JP2020124197A - リプログラミングｔ細胞および造血細胞 - Google Patents

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Abstract

【課題】リプログラミングＴ細胞および造血細胞の提供。【解決手段】人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の産生に関連した方法および組成物を開示する。例えば、人工多能性幹細胞は、ヒトＣＤ３４＋血液始原細胞などのＣＤ３４＋造血細胞またはＴ細胞から作製することができる。様々なｉＰＳ細胞系も提供する。特定の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞受容体の遺伝子再構成を含むゲノムを有する新規な人工多能性幹細胞を提供する。本方法では、Ｔ細胞の臨床的に入手しやすい供給源、例えば、３ｍｌの全血サンプルからｉＰＳ細胞を産生させることができ、造血細胞の動員が必要ない。【選択図】なし

Description

発明の背景
本願は、２００９年６月５日に出願された米国仮特許出願第６１／１８４，５４６号、および２００９年９月４日に出願された米国仮特許出願第６１／２４０，１１６号の優先権を主張し、これらの米国仮特許出願の全体の開示は、本明細書中に参考として援用される。
１．発明の分野
本発明は、分子生物学および幹細胞の分野全般に関する。詳細には、本発明は、体細胞、特にＴ細胞および造血細胞に関する。
２．先行技術の説明
一般に、幹細胞は、一連の成熟機能細胞を生じさせることができる未分化細胞である。例えば、造血幹細胞は、様々な種類の最終分化血液細胞のいずれも生じさせることができる。胚性幹（ＥＳ）細胞は、胚に由来し、多能性であるため、あらゆる器官もしくは組織型、または少なくとも潜在的に完全な胚に発達する能力を有する。
一般にｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略される人工多能性幹細胞は、非多能性細胞、典型的には成体の体細胞から人工的に誘導されるある型の多能性幹細胞である。人工多能性幹細胞は、ある幹細胞遺伝子およびタンパク質の発現、クロマチンのメチル化パターン、倍加時間、胚様体形成、奇形腫形成、生存可能なキメラの形成、ならびに効能（ｐｏｔｅｎｃｙ）および分化能の点などから、多くの点で胚性幹細胞などの天然の多能性幹細胞と同一であると考えられるが、天然の多能性幹細胞に対するそれらの全範囲に亘る関連についてはなお評価中である。
ｉＰＳ細胞は、２００６年にマウスの細胞から初めて作製され（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００６）、そして２００７年にヒトの細胞から作製された（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７ａ；Ｙｕら、２００７）。これは、論争の的になっている胚を使用することなく、研究に重要であり、かつ治療用途を潜在的に有する多能性幹細胞を研究者が入手可能にし得るため、幹細胞の研究における重大な進歩と言われている。
ヒトでは、ｉＰＳ細胞は、一般に皮膚線維芽細胞から作製される。しかしながら、皮膚生検の必要と線維芽細胞を増大させてｉｎ ｖｉｔｒｏで数回継代する必要があるため、患者固有の幹細胞の作製にとって扱いにくい供給源である。さらに、ヒト体細胞のリプログラミングの以前の方法は、体細胞をヒト被験体から直接得るか、または人手のかかる細胞培養系で細胞を維持する必要があるため不便である。したがって、単純で便利、かつ入手が容易な代替の供給源から多能性幹細胞を誘導する方法の開発が要望されている。本発明の開発中に、本発明者らは、患者または健常な個体から血液を採取する、保存する、または移送する、例えば、中心の施設から１つ以上の遠隔地に供給することができるため、血液サンプルがこのような供給源であり得ると見なした。しかしながら、本発明者らが本願に想到するまで、このような臨床的に入手しやすい供給源からＴ細胞由来の多能性幹細胞の作製の報告がなされておらず、このことは、このような技術を開発する大きな必要性
を実証している。
発明の要旨
本発明は、リプログラミングによるＴ細胞および／または造血始原細胞由来の人工多能性幹細胞の作製における当技術分野での主な障害を解消する。本方法では、Ｔ細胞の臨床的に入手しやすい供給源、例えば、３ｍｌの全血サンプルからｉＰＳ細胞を産生させることができ、造血細胞の動員が必要ない。他の実施形態では、造血細胞、例えば、ヒトまたは哺乳動物のＣＤ３４＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ４３＋造血前駆細胞を、血液サンプルから得て、ｉＰＳ細胞に変換することができる。造血前駆細胞は、例えば、ＣＤ３４＋細胞の富化または非ＣＤ３４＋細胞系統の枯渇によって、末梢血の血液サンプルから得ることができる。特定の実施形態では、ＣＤ３４＋造血細胞は、血液サンプルを得る前に被験体でＣＤ３４＋造血始原細胞を動員することなく得た血液サンプル、例えば、冷蔵または凍結保存血液サンプルから得ることができる。このようにして、ｉＰＳ細胞は、血液バンクで見られる末梢血サンプルを含め、様々な血液サンプルから作製することができる。
したがって、Ｔ細胞および／または造血始原細胞から人工多能性幹細胞を作製する方法であって、（ａ）Ｔ細胞および／または造血始原細胞を含む細胞集団を得る工程と、（ｂ）細胞集団のＴ細胞および／または造血始原細胞からｉＰＳ細胞を産生させてｉＰＳ細胞集団を得る工程と、を含む、方法が提供される。細胞集団の例示的な供給源には、限定されるものではないが、血液サンプル、血液成分、骨髄、リンパ節、胎児肝臓、または臍帯が含まれ得る。細胞集団の供給源には、血液サンプルまたは血液サンプル由来の細胞が含まれ得、この血液サンプルは、この血液サンプルを得る前に被験体で造血始原細胞を外部動員（例えば、造血成長因子の被験体への外部からの投与による）することなく被験体から得た。
細胞集団は、凍結保存血液サンプルから得ることができ、細胞集団の供給源または細胞集団を凍結保存しても良い。凍結保存血液サンプルは、ｉＰＳ細胞に上首尾にリプログラミングするためのＴ細胞の供給源として使用できることが実施例で実証された。
本発明の特定の態様の具体的な利点は、少量の血液サンプルの使用により本発明の特定の態様を実施できることである。適量の血液サンプルは、約１〜約５ｍｌ、約１〜１０ｍｌ、約１〜１５ｍｌ、またはより具体的には約３ｍｌであり得る。
ＣＤ３４＋細胞のような造血幹／始原細胞は、末梢血の供給源での富化のために、外部から加えられるＧ−ＣＳＦで誘導して末梢血中に動員することができる。非動員ドナーからの末梢血液細胞が上首尾のリプログラミングを達成できることが本発明の特定の態様で分かったため、外部から加えられる成長因子による骨髄細胞の動員が必要ない。したがって、具体的な態様では、細胞集団の供給源は、外部から加えられる１つ以上の造血成長因子、例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）で細胞が動員されていない被験体とすることができる。本明細書で同義的に使用される用語「外部からの（ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ）」または「外部の（ｅｘｔｅｒｎａｌ）」は、生物体内を起源とする内因性因子によってある程度まで動員されたＣＤ３４＋細胞の使用と対照的な、生物体の外部から動員作用物質を加えることを指す。
リプログラミングに適したＴ細胞の集団を提供するために、Ｔ細胞を含む細胞集団を、例えば、抗ＣＤ３抗体の存在下などのｉｎ ｖｉｔｒｏで、またはｉｎ ｖｉｖｏでＴ細胞を活性化させる（したがって、特定の抗原、例えば、ＧＰ−１００などの黒色腫の癌抗原に対して特異的なＴＣＲを有する）条件下で調製することができる。これには、当技術分野で公知の４量体、ワクチン、および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏでのペプチド刺激の使
用も含まれ得る。細胞集団を１つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）と共にｉｎ ｖｉｔｒｏで培養して、その中でＴ細胞集団を増大させることもできる。Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞とすることができる。具体的な態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはこれらの組み合わせとしても良い。Ｔ細胞の例として、限定されるものではないが、Ｔヘルパー１（ＴＨ１）細胞、Ｔヘルパー２（ＴＨ２）細胞、ＴＨ１７細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、記憶Ｔ細胞、γδＴ細胞、および任意のＴ細胞が挙げられる。
特定の態様では、細胞集団は、約８０％〜約９９％、約９０％〜約９９％、約９７％〜約９９％、または任意の中間の範囲のＴ細胞を含み、これらの範囲は、少なくとも、約、または多くとも、１×１０３、２×１０３、３×１０３、４×１０３、５×１０３、６×１０３、７×１０３、８×１０３、９×１０３、１×１０４、２×１０４、３×１０４、４×１０３、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４、９×１０４、１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１×１０６、２×１０６のＴ細胞、またはその中に導き出せる任意の範囲に一致し得る。例えば、本発明者らは、１ウェル当たり僅か約１〜５×１０３個のＴ細胞を有する９６ウェルプレートでのリプログラミングを実証した（図６Ａ〜図６Ｂ）。
造血前駆細胞の集団を提供するために、造血細胞を含む細胞集団を、ＣＤ３４＋細胞の富化または増大をもたらす条件下で調製することができる。具体的には、本発明は、リプログラミングのための十分なＣＤ３４＋細胞を得るために骨髄細胞の動員が必要ないことを見出す。例えば、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いてＣＤ３４＋造血細胞を富化することができ、特定の実施形態では、インダイレクトＣＤ３４マイクロビーズキットまたはダイレクトＣＤ３４マイクロビーズキット（共にＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能である）をＭＡＣＳと共に使用して、末梢血サンプルなどのサンプル由来のＣＤ３４＋造血細胞を富化することができる。Ｇｒａｔｗｏｈｌら（２００２）に記載されている方法を含め、末梢血から動員されたＣＤ３４＋造血始原細胞を得る別の方法も当技術分野で公知である。これにもかかわらず、特定の好ましい実施形態では、ＣＤ３４＋造血前駆細胞は、１つ以上の造血成長因子に曝露されていない被験体から得ることができ；したがって、ＣＤ３４＋造血前駆細胞は、血液バンクで典型的に見られる血液サンプルを含め、１つ以上の外部から加えられる成長因子によって動員されていないドナーの血液サンプルから有利に得ることができる。他の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、成熟造血細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、顆粒球、および／または赤血球系細胞の枯渇によってサンプル中で富化することができる。細胞系統の枯渇では、細胞懸濁液を、抗体（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＣＤ２３５ａの１つ以上）のカクテルと共にインキュベートし、次いでこのカクテルを用いて、上記の系統陽性細胞を除去することができる（例えば、Ｋａｒａｎｕら、２００３）。系統細胞枯渇キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）も市販されており、この目的で使用することができる。特定の実施形態では、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、および／またはＩＬ−３サイトカインの組み合わせを用いて、例えば、Ａｋｋｉｎａら、（１９９６）に記載されている方法またはＳｔｅｍＰｒｏ（商標）−３４培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡから入手可能）により、ｉＰＳ細胞に変換する前にＣＤ３４＋細胞を増大し、増殖させることができる。
実質的にあらゆる造血始原細胞またはＣＤ３４＋造血細胞を、本明細書に記載された方法によってｉＰＳ細胞にリプログラミングできることが本発明者らによって予測されている。特定の実施形態では、末梢血サンプルから得たまたは由来する造血前駆細胞を、本明細書に記載された方法によってｉＰＳ細胞に変換することができる。造血前駆細胞は、ＣＤ３４およびＣＤ４５の両方、またはＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＣＤ４３を発現することができる。特定の場合には、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）などの幹細胞から造血前駆細胞を作製するのが望ましいこともあり；これらの実施形態では、骨髄性前駆細胞で高度に富化されたＣＤ３４＋、ＣＤ４３＋、およびＣＤ４５＋造血細胞を、例えば、Ｃｈｏｉら（２００９）に記載されているようにｈＥＳＣのＯＰ９フィーダー細胞との共培養によって作製することができる。特定の場合には、造血前駆細胞は、ＣＤ３４が陰性であり得（例えば、Ｇｕｏら、２００３）；これにもかかわらず、これらの造血前駆細胞が、ｉＰＳ細胞に分化できると予測されている。
細胞集団のＴ細胞および／または造血始原細胞からｉＰＳ細胞を産生させるために、本方法は、１つ以上のリプログラミング因子をＴ細胞および／または造血始原細胞に導入する工程を含み得る。特定の態様では、リプログラミング因子は、Ｓｏｘファミリータンパク質およびＯｃｔファミリータンパク質を含むリプログラミングタンパク質とすることができ、これらの各タンパク質の１つ以上を、細胞侵入のためのタンパク質形質導入ドメインに作用的に連結することができる。本発明のさらなる実施形態では、リプログラミング因子は、１つ以上の発現カセットによってコードすることができ、例えば、Ｓｏｘファミリータンパク質およびＯｃｔファミリータンパク質を含み得る。ＳｏｘおよびＯｃｔは、ＥＳ細胞であることを指定する転写制御の階層の中心であると考えられる。例えば、Ｓｏｘは、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、またはＳｏｘ１８、特にＳｏｘ２とすることができ；Ｏｃｔは、Ｏｃｔ４とすることができる。Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、またはＥｓｒｒｂのような追加の因子がリプログラミング効率を上げることができ；リプログラミング因子の特定のセットは、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、および必要に応じてＬｉｎ−２８を含む；またはＳｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ、および必要に応じてｃ−Ｍｙｃを含むセットとすることができる。
具体的な実施形態では、１つ以上の発現カセットは、１つ以上のポリシストロニック転写単位を含み得る。ポリシストロニック単位は、例えば、（ｉ）少なくとも２つのリプログラミング遺伝子、例えば、Ｓｏｘ−Ｏｃｔ、ｃ−Ｍｙｃ−Ｋｌｆ、またはＮａｎｏｇ−Ｌｉｎ２８；あるいは、（ｉｉ）選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカーに連結されたリプログラミング遺伝子などの作動可能に連結されたコード領域の異なる組み合わせを含み得る。本発明者らが、１つのリプログラミング因子および蛍光マーカーを備えた４つの別個のバイシストロニックベクター（このようなベクターマップが図１０に示されている）を使用する代わりに、一切蛍光マーカーを備えていない、１つのベクターに付き２つのリプログラミング因子（Ｓｏｘ２とＯｃｔ４、ｃＭｙｃとＫｌｆ４、またはＮａｎｏｇとＬｉｎ２８）を有するバイシストロニックベクター（ベクターマップが図１１Ａ〜図１１Ｃに示されている）を使用することにより、これら前者のベクターを使用したリプログラミング効率が劇的に改善され、ｉＰＳコロニーが早めに出現する（第２０〜２４日目ではなくおよそ第１０〜１４日目）ことを見出したため、態様（ｉ）が好ましいであろう。
同じポリシストロニック転写単位で複数の遺伝子を共発現させるために、ポリシストロニック転写単位は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）または少なくとも１つのプロテアーゼ切断部位および／またはポリシストロニック転写のための自己切断ペプチドをコードする配列を含み得る。例えば、自己切断ペプチドは、ウイルス２Ａペプチドである。
なおさらなる実施形態では、１つ以上の発現カセットが、ウイルスベクター、エピソームベクター、またはトランスポゾンからなる群から選択されるリプログラミングベクターに含められる。より具体的には、ベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、Ａｋｖ−ＭＬＶ、ＳＬ−３−３−ＭＬＶ、または別の密接に関連したウイルスなどのレトロウイルスベクターとすることができる。ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターとすることもできる。特定の態様では、転写調節要素は、ウイルス遺伝子の組み込みを媒介する末端長反復領域（ＬＴＲ）を含み得る。
代替の態様では、ベクターは、エピソームベクター、例えば、ＥＢＶをベースとしたベクターまたはトランスポゾンをベースとしたベクターとすることができる。
さらなる実施形態では、リプログラミング因子は、リポソームトランスフェクション、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーション、粒子銃、リン酸カルシウム、ポリカチオン、またはポリアニオン、あるいは外来性要素を細胞に導入するのに適した任意の方法によって導入することができる。
一部のさらなる態様では、ｉＰＳ細胞は、１つ以上の胚性幹細胞の特性、例えば、未分化形態、胚性幹細胞特異的マーカー、接着性、多能性、多系統分化能、または当技術分野で公知の任意の特性に基づいて選択することができる。例えば、これは、未分化形態に基づいて子孫細胞を選択するのに特に便利であり得る。胚性幹細胞特異的マーカーは、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０またはＴｒａ−１−８１、Ｔｒａ−２−４９／６Ｅ、ＧＤＦ３、ＲＥＸ１、ＦＧＦ４、ＥＳＧ１、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、およびｈＴＥＲＴからなる群から選択される１つ以上の特異的マーカーとすることができる。この選択工程は、細胞が多能性の状態であって分化した状態に戻らないようにリプログラミング後の２つ以上の時点で利用することができる。ｉＰＳ細胞はまた、便利な分離法にも利用できる表面への接着性が、Ｔ細胞および造血始原細胞とは異なっている。
具体的な態様では、リプログラミングされた細胞は、細胞が多能性となるときに外部から導入された物質を抑制する（ｓｉｌｅｎｃｅ）ことができるため、発現カセットに含まれるベクター遺伝要素またはレポーター遺伝子などの導入された外来性要素の発現が実質的にないことに基づいてｉＰＳ細胞を選択することができる。したがって、組み込んでいるベクター遺伝要素、またはレポーターの発現、例えば蛍光の本質的な消失は、形態の特性に加えて、細胞がリプログラミングされたという指標である。例えば、レポーターの発現の抑制は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ＣＡＴアッセイ、または導入されたレポーター遺伝子に基づいた発光アッセイによって選択することができる。外来性要素の「本質的な消失」または外来性要素を「本質的に含まない」は、ｉＰＳ細胞集団の細胞の１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、または任意の中間のパーセンテージが、外来性要素を含むことを意味する。ｉＰＳ細胞集団は、組み込まれた外来性ウイルス要素を本質的に含み得ない。
ｉＰＳ細胞の臨床への適用のために、本方法は、ｉＰＳ細胞を分化細胞、例えば、心筋細胞、造血細胞、筋細胞、ニューロン、線維芽細胞、脾臓細胞、肝細胞、または表皮細胞に分化させる工程をさらに含み得る。さらなる態様では、上記されたようにｉＰＳ細胞集団から分化した分化細胞、組織、または器官を開示することができる。このような組織には、神経、骨、消化管、上皮、筋肉、軟骨、または心臓組織が含まれ得：このような器官には、脳、脊髄、心臓、肝臓、腎臓、胃、腸、または脾臓が含まれ得る。特定の態様では、このような分化細胞、組織、または器官は、組織の移植、薬物スクリーニング、または胚性幹細胞の代わりを探す開発的研究に使用することができる。
なおさらなる態様では、上記の方法によって作製された人工多能性幹細胞も開示することができる。ヒト細胞とすることができる胚性幹細胞と比較して、不完全なセットのＴ細胞受容体遺伝子のＶ、Ｄ、およびＪセグメントを含むゲノムを有する人工多能性幹細胞を提供することもできる。具体的な態様では、人工多能性幹細胞は、組み込まれた外来性ウイルス要素を本質的に含み得ない。
本発明の方法および／または組成物に関連して説明される実施形態は、本明細書に記載される任意の他の方法または組成物に関して利用することができる。したがって、１つの方法または組成物に関する一実施形態は、本発明の他の方法および組成物にも適用することができる。
本明細書で使用される、核酸に関する用語「コードする」または「コードしている」は、当業者が本発明を容易に理解できるように使用されるが、これらの用語はそれぞれ、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同義的に使用することができる。
本明細書で使用される「ある（ａ）」または「ある（ａｎ）」は、１つ以上を意味し得る。語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と共に請求項（複数可）で使用される場合、語「ある（ａ）」または「ある（ａｎ）」は、１つまたは２つ以上を意味し得る。
請求項における用語「または（ｏｒ）」の使用は、代替のみまたは代替が互いに排他的であると明確に述べられていない限り、「および／または」を意味するが、本開示は、代替のみおよび「および／または」を指す定義も支持する。本明細書で使用される「別の」は、少なくとも２番目以降を意味する。
本出願の全体を通じて、用語「約」は、ある値が、その値を決定するために用いられるデバイスまたは方法に固有の誤差のばらつき、または被試験物中に存在するばらつきを含むことを示すために使用される。
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、この詳細な説明から本発明の趣旨および範囲内の様々な変更および改良が当業者に明らかになるため、単なる例示として与えられることを理解されたい。
以下の図面は、本明細書の一部を構成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含められている。本発明は、本明細書に示される特定の実施形態の詳細な説明と共にこれらの図面の１つ以上を参照することによってより良く理解できる。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
Ｔ細胞またはＣＤ３４＋造血始原細胞から人工多能性幹細胞を作製する方法であって、
（ａ）Ｔ細胞またはＣＤ３４＋造血始原細胞を含む細胞集団を入手する工程であって、前記ＣＤ３４＋造血始原細胞が、被験体に由来し、前記被験体の細胞が、外的に加えられる顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）で動員されていない、工程と、
（ｂ）前記細胞集団の前記Ｔ細胞またはＣＤ３４＋造血始原細胞からｉＰＳ細胞を産生させて、ｉＰＳ細胞集団を提供する工程と、を含む、方法。
（項目２）
前記細胞集団の供給源が、血液サンプル、血液成分、骨髄、リンパ節、胎児肝臓、または臍帯である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記細胞集団の供給源が、約１〜約５ｍｌの血液サンプルである、項目２に記載の方法。（項目４）
前記細胞集団の供給源が、約３ｍｌの血液サンプルである、項目３に記載の方法。
（項目５）
Ｔ細胞を含む前記細胞集団の供給源が被験体であり、前記被験体の細胞が、外的に加えられるＧ−ＣＳＦで動員されていない、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記細胞集団が凍結保存されている、項目１に記載の方法。
（項目７）
Ｔ細胞を含む前記細胞集団を、前記Ｔ細胞を活性化させる条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏまたｉｎ ｖｉｖｏで調製する、項目１に記載の方法。
（項目８）
Ｔ細胞を含む細胞集団を、抗ＣＤ３抗体の存在下で培養する、項目７に記載の方法。
（項目９）
Ｔ細胞またはＣＤ３４＋造血始原細胞を含む前記細胞集団を１つ以上のサイトカインと共にｉｎ ｖｉｔｒｏで培養して、その中で前記Ｔ細胞またはＣＤ３４＋造血始原細胞の細胞集団を増大させる、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記細胞集団がＴ細胞を含み、前記１つ以上のサイトカインがＩＬ−２を含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記細胞集団がＣＤ３４＋造血始原細胞を含み、前記１つ以上のサイトカインが、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、またはＩＬ−３の少なくとも１つを含む、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記Ｔ細胞がヒトＴ細胞である、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記ＣＤ３４＋造血始原細胞が、ヒトＣＤ３４＋造血始原細胞である、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記Ｔ細胞が、Ｔヘルパー１（ＴＨ１）細胞、Ｔヘルパー２（ＴＨ２）細胞、ＴＨ１７細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、記憶Ｔ細胞、またはγδＴ細胞である、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記細胞集団が、約９０％〜約９９％のＴ細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記細胞集団が、約９７％〜約９９％のＴ細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記細胞集団が、少なくとも１×１０３のＴ細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記細胞集団が、少なくとも５×１０３のＴ細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記細胞集団が、約１×１０６〜約２×１０６のＴ細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記集団の前記Ｔ細胞またはＣＤ３４＋造血始原細胞からｉＰＳ細胞を産生させる工程が、１つ以上のリプログラミング因子を前記Ｔ細胞またはＣＤ３４＋造血始原細胞に導入する工程を含む、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記リプログラミング因子が、Ｓｏｘファミリータンパク質およびＯｃｔファミリータンパク質を含むリプログラミングタンパク質である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
１つ以上の前記リプログラミングタンパク質が、タンパク質形質導入ドメインに作用的に連結されている、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記リプログラミング因子が、１つ以上の発現カセットによってコードされ、Ｓｏｘファ
ミリータンパク質およびＯｃｔファミリータンパク質を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
前記１つ以上の発現カセットが、少なくとも１つのポリシストロニック転写単位を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記ポリシストロニック転写単位が、少なくとも２つのリプログラミング遺伝子を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記ポリシストロニック転写単位が、Ｓｏｘ遺伝子およびＯｃｔ遺伝子を含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記ポリシストロニック転写単位が、ｃＭｙｃ遺伝子およびＫｌｆ４遺伝子を含む、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
前記ポリシストロニック転写単位が、Ｎａｎｏｇ遺伝子およびＬｉｎ２８遺伝子を含む、項目２６に記載の方法。
（項目３０）
前記ポリシストロニック転写単位が、リプログラミング遺伝子および選択またはスクリーニングマーカーを含む、項目２５に記載の方法。
（項目３１）
前記ポリシストロニック転写単位が、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、または少なくとも１つのプロテアーゼ切断部位および／またはポリシストロニック転写のための自己切断ペプチドをコードする配列を含む、項目２５に記載の方法。
（項目３２）
前記１つ以上の発現カセットが、ウイルスベクター、エピソームベクター、またはトランスポゾンからなる群から選択されるリプログラミングベクターに含められている、項目２４に記載の方法。
（項目３３）
前記リプログラミングベクターが、レトロウイルスベクターである、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記Ｓｏｘファミリータンパク質がＳｏｘ２である、項目２２または２４のいずれかに記載の方法。
（項目３５）
前記Ｏｃｔファミリータンパク質がＯｃｔ４である、項目２２または２４のいずれかに記載の方法。
（項目３６）
前記リプログラミングタンパク質が、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、またはＥｓｒｒｂをさらに含む、項目２２または２４のいずれかに記載の方法。
（項目３７）
前記リプログラミングタンパク質が、Ｎａｎｏｇをさらに含む、項目３６に記載の方法。（項目３８）
前記リプログラミングタンパク質が、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃをさらに含む、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
前記集団の前記Ｔ細胞またはＣＤ３４＋造血始原細胞からｉＰＳ細胞を産生させる工程が、胚性幹細胞の１つ以上の特性について前記ｉＰＳ細胞を選択する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目４０）
前記特性が、接着性、未分化形態、胚性幹細胞特異的マーカー、または多能性である、項
目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記特性が接着性である、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記特性が未分化形態である、項目４０に記載の方法。
（項目４３）
前記方法が、前記ｉＰＳ細胞を分化細胞に分化させる工程を含む、項目１に記載の方法。（項目４４）
前記分化細胞が、心筋細胞、造血細胞、ニューロン、線維芽細胞、または表皮細胞を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記ｉＰＳ細胞集団が、組み込まれた外来性ウイルス要素を本質的に含まない、項目１に記載の方法。
（項目４６）
項目１〜４５のいずれか１項に記載の方法に従って産生させた人工多能性幹細胞。
（項目４７）
胚性幹細胞と比較して、不完全なセットのＴ細胞受容体遺伝子のＶ、Ｄ、およびＪセグメントを含むゲノムを含む人工多能性幹細胞。
（項目４８）
前記人工多能性幹細胞がヒト細胞である、項目４７に記載の人工多能性幹細胞。
（項目４９）
前記人工多能性幹細胞が、組み込まれた外来性ウイルス要素を含まない、または組み込まれた外来性ウイルス要素を本質的に含まない、項目４７に記載の人工多能性幹細胞。
図１は、活性化Ｔ細胞で始まり、ｈＥＳＣ様形態のｉＰＳＣコロニーをもたらすＴ細胞リプログラミングプロセスの概要を示す図である。Ｔ細胞およびｉＰＳＣコロニーの画像はそれぞれ、１０倍および２０倍の対物レンズを用いてＯｌｙｍｐｕｓＩＸ７１顕微鏡で撮像した。 図２Ａ〜図２Ｃは、ヒトＴ細胞由来人工多能性幹細胞の誘導および特徴付けを示すグラフである。（図２Ａ）投入細胞供給源ＣＤ３表面発現のフローサイトメトリー分析。（ｉ）代表的なドナーにおけるＰＢＭＣ集団からの第−３日目の非活性化ＰＢＭＣおよび第０日目の活性化Ｔ細胞におけるＣＤ３の表面発現。（ｉｉ）ＣＤ３＋細胞の優先的な形質導入を実証するための、代表的なドナーでの形質導入から７２時間後のゲートをかけた形質導入（ＧＦＰ＋）細胞集団におけるＣＤ３発現。（ｉｉｉ）平均１０のドナーＶａｃｕｔａｉｎｅｒ由来サンプルにおける上記の測定（ｉ−ｉｉ）のヒストグラム表示。（図２Ｂ）代表的な白血球アフェレーシス（「ＴｉＰＳ Ｌ−２」）およびＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（著作権）（「ＴｉＰＳ Ｖ−１」）によるＴｉＰＳ系におけるｈＥＳＣ多能性マーカーＯＣＴ４、Ｔｒａ−１−８１、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４のフローサイトメトリー分析。（図２Ｃ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）β遺伝子座のＶ〜Ｊ領域内の保存された領域を標的とするマルチプレックスＰＣＲプライマーを用いたＴＣＲβ鎖再構成（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）の分析。多クローン性開始Ｔ細胞集団が、エレクトロフェログラムにおける有効な断片サイズの範囲内のアンプリコンのピークのベル型曲線によって表されている。線維芽細胞（非Ｔ細胞）ｉＰＳ細胞（「Ｆｉｂ−ｉＰＳ」）が、ＴＣＲβ遺伝子座における生殖系列の再構成がなく、陰性コントロールとして役立つ。クローンに由来するＴｉＰＳ系（２つの白血球アフェレーシスによる系「ＴｉＰＳ Ｌ−１」および「ＴｉＰＳ Ｌ−２」とＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（著作権）による系「ＴｉＰＳ Ｖ−２」からの代表的なデータ）は、規定サイズの１つの明確なピークを示している。ＤＮＡ断片分析を、ＡＢＩ ３７３０ ＤＮＡアナライザーで行った。 図２Ａ〜図２Ｃは、ヒトＴ細胞由来人工多能性幹細胞の誘導および特徴付けを示すグラフである。（図２Ａ）投入細胞供給源ＣＤ３表面発現のフローサイトメトリー分析。（ｉ）代表的なドナーにおけるＰＢＭＣ集団からの第−３日目の非活性化ＰＢＭＣおよび第０日目の活性化Ｔ細胞におけるＣＤ３の表面発現。（ｉｉ）ＣＤ３＋細胞の優先的な形質導入を実証するための、代表的なドナーでの形質導入から７２時間後のゲートをかけた形質導入（ＧＦＰ＋）細胞集団におけるＣＤ３発現。（ｉｉｉ）平均１０のドナーＶａｃｕｔａｉｎｅｒ由来サンプルにおける上記の測定（ｉ−ｉｉ）のヒストグラム表示。（図２Ｂ）代表的な白血球アフェレーシス（「ＴｉＰＳ Ｌ−２」）およびＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（著作権）（「ＴｉＰＳ Ｖ−１」）によるＴｉＰＳ系におけるｈＥＳＣ多能性マーカーＯＣＴ４、Ｔｒａ−１−８１、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４のフローサイトメトリー分析。（図２Ｃ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）β遺伝子座のＶ〜Ｊ領域内の保存された領域を標的とするマルチプレックスＰＣＲプライマーを用いたＴＣＲβ鎖再構成（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）の分析。多クローン性開始Ｔ細胞集団が、エレクトロフェログラムにおける有効な断片サイズの範囲内のアンプリコンのピークのベル型曲線によって表されている。線維芽細胞（非Ｔ細胞）ｉＰＳ細胞（「Ｆｉｂ−ｉＰＳ」）が、ＴＣＲβ遺伝子座における生殖系列の再構成がなく、陰性コントロールとして役立つ。クローンに由来するＴｉＰＳ系（２つの白血球アフェレーシスによる系「ＴｉＰＳ Ｌ−１」および「ＴｉＰＳ Ｌ−２」とＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（著作権）による系「ＴｉＰＳ Ｖ−２」からの代表的なデータ）は、規定サイズの１つの明確なピークを示している。ＤＮＡ断片分析を、ＡＢＩ ３７３０ ＤＮＡアナライザーで行った。 図２Ａ〜図２Ｃは、ヒトＴ細胞由来人工多能性幹細胞の誘導および特徴付けを示すグラフである。（図２Ａ）投入細胞供給源ＣＤ３表面発現のフローサイトメトリー分析。（ｉ）代表的なドナーにおけるＰＢＭＣ集団からの第−３日目の非活性化ＰＢＭＣおよび第０日目の活性化Ｔ細胞におけるＣＤ３の表面発現。（ｉｉ）ＣＤ３＋細胞の優先的な形質導入を実証するための、代表的なドナーでの形質導入から７２時間後のゲートをかけた形質導入（ＧＦＰ＋）細胞集団におけるＣＤ３発現。（ｉｉｉ）平均１０のドナーＶａｃｕｔａｉｎｅｒ由来サンプルにおける上記の測定（ｉ−ｉｉ）のヒストグラム表示。（図２Ｂ）代表的な白血球アフェレーシス（「ＴｉＰＳ Ｌ−２」）およびＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（著作権）（「ＴｉＰＳ Ｖ−１」）によるＴｉＰＳ系におけるｈＥＳＣ多能性マーカーＯＣＴ４、Ｔｒａ−１−８１、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４のフローサイトメトリー分析。