). 아래 표의 파종 밀도를 이용하여, 각 평판에 필요한 293T 세포 수를 파종한다. D10F에서 약 24시간 37℃/5% CO2로 배양한다. 배양물이 세포단층 이상 또는 이하인 경우 형질감염 효율이 감소하며, 그럼으로써 바이러스 생성이 줄어든다. 세포를 현미경을 관찰하여 세포단층이 최적 (약 90-95%)이 되도록 확인한다.
293T 세포 평판의 각 세트의 형질감염을 위해 각 MMLV 또는 대조 플라스미드 (μgOS, μgCK, μgNL 또는 μgGFP)가 얼마나 필요한가를 평가하기 위해 계산한다. 계산을 간소화하기 위해, 각 플라스미드 DNA 시료의 농도를 1.0 또는 2.0 mg/㎖로 조절할 것을 권장한다. 아래 차트 ("벡터"로 표시된 행을 참조)에서 적당한 값을 선택하고 POS, PCK, PNL 또는 PGFP로 곱한다. 그런 다음 플라스미드 DNA 농도 (COS, CCK, CNL 또는 CGFP)로 나누어 필요한 용량 (μlOS, μlCK, μlNL 또는 μlGFP)을 결정한다.
Figure 112012001096283-pct00006
옵션: 각 플라스미드 DNA 농도 (C)를 1 ㎍/㎕로 조정한다. 상기 실시예에 따라 C=1; POS=7로 가정하면 μgOS=(27 ㎍)x7=189÷COS=189 μlOS. 같은 실시예에 따라 PCK=PNL=PGFP=4이므로 μgCK=(27 ㎍)x7=189÷CCK=189 μlCK, μgNL=(27 ㎍)x4=189÷CNL=108 μlNL, μgGFP=(27 ㎍)x4=108÷CGFP=108 μlGFP.
ALL 평판을 위해 필요한 각 보조 플라스미드 (μgGagPol,μgNFk B,μgVSV) 또는 형질감염 시약 (μlPEI)의 총량을 결정하기 위해, 상기 차트 (Gag/Pol, NFkB, VSVG 또는 PEI로 표시된 행)로부터 적절한 값을 선택하고 총합 (POS+PCK+PNL+PGFP)를 곱한다. 이어서 플라스미드 DNA 농도 (COS, CCK, CNL 또는 CGFP)로 나누어 필요한 용량을 결정한다. 실시예에 따라 (POS+PCK+PNL+PGFP)=7+4+4+4=19이고 C=1을 가정하면 μgGagPol=(8.1 ㎍)x19=153.9÷CGagPol=153.1 μlGagPol, μgNFk B=(2.7 ㎍)x19=51.3÷CNFk B=51.3 μlNFk B, μgVSV=(2.7 ㎍)x19=51.3÷CVSVG=51.3 μlVSV, 108 μlx19=2.052 ㎖.
10 cm 평판에서의 형질감염: 튜브 1OS: (POS x 0.5) ㎖의 OptiMEM 를 분취하고, (POS x 40) ㎕ PEI를 혼합하면서 적가한다. 측면을 접촉하지 않는다. 5분간 실온에서 배양한다. 튜브 2OS: 제2 튜브에 (POS x 0.5) ㎖의 OptiMEM 를 분취한다. 적절한 비율 (10:3:3:1)의 플라스미드 칵테일을 준비한다. 상기 차트로부터 적절한 값 (μgGagPol,μgNFk B,μgVSV)을 선택하고 POS로 곱해서 필요한 플라스미드 양을 구한다. 이어서 COS, CGagPol, CNFk B 또는 CVSVG로 나누어 필요량 (μlOS, μlGagPol, μgNFkB 및 μlVSVG)를 결정한다. 이들 용량을 튜브 2OS에 첨가하고 혼합한다: μlOS + μlGagP ol + μgNFk B + μlVSVG. 이들 단계를 OS 플라스미드 대신에 NL 또는 CK 또는 Sox2-GFP로 대체하고 반복한다. 상응하는 튜브 세트를 준비한다: 튜브 1NL 및 2NL 또는 튜브 1CK 및 2CK 또는 튜브 1GFP 및 2GFP. 적당한 P 및 C 값을 바꾸어 튜브 2 칵테일에 적절한 용량을 계산한다. DNA/PEI 혼합물을 제조하기 위해, 각 튜브 #1을 상응하는 튜브 #2와 혼합하고 실온에서 20분간 배양한다. 각 293T 평판을 5 ㎖ PBS로 2회 세척한다. 각 평판에 4 ㎖ OptiMEM을 첨가한다. 1 ㎖의 플라스미드 DNA/PEI 혼합물을 각 평판에 직접 적가한다. 37℃/5% CO2에서 4-6시간 배양한다. 배지를 흡인한 다음, 각 평판을 5 ㎖ PBS로 세척한다. 5 ㎖의 D10F + 50 mM HEPES 배지를 각 평판에 첨가한다. 37℃/5% CO2에서 밤새 배양한다. Sox2-GFP-감염된 (대조) 세포를 형광 현미경으로 옮긴다. 형광은 탐지가능해야 한다. 37℃/5% CO2에서 추가로 24시간 더 배양한다.
15 cm 평판에서의 형질감염: 튜브 1OS: (POS x 1.0) ㎖의 OptiMEM 를 분취하고, (POS x 108) ㎕ PEI를 혼합하면서 적가한다. 측면을 접촉하지 않는다. 5분간 실온에서 배양한다. 실시예에 따라 POS=7: 7 ㎖의 OptiMEM을 튜브 1OS에 분취하고 1.96 ㎖ PEI를 첨가한다. 튜브 2OS: 제2 튜브에 (POS x 1.0) ㎖의 OptiMEM을 분취한다. 실시예에 따라 POS=7: 7 ㎖의 OptiMEM을 튜브 2OS에 분취한다. 적절한 비율 (10:3:3:1)의 플라스미드 칵테일을 준비한다. 상기 차트로부터 적절한 값 (μgGOS,μgGagP ol,μgNFk B 및 μgVSVG)을 선택하고 POS로 곱해서 필요한 플라스미드 양을 구한다. 이어서 COS, CGagPol, CNFk B 또는 CVSVG로 나누어 필요량 (μlOS, μlGagPol, μgNFk B 및 μlVSVG)를 결정한다. 이들 용량을 튜브 2OS에 첨가하고 혼합한다: μlOS + μlGagPol + μgNFk B + μlVSVG.
실시예에 따라, POS=7이고 모든 플라스미드에 대해 C=1을 가정하면, μgos=27 ㎍ x 7 평판 = 108 ÷ COS = 108 μlOS, μgGagPol = 8.1 x 7 = 56.7 ÷ CGagPol = 56.7 μlGagPol, μgNFk B = 2.7 x 7 = 18.9 ÷ CNFk B, μgVSVG = 2.7 x 7 = 18.9 ÷ CNFk B = 18.9 μlVSVG. 이들 용량을 튜브 2OS에 첨가하고 혼합한다. 이들 단계를 OS 플라스미드 대신에 NL 또는 CK 또는 Sox-GFP 플라스미드로 대체하여 반복한다. 상응하는 튜브 세트를 준비한다: 튜브 1NL 및 2NL 또는 튜브 1CK 및 2CK 또는 튜브 1GFP 및 2GFP. 적당한 P 및 C 값을 대입하여 튜브 2 칵테일을 위해 적절한 용량을 산출한다. DNA/PEI 혼합물을 제조하기 위해, 각 튜브 #1을 상응하는 튜브 #2와 혼합하고 실온에서 20분간 배양한다. 각 평판을 10 ㎖ PBS로 2회 세척한다. 각 평판에 13 ㎖ OptiMEM을 첨가한다. 2 ㎖의 플라스미드 DNA/PEI 혼합물을 각 평판에 직접 적가한다. 37℃/5% CO2에서 4-6시간 배양한다. 배지를 흡인한 다음, 각 평판을 15 ㎖ PBS로 세척한다. 5 ㎖의 D10F + 50 mM HEPES 배지를 각 평판에 첨가한다. 37℃/5% CO2에서 밤새 배양한다. Sox2-GFP-감염된 (대조) 세포를 형광 현미경으로 옮긴다. 형광은 탐지가능해야 한다. 37℃/5% CO2에서 추가로 24시간 더 배양한다.
바이러스 상청액의 수확. Sox2-GFP-형질도입 세포를 형광 현미경으로 다시 옮긴다. 세포 대다수는 초록색 형광을 발해야 하며 형광은 평판을 따라 균일해야 한다. 또한, 바이러스 생성 세포는 세포 형태에서 뚜렷한 변화를 나타내야 한다. 형질감염 세포의 각 세트로부터 바이러스 함유 상청액 배지를 모은다 (주의: 상청액은 감염성 바이러스를 함유한다). 바이러스 상청액을 0.45 ㎛ 또는 0.8 ㎛ 필터를 통해 여과시켜 세포 및 파편을 제거한다 (주의: 셀룰로즈 아세테이트 또는 PES 저 단백질 결합 필터를 사용하고 니트로셀룰로즈 필터는 사용해서는 안 된다). MMLV는 한정된 보관수명을 갖는다. 바이러스 상청액은 4℃에서 4일 미만으로 저장한다. 옵션: 상청액은 -80℃에서 저장할 수 있다. 그러나 동결-해동 주기는 기능적 활성의 상실을 일으킨다. 다음의 특성중 적어도 하나를 사용하여 바이러스 역가를 즉시 평가한다: a) Jurkat 세포 또는 T-세포의 증식에 대한 기능적 활성 및/또는 b) 상청액 ㎖ 당 존재하는 바이러스 RNA의 정량. MMLV 벡터의 정석 대조 검정이 아래에 기술된다.
96-웰에서 T-세포의 높은 형질도입 효율을 달성하기 위해, 바이러스를 농축하는 것은 중요하다. 그러나, 농축된 바이러스는 불안정하다. 게다가, T-세포 배양물이 최고로 증식하는 (따라서 가장 쉽게 감염되는) 시간의 창이 좁다. 따라서, 표적 세포의 제조와 농축 단계를 조율하는 것이 중요하다. QC 검정(들)이 충족되었을 때 표적 PBMC의 T-세포를 활성화시키고 재프로그래밍을 위해 바이러스 상청액을 농축한다.
4. 바이러스 활성에 대한 정석 대조 검정을 실시한다:
본 프로토콜은 다음의 MMLV 벡터로 세포를 형질도입함으로써 형질도입 효율을 평가하는 방법을 기술한다: Oct4-Sox2 및 c-Myc-Klf4 또는 Oct4-Sox2 및 Nanog-Lin28 또는 대조 Sox2-GFP 벡터. 이들 검정은 iPS 세포의 유도를 촉진시키는데 사용하는 목적이 있다.
바이러스 활성에 대한 정석 대조 검정: 주의: 바이러스의 상대적인 불안정성때문에 바이러스 상청액이 수집된 날에 QC 검정중 하나 (또는 전부)를 미리 준비하는 것이 중요하다. 바이러스는 -70℃에 저장할 수 있다. 그러나, 동결-해동 주기 및/또는 3주 이상의 저장은 활성의 상실을 일으킨다. 수용가능한 QC 검정 결과를 얻은 후 PBMC는 소생되어야 한다.
제조사의 프로토콜 (Clontech)에 따라 각 바이러스 상청액의 분획을 사용하여 정량 실시간 RT-PCR을 실시한다. 다른 방법으로서 (또는 추가적으로), 증식하는 Jurkat 세포를 수집하고 Cedex를 사용하여 계수한다. 1x106/㎖의 세포를 4 ㎍/㎖ 폴리브렌을 함유한 R10F중에 재현탁시킨다. 웰 당 100 ㎕의 세포를 96-웰 평판에 파종한다. 50 ㎕의 바이러스를 3개 웰에 첨가하고, 바이러스를 평판의 수 개 열을 따라 연속 희석에 의해 적정한다. 48 시간 배양한 다음 세포를 FACS 분석을 위해 수집한다. Oct4의 세포내 면역표지 및 유세포분석에 대한 절차를 참조한다. 대안으로서 (또는 추가적으로) 반-정량 PCR 분석을 위해 감염된 Jurkat 세포를 수집한다. 바이러스 프렙이 QC를 통과하면, T-세포의 형질도입을 위한 다음 단계를 진행한다.
5. 공여자 PBMC의 소생 및 T-세포의 활성화
사람 T-세포의 효율적인 재프로그래밍은 만일 바이러스 상청액의 생성 및 전달이 표적 세포의 활성화와 주의 깊게 조율된다면 MMLV 벡터만으로도 달성할 수 있다. PBMC의 혼합 집단으로부터 CD3+ 세포의 증식에서 사이토카인-유도된 버스트로서 성공적인 활성화가 여기에 공개되고, 배양 48 내지 72시간 사이에서 육안으로 보이는 "모세포" 콜로니가 형성된다. 이 활성화 프로토콜을 MMLV-기초로 한 재프로그래밍 벡터와 함께 이용하기 위해서는 MMLV 상청액이 불안정하다는 것을 주지하는 것이 중요하다. 따라서, 모세포 콜로니가 형성되기 하루 전에 신선한 바이러스가 T-세포 배양물 적용될 수 있도록 면밀하게 통제된 일정에 따라 바이러스를 준비해야 한다. 이 프롤토콜은 상기된 바와 같이 냉동보존된 세포의 소생 및 모세포 콜로니의 유도를 제시한다. PBMC의 다른 소스가 사용될 수 있다.
배지 및 사이토카인의 제조. 바이러스의 첨가 전에 세포가 48시간 동안 활성화되어야 한다. 따라서, 이 단계는 2일째로서 지정한다. 재프로그래밍은 0일에 시작한다. AIM-V 배지에 작용 농도의 pen/strep/글루타민을 첨가한다. 2주 미만 동안 4℃에 저장한다. 소량의 IL2 분획을 준비하고 -20℃에 저장해 둘 것을 권장한다. 사용시 1 분획을 해동시킨다. 1 분획을 해동한 후 2주 미만 동안 4℃에 저장해 둔다. OKT3 (1 ㎎/㎖ 항-CD3)는 4℃에 저장해 두어야 한다. AIM-V 배지 1 ㎖중에 1 ㎕를 희석하여 1 ㎍/㎖ 중간 희석액을 조성한다.
공여자 PBMC의 소생 및 T-세포의 활성화
PBMC가 해동되는 날을 2일째로 지정한다. 저장소에서 PBMC를 제거하고 37℃ 수욕에서 급속히 해동한다. 세포 (및 동결 배지)를 등량의 따스한 RPMI 배지로 희석한다. 유연하게 혼합하고 15 ㎖ 튜브로 옮긴다. RPMI로 서서히 희석하여 10 ㎖의 총량을 조성한다. 철저히 혼합하고, 300 ㎕ 분획을 제거한 다음, 1 미크론의 크기 한계치로 Cedex 알고리즘을 사용하여 세포를 계수하였다. 다른 방법으로서, 세포를 트립판 블루로 염색하고 혈구계수기로 계수한다. 주의: 일차 PBMC 시료 (냉동보존 이전)에 존재한 세포의 50%를 상실하는 것이 흔치않은 것은 아니다. 그러나, 남은 세포 90%가 생존해 있어야 한다. 세포를 350 x g로 10분간 원심분리하고, 상청액을 흡인하며, 따스한 AIM-V + pen/strep/글루타민중에 2 x 106 생존 세포/㎖의 밀도로 재현탁시킨다. 300 IU/㎖ IL2 및 10 ng/㎖ OKT3 항체를 첨가한다. 세포를 혼합하고, 웰 당 100 ㎕를 평저 96-웰 조직 배양 평판에 분배한 다음, 37℃, 5% CO2에서 배양한다. 페리미터 웰은 보다 현저한 증발이 일어나기 때문에 가능하다면 페리미터 웰을 사용하는 것은 피한다. 48 시간 후 (0일) 20배 대물렌즈 (또는 더 높은 배율로)를 장착한 명시야현미경으로 관찰한다. 주의: 세포 분열 및 세포 덩어리 (발생기 모세포 콜로니 형성)의 증거가 탐지되어야 한다.