（図２Ｃ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）β遺伝子座のＶ〜Ｊ領域内の保存された領域を標的とするマルチプレックスＰＣＲプライマーを用いたＴＣＲβ鎖再構成（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）の分析。多クローン性開始Ｔ細胞集団が、エレクトロフェログラムにおける有効な断片サイズの範囲内のアンプリコンのピークのベル型曲線によって表されている。線維芽細胞（非Ｔ細胞）ｉＰＳ細胞（「Ｆｉｂ−ｉＰＳ」）が、ＴＣＲβ遺伝子座における生殖系列の再構成がなく、陰性コントロールとして役立つ。クローンに由来するＴｉＰＳ系（２つの白血球アフェレーシスによる系「ＴｉＰＳ Ｌ−１」および「ＴｉＰＳ Ｌ−２」とＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（著作権）による系「ＴｉＰＳ Ｖ−２」からの代表的なデータ）は、規定サイズの１つの明確なピークを示している。ＤＮＡ断片分析を、ＡＢＩ ３７３０ ＤＮＡアナライザーで行った。 図３Ａ〜図３Ｄは、ヒトＴ細胞由来人工多能性幹細胞の特徴付けを示す画像およびグラフである。（図３Ａ）ｈＥＳ細胞マーカー遺伝子ＤＮＭＴ３８、ＬＥＦＴＢ、ＮＯＤＡＬ、ＲＥＸ１、ＥＳＧ１、ＴＥＲＴ、ＧＤＦ３、およびＵＴＦ１の発現についての代表的な白血球アフェレーシス（「ＴｉＰＳ Ｌ−１およびＬ−２」）およびＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（著作権）（「ＴｉＰＳ Ｖ−２」）によるＴｉＰＳ細胞系のＲＴ−ＰＣＲ分析。ＧＡＰＤＨを、各サンプルの陽性負荷コントロールとして使用した。（図３Ｂ）ゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析により、導入遺伝子の組み込みを確認する。目的のリプログラミング遺伝子（「ＲＧ」）用の順方向プライマーおよびＩＲＥＳ用の逆方向プライマーを利用した。ＯＣＴ４順方向および逆方向プライマーは、ベクターマップ示されているようにＰＣＲ反応の陽性コントロールとして使用した。（図３Ｃ）ＧＡＰＤＨを各サンプルの陽性コントロールとして使用した、ＴｉＰＳ細胞系のＲＴ−ＰＣＲ分析により、外来性導入遺伝子のサイレンシングが示されている。ｈＥＳＣ系Ｈ１および線維芽細胞由来ｉＰＳＣ系（Ｆｉｂ−ｉＰＳ）は、陽性細胞コントロールとして役立ち、活性化ドナーＴ細胞は、陰性細胞コントロールとして役立つ。（図３Ｄ）ＴｉＰＳクローンが、フローサイトメトリー分析によって示されているようにヒト胚性幹細胞特異的多能性マーカーを発現した。 図３Ａ〜図３Ｄは、ヒトＴ細胞由来人工多能性幹細胞の特徴付けを示す画像およびグラフである。（図３Ａ）ｈＥＳ細胞マーカー遺伝子ＤＮＭＴ３８、ＬＥＦＴＢ、ＮＯＤＡＬ、ＲＥＸ１、ＥＳＧ１、ＴＥＲＴ、ＧＤＦ３、およびＵＴＦ１の発現についての代表的な白血球アフェレーシス（「ＴｉＰＳ Ｌ−１およびＬ−２」）およびＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（著作権）（「ＴｉＰＳ Ｖ−２」）によるＴｉＰＳ細胞系のＲＴ−ＰＣＲ分析。ＧＡＰＤＨを、各サンプルの陽性負荷コントロールとして使用した。（図３Ｂ）ゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析により、導入遺伝子の組み込みを確認する。目的のリプログラミング遺伝子（「ＲＧ」）用の順方向プライマーおよびＩＲＥＳ用の逆方向プライマーを利用した。ＯＣＴ４順方向および逆方向プライマーは、ベクターマップ示されているようにＰＣＲ反応の陽性コントロールとして使用した。（図３Ｃ）ＧＡＰＤＨを各サンプルの陽性コントロールとして使用した、ＴｉＰＳ細胞系のＲＴ−ＰＣＲ分析により、外来性導入遺伝子のサイレンシングが示されている。ｈＥＳＣ系Ｈ１および線維芽細胞由来ｉＰＳＣ系（Ｆｉｂ−ｉＰＳ）は、陽性細胞コントロールとして役立ち、活性化ドナーＴ細胞は、陰性細胞コントロールとして役立つ。（図３Ｄ）ＴｉＰＳクローンが、フローサイトメトリー分析によって示されているようにヒト胚性幹細胞特異的多能性マーカーを発現した。 図４Ａ〜図４Ｅは、ＴｉＰＳ細胞系のｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化能を示す画像およびグラフである。（図４Ａ）奇形腫形成は、ｉｎ ｖｉｖｏでの分化能を示している。ＳＣＩＤ／ベージュマウスに注入されたＴｉＰＳ細胞は、５〜１２週間で奇形腫を形成した。ヘマトキシリンおよびエオシン染色は、胃腸または呼吸組織を表す杯細胞をもつ単層上皮（内胚葉）、軟骨（中胚葉）、および網膜色素上皮（外胚葉）を含む３つの一次胚葉からの誘導に一致する組織を示している。ＴｉＰＳ Ｌ−２細胞系の代表的な画像は、４０倍の対物レンズを用いてＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１顕微鏡で撮像した。（図４Ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでのニューロンへの分化。ＴｉＰＳ Ｌ−２細胞を凝集体としてニューロン分化に誘導し、次いでＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４二次抗体をもつニューロンマーカーβＩＩＩチューブリンを染色した；細胞核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色で対比染色した。画像は、２０倍の対物レンズを用いて撮像した。コントラストを調整して、画像をＩｍａｇｅ Ｊソフトウエアで統合した。（図４Ｃ）細胞凝集法によるＴｉＰＳ細胞からの心臓誘導。細胞凝集体は、第１４〜１５日目に、拍動する心臓トロポニンＴ（ｃＴＮＴ）陽性心筋細胞を含む。代表的なサンプルのフローデータが示されている。画像は、１０倍の対物レンズを用いて撮像した。（図４Ｄ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでの造血始原細胞への分化。２つのＴｉＰＳ系での１２日間の無血清胚様体（ＥＢ）分化プロトコルによって作製された造血始原細胞（ＨＰＣ）を、ｈＥＳＣ系（Ｈ１）および線維芽細胞由来ｉＰＳＣ系（Ｆｉｂ−ｉＰＳ）と比較した。ＥＢを単一細胞に分離して、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４３、ＣＤ３１、ＣＤ４１、およびＣＤ２３５ａに対する蛍光色素結合モノクローナル抗体で染色することによってフローサイトメトリーでＨＰＣを定量した。（図４Ｅ）造血性クローン原性（ＣＦＵ）アッセイを、ＥＢ分化して個別化した細胞をサイトカイン（ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、およびＥＰＯ）を含む無血清ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ培地に添加して行った。コロニーは、赤血球（ＣＦＵ−Ｅ／ＢＦＵ−Ｅ）、マクロファージ（ＣＦＵ−Ｍ、データは示していない）、顆粒球（ＣＦＵ−Ｇ、データは示していない）、顆粒球−マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）、および顆粒球−赤血球−マクロファージ−巨核球（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）として形態学的基準にしたがって１４日間のインキュベーションの後にスコアを付けた。全ＣＦＵのカウント数も示す（ＣＦＵ）。画像は、２倍の対物レンズを用いてＯｌｙｍｐｕｓ ＣＫＸ４１顕微鏡で撮像した。 図４Ａ〜図４Ｅは、ＴｉＰＳ細胞系のｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化能を示す画像およびグラフである。（図４Ａ）奇形腫形成は、ｉｎ ｖｉｖｏでの分化能を示している。ＳＣＩＤ／ベージュマウスに注入されたＴｉＰＳ細胞は、５〜１２週間で奇形腫を形成した。ヘマトキシリンおよびエオシン染色は、胃腸または呼吸組織を表す杯細胞をもつ単層上皮（内胚葉）、軟骨（中胚葉）、および網膜色素上皮（外胚葉）を含む３つの一次胚葉からの誘導に一致する組織を示している。ＴｉＰＳ Ｌ−２細胞系の代表的な画像は、４０倍の対物レンズを用いてＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１顕微鏡で撮像した。（図４Ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでのニューロンへの分化。ＴｉＰＳ Ｌ−２細胞を凝集体としてニューロン分化に誘導し、次いでＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４二次抗体をもつニューロンマーカーβＩＩＩチューブリンを染色した；細胞核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色で対比染色した。画像は、２０倍の対物レンズを用いて撮像した。コントラストを調整して、画像をＩｍａｇｅ Ｊソフトウエアで統合した。（図４Ｃ）細胞凝集法によるＴｉＰＳ細胞からの心臓誘導。細胞凝集体は、第１４〜１５日目に、拍動する心臓トロポニンＴ（ｃＴＮＴ）陽性心筋細胞を含む。代表的なサンプルのフローデータが示されている。画像は、１０倍の対物レンズを用いて撮像した。（図４Ｄ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでの造血始原細胞への分化。２つのＴｉＰＳ系での１２日間の無血清胚様体（ＥＢ）分化プロトコルによって作製された造血始原細胞（ＨＰＣ）を、ｈＥＳＣ系（Ｈ１）および線維芽細胞由来ｉＰＳＣ系（Ｆｉｂ−ｉＰＳ）と比較した。ＥＢを単一細胞に分離して、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４３、ＣＤ３１、ＣＤ４１、およびＣＤ２３５ａに対する蛍光色素結合モノクローナル抗体で染色することによってフローサイトメトリーでＨＰＣを定量した。（図４Ｅ）造血性クローン原性（ＣＦＵ）アッセイを、ＥＢ分化して個別化した細胞をサイトカイン（ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、およびＥＰＯ）を含む無血清ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ培地に添加して行った。コロニーは、赤血球（ＣＦＵ−Ｅ／ＢＦＵ−Ｅ）、マクロファージ（ＣＦＵ−Ｍ、データは示していない）、顆粒球（ＣＦＵ−Ｇ、データは示していない）、顆粒球−マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）、および顆粒球−赤血球−マクロファージ−巨核球（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）として形態学的基準にしたがって１４日間のインキュベーションの後にスコアを付けた。全ＣＦＵのカウント数も示す（ＣＦＵ）。画像は、２倍の対物レンズを用いてＯｌｙｍｐｕｓ ＣＫＸ４１顕微鏡で撮像した。 図４Ａ〜図４Ｅは、ＴｉＰＳ細胞系のｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化能を示す画像およびグラフである。（図４Ａ）奇形腫形成は、ｉｎ ｖｉｖｏでの分化能を示している。ＳＣＩＤ／ベージュマウスに注入されたＴｉＰＳ細胞は、５〜１２週間で奇形腫を形成した。ヘマトキシリンおよびエオシン染色は、胃腸または呼吸組織を表す杯細胞をもつ単層上皮（内胚葉）、軟骨（中胚葉）、および網膜色素上皮（外胚葉）を含む３つの一次胚葉からの誘導に一致する組織を示している。ＴｉＰＳ Ｌ−２細胞系の代表的な画像は、４０倍の対物レンズを用いてＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１顕微鏡で撮像した。（図４Ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでのニューロンへの分化。ＴｉＰＳ Ｌ−２細胞を凝集体としてニューロン分化に誘導し、次いでＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４二次抗体をもつニューロンマーカーβＩＩＩチューブリンを染色した；細胞核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色で対比染色した。画像は、２０倍の対物レンズを用いて撮像した。コントラストを調整して、画像をＩｍａｇｅ Ｊソフトウエアで統合した。（図４Ｃ）細胞凝集法によるＴｉＰＳ細胞からの心臓誘導。細胞凝集体は、第１４〜１５日目に、拍動する心臓トロポニンＴ（ｃＴＮＴ）陽性心筋細胞を含む。代表的なサンプルのフローデータが示されている。画像は、１０倍の対物レンズを用いて撮像した。（図４Ｄ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでの造血始原細胞への分化。２つのＴｉＰＳ系での１２日間の無血清胚様体（ＥＢ）分化プロトコルによって作製された造血始原細胞（ＨＰＣ）を、ｈＥＳＣ系（Ｈ１）および線維芽細胞由来ｉＰＳＣ系（Ｆｉｂ−ｉＰＳ）と比較した。ＥＢを単一細胞に分離して、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４３、ＣＤ３１、ＣＤ４１、およびＣＤ２３５ａに対する蛍光色素結合モノクローナル抗体で染色することによってフローサイトメトリーでＨＰＣを定量した。（図４Ｅ）造血性クローン原性（ＣＦＵ）アッセイを、ＥＢ分化して個別化した細胞をサイトカイン（ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、およびＥＰＯ）を含む無血清ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ培地に添加して行った。コロニーは、赤血球（ＣＦＵ−Ｅ／ＢＦＵ−Ｅ）、マクロファージ（ＣＦＵ−Ｍ、データは示していない）、顆粒球（ＣＦＵ−Ｇ、データは示していない）、顆粒球−マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）、および顆粒球−赤血球−マクロファージ−巨核球（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）として形態学的基準にしたがって１４日間のインキュベーションの後にスコアを付けた。全ＣＦＵのカウント数も示す（ＣＦＵ）。画像は、２倍の対物レンズを用いてＯｌｙｍｐｕｓ ＣＫＸ４１顕微鏡で撮像した。 図４Ａ〜図４Ｅは、ＴｉＰＳ細胞系のｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化能を示す画像およびグラフである。（図４Ａ）奇形腫形成は、ｉｎ ｖｉｖｏでの分化能を示している。ＳＣＩＤ／ベージュマウスに注入されたＴｉＰＳ細胞は、５〜１２週間で奇形腫を形成した。ヘマトキシリンおよびエオシン染色は、胃腸または呼吸組織を表す杯細胞をもつ単層上皮（内胚葉）、軟骨（中胚葉）、および網膜色素上皮（外胚葉）を含む３つの一次胚葉からの誘導に一致する組織を示している。ＴｉＰＳ Ｌ−２細胞系の代表的な画像は、４０倍の対物レンズを用いてＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１顕微鏡で撮像した。（図４Ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでのニューロンへの分化。ＴｉＰＳ Ｌ−２細胞を凝集体としてニューロン分化に誘導し、次いでＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４二次抗体をもつニューロンマーカーβＩＩＩチューブリンを染色した；細胞核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色で対比染色した。画像は、２０倍の対物レンズを用いて撮像した。コントラストを調整して、画像をＩｍａｇｅ Ｊソフトウエアで統合した。（図４Ｃ）細胞凝集法によるＴｉＰＳ細胞からの心臓誘導。細胞凝集体は、第１４〜１５日目に、拍動する心臓トロポニンＴ（ｃＴＮＴ）陽性心筋細胞を含む。代表的なサンプルのフローデータが示されている。画像は、１０倍の対物レンズを用いて撮像した。（図４Ｄ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでの造血始原細胞への分化。２つのＴｉＰＳ系での１２日間の無血清胚様体（ＥＢ）分化プロトコルによって作製された造血始原細胞（ＨＰＣ）を、ｈＥＳＣ系（Ｈ１）および線維芽細胞由来ｉＰＳＣ系（Ｆｉｂ−ｉＰＳ）と比較した。ＥＢを単一細胞に分離して、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４３、ＣＤ３１、ＣＤ４１、およびＣＤ２３５ａに対する蛍光色素結合モノクローナル抗体で染色することによってフローサイトメトリーでＨＰＣを定量した。（図４Ｅ）造血性クローン原性（ＣＦＵ）アッセイを、ＥＢ分化して個別化した細胞をサイトカイン（ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、およびＥＰＯ）を含む無血清ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ培地に添加して行った。コロニーは、赤血球（ＣＦＵ−Ｅ／ＢＦＵ−Ｅ）、マクロファージ（ＣＦＵ−Ｍ、データは示していない）、顆粒球（ＣＦＵ−Ｇ、データは示していない）、顆粒球−マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）、および顆粒球−赤血球−マクロファージ−巨核球（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）として形態学的基準にしたがって１４日間のインキュベーションの後にスコアを付けた。全ＣＦＵのカウント数も示す（ＣＦＵ）。画像は、２倍の対物レンズを用いてＯｌｙｍｐｕｓ ＣＫＸ４１顕微鏡で撮像した。 図５は、ｉＰＳＣクローンのトラッキングを示すグラフである。ゲノムＤＮＡを奇形腫サンプルから単離して、ＴＣＲβ鎖再構成についてそれらの親細胞系と比較した。細胞系ＴｉＰＳ Ｖ−１の代表的なデータが示されている。誘導奇形腫は、親細胞系のクローン性再構成を有する。ＴＣＲβ遺伝子座のＶ〜Ｊ領域内の保存された領域を標的とするマルチプレックスプライマーを用いてＰＣＲ分析を行った。ＡＢＩ ３７３０ ＤＮＡアナライザーでＤＮＡ断片分析を行った。バックグラウンド≦１０００ＲＦＵ。 図６Ａ〜図６Ｂは、９６−セル形式でのＴ細胞のリプログラミングを示す画像である。図６Ａ。ドナーＡのＴ細胞に、バイシストロニックベクターＳＯ（Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４）およびＣＫ（ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４）を感染させて、ＭＥＦにプレーティングする。ｉＰＳ細胞コロニーを検出するために生細胞の抗Ｔｒａ１−６０標識化を行った。図６Ｂ。ドナーＡのＴ細胞にバイシストロニックベクターＳＯ（Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４）およびＮＬ（ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８）を感染させ、ＭＥＦにプレーティングする。ｉＰＳ細胞コロニーを検出するために生細胞の抗Ｔｒａ１−６０標識化を行った。投入細胞数を、出発材料におけるＴ細胞の数を表す「投入数」として示した。 図６Ａ〜図６Ｂは、９６−セル形式でのＴ細胞のリプログラミングを示す画像である。図６Ａ。ドナーＡのＴ細胞に、バイシストロニックベクターＳＯ（Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４）およびＣＫ（ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４）を感染させて、ＭＥＦにプレーティングする。ｉＰＳ細胞コロニーを検出するために生細胞の抗Ｔｒａ１−６０標識化を行った。図６Ｂ。ドナーＡのＴ細胞にバイシストロニックベクターＳＯ（Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４）およびＮＬ（ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８）を感染させ、ＭＥＦにプレーティングする。ｉＰＳ細胞コロニーを検出するために生細胞の抗Ｔｒａ１−６０標識化を行った。投入細胞数を、出発材料におけるＴ細胞の数を表す「投入数」として示した。 図７は、ＤＮＡフィンガープリント法の結果を示す表である。短縦列反復（ｓｈｏｒｔ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ）（ＳＴＲ）分析によると、ＴｉＰＳ細胞系は、分析された８つのＳＴＲ遺伝子座に渡って検出された１５すべての対立遺伝子多型について、活性化された親Ｔ細胞と同一であることが示される。２つのＴｉＰＳ系（ＴｉＰＳ Ｌ−１およびＴｉＰＳ Ｌ−２）の代表的なデータが示されている。 図８は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）染色を示す画像である。ＴｉＰＳ系のＴｉＰＳ Ｌ−１およびＴｉＰＳ Ｌ−２はＡＰ陽性である。画像は、ＨＰ Ｓｃａｎｊｅｔ Ｇ３１１０コンピュータスキャナーで撮像した。 図９は、ＴｉＰＳ細胞系が正常な核型を示していることを示す図である。ＴｉＰＳ細胞系「ＴｉＰＳ Ｌ−１」および「ＴｉＰＳ Ｌ−２」は、ＭＥＦで６回継代生育させ、系「ＴｉＰＳ Ｖ−１」および「ＴｉＰＳ Ｖ−２」はそれぞれ、合計１８回のうち８回および合計３４回のうち３０回マトリゲルで継代生育させた。細胞をＧバンド分析したが、クローン異常は検出されなかった。 図１０は、リプログラミング実験に使用されるＭＭＬＶレトロウイルス構築物のべクターマップを示す図である。「ＲＧ」は、リプログラミング遺伝子を指している。 図１１Ａ〜図１１Ｃは、リプログラミングが改善されたリプログラミング実験に使用されるバイシストロニックＭＭＬＶレトロウイルス構築物のベクターマップを示す図である。図１１Ａは、ＭＭＬＶ−Ｏｃｔ４−ＩＲＥＳ−Ｓｏｘ２（「Ｏｃｔ４−Ｓｏｘ２」と短縮される）のベクターマップである。図１１Ｂは、ＭＭＬＶ−ｃＭｙｃ−ＩＲＥＳ−Ｋｌｆ４（「ｃＭｙｃ−Ｋｌｆ４」と短縮される）のベクターマップである。図１１Ｃは、ＭＭＬＶ−Ｎａｎｏｇ−ＩＲＥＳ−Ｌｉｎ２８（「Ｎａｎｏｇ−Ｌｉｎ２８」と短縮される）のベクターマップである。 図１１Ａ〜図１１Ｃは、リプログラミングが改善されたリプログラミング実験に使用されるバイシストロニックＭＭＬＶレトロウイルス構築物のベクターマップを示す図である。図１１Ａは、ＭＭＬＶ−Ｏｃｔ４−ＩＲＥＳ−Ｓｏｘ２（「Ｏｃｔ４−Ｓｏｘ２」と短縮される）のベクターマップである。図１１Ｂは、ＭＭＬＶ−ｃＭｙｃ−ＩＲＥＳ−Ｋｌｆ４（「ｃＭｙｃ−Ｋｌｆ４」と短縮される）のベクターマップである。図１１Ｃは、ＭＭＬＶ−Ｎａｎｏｇ−ＩＲＥＳ−Ｌｉｎ２８（「Ｎａｎｏｇ−Ｌｉｎ２８」と短縮される）のベクターマップである。 図１１Ａ〜図１１Ｃは、リプログラミングが改善されたリプログラミング実験に使用されるバイシストロニックＭＭＬＶレトロウイルス構築物のベクターマップを示す図である。図１１Ａは、ＭＭＬＶ−Ｏｃｔ４−ＩＲＥＳ−Ｓｏｘ２（「Ｏｃｔ４−Ｓｏｘ２」と短縮される）のベクターマップである。図１１Ｂは、ＭＭＬＶ−ｃＭｙｃ−ＩＲＥＳ−Ｋｌｆ４（「ｃＭｙｃ−Ｋｌｆ４」と短縮される）のベクターマップである。図１１Ｃは、ＭＭＬＶ−Ｎａｎｏｇ−ＩＲＥＳ−Ｌｉｎ２８（「Ｎａｎｏｇ−Ｌｉｎ２８」と短縮される）のベクターマップである。
Ｉ．はじめに
規定の因子、例えば、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、およびＬＩＮ２８、またはＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫＬＦ４（Ｙｕら、２００７；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７ｂ）などのウイルスによる輸送によるｉｎ ｖｉｔｒｏでの体細胞の未分化多能性状態へのリプログラミングは、複数の細胞型を用いた患者固有のヒトｉＰＳＣ細
胞の作製の道を開いた（Ｌｏｈら、２００９；Ａａｓｅｎら、２００８）。この前提は、遺伝子の一過性の発現によるｉＰＳＣの誘導によって、または適切な転写因子のタンパク質による形質導入によってさらに前進した（Ｙｕら、２００９；Ｚｈｏｕら、２００９）。今日まで、ヒトにおけるｉＰＳＣ研究の大部分は、細胞供給源として線維芽細胞に焦点を当ててきた。線維芽細胞は、市販されていることと遺伝子送達の容易さから出発材料として特定の利点を提供するが、侵襲性の皮膚生検が必要であり、かつ一次組織から安定した系を樹立するのが困難であるため、ｉＰＳＣ系の大量の臨床での誘導には最適以下である。非動員末梢血は、患者サンプルを入手しやすいため恐らくリプログラミングのための理想的な細胞供給源である（ＭａｈｅｒａｌｉおよびＨｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ、２００８）。加えて、生体ドナーおよび死亡したドナーからの多数の凍結血液サンプルが、世界中の生物保管施設（ｂｉｏｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）に保存されている（Ｋｌｅｅｂｅｒｇｅｒら、１９９９）。
本発明は、現在のリプログラミング技術のいくつかの大きな問題を、Ｔ細胞および／または造血前駆細胞から人工多能性幹細胞を作製することによって解消する。本発明によって見出されたように、より豊富で扱いやすい血液細胞供給源、Ｔリンパ球からのｉＰＳＣの誘導は、１ｍｌの全血に等しい量から得ることができる。これらのＴ細胞由来ｉＰＳＣ（「ＴｉＰＳ」）は、ｈＥＳＣおよび線維芽細胞由来ｉＰＳＣ系と必須の特性を共有している。加えて、Ｔ細胞由来ｉＰＳＣは、その特性であるＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）遺伝子再構成、すなわち、例えば、遺伝子トラッキングマーカーとして、またはヒトＴ細胞の発達を研究する再分化実験で利用できる特性を維持している。
本発明の前に、本発明者らは、Ｔ細胞または造血始原細胞のリプログラミングが成功する可能性について、いくつかの理由から半信半疑であった。第１に、血液サンプル中のＴ細胞および／または造血前駆細胞が、リプログラミングにとって十分な量で存在するか否かが不確かであった。第２に、リプログラミングにおけるＴ細胞受容体遺伝子のＶ（Ｄ）Ｊの組換えによる起こり得る遺伝子消失の効果が研究されていなかった。第３に、これまでリプログラミングされた細胞型の殆どが接着細胞型である。Ｔ細胞は、非接着性であり、懸濁液で培養される。リプログラミングされるＴ細胞が、接着ｉＰＳ細胞に適した接着培養条件へ移行できるかが本発明まで明らかでなかった。したがって、本発明の方法は、Ｔ細胞または造血前駆細胞からのｉＰＳ細胞の作製を初めて可能にするものである。Ｔ細胞は、様々な供給源、例えば、少量の血液サンプルから容易に得ることができる。同様に、造血前駆細胞、例えば、（ＣＤ３４＋／ＣＤ４３＋／ＣＤ４５＋／ＣＤ３８−）または（ＣＤ３４−、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３８−）造血前駆細胞などは、末梢血液サンプルから富化することができる。
本発明の特定の利点は、リプログラミングされた子孫細胞に維持され得るＴ細胞受容体の再構成され減少したＶ、Ｄ、Ｊ遺伝子セグメントにある。これは、Ｔ細胞由来ｉＰＳ細胞の様々なクローン集団の固有の特性または「バーコード」としての役割を果たし、また、それらのｉＰＳ細胞をＶ（Ｄ）Ｊ組換えを受けていない多能性幹細胞と区別するのに役立つ。加えて、Ｔ細胞とｉＰＳ細胞との間の接着性の差異は、自動分別を有利にする。同様に、造血前駆細胞とｉＰＳ細胞との間の接着性の差異は、分別に利用することができる。リプログラミングされたＴ細胞または造血始原細胞を接着に適した培養条件に移す、例えば、照射（ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ）マウス胎仔性線維芽細胞（ＭＥＦ）をＴ細胞用の培養容器の底部に配置すると、Ｔ細胞または造血始原細胞に由来するｉＰＳ細胞は、底部に付着するが、Ｔ細胞および／または造血前駆細胞は、浮遊したままである。本発明のさらなる実施形態および利点を以下に記載する。
ＩＩ．定義
「リプログラミング」は、リプログラミングを行わない同じ条件下よりも、培養下また
はｉｎ ｖｉｖｏで少なくとも１つの新たな細胞型の子孫を形成する、測定可能に増大した能力を細胞に付与するプロセスである。より具体的には、リプログラミングは、体細胞に多能性潜在能力を付与するプロセスである。これは、リプログラミングの前には新たな細胞型の表現型特性を有する子孫が本質的に形成できなくても、十分な増殖後に、測定可能な割合の子孫が新たな細胞型の表現型特性を有すること、別な方法では、新たな細胞型の特性を有する子孫の割合が、リプログラミングの前よりも測定可能な程度に多いことを意味する。特定の条件下で、新たな細胞型の特性をもつ子孫の割合は、少なくとも約１％、５％、２５％、またはそれより多くであり得、この順序で優先度が増している。
Ｔ細胞の「活性化因子」またはＴ細胞を活性化する条件は、Ｔ細胞を活性化する刺激物を指し、かつ抗原提示細胞または他の表面に提示され得る抗原と；特異性にかかわらず多くのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に結合し、かつレクチン、例えば、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ−Ａ）およびフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、ならびにＴＣＲまたはＣＤ３タンパク質上の不変のフレームワークエピトープに特異的に結合する抗体などの作用物質を含む多クローン性活性化因子と；かなりの数のＴ細胞を刺激し、かつ、例えば、ブドウ球菌エンテロトキシンなどのエンテロトキシンを含む超抗原と、を含む。
用語「Ｔリンパ球」および「Ｔ細胞」は、同義的に使用され、１つ以上のＭＨＣ分子または１つ以上の非古典的ＭＨＣ分子と共に抗原提示細胞またはマトリックスの表面に提示されたときに抗原を認識できるＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）を発現する細胞を指す。
「ＣＤ４＋Ｔ細胞」は、表面にＣＤ４を発現するＴ細胞のサブセットを指し、細胞媒介免疫応答に関連している。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、刺激を受けた後の分泌プロフィールによって特徴付けられ、このような分泌プロフィールは、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＬ−１０などのサイトカインの分泌を含み得る。「ＣＤ４」は、当初はＴリンパ球における分化抗原として定義された５５−ｋＤの糖タンパク質であるが、単球／マクロファージを含む他の細胞にも見られる。ＣＤ４抗原は、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）クラスＩＩ拘束免疫応答における結合認識要素に関係している。Ｔリンパ球において、ＣＤ４抗原は、ヘルパー／インデューサーのサブセットを規定する。
「ＣＤ８＋Ｔ細胞」は、その表面にＣＤ８を発現するＴ細胞のサブセットを指し、ＭＨＣクラスＩ拘束であり、細胞傷害性Ｔ細胞として機能する。「ＣＤ８」分子は、胸腺細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球およびサプレッサーＴリンパ球に見られる分化抗原である。ＣＤ８抗原は、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、主要組織適合複合体クラスＩ拘束相互作用における結合認識要素である。
「造血始原細胞」または「造血前駆細胞」は、造血系統に関係付けられるが、さらに造血分化できる細胞を指し、造血幹細胞、多能性造血幹細胞（血球芽細胞）、骨髄性始原細胞、巨核球始原細胞、赤血球始原細胞、およびリンパ系始原細胞を含む。造血幹細胞（ＨＳＣ）は、骨髄性（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）およびリンパ系の系統（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含むすべての血液細胞型を生じさせる多能性幹細胞である。造血始原細胞は、ＣＤ３４を発現し得る。造血始原細胞は、ＣＤ１３３を共発現し得、ＣＤ３８発現に対して陰性であり得る。特定の実施形態では、特定のヒト造血細胞は、ＣＤ３４を発現できないが、これらの細胞は、本明細書に開示される方法によってｉＰＳ細胞に変換することができる。造血前駆細胞には、ＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋造血前駆細胞およびＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋／ＣＤ４３＋造血前駆細胞が含まれる。ＣＤ３４＋／ＣＤ４３＋／ＣＤ４５＋造血前駆細胞は、骨髄性始原細胞のために高度に富化することができる。造血細胞の様々な系統、例えば、ＣＤ３４＋／ＣＤ４３＋／ＣＤ４５＋造血前駆細胞などは、本明細書に開示される方法によってｉＰＳ細胞に変換することができる。造血細胞はまた、ＣＤ３４−／ＣＤ１３３＋／ＣＤ３８−（始原造血前駆細胞）、ＣＤ４３（＋）ＣＤ２３５ａ（＋）ＣＤ４１ａ（＋／−）（赤血球−巨核球形成（ｅｒｙｔｈｒｏ−ｍｅｇａｋａｒｙｏｐｏｉｅｔｉｃ））、ｌｉｎ（−）ＣＤ３４（＋）ＣＤ４３（＋）ＣＤ４５（−）（多能性）、およびｌｉｎ（−）ＣＤ３４（＋）ＣＤ４３（＋）ＣＤ４５（＋）（骨髄性スキュー（ｍｙｅｌｏｉｄ−ｓｋｅｗｅｄ））細胞、ＣＤ１３３＋／ＡＬＤＨ＋（アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄｅｈｙｄｅｈｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ））を含む始原造血細胞の様々なサブセットも含む（例えば、Ｈｅｓｓら、２００４；Ｃｈｒｉｓｔら、２００７）。これらの始原造血細胞型または造血前駆細胞はいずれも、本明細書に記載されるようにｉＰＳ細胞に変換できると推測されている。
「ベクター」または「構築物」（時には、遺伝子送達または遺伝子輸送「ビヒクル」と呼ばれる）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む高分子または分子の複合体を指す。ベクターは、直鎖状分子であってもよく、または環状分子であってもよい。
「プラスミド」、ベクターの一般型は、染色体ＤＮＡとは別個に複製可能な、染色体ＤＮＡとは別個の染色体外ＤＮＡ分子である。特定の場合には、プラスミドは、環状および二本鎖である。
「発現構築物」または「発現カセット」は、転写を誘導することができる核酸分子を意味する。発現構築物には、少なくとも、プロモーター、またはプロモーターに機能的に等価な構造物が含まれる。追加の要素、例えば、エンハンサーおよび／または転写終結シグナルなども含まれ得る。
用語「外来性」は、細胞または生物におけるタンパク質、遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチドに関連して使用される場合は、人工または天然の手段によって細胞または生物内に導入されたタンパク質、遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチドを指し、または細胞に関しては、人工または天然の手段によって、単離されてから他の細胞または生物に導入された細胞を指す。外来性核酸は、異なる生物または細胞に由来し得、または生物もしくは細胞内で自然に発生する核酸の１つ以上の追加のコピーであり得る。外来性細胞は、異なる生物から得ても良いし、または同じ生物から得ても良い。限定されない例として、外来性核酸は、天然の細胞の染色体位置とは異なる染色体位置にある、または天然で見られる核酸配列とは異なる核酸配列によって他の方法で配置されている。
本明細書で使用される用語「〜に対応する」は、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部と相同（すなわち、厳密に進化的に関連していないが、同一である）であること、またはポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と同一であることを意味する。反対に、本明細書で使用される用語「相補的」は、相補的な配列が、参照ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部と相同であることを意味する。例示として、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。
特定のタンパク質を「コード」する「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「コード領域」、「配列」、「セグメント」、「断片」、または「導入遺伝子」は、適切な調節配列の制御下に置かれると、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで転写され、必要に応じて、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドに翻訳もされる核酸分子である。コード領域は、ｃＤＮＡ型、ゲノムＤＮＡ型、またはＲＮＡ型のいずれかで存在することができる。ＤＮＡ型で存在する場合は、核酸分子は、一本鎖（すなわち、センス鎖）または二本鎖であり得る。コード領域の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって決定されている。遺伝子には、限定されるものではないが、原核または真核ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核または真核ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を含み得る。転写停止配列は、通常は、遺伝子配列の３’に位置する。
用語「細胞」は、当技術分野におけるその最も広い意味で本明細書で使用され、多細胞生物の組織の構造単位であり、外部から細胞を隔離する膜構造物によって取り囲まれ、自己複製する能力を有し、かつ遺伝情報およびこれを発現させるための機構を有する生体を指す。本明細書で使用される細胞は、天然に存在する細胞または人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞など）とすることができる。
本明細書で使用される用語「幹細胞」は、自己複製能力および多能性を有する細胞を指す。典型的には、幹細胞は、傷害を受けた組織を再生することができる。本明細書の幹細胞は、限定されるものではないが、胚性幹（ＥＳ）細胞または組織幹細胞（組織特異的幹細胞または体性幹細胞とも呼ばれる）とすることができる。上記の能力を有し得る人工的に作製された細胞（例えば、本明細書で使用される融合細胞、またはリプログラミングされた細胞など）は、幹細胞とすることができる。
「胚性幹（ＥＳ）細胞」は、初期胚に由来する多能性幹細胞である。ＥＳ細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年からノックアウトマウスの作製にも利用されている。１９９８年に、ヒトＥＳ細胞が樹立され、現在は、再生医療に利用可能になっている。
組織幹細胞は、ＥＳ細胞とは異なり、分化能が制限されている。組織幹細胞は、組織の特定の位置に存在し、未分化細胞内構造物を有する。したがって、組織幹細胞の多能性は、典型的には低い。組織幹細胞は、高めの核／細胞質比を有し、細胞内小器官を殆ど有していない。大抵の組織幹細胞は、低い多能性、長い細胞周期、および個体の寿命を超えた増殖能を有する。組織幹細胞は、細胞が由来する部位、例えば、皮膚系、消化系、骨髄系、および神経系などに基づいて分類される。皮膚系の組織幹細胞には、表皮幹細胞および毛包幹細胞などが含まれる。消化系の組織幹細胞には、膵（共通）幹細胞および肝幹細胞などが含まれる。骨髄系の組織幹細胞には、造血幹細胞および間葉幹細胞などが含まれる。神経系の組織幹細胞には、神経幹細胞および網膜幹細胞などが含まれる。
一般にｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略される「人工多能性幹細胞」は、非多能性細胞、典型的には成体の体細胞または最終分化した細胞、例えば、線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、ニューロン、または表皮細胞などから、リプログラミング因子と呼ばれる特定の因子の導入によって人工的に作製されるある種の多能性幹細胞を指す。
「多能性」は、１つ以上の組織または器官、または特に３つの胚葉：内胚葉（内側胃内壁、胃腸管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿器）、または外胚葉（表皮組織および神経系）のいずれかを構成するすべての細胞に分化する潜在能力を有する幹細胞を指す。本明細書で使用される「多能性幹細胞」は、３つの胚葉のいずれかに由来する細胞、例えば、全能性細胞または人工多能性細胞の直系の子孫に分化できる細胞を指す。
核酸分子に関して「作動可能に連結された」は、２つ以上の核酸分子（例えば、転写される核酸分子、プロモーター、およびエンハンサー要素）が、核酸分子の転写が可能となるように連結されていることを意味する。ペプチドおよび／またはポリペプチド分子に関して「作動可能に連結された」は、２つ以上のペプチドおよび／またはポリペプチド分子が、融合ポリペプチドの各ペプチドおよび／またはポリペプチド成分の少なくとも１つの特性を有する１本のポリペプチド鎖、すなわち融合ポリペプチドが得られるように連結されていることを意味する。融合ポリペプチドは特にキメラ、すなわち異種分子からなるキ
メラポリペプチドである。
「相同性」は、２つのポリヌクレオチド間または２つのポリペプチド間の同一性のパーセントを指す。ある配列と別の配列との間の対応は、当技術分野で公知の技術によって決定することができる。例えば、相同性は、配列情報を整列させて入手が容易なコンピュータプログラムを用いて２つのポリペプチド分子間の配列情報の直接的な比較によって決定することができる。別法では、相同性は、相同領域間で安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続く一本鎖特異的ヌクレアーゼ（複数可）を用いた消化、および消化された断片のサイズの決定によって決定することができる。２つのＤＮＡ配列または２つのポリペプチド配列が互いに「実質的に相同」とは、ヌクレオチドまたはアミノ酸それぞれの少なくとも約８０％、詳細には少なくとも約９０％、最も詳細には少なくとも約９５％が、上記の方法を用いて決定されるように、所定長の分子に亘ってマッチする場合である。
ＩＩＩ．幹細胞の一般的な背景
本発明の特定の実施形態では、リプログラミング因子を体細胞に導入することによって体細胞、特にＴ細胞をリプログラミングする方法が開示される。これらの細胞の子孫は、以下に記載する様々な態様で胚性幹細胞と同一であり得るが、外来性遺伝要素を本質的に含まない。胚性幹細胞の特性を理解することが、人工多能性幹細胞の選択に役立ち得る。幹細胞のリプログラミングの研究から公知のリプログラミング因子を、これらの新規な方法に使用することができる。胚性幹細胞の使用に対する倫理的ハードルのために、これらの人工多能性幹細胞を、治療および研究用途として胚性幹細胞の代わりに潜在的に使用できることをさらに意図する。
Ａ．幹細胞
幹細胞は、すべてではないにしても殆どの多細胞生物で見られる細胞である。幹細胞は、有糸細胞分裂によって自身を再生する能力、および様々な特殊化した細胞型への分化によって特徴付けられる。広義の２種類の哺乳動物幹細胞は、胚盤胞で見られる胚性幹細胞および成体の組織で見られる成体幹細胞である。発達中の胚では、幹細胞は、特殊化した胚組織のすべてに分化することができる。成体生物では、幹細胞および始原細胞は、体の修復系として機能して、特殊化した細胞を補充するだけではなく、血液、皮膚、または腸組織などの再生器官の正常な代謝回転を維持する。
幹細胞は、細胞培養によって増殖させて、筋肉または神経などの様々な組織の細胞に一致した特性を持つ特殊化した細胞に変換することができるため、幹細胞の医療への使用が提案されている。特に、胚性細胞系、治療用クローニングによって作製された自己胚性幹細胞、および臍帯血または骨髄由来の高度に柔軟な成体幹細胞が、有望な候補としてもてはやされている。最近になって、成体細胞の人工多能性幹細胞へのリプログラミングは、胚性幹細胞に取って代わる大きな潜在力を有する。
Ｂ．胚性幹細胞
胚性幹細胞系（ＥＳ細胞系）は、胚盤胞または初期桑実期胚の内細胞塊（ＩＣＭ）の胚盤葉上層組織由来の細胞の培養物である。胚盤胞は、ヒトでは約４〜５日齢の初期胚であり、５０〜１５０の細胞からなっている。ＥＳ細胞は、多能性であり、発達中に３つの主要な胚葉：外胚葉、内胚葉、および中胚葉のすべての誘導体を発生させる。言い換えれば、ＥＳ細胞は、特定の細胞型にとって十分かつ必要な刺激が与えられると、成体の体の２００を超える細胞型のそれぞれに発達することができる。ＥＳ細胞は、胚外膜または胎盤に寄与しない。
これまでの研究の殆どすべては、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳ）またはヒト胚性幹細胞（
ｈＥＳ）を用いて行われてきた。両方の幹細胞は、必須の幹細胞の特性を有するが、これらは、未分化状態を維持するためには全く異なる環境を必要とする。マウスＥＳ細胞は、ゼラチン層の上で成長することができ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）の存在を必要とする。ヒトＥＳ細胞は、マウス胎仔性線維芽細胞（ＭＥＦ）のフィーダー層の上で成長することができ、しばしば、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２）の存在を必要とする。最適な培養条件または遺伝子操作（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、２００３）を用いなくても、胚性幹細胞は、急速に分化する。
ヒト胚性幹細胞はまた、いくつかの転写因子および細胞表面タンパク質の存在によっても定義することができる。転写因子Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ２は、分化および多能性の維持をもたらす遺伝子の抑制を保証するコア調節ネットワークを形成する（Ｂｏｙｅｒら、２００５）。ｈＥＳ細胞を同定するために最も一般的に使用されている細胞表面抗原には、糖脂質ＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４ならびにケラタン硫酸抗原Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１が含まれる。
２０年にも及ぶ研究がなされても、胚性幹細胞を用いる認可された処置またはヒト治験は存在しない。多能性細胞であるＥＳ細胞は、正しい分化に特定のシグナルを必要とし、体内に直接注入されると、ＥＳ細胞は、様々な種類の細胞に分化して奇形腫を引き起こす。移植片拒絶を回避しつつＥＳ細胞を使用可能な細胞に分化させることは、胚性幹細胞の研究者がなお直面するほんの僅かなハードルに過ぎない。多くの国々は、現在、ＥＳ細胞の研究または新規なＥＳ細胞系の作製を一時的に禁止している。胚性幹細胞は、その無制限の増殖と多能性を併せ持つ能力のため、傷害または疾患後の再生医療または組織置換のための理論的に可能な供給源のままである。しかし、これらの問題を回避する１つの方法は、直接的なリプログラミングによって体細胞に多能性の状態を誘導することである。
ＩＶ．リプログラミング因子
ｉＰＳ細胞の作製には、誘導のために使用されるリプログラミング因子が極めて重要である。以下の因子またはそれらの組合せは、本発明に開示される方法に使用することができる。特定の態様では、ＳｏｘおよびＯｃｔ（特にＯｃｔ３／４）をコードする核酸が、リプログラミングベクターに導入される。例えば、１つ以上のリプログラミングベクターは、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、および必要に応じてＬｉｎ２８をコードする発現カセット、またはＳｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、および必要に応じてｃ−Ｍｙｃをコードする発現カセット、またはＳｏｘ２、Ｏｃｔ４、および必要に応じてＥｓｒｒｂをコードする発現カセット、またはＳｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、および必要に応じてＳＶ４０ラージＴ抗原をコードする発現カセットを含み得る。これらのリプログラミング因子をコードする核酸は、同じ発現カセット、異なる発現カセット、同じリプログラミングベクター、または異なるリプログラミングベクターの中に含められ得る。
Ｏｃｔ４およびＳｏｘ遺伝子ファミリーの特定のメンバー（Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、およびＳｏｘ１５）は、存在しないと誘導を不可能にする誘導プロセスに関与する極めて重要な転写調節因子として同定された。しかし、Ｋｌｆファミリーの特定のメンバー（Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、およびＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリー（ｃ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、およびＮ−Ｍｙｃ）、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８を含むさらなる遺伝子が、誘導効率を上げることが確認された。
Ｏｃｔ４（Ｐｏｕ５ｆ１）は、八量体（「Ｏｃｔ」）転写因子のファミリーの１つであり、多能性の維持において極めて重要な役割を果たす。割球および胚性幹細胞などのＯｃｔ４＋細胞におけるＯｃｔ４の非存在は、自発的な栄養膜細胞分化をもたらし、したがって、Ｏｃｔ４の存在は、胚性幹細胞の多能性および分化能を生じさせる。Ｏｃｔ４の類縁体、Ｏｃｔ１、およびＯｃｔ６を含む「Ｏｃｔ」ファミリーの様々な他の遺伝子は、誘導を引き起こすことができないため、誘導プロセスに対するＯｃｔ−４の排他性を実証している。
Ｓｏｘファミリーの遺伝子は、多能性幹細胞だけで発現されるＯｃｔ４とは対照的に複能性幹細胞および単能性幹細胞に関連しているが、Ｏｃｔ４と同様に多能性の維持に関連している。Ｓｏｘ２は、リプログラミングの誘導のために使用された初めの遺伝子であり、Ｓｏｘファミリーの他の遺伝子は、誘導プロセスでも働くことが見出された。Ｓｏｘ１は、Ｓｏｘ２と同様の効率でｉＰＳ細胞を産生し、遺伝子Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、およびＳｏｘ１８も、低い効率であるがｉＰＳ細胞を産生する。
胚性幹細胞では、Ｎａｎｏｇは、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２と共に、多能性の促進に必要である。したがって、Ｔｈｏｍｓｏｎらが、因子の１つとしてＮａｎｏｇを用いてｉＰＳ細胞を作製することが可能であることを報告していたが、Ｙａｍａｎａｋａらが、Ｎａｎｏｇが誘導に必須ではないことを報告したときは驚きであった。
Ｌｉｎ２８は、分化および増殖に関連した胚性幹細胞および胚性癌細胞で発現されるｍＲＮＡ結合タンパク質である。Ｔｈｏｍｓｏｎらは、Ｌｉｎ２８は不要ではあるが、ｉＰＳ作製における因子であることを実証した。
Ｋｌｆファミリーの遺伝子のうちのＫｌｆ４は、Ｙａｍａｎａｋａらによって初めに同定され、ＪａｅｎｉｓｃｈらによってマウスｉＰＳ細胞の作製のための因子として確認され、ＹａｍａｎａｋａらによってヒトｉＰＳ細胞の作製のための因子であることが実証された。しかしながら、Ｔｈｏｍｐｓｏｎらは、Ｋｌｆ４は、ヒトｉＰＳ細胞の作製に不要であり、実際、ヒトｉＰＳ細胞を作製できなかったことを報告した。Ｋｌｆ２およびＫｌｆ４は、ｉＰＳ細胞を作製可能な因子であることが判明し、関連遺伝子Ｋｌｆ１およびＫｌｆ５も、低い効率であるが同様にｉＰＳ細胞を作製することが可能であった。
Ｍｙｃファミリーの遺伝子は、癌に関与するプロトオンコジーンである。ＹａｍａｎａｋａらおよびＪａｅｎｉｓｃｈらは、ｃ−ＭｙｃがマウスｉＰＳ細胞の作製に関与する因子であることを実証し、Ｙａｍａｎａｋａらは、ｃ−ＭｙｃがヒトｉＰＳ細胞の作製に関与する因子であることを実証した。しかしながら、ＴｈｏｍｓｏｎらおよびＹａｍａｎａｋａらは、ｃ−Ｍｙｃは、ヒトｉＰＳ細胞の作製に不要であることを報告した。ｉＰＳ細胞の誘導における「Ｍｙｃ」ファミリーの遺伝子の使用は、臨床治療ではｉＰＳ細胞の結末に問題があり、ｃ−Ｍｙｃ誘導ｉＰＳ細胞が移植されたマウスの２５％が致命的な奇形腫を発症した。Ｎ−ＭｙｃおよびＬ−Ｍｙｃは、同様の効率でｃ−ｍｙｃの代わりに誘導することが確認された。ＳＶ４０ラージ抗原を用いて、ｃ−Ｍｙｃが発現されたときに起こり得る細胞傷害性を軽減または防止することができる。
本発明に使用されるリプログラミングタンパク質は、ほぼ同じリプログラミング機能をもつタンパク質ホモログによって置換することができる。これらのホモログをコードする核酸も、リプログラミングに使用することができる。保存的アミノ酸置換、すなわち、例えば、極性酸性アミノ酸としてアスパラギン酸−グルタミン酸；極性塩基性アミノ酸としてリシン／アルギニン／ヒスチジン；非極性または疎水性アミノ酸としてロイシン／イソロイシン／メチオニン／バリン／アラニン／グリシン／プロリン；極性または非荷電親水性アミノ酸としてセリン／トレオニンが好ましい。保存的アミノ酸置換には、側鎖に基づいた群化も含まれる。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群は、セリンおよびトレオニンであり；アミドを含む側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニ
ン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リシン、アルギニン、およびヒスチジンであり；硫黄を含む側鎖を有するアミノ酸群は、システインおよびメチオニンである。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンでの置換、アスパルテートのグルタメートでの置換、トレオニンのセリンでの置換、またはアミノ酸の構造的に関連したアミノ酸での同様の置換が、得られるポリペプチドの特性に大きな影響を与えないと予想するのは合理的である。アミノ酸の変化が機能的なポリペプチドをもたらすか否かは、そのポリペプチドの特定の活性をアッセイすることによって容易に決定することができる。
Ｖ．Ｔ細胞および／または造血前駆細胞のリプログラミング
当技術分野で一般に使用される皮膚線維芽細胞に加えて、代替の供給源からｉＰＳ細胞を提供するために、Ｔ細胞を含む細胞集団をリプログラミングする方法を提供する。特定の実施形態では、リプログラミングのためにかなりの数のＴ細胞を提供するためにＴ細胞を活性化して増殖させる。
Ａ．Ｔ細胞
用語「Ｔ細胞」は、当技術分野で定義されるＴリンパ球を指し、胸腺細胞、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球を含むものとする。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはＣＤ４−ＣＤ８−細胞とすることができる。Ｔ細胞はまた、Ｔヘルパー細胞、例えば、Ｔヘルパー１（ＴＨ１）またはＴヘルパー２（ＴＨ２）細胞、またはＴＨ１７細胞、および細胞傷害性Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、記憶Ｔ細胞、またはγδＴ細胞とすることもできる（Ｗｉｌｓｏｎら、２００９；Ｗｙｎｎ、２００５；Ｌａｄｉら、２００６）。少なくとも１つのマーカー、例えば、ＣＤ４などによって互いに異なるＴ細胞を、本明細書ではＴ細胞の「サブセット」と呼ぶ。
ヘルパーＴ細胞（エフェクターＴ細胞またはＴｈ細胞）は、適応免疫系の「媒介者」である。活性化されると、ヘルパーＴ細胞は、急速に分裂して、免疫応答を調節または補助するサイトカインと呼ばれる低分子タンパク質を分泌する。サイズ、受け取られるサイトカインシグナルによって、これらの細胞は、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、ＴＨＦ、または異なるサイトカインを分泌する他のサブセットの１つに分化する。ＣＤ４＋細胞は、ＭＨＣクラスＩＩに関連する。
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶にも関係している。これらの細胞は、その表面にＣＤ８糖タンパク質を発現するため、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＭＨＣクラスＩに関連する）としても知られている。ＳＬＯＢのＴ調節性ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞との相互作用により、これらの細胞は、アネルギー状態に不活化され得、これにより実験的自己免疫性脳脊髄髄炎などの自己免疫疾患を防止する。
記憶Ｔ細胞は、感染から回復した後に長期間生存する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。記憶Ｔ細胞は、同種抗原に再び曝露されるとエフェクターＴ細胞をかなりの数まで迅速に増大させ、過去の感染に対する「記憶」を有する免疫系を提供する。記憶Ｔ細胞は、２つの亜型：中心記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ細胞）およびエフェクター記憶Ｔ細胞（ＴＥＭ細胞）を含む。記憶細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。
調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、以前はサプレッサーＴ細胞として知られており、免疫寛容の維持に極めて重要である。調節性Ｔ細胞は、従来のαβＴＣＲ発現ＣＤ４陽性細胞に類似している。調節性Ｔ細胞は、ＣＤ２５タンパク質とＦｏｘｐ３タンパク質の共発現によってさらに特徴付けることができる。調節性Ｔ細胞の主な役割は、免疫反応の終了
に向けてＴ細胞媒介性免疫を停止することと、胸腺における陰性選択のプロセスから免れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。自然発生のＴｒｅｇ細胞および適応Ｔｒｅｇ細胞を含む、ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞の２つの主なクラスが記載されている。自然発生のＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞としても知られる）は胸腺で発生するが、適応Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても知られる）は、通常の免疫応答中に生じ得る。自然発生のＴｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分子の存在によって他のＴ細胞と区別することができる。ＦＯＸＰ３遺伝子の変異が、調節性Ｔ細胞の発生を防止して、致命的な自己免疫疾患ＩＰＥＸを引き起こし得る。
ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫ Ｔ細胞）は、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ１６１、ＣＤ９４、ＣＤ１５８ａ、およびＣＤ１５８ｂを含む、αβまたはγδＴＣＲと様々なＮＫ受容体との共発現によって特徴付けられる不均一なＴ細胞集団である。ＮＫ Ｔ細胞は、活性化後にかなりの数のサイトカインを迅速に分泌する能力を有する。ＮＫ Ｔ細胞クローンは、１型、２型、または両方の型のサイトカインを分泌し、Ｔｈ０細胞のＴｈ１またはＴｈ２細胞への分化に影響を及ぼし得る。ＮＫ Ｔ細胞は、マウスでは不変ＴＣＲ Ｖａｌｐｈａ１４を発現し、ヒトでは不変ＴＣＲ Ｖａｌｐｈａ２４を発現する細胞として記載された。近年、多様なＴＣＲを発現するＮＫ Ｔ細胞が、ＮＫ Ｔ細胞集団の１つを表すＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞としても認識された。ＮＫ Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ８＋、ＣＤ４−ＣＤ８−、ＣＤ４−ＣＤ８＋、またはＣＤ４＋ＣＤ８−であり得る。
γδＴ細胞（ガンマ・デルタＴ細胞）は、表面に特有のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞の小さいサブセットを表す。Ｔ細胞の大部分は、αＴＣＲ鎖およびβＴＣＲ鎖と呼ばれる２つの糖タンパク質鎖からなるＴＣＲを有する。しかしながら、γδＴ細胞では、ＴＣＲは、１つのγ鎖と１つのδ鎖からなる。Ｔ細胞のこの群は、αβＴ細胞よりも一般的ではないが（Ｔ細胞全体の５％）、上皮内リンパ球（ＩＥＬ）として知られるリンパ球の集団の中で、腸粘膜で最も豊富に見られる。γδＴ細胞を活性化する抗原分子は、まだあまり知られていない。しかしながら、γδＴ細胞は、ＭＨＣ拘束されておらず、抗原提示細胞のＭＨＣ分子によって提示されるペプチドを必要とするのではなく、全タンパク質を認識できるようである。しかしながら、一部のγδＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩＢ分子を認識する。末梢血液中で主なγδＴ細胞集団を構成するヒトＶγ９／Ｖδ２Ｔ細胞は、低分子の非ペプチド微生物代謝産物、ＨＭＢ−ＰＰ、すなわちイソペンテニルピロリン酸前駆体に特異的かつ迅速に応答するという点で独特である。健常なドナー由来の末梢血中に見られ得るＴ細胞の推定パーセンテージは、次の通りである：ＣＤ３＋＝７０．７８％±４．７１；ＣＤ３＋ＣＤ４＝３８．９７％±５．６６；ＣＤ３＋ＣＤ８＝２８．９５５％±７．４３；ＣＤ３＋ＣＤ５６＋＝５．２２％±１．７４；ＣＤ３-ＣＤ５６＋＝１０．３０５％±４．７；ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＝４５．００％±７．１９；ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＯ＋＝２７．２１％±７．３４。
Ｔ細胞は、Ｔ細胞の精製された集団とすることができ、別法では、Ｔ細胞は、異なる型の細胞、例えば、Ｂ細胞および／または他の末梢血細胞などの細胞集団に入れることができる。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞などのＴ細胞のサブセットの精製された集団とすることができ、またはＴ細胞は、異なるＴ細胞のサブセットを含むＴ細胞の集団とすることができる。本発明の別の実施形態では、Ｔ細胞は、長期間に亘って培養物中に維持されたＴ細胞クローンである。Ｔ細胞クローンは、様々な程度に形質転換することができる。具体的な実施形態では、Ｔ細胞は、培養物中で無制限に増殖するＴ細胞クローンである。
本発明の好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、一次Ｔ細胞である。用語「一次Ｔ細胞」は、長期間に亘って培養物中に維持されたＴ細胞に対して、個体から得たＴ細胞を含むものとする。したがって、一次Ｔ細胞は、特に、被験体から得た末梢血Ｔ細胞である。一次Ｔ細胞の集団は、殆どをＴ細胞の１つのサブセットから構成することができる。別法では、
一次Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の異なるサブセットから構成することができる。
Ｔ細胞は、健常な個体からの予め保存された血液サンプルに由来しても良く、別法では、ある症状に陥っている個体に由来しても良い。この状態は、感染症、例えば、ウイルス感染、細菌感染、もしくは任意の他の微生物による感染から生じる状態、または過剰増殖性疾患、例えば、黒色腫のようながんであり得る。具体的な実施形態では、Ｔ細胞は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した個体に由来する。本発明のなお別の実施形態では、Ｔ細胞は、自己免疫疾患またはＴ細胞病態に罹患している被験体または罹患しやすい被験体に由来する。Ｔ細胞は、ヒト起源、ネズミ起源、または任意の他の哺乳動物種起源とすることができる。
Ｂ．造血始原細胞
造血幹細胞および造血始原細胞が医療用途においてかなりの将来性があるため、造血始原細胞の胚性幹細胞からの分化の改善された方法を試すために相当な研究が行われてきた。ヒト成人では、主に骨髄に存在する造血幹細胞が、血液系のあらゆる細胞に分化する、活発に分裂する造血（ＣＤ３４＋）始原細胞の不均一な集団を産生する。ＣＤ３４＋内皮細胞をｉＰＳ細胞に変換できると予測されるが、特定の実施形態では、内皮細胞ではない造血細胞を使用するのが望ましいことがある：例えば、場合によっては、ＣＤ３１やＶＥカドヘリンを発現しない造血始原細胞または造血前駆細胞を使用するのが望ましいことがある。他のマーカー、例えば、ＣＤ４３および／またはＣＤ４５マーカーも、造血始原細胞の同定を容易にするために使用することができる（例えば、Ｋａｄａｊａ−Ｓａａｒｅｐｕｕら、２００８；Ｖｏｄｙａｎｉｋら、２００６）。造血細胞は、ＣＤ４３（＋）ＣＤ２３５ａ（＋）ＣＤ４１ａ（＋／−）（赤血球−巨核球形成）細胞、ｌｉｎ（−）ＣＤ３４（＋）ＣＤ４３（＋）ＣＤ４５（−）（多能性）細胞、およびｌｉｎ（−）ＣＤ３４（＋）ＣＤ４３（＋）ＣＤ４５（＋）（骨髄性スキュー）細胞を含む始原造血細胞の様々なサブセットを含む。ヒト成人では、造血始原細胞は、増殖して分化し、数千億の成熟血液細胞を毎日産生する。造血始原細胞は、臍帯血にも存在する。ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ヒト胚性幹細胞は、造血始原細胞に分化し得る。造血始原細胞はまた、末梢血のサンプルから増大または富化することができる。造血細胞は、ヒト起源、ネズミ起源、または任意の他の哺乳動物種起源であり得る。
Ｃ．細胞集団の供給源
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、通常は骨髄に存在するが、末梢血でかなりの数のＨＳＣを採取するために臨床的に使用される動員と呼ばれるプロセスで血液中に強制的に移動させることができる。１つの動員剤の選択は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。
末梢血液中を循環するＣＤ３４＋造血幹細胞または造血始原細胞は、非混乱状態（ｕｎｐｅｒｔｕｒｂｅｄ ｓｔａｔｅ）で、または造血成長因子様Ｇ−ＣＳＦの外部投与後の動員後に、アフェレーシス技術によって収集することができる。動員後に収集される造血幹細胞または造血始原細胞の数は、非混乱状態でのアフェレーシス後に得られる数よりも多い。本発明の具体的な態様では、細胞集団の供給源は、造血幹細胞または造血始原細胞を富化する必要がないため、外的に加えられた因子によって細胞が動員されていない被験体である。
本明細書に記載される方法に使用される細胞集団は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、げっ歯類細胞（例えば、マウスまたはラット）、ウシ細胞、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）細胞、イヌ細胞、およびネコ細胞、またはこれらの混合物であり得る。非ヒト霊長類細胞には、アカゲザル細胞が含まれる。細胞は、動物、例えば、ヒト患者から得ることができ、または細胞は、細胞系から得ることができる。細胞を動物から得る場合は、細胞は、例えば、分離されていない細胞（すなわち、混合集団）などとして使用することができる；細胞は、例えば、形質転換によって初めに培養物中で樹立することができる；または細胞に、予備的な精製法を行っても良い。例えば、細胞集団は、細胞表面マーカーの発現に基づいて陽性選択または陰性選択によって処理しても良いし；ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで１つ以上の抗原で刺激しても良いし；ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで１つ以上の生物学的修飾物質で処理しても良いし；またはこれらの任意の組み合わせまたはこれらの全ての組み合わせで処理しても良い。例示的な実施形態では、細胞集団に、非Ｔ細胞および／または特定のＴ細胞サブセットの枯渇のために陰性選択を行う。陰性選択は、Ｂ細胞マーカー、例えば、ＣＤ１９およびＣＤ２０；単球マーカーＣＤ１４；ＮＫ細胞マーカーＣＤ５６を含む、様々な分子の細胞表面の発現に基づいて行うことができる。別法では、細胞集団に、非ＣＤ３４＋造血細胞および／または特定の造血細胞のサブセットの枯渇のために陰性選択を行っても良い。陰性選択は、様々な分子、例えば、ＭＡＣＳまたはカラム分離によって他の細胞型の分離に使用することができる抗体（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、およびＣＤ２３５ａ）のカクテルなどの細胞表面の発現に基づいて行うことができる。
細胞集団は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、全血または混合集団を含有するその画分、脾臓細胞、骨髄性細胞、腫瘍浸潤リンパ球、白血球アフェレーシスによって得られる細胞、生検組織、リンパ節、例えば、腫瘍からの流入リンパ節（ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ ｄｒａｉｎｉｎｇ ｆｒｏｍ ａ ｔｕｍｏｒ）を含む。適切なドナーは、免疫ドナー、非免疫（ナイーブ）ドナー、処置または未処置ドナーを含む。「処置」ドナーは、１つ以上の生物学的修飾物質に曝露されたドナーである。「未処置」ドナーは、１つ以上の生物学的修飾物質に曝露されていないドナーである。
Ｔ細胞を含む細胞集団を得る方法は、当技術分野で周知である。例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、当技術分野で公知の方法に従って、記載されているように得ることができる。このような方法の例は、実施例に記載されており、Ｋｉｍら（１９９２）；Ｂｉｓｗａｓら（１９９０）；Ｂｉｓｗａｓら（１９９１）によって説明されている。
造血前駆細胞を細胞集団から得る方法も、当技術分野で周知である。造血前駆細胞は、様々なサイトカイン、例えば、ｈＳＣＦ、ｈＦＬＴ３、および／またはＩＬ−３（Ａｋｋｉｎａら、１９９６）を用いて増大させても良いし、またはＭＡＣＳまたはＦＡＣＳを用いてＣＤ３４＋細胞を富化しても良い。上記のように、陰性選択技術を用いて、ＣＤ３４＋細胞を富化しても良い。
また、被験体から細胞サンプルを得てから、望ましい細胞型を得るために細胞サンプルを富化することも可能である。例えば、ＰＢＭＣおよび／またはＣＤ３４＋造血細胞を、本明細書に記載されているように血液から単離することができる。向流遠心分離（エラトリエーション）を用いて、Ｔ細胞をＰＢＭＣから富化することができる。細胞は、様々な技術、例えば、望ましい細胞型の細胞表面のエピトープに結合する抗体を用いた単離および／または活性化を用いて他の細胞から単離することもでき、例えば、ある種のＴ細胞単離キットは、抗体結合ビーズを用いて細胞を活性化させ、次いで同じビーズでカラム分離を行うことができる。使用できる別の方法には、受容体の結合によって細胞を活性化させずに、細胞表面マーカーに対する抗体を用いて特定の細胞型を選択的に富化する陰性選択が含まれる。
骨髄細胞は、腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊柱、肋骨、または他の髄腔から得ることができる。骨髄は、患者から採取し、様々な分離および洗浄手順によって単離することができる。骨髄細胞を単離するための公知の手順は、（ａ）骨髄懸濁液を３つの画分に遠心分離して中間画分またはバフィーコートを収集する工程と、（ｂ）工程（ａ）のバフィーコート
画分を分離用流体、通常はＦｉｃｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＡＢの商標）でもう１回遠心分離し、骨髄細胞を含む中間画分を収集する工程と、（ｃ）再輸血可能な骨髄細胞の回収のために工程（ｂ）で収集した画分を洗浄する工程と、を含む。
Ｔ細胞が富化された細胞集団を使用したい場合は、このような細胞集団を、連続流細胞分離装置（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｌｏｗ ｃｅｌｌ ｓｅｐａｒａｔｏｒ）を用いた機械式アフェレーシスおよび白血球アフェレーシスによって混合細胞集団から得ることができる。例えば、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（商標）勾配を用いた分離、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配を用いた分離、またはエラトリエーションを含む、任意の公知の方法によってバフィーコートから単離することができる。
Ｄ．Ｔ細胞活性化
特定の態様では、Ｔ細胞を、Ｔ細胞受容体に結合してＴ細胞活性化のシグナル伝達カスケードを作動させる作用物質によって活性化する。例えば、ＣＤ３抗体を使用することができる。Ｔ細胞をかなりの数に増大させてリプログラミングのための増殖状態にするために、ＩＬ−２などのサイトカインを用いることもできる。
ナイーブＴ細胞は、分裂しないで何年も生存することができる。これらの休止小細胞は、クロマチンを凝縮させ、少量の細胞質であり、ＲＮＡまたはタンパク質を殆ど合成しない。活性化されると、これらの細胞は、細胞周期に再び入り、急速に分裂して、武装化エフェクターＴ細胞に分化する多数の子孫を産生するはずである。これらの細胞の増殖および分化は、活性化Ｔ細胞自体によって産生されるインターロイキン−２（ＩＬ−２）と呼ばれるサイトカインによって駆動される。
必要な共刺激シグナルの存在下での特定の抗原との初めの遭遇により、Ｔ細胞が細胞周期のＧ１期に入り；同時に、Ｔ細胞は、ＩＬ−２受容体のα鎖と共にＩＬ−２の合成も誘導する。ＩＬ−２受容体は、α、β、およびγの３つの鎖を有する。休止Ｔ細胞は、適度な親和性でＩＬ−２に結合するβ鎖およびα鎖からなるこの受容体の形態を発現し、休止Ｔ細胞が、非常に濃度の高いＩＬ−２に応答できるようになる。α鎖のβ鎖およびγ鎖との結合により、ＩＬ−２に対する非常に高い親和性をもつ受容体が産生され、休止Ｔ細胞が、非常に濃度の低いＩＬ−２に応答できるようになる。次いで、ＩＬ−２の高親和性受容体への結合により、残りの細胞周期の進行が始まる。このように活性化されたＴ細胞は、数日間に亘って１日に２〜３回分裂することができ、１つの細胞が、すべてが同じ抗原受容体を有する数千の子孫からなるクローンを産生する。ＩＬ−２は、これらの細胞の武装化エフェクターＴ細胞への分化も促進する。
活性化の特定の機序は、Ｔ細胞の異なる型間で僅かに異なるが、ＣＤ４＋Ｔ細胞における「２シグナルモデル」が、大抵は当てはまる。ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化は、ＡＰＣ上の主要組織適合複合体ペプチドおよびＢ７ファミリーメンバーのそれぞれによるＴ細胞上のＴ細胞受容体およびＣＤ２８の両方の結合によって生じる。Ｔ細胞受容体およびＣＤ２８の両方が、有効な免疫応答の生成に必要であり；ＣＤ２８共刺激の非存在下では、Ｔ細胞受容体のシグナル伝達のみが、アネルギーとなる。ＣＤ２８およびＴ細胞受容体の両方の下流のシグナル伝達経路は、多くのタンパク質が関与する。
第１のシグナルは、別の細胞上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によって提示される短ペプチドへのＴ細胞受容体の結合によって生じる。これにより、確実にそのペプチドに特異的なＴＣＲをもつＴ細胞のみが活性化される。パートナー細胞は、ナイーブ応答（ｎａｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の場合に通常は樹状細胞であるプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）であるが、Ｂ細胞およびマクロファージも重要なＡＰＣであり得る。ＭＨ
ＣクラスＩ分子によってＣＤ８＋Ｔ細胞に提示されるペプチドは、アミノ酸８〜９の長さであり；ＭＨＣクラスＩＩ分子によってＣＤ４＋細胞に提示されるペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子の結合裂の末端が開いているため、より長い。
第２のシグナルは、通常は病原体の産物であるが時には細胞の分解産物、例えば、壊死体または熱ショックタンパク質である比較的少数の刺激によってＡＰＣ上の表面受容体が誘導される共刺激から生じる。ナイーブＴ細胞によって構成的に発現される唯一の共刺激受容体がＣＤ２８であるため、これらの細胞の共刺激は、ＡＰＣ上のＣＤ８０およびＣＤ８６タンパク質から生じる。他の受容体、例えば、ＯＸ４０およびＩＣＯＳは、Ｔ細胞の活性化のときに発現されるが、これらの発現は、ＣＤ２８に大きく依存する。第２のシグナルは、Ｔ細胞が抗原に応答するのを許可する。第２のシグナルがないと、Ｔ細胞は、アネルギーとなり、後に活性化するのがより困難になる。自己ペプチドは、通常は適切な共刺激で提示されないため、この機序は、自己に対する不適切な応答を防止する。