6. 바이러스 상청액의 농축
이 프로토콜은 재프로그래밍 벡터의 조합 (cMyc-Klf4 또는 Nanog-Lin28과 함께 Oct4-Sox2)으로 형질감염한 후 293T 세포로부터 수집된 레트로바이러스 상청액을 농축시킴으로써 MMLV 벡터의 역가를 증가시키는 두 가지 개별 방법을 제시한다. 대표적인 벡터 지도는 도 11a-11c에 나타나 있다. 이것은 T-세포의 레트로바이러스 형질도입에 의한 iPS 세포의 유도를 촉진하려는 의도이다. 바이러스 상청액의 역가는 상기된 MMLV 벡터의 정석 대조 검정에 따라 검정할 것을 권장한다.
대용량의 바이러스를 위해, 렌티X 방법을 권장한다. 이 방법은 철야 배양을 요구하므로, 1일째에 개시되어야 한다. 다른 방법으로서, 30 ㎖ 이하의 바이러스 프렙인 경우 아미콘 방법을 0일에 사용할 수 있다.
미농축된 MMLV 상청액 (상기된 절차에 따라 제조됨)은 유의적 활성 상실을 피하기 위해 4℃에 4일간 저장해 둘 수 있다. 어느 방법 (아래)을 사용하든 상청액을 농축한 후 바이러스는 빙냉에서 유지하고 가능한 곧 사용하여야 한다. 만일 이 과정이 종료될 시점에 표적 세포의 감염 준비가 되지 않았다면 농축된 바이러스는 -80℃에 저장한다.
렌티X 방법에 의한 바이러스의 농축 (-1일째). 주의: 이 방법은 대규모 바이러스 농축 (상청액 용량 ＞ 30 ㎖)을 위해 권장된다. 상청액을 50 ㎖ 튜브로 옮기고 렌티-X 농축제를 제조사의 권장 내용에 따라 첨가한다. 3 용량의 등명한 바이러스 상청액을 1 용량의 렌티-X 농축제와 배합한다. 유연한 전위에 의해 혼합한다. 4℃에서 밤새 배양한다. 18-24시간 후 0일에 시료를 1500 x g로 4℃에서 45분간 원심분리한다. 원심분리 후 회색 펠렛이 보인다. 조심스럽게 상청액을 제거하고 펠렛이 교란되지 않도록 한다. 잔여 상청액을 피펫 팁이나 1500 x g로 간단히 원심분리하여 제거할 수 있다. 펠렛을 냉 D10F를 사용하여 최초 용량의 1/50으로 유연하게 재현탁시킨다. 처음에 펠렛은 약간 점성일 수 있지만 빠르게 현탁액으로 바뀐다. 즉시 바이러스를 표적 세포에 적용한다.
아미콘 여과 방법에 의한 바이러스의 농축 (0일). 이 방법은 30 ㎖ 이하의 바이러스 상청액 프렙을 농축할 때 사용한다. 10 ㎖의 PBS를 가하여 아미콘Y 100,000 MW 카세트를 세척하고, 이 장치를 1000 x g로 3분 동안 또는 PBS가 필터를 통과할 때까지 원심분리한다. 아미콘 카세트에 15 ㎖의 상청액 바이러스를 적용하고 2000 x g로 20분간 회전시킨다. 전형적으로, 이 결과는 약 10배 농축 (용량 기준)으로 나타난다. 시료를 추가로 5 내지 10분 더 회전시켜 바이러스를 더 농축한다. 이 과정을 반복하여 용량을 50배까지 줄일 수 있다 (최종 용량은 약 300 ㎕이다). 각 바이러스 벡터 상청액에 대해 이 과정 (동시에)을 반복한다. 권장 사항: 4개 이상의 아미콘 카세트를 한번에 진행하지 않아야 한다. 오래 지연되는 동안 상청액은 카세트로 수동적으로 흘러나와 반대편 회전자 암을 따라 중량의 불균등 분포가 이루어진다. 이것은 원심분리의 불균형을 초래할 수 있다. 농축물을 수집한다. 즉시 바이러스를 표적 세포에 적용한다.
7. 활성화 T-세포의 형질도입 (0일)
이 과정은 농축된 MMLV-기본 재프로그래밍 벡터로 사람 말초 혈액 T-림프구를 형질도입하기 위한 것이다. 이 프로토콜은 96-웰 평판에서 MMLV-기본 재프로그래밍 벡터 Oct4-Sox2, c-Myc-Klf4 또는 Nanog-Lin28 또는 Sox2-GFP 또는 이들의 조합에 의한 T-세포의 형질도입을 제시한다. 이 프로토콜을 이용하기 전에 바이러스 활성을 평가하기 위해 상기된 정석 대조 검정이 권장된다.
형질도입 당일은 재프로그래밍 과정의 시작을 나타낸다 (0일로 표기됨). 이 시점은 PBMC가 해동되고 96-웰에서 활성화된 후 (절차 5 (공여자 PBMC의 소생 및 T-세포의 활성화)에 기술된 바와 같이) 48시간 경과해서 일어난다. 농축된 MMLV 벡터는 절차 3, 4 및 6에 따라 사전에 준비되어야 한다.
세포를 위상차 현미경으로 관찰한다. 발생기 모세포 콜로니 형성의 증거가 있어야 한다.
옵션: 세포를 수거하고 계수한다. 전형적으로, PBMC의 수는 활성화 24시간 (-2일 내지 -1일) 내에 웰 당 약 25-50,000 세포로 상당히 감소한다. 24 내지 48시간 사이에 (-1일 내지 0일), 세포 수는 전형적으로 변하지 않는다. 0일과 1일째 사이에, ATP 함량은 증가하고 발생기 모세포 콜로니 형성이 나타난다. 0일에서의 세포 수는 전형적으로 웰 당 1 내지 2x105이다. 0일과 1일째 사이에, 모세포 콜로니는 뚜렷이 나타나야하고 세포 수는 상당히 증가한다.
옵션: 세포를 FACS 분석을 위해 수거하여 T-세포를 성상확인한다. 다수의 PBMC 공여자에 대한 사전 시험들은 0일에 ＞90%의 세포가 항-CD3 표면 표지를 나타냄을 보여준다. CD4+ 및 CD8+ 세포의 분포는 다양하다. 전형적으로 CD4+ 세포가 CD8+ 세포에 비해 2배 존재한다.
등량의 각 농축 바이러스를 배합하고 8 ㎍/㎖ 폴리브렌 및 300 unit/㎖ IL-2를 첨가한다. 이 혼합물은 주어진 웰 수에 대해 감염시키기에 충분한 정도로 준비한다.
절차 3에 기술된 과정을 따라, 10개의 상이한 공여자 T-세포 시료를 7개 웰에 파종하고, 각 시료는 96-웰에서 활성화된다; 이들은 총 70개 웰을 점유한다. 각 공여자로부터의 2개 웰은 OS+CK 재프로그래밍 바이러스 (nOS + CK=20)을 수용 한다. 2개 웰은 OS+NL 재프로그래밍 바이러스 (nOS + NL=20)를 수용한다. 2개 웰은 대조 Sox2-GFP 바이러스 (nGFP=20)을 수용한다. 나머지 한 개 웰은 비-형질도입된 대조군을 대표한다. (50 μlOS + 50 μlCK ) x nOS + CK = 2 ㎖를 배합하고 2 ㎕의 폴리브렌과 1.2 ㎕의 IL-2를 첨가한다.
(50 μlOS + 50 μlNL ) x nOS + NL = 2 ㎖를 배합하고 2 ㎕의 폴리브렌과 1.2 ㎕의 IL-2를 첨가한다. (50 μlGFP + 50 D10F) x nGFP = 2 ㎖를 배합하고 2 ㎕의 폴리브렌과 1.2 ㎕의 IL-2를 첨가한다. 모의-감염을 위해 2 ㎖의 D10F, 2 ㎕의 폴리브렌과 1.2 ㎕의 IL-2를 배합한다.
손대지 않은 웰 각각에 100 ㎕의 바이러스 칵테일을 첨가한다. 세포를 피펫으로 유연하게 혼합한다. 100 ㎕의 D10F + 300 IU/㎖ IL2 + 8 ㎍/㎖ 폴리브렌을 첨가하여 모의-감염을 실시한다. 세포를 피펫으로 유연하게 혼합한다. 적절한 생물봉쇄 어뎁터를 사용하여 96-웰 평판을 32℃에서 1000 x g로 90분 동안 원심분리한다. 평판을 배양기로 옮겨 37℃/5% CO2에서 밤새 배양한다.
MEF-공동-배양 (절차 8)에 의해 재프로그래밍을 준비하기 위한 조사된 MEF의 평판배양 (0일 또는 1일째)
1일째 - 바이러스의 최초 노출 후 24시간 경과하여, 세포 형태를 검사한다. 현미경상에서 모세포 콜로니가 뚜렷하게 보여야 한다. 옵션: 세포를 수거하고, 원심분리하며, (무바이러스) D10F 배지에 재현탁시키고, Cedex에서 계수한다. 다른 방법으로서, 트립판 블루 및 혈구계수기를 사용한다.
세포를 교란시키지 않으면서 각 웰로부터 100 ㎕의 배지를 주의 깊게 제거한다. 다수 웰의 경우, 멀티-채널 피펫을 사용하고, 팁을 너무 내려 팁이 각 웰의 바닥에 닫지 않도록 주의한다. 이 배지를 10% 표백제가 함유된 비이커 또는 트레이에 버린다. 배지를 100 ㎕의 신선한 D10F + HEPES + IL2 (300 μ/㎖)로 교환한다. 다음날 배지 제거 단계를 반복한다 (2일째).
아래 기술된 절차 9에 따른 T-세포 증식의 검증 및 형질도입 효율 (2일째)의 평가.
8. 조사된 MEF의 평판배양 (0일 또는 1일째):
본 단락은 젤라틴 피복된 웰 상에서 마우스 배아 섬유아세포 (MEF)를 평판배양하는 방법을 기술한 것이고, 이것은 iPS 세포의 유도를 촉진하고자 하는 의도이다.
적응용 배지 (CM)의 생성을 위해 조사된 MEF를 평판배양한다. 예정된 사용 2-3일 전에 MEF를 주문한다. T-세포 재프로그래밍을 위한 절차 3의 실시예를 따라, 6-웰 포맷에서 약 20회 "급식" 동안의 재프로그래밍 공동배양물을 유지하는데 필요한 MEF-CM의 양을 계산한다. 각 급식은 웰 당 1.25 ㎖의 제거 및 교환을 요구한다.
10개 공여자 시료 (형질도입된 T-세포) x 2개 실험 조건 (SO+CK 대 SO+NL) x 조건 당 3개 웰 = 60개 웰이 사용되었다. SO는 Sox2 및 Oct4를 갖는 이중시스트론 벡터를 가리키고, CK는 cMyc 및 Klf4를 갖는 이중시스트론 벡터를 가리키며, NL은 Nanog 및 Lin28을 가리키고, 모두 어떠한 형광 마커도 함유하지 않는다 (벡터 지도는 도 11a-11c에 도시되어 있다). MEF-CM의 필요량을 계산한다 (60 x 20 x 1.25 ㎖ = 1.5 리터).
충분한 용량의 MEF-CF를 생성하는데 필요한 T75 플라스크-MEF 배양물의 수를 계산한다. (주목: 한 개 플라스크로부터의 반복된 수확은 약 120 ㎖의 MEF-CM을 생성한다). 상기 실시예에 따라 1.5 리터의 MEF-CM을 생성하기 위해서는 1500 ㎖ ÷ 120 ㎖/플라스크 = 12.5개 플라스크. 반올림해서 13개 플라스크.
T75 플라스크 당 12 ㎖의 멸균 0.1% 젤라틴을 첨가한다. 배양기 (37℃/5% CO2)에서 1시간 이상 배양한다. 젤라틴을 흡인하고 20 ㎖의 고밀도 조사된 MEF (∼2.1 x 105 세포/㎖)를 첨가한다. 밤새 배양한다 (37℃/5% CO2). MEF가 부착되었는지 세포를 육안으로 확인한다. 평판배양 24시간 후 배지를 흡인하고 플라스크 당 20 ㎖의 hES 배지로 교환한다. 24시간 후, ∼20 ㎖의 MEF-CM을 각 플라스크로부터 수거한다. 추가 5일 동안 단계 6.8 및 6.9를 반복한다. MEF-CM을 -20℃로 동결시킨다. 4 ng/㎖ zbFGF를 첨가하고 IPS 배양을 위해 사용하기 전에만 여과한다.
공동-배양물의 재프로그래밍을 위해 조사된 MEF를 평판배양한다 (0일 또는 1일째). 예정된 사용 2-3일 전에 MEF를 주문한다. 공동-배양물의 재프로그래밍을 위해 형질도입 세포를 첨가하기 1 내지 2일 전에 MEF는 평판배양되어야 한다. T-세포 재프로그래밍을 위한 절차 3의 실시예에 따라, 수용하는데 필요한 MEF의 웰 수를 계산한다: 10개 공여자 시료 x 공여자 당 3개 웰 x 3개 실험 조건 (SO+CK 대 SO+NL 대 GFP 대조군) = 90개 웰. 필요한 6-웰 평판의 수를 계산한다. (90÷6=15개 평판). 2 ㎖의 멸균 0.1% 젤라틴/웰 (6-웰 포맷)을 첨가한다. 옵션: 96-웰 평판을 웰 당 100 ㎕ 젤라틴으로 피복시킨다. 배양기 (37℃/5% CO2)에서 적어도 1시간 배양한다. 젤라틴을 흡인하고 2.5 ㎖의 조사된 MEF 세포 현탁액을 각 웰 (6-웰) 상에 첨가한다. 옵션: 96-웰의 경우, 젤라틴을 흡인하고 200 ㎕의 MEF 세포 현탁액을 각 웰상에 첨가한다. 밤새 (37℃/5% CO2) 배양한다. MEF가 부착되었는지 세포를 육안으로 확인한다.
9. 형질도입 효율의 평가를 위한 정석 대조 검정의 실시 (2일째):
이 절차는 사람 말초 혈액 T-세포의 MMLV 형질도입을 평가하는 정석 대조 검정을 제시한다. 이 검정은 Oct4-Sox2, c-Myc-Klf4, Oct4-Sox2 및 Nanog-Lin28의 조합을 포함한 농축된 MMLV 벡터에 세포가 노출된 후 48시간 경과하여 표적 T-세포군에 존재하는 전이 유전자 또는 재프로그래밍 인자의 존재를 탐지하는데 그 의도가 있다.
상기 절차에 따라 사람 T-세포를 활성화시킨다. 48시간 후, 절차 7에 따라 활성화 T-세포를 감염시킨다. Cedex 또는 혈구계수기를 사용하여 세포를 계수한다.
절차 3의 실시예에 따라 (이어서 절차 7의 진행), 활성화 세포를 교란하지 않으면서 각 웰로부터 100 ㎕의 상청액 배지를 제거한다. 모든 웰은 약 100 ㎕의 잔여 배지를 함유해야 한다. 두 Sox2-GFP-감염 웰중 하나로부터 잔여 100 ㎕의의 세포를 혼합하고 수확한 다음, 세포를 Cedex 컵으로 직접 옮긴다. 각 웰을 200 ㎕의 PBS로 세척하고, 수확한 다음, 세척액을 Cedex 컵에다 배합한다. 필요한 경우 최종 용량을 300 ㎕로 조정한다. 10개 공여자 T-세포 시료 각각을 위해 혼합 및 세척 단계를 반복한다.
T-세포 알고리즘 (크기 한계치 = 1 미크론)을 사용하여 Cedex에서 세포를 계수한다. 세포 밀도를 기록한다 (주의: 웰 당 2-4 x 105이어야 한다). 다른 방법으로서, 한개 웰로부터의 세포를 철저히 혼합하고 10 ㎕를 제거하며 10 ㎕의 트립판 블루와 혼합한 다음, 세포를 혈구계수기로 계수한다. (주의: 이 계수 방법은 Cedex보다 정밀도가 떨어지지만 적은 수의 세포를 사용한다).