特定の態様では、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の両方を、共刺激が関与するＴ細胞活性化に使用することができる。代替の態様では、プレート結合抗ＣＤ３などの抗ＣＤ３の架橋結合を利用することができる。可溶性抗ＣＤ３が、ＰＢＭＣ中のＴ細胞を活性化するために使用される場合は、可溶性抗ＣＤ３抗体が、ＰＢＭＣのＡＰＣに結合し得、抗体をＴ細胞に提示する。可溶性抗ＣＤ３抗体が単独で精製Ｔ細胞集団に使用される場合は、上記の理由から、アネルギーとなる。本発明の特定の実施形態は、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）およびＩＬ２の存在下でＴ細胞を培養する工程を含むが、これは、費用がかかり面倒なビーズまたはプレート結合抗体を使用する必要がないため有利で便利であり；ＯＫＴ３およびＩＬ２の添加後に、ＰＢＭＣの細胞環境が、Ｔ細胞の活性化に役立つ。この結果、Ｔ細胞が、選択的な増大によってＰＢＭＣ培養物中の他の細胞型を過密状態にする。
Ｔ細胞受容体は、いくつかのタンパク質の複合体として存在する。実際のＴ細胞受容体は、２つの別個のペプチド鎖からなり、これらのペプチド鎖は、独立したＴ細胞受容体αおよびβ（ＴＣＲαおよびＴＣＲβ）遺伝子から産生される。複合体中の他のタンパク質は、ＣＤ３タンパク質：ＣＤ３εγおよびＣＤ３εδヘテロ二量体、ならびに合計６つのＩＴＡＭモチーフを有する最も重要なＣＤ３ζホモ二量体である。ＣＤ３ζ上のＩＴＡＭモチーフは、Ｌｃｋによってリン酸化され得、リン酸化されるとＺＡＰ−７０を動員する。Ｌｃｋおよび／またはＺＡＰ−７０も、多くの他の分子、特にＣＤ２８、ＬＡＴ、およびＳＬＰ−７６上のチロシンをリン酸化することができ、これにより、これらのタンパク質の周囲でのシグナル伝達複合体の凝集を可能にする。
リン酸化ＬＡＴは、ＳＬＰ−７６を膜に動員し、そこでリン酸化ＬＡＴが、ＰＬＣγ、ＶＡＶ１、Ｉｔｋ、および場合によってはＰＩ３Ｋを取り込むことができる。ＰＬＣγおよびＰＩ３Ｋの両方は、膜の内側リーフレット上のＰＩ（４，５）Ｐ２に作用して、活性な中間体ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、イノシトール−１，４，５−三リン酸（ｉｎｏｓｉｔｏｌ−１，４，５−ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＩＰ３）、およびホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｌｙｉｎｏｓｉｔｏｌ）−３，４，５−三リン酸（ＰＩＰ３）を生成する。ＤＡＧは、Ｔ細胞中のある種のＰＫＣ、例えば、ＰＫＣθに結合し活性化するが、これは、転写因子ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１を活性化するための重要なプロセスである。ＩＰ３は、ＰＬＣγによって膜から放出され、急速に拡散してＥＲ上の受容体を活性化し、これによりカルシウムの放出が誘導される。次いで、放出されたカルシウムが、カルシニュリンを活性化し、カルシニュリンがＮＦＡＴを活性化し、これにより核へ移行する。ＮＦＡＴは、転写因子であり、遺伝子の多面発現性のセット、特にＩＬ−２、すなわち活性化Ｔ細胞の長期の増殖を促進するサイトカインの転写を活性化する。
本発明の方法によって、核酸分子を、活発に増殖している（すなわち、増大している）Ｔ細胞に導入する。Ｔ細胞は、様々な作用物質、例えば、一次活性化シグナルおよび共刺激シグナルをＴ細胞に供給する作用物質の組み合わせ物にＴ細胞を接触させることによって刺激して増大させることができる。Ｔ細胞を刺激して増大させるために使用できる作用物質は、当技術分野で周知であり、以下に記載する。刺激されて増殖するＴ細胞は、細胞の拡大、クランピング、および培養培地の酸性化によって特徴付けられる。したがって、Ｔ細胞の増殖は、例えば、コールターカウンターなどを用いたＴ細胞のサイズの検査またはＴ細胞の体積の測定によって証明することができる。休止Ｔ細胞は、約６．８ミクロンの平均直径を有する。Ｔ細胞を初めに活性化および刺激した後の、Ｔ細胞の平均直径は、第４日目までに１２ミクロンを超えるまで増大し、概ね第６日目までに縮小し始める。さらに、Ｔ細胞の増殖は、当技術分野で公知の標準的な技術、例えば、トリチウム化チミジンの取り込みによって評価することができる。
本発明の方法は、核酸分子を増殖中のＴ細胞に導入する前に、増殖中のＴ細胞を少なくとも１つの刺激剤に接触させる工程を含む。用語「刺激剤」は、Ｔ細胞にトランスフェクトした核酸分子に含まれる遺伝子の発現レベルが、Ｔ細胞を刺激剤に接触させたのちにＴ細胞に核酸分子を導入した場合のほうが、Ｔ細胞を刺激剤に接触させないで核酸分子を導入した場合よりも高くなるように、Ｔ細胞にシグナルを与える作用物質を含むものとする。
本発明の具体的な実施形態では、刺激剤は、一次活性化シグナルをＴ細胞に与える作用物質である。用語「一次活性化シグナル」は、Ｔ細胞の活性化を誘導する、典型的にはＴＣＲ／ＣＤ３複合体によって引き起こされるシグナルを含むものとする。Ｔ細胞の活性化は、共刺激シグナルなどの二次シグナルを受け取るとＴ細胞の増殖および分化が誘導されるようなＴ細胞の改変を含むものとする。具体的な実施形態では、一次活性化シグナルは、Ｔ細胞受容体またはＴ細胞受容体に結合したＣＤ３複合体に接触する作用物質によって与えられる。好ましい実施形態では、この作用物質は、ＣＤ３に対して反応性の抗体、例えば、モノクローナル抗体ＯＫＴ３（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄから入手可能である；Ｎｏ．ＣＲＬ８００１）である。本発明の別の実施形態では、刺激剤は、Ｔ細胞上のＣＤ２複合体を刺激する作用物質であり、例えば、Ｔ１１．３＋Ｔ１１．１またはＴ１１．３＋Ｔ１１．２（例えば、Ｍｅｕｅｒら、１９８４を参照されたい）などの抗体の組み合わせである。
本方法の別の実施形態では、刺激剤は、ＩＬ−２などのリンホカインである。リンホカインは、特に、別の作用物質、例えば、Ｔ細胞を刺激するためにＴ細胞に一次活性化シグナルを与える作用物質と組み合わせて使用される。したがって、本発明の好ましい実施形態では、Ｔ細胞に一次活性化シグナルを与える作用物質（例えば、抗ＣＤ３抗体）とＩＬ−２の有効量の組み合わせにＴ細胞を接触させた後に、Ｔ細胞に核酸分子をトランスフェクトして、核酸分子がＴ細胞で発現されるようにする。
本発明の好ましい実施形態では、Ｔ細胞を、Ｔ細胞において一次活性化シグナルおよび共刺激シグナルの両方を刺激する作用物質の組み合わせで活性化する。用語「共刺激剤」は、一次活性化シグナルを受け取ったＴ細胞（例えば、活性化Ｔ細胞）が刺激されて増殖する、またはサイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、またはインターフェロンγを分泌するように、Ｔ細胞に共刺激シグナルを与える作用物質を含むものとする。具体的な実施形態では、共刺激剤は、Ｔ細胞の表面のＣＤ２８またはＣＴＬＡ４分子と相互作用する。より一層具体的な実施形態では、共刺激シグナルは、Ｂリンパ球抗原Ｂ７−１またはＢ７−２などのＣＤ２８またはＣＴＬＡ４のリガンドである。用語「ＣＤ２８の天然のリガンドの刺激形態」は、共刺激シグナルをＴ細胞に与えることができるＢ７−１およびＢ７−２分子、それらの断片、またはそれらの改変物を含むものとする。ＣＤ２８の天然リ
ガンドの刺激形態は、例えば、活性化末梢血リンパ球をＣＤ２８の天然リガンドの一形態と接触させて、標準的なＴ細胞増殖アッセイを行なうことによって特定することができる。したがって、ＣＤ２８の天然リガンドの刺激形態は、Ｔ細胞の増殖を刺激することができる。ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４の天然リガンドの刺激形態は、例えば、国際公開第９５／０３４０８号に記載されている。
核酸分子をＴ細胞に導入する前にＴ細胞を活性化するために使用できる他の作用物質には、Ｔ細胞活性化および／または共刺激に関与する１つ以上の細胞内シグナル伝達経路を刺激する作用物質が含まれる。本発明の具体的な実施形態では、刺激剤は、カルシウムイオノホア、例えば、イオノマイシンまたはＡ２３１８７である。別法では、刺激剤は、プロテインキナーゼＣ、例えば、ホルボールエステルを刺激する作用物質とすることができる。好ましいホルボールエステルは、ホルボール−１２，１３−二酪酸である。本発明のより一層好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、核酸分子でのトランスフェクションの前にカルシウムイオノホアとホルボールエステルとの組み合わせに接触させる。刺激剤は、プロテインチロシンキナーゼを活性化する作用物質とすることもできる。プロテインチロシンキナーゼを刺激する好ましい作用物質は、過バナジン酸塩である（Ｏ’Ｓｈｅａら、１９９２）。
本発明のなお別の実施形態では、刺激剤は、多クローン性活性化因子である。多クローン性活性化因子には、Ｔ細胞の形質膜で発現する糖タンパク質に結合する作用物質が含まれ、さらにレクチン、例えば、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリン（ＣｏｎＡ）、およびヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）が含まれる。
クローンに特定の活性化シグナルを与えることにより、Ｔ細胞集団におけるＴ細胞の特定のクローンのみを選択的にトランスフェクトすることが可能である。Ｔ細胞クローンの特定の活性化は、例えば、抗原提示細胞によって提示される特定の抗原を用いて達成することができる。
使用できる他の刺激剤には、超抗原が含まれる。本明細書で定義される用語「超抗原」は、細菌エンテロトキシン、またはＴ細胞の増殖を刺激できる他の細菌タンパク質を含むものとする。超抗原には、ブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥ）、例えば、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ、ＳＥＤ、およびＳＥＥが含まれる。超抗原は、ウイルス起源、例えば、レトロウイルス超抗原とすることもできる。
当技術分野で公知もしくは本明細書に記載されているＴ細胞刺激アッセイを用いて同定できる他の作用物質と組み合わせて、または単独でＴ細胞を刺激することができる別の作用物質も、本発明の範囲内である。核酸分子のＴ細胞への導入の前にＴ細胞を刺激するために、上記の作用物質の任意の組み合わせを使用することができる。
刺激剤は、溶解して、または固体表面に結合させて使用することができる。固体表面は、例えば、組織培養皿またはビーズの表面とすることができる。刺激剤の性質によって、固体表面への結合は、当技術分野で周知の方法によって行うことができる。例えば、市販の架橋試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ Ｉｌｌ．）を用いて細胞表面に化学的に架橋結合する、または４℃で一晩インキュベートすることによってプラスチックに固定することができる。Ｔ細胞の刺激のためにいくつかの作用物質が使用される場合は、一部の作用物質を溶解した状態にすることができ、一部の作用物質を固体支持体に結合させることができる。好ましい実施形態では、Ｔ細胞を、固相結合抗ＣＤ３抗体と可溶性抗ＣＤ２８抗体との組み合わせで刺激する。
Ｔ細胞に添加される刺激剤（複数可）の具体的な用量は、刺激剤の種類によって異なる。典型的には、刺激剤は、当技術分野で記載されているように、Ｔ細胞を刺激して増殖させサイトカインを分泌させるために使用される用量と同じ用量で使用される。
本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法は、Ｔ細胞のトランスフェクションの後にｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞を刺激して増大させる工程さらに含む。Ｔ細胞を、ＩＬ−２の存在下で、実施例のセクションで記載されているようにｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激して増大させることができる。具体的な実施形態では、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３などの一次活性化シグナルを与える作用物質および抗ＣＤ２８抗体などの共刺激シグナルを与える作用物質と共にインキュベートすることもできる。
より一層好ましい実施形態では、Ｔ細胞は一次Ｔ細胞である。したがって、Ｔ細胞は、ある被験体から得て、本発明の方法によってトランスフェクトし、次いでｉｎ ｖｉｔｒｏで増大させることができる。本発明の別の実施形態では、トランスフェクトされて増大されたＴ細胞を被験体に再投与する。勾配遠心分離などによって、被験体に投与する前にＴ細胞をさらに精製することが好ましい場合もある。
Ｅ．Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え
本発明者らは、Ｔ細胞受容体でのＶ（Ｄ）Ｊ組換えがＴ細胞のリプログラミングを阻害しないことを見出した。Ｔ細胞由来のｉＰＳ細胞の特定の再構成は、特定の態様において、ｉＰＳ細胞を追跡してｉＰＳ細胞の様々な集団を同定するための固有の「バーコード」として役立ち得る。さらなる態様では、Ｖ、Ｄ、Ｊ遺伝子セグメントの原型のセットを有する胚性幹細胞と比較して、Ｖ、Ｄ、Ｊ遺伝子セグメントの不完全なセットを有するｉＰＳ細胞を提供することもできる。これらのｉＰＳ細胞のＶ、Ｄ、Ｊ遺伝子セグメントの再構成は、クローン集団内では同じであり得るが、異なるクローン集団間では異なり得る。具体的な態様では、γ／δＴＣＲ＋Ｔ細胞は、本方法でリプログラミングすることもできる。このＴ細胞集団の１つを起源とするｉＰＳクローンは、生殖細胞系の構成に酷似したゲノムを有し得、したがって、例えば、より強健なレパートリーのＴ細胞また他の分化細胞に再分化できる場合があるため有利であり得る。
Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えは、脊椎動物で起こる遺伝子組み換えの機序であり、免疫系で重要な役割を持つ特定のタンパク質をコードする遺伝子のセグメントをランダムに選択して構築する。この部位特異的組換え反応は、細菌侵入者からの、ウイルス侵入者からの、および寄生生物侵入者からの、ならびに腫瘍細胞などの機能障害細胞からの多様な抗原の認識に必要な多様なレパートリーのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子を生成する。
殆どのＴ細胞受容体は、α鎖およびβ鎖からなる。Ｔ細胞受容体遺伝子は、リンパ球の発生中に再構成されてその細胞に固有の抗原受容体を提供する複数のＶ、Ｄ、およびＪ遺伝子を同様にＴ細胞受容体遺伝子のβ鎖に含む（かつＶおよびＪ遺伝子をＴ細胞受容体遺伝子のα鎖に含む）という点で免疫グロブリン遺伝子に類似している。
Ｔ細胞の発生中に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖は、免疫グロブリンに関して記載された配列と本質的に同じ配列に順序付けられた組換えを受ける。ＤからＪへの組換えは、ＴＣＲのβ鎖で初めに起こる。このプロセスは、Ｄβ１遺伝子セグメントの６つのＪβ１セグメントの１つへの連結か、またはＤβ２遺伝子セグメントの６つのＪβ２セグメントの１つへの連結を伴い得る。ＤＪ組換えの後に、（上記のように）ＶβからＤβＪβへの再構成が起こる。新たに形成された複合体におけるＶβ−Ｄβ−Ｊβ遺伝子間のすべての遺伝子が除去されて、定常ドメイン遺伝子（Ｖβ−Ｄβ−Ｊβ−Ｃβ）を組み込む一次転写物が合成される。ｍＲＮＡの転写は、あらゆる介在配列をスプライシングし、ＴＣＲのＣβ鎖の完全長のタンパク質の翻訳を可能にする。
ＴＣＲのアルファ（α）鎖の再構成は、β鎖の再構成の後に起こり、Ｉｇ軽鎖に関して記載されたＶからＪへの再構成に類似している（上記を参照されたい）。β鎖およびα鎖の構築により、大部分のＴ細胞で発現されるαβ−ＴＣＲが形成される。
ＶＩ．リプログラミング因子の発現および形質導入
本発明の特定の態様では、リプログラミング因子を、１つ以上のベクター、例えば、組み込み型ベクターまたはエピソームベクターに含まれる発現カセットから発現させる。さらなる態様では、リプログラミングタンパク質を、タンパク質形質導入によって体細胞に直接導入することができる（参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第６１／１７２，０７９号を参照されたい）。
Ａ．組み込み型ベクター
ｉＰＳ細胞は、本発明では、リプログラミングタンパク質をコードする特定の核酸または遺伝子の非多能性細胞、例えば、Ｔ細胞または造血前駆細胞へのトランスフェクションによって得ることができる。トランスフェクションは、典型的には、現行方式ではレトロウイルスなどの組み込み型ウイルスベクターによって達成される。トランスフェクトされた遺伝子は、マスター転写調節因子Ｏｃｔ４（Ｐｏｕｆ５１）およびＳｏｘ２を含み得るが、他の遺伝子も誘導効率を高めることが示唆されている。臨界期の後、少数のトランスフェクトされた細胞が、多能性幹細胞に形態学的および生化学的に類似し始め、形態学的選択、倍加時間によって、またはレポーター遺伝子および抗生物質感染によって単離することができる。
２００７年１１月に、２つの別個の研究チームの研究（Ｙｕら、２００７；Ｙａｍａｎａｋａら、２００７）によって成人ヒト線維芽細胞からｉＰＳを作製するという画期的な仕事を達成した。以前にマウスモデルで使用された同じ原理を用いて、Ｙａｍａｎａｋａは、レトロウイルス系を用いて同じ４つの中心的な遺伝子：Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃでヒト線維芽細胞を多能性幹細胞に形質転換することに成功したが、ｃ−Ｍｙｃは発癌性である。トンプソンおよび同僚らは、レンチウイルス系を用いてＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮＡＮＯＧ、および異なる遺伝子ＬＩＮ２８を使用してｃ−Ｍｙｃの使用を回避した。最近になって、繁殖力のあるマウスがｉＰＳ細胞から作製され、したがって、実質的にあらゆるまたはすべての分化細胞型を形成できるこれらの細胞の潜在能力が実証された（Ｂｏｌａｎｄら、２００９）。
上記されたように、ヒト皮膚線維芽細胞からの多能性幹細胞の誘導は、リプログラミング遺伝子の異所性発現用のレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを用いて達成された。モロニーマウス白血病ウイルスなどの組換えレトロウイルスは、安定して宿主ゲノムに組み込む能力を有する。組換えレトロウイルスは、宿主ゲノムへの組み込みを可能にする逆転写酵素を含む。レンチウイルスは、レトロウイルスのサブクラスである。レンチウイルスは、非分裂細胞ならびに分裂細胞のゲノムに組み込む能力により、ベクターとして広く利用されている。ＲＮＡの形態のウイルスゲノムは、ウイルスが細胞に侵入すると逆転写されてＤＮＡを産生し、そのＤＮＡは次いでウイルスインテグラーゼ酵素によってランダムな位置でゲノムに挿入される。したがって、Ｔ細胞のリプログラミングの成功のために、実施例のセクションに示されているように、組み込みをベースとしたウイルス手法を用いることができる。
Ｂ．エピソームベクター
これらのリプログラミング法は、染色体外で複製するベクター（すなわち、エピソームベクター）を使用することもでき、エピソームベクターは、エピソームとして複製して外来ベクターまたはウイルス要素を本質的に含まないｉＰＳ細胞を作製できるベクターであ
る（参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第６１／０５８，８５８号を参照されたい；Ｙｕら、２００９）。多数のＤＮＡウイルス、例えば、アデノウイルス、サル空胞形成ウイルス４０（ＳＶ４０）またはウシ・パピローマ・ウイルス（ＢＰＶ）、または出芽酵母ＡＲＳ（自己複製配列）含有プラスミドは、哺乳動物細胞おいて染色体外で、またはエピソームとして複製する。これらのエピソームプラスミドは、組み込みベクターに関連したこれらのすべての不都合（Ｂｏｄｅら、２００１）が本質的にない。例えば、上記定義されたように、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）を含むリンパ球指向性ヘルペスウイルスをベースとしたものは、染色体外で複製し、体細胞にリプログラミング遺伝子を送達するのに役立ち得る。
例えば、本発明に使用されるプラスミドをベースとする手法は、詳細が後述されるように、ＥＢＶ要素をベースとした系の臨床実践場面での取り扱いやすさを損なうことなく、この系の複製および維持の成功に必要な強い要素を抽出することができる。必須のＥＢＶ要素は、ＯｒｉＰおよびＥＢＮＡ−１またはそれらの変異体もしくは機能的等価物である。この系のさらなる利点は、これらの外来要素が、細胞に導入されてから時間が経つと消滅し、外来要素を本質的に含まない自立ｉＰＳ細胞をもたらすことである。
プラスミドまたはリポソームをベースとした染色体外ベクター、例えば、ｏｒｉＰをベースとしたベクター、および／またはＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするベクターの使用により、ＤＮＡの大きい断片が細胞に導入され、染色体外に維持され、細胞周期ごとに１回複製され、娘細胞に効率的に分割され、そして免疫応答を実質的に誘発しないことが可能となる。具体的には、ＯｒｉＰをベースとした発現ベクターの複製に必要な唯一のウイルスタンパク質であるＥＢＮＡ−１は、ＭＨＣクラスＩ分子にその抗原の提示を必要とするプロセシングを回避する効率的な機序を発達させたため、細胞性免疫応答を誘発しない（Ｌｅｖｉｔｓｋａｙａら、１９９７）。さらに、ＥＢＮＡ−１は、トランスで作用してクローン化遺伝子の発現を促進することができ、一部の細胞系において最大１００倍のクローン化遺伝子の発現を誘導する（Ｌａｎｇｌｅ−Ｒｏｕａｕｌｔら、１９９８；Ｅｖａｎｓら、１９９７）。最後に、このようなｏｒｉＰをベースとした発現ベクターの製造は低コストである。
他の染色体外ベクターは、他のリンパ球指向性ヘルペスウイルスをベースとしたベクターを含む。リンパ球指向性ヘルペスウイルスは、リンパ芽球（例えば、ヒトＢリンパ芽球）で複製し、そしてその自然の生活環の一部のためにプラスミドになるヘルペスウイルスである。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、「リンパ球指向性」ヘルペスウイルスではない。例示的なリンパ球指向性ヘルペスウイルスには、限定されるものではないが、ＥＢＶ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）；リスザルヘルペスウイルス（ＨＳ）およびマレック病ウイルス（ＭＤＶ）が含まれる。また、酵母ＡＲＳ、アデノウイルス、ＳＶ４０、またはＢＰＶなどの、エピソームをベースとしたベクターの他の供給源も意図している。
ウイルス遺伝子送達の潜在的な問題を回避するために、今年、２つのグループが、ウイルスベクターを用いずにトランスポゾンをベースとした手法でヒト細胞に多能性をもたらすことに成功した共同研究について報告した（Ｗｏｌｔｊｅｎら、２００９；Ｋａｊｉら、２００９）。ウイルス由来２Ａペプチド配列を用いてリプログラミング因子を含むポリシストロニックベクターを作製し、これをｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターによって細胞に送達することによって、安定したｉＰＳ細胞がヒトおよびマウスの線維芽細胞の両方で作製された。次いで、樹立されたｉＰＳ細胞系では必要のない２Ａ連結リプログラミング因子を除去した。これらの戦略は、本発明の特定の態様において、Ｔ細胞または造血前駆細胞のリプログラミングに同様に適用することができる。
Ｃ．タンパク質形質導入
外来性遺伝子改変が標的細胞に導入されるのを回避する１つの可能な方法は、送達される遺伝子の転写に依存するのではなく、リプログラミングタンパク質を直接細胞に導入することである。以前の研究により、タンパク質形質導入を媒介する短ペプチド、例えば、ＨＩＶ ｔａｔおよびポリアルギニンを様々なタンパク質に結合することによって、ｉｎ
ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでこれらのタンパク質を細胞に送達できることが実証されている。近年の研究により、組換えリプログラミングタンパク質を直接送達することによって、マウス線維芽細胞を多能性幹細胞に完全にリプログラミングできることが実証された（Ｚｈｏｕら、２００９）。タンパク質形質導入で細胞をリプログラミングする方法をさらに詳細にまとめたものが、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第６１／１７２，０７９号に開示されている。
本発明の特定の態様では、タンパク質形質導入ドメインを用いて、リプログラミングタンパク質をＴ細胞に直接導入することができる。タンパク質形質導入を用いて、リプログラミングタンパク質の細胞への送達を増強することができる。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質に由来するＴＡＴタンパク質のある領域を標的タンパク質に融合して、標的タンパク質の細胞への侵入を可能にすることができる。これらの形質導入ドメインの融合を用いる利点は、タンパク質の侵入が、迅速で、濃度に依存し、様々な細胞型に働くようであるということである。
本発明のさらなる態様では、核局在配列を用いて、リプログラミングタンパク質の核侵入を容易にすることもできる。核局在シグナル（ＮＬＳ）は、様々なタンパク質について記載されている。核へのタンパク質輸送の機序は、核局在シグナルを含む標的タンパク質のカリオフェリンのαサブユニットへの結合によるものである。これに続いて、標的タンパク質：カリオフェリン複合体が核孔を介して核へ輸送される。しかしながら、リプログラミングタンパク質は、しばしば、内因性核局在配列を有し得る転写因子である。したがって、核局在配列は、必ずしも必要ではない。
リプログラミングタンパク質の体細胞への直接導入を本発明に使用することができるが、それは、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含む融合タンパク質を作製することによって、またはリプログラミングタンパク質とＰＴＤを各分子上の官能基を介して化学的に架橋結合することによって、ＰＴＤに作用的に連結したリプログラミングタンパク質を用いて行なわれる。
標準的な組換え核酸法を用いて、本明細書で使用される１つ以上の形質導入可能なリプログラミングタンパク質を発現させることができる。一実施形態では、形質導入可能なタンパク質をコードする核酸配列を、例えば、転写および翻訳のための適切なシグナルおよびプロセシング配列ならびに調節配列を有する核酸発現ベクターにクローニングする。別の実施形態では、タンパク質は、自動有機合成法を用いて合成することができる。
加えて、タンパク質の細胞への輸送にも役立ち得る数種の方法が存在し、これらの１つ以上の方法を、単独で使用するか、または、限定されるものではないが、微量注入、エレクトロポレーション、およびリポソームの使用を含むタンパク質形質導入ドメインを用いた方法と組み合わせて使用することができる。これらの方法の殆どは、精製したタンパク質調製物を必要とし得る。組換えタンパク質の精製は、しばしば、親和性タグの発現構築物への組み込みによって容易になり、その結果、精製工程が迅速かつ効率的になる。
ＶＩＩ．ベクターの構築および送達
特定の実施形態では、リプログラミングベクターは、細胞内で、上記されたリプログラミング因子をコードする核酸配列に加えて追加の要素を含むように構築することができる。これらのベクター成分および送達方法の詳細は以下に開示される。
Ａ．ベクター
当業者であれば、標準的な組換え技術によってベクターを構築する十分な能力を備えているであろう（例えば、それぞれ参照により本明細書に組み入れられるＭａｎｉａｔｉｓら、１９８８、およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９９４を参照されたい）。
ベクターは、遺伝子送達および／または遺伝子発現をさらに調節する、または標的細胞に有利な特性を他の方法で付与する他の成分または機能性も含むことができる。このような他の成分には、例えば、細胞への結合または細胞を標的とすることに影響を与える成分（細胞型または組織特異的な結合を媒介する成分を含む）；細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を与える成分；取り込み後の細胞内のポリヌクレオチドの局在化に影響を与える成分（例えば、核局在化を媒介する作用物質）；およびポリヌクレオチドの発現に影響を与える成分が含まれる。
また、このような成分には、ベクターによって送達された核酸を取り込んで発現している細胞の検出または選択に使用することができる検出マーカーおよび／または選択マーカーなどのマーカーも含まれ得る。このような成分は、ベクターの天然の形体として提供することができる（例えば、結合および取り込みを媒介する成分または機能性を有する特定のウイルスベクターの使用）、またはベクターは、このような機能性を提供するように改変することができる。非常に様々なこのようなベクターは、当技術分野で公知であり、一般に入手可能である。ベクターが宿主細胞に維持されている場合は、ベクターは、自律構造物として有糸分裂の間に細胞によって安定的に複製されるか、宿主細胞のゲノム内に組み込まれるか、または宿主細胞の核もしくは細胞質内に維持されるかのいずれかであり得る。
Ｂ．調節要素
ベクター内に含められる真核生物発現カセットは、特に、タンパク質コード配列、介在配列を含むスプライシングシグナル、および転写停止／ポリアデニル化配列に作動可能に連結された真核生物転写プロモーターを含む（５’から３’方向に）。
ｉ．プロモーター／エンハンサー
「プロモーター」は、転写の開始および速度が制御される核酸配列の領域である制御配列である。プロモーターは、調節タンパク質および分子がＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などに結合して核酸配列の特異的な転写を開始することができる遺伝要素を含み得る。句「作用的に配置された」、「作用的に連結された」、「制御下」および「転写制御下」は、プロモーターが、核酸配列に対して正確な機能位置および／または向きにあって、核酸配列の転写開始および／または発現を制御することを意味する。
本発明のＥＢＮＡ１をコードするベクターに使用するのに適したプロモーターは、ＥＢＮＡ１タンパク質をコードする発現カセットの発現を誘導して、ＥＢＮＡ１タンパク質を十分な定常状態のレベルにし、ＥＢＶ ｏｒｉＰを含むベクターを安定的に維持するプロモーターである。プロモーターはまた、リプログラミング因子をコードする発現カセットの効率的な発現のためにも使用することができる。
プロモーターは、一般に、ＲＮＡ合成の開始部位の位置を決定する機能を果たす配列を含む。この最もよく知られている例は、ＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスを有していない一部のプロモーター、例えば、哺乳動物末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターなどでは、開始部位自体の上にある別個の要素が、開始位置を決定するのを助ける。追加のプロモー
ター要素が、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは、開始部位の３０〜１１０塩基対上流の領域に位置するが、多数のプロモーターが、開始部位の下流の機能要素も含むことが示されている。コード配列をプロモーター「の制御下」に置くために、選択されたプロモーターの「下流」の（すなわち、３’側の）転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端の位置を決定する。「上流」プロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされたＲＮＡの発現を促進する。
プロモーター要素間の間隔は、柔軟である場合が多いため、要素が互いに対して逆になる、または移動してもプロモーター機能は保たれる。ｔｋプロモーターでは、プロモーター要素間の間隔は、活性が低下し始めるまでに５０塩基対まで広げることができる。プロモーターによって、個々の要素は、協働で、または独立して機能して、転写を活性化することができる。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性調節配列と呼ばれる「エンハンサー」と共に使用しても良いし、しなくても良い。
プロモーターは、核酸配列に自然に結合されたものであり得、コードセグメントおよび／またはエキソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得ることができる。このようなプロモーターは、「内因性」と呼ぶことができる。同様に、エンハンサーは、核酸配列の下流または上流のいずれかに位置しており、その核酸配列に自然に結合されたものであり得る。別法では、自然環境では通常は核酸配列に結合されていないプロモーターを指す組換えプロモーターまたは異種プロモーターの制御下にコード核酸セグメントを置くことによって一定の利点が得られる。組換えエンハンサーまたは異種エンハンサーもまた、自然環境では通常は核酸配列に結合していないエンハンサーを指す。このようなプロモーターまたはエンハンサーには、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、および任意の他のウイルスまたは原核細胞もしくは真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、および「天然に存在し」ていない、すなわち異なる転写調節領域の異なる要素および／または発現を変更する変異を含むプロモーターまたはエンハンサーが含まれ得る。例えば、組換えＤＮＡの構築に最も良く使用されるプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）プロモーター系、ラクトースプロモーター系、およびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系が含まれる。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に作製するのに加えて、配列は、本明細書に開示される組成物に関連した、組換えクローニングおよび／またはＰＣＲ（商標）を含む核酸増幅技術を用いて作製することができる（それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第４，６８３，２０２号および同第５，９２８，９０６号を参照されたい）。さらに、ミトコンドリアおよび葉緑体などの非核細胞小器官内での配列の転写および／または発現を誘導する制御配列も利用できるということが意図される。
当然、発現のために選択される細胞小器官、細胞型、組織、器官、または生物におけるＤＮＡセグメントの発現を効率的に誘導するプロモーターおよび／またはエンハンサーを利用することが重要である。分子生物学の当業者であれば、通常は、タンパク質の発現のためのプロモーター、エンハンサー、および細胞型の組合せの使用を知っている（例えば、参照により本明細書に組み入れられるＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照されたい）。利用されるプロモーターは、導入されるＤＮＡセグメントの高レベルの発現を誘導する適切な条件下で、構成的、組織特異的、誘導性、および／または有用であり得、組換えタンパク質および／またはペプチドの大量生産などに有利である。プロモーターは、異種性または内因性であり得る。
加えて、任意のプロモーター／エンハンサーの組合せ（例えば、ワールドワイドウエブ：ｅｐｄ．ｉｓｂ−ｓｉｂ．ｃｈ／にある真核生物プロモーターデータベースＥＰＤＢの通り）を使用しても発現を駆動することができる。Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６細胞質発現系の使用は、別の可能な実施形態である。適切な細菌ポリメラーゼが、送達複合体の一部
としてまたは追加の遺伝子発現構築物として提供されると、真核細胞は、特定の細菌プロモーターによる細胞質転写を支持し得る。
プロモーターの限定されない例として、初期または後期ウイルスプロモーター、例えば、ＳＶ４０初期または後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）初期プロモーター：真核細胞プロモーター、例えば、βアクチンプロモーター（Ｎｇ、１９８９；Ｑｕｉｔｓｃｈｅら、１９８９）、ＧＡＤＰＨプロモーター（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８８；Ｅｒｃｏｌａｎｉら、１９８８）、メタロチオネインプロモーター（Ｋａｒｉｎら、１９８９；Ｒｉｃｈａｒｄｓら、１９８４）；および連結応答要素プロモーター、例えば、サイクリックＡＭＰ応答要素プロモーター（ｃｒｅ）、血清応答要素プロモーター（ｓｒｅ）、ホルボールエステルプロモーター（ＴＰＡ）、および最小ＴＡＴＡボックス近傍の応答要素プロモーター（ｔｒｅ）などが挙げられる。また、ヒト成長ホルモンプロモーター配列（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋに記載されているヒト成長ホルモン最小プロモーター、受託番号Ｘ０５２４４、ヌクレオチド２８３−３４１）またはマウス乳腺腫瘍プロモーター（ＡＴＣＣから入手可能、カタログ番号ＡＴＣＣ４５００７）を使用することも可能である。具体例は、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターでありえる。
ｉｉ．プロテアーゼ切断部位／自己切断ペプチドおよび内部リボソーム結合部位
本発明による特定の態様では、マーカーまたはリプログラミングタンパク質をコードする遺伝子を、プロテアーゼ切断部位（すなわち、プロテーゼ認識部位を含む配列）または少なくとも１つの自己切断ペプチドをコードする配列（２つ以上存在し得る）によって互いに連結することができる。
本発明の特定の実施形態によると、ポリシストロニックメッセージを構成する遺伝子を連結する配列（複数可）によってコードされる切断部位を切断できるプロテアーゼ（複数可）は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる。より具体的には、プロテアーゼ（複数可）をコードする遺伝子（複数可）は、少なくとも１つのポリシストロニックメッセージの一部である。