형질도입된 T-세포의 형질도입 효율의 평가.
옵션: 형광 현미경을 사용하여 Sox2-GFP 바이러스로 형질도입된 세포를 관찰한다. 각 공여자 시료 (10개 웰)로부터의 Sox2-GFP-감염된 T-세포의 1개 웰로부터 남은 100 ㎕의 세포를 멀티-채널 피펫으로 혼합하고 수집한다. 96-웰 V-바닥 수집 평판에서 상응하는 웰 세트로 세포를 옮긴다. 각 공여자 시료 (10개 웰)로부터의 대조 웰 (비-감염)로부터 남은 100 ㎕의 세포를 혼합하고 수집한다. 각 웰을 75 ㎕의 PBS로 세척하고, 세척물을 상응하는 수집 평판 웰로 수집하고 배합한다. 수집한 평판배양물을 350 x g로 10분간 원심분리한다. 각 웰의 펠렛을 교란시키지 않으면서 멀티-채널 피펫으로 상청액을 조심스럽게 제거한다. 상청액을 10% 표백제가 함유된 비이커 또는 트레이에 버린다. 펠렛을 웰 당 150 ㎕ FACS 완충액으로 재현탁하고 세척한다. 수집한 평판배양물을 350 x g로 10분간 원심분리한다. 각 웰의 펠렛을 교란시키지 않으면서 상청액을 조심스럽게 제거한다. 펠렛을 2-5 ㎍/㎖ 항-CD3-APC가 함유된 FACS 완충액에 재현탁시킨다. 실온하에 암실에서 45분간 배양한다.
수집한 평판배양물을 350 x g로 10분간 원심분리한다. 각 웰의 펠렛을 교란시키지 않으면서 상청액을 조심스럽게 제거한다. 펠렛을 웰 당 150 ㎕ FACS 완충액으로 재현탁시키고 세척한다. 원심분리 단계를 반복한다.
펠렛을 웰 당 1 ㎍/㎖ 프로피듐 요오다이드가 함유된 100 ㎕ FACS 완충액으로 재현탁시키고 세척한다. 세포를 Accuri로 분석한다. GFP+를 발현하는 생세포의 퍼센트를 산정함으로써 형질도입 효율을 평가한다. GFP+세포군에 대한 게이팅에 의해 CD3+인 GFP+ 세포의 퍼센트를 평가한다.
10. 형질도입 T-세포와 MEF의 공동배양 (3-30일째)
이 절차는 마우스 배아 섬유아세포 (MEF)상에서 재프로그래밍 인자로 형질도입된 사람 T-세포를 공동배양하기 위한 과정을 제시한다. 이 프로토콜은 부착성 MEF상에서 형질도입된 T-세포의 공동배양 및 이들 세포에 재급식하는 방법에 관한 것이다.
1. 절차 8에 따라 MEF-적응용 배지를 제조한다. 이 시약을 아래 단계 4의 진행 전에 준비한다.
2. (절차 8에 따른) 재프로그래밍을 위해 조사된 MEF를 평판배양한다. 웰 당 (6-웰 포맷에서) 2.5 ㎖의 MEF를 또는 웰 당 (96-웰 포맷에서) 200 ㎕를 수용하고 평판배양한다. 24-72시간 후, 배지를 2 ㎖의 hES:D10F 배지 (6-웰 포맷의 경우)로 또는 웰 당 100 ㎕ (96-웰 포맷의 경우)로 교환한다.
3. T-세포가 레트로바이러스에 노출된 후 2일 경과하여 정석 대조 검정을 실시하여 형질도입 효율을 평가한다 (참조: 서류번호 100405.RDL.09). T-세포의 프로그래밍시 이 시점은 2일째로 지정된다. 만일 형질도입 효율이 적당하다면, 단계 4를 진행한다.
4. 형질도입된 T-세포를 수집하고 (절차 7에 따라) 활성화 및 형질도입이 성공적임을 절차에 따라 검증한다.
6-웰 MEF 평판의 경우: 웰 당 0.5-4 x 105 세포 (25-100 ㎕의 용량으로)를 옮긴다. 전체 표면을 따라 적가한다. 옵션: MEF 평판상의 3개 웰을 따라 유입 세포 수를 적정한다. 96-웰 MEF 평판의 경우, 웰 당 1-8 x 104 세포 (10-25 ㎕의 용량으로)를 옮긴다. (주의: 가능하다면 페리미터 웰의 사용을 피한다). 옵션: MEF 평판상의 복수 웰을 따라 유입 세포 수를 적정한다.
서류번호 100405_RDL_03에 기술된 아래 실시예를 실시한다: 10개 공여자 시료로부터 유도된 10 세트의 활성화 T-세포 배양물이 있다. 각 공여자 시료는 96-웰 평판의 7개 웰을 따라 배열하고 T-세포를 활성화한다. 2개 웰은 SO+CK MMLV 벡터로 감염되었고, 2개 웰은 SO+NL MMLV 벡터로 감염되었다.
각 공여자로부터 SO+CK 감염된 T-세포를 수집하고 세포를 FACS 튜브 또는 15 ㎖ 코니칼 튜브에서 배합한다. 각 공여자로부터 SO+NL 감염된 T-세포를 수집하고 세포를 개별 튜브에서 배합한다. 옵션: 파종 밀도를 정확하게 확인하기 위해 (즉, 얼마나 많은 T-세포가 MEF 평판에 전달되어야 하는가를 알아보기 위해), 세포를 혼합하고, 10 ㎕ 분획을 제거한 다음, 10 ㎕ 트립판 블루와 배합하고, 혈구계수기로 세포를 계수한다. 적절한 생물봉쇄 기구 및 원심분리 어뎁터를 사용하여 시료를 350 x g로 10분간 원심분리한다. 상청액을 주의 깊게 제거하고 이 배지를 10% 표백제가 함유된 비이커 또는 트레이에 버린다. 세포를 400 ㎕의 hES:D10F로 재현탁시킨다 (총 약 4-8 x 105 세포). 200 ㎕의 세포 (2-4 x 105 세포)를 혼합하고 MEF 평판상의 1개 웰 (6-웰)에 적가한다.
남은 세포를 hES:D10F 배지로 2배 희석한 다음, 200 ㎕의 세포 (1-2 x 105 세포)를 동일한 MEF 평판상의 제2 웰에 적가한다. 남은 세포를 hES:D10F 배지로 희석한 다음, 200 ㎕의 세포 (약 0.5 x 105 세포)를 동일한 MEF 평판상의 제3 웰에 적가한다. 37℃/5% CO2에서 밤새 배양한다.
5. 유지: 급식 일정 (4일째-30일째). 2일 후 (4일째), 다음의 방법을 사용하여 각 웰로부터의 배지 50%를 hES 배지 + 100 ng/㎖의 제브라피쉬 FGF (성장 배지)로 교환한다: 배양기로부터 6-웰 평판을 제거한다. 평판의 한쪽을 버린/미사용된 10 cm 배양 접시 덮개에 올려 두고 배양 배지가 웰의 한쪽으로 흐르도록 한다. (주의: 이 각도에서 배지는 MEF의 전체 단층을 덮어야 하며 웰 밖으로 넘쳐서는 않된다). 세포가 10분간 정착하게 둔다. MEF 평판으로부터 각 덮개를 제거하고, 배양물의 표면으로부터 배지의 50%를 주의 깊게/서서히 흡인한다. 세포가 흡인되지 않도록 주의한다. 덮개(들)는 이후 모든 급식 내내 그대로 둔다. 옵션: 흡인물을 수집하고, 350 x g로 4분간 원심분리하며, 1 ㎖ 배지에 재현탁시키고, Cedex에서 계수한다. 1% 미만의 세포가 손실되는가를 검증한다. 세포가 교란되지 않도록 하면서 1.25 ㎖의 신선한 성장 배지를 순환 방식으로 적가한다. 평판을 배양기에 다시 넣는다. 96-웰 평판 공동배양물의 배지를 교체하기 위해, 멀티-채널 피펫을 사용하고 팁을 웰의 바닥으로 약 반정도 깊이까지 삽입한다. 배양물의 표면으로부터 100 ㎕를 서서히 흡인한다. 세포를 흡인하지 않도록 주의한다. (주의: 6-웰 공동배양 포맷과 비교하여, 배지가 이 포맷에서 쉽게 진탕되지 못하기 때문에 T-세포가 더 정지 상태로 나타난다). 세포가 교란되지 않도록 하면서 100 ㎕의 신선한 배지 (hES 배지 + 100 ng/㎖의 zFGF)를 적가한다. 평판을 배양기에 다시 넣는다.
6일째에 상기된 4일째의 급식 방법을 반복한다. 8일째에, 세포에 성장 배지 + 20% MEF-적응용 배지를 재급식한다 (상기와 같이). 8일째에 48시간 마다 급식 단계를 반복한다. 이 시점에서 웰을 육안으로 검사하여 콜로니 형성을 모니터링한다.
11. Tra1-60을 발현하는 콜로니의 동정 및 채집:
본 절차는 재프로그래밍 조건하에 MEF 공동 배양물상에서 성장한 Tra1-60+ 콜로니를 동정하고 채집하는 지침을 보여준다. 적절한 조건하에서, 일차 사람 세포내로 재프로그래밍 인자의 도입 후 iPS 세포의 콜로니가 생성된다. 이 프로토콜은 Tra1-60에 대한 항체를 사용하여 MEF 공동 배양물에서 발생하는 추정 iPSC 콜로니를 형광 표지한다. 형광 표지 패턴과 콜로니의 형태를 비교함으로써 콜로니에 다능성의 정석 값으로서 점수를 부여한다. 이와 같은 점수 매김 시스템은 추가의 성상확인을 위해 추정 iPS 세포의 선택적 증식을 촉진한다.
재프로그래밍 인자로 형질도입한 후, 사람 세포를 MEF상에서 15-30일 동안 공동 배양한다. 이 기간 동안에 세포를 콜로니 형성에 대해 육안으로 검사해야 한다. 콜로니가 지나치게 성장하는 것은 아니지만 육안으로 보일 때 존재하는 콜로니의 총 수를 계수하거나 산정한다.
만일 재프로그래밍 벡터(들)가 형광 리포터를 포함하지 않는다면, 다음의 단계를 진행한다: 콜로니를 채집하기 1 또는 2일 전에, 조사된 MEF를 젤라틴-피복된 6-웰 평판 또는 96-웰 평판의 세트 상에 (절차 8에 따라) 또는 10 cm 접시 상에 파종한다.
만일 재프로그래밍 벡터(들)가 형광 리포터가 포함하는 경우, 발생기 콜로니를 형광 현미경으로 모니터링해야 한다. 형광 및 비-형광 콜로니를 주목한다. 재프로그래밍 과정은 전형적으로 형광 리포터를 발현억제한다. 그러나, 일부 경우에, 세포는 형광을 발할 수 있다. 이러한 이유 때문에, 리포터의 것과 중복하는 형광 스펙트럼을 갖는 형광 항체 (아래)를 사용하는 것을 피하는 것이 중요하다.
항-Tra1-60 생세포 표지 프로토콜을 다음과 같이 실시한다: DMEM/F12 (무혈청) 배지로 염색할 웰을 2회 세척한다. 성장 배지 (hES)에서 일차 항체를 희석하여 작용 희석액을 조성한다. 희석된 항체를 0.22 ㎛ 멸균 필터로 여과한다. 희석된 일차 항체를 세포에 첨가한다. 단층을 덮기에 충분한 용량을 첨가한다. 37℃ 및 5% CO2에서 45분 내지 1시간 동안 배양한다. 세포를 DMEM/F12 배지로 2회 세척한다. 주의: 만일 형광 표지된 일차 항체를 사용한다면, 배지를 신선한 hES로 교환하고 세포를 영상화한다. 다른 방법으로서, 이차 항체를 성장 배지 (hES)에 희석한다. 희석된 이차 항체를 0.22 ㎛ 멸균 필터로 여과한다. 희석된 항체를 세포에 첨가한다. 37℃ 및 5% CO2에서 30분 동안 배양한다. 세포를 DMEM/F12로 1회 세척하고 배지를 신선한 hES+CM으로 교환한 다음 형광 현미경으로 영상을 확보한다.
많은 콜로니가 있는 경우, 디지털 영상을 획득하고 관찰한 후 점수를 매긴다. 불과 소수의 콜로니가 있는 경우는 시료를 현미경으로 보면서 각 콜로니에 점수를 매긴다. 아래에 기술된 바와 같이 명시야 현미경을 사용하여 "형태" 점수를 매긴다: 1= 콜로니가 부분적으로 재프로그래밍된 것을 나타낸다. 콜로니는 퍼짐 경계 및/또는 경계에서의 분화 세포 및/또는 구별되는 세포질과 핵을 갖는 섬유아세포-유사한 분화 세포를 갖는다. 2= 콜로니가 수작업으로 채집할 수 있을 정도로 뚜렷하다; 이것은 반-인접 조밀 경계선이 분화 지역으로 끊어져 있는 비-분화 세포의 콜로니 (낮은 세포질:핵 비율) 또는 분화 세포의 후광으로 둘러싸인 완전히 인접한 조밀 경계선을 갖는 콜로니 (계란 후라이 형태)를 포함할 수 있다. 3= 콜로니가 고전적 형태와 조밀한 경계를 가지며, 분화 세포가 없고, 세포의 세포질:핵 비율이 낮다.
다음과 같이 각 콜로니를 형광 현미경으로 관찰하면서 "Tra1-60"에 점수를 부여한다: 0= 표지 없음; 1= 희미하거나 얼룩짐; 2= 불균질하거나 불규칙한 표지 패턴이고 뚜렷한 경계의 증거가 미미하거나 없음; 3= 경계가 뚜렷하고 균일한 표지.
Tra1-60-양성 콜로니의 동정 및 채집.
평판을 잉크로 표시하여 최고 점수의 콜로니를 동정한다. "3-3"의 점수가 이상적이지만, 이상적인 형태에 미치지 못하는 콜로니 (예, "2-3" 또는 "2-2"로 점수가 부여될 수 있는 것들)를 채집하고 성공적으로 증식시킨 선례가 있다.
6-웰 평판 (또는 10 cm 접시)로부터 콜로니를 채집하기 위해, 세포를 채집 후드로 옮긴다. 콜로니를 해부현미경으로 관찰하면서, 콜로니 경계 주변에서 접시의 표면위에 피펫 팁으로 ("틱 택 토 보드" 형태로) 그린다. 이러한 행위로 콜로니는 3-6개 조각으로 나뉘어 콜로니가 주변 MEF와 분리되어야 한다. 콜로니 단편을 피펫 팁으로 그린다. (주의: 최초 웰에 남아 이탈된 절편이 재부착하고 이차 콜로니를 생성할 수 있음은 인식해야 한다. 이것은 콜로니 계수 및 재프로그래밍 효율의 산정에 오류를 일으킬 수 있다). 절편을 hES 배지 + 100 ng/㎖ 제브라피쉬 bFGF (성장 배지)와 함께 MEF를 함유한 6 웰 평판의 수용 웰내로 직접 옮긴다.
96-웰 포맷으로부터 콜로니를 채집하기 위해, 형태 및 Tra-60 표지 점수가 양호한 단일 콜로니만을 갖는 웰을 동정한다. 배지를 웰로부터 흡인한다. 디스파제를 첨가하고 37℃에서 7분간 배양한다. 유연하게 피펫으로 업 앤드 다운하여 콜로니를 떼어낸다. 콜로니 절편을 15 ㎖ 튜브로 옮기고 hES 배지로 희석한다. 350 x g로 10분간 원심분리한다. 상청액을 흡인한 다음 성장 배지에 재현탁시킨다.
절편을 성장 배지에 MEF를 함유한 6-웰의 수용 웰내로 직접 옮긴다. 콜로니 절편은 새로운 MEF에 부착하고 다수의 새로운 콜로니를 형성해야 한다. 24시간 후, 배지를 신선한 성장 배지로 교환한다. 세포가 단층이 될 때까지 증식 및 형태를 모니터링한다. 매일 배지를 신선한 성장 배지로 교환한다.
실시예 10 재료
실시예 1-9에서 사용된 재료는 표 5-7에 기술되어 있다.
Figure 112012001096283-pct00007
Figure 112012001096283-pct00008
Figure 112012001096283-pct00009

실시예 11
CD34+ 조혈 세포로부터 iPS 세포의 생성
PBMC를 류코팩 또는 실시예 1에 기술된 바와 같이 새로 채취한 혈액 시료로부터 분리하였다. 간접용 CD34 마이크로비드 키트 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) 또는 직접용 CD34 마이크로비드 키트 또는 계통 고갈 키트 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 제조사의 지침에 따라 사용하여 CD34+ 세포에 대한 MACS 분리를 실시하였다. CD34+ MACS 정제 세포의 분획을 FACS 분석을 위해 수집하고 남은 세포를 아래의 CD34+ 세포 증식 배지를 사용하여 저 부착성 6-웰 평판에서 재평판배양하였다. CD34+ 세포 농축은 CD34 직접용 마이크로비드 또는 간접용 CD34 합텐 항체 염색 키트를 사용하여 실시할 수 있다.
Figure 112012001096283-pct00010
CD34+ 세포 증식 배지: 제조사의 지침에 따라 스템 프로 34 (Invitrogen)를 원하는 양의 영양 보조제와 혼합한다. 스템 프로 완전 배지에 100 ng/㎖의 재조합 줄기 세포 인자 및 재조합 100 ng/㎖의 Flt-3 리간드 및 20 ng/㎖의 재조합 사람 인터류킨-3 (IL-3)을 보충한다. 또한, 이 배지에 신선한 1% 글루타민 및 1% 페니실린 스트렙토마이신 용액을 보충한다. 사용하기 전에 모든 보충제는 혼합하고 배지는 여과하였다.
세포는 상기된 방법을 통해 형질감염 약 24시간 전에 파종하였다. 또한, 293T 세포는 레트로바이러스 생성을 위해 형질감염되었고, 그런 다음 조혈 세포가 상기된 바와 같이 MMLV 레트로바이러스에 의해 전달되는 (OCT4, SOX2, NANOG 및 Lin28) 또는 (OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC) 유전자로 형질감염되었다. 이들 실험의 결과로서, 상기 유전자의 세트중 어느 하나로 형질감염된 CD34+ 조혈 세포가 새로운 iPS 세포주를 생성한 것이 관찰되었다.
MMLV 레트로바이러스를 사용하여 PBMC를 재프로그래밍하기 위해 다음의 프로토콜이 사용되었다: 신속한 냉각을 위해 -20℃에 MACS LS 분리 컬럼을 적용한다 (다른 방법으로, 컬럼 및 MACS 완충액을 4℃에서 밤새 냉각시킬 수 있다). 적절한 수의 PBMC 바이알을 해동하여 ∼3 x 108 세포를 수집한다. 세포를 MACS 완충액과 함께 5 ㎖로 조성한다 (진행 내내 완충액은 냉장 보관한다). 1200 rpm으로 5분 원심분리하고, 상청액을 흡인하며, MACS 완충액에 재현탁시킨다. 혈구계수기를 사용하여 세포를 계수한다. 세포 현탁액을 1x108의 3개 튜브에 나누고 300 x g로 10분간 원심분리한다. CD34+ 세포 농축은 CD34 직접용 마이크로비드 또는 간접용 CD34 합텐 항체 염색 키트를 사용하여 실시할 수 있다. 각 세포 펠렛을 300 ㎕의 MACS 완충액에 재현탁시킨다. 튜브당 100 ㎕의 FcR 차단 시약을 첨가하고 혼합한다. 튜브당 100 ㎕의 CD34-합텐-항체 또는 직접용 CD34 비드를 첨가하고 혼합한다. 4℃에서 15분간 배양한다. 세포를 5 ㎖의 MACS 완충액으로 세척하고 300 x g로 10분간 원심분리한다. 상청액을 완전히 흡인한다. 세포를 500 ㎕의 MACS 완충액에 재현탁시킨다. 일단계 CD34 직접용 마이크로비드를 사용하는 경우 세포는 분리만 하면된다. 간접용 CD34 분리 비드를 사용한다면 분리하기 전에 항-합텐 마이크로비드로 배양하는 단계가 하나 더 있다. 100 ㎕의 항-합텐 마이크로비드를 첨가하고 혼합한다. 4℃에서 15분간 배양한다. 세포를 2 ㎖의 MACS 완충액으로 세척하고, 300 x g로 10분간 원심분리한다. 500 ㎕의 MACS 완충액에 재현탁시킨다. 4℃로부터 MACS LS 컬럼을 제거한다. 컬럼을 분리기 자석에 올려놓는다. 컬럼을 3 ㎖의 MACS 완충액으로 세정한다. 세포 현탁액을 컬럼에 적용한다. 통과한 비표지 세포를 수집하고 컬럼을 3 ㎖의 MACS 완충액으로 세척한다. 세척을 두 번 더 반복한다. 컬럼을 자석으로부터 제거하고 적합한 수집 튜브에 넣는다. 3 ㎖의 MACS 완충액을 첨가하고 컬럼을 제공된 플런저로 밀어냄으로써 농축된 CD34+ 세포 분획을 수집한다. FACS 분석을 위해 농축된 세포군의 분획을 수집한다. 남은 세포를 CD34+ 세포 증식 배지를 사용하여 저 부착 6-웰 평판에 재평판배양한다. 계통 세포 고갈 키트를 사용할 때 세포를 계통 양성 항체 (CD2, CD3, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD56, CD123, CD235a)와 배양하여 성체 조혈 세포 유형 (예, T 세포, B 세포, NK 세포, 수지상 세포, 단핵세포, 과립구, 적혈구)를 제거한다. 배양 후, 세포를 세척하고 항-바이오틴 마이크로비드와 배양한다. 세포 현탁액을 세척하고 컬럼에 의해 수동으로 분리하거나 AutoMACs 세포분리기로 분리한다.
iPS 콜로니의 동정 및 채집은 다음의 방법으로 실시하였다: 일반적으로 콜로니는 형태학적으로 조밀하고 거대 핵과 2개의 뚜렷한 핵소체를 갖는 작고 밀집한 세포로 구성된다. 콜로니는 흔히 너무 조밀하여 뚜렷한 특징을 관찰하는 것이 용이하지 못하며, 콜로니의 중심에 분화된 물질이 있는 듯이 나타난다. 콜로니의 경계는 보통 뚜렷하다. 그러나, 혈액 iPS 세포 (BiPSC)는 모호한 경계에 보다 확산된 형태로 보이고, 이러한 특징은 섬유아세포로부터 유도된 이전의 iPSC와 전형적으로 일치하지 않는다. 콜로니는 삽입된 바이러스 DNA로부터 발현된 GFP 및 RFP를 억제한다. 일부 진성 콜로니는 감염 후 20일까지 형광을 상실하며, 일부는 감염 후 약 35 내지 40일 경과하여 채집되고 이전된 후 형광을 상실하였다. 모든 콜로니는 GFP 및 RFP 발현이 결여되어야 한다 (비록 일부 발현이 단세포 근처에서 나타났을 지라도). 수동으로 채집하기 위해, 피펫 팁을 사용하여 콜로니를 3 내지 6개의 조각으로 분쇄하여 줄기 세포가 주변의 MEF 및 조혈모 세포로부터 유리될 가능성을 높였다. 채집은, 전체 콜로니를 계수하는데 오류가 발생하지 않도록, 즉 작은 덩어리의 콜로니가 재정착하여 새로운 클론으로서 잘못 계수될 수 있는 가능성을 방지하기 위하여 다수의 콜로니가 형성될 때까지 피했다. 이어서, 세포는 hES 배지 + 100 ng/㎖ 제브라피쉬 bFGF와 함께 MEF를 함유한 6-웰 평판의 수용 웰내로 직접 옮겼다. 증식, 형태 및 형광 상실을 1-2주 동안 모니터링하여 클론이 완전히 재프로그래밍되었는가 확인하였다. 세포에 매일 급식하였다. 채집되고 평판배양된 콜로니가 부착하고 특징적인 ES-유사 형태를 나타낸 후, 매일 급식하면서 새로운 세트의 6-웰 MEF 평판상에 상기한 바와 같이 수동으로 콜로니를 채집하였다. 웰이 단일세포층으로 나타나면서, 콜라게나제를 사용하여 정상적인 iPSC 세포주로서 계대하고, 여러 계대에서 분획을 동결시키며, 각 세트를 해동하여 시험한다.
채집되어 증식된 콜로니를 다능성 마커 (SSEA-4, Oct3/4, Tra-160, Tra-181)의 존재에 대해 염색한다. 또한 알카리성 포스파타제 활성의 존재를 위해 콜로니를 염색하였다. 클론을 정상적인 핵형의 존재에 대해 시험하였고 iPS 클론의 실체는 FISH 분석에 의해 모 세포 유형으로 확인되었다. 이들 시험의 결과는 CD34+ 세포가 iPS 세포로 성공적으로 전환되었음을 증명한다. 비록 형질도입의 효율이 CD34+ 세포가 (Sox2, Oct4, c-Myc 및 Klf-4) 인자로 형질감염되었을 때 더 높았을 지라도 CD34+ 세포가 (Sox2, Oct4, Nanog 및 Lin28) 인자로 형질감염되어 유도된 iPS 세포는 조사된 MEF 및 매트리젤 상에서 클론의 유지 동안 더 안정한 것으로 관찰되었다. 추가의 실험에서, 류코팩 및 공여자 혈액으로부터 수득된 CD34+ 세포는 (Sox2, Oct4, c-Myc 및 Klf-4)로의 형질감염을 통해 iPS 세포로 성공적으로 전환되었다. 전구 세포 유형의 재프로그래밍 효율은 100,000 세포당 약 10개의 콜로니인 것으로 관찰되었다.
본원에 기술되고 청구된 모든 방법은 상세한 설명에 비추어 과중한 실험적 부담없이 실시될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 양태의 관점에서 기술된 한편, 이들 방법, 방법의 단계 또는 단계의 순서에 본 발명의 개념, 취지 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 변형이 적용될 수 있음을 본 분야의 전문가는 이해할 것이다. 보다 특정적으로는, 화학적으로 및 생리학적으로 관련이 있는 특정 물질이 본원에 기술된 물질을 대신하여 사용될 수 있으면서 동일하거나 유사한 결과를 달성할 수 있음은 명백하다. 본 분야의 전문가에게 명백한 것으로서 그와 같이 유사한 모든 치환 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 정의된 본 발명의 취지, 범위 및 개념에 속하는 것이다.
참조 문헌
하기 참조 문헌은 예시 절차 또는 다른 상세 보충설명을 제공하는 정도로 본 발명에 나타나 있고, 참조로서 본 발명에 구체적으로 도입된다.
Figure 112012001096283-pct00011
Figure 112012001096283-pct00012
Figure 112012001096283-pct00013
Figure 112012001096283-pct00014
Figure 112012001096283-pct00015