適切なプロテアーゼ切断部位および自己切断ペプチドは、当業者には公知である（例えば、Ｒｙａｎら、１９９７；Ｓｃｙｍｃｚａｋら、２００４を参照されたい）。プロテアーゼ切断部位の好ましい例は、ポチウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えば、タバコｅｔｃｈウイルスプロテアーゼ）、ポチウイルスＨＣプロテアーゼ、ポチウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）Ｎｌａプロテアーゼ、ビオウイルスＲＮＡ−２コードプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（イネツングロスフェリカルウイルス）３Ｃｉｉｋｅプロテアーゼ、ＰＹ＼ＩＦ（パースニップ黄斑ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、トロンビン、因子Ｘａ、およびエンテロキナーゼである。その高い切断厳密性により、ＴＥＶ（タバコｅｔｃｈウイルス）プロテアーゼ切断部位を使用することができる。
例示的な自己切断ペプチド（「シス作用加水分解要素」、ＣＨＹＳＥＬとも呼ばれ；ｄｅＦｅｌｉｐｅ（２００２）を参照されたい）は、ポチウイルスおよびカルジオウイルス２Ａペプチドに由来する。特定の自己切断ペプチドは、ＦＭＤＶ（口蹄疫ウイルス）由来２Ａペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス、ゾーシーアシグナウイルス（Ｔｈｏｓｅａ’ ａｓｉｇｎａ ｖｉｒｕｓ）、およびブタテッショウウイルスから選択することができる。
特定の開始シグナルも、ポリシストロニックメッセージのコード配列の効率的な翻訳に
使用することができる。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接配列を含む。ＡＴＧ開始コドンを含む外来性翻訳制御シグナルを備える必要があり得る。当業者であれば、容易にこれを決定し、必要なシグナルを備えることができる。望ましいコード配列のリーディングフレームが全インサートを確実に翻訳するためには、開始コドンが「インフレーム」でなければならないことは周知である。外来性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然または合成のいずれかとすることができる。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素を含めることによって増強することができる。
本発明の特定の実施形態では、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）要素の使用により、多重遺伝子またはポリシストロニックメッセージを生成する。ＩＲＥＳ要素は、５’メチル化Ｃａｐ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルを回避して、内部部位で翻訳を開始することができる（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８）。哺乳動物メッセージ由来のＩＲＥＳ（ＭａｃｅｊａｋおよびＳａｒｎｏｗ、１９９１）はもちろん、ピコルナウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）由来のＩＲＥＳ要素が記載されている（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８）。ＩＲＥＳ要素は、異種オープンリーディングフレームに連結することができる。複数のオープンリーディングフレームは、一緒に転写され、それぞれがＩＲＥＳによって分離され、ポリシストロニックメッセージを生成することができる。ＩＲＥＳ要素によって、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームにアクセス可能である。複数の遺伝子は、１つのプロモーター／エンハンサーを使用して１つのメッセージを転写することで効率的に発現させることができる（それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，９２５，５６５号および同第５，９３５，８１９号を参照されたい）。
ｉｉｉ．複数のクローニング部位
ベクターは、複数のクローニング部位（ＭＣＳ）を含み得、このＭＣＳは、複数の制限酵素部位を含む核酸領域であり、どの制限酵素部位も、標準的な組換え技術とともに使用してベクターを消化することができる（例えば、参照により本明細書に組み入れられるＣａｒｂｏｎｅｌｌｉら、１９９９、Ｌｅｖｅｎｓｏｎら、１９９８、およびＣｏｃｅａ、１９９７を参照されたい）。「制限酵素消化」は、核酸分子の特定の位置でのみ機能する酵素を用いた核酸分子の触媒的切断を指す。これらの制限酵素の多くは市販されている。このような酵素の使用は、当業者には広く理解されている。しばしば、ベクターは、ＭＣＳ内で切断して外来性配列のベクターへのライゲーションを可能にする制限酵素を使用して線状化または断片化される。「ライゲーション」とは、２つの核酸断片間にホスホジエステル結合を形成するプロセスを指し、これらの断片は互いに連続していても良いし、連続していなくても良い。制限酵素およびライゲーション反応を伴う技術は、組換え技術の当業者には周知である。
ｉｖ．スプライシング部位
殆どの転写された真核生物ＲＮＡ分子は、一次転写物からイントロンを除去するためのＲＮＡスプライシングを受ける。真核生物ゲノム配列を含むベクターは、タンパク質発現のための転写物の適切なプロセシングを確実にするためにドナースプライシング部位および／またはアクセプタースプライシング部位を必要とし得る（例えば、参照により本明細書に組み入れられるＣｈａｎｄｌｅｒら、１９９７を参照されたい）。
ｖ．終結シグナル
本発明のベクターまたは構築物は、一般に、少なくとも１つの終結シグナルを含む。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写物の特異的な終結に関与するＤＮＡ配列から構成されている。したがって、特定の実施形態では、ＲＮＡ転写物の産生を終了させる終結シグナルを意図している。ターミネーターは、望ましいメッセージのレベルを達成するためにｉｎ ｖｉｖｏで必要であり得る。
真核生物系では、ターミネーター領域は、ポリアデニル化部位を露出するために新たな転写物の部位特異的切断を可能にする特異的ＤＮＡ配列も含み得る。これは、特殊化された内因性ポリメラーゼが約２００Ａ残基（ポリＡ）のストレッチを転写物の３’末端に付加するようにするシグナルである。このポリＡ尾部で修飾されたＲＮＡ分子は、より安定であるようであり、より効率的に翻訳される。したがって、真核生物に関する他の実施形態では、ターミネーターが、ＲＮＡの切断のためのシグナルを含むことが好ましく、ターミネーターのシグナルが、メッセージのポリアデニル化を促進することがさらに好ましい。ターミネーターおよび／またはポリアデニル化部位の要素は、メッセージのレベルを強めて、カセットから他の配列への通読を最小にするように機能し得る。
本発明で使用するように意図したターミネーターは、例えば、限定されるものではないが、遺伝子の終結配列、例えば、ウシ成長ホルモンターミネーターなど、またはウイルス終結配列、例えば、ＳＶ４０ターミネーターなどを含む、本明細書に記載された、または当業者に公知の転写のあらゆる既知のターミネーターを含む。特定の実施形態では、終結シグナルは、配列の切断などにより、転写可能または翻訳可能な配列が欠失され得る。
ｖｉ．ポリアデニル化シグナル
発現、特に真核生物の発現では、典型的には、ターミネーターは、転写物の適切なポリアデニル化を生じさせるポリアデニル化シグナルを含む。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実施の成功にとって重要であるとは考えられていないが、任意のこのような配列を利用することができる。好ましい実施形態は、様々な標的細胞で十分に機能することが知られている便利なＳＶ４０ポリアデニル化シグナルまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む。ポリアデニル化は、転写物の安定性を向上させることができ、または細胞質輸送を容易にすることができる。
ｖｉｉ．複製起点
宿主細胞でベクターを増殖させるために、ベクターは、複製部位の１つ以上の起点（しばしば「ｏｒｉ」と呼ばれる）、例えば、上記のＥＢＶのｏｒｉＰまたは遺伝子組換えｏｒｉＰに一致する核酸配列を含むことができ、この遺伝子組換えｏｒｉＰは、分化プログラミングでの機能が同じまたは向上した、複製が開始される特定の核酸配列である。別法では、上記の他の染色体外複製ウイルスの複製起点または自己複製配列（ＡＲＳ）を利用することができる。
ｖｉｉｉ．選択マーカーおよびスクリーニングマーカー
本発明の特定の実施形態では、本発明の核酸構築物を含む細胞は、発現ベクターにマーカーを含めることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで同定することができる。このようなマーカーは、識別可能な変化を細胞に付与して、発現ベクターを含む細胞の容易な同定を可能にすることができる。一般に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するマーカーである。陽性選択マーカーは、そのマーカーの存在がその選択を可能にするマーカーであるのに対して、陰性選択マーカーは、そのマーカーの存在がその選択を妨げるマーカーである。陽性選択マーカーの例は、薬剤耐性マーカーである。
通常は、薬物選択マーカーの含有は、形質転換体のクローニングおよび同定に役立ち、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、およびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子が、有用な選択マーカーである。条件の実施に基づいて形質転換体の区別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、基準が比色分析であるＧＦＰなどのスクリーニングマーカーを含む他の種類のマーカーも意図している。別法では、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などの陰性選択マーカーとしてスクリーニング可能な酵素を利用することができる。当業者であれば、場合によってはＦＡＣＳ分析と共に免疫学的マーカーを利用する方法も知っている。使用されるマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現可能である限り、重要であるとは考えられない。選択マーカーおよびスクリーニングマーカーのさらなる例は、当業者には周知である。本発明の１つの特徴には、分化プログラミング因子がベクターを含まない細胞で望ましい分化状態に変更した後に、選択マーカーおよびスクリーニングマーカーを用いてそれらの細胞を選択することが含まれる。
Ｃ．ベクター送達
本発明を用いたリプログラミングベクターの体細胞内への導入では、本明細書に記載された、または当業者に公知である細胞の形質転換のための核酸送達の任意の適切な方法を使用することができる。このような方法には、限定されるものではないが、ｅｘ ｖｉｖｏトランスフェクション（Ｗｉｌｓｏｎら、１９８９、Ｎａｂｅｌら、１９８９）、微量注入（ＨａｒｌａｎｄおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５；参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，７８９，２１５号）を含む注入（それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，９９４，６２４号、同第５，９８１，２７４号、同第５，９４５，１００号、同第５，７８０，４４８号、同第５，７３６，５２４号、同第５，７０２，９３２号、同第５，６５６，６１０号、同第５，５８９，４６６号、および同第５，５８０，８５９号）；エレクトロポレーション（参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，３８４，２５３号；Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６；Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４）；リン酸カルシウム沈殿（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ、１９７３；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、１９８７；Ｒｉｐｐｅら、１９９０）；ＤＥＡＥ−デキストランの使用およびこれに続くポリエチレングリコールの使用（Ｇｏｐａｌ、１９８５）；直接超音波負荷（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７）；リポソーム媒介トランスフェクション（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、１９８２；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７；Ｗｏｎｇら、１９８０；Ｋａｎｅｄａら、１９８９；Ｋａｔｏら、１９９１）、および受容体媒介トランスフェクション（ＷｕおよびＷｕ、１９８７；ＷｕおよびＷｕ、１９８８）；微粒子銃（それぞれ参照により本明細書に組み入れられる国際出願第９４／０９６９９号および同第９５／０６１２８号；米国特許第５，６１０，０４２号、同第５，３２２，７８３号、同第５，５６３，０５５号、同第５，５５０，３１８号、同第５，５３８，８７７号、および同第５，５３８，８８０号）；炭化ケイ素繊維を用いた攪拌（Ｋａｅｐｐｌｅｒら、１９９０；それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，３０２，５２３号および同第５，４６４，７６５号）；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換（それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，５９１，６１６号および同第５，５６３，０５５号）；プロトプラストのＰＥＧ媒介形質転換（Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈら、１９９３；それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第４，６８４，６１１号および同第４，９５２，５００号）；乾燥／阻害媒介ＤＮＡ取り込み（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、１９８５）、およびこのような方法の任意の組み合わせなどによるＤＮＡの直接送達が含まれる。これらのような技術の適用によって、細胞小器官（複数可）、細胞（複数可）、組織（複数可）、または生物（複数可）を安定的または一過性に形質転換することができる。
ｉ．リポソーム媒介トランスフェクション
本発明の特定の実施形態では、核酸は、例えば、リポソームなどの脂質複合体の中に閉じ込めることができる。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部の水性媒体によって特徴付けられる小胞構造物である。多重膜リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。多重膜リポソームは、リン脂質が過剰の水溶液中で懸濁されると自然に生じる。脂質成分は、密閉構造物が形成される前に自己再構成され、脂質二重層間に水および溶解した溶質を閉じ込める（ＧｈｏｓｈおよびＢａｃｈｈａｗａｔ、１９９１）。また、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）またはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）と複合体を形成した核酸も意図している。使用されるリポソームの量は、リポソームの性質ならびに使用される細胞によって様々であり得、例えば、細胞１，０００，０００〜１０，０００，０００に対して約５〜約２０μｇのベクターＤＮＡを意図し得る。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの外来性ＤＮＡのリポソーム媒介核酸送達および発現は、大成功であった（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、１９８２；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７）。培養されたニワトリ胚、ＨｅＬａ細胞、および肝細胞腫細胞における外来性ＤＮＡのリポソーム媒介送達および発現の実現性もまた実証された（Ｗｏｎｇら、１９８０）。
本発明の特定の実施形態では、リポソームは、赤血球凝集性ウイルス（ＨＶＪ）と複合体を形成し得る。これは、細胞膜との融合を容易にして、リポソームカプセル化ＤＮＡの細胞侵入を促進することを示している（Ｋａｎｅｄａら、１９８９）。他の実施形態では、リポソームは、核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と複合体を形成する、またはこのタンパク質と共に利用することができる（Ｋａｔｏら、１９９１）。なおさらなる実施形態では、リポソームは、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両方と複合体を形成する、またはこれらと共に利用することができる。他の実施形態では、送達ビヒクルは、リガンドおよびリポソームを含み得る。
ｉｉ．エレクトロポレーション
本発明の特定の実施形態では、核酸は、エレクトロポレーションによって細胞に導入される。エレクトロポレーションは、細胞の懸濁液およびＤＮＡの高電圧放電への曝露を含む。レシピエント細胞は、機械的創傷によってさらに形質転換しやすくすることができる。また、使用されるベクターの量は、使用される細胞の性質によって様々であり得、例えば、細胞１，０００，０００〜１０，０００，０００に対して約５〜約２０μｇのベクターＤＮＡを意図し得る。
エレクトロポレーションを使用する真核細胞のトランスフェクションは、かなりの成功であった。この方式で、マウス前Ｂリンパ球が、ヒトκ免疫グロブリン遺伝子（Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４）をトランスフェクトされ、ラット肝細胞が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６）をトランスフェクトされた。
ｉｉｉ．リン酸カルシウム
本発明の他の実施形態では、核酸は、リン酸カルシウム沈殿を用いて細胞に導入される。ヒトＫＢ細胞が、この技術を用いてアデノウイルス５ＤＮＡ（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ、１９７３）をトランスフェクトされた。同様に、この方式で、マウスＬ（Ａ９）、マウスＣ１２７、ＣＨＯ、ＣＶ−１、ＢＨＫ、ＮＩＨ３Ｔ３、およびＨｅＬａ細胞が、ネオマイシンマーカー遺伝子（ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、１９８７）をトランスフェクトされ、ラット肝細胞が、様々なマーカー遺伝子（Ｒｉｐｐｅら、１９９０）をトランスフェクトされた。
ｉｖ．ＤＥＡＥ−デキストラン
別の実施形態では、核酸は、ＤＥＡＥ−デキストラン、続いてポリエチレングリコールを用いて細胞に送達される。この方式で、レポータープラスミドが、マウス骨髄腫細胞および赤白血病細胞に導入された（Ｇｏｐａｌ、１９８５）。
ｖ．超音波負荷
本発明のさらなる実施形態は、直接超音波負荷による核酸の導入を含む。ＬＴＫ―線維芽細胞が、超音波負荷によってチミジンキナーゼ遺伝子をトランスフェクトされた（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７）。
ｖｉ．受容体媒介トランスフェクション
なおさらに、核酸は、受容体媒介送達ビヒクルによって標的細胞に送達することができる。受容体媒介送達ビヒクルは、標的細胞で起こる受容体媒介エンドサイトーシスによる高分子の選択的な取り込みを利用している。様々な受容体の細胞型特異的分布から見て、この送達方法は、別の程度の特異性を本発明に付加する。
特定の受容体媒介遺伝子標的ビヒクルは、細胞受容体特異的リガンドおよび核酸結合剤を含む。他のビヒクルは、送達される核酸が機能的に結合された細胞受容体特異的リガンドを含む。いくつかのリガンドが、受容体媒介遺伝子輸送に使用され（ＷｕおよびＷｕ、１９８７；Ｗａｇｎｅｒら、１９９０；Ｐｅｒａｌｅｓら、１９９４；Ｍｙｅｒｓ、欧州特許第０２７３０８５号）、技術の操作性が確立される。別の哺乳動物細胞型に関連した特異的送達が記載されている（参照により本明細書に組み入れられるＷｕおよびＷｕ、１９９３）。本発明の特定の態様では、リガンドは、標的細胞集団上で特異的に発現される受容体に対応するように選択される。
他の実施形態では、細胞特異的核酸標的ビヒクルの核酸送達ビヒクル成分は、リポソームと組み合わせられた特異的結合リガンドを含み得る。送達される核酸（複数可）は、リポソーム内に収容され、特異的結合リガンドが、リポソーム膜内に機能的に取り込まれる。したがって、リポソームは、標的細胞の受容体（複数可）に特異的に結合し、内容物を細胞に送達する。例えば、ＥＧＦ受容体のアップレギュレーションを示す細胞への核酸の受容体媒介送達に上皮成長因子（ＥＧＦ）が使用される系を用いることで、このような系が機能的であることが示された。
なおさらなる実施形態では、標的送達ビヒクルの核酸送達ビヒクル成分は、特に、細胞特異的な結合を誘導する１つ以上の脂質または糖タンパク質を含むリポソーム自体であり得る。例えば、ラクトシル−セラミド、ガラクトース末端アシアロガングリオシド（ａｓｉａｌｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）が、リポソーム内に取り込まれ、そして肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込みの増加が観察された（Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７）。本発明の組織特異的形質転換構築物が、同様の方式で標的細胞に特異的に送達できることを意図している。
ｖｉｉ．微粒子銃
微粒子銃技術は、少なくとも１つの細胞小器官、細胞、組織、または生物に核酸を導入するために使用することができる（それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，５５０，３１８号；同第５，５３８，８８０号；同第５，６１０，０４２号；および国際出願第９４／０９６９９号）。この方法は、細胞を殺滅することなくＤＮＡ被覆微粒子を、細胞膜を貫通して細胞内に侵入させることができる高速度までＤＮＡ被覆微粒子を加速させる能力に依存する（Ｋｌｅｉｎら、１９８７）。当技術分野で公知の様々な微粒子銃技術が存在し、その多くが本発明に適用可能である。
この微粒子銃では、１つ以上の粒子を少なくとも１つの核酸で被覆し、推進力によって細胞に送達することができる。小さな粒子を加速させるためのいくつかのデバイスが開発されている。１つのこのようなデバイスは、動力を次々に供給する電流を生成する高電圧放電に依存する（Ｙａｎｇら、１９９０）。使用される微粒子発射物（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）は、タングステンまたは金の粒子やビーズなどの生物学的に不活性な物質からなっている。例示的な粒子には、タングステン、白金、および特に金からなる粒子
が含まれる。場合によっては、金属粒子上へのＤＮＡ沈殿が、微粒子銃を使用するレシピエント細胞へのＤＮＡ送達に必要ではないことも意図している。しかしながら、粒子は、ＤＮＡで被覆されるのではなく、ＤＮＡを含むことができることを意図している。ＤＮＡ被覆粒子は、粒子銃によるＤＮＡ送達のレベルを上げることができるが、ＤＮＡ被覆粒子自体は必ずしも必要ではない。
微粒子を撃つために、懸濁液中の細胞が、フィルターまたは固形培養培地上で濃縮される。別法では、未成熟胚または他の標的細胞を、固形培養培地上に配置することができる。微粒子が撃たれる細胞は、微粒子発射物停止プレートよりも下の適切な距離に配置される。
ＶＩＩＩ．ｉＰＳ細胞の選択
本発明の特定の態様では、１つ以上のリプログラミング因子が体細胞に導入された後、細胞が、増大のために培養される（必要に応じて、トランスフェクト細胞を濃縮するために陽性選択またはスクリーニングマーカーのようなベクター要素の存在について選択される）。リプログラミングベクターが、これらの細胞でリプログラミング因子を発現し、細胞分裂と共に複製および分割することができる。別法では、リプログラミングタンパク質を、リプログラミングタンパク質を含む培地を補充することによってこれらの細胞および子孫細胞に侵入させることができる。これらのリプログラミング因子は体細胞ゲノムをリプログラミングして自律多能性状態を確立するので、この間またはベクターの存在の陽性選択の除去後に外来性遺伝要素が徐々に消失するか、またはリプログラミングタンパク質を添加する必要がなくなる。
これらの人工多能性幹細胞は、多能性胚性幹細胞と実質的に同一であることが予想されているため、胚性幹細胞の特性に基づいてこれらのＴ細胞または造血前駆細胞に由来する子孫細胞から選択することができる。また、追加の陰性選択工程を利用して、リプログラミングベクターＤＮＡの非存在の検査またはレポーターなどの選択マーカーの使用による外来性遺伝要素を本質的に含まないｉＰＳ細胞の選択を促進する、または助けることもできる。
Ａ．胚性幹細胞の特性による選択
以前の研究で作製に成功したｉＰＳＣは、以下に示す点で自然に分離される多能性幹細胞（それぞれ、マウス胚性幹細胞ｍＥＳＣおよびヒト胚性幹細胞ｈＥＳＣなど）に著しく類似しているため、自然に分離される多能性幹細胞に対するｉＰＳＣの同一性、真正性、および多能性が確認された。したがって、本発明で開示される方法で作製される人工多能性幹細胞は、１つ以上の以下の胚性幹細胞の特性に基づいて選択することができる。
ｉ．細胞の生物学的特性
形態：ｉＰＳＣは、ＥＳＣに形態学的に類似している。各細胞は、丸い形状、二重核小体または大きい核小体、および少ない細胞質を有することができる。ｉＰＳＣのコロニーも同様に、ＥＳＣのコロニーに類似し得る。ヒトｉＰＳＣは、ｈＥＳＣに類似した縁が鋭く平坦な密集したコロニーを形成し、マウスｉＰＳＣは、ｍＥＳＣに類似し、ｈＥＳＣよりも平坦ではなく、より塊状のコロニーを形成する。
増殖特性：倍加時間および有糸分裂活性は、幹細胞がその定義の一部として自己再生しなければならないため、ＥＳＣに重要なものである。ｉＰＳＣは、有糸分裂活性があり、ＥＳＣと等しい速度で活発に自己再生し、増殖し、そして分裂することができる。
幹細胞マーカー：ｉＰＳＣは、ＥＳＣ上に発現される細胞表面抗原マーカーを発現し得る。ヒトｉＰＳＣは、限定されるものではないが、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ
−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−４９／６Ｅ、およびＮａｎｏｇを含め、ｈＥＳＣに特異的なマーカーを発現した。マウスｉＰＳＣは、ｍＥＳＣと同様に、ＳＳＥＡ−１を発現したが、ＳＳＥＡ−３もＳＳＥＡ−４も発現しなかった。
幹細胞遺伝子：ｉＰＳＣは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＧＤＦ３、ＲＥＸ１、ＦＧＦ４、ＥＳＧ１、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、およびｈＴＥＲＴを含め、未分化ＥＳＣで発現される遺伝子を発現し得る。
テロメラーゼ活性：テロメラーゼは、約５０回の細胞分裂のヘイフリック限界によって制限されない細胞分裂を持続させるために必要である。ｈＥＳＣは、自己再生および増殖を持続させるために高いテロメラーゼ活性を発現し、ｉＰＳＣもまた、高いテロメラーゼ活性を示し、テロメラーゼタンパク質複合体に必要な成分であるｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）を発現する。
多能性：ｉＰＳＣは、ＥＳＣに類似した方式で完全に分化した組織に分化することができる。
神経分化：ｉＰＳＣは、ニューロンに分化して、βＩＩＩ−チューブリン、チロシンヒドロキシラーゼ、ＡＡＤＣ、ＤＡＴ、ＣｈＡＴ、ＬＭＸ１Ｂ、およびＭＡＰ２を発現し得る。カテコールアミン関連酵素の存在は、ｉＰＳＣが、ｈＥＳＣと同様に、ドーパミン作動性ニューロンに分化し得ることを示唆し得る。幹細胞関連遺伝子は、分化後にダウンレギュレートされる。
心臓分化：ｉＰＳＣは、自発的に鼓動を開始する心筋細胞に分化し得る。心筋細胞は、ｃＴｎＴ、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＬ２Ａ、ＭＹＨＣβ、およびＮＫＸ２．５を発現する。幹細胞関連遺伝子は、分化後にダウンレギュレートされる。
奇形腫形成：免疫不全マウスに注入されたｉＰＳＣは、一定期間、例えば、９週間後に自然に奇形腫を形成し得る。奇形腫は、内胚葉、中胚葉、および外胚葉の３つの胚葉に由来する組織を含む多系統の腫瘍であり：これは、典型的には１種類だけの細胞型からなる他の腫瘍とは異なっている。奇形腫形成は、多能性のランドマーク試験である。
胚様体：培養下のｈＥＳＣは、「胚様体」と呼ばれる球状胚様構造物を自然に形成し、この胚様体は、有糸分裂で活性であり分化するｈＥＳＣのコアと３つすべての胚葉から完全に分化した細胞の周辺（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｒｙ）からなる。ｉＰＳＣも同様に、胚様体を形成し、周辺の分化細胞を有し得る。
胚盤胞注入：ｈＥＳＣは、胚盤胞の内細胞塊（胚結節）内に自然に存在し、胚結節において、胚盤胞の殻（栄養膜）が胚外組織に分化する間に胚に分化する。中空栄養膜は、生きた胚を形成することができないため、胚盤胞内の胚性幹細胞が分化して胚を形成する必要がある。雌レシピエントに移入される胚盤胞を形成するために微量ピペットで栄養膜に注入されたｉＰＳＣは、生きたキメラ仔マウス：体全体にｉＰＳＣ誘導体が１０〜９０％組み込まれたキメラ現象のマウスとなり得る。
ｉｉ．後成的リプログラミング
プロモーターの脱メチル化：メチル化は、メチル基のＤＮＡ塩基への転移、典型的には、ＣｐＧ部位（シトシン／グアニン配列の近傍）のシトシン分子へのメチル基の転移である。遺伝子の広範なメチル化は、発現タンパク質の活性の抑制または発現に干渉する酵素の動員によって発現に干渉する。したがって、遺伝子のメチル化は、転写を防止することによって効率的に遺伝子を抑制する。Ｏｃｔ４、Ｒｅｘ１、およびＮａｎｏｇを含む多能性関連遺伝子のプロモーターは、ｉＰＳＣ内で脱メチル化され得、それらのプロモーター活性ならびにｉＰＳＣ内の多能性関連遺伝子の活発な促進および発現を示す。
ヒストン脱メチル化：ヒストンは、様々なクロマチン関連修飾によってそれらの活性をもたらすことができるＤＮＡ配列に構造的に局在する密集タンパク質である。Ｏｃｔ／４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇに関連したＨ３ヒストンは、脱メチル化され、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇの発現を活性化し得る。
ＩＸ．ｉＰＳ細胞の培養および分化
開示された方法を用いてリプログラミング因子が体細胞に導入されたら、これらの細胞を、多能性を維持するのに十分な培地で培養することができる。本発明で作製された人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の培養は、霊長類多能性幹細胞、より具体的には、米国特許出願第２００７０２３８１７０号および同第２００３０２１１６０３号に記載されている胚性幹細胞を培養するために開発された技術および様々な培地を用いることができる。当業者には公知である、ヒト多能性幹細胞の培養および維持の別の方法も、本発明に使用できることを理解されたい。
特定の実施形態では、非限定条件を使用することができ：例えば、多能性細胞を、線維芽細胞のフィーダー細胞で、または幹細胞を未分化状態に維持するために線維芽細胞のフィーダー細胞に曝露された培地で培養することができる。別法では、多能性細胞は、限定されたフィーダー依存性培養系、例えば、ＴｅＳＲ培地（Ｌｕｄｗｉｇら、２００６；Ｌｕｄｗｉｇら、２００６）を用いて培養し、本質的に未分化状態に維持することができる。フィーダー依存性培養系および培地を用いて多能性細胞を培養し、維持することができる。これらの手法は、マウス線維芽細胞「フィーダー層」を必要とすることなく、ヒト胚性幹細胞を本質的に未分化の状態に維持することができる。本明細書に記載されているように、必要に応じてコストを削減するためにこれらの方法に様々な変更を加えることができる。
例えば、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞と同様に、ｉＰＳ細胞は、８０％ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＃１０８２９−０１８または＃１１９６５−０９２）、加熱不活化処理されていない２０％規定ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（またはヒトＡＢ血清）、１％非必須アミノ酸、１ｍＭのＬ−グルタミン、および０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノールで維持することができる。別法では、ｉＰＳ細胞は、８０％Ｋｎｏｃｋ−Ｏｕｔ ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＃１０８２９−０１８）、２０％血清代替物（Ｇｉｂｃｏ ＃１０８２８−０２８）、１％非必須アミノ酸、１ｍＭのＬ−グルタミン、および０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノールで調製された無血清培地で維持することができる。使用の直前に、約４ｎｇ／ｍＬの最終濃度なるようにヒトｂＦＧＦを添加することができ（国際出願第９９／２０７４１号）、または、実施例のように代わりにゼブラフィッシュｂＦＧＦを使用することができる。
様々なマトリックス成分を、ヒト多能性幹細胞の培養および維持に使用することができる。例えば、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニン、およびビトロネクチンを組み合わせて使用して、参照によりその全容が組み入れられるＬｕｄｗｉｇら（２００６ａ；２００６ｂ）に記載されているように、多能性細胞の増殖のための固体支持体を提供する手段として培養表面を被覆することができる。
また、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を用いて、ヒト多能性幹細胞の細胞培養および維持のための基質を提供することもできる。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）は、マウス腫瘍細胞によって分泌されるゼラチン状タンパク質混合物であり、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）から市販されている。この混合物は、多くの組織に見られる複雑な細胞外環境に類似しており、細胞培養の基質として細胞生物学者によって使用されている。
ｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞と同様に、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．）、ならびにＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１（Ａｎｄｒｅｗｓら、１９８７）に対する抗体を用いて免疫組織化学およびフローサイトメトリーによって同定または確認することができる特徴的な抗原を有する。胚性幹細胞の多能性は、８〜１２週齢の雄ＳＣＩＤマウスの後脚筋肉に約０．５〜１０×１０６の細胞を注入することによって確認することができる。奇形腫が発症し、それにより、３つの胚葉のそれぞれの少なくとも１つの細胞型が実証される。
様々な手法を本発明に用いて、ｉＰＳ細胞を、限定されるものではないが、造血細胞、筋細胞（例えば、心筋細胞）、ニューロン、線維芽細胞、および上皮細胞、ならびにこれらに由来する組織または器官を含む細胞系統に分化させることができる。ｉＰＳ細胞の造血分化の例示的な方法には、例えば、共に参照によりその全容が本明細書に組み入れられる米国特許出願第６１／０８８，０５４号および同第６１／１５６，３０４号に開示されている方法、または胚様体（ＥＢ）をベースとした方法（Ｃｈａｄｗｉｃｋら、２００３；Ｎｇら、２００５）が含まれ得る。フィブロネクチン分化法も、Ｗａｎｇら、２００７に例示されているように、血液系統への分化に使用することができる。ｉＰＳ細胞の心臓分化の例示的な方法には、胚様体（ＥＢ）法（Ｚｈａｎｇら、２００９）、ＯＰ９間質細胞法（Ｎａｒａｚａｋｉら、２００８）、または成長因子／化学法（参照によりその全容が全て本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００８００３８８２０号、同第２００８０２２６５５８号、同第２００８０２５４００３号、および同第２００９００４７７３９号を参照されたい）が含まれ得る。
Ｘ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含められている。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能するように本発明者によって発見された技術の代表であり、したがって、本発明の実施にとって好ましい方式を構成すると見なすことができることを当業者であれば理解するべきである。しかしながら、当業者であれば、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施形態で多くの変更が可能であり、変更しても同様または類似の結果が得られることを本開示から理解できよう。
実施例１
白血球除去法によるＰＢＭＣのアリコートの作製
白血球除去サンプル（ｌｅｕｋｏｐａｋ）を、８リットルの末梢血を遠心力場によって循環させるプロセスから得、単核細胞を濃縮して得られる約１２５ｍｌの容量中で赤血球の量を制限した。ｌｅｕｋｏｐａｋをさらに次のように処理した：ｌｅｕｋｏｐａｋバッグの一端をアルコールスワブで拭き取り、剃刀の刃でカットしてフラスコ内に注いだ。この容量を、ハンクス液で約５００ｍｌに希釈し、次いで５０ｍｌの容量の１６〜２９本の試験管に、試験管１本あたり３０ｍｌずつ分注した。試験管を、ブレーキおよび加速を行わずに４００ｇで３０分間回転させた。白色液を吸引し、新たな５０ｍｌ管に半分まで入れ、２５ｍｌのＰＢＳで一杯にした。この処理手順をさらに２回繰り返して、合計３回洗浄した。最後の洗浄の前に細胞を血球計でカウントした。収量は、３０〜６０本の試験管で、１本の試験管当たり１×１０８細胞であった。
全血を処理するために、採血血液を、抗凝結剤の入った試験管またはＣＰＴ管に入れた。ＣＰＴ管に入れた血液サンプルの処理について概略を述べる。手短に言えば、上相（血漿）約７〜８ｍｌを５０ｍｌ滅菌管に移す。カルシウムを含まないＰＢＳで５０ｍｌに希釈する。反転させて混合する。３００ＲＣＦで１５分間遠心分離する。ペレットを乱さずに、上清の約９５％を除去する。この上清を別の５０ｍｌ管に移す。試験管を叩いてペレットを穏やかに再懸濁する。２０ｍｌのカルシウムを含まないＰＢＳを添加する。反転させて混合する。半分（約１０ｍｌ）を１５ｍｌ管に移す。両方の試験管を３００ＲＣＦで１５分間遠心分離する。ペレットを乱さずに、できる限り多くの上清を除去する。Ｔ細胞に適した培地（ＡＩＭ−Ｖをベースとした培地）または後述されるＣＤ３４培地（Ｓｔｅｍ Ｐｒｏをベースとした培地）の２ｍｌを用いて５０ｍｌ管中でペレットを再懸濁し、ｃｅｄｅｘ細胞カウンターで生存細胞数をカウントする。
血液サンプルを、ＥＤＴＡのような抗凝結剤を含む試験管に集める場合は、処理工程には、赤血球の溶解、続く血液サンプルからのＦｉｃｏｌｌ勾配によるＰＢＭＣの分離が含まれる。サンプルを、初めにカルシウム−マグネシウムを含まない等容量のＰＢＳで希釈する。赤血球を、製造者の取扱説明書にしたがってＡＣＫ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて溶解する。赤血球を含まない細胞懸濁液を洗浄して、ｌｅｕｋｏｐａｋサンプルについて以前に記載したようにＦｉｃｏｌｌ勾配上に積層する。バフィーコートからＰＢＭＣを得て、カルシウム−マグネシウムを含まないＰＢＳで再び洗浄して、Ｔ細胞に適した培地（ＡＩＭ−Ｖをベースとした培地）またはＣＤ３４培地（Ｓｔｅｍ Ｐｒｏをベースとした培地）に再懸濁する。
実施例２
Ｔ細胞の活性化および増大
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｏｒｐ（Ｃｏｌｍａｒ、ＰＡ）ドナー＃３３２３１（「ドナーＡ」）から得た。白血球パックをＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）で処理して、上記されたようにＰＢＭＣを得て、これを次にはアリコートにして凍結させ、液体窒素中に保存した。アリコートを解凍し、３００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および１０ｎｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３クローン、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加した新たに調製したＡＩＭ−Ｖ培地＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ／グルタミン（ＡＩＶ−Ｖ／ｐｓ／ｓ／ｇ培地）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増殖させた。活性化から数日後に、指数関数的な増殖をＣＥＤＥＸ細胞カウンターで確認した。培養３日後に、細胞をＴ細胞表現型についてアッセイし、次いでリプログラミング因子で形質導入した。一実験では、Ｔ細胞表現型を、プレーティングの前または形質導入の後に確認しなかった。このＴ細胞活性化実験を複数回繰り返したところ、一貫して同じ結果が得られた。Ｔ細胞は、活性化後および形質導入後に培養物の９０％以上を占めた。Ｔ細胞がリプログラミング因子（複数可）で形質導入されたことが確認された。
Ｔ細胞の活性化および増大手順の詳細（表１）。ＰＢＭＣバイアルを解凍し、７５×１０６細胞を収集した（約３つのバイアル）。各ＰＢＭＣバイアルの内容物を、７ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／ｐ／ｓ／ｇ培地に添加した。細胞懸濁液を１２００ｒｐｍで４分間遠心分離した。ペレットを１０ｍｌのＡＩＭ−Ｖ＋ｐ／ｓ／ｇ中に再懸濁した。細胞濃度を、合計２８ｍｌでは１×１０６細胞／ｍｌ、合計２５ｍｌでは２×１０６細胞／ｍｌに調整した。ＩＬ２（３００ＩＵ／ｍｌ）およびＯＫＴ３（１０ｎｇ／ｍｌ）を細胞懸濁液に添加して混合した。各濃度の細胞を、２４ウェル組織培養プレートの１ウェルに付き１．５ｍｌをプレーティングし、３７℃でインキュベートした。合計すると、１×１０６細胞／ｍｌ（１．５ｍｌ／ウェル）の１８のウェルと２×１０６細胞／ｍｌ（１．５ｍｌ／ウェル）の１６のウェルを使用した。細胞数を確認し、第０日目として記録した。第０日目の細胞数を、指数関数的な増大を確認するために第３日目および第４日目の細胞数と比較した。
表１−Ｔ細胞の活性化および増大
実施例３
レトロウイルスの生産
レトロウイルスベクターＮａｎｏｇ ＲＦＰ、Ｌｉｎ２８ ＲＦＰ、Ｏｃｔ４ ｅＧＦＰ、およびＳｏｘ２ ｅＧＦＰを、既に記載されているように構築した（参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第６１／０８８，０５４号を参照されたい）。レトロウイルスベクターｃ−Ｍｙｃ ＲＦＰ、Ｋｌｆ４ ＲＦＰ、Ｏｃｔ４ ｅＧＦＰ、およびＳｏｘ２ ｅＧＦＰを同様に構築した。ｃ−Ｍｙｃの発現の潜在的な毒作用を中和するために、レトロウイルスベクターＳＶ４０ラージＴ遺伝子（ＳＶ４０ＬＴ）−ＲＦＰを構築し、一部の組み合わせに使用することができる（Ｙｕら、２００９）。
２９３Ｔ細胞の調製手順の詳細（表２）：トランスフェクションの約２４時間前に細胞を播種した。実施する実験に十分な容量のウイルス上清を得るために必要な細胞数を計算した。培地を吸引し、２９３Ｔプレートを５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、次いで吸引した。１枚の１０ｃｍプレートに付き１ｍｌの０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡを添加し、均等に分布させた。このプレートを室温で２〜５分間インキュベートし、手またはフードの壁部にしっかりと叩きつけて細胞を外し、４ｍｌのＤ１０Ｆを添加した。２９３Ｔ細胞を粉砕して（ピペットで３〜４回）単一細胞懸濁液にし、１５ｍｌ円錐管に移した。３００μｌの２９３Ｔ細胞を、ＣＥＤＥＸ細胞カウンターでカウントするために取り出した。細胞濃度を、Ｄ１０Ｆ培地で５×１０５細胞／ｍｌに調整した。１０ｍｌの細胞懸濁液を、実験に必要な１０ｃｍプレートのそれぞれにプレーティングした（１プレートに付き５×１０６細胞）。
表２−２９３Ｔ細胞の調製
レトロウイルス生産のための一過性のトランスフェクション：２９３Ｔ細胞を１枚の１０ｃｍ皿に付き５×１０６細胞で播種し、一晩インキュベートした。翌日、細胞をＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ）親油性試薬およびＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて１０μｇのＭＭＬＶレトロウイルスベクター、３μｇのＧａｇ／ｐｏｌ、１μｇのＮＦｋＢ、および１μｇのＶＳＶｇでトランスフェクトした。５００μｌのＯｐｔｉＭＥＭを４０μｌのＰＥＩと共に５分間インキュベートした。別個の試験管で、１０μｇのレトロウイルスベクター＋３μｇのＧａｇ／ｐｏｌ＋１μｇのＮＦｋＢ＋１μｇのＶＳＶｇを５００μｌのＯｐｔｉＭＥＭに添加した。ＰＥＩ／ＯｐｔｉＭＥＭ混合物をＤＮＡ／ＯｐｔｉＭＥＭ混合物に添加して合計約１ｍｌにし、２５分間インキュベートした。インキュベーション中に、レシピエント２９３Ｔプレートを、ＦＢＳが添加されていない１０ｍｌのＰＢＳ−／−および４ｍｌのＤＭＥＭで洗浄した。ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を、２９３Ｔ細胞に直接滴下添加した。４時間後に、培地を５ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／５０ｍＭのＨＥＰＥＳと交換し、インキュベートした。トランスフェクションの４８時間後に、高効率のトランスフェクションを確認するために２９３Ｔ細胞の蛍光を視覚化した。培地（５ｍｌ／プレート）を、ウイルス含有上清として収集した。上清を、後の形質導入のために孔径が０．８μｍのフィルターでろ過して収集した。
Ｔ細胞の増大および表現型の検証の詳細（リプログラミングの約１日前）：Ｔ細胞は、サイトカインおよび抗体の添加により、細胞集団の殆どを占めるはずである。検証は、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、および抗ＣＤ８フローサイトメトリー抗体で染色した表面によって行った。加えて、細胞のカウントを行った。解凍後の遅延を認めたが、細胞は、その数が第０日目から増加し；この細胞数を記録して、次の日の細胞数と比較して倍加を検証した。
実施例４
Ｔ細胞のレトロウイルス形質導入（第０日目）
ＩＬ２およびＯＫＴ３による活性化および増大の３日後に、細胞集団は、９７〜９９％がＴ細胞からなっていた。これらのＴ細胞を、レトロウイルス含有培地、３００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ２（組換えヒトＩＬ−２）、および４μｇ／ｍｌのポリブレンが添加された２ｍｌのＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）の容量中に１×１０６細胞／ウェルで再懸濁した。レトロウイルス含有培地は、リプログラミングに関与することが知られている数種の転写因子の１つと組み合わせたＭＭＬＶパッケージング要素での２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによって調製した。ウイルスを個々に調製した後に、培地を２つの異なるカクテルに混合してＴ細胞に曝露し；セット１は、転写因子Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ−４を発現するウイルスを含み、セット２は、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８を発現するウイルスを使用した。別々に、細胞を、コントロール形質導入として機能する６つのウイルスの１つに曝露した。細胞培養培地を、ウイルス含有培地に交換し、１０００×ｇ、３２℃で１．５時間遠心分離した（スピンフェクション（ｓｐｉｎｆｅｃｔｉｏｎ））。続いて、細胞を３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後に、１ｍｌの培地を慎重に吸引して、新鮮なＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに交換した。細胞を徐々に粉砕して混合し、均等な再懸濁液にした。粉砕後、培養物を、スピンフェクションの開始から１８時間インキュベートした。１８時間後に細胞を回収し、１０％ＦＢＳ＋ＩＬ２＋ポリブレンが添加された新鮮なウイルス上清＋ＤＭＥＭに再懸濁し、新たな２４ウェルプレートに再プレーティングし、上記のように２回目のスピンフェクションを行った。
レトロウイルスの回収およびＴ細胞の形質導入（第０日目）の手順の詳細：リプログラミング因子に加えて、各レトロウイルスは、蛍光タンパク質タグを有していた。したがって、高効率のトランスフェクションを確認するために、２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの４８時間後に蛍光顕微鏡によって視覚化した。２９３Ｔ培地（約５ｍｌ／プレート）を収集し、遠心分離してデブリを除去し、ウイルス含有上清を０．８μｍのシリンジフィルターに通してろ過し、別個の１５ｍｌまたは５０ｍｌ円錐管に入れた。ウイルスは、第０日目〜５日目まで４℃で保存した。Ｔ細胞を活性化し、Ｔ細胞が感染のとき（第３日目）に指数関数的に増殖しているかを確認するために連日カウントした。細胞を回収し、遠心分離し、ウイルス含有上清に再懸濁し、２４ウェルプレートに１ｅ１０６細胞／ウェルで播種した。１ウェル当たり使用した各ウイルスストックの容量を表３に示す（合計容量＝２ｍｌ）。６つの別個のコントロール形質導入を、個々のウイルスストックの感染力を確認するために行った。後者の形質導入の場合、１ｅ１０６細胞を５００μｌのウイルスストックの１つに再懸濁し、Ｄ１０Ｆおよび３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ２＋４μｇ／ｍｌのポリブレンを使用して総容量を２．０ｍｌに調整した。すべてのリプログラミング試験は、２連または３連で行った。非形質導入細胞は、陰性コントロールとして使用した。
表３−Ｔ細胞のリプログラミング用のウイルス上清
プレートを、加速度を約４、ブレーキを約４に設定して、１０００ｇ、３２℃で１．５時間スピンフェクションを行った。スピン後、プレートをインキュベーターに移して４時間インキュベートした。４時間のインキュベーションの後、プレートをぶつけないように慎重にフードに移した（細胞をウェルの底に沈降させたまま）。プレートをフード内で５分間放置した。１ｍｌの培地／ウイルスを、Ｐ１０００ピペッターを用いてウェルの上部から慎重に吸引した。１ｍｌの新鮮なＤ１０Ｆおよび３００ＩＵのＩＬ２を添加した後、プレートを３７℃で１８時間インキュベートした。未使用のウイルス上清はすべて、２回目の感染のために４℃で保存した。
Ｔ細胞の２回目の形質導入の手順の詳細（第１日目）：初めのスピンフェクションの開始（第０日目）から２４時間後に、すべてのウェルの細胞を、滅菌の蓋が付いたＦＡＣＳ管に個々に集め、１２００ｒｐｍで４分間遠心分離した。上清を、各管／ウェルについて、新鮮な１０μｌ非ろ過チップ（ｎｏｎ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ ｔｉｐ）を用いてガラス吸引器で吸引した。細胞を、上記されたように適切なウイルス（複数可）、ＩＬ２、およびポリブレンに再懸濁した。細胞を、同じプレートの未使用のウェルまたは新たな２４ウェルプレートにプレーティングした（初めの形質導入のウェルは再使用しなかった）。続いてスピンフェクションを行い、上記の工程を繰り返した。
Ｔ細胞の増大を検証する手順の詳細（第１日目）：Ｃｅｄｅｘ細胞カウントを、形質導入されていないサンプルの残りのウェルに対して行った。この時点で、細胞は、第０日目から数では指数関数的に増加していた。この細胞数を記録し、前日の細胞数と比較して倍加を検証した。このウェルは、陰性コントロールとして、ならびに任意のさらなる試験のために維持した。このウェルの細胞は、培地を半分交換し、必要に応じて３００ＩＵ ＩＬ２／ｍｌのＩＬ２を供給した。
実施例５
形質導入Ｔ細胞のＭＥＦへのプレーティング
ＭＥＦプレーティング：形質導入細胞またはｉＰＳコロニーを導入する１日〜３日前に、ゼラチン被覆６ウェルプレートまたは１０ｃｍ皿にＭＥＦをプレーティングした（ＭＥＦのプレーティングは、形質導入の１日前が最適であり得る）。
Ｔ細胞の増大および形質導入効率の検証：Ｔ細胞の同一性を、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、および抗ＣＤ８を用いたフローサイトメトリー表面染色によって活性化の２〜３日後に検証し、ならびに形質導入後に、形質導入に成功した細胞集団を検証した。第０日目、第２日目、第３日目、および第４日目にＣＥＤＥＸ細胞カウントを行って指数関数的増加、したがってＭＭＬＶレトロウイルスへの感染のしやすさを確認した。
形質導入Ｔ細胞のＭＥＦへのプレーティング：初めの形質導入の後の第３日目に、成功および効率の推定値を、上に列記した蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーによって検証した。形質導入細胞を、２つの細胞濃度（５×１０６および２×１０６）で、ＦＧＦを含まない（ＩＬ２も他のサイトカインも添加されていない）Ｄ１０Ｆ：ｈＥＳの５０：５０の組み合わせ培地が入っている１０ｃｍ皿ＭＥＦプレートに添加した。細胞をインキュベートし、１日おきに栄養補給した。
照射されたＭＥＦをプレーティングする手順の詳細：ＭＥＦを、形質導入細胞を導入する１〜３日前にプレーティングした。１０ｃｍプレートの必要な数を計算した（１枚の１０ｃｍプレートに付き５００ｋの形質導入細胞；転写因子（セット１またはセット２）、非形質導入コントロール、ｃ−Ｍｙｃのみのコントロール、ＭＥＦのみのコントロール−５枚のプレート＋）。０．１％ゼラチンを用いて１０ｃｍプレートを少なくとも１時間被覆し、続いて吸引した。１５ｍｌの照射ＭＥＦ細胞懸濁液（約７．５×１０４細胞／ｍｌ）を各１０ｃｍプレートに添加した。翌日、細胞をチェックしてＭＥＦが結合していることを確かめた。
形質導入Ｔ細胞の照射ＭＥＦへの移入のための手順の詳細（第３日目）：蛍光顕微鏡を用いて形質導入を検証した。フローサイトメーターを用いて形質導入を検証し、形質導入の効率を決定した。最小で２０％の効率が、リプログラミング（ＭＥＦへのプレーティングなど）を実施する要件と見なされる。ＧＦＰ／ＲＦＰ分析および表面染色を実施して、Ｔ細胞の形質導入が他の細胞集団に無関係であることを検証した。１００μｌの細胞をＦＡＣＳ管に収集して、１２００ｒｐｍで４分間回転させた。上清を吸引し、細胞を５ｍｌ
のＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、再び遠心分離した。ペレットを１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、または抗ＣＤ８フローサイトメトリー抗体で染色した。細胞をフローサイトメーター上で分析して、ＣＤ３＋細胞（Ｔ細胞）が形質導入されたこと、形質導入されたサブセットが何であるかを検証した。培地を、照射ＭＥＦプレートから吸引し、７．５ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを添加した。５×１０５の形質導入Ｔ細胞を収集し、１２００ｒｐｍで４分間遠心分離し、ｂＦＧＦを含まない７．５ｍｌのｈＥＳ培地に再懸濁した。Ｔ細胞を、照射ＭＥＦプレートに滴下添加した。ＩＬ２および他のサイトカインは添加しなかった。次いで、ＭＥＦプレートを３７℃でインキュベートした。
実施例６
ＭＥＦがプレーティングされた形質導入細胞の維持および栄養補給
第５〜９日目：１００ｎｇ／ｍｌのゼブラフィッシュＦＧＦが添加されたｈＥＳ培地（ＣＭ）を用いて、各リプログラミング１０ｃｍプレートに対して半分の培地交換を行った。細胞の懸濁ロスを最小限にすると共に培地補充の正の効果を最大限にするために、新たな栄養補給戦略を開発した。簡単に述べると、５つの１０ｃｍ皿の蓋を、皿を傾けるための支持体として使用した（そしてすべての後の栄養補給のために再使用した）。皿は、軽く付着したどの細胞も乱さないようにインキュベーターから慎重に取り出した。プレートを、確保しておいた（ｒｅｓｅｒｖｅｄ）蓋の上に、ＭＥＦ／細胞が一切露出しない一定角度でセットした。細胞を１０分間沈降させた。沈降期間の後、各蓋を取り外して、７．５ｍｌを、プレートの底部に対して水平な培地の最上部から慎重に／ゆっくりと吸引した。この取り出された培地を収集し、１２００ｒｐｍで４分間遠心分離し、１ｍｌの培地に再懸濁し、ＣＥＤＥＸでカウントして、細胞ロスが１％未満であることを確認した。次いで、７．５ｍｌの新鮮な培地を、細胞を乱さないように慎重に円を描くように滴下添加し、皿をインキュベーターに戻した。この方法は、定期的な培地交換を可能にすると共に細胞ロスを最小限にするという目的を果たす。第９〜３０日目：１００ｎｇ／ｍｌのゼブラフィッシュｂＦＧＦが添加されたＭＥＦ順化ｈＥＳ培地（ＭＥＦ−ＣＭ）を用いて、各リプログラミング１０ｃｍプレートに対して半分の培地交換を行った。
維持および栄養補給スケジュールの手順の詳細（第５〜３０日目）：第５〜９日目：１００ｎｇ／ｍｌのゼブラフィッシュＦＧＦが添加されたｈＥＳ培地（ＣＭ）を用いて、各リプログラミング１０ｃｍプレートに対して半分の培地交換を行った。５つの１０ｃｍ皿の蓋を、皿を傾斜させる支持体として後の栄養補給すべてに使用するために集めた。１０ｃｍリプログラミング皿をインキュベーターから取り出し、プレートは一定の角度になるがＭＥＦ／細胞が露出しないように確保しておいた蓋の上にセットした（培地は、全表面を覆ったまま、底に溜まり、こぼれないようにするべきである）。皿を１０分間落ち着かせた。この落ち着かせる期間の後、各蓋を取り外して、７．５ｍｌの上清を、プレートの底部に対して水平な培地の最上部から慎重にゆっくりと吸引した。上清、すなわち吸引した培地を収集し、１２００ｒｐｍで４分間遠心分離し、１ｍｌの培地に再懸濁し、ＣＥＤＥＸでカウントした。細胞ロスが１％未満であることが確認された。７．５ｍｌの新鮮な培地を、細胞を乱さないように慎重に円を描くように滴下添加し、インキュベーターに戻した。栄養補給計画は、リプログラミングプレートに対して１日おきに開始した。第９〜３０日目：１００ｎｇ／ｍｌのゼブラフィッシュＦＧＦが添加されたＭＥＦ順化ｈＥＳ培地（ＭＥＦ−ＣＭ）を用いて、各リプログラミング１０ｃｍプレートに対して半分の培地交換を行った。栄養補給は、第５〜９日目と同様にこの培地で行った。
実施例７
ｉＰＳコロニーの同定および採取
活性化され増大しているＴ細胞は、特徴的な細胞形態およびクラスター形成挙動を示した。レトロウイルス形質導入効率の検出を、初めの形質導入から７２時間後のＧＦＰおよびＲＦＰ発現によって判定し、約３週間にわたって導入遺伝子が抑制され、ｈＥＳ細胞表現型を示した。明確なｉＰＳ細胞コロニーが、第２３日目に出現し始めた。ＧＦＰおよびＲＦＰサイレンシングは、蛍光顕微鏡によって検証され、コロニーを、ピペットチップで採取して剥離フードに入れた。次いで、コロニーの断片を、照射ＭＥＦを含む新たな６ウェルプレートに移した。コロニーの数をカウントして、プレーティングされた投入細胞数を考慮してリプログラミング効率を推定した。この時点から、クローンコロニーに毎日栄養補給し、手作業でもう１回継代し、次いで詳細が後述されるように増大させた。
手順の詳細：形態学的に、ｉＰＳ細胞コロニーは、高密度であり、拡大した核および２つの別個の核小体をもつ緻密な小細胞からなる。コロニーの境界は、通常は明確であった。ｉＰＳコロニーは、組み込まれたウイルスＤＮＡからのＧＦＰおよびＲＦＰの発現を抑制した。一部の真正のコロニーは、形質導入から約２０日後に蛍光を消失し、一部の真正のコロニーは、感染から約３５〜４０日後に採取され移されてから蛍光を消失した。ここで観察されたコロニーでは、すべてのコロニーが、ＧＦＰおよびＲＦＰを発現しなかった（ただし、ある程度の発現が、近傍の単一細胞で確認された）。これは、細胞型間で様々であり、特に線維芽細胞と比較すると異なり得る。手作業で採取するために、ピペットチップを、「三目並べ盤（ｔｉｃ ｔａｃ ｔｏｅ ｂｏａｒｄ）」式にコロニー上に直接引いて３〜６の断片に分割し、幹細胞が周囲のＭＥＦおよびＴ細胞から離れやすくした。採取は、総コロニーのカウントの混乱を避けるため、すなわちコロニーの小塊が残ったときに、これが再定住して新たなクローンとして誤ってカウントされないようにするため、複数のコロニーが形成されるまでは避けた。次いで、細胞を、ｈＥＳ培地および１００ｎｇ／ｍｌのゼブラフィッシュｂＦＧＦが添加されたＭＥＦを含む６ウェルプレートの受入ウェルに直接移した。クローンが実際に完全にリプログラミングされたことを確信するために、増殖、形態、および蛍光の消失を１〜２週間にわたって監視した。採取後の１日は細胞に栄養補給しなかったが、以降は毎日栄養補給した。採取してプレーティングしたコロニーが接着して特徴的なＥＳ様形態を示したら、これらのＥＳ様コロニーを、上記のように再び手作業で６ウェルの照射ＭＥＦプレートの新たなセットに移し、毎日栄養補給した。ウェルがコンフルエントになると、細胞は、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼで通常のｉＰＳ細胞系として継代された（Ｙｕら、２００７）。ｉＰＳ細胞を、様々な継代で凍結し、各セットに対して試験解凍を行った。
クローンｉＰＳコロニーは、第２３〜３０日目に２１のコロニー（第３０日目の時点では、すべてがセット１の因子から）を形成し、７つのコロニーは、高い形質導入細胞播種密度（１枚の１０ｃｍ皿に付き２×１０６）からのものであり、１４のコロニーは、低密度（１枚の１０ｃｍ皿に付き５×１０５）からのものであった。別のコロニーが成長しないと判定するまで皿に栄養補給した。すべてのｉＰＳ系を得て、凍結し、増大させた。
実施例８
ヒト末梢血Ｔリンパ球からの人工多能性幹細胞の誘導
１×１０６細胞を含む活性化されたＴ細胞が富化された集団を、蛍光マーカー遺伝子に連結されたリプログラミング因子（ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ｃ−Ｍｙｃ、またはＫＬＦ４）の１つをそれぞれがコードする４つの別個のベクターでレトロウイルス形質導入を２回（第０日目と第１日目）行った（代表的なベクターマップが図１０に示されている）。形質導入効率を、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーで第３日目に評価した。ＣＤ３の染色は、形質導入集団が９９％±１％ＣＤ３＋であることを示した（図２Ａ）。
Ｔ細胞は、全血中に豊富に存在すること（健常な成人では約６．５×１０５〜３．１×１０６／ｍｌ）（ＬｉｃｈｔｍａｎおよびＷｉｌｌｉａｍｓ、２００６）、十分に確立されたプロトコルを用いた培養が容易なこと（Ｊｏｈｎｓｏｎら、２００９；Ｍｏｒｇａｎら、２００６）から、リプログラミングの出発材料として良く適している。Ｔ細胞の増殖および効率的なレトロウイルス形質導入を促進するために、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ｉＰＳ細胞にリプログラミングするために白血球アフェレーシスまたは標準的な静脈穿刺（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（著作権）ＣＰＴ管）で単離した（図１）。非動員ドナー由来ＰＢＭＣを、無血清培地中ＩＬ−２の存在下、抗ＣＤ３抗体で活性化し、増大させた（図２Ａ）。これは、平均第３日目の純度が９０％±７％のＣＤ３＋からなる成熟ＣＤ３＋Ｔ細胞の好ましい増大をもたらした（図２Ａ）。
次いで、大部分がＴ細胞に向かってスキューされた（ｓｋｅｗｅｄ）細胞集団にリプログラミング因子を形質導入した。形質導入されたＴ細胞を含む細胞集団を、１００ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）が添加されたｈＥＳＣ培地中の照射マウス胎仔性線維芽細胞（ＭＥＦ）上に置いた。ｉＰＳＣコロニーが、第２３日目に初めて観察された。Ｔ細胞のリプログラミング効率を、ｈＥＳＣ様形態のコロニーの数を形質導入細胞の投入数で除して推定したところ、約０．０１％と決定され、発表された線維芽細胞およびＣＤ３４＋細胞リプログラミング効率（Ｙｕら、２００７；Ｌｏｈら、２００９）に類似していた。
ＴｉＰＳを、白血球アフェレーシスによるサンプル（ヒスパニック系成人男性から、「ＴｉＰＳ−Ｌ」と呼ばれる系）および全血Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（著作権）によるサンプル（白人成人男性から、「ＴｉＰＳ−Ｖ」と呼ばれる系）の両方から作製した。いずれの場合も、リプログラミングは、１ｍｌの全血中のＴ細胞の総計に等しい投入細胞数を用いて達成した。ｈＥＳＣ形態を示すコロニーは、ＭＥＦ上で増大し、クローンは、ｍＴｅＳＲ培地およびＭａｔｒｉｇｅｌ被覆プレートを用いて無フィーダー条件下での維持に成功した。
多能性は、フローサイトメトリー（図２Ｂ）およびアルカリホスファターゼ染色（図８）を用いてｈＥＳＣ多能性マーカーＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−８１、およびＯＣＴ４の発現によって検証した。
ＴｉＰＳが、開始ドナーＴ細胞集団と遺伝的背景を共有していることを検証して細胞系の交差汚染を排除するために、ＤＮＡフィンガープリント法も実施した（図７）。短縦列反復（ＳＴＲ）分析により、ｉＰＳコロニーがドナーの遺伝物質に由来することが示された。ドナーＰＢＭＣおよびｉＰＳ系は、男性特異的であり、分析された８つのＳＴＲ遺伝子座における１５の対立遺伝子多型に対して互いに同一である（以下の表４）。
表４．多型による細胞同一性の確認

ＴＣＲβ鎖再構成のマルチプレックスＰＣＲ検出によりＴｉＰＳ系のＴ細胞の起源が確認された（図２Ｃ）。Ｔ細胞は、ＴＣＲβ鎖における１つの増殖性Ｖ−Ｊ再構成を有し、ＴｉＰＳ細胞になった後はこの特徴的な遺伝子配列を維持するはずであり；最も一般的なβ鎖再構成ＰＣＲ増幅用の様々なプライマーを組み合わせるマスターミックスの使用により、ＡＢＩ ３７３０ ＤＮＡアナライザーでの断片分析エレクトロフェログラムによる決定で、固有のサイズおよび配列の１つのバンドが示された。線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、「Ｆｉｂ−ｉＰＳ」を陰性コントロールとして用いた。
ＴｉＰＳクローンは、ヒト胚性幹細胞マーカー遺伝子ＤＮＭＴ３８、ＬＥＦＴ８、ＮＯＤＡＬ、ＲＥＸ１、ＥＳＧ１、ＴＥＲＴ、ＧＤＦ３、およびＵＴＦ１を発現した（図３Ａ）。全ＲＮＡを、Ｈ１ ｈＥＳ細胞、Ｆｉｂ−ｉＰＳ（線維芽細胞由来）、一次ドナー由来Ｔ細胞、およびＴｉＰＳクローンから単離した。ＴｉＰＳ１ｅｅおよびＴｉＰＳ１ｂをＲＴ−ＰＣＲを用いて分析した。さらなる特徴付けにより、導入遺伝子の宿主ゲノムへの組み込みの他、リプログラミングが成功した後の導入遺伝子の抑制が実証された（図３Ｂ〜図３Ｃ）。ＴｉＰＳは、上記のすべてのアッセイにおいて、ｈＥＳＣ系Ｈ１および線維芽細胞由来ｉＰＳＣ系コントロールの両方に類似していた。リプログラミング遺伝子の内因性および外因性（導入遺伝子）発現が、導入遺伝子の発現の抑制によって明らかなように完全なリプログラミングを示した（図３Ｃ）。ＧＡＰＤＨを、ＡとＢの両方において増幅コントロールとして使用した。ゲノムＤＮＡを単離し、このゲノムＤＮＡを、目的の遺伝子用の順方向プライマーおよびＩＲＥＳ用の逆方向プライマーを使用するＰＣＲによって分析して、リプログラミング遺伝子の組み込みを確認した（図３Ｂ）。ＯＣＴ４順方向および逆方向プライマーを、ＰＣＲ反応コントロールとして使用した。
ＴｉＰＳクローンは、フローサイトメトリー分析（図３Ｄ）、アルカリホスファターゼ染色、およびＧｂａｎｄｉｎｇ染色体分析による核型分析によって示されるように、ヒト胚性幹細胞特異的多能性マーカーを発現した。系統は、複数回の継代後も核型的に正常であり、正常な核型を維持したまま、培養物中で増殖して３０回以上継代した（図９）。
最後に、ＴｉＰＳ細胞系を、それらのｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化能を決定するために評価した。ＴｉＰＳクローンは、３つすべての胚葉からの誘導に一致する、奇形腫を含む組織を形成した（図４Ａ）。細胞系を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、様々な方向の分化プロトコルで外胚葉系統および中胚葉系統に分化するそれらの能力についてもアッセイした。これらのクローンは、ニューロン、拍動する心臓トロポニンＴ陽性心筋細胞、および多能性顆粒球−赤血球−マクロファージ−巨核球（ＧＥＭＭ）造血細胞を産生することができた（図４Ｂ〜図４Ｅ）。
ＴｉＰＳは、複数の細胞型に分化した。ＴｉＰＳは、以下の方法によって心筋細胞に分化した。ＴｉＰＳクローンは、胚様体（ＥＢ）を形成し、ＨＧＦ／ｂＦＧＦ媒介心臓誘導によって心筋細胞に分化した（図４Ｃ）。拍動する心筋細胞凝集体が、第１４日目に観察された。ＴｉＰＳは、血液にも分化した（図４Ｅ）。造血始原細胞（ＨＰＣ）は、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＦＧＦ−２の組み合わせを用いてＥＢから誘導した。ＴｉＰＳ１ｅｅ由来ＨＰＣの機能特性を、コロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイを用いて決定した。ＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−Ｅ、およびＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニーが第１２日目に観察された。
要約すると、ｉＰＳ細胞を、非動員ドナーの末梢血由来のＴ細胞から作製するのに成功した。出発材料の量は、標準的なｖａｃｕｔａｉｎｅｒからの出発材料の１ｍｌに適応可能であった。ＴｉＰＳは、ホストの材料の同一性を反映した。ＴｉＰＳは、正常なヒトＥＳ細胞および他の細胞供給源由来のｉＰＳ細胞の顕著な特徴も有していた。ＴｉＰＳは、拍動する心筋細胞凝集体および血液細胞を含む複数の細胞型にさらに分化した。
ＴｉＰＳクローンとｈＥＳＣ系または線維芽細胞由来ｉＰＳＣ系との間の分化能における有意差は観察されなかった（図４Ｄ〜図４Ｅ）。ｉＰＳＣゲノムにおけるＴＣＲ遺伝子再構成の持続がもたらす、後の分化に対する潜在的な影響を試験することができる。
ＴＣＲ再構成は、実際、誘導奇形腫における親系クローンＴＣＲβ鎖再構成の検出によって実証されるように、ｉＰＳＣクローンのトラッキングなどの特定の状況で利点を証明することができる（図５）。さらに、Ｔ細胞への再分化のときに、ＴｉＰＳ細胞は、それらの予め再構成されたＴＣＲ遺伝子の発現によってもたらされるＴＣＲ対立遺伝子排除の機序によって、規範胸腺発生配列における重要な工程を回避し得る。この現象は、Ｔ細胞発生の研究で探求できる。
挿入変異誘発および他の潜在的な細胞機能の破壊が、レトロウイルス・リプログラミング・プロトコル（Ｍｉｒｘｈｗｌｌら、２００４）を使用すると起こり得ることに留意されたい。エピソームリプログラミング法の使用における近年の進展により、これらの問題に対処することができ、これらの代替の方法によってＴ細胞をリプログラミングする試みが進行中である（Ｙｕら、２００９；Ｚｈｏｕら、２００９）。さらに、このようなエピソームによりリプログラミングされたＴｉＰＳ細胞の潜在的な治療用途の興味深い例は、腫瘍関連抗原に特異的な内因性ＴＣＲ遺伝子を有する、組込みのない造血幹細胞を分化させる供給源としてである（ｖａｎ Ｌｅｎｔら、２００７）。
マウスで最終分化したＢリンパ球をリプログラミングする以前の報告は、細胞の同一性に関連した転写因子の追加またはノックダウンを必要とし、ドキシサイクリン誘導発現系（Ｈａｎｎａら、２００８）を使用した。近年、マウスＴ細胞のリプログラミングの論文が発表され、このリプログラミングでは、ｉＰＳＣ作製の成功のためにｐ５３遺伝子のノックアウトを必要とした（Ｈｏｎｇら、２００９）。抗増殖経路の操作を伴う実験（Ｌｉら、２００９；Ｍａｒｉｏｎら、２００９；Ｋａｗａｍｕｒａら、２００９；Ｕｔｉｋａｌら、２００９）により、リプログラミングの機序についての洞察が得られ、そしてその実験ではリプログラミング効率を著しく増大させることができる。しかしながら、上記のどの操作も、ヒトＴ細胞のウイルスリプログラミングの成功には必要ないようである。加えて、本発明者らのデータと、成人ＣＤ３４＋造血始原細胞のリプログラミングに使用される方法論（Ｌｏｈら、２００９；Ｙｅら、２００９）とを結びつけ、今や、投入細胞の分化段階とリプログラミング効率と関連付けるマウス系での近年の観察結果（Ｅｍｉｎｌｉら、２００９）を調べるための初代のヒト系を提供する。
臨床的に有利な少容量の非動員ヒト末梢血からのｉＰＳＣの誘導が発見された。Ｔ細胞は、低侵襲的に多数のドナーから採取して、十分に確立されたプロトコルで培養できるリプログラミング用の豊富な細胞供給源の代表である。実験で、ＴｉＰＳは、ｈＥＳＣ系および線維芽細胞由来ｉＰＳＣ系と同様の特性および分化能を有することが見出された。加えて、ＴｉＰＳは、ｉＰＳＣクローンのトラッキング、Ｔ細胞の発生、およびｉＰＳＣ技術の治療への適用を探求する新規なモデルを提供する。
材料と方法
細胞増殖培地および塩基性線維芽細胞成長因子−ｉＰＳＣ系を、既に記載された方法を用いて維持した（Ｙｕら、２００７）。ゼブラフィッシュｂＦＧＦを、既に記載されているようにすべての実験でヒトｂＦＧＦの代わりに使用した（Ｌｕｄｗｉｇら、２００６ａ）。
線維芽細胞ｉＰＳＣ系−「Ｆｉｂ−ｉＰＳ」と呼ばれるコントロール線維芽細胞由来ｉＰＳＣ系を、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得たＩＭＲ９０細胞を用いて、既に記載されているように作製した（Ｙｕら、２００７）。
Ｔ細胞の活性化および増大−末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、リンパ球分離培地（Ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）で処理されたＨＬＡ−Ａ２陽性ヒスパニック系成人男性ドナー（「ドナーＬ」）白血球パック（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｏｒｐ、Ｃｏｌｍａｒ、ＰＡ）から得た。加えて、全血サンプルを、Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（著作権）ＣＰＴ（商標）管（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）での標準的な静脈穿刺によって血液型不明の白人男性ドナー（「ドナーＶ」）から採取し、製造者の推奨にしたがって遠心分離によってＰＢＭＣを収集した。血液サンプルは、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃｏｌｍａｒ、ＰＡ、ＵＳＡ）が承認したＤｅｃｌａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｌｓｉｎｋｉ ａｎｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄにしたがった同意書を基に得た。Ｔ細胞を、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ／グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋３００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）および１０ｎｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＯＫＴ３クローン、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）が添加された新たに調製されたＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で増大させた（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ、２００５；Ｂｅｒｇｅｒら、２００３）。増殖を、培養から３日後にＣＥＤＥＸ（Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ、Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）細胞カウンターによって検証し、この時点で、細胞をＴ細胞表現型についてアッセイし、次いでリプログラミング因子を形質導入した。