Claims (49)

  1. 사람 T 세포로부터 사람 유도 만능 줄기 (induced pluripotent stem: iPS) 세포를 제조하는 방법으로서,
    (a) 분리된 말초 혈액 시료로부터 사람 T 세포를 포함한 세포군을 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 세포군의 사람 T 세포로부터 사람 iPS 세포를 시험관 내에서 (in vitro) 생성하여 사람 iPS 세포군을 제공하는 단계
    를 포함하고,
    이때 상기 분리된 말초 혈액 시료가, 세포가 외부로부터 적용된 G-CSF로 가동화되지 않은 대상자로부터 유래하고,
    상기 세포군의 사람 T 세포로부터 사람 iPS 세포를 생성하는 단계가 상기 사람 T 세포 내로 재프로그래밍 인자를 도입함을 포함하고, 여기서 재프로그래밍 인자는 Sox 계통 단백질 및 Oct4 단백질을 포함하는 재프로그래밍 단백질인, 사람 T 세포로부터 사람 iPS 세포를 제조하는 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 분리된 말초 혈액 시료의 양이 1 내지 5 ㎖인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 분리된 말초 혈액 시료의 양이 3 ㎖인, 방법.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 사람 T 세포를 포함하는 상기 세포군이 냉동보존된 것인, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 사람 T 세포를 포함한 상기 세포군이 상기 T 세포를 활성화하는 조건하에서 시험관내에서 제조되는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 사람 T 세포를 포함한 상기 세포군이 항-CD3 항체의 존재하에서 배양되는, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 사람 T 세포를 포함한 상기 세포군을 시험관내에서 하나 이상의 사이토카인과 함께 배양하여 상기 시험관내에서 상기 사람 T 세포가 증식되는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 하나 이상의 사이토카인이 IL-2를 포함하는, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 사람 T 세포가 CD4+ 또는 CD8+ T 세포인, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 사람 T 세포가 T 보조 1 (TH1) 세포, T 보조 2 (TH2) 세포, TH17 세포, 세포독성 T 세포, 조절 T 세포, 자연살해 T 세포, 미경험(naive) T 세포, 기억 T 세포 또는 감마 델타 T 세포인, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 사람 T 세포를 포함하는 상기 세포군이 90% 내지 99%의 사람 T 세포를 포함하는, 방법.
  14. 제1항에 있어서, 사람 T 세포를 포함하는 상기 세포군이 97% 내지 99%의 사람 T 세포를 포함하는, 방법.
  15. 제1항에 있어서, 사람 T 세포를 포함하는 상기 세포군이 적어도 1 x 103 개의 사람 T 세포를 포함하는, 방법.
  16. 제1항에 있어서, 사람 T 세포를 포함하는 상기 세포군이 적어도 5 x 103 개의 사람 T 세포를 포함하는, 방법.
  17. 제1항에 있어서, 사람 T 세포를 포함하는 상기 세포군이 1 x 106 내지 2 x 106 개의 사람 T 세포를 포함하는, 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 재프로그래밍 단백질중 하나 이상이 단백질 형질도입 도메인에 작동적으로 연결되는, 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 재프로그래밍 인자들이 하나 이상의 발현 카세트에 의해 암호화되어 있는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 하나 이상의 발현 카세트가 적어도 폴리시스트론 전사 단위를 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 폴리시스트론 전사 단위가 적어도 두 개의 재프로그래밍 유전자를 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 폴리시스트론 전사 단위가 Sox 유전자 및 Oct4 유전자를 포함하는, 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 폴리시스트론 전사 단위가 cMyc 유전자 및 Klf4 유전자를 포함하는, 방법.
  24. 제21항에 있어서, 상기 폴리시스트론 전사 단위가 Nanog 유전자 및 Lin28 유전자를 포함하는, 방법.
  25. 제20항에 있어서, 상기 폴리시스트론 전사 단위가 재프로그래밍 유전자 및 선택 또는 선별 마커를 포함하는, 방법.
  26. 제20항에 있어서, 상기 폴리시스트론 전사 단위가 내부 리보솜 유입 부위 (IRES)을 포함하거나, 또는 폴리시스트론 전사를 위한 하나 이상의 프로테아제 절단 부위, 자가-절단 펩타이드, 또는 상기 프로테아제 절단 부위와 자가-절단 펩타이드 둘 모두를 암호화하는 서열을 포함하는, 방법.
  27. 제19항에 있어서, 상기 하나 이상의 발현 카세트가 바이러스 벡터, 에피솜 벡터 또는 트랜스포손으로 이루어진 그룹중에서 선택된 재프로그래밍 벡터 내에 포함되는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 재프로그래밍 벡터가 레트로바이러스 벡터인, 방법.
  29. 제1항 또는 제19항에 있어서, 상기 Sox 계통 단백질이 Sox2인, 방법.
  30. 제1항 또는 제19항에 있어서, 상기 재프로그래밍 단백질이 추가로 Nanog, Lin28, c-Myc, Klf4 또는 Esrrb를 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 재프로그래밍 단백질이 추가로 Nanog를 포함하는, 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 재프로그래밍 단백질이 추가로 Klf4 및 c-Myc를 포함하는, 방법.
  33. 제1항에 있어서, 상기 세포군의 사람 T 세포로부터 사람 iPS 세포를 생성하는 것이 배아 줄기 세포의 하나 이상의 특징에 대해 사람 iPS 세포를 선택하는 것을 포함하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 특징이 부착성, 미분화된 형태, 배아 줄기 세포-특이적 마커 또는 다능성인, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 특징이 부착성인, 방법.
  36. 제34항에 있어서, 상기 특징이 미분화된 형태인, 방법.
  37. 제1항에 있어서, 상기 사람 iPS 세포를 분화된 세포로 분화시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 분화된 세포가 심근세포, 조혈세포, 신경세포, 섬유아세포 또는 상피세포를 포함하는, 방법.
  39. 제1항에 있어서, 상기 사람 iPS 세포군이, 삽입된 외인성 바이러스 요소를 0% 초과하나 1% 미만으로 포함하는, 방법.
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
KR1020127000289A 2009-06-05 2010-06-04 Ｔ 세포 및 조혈 세포의 재프로그래밍 KR101811235B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18454609P 2009-06-05 2009-06-05
US61/184,546 2009-06-05
US24011609P 2009-09-04 2009-09-04
US61/240,116 2009-09-04
PCT/US2010/037376 WO2010141801A2 (en) 2009-06-05 2010-06-04 Reprogramming t cells and hematophietic cells

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177012506A Division KR101813464B1 (ko) 2009-06-05 2010-06-04 Ｔ 세포 및 조혈 세포의 재프로그래밍
KR1020167025805A Division KR101772860B1 (ko) 2009-06-05 2010-06-04 Ｔ 세포 및 조혈 세포의 재프로그래밍

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20120026125A KR20120026125A (ko) 2012-03-16
KR101811235B1 true KR101811235B1 (ko) 2017-12-21

Family

ID=42357428

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177012506A KR101813464B1 (ko) 2009-06-05 2010-06-04 Ｔ 세포 및 조혈 세포의 재프로그래밍
KR1020167025805A KR101772860B1 (ko) 2009-06-05 2010-06-04 Ｔ 세포 및 조혈 세포의 재프로그래밍
KR1020127000289A KR101811235B1 (ko) 2009-06-05 2010-06-04 Ｔ 세포 및 조혈 세포의 재프로그래밍

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177012506A KR101813464B1 (ko) 2009-06-05 2010-06-04 Ｔ 세포 및 조혈 세포의 재프로그래밍
KR1020167025805A KR101772860B1 (ko) 2009-06-05 2010-06-04 Ｔ 세포 및 조혈 세포의 재프로그래밍

Country Status (10)

Country Link
US (4) US8741648B2 (ko)
EP (3) EP3150701B1 (ko)
JP (9) JP2012528599A (ko)
KR (3) KR101813464B1 (ko)
CN (3) CN103087991B (ko)
AU (1) AU2010254811B2 (ko)
CA (2) CA2952805C (ko)
DK (3) DK3150701T3 (ko)
IL (2) IL216707B (ko)
WO (1) WO2010141801A2 (ko)