レトロウイルス作製のための一過性トランスフェクション−レトロウイルスを、ポリエチレンイミン（「ＰＥＩ」）親油性試薬（４０μｇ／１０ｃｍプレート）を用いて、それぞれが４つのリプログラミング遺伝子および蛍光マーカー遺伝子（ＧＦＰまたはＲＦＰ）をコードする１０μｇのレトロウイルスベクター（モロニーマウス白血病ウイルス）主鎖、３μｇのＧａｇ−Ｐｏｌ、ＮＦｋＢの誘導体をコードする１μｇのプラスミド、および１μｇの水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質を用いて、７０〜８０％コンフルエンスの１０ｃｍプレート内で２９３Ｔ細胞をトランスフェクトすることによって作製した。４時間後、培地を、５ｍｌのＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）および５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に交換した。ウイルス上清を、トランスフェクションの４８時間後に収集し、遠心分離し、０．８μｍの孔径のフィルターに通した。
スピンフェクションによるレトロウイルス形質導入−１ウェルに付き１×１０６の活性化ドナー細胞を、４つのレトロウイルス上清＋４μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および３００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ−２の混合物に入れて、１０００×ｇ、３２℃での１．５時間の遠心分離によって「スピンフェクション」を行った。スピンフェクション後、プレートの培地を半分交換し、一晩インキュベートした。翌日、細胞を遠心分離によって回収し、２回目のスピンフェクションを行った。
Ｔ細胞の増大および形質導入効率の検証−Ｔ細胞同一性を、抗ＣＤ３抗体（ＢＤ、クローンＨＩＴ３ａ）を用いたフローサイトメトリー表面染色による活性化の３日後に検証し、形質導入後にどの細胞集団が形質導入に成功したかを検証した。サンプルを、Ａｃｃｕｒｉ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）フローサイトメーターにかけた。ＣＥＤＥＸ細胞カウントを第０日目、第３日目、および第４日目に行って、増大と、これによるＭＭＬＶレトロウイルス感染のしやすさを確認した（データは示していない）。
ＭＥＦへの形質導入Ｔ細胞のプレーティング−初めの形質導入から７２時間後に、上に列記された蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーによって形質導入の成功および効率の推定値を検証した。５×１０５の形質導入細胞をＭＥＦが播種された１０ｃｍプレートに添加し、１〜３日後にｚｂＦＧＦ（または別のサイトカイン）を含まないＤ１０Ｆ：ｈＥＳＣが５０／５０の組み合わせ培地中においた。細胞をインキュベートし、１日おきの半分の培地交換によってｈＥＳＣ培地＋１００ｎｇ／ｍｌのｚｂＦＧＦ（第１週）またはＭＥＦ順化培地＋１００ｎｇ／ｍｌのｚｂＦＧＦ（第２週以降）で栄養補給した。栄養補給中の細胞ロスを回避するために、プレートを１０分間やや傾けて細胞を沈降させ、培地を培地層からゆっくりと除去した。
ｉＰＳＣコロニー確認および採取−明確な境界および典型的なｈＥＳＣ形態をもつコロニーが、概ね第２３日目に出現し始めた。ＧＦＰおよびＲＦＰサイレンシングを、蛍光顕微鏡で検証し、コロニーの数をカウントして、プレーティングされた投入細胞数を考慮してリプログラミング効率を推定した。コロニーを手作業で回収し、ＭＥＦに移し、確立されたプロトコル（ＭａｈｅｒａｌｉおよびＨｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ、２００８；Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８）にしたがって増大させた。リプログラミング効率の推定値は、推定ｉＰＳＣコロニーの総数を形質導入細胞の投入数で除して得た。回収後に残った偽陽性再播種コロニーが含まれないように、コロニー回収（第２５〜３０日目）後にカウントを中止した。
ＤＮＡフィンガープリント法−ＴｉＰＳ細胞系およびドナーＰＢＭＣを、短縦列反復（ＳＴＲ）の分析のためにウィスコンシン大学のＨｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に送付した。８つのＳＴＲ遺伝子座の遺伝子型をＴｉＰＳ細胞サンプルのＤＮＡから決定した。
核型分析−ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）がＧバンド分析を行った。
Ｔ細胞受容体β鎖再構成分析−ゲノムＤＮＡを、製造者のプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅキットを用いる）にしたがってドナーＴ細胞、ＴｉＰＳ細胞系、および陰性コントロールとして使用される線維芽細胞（非Ｔ細胞）由来ｉＰＳＣ系から単離した。加えて、ＤＮＡを、まず組織および細胞サンプルをＴｒｉｓ、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ、ＳＤＳ、およびプロテイナーゼＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む緩衝液に溶解することによって凍結奇形腫サンプルおよび親細胞系から単離した。次いで、ＤＮＡを飽和ＮａＣｌおよびエタノールで沈降させ、ＰＣＲ分析のために水に再懸濁した。大部分のクローンＴＣＲβ鎖再構成（ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎら、２００３）に特異的なマルチプレックス・プライマー・キット（Ｉｎｖｉｖｏｓｃｒｉｂｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いてＰＣＲを行った。キャピラリー電気泳動法およびＰＣＲ産物の断片の分析を、ＡＢＩ ３７３０ ＤＮＡアナライザーを用いてウィスコンシン大学のＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で行った。Ｐｅａｋ Ｓｃａｎｎｅｒソフトウエア（ＡＢＩ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いてデータを分析した。
アルカリホスファターゼ（ＡＰ）染色−ＭＥＦで増殖したコンフルエント細胞を、製造者のプロトコルにしたがってベクターブルーアルカリホスファターゼ基質キットＩＩＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＳＫ−５３００、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）でＡＰ染色した。
導入遺伝子およびｈＥＳＣマーカー遺伝子の発現についてのＲＴ−ＰＣＲ−全ＲＮＡを、製造者のプロトコルにしたがってＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を用いて単離した。第１鎖ｃＤＮＡ合成を、製品プロトコルにしたがってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ第１鎖合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてオリゴｄＴプライマーで行った（既に記載されているように（Ｙｕら、２００９；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７））。ｃＤＮＡを１：２に希釈し、ＰＣＲ反応をマスターサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｕｐｐａｕｇｅ、ＮＹ）を用いてＧｏＴａｑ Ｇｒｅｅｎマスターミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で行った。
ウイルス組み込みのＰＣＲ分析−ゲノムＤＮＡを、培養細胞についての製造者のプロトコルにしたがってＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて１〜５×１０６のｉＰＳＣから単離した。ゲノムＤＮＡ（５μｌ）をＰＣＲ反応に使用し、ＧｏＴａｑ Ｇｒｅｅｎマスターミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてウイルス取り込みを調べた。導入遺伝子のみを検出し、内因性遺伝子を検出しない特定のプライマーのセットを使用した。内因性ＯＣＴ４用のプライマーは、反応の陽性コントロールとして機能した。反応は、既に記載されているようにプライマーを用いて行った（Ｙｕら、２００９；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７）。
フローサイトメトリー：ｉＰＳＣ系細胞内および表面多能性マーカーの特徴付け−Ｍａｔｒｉｇｅｌに維持されたＴｉＰＳを回収し、Ｔｒａ−１−８１（ＢＤ ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎまたはＳｔｅｍｇｅｎｔ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、両者ともクローンＴｒａ−１−８１）、ＳＳＥＡ−３（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、クローンＭＣ６３１）、およびＳＳＥＡ−４（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、クローンＭＣ８１３−７０）の存在について染色した。細胞内ＯＣＴ４（ＢＤ、クローン４０／Ｏｃｔ−３）染色を、２％パラホルムアルデヒドで固定され、ＰＢＳ＋０．１％サポニンで透過化された細胞に行った。細胞を一晩染色し、翌日、Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーターで分析した。
造血分化およびコロニー形成単位アッセイ−未分化ＴｉＰＳを、Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆プレートの無フィーダー条件に適応させ、ｍＴｅＳＲ培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）を用いて維持した。コロニーを、ＴｒｙｐＬＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて回収し、低接着プレート内の無血清胚葉体（ＥＢ）基本培地［ＩＭＤＭ、ＮＥＡＡ、グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および２０％ＢＩＴ−９５００（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびＲＯＣＫ阻害剤Ｈ１１５２を含む］に入れて凝集体の形成を促進させた。凝集体形成後に、細胞を、成長因子およびサイトカイン：ｒｈＢＭＰ−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、ｒｈＶＥＧＦ、ｚｂＦＧＦ、ｒｈＦｌｔ−３リガンド、ｒｈＩＬ−３、およびｒｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が添加されたＥＢ基本培地に入れ、１２日間放置した。細胞を回収し、各ｉＰＳＣクローンによって形成された表現型を、フローサイトメトリーによるＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ４１、およびＣＤ２３５ａの表面染色によって評価した。個別化された細胞を、製造者の取扱説明書にしたがってコロニー形成単位をアッセイするためにＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地に入れた。
奇形腫形成についてのアッセイ−ＭＥＦ上で培養された特徴付けられたｉＰＳＣを、ＳＣＩＤ／ベージュマウスの後肢に筋肉内注射した（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）。それぞれを１枚の６ウェルプレートの細胞で、１つの細胞系に付き３匹のマウスに注射した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、注射の前に細胞懸濁液に総容量の１／３添加した。腫瘍が、５〜１２週目に形成され、この腫瘍をヘマトキシリンおよびエオシン染色して、ＭｃＡｒｄｌｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ウィスコンシン大学マディソン校）による組織学的分析を行った。すべての動物実験は、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに承認された適切な国内および国際ガイドラインにしたがって行った。
心臓分化−心臓発生を細胞凝集法によって誘導した。要約すると、ＭＥＦ上で増殖したＴｉＰＳ細胞を、コラゲナーゼＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｒｅｎ）を用いて回収し、Ｍａｔｒｉｇｅｌで増殖した細胞を、クエン酸ナトリウムを用いて１つの細胞懸濁液中へ解離させた。この細胞懸濁液は、組換えヒト肝細胞成長因子（ＨＧＦ）および／またはｚｂＦＧＦの存在下、超低接着フラスコ内での凝集体の形成を可能にした。加えて、ＲＯＣＫ阻害剤Ｈ１１５２を、Ｍａｔｒｉｇｅｌを源とする細胞懸濁液に添加した。第１４〜１５日目に、拍動する凝集体を解離して、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、クローン１Ｃ１１）で染色した。
ニューロン分化−ＴｉＰＳ細胞の神経分化を、既に記載されているように行った（Ｅｂｅｒｔら、２００９）。要約すると、ＭＥＦ上で増殖したＴｉＰＳをコラゲナーゼＩＶで部分的に解離させ、Ｂ２７補充剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｂＦＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、および上皮成長因子（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）が添加されたＳｔｅｍｌｉｎｅ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に凝集体として浮遊状態で培養した。培養物を、ＭｃＩｌｗａｉｎ組織チョッパーを用いて毎週継代した。神経分化を誘導するために、球状細胞（ｓｐｈｅｒｅ）を神経誘導培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｎ２補充剤、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１週間増殖させ、次にこれを、ｃＡＭＰ（１μＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、アスコルビン酸（２００ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、脳由来神経栄養因子およびグリア細胞系由来神経栄養因子（共に１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）が添加された同じ神経誘導培地のポリオルニチン／ラミニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）被覆カバースリップに配置し、さらに３週間放置した。ニューロンマーカーβＩＩＩ−チューブリンの発現を、既に記載されているように免疫蛍光染色によって分析した（Ｚｈａｎｇら、２００１）。
実施例９
凍結保存ヒト末梢血患者サンプル由来のＴ細胞のレトロウイルスリプログラミング
この実施例は、「１０人のドナー」実験に使用されたプロトコルを表す。この実験では、リプログラミングを、１０の患者サンプルに対して試験として行い、１０の患者サンプルのそれぞれが、リプログラミングに成功した。図６Ａ〜図６Ｂに示されているように、少数の投入Ｔ細胞を含む９６ウェル形式内のＭＥＦ上のＩＰＳコロニーのＴｒａ−１−６０染色。これは、Ｔ細胞手法の効率を実証している。
この実施例は、ヒト末梢血Ｔリンパ球の効率的なレトロウイルスリプログラミングの一連の手順（以下に詳細に記載される手順１〜１１）、特に、ヒト末梢血Ｔリンパ球のモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）をベースとしたリプログラミングを達成するために必要な複数の工程およびタイミングを記載する。本実施例は、凍結保存細胞、ならびに二重遺伝子ＭＭＬＶベクターＯｃｔ４−Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃ−Ｋｌｆ４またはＮａｎｏｇ−Ｌｉｎ２８を含む新たに調製されたウイルス上清の使用に焦点を当てる。本実施例の手順は、他のベクター系に使用するために適応させることができ、非凍結保存サンプルにも使用することができる。
１．予備的手順：
末梢血サンプルの注文および／または受け取りの前に、接着２９３Ｔ細胞の活発に増殖する培養物および非接着Ｊｕｒｋａｔ細胞の別個の培養物を樹立して維持する。２９３Ｔ細胞は、増殖してウイルス生産の要求を満たす。ウイルス生産では、以下の「ＭＭＬＶリプログラミング・ウイルス・ベクターの調製」に記載されている数種のベクターおよびヘルパープラスミドを使用する必要がある。この工程を進める前に、これらのＤＮＡサンプルを用意する必要がある。最後に、「ＭＭＬＶリプログラミングウイルスベクターを調製する」前にＭＥＦ順化培地の過剰供給の用意しておくことも推奨される。
２．末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製して凍結保存する：
以下に、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒト末梢血が入っているＶａｃｕｔａｉｎｅｒｓ（登録商標）ＣＰＴ（商標）管から単離して、ＰＢＭＣを凍結保存する手順を記載する。この手順は、ｉＰＳ細胞の誘導を促進すること目的とし、血液を別個の（ＳＳＴ）管に吸引し、この管を、感染性疾患の検査のために適切な研究施設に送付した。血液サンプルがＣＰＴ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（著作権）に収集され、本発明者らに送付された。サンプルを受け取ると、そのサンプルを適切な生物封じ込めデバイス内に４℃で保管した。ドナー情報をデータベースに記録し、識別する文字または数字をこのドナーに割り当てた。陰性を証明する感染性疾患の検査データの受け取りも、安全委員会によって規定されたように文書で記録した。
血液サンプルを受け取ったら、ＰＢＭＣを、６００×ｇ、４℃で２５分間のＳｏｒｖａｌｌ Ｌｅｇｅｎｄ ＲＴ遠心分離（利用可能であれば生物閉じ込めアダプターを使用）によってＣＰＴ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（著作権）から単離し、ペレットを１０ｍｌの低温ＰＢＳ（凍結保存のため）またはＲＰＭＩ＋Ｐ／Ｓ（生きた細胞培養物のため）に再懸濁した。細胞を、Ｃｅｄｅｘ計器でカウントした。別法では、トリパンブルーおよび血球計を用いて反復カウントを行う。サンプルをカウントし、１ｍｌ当たりの生存細胞数および生存率も記録する。４００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、残った凝固因子を排除するために上清を吸引する。
単離後、ＰＢＭＣの凍結保存の準備として、ペレットを約１０×１０６細胞／ｍｌで低温ＣｒｙｏＳｔｏｒ１０に再懸濁して、予め冷却されたクライオバイアルに移した。典型的には、１つの８ｍｌ ＣＰＴ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（著作権）からの収量は、１５，０００，０００〜２０，０００，０００の細胞であり、２つのクライオバイアルに分ける。クライオバイアルを予め冷却されたＭｒ．Ｆｒｏｓｔｙキャニスターに入れ、次いでこのキャニスターを−８０℃のフリーザーに入れて一晩置いた。翌日、クライオバイアルを長期保存のために液体窒素貯蔵タンクに移した。
３．ＭＭＬＶリプログラミング・ウイルス・ベクターを調製する：
最適なウイルス活性を維持するために、ウイルス上清は、使用前に４℃で４日以上保存しないことが推奨されている。このプロトコルは、ＭＭＬＶをベースとしたリプログラミングバイシストロニックベクターＯｃｔ４−Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃ−Ｋｌｆ４、およびＮａｎｏｇ−Ｌｉｎ２８（ベクターマップは図１１Ａ〜図１１Ｃに示されている）の一過性のトランスフェクションによるレトロウイルス含有培地の生産について記載する。これらのベクターの２つまたは３つの組み合わせを用いて、９６ウェル形式内のヒトＴ細胞のレトロウイルス形質導入によってｉＰＳ細胞の誘導を促進することを目的とする。
数日間（または数週間）にわたる２９３Ｔ細胞の増殖および増大。スケールアップの程度は、以下に記載される一過性トランスフェクション法に必要な細胞数、および作製されるウイルス含有上清の対応する容量に依存する。これらの値を計算する式を以下に示す。
ウイルス生産の準備。ＭＭＬＶリプログラミングベクターは、ベクタープラスミドの名称（図１１Ａ〜図１１Ｃに示されている）に対応してＯｃｔ４−Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃ−Ｋｌｆ４、またはＮａｎｏｇ−Ｌｉｎ２８と命名され、それぞれＯＳ、ＣＫ、およびＮＬと呼ばれる。リプログラミングは、ＯＳ＋ＣＫ、ＯＳ＋ＮＬ、または３つすべてのベクター（ＯＳ＋ＣＫ＋ＮＬ）の組み合わせの使用によって達成することができる。過度の各ベクタープラスミドＤＮＡおよび以下に記載されるヘルパープラスミドは、このプロトコルを開始する前に用意しなければならない。また、コントロールＭＭＬＶプラスミド（Ｓｏｘ２−ＧＦＰ）を用意することも推奨される。
ウイルスを受け取る標的細胞を含むウェルの数（ｎ）、およびウイルスのどの組み合わせを各ウェルが受け取るかを決定する。例えば、１０の異なるドナーＴ細胞サンプルをそれぞれ、９６ウェル形式の７つのウェルに播種し、以下に記載されるように活性化した；これらのサンプルが総計７０のウェルを占有し：各ドナー由来の２つウェルに、ＯＳ＋ＣＫリプログラミングウイルス（ｎＯＳ＋ＣＫ＝２０）が入れられ；２つのウェルに、ＯＳ＋ＮＬリプログラミングウイルス（ｎＯＳ＋ＮＬ＝２０）が入れられ；２つのウェルに、コントロールＳｏｘ２−ＧＦＰウイルス（ｎＧＦＰ＝２０）が入れられ；残りの１つのウェルが、非形質導入コントロールである。
次の式：Ｖ＝（ｎ）×（用量）×Ｆを使用して必要な各ベクターから上清培地の容量（Ｖ）を計算し；式中の用量＝各ウェルに添加されるウイルスのｍｌ（典型的には０．０５ｍｌ）であり、Ｆは、上清の沈降（以下のウイルスを濃縮する工程における）の後に達成される濃度係数（典型的には５０倍）を表す。上の例にしたがい、ＯＳウイルスを入れるウェルの総数は、ｎＯＳ＋ＣＫ＋ｎＯＳ＋ＮＬ＝４０である。用量＝０．０５ｍｌおよびＦ＝５０と仮定して計算すると、ＶＯＳ＝（ｎＯＳ＋ＣＫ＋ｎＯＳ＋ＮＬ）×（用量）×Ｆ＝４０×（０．０５）×５０＝１００ｍｌであり、ＶＣＫ＝（ｎＯＳ＋ＣＫ）×（用量）×Ｆ＝２０×（０．０５）×５０＝５０ｍｌであり、ＶＮＬ＝（ｎＯＳ＋ＮＬ）×（用量）×Ｆ＝２０×（０．０５）×５０＝５０ｍｌであり、ＶＧＦＰ＝（ｎＧＦＰ）×（用量）×Ｆ＝２０×（０．０５）×５０＝５０ｍｌである。
各ウイルスに必要な２９３Ｔ細胞のプレートの数（Ｐ）を式：（Ｐ）×（Ｙ）＝Ｖを用いて計算するが、式中、ＶはＶＯＳ、ＶＣＫ、ＶＮＬ、またはＶＧＦＰ（上記の計算から）であり、Ｙは、所定のプレート形式の上清の収量である。Ｙの値については、下表を参照されたい。Ｐの計算が整数でない場合は、最も近い整数に切り上げる。必要に応じて、過剰な数の２９３Ｔプレートを用意する。
式：ＰＯＳ＝ＶＯＳ÷（Ｙ）を解く。上の例では：ＶＯＳ＝１００ｍｌ、１プレート当たりの収量を増やすために１５ｃｍ形式を選択し、したがってＹ＝１４．５である。ＰＯＳ＝１００÷１４．５＝６．８プレート。切り上げるとＰＯＳ＝７プレート。ＶＣＫ＝ＶＮＬ＝ＶＧＦＰ＝５０ｍｌ、したがってＰＣＫ、ＰＮＬ、またはＰＧＦＰについて式を解くと：５０÷１４．５＝３．４プレート。切り上げるとそれぞれ４プレートである。ＰＣＫ＝ＰＮＬ＝ＰＧＦＰ＝４プレート。
２９３Ｔ細胞をＰＢＳで洗浄し、単層を覆うのに十分なトリプシンを添加する。室温で１０分間インキュベートし、次いで皿の側面を軽く叩いて細胞を移動させる。細胞を５０ｍｌ管（複数可）に集める。各プレートを少容量のＤ１０Ｆで洗浄する。洗浄培地と細胞を収集して混合する。完全に混合して、３００μｌのアリコートをＣｅｄｅｘカップに移し、細胞をカウントする。別法では、トリパンブルーおよび血球計を使用する。３５０×ｇで１０分間遠心分離する。上清を吸引し、ペレットを新たなＤ１０Ｆに再懸濁する。各ウイルスに必要な２９３Ｔ細胞のプレート数（Ｐ）の計算工程からプレートの総数（ＰＯＳ＋ＰＣＫ，＋ＰＮＬ＋ＰＧＦＰ）を計算する。表（以下）の播種密度を使用して、各プレートに必要な数の２９３Ｔ細胞を蒔く。Ｄ１０Ｆで、約２４時間、３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートする。培養物が過剰または過少コンフルエントである場合は、トランスフェクション効率、したがってウイルス生産が減少する。顕微鏡下で細胞を可視化して、密集度が最適（約９０〜９５％）であることを確認する。
２９３Ｔ細胞プレートの各セットのトランスフェクションにＭＭＬＶまたはコントロールプラスミド（μｇＯＳ、μｇＣＫ、μｇＮＬ、またはμｇＧＦＰ）のそれぞれがどの程度必要であるかを調べるために計算する。計算を単純にするために、各プラスミドＤＮＡサンプルの濃度を１．０ｍｇ／ｍｌまたは２．０ｍｇ／ｍｌに調整することが推奨される。以下の表（「ベクター」の列を参照されたい）から適切な値を選択し、ＰＯＳ、ＰＣＫ，、ＰＮＬまたはＰＧＦＰを乗じる。次いで、プラスミドＤＮＡ濃度（ＣＯＳ、ＣＣＫ、ＣＮＬ、またはＣＧＦＰ）で除して、必要な容量（μｌＯＳ、μｌＣＫ、μｌＮＬ、またはμｌＧＦＰ）を決定する。
任意選択：各プラスミドＤＮＡ濃度（Ｃ）を１μｇ／ｍｌに調整する。上の例にしたがい、Ｃ＝１と仮定すると；ＰＯＳ＝７、したがってμｇＯＳ＝（２７μｇ）×７＝１８９÷ＣＯＳ＝１８９μｌＯＳである。同じ例にしたがい、ＰＣＫ＝ＰＮＬ＝ＰＧＦＰ＝４、したがってμｇＣＫ＝（２７μｇ）×４＝１０８÷ＣＣＫ＝１０８μｌＣＫ、μｇＮＬ＝（２７μｇ）×４＝１０８÷ＣＮＬ＝１０８μｌＮＬ、μｇＧＦＰ＝（２７μｇ）×４＝１０８÷ＣＧＦＰ＝１０８μｌＧＦＰである。
すべてのプレートに必要な各ヘルパープラスミド（μｇＧａｇＰｏｌ、μｇＮＦｋＢ、μｇＶＳＶ）またはトランスフェクション試薬（μｌＰＥＩ）の総量を決定するために、上の表（Ｇａｇ／Ｐｏｌ、ＮＦｋＢ、ＶＳＶＧ、またはＰＥＩの列）から適切な値を選択し、この値に合計値（ＰＯＳ＋ＰＣＫ，＋ＰＮＬ＋ＰＧＦＰ）を乗じる。次いで、得られた値をプラスミドＤＮＡ濃度（ＣＯＳ、ＣＣＫ、ＣＮＬ、またはＣＧＦＰ）で除して必要な容量を決定する。例にしたがい、（ＰＯＳ＋ＰＣＫ，＋ＰＮＬ＋ＰＧＦＰ）＝７＋４＋４＋４＝１９であり、Ｃ＝１と仮定すると；μｇＧａｇＰｏｌ＝（８．１μｇ）×１９＝１５３．９÷ＣＧａｇＰｏｌ＝１５３．１μｌＧａｇＰｏｌ、μｇＮＦｋＢ＝（２．７μｇ）×１９＝５１．３÷ＣＮＦｋＢ＝５１．３μｌＮＦｋＢ、μｇＶＳＶ＝（２．７μｇ）×１９＝５１．３÷ＣＶＳＶＧ＝５１．３μｌＶＳＶ、μｌＰＥＩ＝１０８μｌ×１９＝２．０５２ｍｌである。
１０ｃｍプレート形式でのトランスフェクション：試験管１ＯＳ：ＯｐｔｉＭＥＭをアリコート（ＰＯＳ×０．５）ｍｌにし、次いで混合しながら（ＰＯＳ×４０）μｌのＰＥＩを滴下添加する。側面に触れないようにする。室温で５分間インキュベートする。試験管２ＯＳ：ＯｐｔｉＭＥＭのアリコート（ＰＯＳ×０．５）ｍｌを第２の試験管に入れる。プラスミドの適切な比率（１０：３：３：１）のカクテルを用意する。上の表から適切な値（μｇＯＳ、μｇＧａｇＰｏｌ、μｇＮＦｋＢ、およびμｇＶＳＶＧ）を選択し、この値にＰＯＳを乗じて必要なプラスミドの量を求める。次いで、ＣＯＳ、ＣＧａｇＰｏｌ、ＣＮＦｋＢ、またはＣＶＳＶＧで除して必要な容量（μｌＯＳ、μｌＧａｇＰｏｌ、μｌＮＦｋＢ、およびμｌＶＳＶＧ）を決定する。これらの容量を試験管２ＯＳに添加する：μｌＯＳ＋μｌＧａｇＰｏｌ＋μｌＮＦｋＢ＋μｌＶＳＶＧ、次いで混合する。ＯＳプラスミドの代わりにＮＬ、またはＣＫ、またはＳｏｘ２−ＧＦＰプラスミドで、これらの工程を繰り返す。対応する試験管のセットを用意する：試験管１ＮＬおよび２ＮＬ、試験管１ＣＫおよび２ＣＫ、または試験管１ＧＦＰおよび２ＧＦＰ。適切なＰおよびＣ値を代入して、試験管２カクテルの適切な容量を計算する。ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を作製するために、各試験管＃１を対応する試験管＃２と混ぜ合わせ、混合し、室温で２０分間インキュベートする。２９３Ｔの各プレートを５ｍｌのＰＢＳで２回洗浄する。４ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭを各プレートに添加する。１ｍｌのプラスミドＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を各プレートに直接、滴下添加する。３７℃／５％ＣＯ２で４〜６時間インキュベートする。培地を吸引し、次いで各プレートを５ｍｌのＰＢＳで洗浄する。５ｍｌのＤ１０Ｆ＋５０ｍＭのＨＥＰＥＳ培地を各プレートに加える。３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。ＳＯＸ２−ＧＦＰ感染（コントロール）細胞を蛍光顕微鏡に移す。蛍光は検出可能なはずである。さらに２４時間、３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートする。
１５ｃｍプレート形式でのトランスフェクション：試験管１ＯＳ：ＯｐｔｉＭＥＭをアリコート（ＰＯＳ×１．０）ｍｌにし、次いで混合しながら（ＰＯＳ×１０８）μｌのＰＥＩを滴下添加する。側面に触れないようにする。室温で５分間インキュベートする。例にしたがい、ＰＯＳ＝７：ＯｐｔｉＭＥＭのアリコート７ｍｌを試験管１ＯＳに入れ、１．９６ｍｌのＰＥＩを添加する。試験管２ＯＳ：ＯｐｔｉＭＥＭのアリコート（ＰＯＳ×１．０）ｍｌを第２の試験管に入れる。例にしたがい、ＰＯＳ＝７：ＯｐｔｉＭＥＭのアリコート７ｍｌを試験管２ＯＳに入れる。適切な比率（１０：３：３：１）のプラスミドのカクテルを用意する。上の表から適切な値（μｇＯＳ、μｇＧａｇＰｏｌ、μｇＮＦｋＢ、およびμｇＶＳＶＧ）を選択し、この値にＰＯＳを乗じて必要なプラスミドの量を求める。次いで、ＣＯＳ、ＣＧａｇＰｏｌ、ＣＮＦｋＢ、またはＣＶＳＶＧで除して必要な容量（μｌＯＳ、μｌＧａｇＰｏｌ、μｌＮＦｋＢ、およびμｌＶＳＶＧ）を決定する。これらの容量を試験管２ＯＳに添加する：μｌＯＳ＋μｌＧａｇＰｏｌ＋μｌＮＦｋＢ＋μｌＶＳＶＧ、次いで混合する。
例にしたがい、ＰＯＳ＝７であり、すべてのプラスミドに対してＣ＝１と仮定すると：μｇＯＳ＝２７μｇ×７プレート＝１０８÷ＣＯＳ＝１０８μｌＯＳ、μｇＧａｇＰｏｌ＝８．１×７＝５６．７÷ＣＧａｇＰｏｌ＝５６．７μｌＧａｇＰｏｌ、μｇＮＦｋＢ＝２．７×７＝１８．９÷ＣＮＦｋＢ＝１８．９μｌＮＦｋＢ、μｇＶＳＶＧ＝２．７×７＝１８．９÷ＣＮＦｋＢ＝１８．９μｌＶＳＶＧである。これらの容量を試験管２ＯＳに加えて混合する。ＯＳプラスミドの代わりにＮＬ、またはＣＫ、またはＳｏｘ２−ＧＦＰプラスミドで、これらの工程を繰り返す。対応する試験管のセットを用意する：試験管１ＮＬおよび２ＮＬ、試験管１ＣＫおよび２ＣＫ、または試験管１ＧＦＰおよび２ＧＦＰ。適切なＰ値およびＣ値を代入して、試験管２のカクテルの適切な容量を計算する。ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を作製するために、各試験管＃１を対応する試験管＃２と混ぜ合わせ、混合し、室温（ＲＴ）で２０分間インキュベートする。各プレートを１０ｍｌのＰＢＳで２回洗浄する。１３ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭを各プレートに添加する。２ｍｌのプラスミドＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を各プレートに直接、滴下添加する。３７℃／５％ＣＯ２で４〜６時間インキュベートする。培地を吸引し、次いで各プレートを１５ｍｌのＰＢＳで洗浄する。１５ｍｌのＤ１０Ｆ＋５０ｍＭのＨＥＰＥＳ培地を各プレートに加える。３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。ＳＯＸ２−ＧＦＰ感染（コントロール）細胞を蛍光顕微鏡に移す。蛍光は検出可能なはずである。さらに２４時間、３７℃でインキュベートする。
ウイルス上清の回収：Ｓｏｘ２−ＧＦＰ形質導入細胞を再び蛍光顕微鏡に移す。細胞の大部分が、緑色蛍光を発しているはずであり、この蛍光は、プレート全体で均一なはずである。また、ウイルス産生細胞が、細胞の形態における顕著な変化を示すはずである。トランスフェクト細胞の各セットからのウイルス含有上清培地をプールする（注意：上清は感染性ウイルスを含む）。ウイルス上清を０．４５μｍまたは０．８μｍのフィルターに
通してろ過し細胞およびデブリを除去する（注意：酢酸セルロースフィルターまたはＰＥＳ低タンパク質結合フィルターを使用する。ニトロセルロースフィルターを使用しないこと）。ＭＭＬＶは、貯蔵寿命が短い：ウイルス上清は、４℃で４日超保存しない。任意選択：上清は、−８０℃で保存することができるが、凍結解凍サイクルは、機能的活性を消失させる。直ちに、（ａ）Ｊｕｒｋａｔ細胞またはＴ細胞の増殖に対する機能的活性および／または（ｂ）上清１ｍｌ当たりに存在するウイルスＲＮＡの定量の少なくとも１つの測定を用いてウイルス力価の評価を行う。ＭＭＬＶベクターの品質管理アッセイを以下に記載する。
９６ウェル形式でのＴ細胞の高い形質導入効率を達成するためには、ウイルスを濃縮することが重要である。しかしながら、濃縮ウイルスは、不安定でもある。さらに、Ｔ細胞培養物が最も増殖性が高い（したがって最も容易に感染）時間枠は狭い。したがって、標的細胞の準備および濃縮工程を調整することが重要である。ＱＣアッセイ（複数可）が要件を満たしたら、リプログラミングのために標的ＰＢＭＣのＴ細胞を活性化させてウイルス上清を濃縮する。
４．ウイルス活性についての品質管理アッセイを行う：
このプロトコルは、ＭＭＬＶベクター：Ｏｃｔ４−Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃ−Ｋｌｆ４、またはＯｃｔ４−Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇ−Ｌｉｎ２８、またはコントロールＳｏｘ２−ＧＦＰベクターでの細胞の形質導入による形質導入効率を評価する方法を記載する。これらのアッセイは、ｉＰＳ細胞の誘導の促進に使用されることを目的とする。
ウイルス活性についての品質管理アッセイ：注意：ウイルスの相対的不安定性のため、ウイルス上清を収集した日に、以下のＱＣアッセイの１つ（またはすべて）を開始する準備をすることが重要である。ウイルスは−７０℃で保存することができるが、凍結解凍サイクルおよび／または３週間を超える保存は、活性を消失させる。許容できるＱＣアッセイの結果が得られると、ＰＢＭＣは、再活動化（ｒｅ−ａｎｉｍａｔｅｄ）するはずである。
製造者のプロトコル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にしたがって各ウイルス上清のアリコートを用いて定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行う。別法では（またはこれに加えて）、増殖しているＪｕｒｋａｔ細胞を収集してＣｅｄｅｘでカウントする。４μｇ／ｍｌのポリブレンを含むＲ１０Ｆに細胞を１×１０６／ｍｌに再懸濁する。１ウェル当たり１００μｌの細胞を９６ウェルプレートに播種する。５０μｌのウイルスを３つのウェルに加え、プレートのいくつかの行にわたる連続希釈によってウイルスを滴定する。４８時間インキュベートしてから、ＦＡＣＳ分析のために細胞を収集する。Ｏｃｔ４の細胞内免疫標識化およびフローサイトメトリーの手順を参照されたい。別法では（またはこれに加えて）、半定量的ＰＣＲ分析のために感染Ｊｕｒｋａｔ細胞を収集する。ウイルス調製物（ｖｉｒｕｓ ｐｒｅｐ）がＱＣを合格したら、Ｔ細胞の形質導入のために次の工程に進む。
５．ドナーＰＢＭＣを再活動化させてＴ細胞を活性化する：
ヒトＴ細胞の効率的なリプログラミングは、ウイルス上清の生産および送達が標的細胞の活性化と慎重に調和された場合にのみ、ＭＭＬＶベクターで達成することができる。ここで、ＰＢＭＣの混合集団由来のＣＤ３＋細胞の増殖におけるサイトカイン誘導バーストとしての活性化の成功が、培養の４８〜７２時間の間に巨視的な「芽球」コロニーの形成をもたらすことを開示する。ＭＭＬＶをベースとしたリプログラミングベクターを用いたこの活性化プロトコルを利用するために、ＭＭＬＶ上清が不安定であることに留意するのが重要である。したがって、芽球コロニー形成の１日前に新鮮なウイルスをＴ細胞培養物に添加できるように厳しく管理されたスケジュールでウイルスを調製するべきである。このプロトコルは、上記のように凍結保存された細胞の再活動化、および芽球コロニーの誘
導を記載する。ＰＢＭＣの代替の供給源を利用することもできる。
培地およびサイトカインを調製する。ウイルスの添加前に、細胞を４８時間活性化しなければならない。したがって、この工程は第−２日目とする。リプログラミングは、第０日目に始まる。作業濃度のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／グルタミンをＡＩＭ−Ｖ培地に添加する。４℃で２週間超保存しない。ＩＬ２の少容量のアリコートを調製し、−２０℃で保存することが推奨される。ここで使用するために１つのアリコートを解凍する。１つのアリコートを解凍後、４℃で２週間超保存しない。ＯＫＴ３（１ｍｇ／ｍｌの抗ＣＤ３）は、４℃で保存するべきである。１ｍｌのＡＩＭＶ培地中で１μｌを希釈して１μｇ／ｍｌの中間希釈物にする。
ドナーＰＢＭＣの再活動化およびＴ細胞の活性化。ＰＢＭＣが解凍される日を第−２日目と呼ぶことにする。貯蔵庫からＰＢＭＣを取り出して、３７℃の水槽で急速解凍する。細胞（および凍結培地）を等容量の温かいＲＰＭＩ培地で希釈する。穏やかに混合して、１５ｍｌ管に移す。総容量１０ｍｌまでＲＰＭＩで徐々に希釈する。完全に混合し、３００μｌのアリコートを取り出し、１ミクロンのサイズ閾値でＣｅｄｅｘアルゴリズムを用いて細胞をカウントする。別法では、細胞をトリパンブルーで染色し、血球計でカウントする。注意：一次ＰＢＭＣサンプル（凍結保存前）に存在した細胞の５０％のロスも珍しくない。しかしながら、残った細胞は、９０％超が生細胞であるはずである。細胞を３５０×ｇで１０分間遠心分離し、上清を吸引し、２×１０６の生細胞／ｍｌの密度で温かいＡＩＭ−Ｖ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／グルタミンに再懸濁する。３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ２および１０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体を加える。細胞を混合し、平底９６ウェル組織培養プレートに１ウェル当たり１００μｌ分注し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。周辺部のウェルは蒸発がより顕著であるため、可能であればこれらのウェルの使用は避ける。４８時間後（第０日目）に、２０倍（またはそれよりも高倍率）の対物レンズを用いて明視野顕微鏡によって細胞を観察する。注意：細胞分裂および細胞のクラスター（新生芽球コロニー形成）の証拠が検出可能なはずである。