Families Citing this family (93)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3150701B1 (en) 2009-06-05 2018-10-03 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Reprogramming t cells and hematopoietic cells
US9206394B2 (en) 2010-02-03 2015-12-08 The University Of Tokyo Method for reconstructing immune function using pluripotent stem cells
WO2011096482A1 (ja) * 2010-02-03 2011-08-11 国立大学法人東京大学 多能性幹細胞を用いた免疫機能再建法
CN103097521A (zh) * 2010-04-16 2013-05-08 学校法人庆应义塾 人工多能性干细胞的制造方法
AU2011267849B2 (en) * 2010-06-15 2015-02-05 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Generation of induced pluripotent stem cells from small volumes of peripheral blood
US8765470B2 (en) * 2010-08-04 2014-07-01 Cellular Dynamics International, Inc. Reprogramming immortalized B-cells to induced pluripotent stem cells
EP2673358B1 (en) 2011-02-08 2019-01-09 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Hematopoietic precursor cell production by programming
WO2012177880A1 (en) 2011-06-21 2012-12-27 Georgia Tech Research Corporation Adhesive signature-based methods for the isolation of stem cells and cells derived therefrom
WO2013070468A1 (en) * 2011-11-08 2013-05-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Glypican-3-specific antibody and uses thereof
US10428309B2 (en) 2011-12-01 2019-10-01 New York Stem Cell Foundation, Inc. Systems and methods for producing stem cells and differentiated cells
BR122020005735B1 (pt) * 2011-12-01 2021-12-28 New York Stem Cell Foundation, Inc Sistema para a geração de células adultas diferenciadas a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (ipscs)
EP2853590B1 (en) * 2012-05-22 2018-11-07 The University of Tokyo Method for producing antigen-specific t cells
DK2981607T3 (da) 2013-04-03 2020-11-16 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Effektiv generering af tumormålrettede t-celler afledt af pluripotente stamceller
US10266807B2 (en) 2013-04-03 2019-04-23 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Methods and compositions for culturing endoderm progenitor cells in suspension
WO2015006725A2 (en) 2013-07-12 2015-01-15 Cedars-Sinai Medical Center Generation of induced pluripotent stem cells from normal human mammary epithelial cells
CN103695469B (zh) * 2013-11-12 2017-01-11 中山大学 一种制备cd44基因缺陷小鼠诱导多能干细胞的方法
JP2015146803A (ja) * 2014-01-10 2015-08-20 学校法人 聖マリアンナ医科大学 メラノサイトの分化誘導方法
KR20240091064A (ko) * 2014-03-04 2024-06-21 페이트 세러퓨틱스, 인코포레이티드 개선된 재프로그래밍 방법 및 세포 배양 플랫폼
US10023879B2 (en) * 2014-06-04 2018-07-17 Fate Therapeutics, Inc. Minimal volume reprogramming of mononuclear cells
JP6715482B2 (ja) * 2014-07-18 2020-07-01 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞から免疫細胞療法用ｔ細胞を誘導する方法
EP3183338B1 (en) 2014-08-19 2020-03-04 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Neural networks formed from cells derived from pluripotent stem cells
US10047341B2 (en) 2014-10-14 2018-08-14 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Generation of keratinocytes from pluripotent stem cells and maintenance of keratinocyte cultures
CA2996582A1 (en) * 2015-08-31 2017-03-09 I Peace, Inc. Pluripotent stem cell manufacturing system and method for producing induced pluripotent stem cells
AU2016321170B2 (en) 2015-09-08 2022-09-01 Fujifilm Cellular Dynamics Method for reproducible differentiation of clinical-grade retinal pigment epithelium cells
AU2016318774B2 (en) 2015-09-08 2022-08-18 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. MACS-based purification of stem cell-derived retinal pigment epithelium
US10662409B2 (en) 2015-09-09 2020-05-26 Trustees Of Tufts College Methods of generating neural stem cells
JP6800987B2 (ja) 2015-10-19 2020-12-16 フジフィルム セルラー ダイナミクス，インコーポレイテッド ウイルス受容性多能性幹細胞（ｐｓｃ）由来肝細胞の生産
US10865381B2 (en) 2015-10-20 2020-12-15 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Multi-lineage hematopoietic precursor cell production by genetic programming
CN106609283A (zh) * 2015-10-26 2017-05-03 潘雨堃 一种利用转座子进行多基因同时操作的方法
MY189819A (en) * 2015-11-27 2022-03-10 Cartherics Pty Ltd Genetically modified cells and uses thereof
US9913865B2 (en) * 2015-12-28 2018-03-13 Ingeneron Inc. Induced pacemaker and Purkinje cells from adult stem cells
EP3397753B1 (en) 2015-12-30 2021-10-27 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Microtissue formation using stem cell-derived human hepatocytes
US20170226483A1 (en) * 2016-01-12 2017-08-10 Lonza Walkersville, Inc. Methods and Vectors to Produce Vector Free Induced Pluripotent Stem Cells
CN107022522A (zh) * 2016-02-01 2017-08-08 溯源生命科技股份有限公司 脐带血cd34阳性细胞向间充质干细胞的直接转分化技术
ES2904882T3 (es) * 2016-04-29 2022-04-06 Virogin Biotech Canada Ltd Vectores de HSV con replicación mejorada en células cancerosas
US11572545B2 (en) 2016-06-16 2023-02-07 Cedars-Sinai Medical Center Efficient method for reprogramming blood to induced pluripotent stem cells
US10221395B2 (en) 2016-06-16 2019-03-05 Cedars-Sinai Medical Center Efficient method for reprogramming blood to induced pluripotent stem cells
AU2017290805B2 (en) 2016-07-01 2023-11-16 Research Development Foundation Elimination of proliferating cells from stem cell-derived grafts
EP4328301A3 (en) 2016-08-16 2024-06-19 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Methods for differentiating pluripotent cells
WO2018067836A1 (en) 2016-10-05 2018-04-12 Cellular Dynamics International, Inc. Methods for directed differentiation of pluripotent stem cells to hla homozygous immune cells
US10961505B2 (en) 2016-10-05 2021-03-30 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Generating mature lineages from induced pluripotent stem cells with MECP2 disruption
US11458225B2 (en) 2016-11-09 2022-10-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services 3D vascularized human ocular tissue for cell therapy and drug discovery
EP3555266B1 (en) * 2016-12-13 2023-11-15 The United States of America, as Represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Methods of preparing an isolated or purified population of thymic emigrant cells and methods of treatment using same
EP3568464A1 (en) * 2017-01-13 2019-11-20 The Regents of The University of California Immunoengineered pluripotent cells
US20200017837A1 (en) * 2017-02-03 2020-01-16 National University Corporation Kobe University Method For Producing Induced Pluripotent Stem Cells
CN110691844B (zh) * 2017-02-07 2023-09-08 新加坡科技研究局 从多能干细胞产生模拟的先天免疫细胞的方法和试剂盒
EP4154710A1 (en) * 2017-04-04 2023-03-29 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Preparation, expansion, and uses of adult pluripotent stem cells
DK3612557T3 (da) 2017-04-18 2022-04-19 Fujifilm Cellular Dynamics Inc Antigenspecifikke immuneffektorceller
EP3638775A1 (en) * 2017-06-13 2020-04-22 Fate Therapeutics, Inc. Compositions and methods for inducing myeloid suppressive cells and use thereof
US11572544B2 (en) 2017-06-14 2023-02-07 The Children's Medical Center Corporation Hematopoietic stem and progenitor cells derived from hemogenic endothelial cells by episomal plasmid gene transfer
US10378070B2 (en) * 2017-09-07 2019-08-13 Kyoto University Vector and gene introduction agent for monitoring and visualizing cell differentiation using expression of micro RNA as indicator and monitoring and visualizing method using thereof
CN111164204A (zh) * 2017-10-06 2020-05-15 赛雅思株式会社 来自iPS细胞的具有遗传多样性的T细胞群体的制备方法
GB201805683D0 (en) * 2018-04-05 2018-05-23 Touchlight Ip Ltd Reprogramming vectors
EP3781675A1 (en) 2018-04-20 2021-02-24 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Method for differentiation of ocular cells and use thereof
CN108642083B (zh) * 2018-04-28 2022-03-22 安徽中盛溯源生物科技有限公司 一种将t细胞高效诱导成多能干细胞的重编程方法
WO2020013315A1 (ja) * 2018-07-13 2020-01-16 国立大学法人京都大学 γδＴ細胞の製造方法
MX2021000421A (es) 2018-07-15 2021-05-12 Enochian Biopharma Inc Métodos y composiciones que usan células dendríticas recombinantes para el tratamiento del cáncer.
WO2020095592A1 (ja) * 2018-11-07 2020-05-14 剛士 田邊 医薬品組成物及び化粧品組成物
EA202191338A1 (ru) * 2018-11-16 2021-08-10 Селджин Корпорейшн Улучшенный способ производства т-клеток
CN117982733A (zh) 2018-11-19 2024-05-07 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 可生物降解的组织置换植入物及其用途
SG11202104941YA (en) * 2018-11-21 2021-06-29 Agency Science Tech & Res Generation of mature kupffer cells
EA202191463A1 (ru) 2018-11-28 2021-10-13 Борд Оф Риджентс, Дзе Юниверсити Оф Техас Систем Мультиплексное редактирование генома иммунных клеток для повышения функциональности и устойчивости к подавляющей среде
CA3121210A1 (en) 2018-11-29 2020-06-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for ex vivo expansion of natural killer cells and use thereof
CA3165346A1 (en) 2020-01-23 2021-07-29 George Q. Daley Stroma-free t cell differentiation from human pluripotent stem cells
US11091524B1 (en) 2020-04-22 2021-08-17 Houston Gene Therapeutics Llc Compositions for treatment of vascular disease
US20230210899A1 (en) 2020-05-28 2023-07-06 Aztherapies, Inc. CAR-Treg-Based Therapies Targeting Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG) for Treating Neurodegenerative Diseases
AU2021280343A1 (en) 2020-05-29 2022-12-08 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Retinal pigmented epithelium and photoreceptor dual cell aggregates and methods of use thereof
JP2023536210A (ja) 2020-05-29 2023-08-24 フジフィルム セルラー ダイナミクス，インコーポレイテッド 網膜色素上皮及び光受容体の二重層、並びにその使用
ES2922973T1 (es) 2020-07-20 2022-09-22 Enanta Pharm Inc Peptidos funcionalizados como agentes antivirales
WO2022104109A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Catamaran Bio, Inc. Genetically modified natural killer cells and methods of use thereof
US11384090B2 (en) 2020-11-23 2022-07-12 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
WO2022109360A1 (en) 2020-11-23 2022-05-27 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Novel spiropyrrolidine derived antiviral agents
US11352363B1 (en) 2020-11-23 2022-06-07 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
US20220162288A1 (en) 2020-11-25 2022-05-26 Catamaran Bio, Inc. Cellular therapeutics engineered with signal modulators and methods of use thereof
US20240219375A1 (en) 2021-04-07 2024-07-04 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Dopaminergic precursor cells and methods of use
US11319325B1 (en) 2021-05-11 2022-05-03 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Macrocyclic spiropyrrolidine derived antiviral agents
US20220389436A1 (en) 2021-05-26 2022-12-08 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Methods to prevent rapid silencing of genes in pluripotent stem cells
AU2022282379A1 (en) 2021-05-28 2023-11-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Biodegradable tissue scaffold with secondary matrix to host weakly adherent cells
EP4347795A1 (en) 2021-05-28 2024-04-10 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Methods to generate macular, central and peripheral retinal pigment epithelial cells
US11339170B1 (en) 2021-07-23 2022-05-24 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
US11325916B1 (en) 2021-07-29 2022-05-10 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
US20230078230A1 (en) 2021-09-13 2023-03-16 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Methods for the production of committed cardiac progenitor cells
CN114107378A (zh) * 2021-09-13 2022-03-01 钦元再生医学(珠海)有限公司 一种通用型car-t细胞的制备方法
CA3235390A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Deepika Rajesh Dopaminergic neurons comprising mutations and methods of use thereof
WO2023172514A1 (en) 2022-03-07 2023-09-14 Catamaran Bio, Inc. Engineered immune cell therapeutics targeted to her2 and methods of use thereof
WO2023196577A1 (en) * 2022-04-08 2023-10-12 New York Stem Cell Foundation, Inc. Methods for production of ipscs
WO2023240147A1 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Century Therapeutics, Inc. Genetically engineered cells expressing cd16 variants and nkg2d and uses thereof
US20240003871A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Ipsc-derived astrocytes and methods of use thereof
WO2024050534A2 (en) * 2022-09-01 2024-03-07 Regents Of The University Of Minnesota In vitro generated hematopoietic stem progenitor cells and t cells and methods of making and using the same
US20240139256A1 (en) 2022-09-30 2024-05-02 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Methods for the production of cardiac fibroblasts
WO2024102838A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Century Therapeutics, Inc. Engineered interleukin-7 receptors and uses thereof
WO2024192329A1 (en) 2023-03-16 2024-09-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods for producing stable human chondroctyes and their use for promoting cartillage growth and repair
CN118272437A (zh) * 2024-04-11 2024-07-02 广州瑞铂茵健康科技有限公司 一种诱导性多能干细胞及其制备方法和应用

Family Cites Families (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US172079A (en) 1876-01-11 Improvement in grinding-disks
US4002173A (en) 1974-07-23 1977-01-11 International Paper Company Diester crosslinked polyglucan hydrogels and reticulated sponges thereof
NO812612L (no) 1980-08-06 1982-02-08 Ferring Pharma Ltd Enzym-inhibitorer.
NL8200523A (nl) 1982-02-11 1983-09-01 Univ Leiden Werkwijze voor het in vitro transformeren van planteprotoplasten met plasmide-dna.
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
EP0273085A1 (en) 1986-12-29 1988-07-06 IntraCel Corporation A method for internalizing nucleic acids into eukaryotic cells
US4952500A (en) 1988-02-01 1990-08-28 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cloning systems for Rhodococcus and related bacteria
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5302523A (en) 1989-06-21 1994-04-12 Zeneca Limited Transformation of plant cells
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
US5610042A (en) 1991-10-07 1997-03-11 Ciba-Geigy Corporation Methods for stable transformation of wheat
US5591616A (en) 1992-07-07 1997-01-07 Japan Tobacco, Inc. Method for transforming monocotyledons
US5702932A (en) 1992-07-20 1997-12-30 University Of Florida Microinjection methods to transform arthropods with exogenous DNA
WO1994002620A2 (en) 1992-07-27 1994-02-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. An improved method of agrobacterium-mediated transformation of cultured soybean cells
DE4228457A1 (de) 1992-08-27 1994-04-28 Beiersdorf Ag Herstellung von heterodimerem PDGF-AB mit Hilfe eines bicistronischen Vektorsystems in Säugerzellen
GB9222888D0 (en) 1992-10-30 1992-12-16 British Tech Group Tomography
GB9223084D0 (en) 1992-11-04 1992-12-16 Imp Cancer Res Tech Compounds to target cells
JPH09500788A (ja) 1993-07-26 1997-01-28 ダナ・ファーバー・キャンサー・インスティテュート・インコーポレイテッド Ｂ７−２：ｃｔｌａ４／ｃｄ２８カウンターレセプター
US5656610A (en) 1994-06-21 1997-08-12 University Of Southern California Producing a protein in a mammal by injection of a DNA-sequence into the tongue
FR2722208B1 (fr) 1994-07-05 1996-10-04 Inst Nat Sante Rech Med Nouveau site interne d'entree des ribosomes, vecteur le contenant et utilisation therapeutique
US5736524A (en) 1994-11-14 1998-04-07 Merck & Co.,. Inc. Polynucleotide tuberculosis vaccine
GB9502022D0 (en) 1995-02-02 1995-03-22 Abuljadayel Ilham M S A method for preparing lymphohaematopoietic progenitor cells
US5780448A (en) 1995-11-07 1998-07-14 Ottawa Civic Hospital Loeb Research DNA-based vaccination of fish
US5928906A (en) 1996-05-09 1999-07-27 Sequenom, Inc. Process for direct sequencing during template amplification
US5945100A (en) 1996-07-31 1999-08-31 Fbp Corporation Tumor delivery vehicles
DE19635568C1 (de) 1996-09-02 1998-03-26 Gsf Forschungszentrum Umwelt Vektorsysteme zur konditionalen Genexpression
US5981274A (en) 1996-09-18 1999-11-09 Tyrrell; D. Lorne J. Recombinant hepatitis virus vectors
US5994624A (en) 1997-10-20 1999-11-30 Cotton Incorporated In planta method for the production of transgenic plants
JP3880795B2 (ja) 1997-10-23 2007-02-14 ジェロン・コーポレーション フィーダー細胞を含まない培養物中で、霊長類由来始原幹細胞を増殖させるための方法
US20030211603A1 (en) 2001-08-14 2003-11-13 Earp David J. Reprogramming cells for enhanced differentiation capacity using pluripotent stem cells
CA2684022C (en) 2002-05-17 2014-09-23 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Mesoderm and definitive endoderm cell populations
JP2004194720A (ja) 2002-12-16 2004-07-15 Toray Ind Inc リガンド固定化カラム
US7790039B2 (en) 2003-11-24 2010-09-07 Northwest Biotherapeutics, Inc. Tangential flow filtration devices and methods for stem cell enrichment
US7347352B2 (en) 2003-11-26 2008-03-25 Kulicke And Soffa Industries, Inc. Low loop height ball bonding method and apparatus
US7452718B2 (en) 2004-03-26 2008-11-18 Geron Corporation Direct differentiation method for making cardiomyocytes from human embryonic stem cells
JP2007535947A (ja) 2004-05-03 2007-12-13 ペテル マクカルルム キャンサー インスティチュート 幹細胞増幅及び分化のための方法
US7465580B2 (en) 2004-05-19 2008-12-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Non-cytotoxic oriP replicon
US20080038820A1 (en) 2004-06-22 2008-02-14 Rudy-Reil Diane E Induction of pluripotent stem cells into mesodermal lineages
JP2006067858A (ja) 2004-08-31 2006-03-16 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd 共培養による造血幹細胞の増幅方法
KR20070058584A (ko) 2004-09-08 2007-06-08 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 인간 배아 줄기 세포의 배양
JP2008523823A (ja) 2004-12-22 2008-07-10 イーエス・セル・インターナショナル・プライヴェート・リミテッド ヒト胚性幹細胞の分化ならびにそれに由来する心筋細胞および心筋前駆細胞
US7606580B2 (en) 2005-05-11 2009-10-20 Aol Llc Personalized location information for mobile devices
JP4839021B2 (ja) 2005-06-10 2011-12-14 国立大学法人 岡山大学 白血球及び／又は造血幹・前駆細胞動員剤
US20090252711A1 (en) 2006-05-11 2009-10-08 Andrew Craig Boquest Stem Cells And Methods Of Making And Using Stem Cells
MX2008015392A (es) 2006-06-07 2009-05-05 Univ Tokushima Tratamiento de enfermedades isquemicas que usan eritropoyetina.
US8450464B2 (en) 2006-10-02 2013-05-28 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies that bind CXCR4
US7777395B2 (en) * 2006-10-12 2010-08-17 Eastman Kodak Company Continuous drop emitter with reduced stimulation crosstalk
CA2684242C (en) 2007-03-23 2019-11-12 Wisconsin Alumni Research Foundation Somatic cell reprogramming
JP2008237136A (ja) * 2007-03-28 2008-10-09 Foundation For Biomedical Research & Innovation ヒト造血細胞の培養方法
JP2008307007A (ja) 2007-06-15 2008-12-25 Bayer Schering Pharma Ag 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞
US20120282229A1 (en) 2007-08-01 2012-11-08 Christian Kannemeier Non-viral delivery of transcription factors that reprogram human somatic cells into a stem cell-like state
ES2589122T3 (es) * 2007-08-31 2016-11-10 Whitehead Institute For Biomedical Research Estimulación de la ruta de la Wnt en la reprogramación de células somáticas
EP2072618A1 (en) 2007-12-14 2009-06-24 Johannes Gutenberg-Universität Mainz Use of RNA for reprogramming somatic cells
US9206439B2 (en) 2008-01-14 2015-12-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Efficient oriP/EBNA-1 plasmid vector
EP2103685A1 (en) 2008-03-20 2009-09-23 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Vectors and methods for generating vector-free induced pluripotent stem (iPS) cells using site-specific recombination
WO2009115295A1 (en) 2008-03-17 2009-09-24 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Vectors and methods for generating vector-free induced pluripotent stem (ips) cells using site-specific recombination
CN101550406B (zh) 2008-04-03 2016-02-10 北京大学 制备多潜能干细胞的方法,试剂盒及用途
SG10201400329YA (en) 2008-05-02 2014-05-29 Univ Kyoto Method of nuclear reprogramming
JP2011522540A (ja) 2008-06-04 2011-08-04 セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッド 非ウイルスアプローチを用いたｉＰＳ細胞の産生のための方法
JP5340265B2 (ja) * 2008-06-27 2013-11-13 国立大学法人京都大学 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法
CN105802917A (zh) 2008-10-24 2016-07-27 威斯康星校友研究基金会 通过非病毒重编程获得的多潜能干细胞
JPWO2010131747A1 (ja) 2009-05-15 2012-11-08 国立大学法人 東京大学 ウイルス産生細胞
EP3150701B1 (en) 2009-06-05 2018-10-03 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Reprogramming t cells and hematopoietic cells
AU2010263055A1 (en) 2009-06-19 2012-02-23 Center Of Regenerative Medicine Of Barcelona, Spain Generation of induced pluripotent stem cells from cord blood
CN102803476A (zh) 2009-09-14 2012-11-28 程临钊 血细胞重编程产生多潜能干细胞和多功能干细胞
AU2011267849B2 (en) 2010-06-15 2015-02-05 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Generation of induced pluripotent stem cells from small volumes of peripheral blood
US8765470B2 (en) 2010-08-04 2014-07-01 Cellular Dynamics International, Inc. Reprogramming immortalized B-cells to induced pluripotent stem cells

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Blood, 2009.5.28. 113(22):5475-5479 (2009.3.18. 온라인공개)

Also Published As

Publication number Publication date
CA2952805A1 (en) 2010-12-09
CA2764373A1 (en) 2010-12-09
JP2020124197A (ja) 2020-08-20
US9347044B2 (en) 2016-05-24
WO2010141801A3 (en) 2011-03-31
IL216707A0 (en) 2012-02-29
US20140315304A1 (en) 2014-10-23
IL261851B (en) 2020-06-30
JP2018183169A (ja) 2018-11-22
CN105925535A (zh) 2016-09-07
CN103087991B (zh) 2018-06-12
EP3150701B1 (en) 2018-10-03
EP2548950A3 (en) 2013-02-20
JP2018198604A (ja) 2018-12-20
AU2010254811B2 (en) 2015-02-19
KR20120026125A (ko) 2012-03-16
KR101772860B1 (ko) 2017-08-30
EP3150701A1 (en) 2017-04-05
CN103087991A (zh) 2013-05-08
US10221396B2 (en) 2019-03-05
US20120135525A1 (en) 2012-05-31
JP2021000131A (ja) 2021-01-07
DK2438160T3 (en) 2016-01-11
KR20170055562A (ko) 2017-05-19
IL216707B (en) 2019-03-31
EP2548950A2 (en) 2013-01-23
AU2010254811A1 (en) 2011-12-01
EP2438160B1 (en) 2015-12-23
CA2952805C (en) 2021-06-01
JP2018029622A (ja) 2018-03-01
EP2548950B1 (en) 2017-10-25
CA2764373C (en) 2019-11-19
WO2010141801A2 (en) 2010-12-09
EP2438160A2 (en) 2012-04-11
JP6865199B2 (ja) 2021-04-28
US20160257939A1 (en) 2016-09-08
CN102459575A (zh) 2012-05-16
JP2012528599A (ja) 2012-11-15
JP2020022462A (ja) 2020-02-13
IL261851A (en) 2018-10-31
US20170226484A1 (en) 2017-08-10
US8741648B2 (en) 2014-06-03
JP2014217393A (ja) 2014-11-20
KR20160113327A (ko) 2016-09-28
DK3150701T3 (en) 2019-01-14
JP2017104140A (ja) 2017-06-15
KR101813464B1 (ko) 2018-01-30
DK2548950T3 (en) 2017-12-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101811235B1 (ko) Ｔ 세포 및 조혈 세포의 재프로그래밍
JP5652783B2 (ja) ＮＫＴ細胞由来ｉＰＳ細胞およびそれ由来のＮＫＴ細胞
AU2015200413B2 (en) Reprogramming t cells and hematopoietic cells
BROWN et al. Patent 2764373 Summary

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
A107 Divisional application of patent
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
A107 Divisional application of patent
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)