６．ウイルス上清を濃縮する：
このプロトコルは、リプログラミングベクターの組み合わせ（Ｏｃｔ４−Ｓｏｘ２とｃＭｙｃ−Ｋｌｆ４またはＮａｎｏｇ−Ｌｉｎ２８；代表的なベクターマップは図１１Ａ〜図１１Ｃに示されている）を用いたトランスフェクションの後に２９３Ｔ細胞から収集したレトロウイルス上清を濃縮することによってＭＭＬＶベクターの力価を上げる２つの別個の方法を記載する。Ｔ細胞のレトロウイルス形質導入によってｉＰＳ細胞の誘導を促進することを目的とする。ウイルス上清の力価は、上記のようにＭＭＬＶベクターの品質管理アッセイにしたがってアッセイすることが推奨される。
大容量のウイルスの場合は、ＬｅｎｔｉＸ法が推奨される。この方法は、一晩のインキュベーションが必要であり、したがって第−１日目に開始するべきである。別法では、３０ｍｌ以下のウイルス調製物の場合は、Ａｍｉｃｏｎ法を第０日目に使用することができる。
非濃縮ＭＭＬＶ上清（上記の手順に従って調製）を、活性を著しく消失させることなく４℃で４日間保存することができる。いずれかの方法（以下）を用いて上清を濃縮したら、ウイルスを低温（氷上）に保ち、できるだけ早く使用するべきである。標的細胞が、この手順の完了のときに感染させる準備ができていない場合は、濃縮ウイルスを−８０℃で保存する。
ＬｅｎｔｉＸ法によってウイルスを濃縮する（第−１日目）。注意：この方法は、大規模のウイルス濃縮（上清の容量＞３０ｍｌ）に推奨される。上清を５０ｍｌ管に移し、製
造者の推奨にしたがってＬｅｎｔｉ−Ｘ濃縮器に入れた。３容量の清澄化したウイルス上清とＬｅｎｔｉ−Ｘ濃縮器の１容量を混ぜ合わせる。穏やかな反転によって混合する。４℃で一晩インキュベートする。１８〜２４時間後、第０日目に、サンプルを１，５００×ｇ、４℃で４５分間遠心分離する。遠心分離後、オフホワイトのペレットが見える。ペレットを乱さないように注意しながら上清を慎重に取り除く。残った上清は、ピペットチップで、または１，５００×ｇでの短時間の遠心分離で除去することができる。ペレットを、低温Ｄ１０Ｆを用いて元の容量の１／５０に穏やかに再懸濁する。ペレットは、初めは幾分粘着性であり得るが、すぐに懸濁液となるはずである。直ちに、ウイルスを標的細胞に加える。
Ａｍｉｃｏｎろ過法によってウイルスを濃縮する（第０日目）。この方法を用いて、３０ｍｌ以下のウイルス上清調製物を濃縮する。ＡｍｉｃｏｎＹ １００，０００ＭＷカセットを１０ｍｌのＰＢＳの添加によって洗浄し、３分間またはＰＢＳがすべてフィルターを通過するまで１０００×ｇでデバイスを遠心分離する。１５ｍｌの上清ウイルスをＡｍｉｃｏｎカセットに加え、２０００×ｇで２０分間回転させる。典型的には、これは、約１０倍の濃度（容量で）をもたらす。サンプルをさらに５〜１０分間回転させてウイルスをさらに濃縮する。このプロセスを繰り返して、５０倍（最終容量が約３００μｌ）まで容量を減らすことができる。このプロセスを各ウイルスベクター上清で繰り返す（並行して）。推奨：４を超えるＡｍｉｃｏｎカセットを一度に処理しようとしてはならない。長い遅延の間、上清が、カセットを通って受動的に滴が漏れ、対向するローターアーム全体にわたる重量分布が不均一となる。これにより、遠心分離の平衡が失われ得る。貯留物を収集する。直ちに、ウイルスを標的細胞に加える。
７．活性化Ｔ細胞に形質導入する（第０日目）：
この手順は、濃縮ＭＭＬＶをベースとしたリプログラミングベクターを用いたヒト末梢血Ｔリンパ球の形質導入についてである。このプロトコルは、ＭＭＬＶをベースとしたリプログラミングベクターＯｃｔ４−Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ−Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ−Ｌｉｎ２８、またはＳｏｘ２−ＧＦＰ、またはこれらの組み合わせを含む９６ウェルプレートでのＴ細胞の形質導入を記載する。上記の品質管理アッセイでは、このプロトコルの使用の前にウイルス活性を評価することが推奨されている。
形質導入の日は、リプログラミングプロセスの開始を意味する（第０日目とする）。この時点は、ＰＢＭＣが解凍されて９６ウェル形式で活性化されてから４８時間後であった（手順５．ドナーＰＢＭＣを再活動化させてＴ細胞を活性化させる、に記載されているように）。濃縮ＭＭＬＶベクターは、手順３、４、および６にしたがって事前に調製するべきである。
細胞は、位相差顕微鏡下で観察する。新生芽球コロニー形成の証拠があるはずである。
任意選択：細胞を収集してカウントする。典型的には、ＰＢＭＣの数は、活性化から２４時間以内（第−２日目〜第−１日目）に約２５〜５０，０００細胞／ウェルに著しく低下する。２４〜４８時間（第−１日目〜第０日目）の間は、細胞数は、典型的には変化しない。第０日目〜第１日目の間に、ＡＴＰの量が増加し、新生芽球コロニー形成が出現する。第０日目の細胞数は、典型的には１〜２×１０５／ウェルである。第０日目〜第１日目の間に、芽球コロニーが明らかとなるはずであり、細胞数が著しく増加する。
任意選択：Ｔ細胞を特徴付けるＦＡＣＳ分析のために細胞を収集する。複数のＰＢＭＣドナーに対する以前の試験は、９０％を超える細胞が、第０日目に抗ＣＤ３表面標識を提示したことを示している。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の分布は様々である。典型的には、ＣＤ４＋細胞は、ＣＤ８＋細胞と比較して２倍も存在する。
等容量の各濃縮ウイルスを混ぜ合わせ、８μｇ／ｍｌのポリブレンおよび３００単位／ｍｌのＩＬ−２を添加する。感染させる所定数のウェルのため十分にこの混合物を調製する。
手順３に記載の手法にしたがい：１０の異なるドナーＴ細胞サンプルをそれぞれ、９６ウェル形式の７つのウェルに播種して活性化した；これらのサンプルは、合計７０のウェルを占有した。各ドナーの２つのウェルに、ＯＳ＋ＣＫリプログラミングウイルス（ｎＯＳ＋ＣＫ＝２０）を添加する。２つのウェルに、ＯＳ＋ＮＬリプログラミングウイルス（ｎＯＳ＋ＮＬ＝２０）を添加する。２つのウェルに、コントロールＳｏｘ２−ＧＦＰウイルス（ｎＧＦＰ＝２０）を添加する。残りの１つのウェルは、非形質導入コントロールである。混ぜ合わせ（５０μｌＯＳ＋５０μｌＣＫ）×ｎＯＳ＋ＣＫ＝２ｍｌ；２μｌのポリブレンおよび１．２μｌのＩＬ−２を添加する。
混ぜ合わせ（５０μｌＯＳ＋５０μｌＮＬ）×ｎＯＳ＋ＮＬ＝２ｍｌ；２μｌのポリブレンおよび１．２μｌのＩＬ−２を添加する。混ぜ合わせ（５０μｌＧＦＰ＋５０ Ｄ１０Ｆ）×ｎＧＦＰ＝２ｍｌ；２μｌのポリブレンおよび１．２μｌのＩＬ−２を添加する。模擬感染として、２ｍｌのＤ１０Ｆ、２μｌのポリブレン、および１．２μｌのＩＬ−２を混ぜ合わせる。
ウェルを乱さないために、１００μｌのウイルスカクテルを各ウェルに加える。細胞をピペッターで穏やかに混合する。１００μｌのＤ１０Ｆ＋３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ２＋８μｇ／ｍｌのポリブレンを添加して模擬感染を行う。細胞をピペッターで穏やかに混合する。適切な生物閉じ込めアダプターを用いて９６ウェルプレートを、１０００×ｇ、３２℃で９０分間遠心分離する。プレートを３７℃／５％ＣＯ２のインキュベーターに移して一晩置く。
（手順８にしたがって）ＭＥＦ共培養によるリプログラミングの準備として照射ＭＥＦをプレーティングする（第０日目または第１日目）。
第１日目−ウイルスへの最初の曝露から２４時間後に細胞の形態を検査する。芽球コロニーが、顕微鏡下ではっきりと見えるはずである。任意選択：細胞を収集し、遠心分離し、Ｄ１０Ｆ培地（ウイルスを含まない）に再懸濁し、Ｃｅｄｅｘでカウントする。別法では、トリパンブルーおよび血球計を使用する。
細胞を乱さずに各ウェルから１００μｌの培地を慎重に除去する。複数のウェルの場合は、チップが下がって各ウェルの底部に近づき過ぎないように注意しながら、多チャンネルピペッターを使用する。この培地を、１０％漂白剤を含むビーカーまたはトレーに廃棄する。１００μｌの新鮮なＤ１０Ｆ＋ＨＥＰＥＳ＋ＩＬ２（３００ｕ／ｍｌ）で培地を交換する。翌日、培地除去工程を繰り返す（第２日目）。
下記の手順９にしたがってＴ細胞の増大を検証し、形質導入効率を評価する（第２日目）。
８．照射ＭＥＦをプレーティングする（第０日目または第１日目）：
このセクションは、ｉＰＳ細胞の誘導を促進することを目的とする、ゼラチン被覆ウェルにマウス胎仔性線維芽細胞（ＭＥＦ）をプレーティングする方法を記載する。
順化培地（ＣＭ）の生産のために照射ＭＥＦをプレーティングする。使用予定の２〜３日前にＭＥＦを注文する。Ｔ細胞リプログラミングの手順３の例にしたがい、６ウェル形式において約２０回の「栄養補給」でリプログラミング共培養物を維持するのに必要なＭＥＦ−ＣＭの量を計算する。各栄養補給には、１．２５ｍｌ／ウェルの除去および補充が必要である。
１つの条件に付き、１０のドナーサンプル（形質導入Ｔ細胞）×２つの実験条件（ＳＯ＋ＣＫ対ＳＯ＋ＮＬ）×３つのウェル＝６０のウェルを使用した。ＳＯは、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４を有するバイシストロニックベクターを指し、ＣＫは、ｃＭｙｃおよびＫｌｆ４を有するバイシストロニックベクターを指し、ＮＬは、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８を指し、これらのいずれも蛍光マーカーを含まない（ベクターマップが図１１Ａ〜図１１Ｃに示されている）。必要なＭＥＦ−ＣＭの容量を計算する。（６０×２０×１．２５ｍｌ＝１．５リットル）。
十分な容量のＭＥＦ−ＣＭを調製するのに必要なＴ７５フラスコ−ＭＥＦ培養物の数を計算する。（注意：１つのフラスコから繰り返し収集することで、約１２０ｍｌのＭＥＦ−ＣＭを調製する）。上記の例にしたがい、１．５リットルのＭＥＦ−ＣＭを調製するためには、１５００ｍｌ÷１２０ｍｌ／フラスコ＝１２．５フラスコ。１３のフラスコに切り上げる。
１つのＴ７５フラスコに付き１２ｍｌの滅菌０．１％ゼラチンを添加する。インキュベーターで少なくとも１時間インキュベートする（３７℃／５％ＣＯ２）。ゼラチンを吸引し、２０ｍｌの高密度照射ＭＥＦ（約２．１×１０５細胞／ｍｌ）を添加する。一晩インキュベートする（３７℃／５％ＣＯ２）。ＭＥＦが付着したこと確認するために細胞を視覚化する。プレーティングの２４時間後、培地を吸引し、１つのフラスコに付き２０ｍｌのｈＥＳに交換する。２４時間後、各フラスコから約２０ｍｌのＭＥＦ−ＣＭを収集する。工程６．８および６．９をさらに５日間繰り返す。ＭＥＦ−ＣＭを−２０℃で凍結する（４ｎｇ／ｍｌのｚｂＦＧＦを添加し、ＩＰＳ培養物に使用する前にのみろ過し、次いでろ過する。
共培養物をリプログラミングするために照射ＭＥＦをプレーティングする（第０日目または第１日目）。使用予定の２〜３日前にＭＥＦを注文する。共培養物をリプログラミングするために形質導入細胞を添加する１日または２日前にＭＥＦをプレーティングするべきである。Ｔ細胞リプログラミングのために手順３の例にしたがい、１０のドナーサンプルを添加するのに必要なＭＥＦのウェルの数を計算する：１０のドナーサンプル×３つのウェル／ドナー×３つの実験条件（ＳＯ＋ＣＫ対ＳＯ＋ＮＬ対ＧＦＰコントロール）＝９０のウェル。必要な６ウェルプレートの数を計算する（９０÷６＝１５プレート）。１つのウェル（６ウェル形式）に付き２ｍｌの滅菌０．１％ゼラチンを添加する。任意選択：９６ウェルプレートを、１つのウェルに付き１００μｌのゼラチンで被覆する。インキュベーターで少なくとも１時間インキュベートする（３７℃／５％ＣＯ２）。ゼラチンを吸引し、各ウェル（６ウェル形式）に２．５ｍｌの照射ＭＥＦ細胞懸濁液を添加する。任意選択：９６ウェル形式の場合は、ゼラチンを吸引し、各ウェルに２００μｌのＭＥＦ細胞懸濁液を添加する。一晩インキュベートする（３７℃／５％ＣＯ２）。ＭＥＦが付着したこと確認するために細胞を視覚化する。
９．形質導入効率を評価するために品質管理アッセイを行う（第２日目）：
この手順は、ヒト末梢血Ｔ細胞のＭＭＬＶ形質導入を評価するための品質管理アッセイを記載する。このアッセイは、Ｏｃｔ４−Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ−Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ４−Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇ−Ｌｉｎ２８の組み合わせを含む濃縮ＭＭＬＶベクターに細胞が曝露されてから４８時間後に標的Ｔ細胞集団に存在する導入遺伝子またはリプログラミング因子の存在を検出することを目的とする。
上記の手順にしたがってヒトＴ細胞を活性化する。４８時間後、手順７にしたがって活性化Ｔ細胞を感染させる。Ｃｅｄｅｘまたは血球計で細胞をカウントする。
手順３（および手順７に続いている）の例にしたがい、活性化細胞を乱さずに各ウェルから１００μｌの上清培地を除去する。すべてのウェルは、約１００μｌ残るはずである。２つのＳｏｘ２−ＧＦＰ感染ウェルのうちの一方の残りの１００μｌの細胞を混合して収集し、細胞をＣｅｄｅｘカップに直接移す。各ウェルを２００μｌのＰＢＳで洗浄し；洗浄液を収集し混合してＣｅｄｅｘカップに入れる。必要に応じての最終容量を３００μｌに調整する。１０のドナーＴ細胞サンプルのそれぞれに対して混合および洗浄工程を繰り返す。
Ｔ細胞アルゴリズム（サイズ閾値＝１ミクロン）を用いてＣｅｄｅｘで細胞をカウントする。細胞密度を記録する（注意：１つのウェルに付き２〜４×１０５存在するはずである）。別法では、１つのウェルからの細胞を完全に混合し、１０μｌを取り出して１０μｌのトリパンブルーと混合し、次いで血球計で細胞をカウントする。（注意：このカウント法は、Ｃｅｄｅｘよりも精度が低い；しかしながら、使用する細胞が少ない）。
形質導入Ｔ細胞の形質導入効率を評価する。任意選択：蛍光顕微鏡を使用して、Ｓｏｘ２−ＧＦＰウイルスで形質導入された細胞を視覚化する。多チャンネルピペッターを使用して、各ドナーサンプル由来のＳｏｘ２−ＧＦＰ感染Ｔ細胞が入った１つのウェルの残りの１００μｌの細胞を混合して収集する（１０ウェル）。細胞を、９６ウェルＶ底収集プレートの対応するウェルのセットに移す。各ドナーサンプルからのコントロール（非感染）ウェルの残りの１００μｌの細胞を混合して収集する（１０ウェル）。各ウェルを７５μｌのＰＢＳで洗浄し；洗浄液を収集し混合して収集プレートの対応するウェルに入れる。収集プレートを３５０×ｇで１０分間遠心分離する。多チャンネルピペッターを使用して、各ウェルのペレットを乱さずに上清を慎重に除去する。この上清を、１０％漂白剤を含むビーカーまたはトレーに廃棄する。１つのウェルに付き１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液でペレットを再懸濁し、洗浄する。収集プレートを３５０×ｇで１０分間遠心分離する。各ウェルのペレットを乱さずに上清を慎重に除去する。２〜５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３−ＡＰＣを含むＦＡＣＳ緩衝液にペレットを再懸濁する。暗所で４５分間、室温でインキュベートする。
収集プレートを３５０×ｇで１０分間遠心分離する。各ウェルのペレットを乱さずに上清を慎重に除去する。１つのウェルに付き１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液でペレットを再懸濁し、洗浄する。遠心分離工程を繰り返す。
１つのウェルに付き１μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムを含む１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液でペレットを再懸濁し、洗浄する。細胞をＡｃｃｕｒｉで分析する。ＧＦＰ＋を発現する生細胞のパーセンテージを推定することによって形質導入効率を評価する。ＧＦＰ＋集団に対するゲーティングによってＣＤ３＋であるＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを評価する。
１０．形質導入Ｔ細胞とＭＥＦを共培養する（第３〜３０日目）：
この手順は、マウス胎仔性線維芽細胞（ＭＥＦ）上でのリプログラミング因子が形質導入されたヒトＴ細胞の共培養についての手順を記載する。このプロトコルは、接着ＭＥＦ上での形質導入Ｔ細胞の共培養、およびこれらの細胞に再び栄養補給する方法を記載する。
１．手順８にしたがってＭＥＦ順化培地を調製する。以下の工程４に進む前にこの試薬を調製する。
２．（手順８にしたがって）リプログラミングのために照射ＭＥＦをプレーティングする。１つのウェルに付き２．５ｍｌ（６ウェル形式）のＭＥＦまたは１つのウェルに付き２００μｌ（９６ウェル形式）のＭＥＦを入手してプレーティングする。２４〜７２時間後に、２ｍｌのｈＥＳ：Ｄ１０Ｆ培地で培地交換する（６ウェル形式の場合）または１つのウェルに付き１００μｌのｈＥＳ：Ｄ１０Ｆ培地で培地交換する（９６ウェル形式の場合）。
３．Ｔ細胞がレトロウイルスに曝露されてから２日後に形質導入効率を評価するために品質管理アッセイを行う（文献番号１００４０５．ＲＤＬ．０９を参照されたい）。Ｔ細胞リプログラミングでは、この時点を第２日目とする。形質導入効率が十分な場合は、工程４に進む。
４．（手順７にしたがって）形質導入Ｔ細胞を収集し、活性化および形質導入が成功であったかを手順にしたがって確認する。
６ウェルＭＥＦプレートの場合：１つのウェルに付き０．５〜４×１０５細胞（容量では２５〜１００μｌ）を入れる。全表面にわたって滴下添加する。任意選択：ＭＥＦプレートの３つのウェルにわたって投入細胞数を用量設定する。９６ウェルＭＥＦプレートの場合：１つのウェルに付き１〜８×１０４細胞（容量では１０〜２５μｌ）を入れる。（注意：可能な限り周辺部のウェルの使用は避ける。）任意選択：ＭＥＦプレートの複数のウェルにわたって投入細胞数を用量設定する。
以下の例は、文献番号１００４０５＿ＲＤＬ＿０３の記載にしたがい；１０の血液ドナーサンプル由来の活性化Ｔ細胞培養物が１０セット存在する。各ドナーサンプルを、９６ウェルプレートの７（７）つのウェルに配置し、Ｔ細胞を活性化させた。２（２）つのウェルをＳＯ＋ＣＫ ＭＭＬＶベクターに感染させ：２（２）つのウェルをＳＯ＋ＮＬ ＭＭＬＶベクターに感染させた。
各ドナーから、ＳＯ＋ＣＫ感染Ｔ細胞を収集し、この細胞をＦＡＣＳ管または１５ｍｌ円錐管中で混合する。各ドナーから、ＳＯ＋ＮＬ感染Ｔ細胞を収集し、これを別個の試験管中で混合する。任意選択：播種密度（すなわち、いくつのＴ細胞がＭＥＦプレートに送達されたか）を正確に明らかにするために、細胞を混合し、１０μｌのアリコートを取り出して１０μｌのトリパンブルーと混合し、細胞を血球計でカウントする。適切な生物閉じ込めデバイスおよび遠心分離アダプターを用いてサンプルを３５０×ｇで１０分間遠心分離する。この上清を慎重に除去して、１０％漂白剤を含むビーカーまたはトレーに廃棄する。細胞を４００μｌのｈＥＳ：Ｄ１０Ｆ（合計で約４〜８×１０５の細胞）に再懸濁する。混合して、２００μｌの細胞（２〜４×１０５の細胞）をＭＥＦプレート（６ウェル形式）の１つのウェルに滴下して移す。
残りの細胞をｈＥＳ：Ｄ１０Ｆ培地で２倍に希釈し、次いで２００μｌの細胞（１〜２×１０５の細胞）を同じＭＥＦプレートの第２のウェルに滴下して移す。残りの細胞をｈＥＳ：Ｄ１０Ｆ培地で２倍に希釈し、次いで２００μｌの細胞（約０．５〜１×１０５の細胞）を同じＭＥＦプレートの第３のウェルに滴下して移す。３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。
５．維持：栄養補給スケジュール（第４〜３０日目）。２日後（第４日目）に、各ウェルの培地の５０％を、以下の方法を用いてｈＥＳ培地＋１００ｎｇ／ｍｌのゼブラフィッシュＦＧＦ（増殖培地）に交換する：６ウェルプレートをインキュベーターから取り出す。プレートの一側を、廃棄用／未使用の１０ｃｍ培養皿の蓋に乗せて、培養培地がウェル
の一側に流れるようにする。（注意：この角度では、培地は、ＭＥＦの単層全体をなお覆っているはずであり、ウェルからこぼれ落ちていない）。細胞を１０分間沈降させる。ＭＥＦプレートから各蓋を取り外し、培養物の表面から培地の５０％を慎重に／ゆっくりと吸引する。細胞を吸引しないように注意する。蓋（複数可）は、引き続く全ての栄養補給のためにとっておく。任意選択：吸引物を収集し、３５０×ｇで４分間遠心分離し、１ｍｌの培地に再懸濁し、Ｃｅｄｅｘでカウントする。１％未満の細胞ロスしかないことを確認する。１．２５ｍｌの新鮮な増殖培地を、細胞を乱さないように円を描くように滴下添加する。プレートをインキュベーターに戻す。９６ウェルプレートの共培養物中の培地を交換するために、多チャンネルピペッターを用い、そのチップをウェルの底から約半分まで挿入する。培養物の表面から１００μｌをゆっくり吸引する。細胞を吸引しないように注意する。（注意：６ウェル共培養形式と比較すると、Ｔ細胞は、この形式では培地が容易には撹拌されないため、より動かないようである）。１００μｌの新鮮な培地（ｈＥＳ培地＋１００ｎｇ／ｍｌのｚＦＧＦ）を、細胞を乱さないように滴下添加する。プレートをインキュベーターに戻す。
第６日目に、上記の第４日目の栄養補給法を繰り返す。第８日目に、増殖培地＋２０％ＭＥＦ順化培地で、（上記のように）細胞に再び栄養補給する。第８日目の栄養補給工程を４８時間ごとに繰り返す。この期間中にコロニー形成を監視するためにウェルを視覚的に検査する。
１１．Ｔｒａ１−６０を発現しているコロニーを識別して採取する：
手順は、リプログラミング条件下、ＭＥＦ共培養で増殖したＴｒａ１−６０＋コロニーを識別して採取するためのガイドラインを記載する。適切な条件下で、ｉＰＳ細胞のコロニーが、リプログラミング因子の一次ヒト細胞への導入後に形成される。このプロトコルは、Ｔｒａ１−６０に対する抗体を利用して、ＭＥＦ共培養で形成される推定ｉＰＳＣコロニーに蛍光標識するものである。コロニーの蛍光標識パターンおよびコロニーの形態を比較することにより、多能性の質的評価基準であるスコアをコロニーに割り当てる。このスコア化システムは、さらなる特徴付けのための推定ｉＰＳ細胞の選択的な増大を容易にする。
リプログラミング因子を形質導入した後、ヒト細胞を、ＭＥＦ上で１５〜３０日間共培養する。この期間中、細胞を、コロニー形成について視覚的に検査するべきである。コロニーを視認できるが、過度に増殖していない場合は、存在するコロニーの総数をカウントまたは推定する。
リプログラミングベクター（複数可）が蛍光レポーターを含まない場合は、次の工程に進み：コロニーの採取の１日または２日前に、（手順８にしたがって）ゼラチンが被覆された６ウェルプレートもしくは９６ウェルプレートまたは１０ｃｍ皿のセット照射ＭＥＦを蒔く。
リプログラミングベクター（複数可）が蛍光レポーターを含む場合は、新生コロニーを、蛍光顕微鏡下で監視するべきである。蛍光コロニーおよび非蛍光コロニーの記録をとる。リプログラミング事象は、典型的には蛍光レポーターを抑制する。しかしながら、場合によっては、細胞は、蛍光を維持することもある。このため、レポーターの蛍光スペクトルと重複する蛍光スペクトルをもつ蛍光抗体（以下）の使用を回避することが重要である。
抗Ｔｒａ１−６０生細胞の標識化プロトコルを次のように行う：染色するウェルをＤＭＥＭ／Ｆ１２（無血清）培地で２回洗浄する。一次抗体を増殖培地（ｈＥＳ）で作業希釈倍率まで希釈する。希釈した抗体を０．２２μｍ滅菌フィルターでろ過する。希釈した一
次抗体を細胞に添加する。十分な容量を添加して単層を覆う。３７℃、５％ＣＯ２で４５分間〜１時間インキュベートする。細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で２回洗浄する。注意：蛍光標識一次抗体を使用する場合は、培地を新鮮なｈＥＳに交換し、細胞を撮像する。そうでない場合は：二次抗体を増殖培地（ｈＥＳ）で希釈する。希釈した二次抗体を０．２２μｍ滅菌フィルターでろ過する。希釈した抗体を細胞に添加する。３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートする。細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２で１回洗浄し、培地を新鮮なｈＥＳ＋ＣＭに交換し、蛍光顕微鏡で撮像する。
多数のコロニーが存在する場合は、デジタル画像を取得して観察してからスコアを付ける。２〜３のコロニーのみの場合は、サンプルを顕微鏡で観察して、各コロニーにスコアを付ける。以下の記載にしたがって、明視野顕微鏡で「形態」スコアを付ける：１＝コロニーは、部分的にリプログラミングされたとして表現され；コロニーは、拡散した境界、および／または境界における分化細胞；および／または認識できる細胞質および核を有する線維芽細胞様の分化細胞を有する。２＝コロニーは、手作業で採取できるほど明確であり；このコロニーは、半連続の厳密な境界が分化部分によって中断された非分化細胞のコロニー（細胞質：核の比が小さい）、または完全に連続した厳密な境界が分化細胞のかさ（ｈａｌｏ）（「目玉焼き」形態）によって取り囲まれたコロニーを含み得る。３＝古典的な形態；厳密な境界を有し；分化細胞を含まないコロニーであり、細胞は、細胞質：核の比が小さい。
各コロニーを蛍光顕微鏡で視覚化して、０＝無標識；１＝弱いまたは斑点状；２＝不均一または不規則な標識パターン；明確な境界の証拠が殆どまたは全くない；３＝境界が明確な均一な標識：の記述にしたがって、「Ｔｒａ１−６０」スコアを付ける。
Ｔｒａ１−６０陽性コロニーを識別して採取する。スコアの最も高いコロニーを識別するためにプレートにインクで印を付ける。スコア「３−３」が理想的であるが、形態が理想よりも下のコロニー（例えば、「２−３」または「２−２」としてスコアが付けられ得るコロニー）を採取して増殖を成功させるための優先順位が存在する。
６ウェルプレート（または１０ｃｍ皿）からコロニーを採取するために、細胞を採取フードに移す。コロニーを解剖顕微鏡で視覚化して、コロニーの境界の周りの皿の表面に（「三目並べ」式に）手作業でピペットチップを引く。この操作により、コロニーが３〜６の断片に分割され、周囲のＭＥＦから離れるはずである。コロニーの断片をピペットチップ内に吸引する。（注意：元のウェル内に残る分離された断片が、再び付着して二次コロニーを形成する可能性があることに留意されたい。これは、コロニーのカウントおよびリプログラミング効率の推定を混乱させ得る）。断片を、ｈＥＳ培地＋１００ｎｇ／ｍｌのゼブラフィッシュｂＦＧＦが添加されたＭＥＦ（増殖培地）を含む６ウェルプレートの受入れウェルに直接移す。
コロニーを９６ウェル形式から採取するために、形態が良好でＴｒａ１−６０標識スコアが良好なコロニーが１つだけのウェルを識別する。培地をウェルから吸引する。ディスパーゼを添加し、３７℃で７分間インキュベートする。ピペッティングで穏やかに上下させてコロニーを分離する。コロニー断片を１５ｍｌ管に移し、ｈＥＳ培地で希釈する。３５０×ｇで１０分間遠心分離する。上清を吸引し、次いで増殖培地に再懸濁する。
断片を、増殖培地にＭＥＦを含む６ウェルプレートの受入ウェルに直接移す。コロニーの断片は、新たなＭＥＦに付着して複数の新たなコロニーを形成するはずである。２４時間後、培地を新鮮な増殖培地に交換する。細胞がコンフルエントになるまで増殖および形態を監視する。培地は、新鮮な増殖培地で毎日交換する。
実施例１０ 材料
実施例１〜９で使用される材料が、表５〜表７に示されている。
表５−試薬
表６
表７
実施例１１
ＣＤ３４＋造血細胞からのｉＰＳ細胞の作製
ＰＢＭＣを、実施例１に記載されているようにｌｅｕｋｏｐａｋまたは新たに採血された血液サンプルから単離した。製造者の取扱説明書にしたがって、間接ＣＤ３４マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、直接ＣＤ３４マイクロビーズキット、または系統細胞枯渇キット（ｌｉｎｅａｇｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｋｉｔ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＣＤ３４＋細胞のＭＡＣＳ分離を行った。ＣＤ３４＋ＭＡＣＳ精製細胞の画分をＦＡＣＳ分析のために収集し、残った細胞を、以下に示すＣＤ３４＋細胞増大培地を用いて低接着６ウェルプレートに再プレーティングした。ＣＤ３４＋細胞富化を、ＣＤ３４直接マイクロビーズまたは間接ＣＤ３４ハプテン抗体染色キットを用いて行うことができる。
表８．ＣＤ３４増大培地
ＣＤ３４＋細胞増大培地：Ｓｔｅｍ Ｐｒｏ ３４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造者の使用説明書にしたがって所望の容量の栄養補助剤と混合する。Ｓｔｅｍ Ｐｒｏコンプリートには、１００ｎｇ／ｍｌの組換えＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ、１００ｎｇ／ｍｌの組換えＦｌｔ−３リガンド、および２０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン−３（ＩＬ−３）が添加されている。この培地は、新鮮な１％グルタミンおよび１％ペニシリンストレプトマイシン溶液も添加されている。すべての補助剤を混合し、使用前に培地をろ過した。
細胞を、上記の方法によって、トランスフェクションの約２４時間前に播種した。また、２９３Ｔ細胞をレトロウイルス生産のためにトランスフェクトし、次いで造血細胞を、上記のようにＭＭＬＶレトロウイルスによって送達される（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＬｉｎ２８）遺伝子または（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ）遺伝子のいずれかをトランスフェクトした。これらの実験の結果として、上記の遺伝子のいずれかのセットをトランスフェクトされたＣＤ３４＋造血細胞により、新たなｉＰＳ細胞系の産生が得られたことが観察された。
以下のプロトコルを、ＭＭＬＶレトロウイルスを用いたＰＢＭＣのリプログラミングに使用した：ＭＡＣＳ ＬＳ分離カラムを、急速冷却のために−２０℃に置く（別法では、カラムおよびＭＡＣｓ緩衝液を４℃で一晩冷却しても良い）。適切な数のＰＢＭＣバイアルを解凍して、約３×１０８の細胞を収集する。細胞をＭＡＣＳ緩衝液で５ｍｌにする（手順中は緩衝液を低温に保つ）。１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を吸引し、ＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁する。血球計で細胞をカウントする。細胞懸濁液を１×１０８からなる３本の試験管に分けて、３００×ｇで１０分間遠心分離する。ＣＤ３４＋細胞富化を、ＣＤ３４直接マイクロビーズまたは間接ＣＤ３４ハプテン抗体染色キットを用いて行うことができる。各細胞ペレットを３００μｌのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁する。１本の試験管に付き１００μｌのＦｃＲブロッキング試薬を添加し、混合する。１本の試験管に付き１００μｌのＣＤ３４ハプテン抗体または直接ＣＤ３４ビーズを添加し、混合する。４℃で１５分間インキュベートする。細胞を５ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液で洗浄し、３００×ｇで１０分間遠心分離する。上清を完全に吸引する。細胞を５００μｌのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁する。１ステップのＣＤ３４直接マイクロビーズを使用する場合は、細胞を分離できる状態である。間接ＣＤ３４分離ビーズを使用する場合は、分離の前に抗ハプテンマイクロビーズと共にもう１回インキュベートする工程がある。１００μｌの抗ハプテンマイクロビーズを添加し、混合する。４℃で１５分間インキュベートする。細胞を２ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液で洗浄し、３００×ｇで１０分間遠心分離する。５００μｌのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁する。ＭＡＣＳ ＬＳカラムを４℃から取り出す。カラムを分離器の磁石の上に配置する。カラムを３ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液で洗い流す。細胞懸濁液をカラムに入れる。通過した未標識細胞を収集し、カラムを３ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液で洗浄する。洗浄をさらに２回繰り返す。カラムを磁石から移動させて、適切な収集管に入れる。３ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液を添加し、備え付けのプランジャーを用いてカラムから洗い出し富化ＣＤ３４＋細胞画分を収集する。ＦＡＣＳ分析のために富化集団の画分を収集する。ＣＤ３４＋細胞増大培地を用いて低接着６ウェルプレートに残った細胞を再プレーティングする。系統細胞枯渇キットを用いる場合は、細胞を系統陽性抗体（ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＣＤ２３５ａ）のビオチン化カクテルと共にインキュベートして、成熟造血細胞型、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、顆粒球、赤血球系細胞を除去する。インキュベーションの後、細胞を洗浄し、抗ビオチンマイクロビーズと共にインキュベートする。細胞懸濁液を洗浄し、手作業によりカラムで分離する、またはＡｕｔｏＭＡＣｓ細胞分離器を用いて分離する。
ｉＰＳコロニーの識別および採取を以下の方法で行った：形態学的に、コロニーは、一般に高密度であり、拡大した核および２つの別個の核小体をもつ緻密な小細胞からなっていた。コロニーは、しばしば、このような独特の特徴を観察するには密度が高すぎて、コロニーの中心に分化した物質を有するようである。コロニーの境界は、通常は明確である。しかしながら、血液ｉＰＳ細胞（ＢｉＰＳＣ）は、より拡散しており、線維芽細胞由来の以前のｉＰＳＣに典型的には一致しない特徴である毛羽立ったような境界を有するようにみえた。コロニーは、組み込まれたウイルスＤＮＡからのＧＦＰおよびＲＦＰの発現を抑制する。一部の真正のコロニーは、感染の２０日後に蛍光を消失し、一部の真正のコロニーは、感染の約３５〜４０日後に採取して移してから蛍光を消失した。すべてのコロニーは、ＧＦＰおよびＲＦＰを発現しないはずである（ただし、ある程度の発現が、近傍の単一細胞で確認された）。手作業で採取するために、ピペットチップを用いてコロニーを３〜６の断片に分割して、幹細胞が周囲のＭＥＦおよび造血幹細胞から離れやすくした。採取は、総コロニーのカウントの混乱を回避するため、すなわちコロニーの小塊が再定住して新たなクローンとして誤ってカウントされないようにするために複数のコロニーが形成されるまでは見合わせた。次いで、細胞を、ｈＥＳ培地＋１００ｎｇ／ｍｌのゼブラフィッシュｂＦＧＦが添加されたＭＥＦを含む６ウェルプレートの受入ウェルに直接移した。クローンが実際に完全にリプログラミングされたことを確実にするために、増殖、形態、および蛍光の消失を１〜２週間にわたって監視した。細胞に毎日栄養補給した。採取してプレーティングしたコロニーが接着して特徴的なＥＳ様形態を示したら、コロニーを、上記のように再び手作業で６ウェルＭＥＦプレートの新たなセットに移し、毎日栄養補給した。ウェルがコンフルエントになると、コラゲナーゼを用いて通常のｉＰＳＣ系として継代し、様々な継代でアリコートを凍結し、各セットに対して試験解凍を行う。
採取して増大させたコロニーを、多能性マーカー（ＳＳＥＡ−４、Ｏｃｔ３／４、Ｔｒａ−１６０、およびＴｒａ−１８１）の存在について染色する。また、コロニーを、アルカリホスファターゼ活性の存在についても染色する。クローンを、通常の核型の存在について検査し、ｉＰＳクローンの同一性が、ＦＩＳＨ分析によって親細胞型に対して確認された。これらの検査の結果は、ＣＤ３４＋細胞のｉＰＳ細胞への変換が成功したことを示した。ＣＤ３４＋細胞に（Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ−４）をトランスフェクトしたときのトランスフェクション効率が高いことが観察されたが、ＣＤ３４＋細胞の（Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８）因子でのトランスフェクションに由来するｉＰＳ細胞が、照射ＭＥＦおよびＭａｔｒｉｇｅｌでのクローンの維持の間により安定であることが観察された。さらなる実験では、ｌｅｕｋｏｐａｋおよびドナー血液から得たＣＤ３４＋細胞を、（Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ−４）を用いたトランスフェクションによってｉＰＳ細胞に変換することに成功した。始原細胞型のリプログラミング効率は、１００，０００細胞当たり約１０コロニーであることが観察された。
本明細書に開示され請求されるすべての方法は、本開示から、過度の実験をしなくても構築および実施され得る。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して記載してきたが、本発明の概念、趣旨、および範囲から逸脱することなく、変形形態が、本明細書に記載された方法ならびにその方法の工程または順序だった工程に適用できることは当業者には明らかである。より詳細には、化学的および生理学的の両方に関連する特定の作用物質が、本明細書に記載された作用物質の代替となり得、同じまたは同様の結果が達成されることは明らかである。当業者には明らかなすべてのこのような同様の代替物および変更は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の趣旨、範囲、および概念の中に包含されると見なされる。
参照文献
以下に示す参照文献は、本明細書の記載を補足する例示的な手順または他の詳細を提供する程度に、参照により本明細書に明確に組み入れられる。

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  1. 本願明細書に記載された発明。
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