JP6865199B2 - リプログラミングt細胞および造血細胞 - Google Patents
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Description
本願は、2009年6月5日に出願された米国仮特許出願第61/184,546号、および2009年9月4日に出願された米国仮特許出願第61/240,116号の優先権を主張し、これらの米国仮特許出願の全体の開示は、本明細書中に参考として援用される。
本発明は、分子生物学および幹細胞の分野全般に関する。詳細には、本発明は、体細胞、特にT細胞および造血細胞に関する。
一般に、幹細胞は、一連の成熟機能細胞を生じさせることができる未分化細胞である。例えば、造血幹細胞は、様々な種類の最終分化血液細胞のいずれも生じさせることができる。胚性幹(ES)細胞は、胚に由来し、多能性であるため、あらゆる器官もしくは組織型、または少なくとも潜在的に完全な胚に発達する能力を有する。
本発明は、リプログラミングによるT細胞および/または造血始原細胞由来の人工多能性幹細胞の作製における当技術分野での主な障害を解消する。本方法では、T細胞の臨床的に入手しやすい供給源、例えば、3mlの全血サンプルからiPS細胞を産生させることができ、造血細胞の動員が必要ない。他の実施形態では、造血細胞、例えば、ヒトまたは哺乳動物のCD34+、CD45+、CD43+造血前駆細胞を、血液サンプルから得て、iPS細胞に変換することができる。造血前駆細胞は、例えば、CD34+細胞の富化または非CD34+細胞系統の枯渇によって、末梢血の血液サンプルから得ることができる。特定の実施形態では、CD34+造血細胞は、血液サンプルを得る前に被験体でCD34+造血始原細胞を動員することなく得た血液サンプル、例えば、冷蔵または凍結保存血液サンプルから得ることができる。このようにして、iPS細胞は、血液バンクで見られる末梢血サンプルを含め、様々な血液サンプルから作製することができる。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
T細胞またはCD34+造血始原細胞から人工多能性幹細胞を作製する方法であって、
(a)T細胞またはCD34+造血始原細胞を含む細胞集団を入手する工程であって、前記CD34+造血始原細胞が、被験体に由来し、前記被験体の細胞が、外的に加えられる顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)で動員されていない、工程と、
(b)前記細胞集団の前記T細胞またはCD34+造血始原細胞からiPS細胞を産生させて、iPS細胞集団を提供する工程と、を含む、方法。
(項目2)
前記細胞集団の供給源が、血液サンプル、血液成分、骨髄、リンパ節、胎児肝臓、または臍帯である、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記細胞集団の供給源が、約1〜約5mlの血液サンプルである、項目2に記載の方法。(項目4)
前記細胞集団の供給源が、約3mlの血液サンプルである、項目3に記載の方法。
(項目5)
T細胞を含む前記細胞集団の供給源が被験体であり、前記被験体の細胞が、外的に加えられるG−CSFで動員されていない、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記細胞集団が凍結保存されている、項目1に記載の方法。
(項目7)
T細胞を含む前記細胞集団を、前記T細胞を活性化させる条件下でin vitroまたin vivoで調製する、項目1に記載の方法。
(項目8)
T細胞を含む細胞集団を、抗CD3抗体の存在下で培養する、項目7に記載の方法。
(項目9)
T細胞またはCD34+造血始原細胞を含む前記細胞集団を1つ以上のサイトカインと共にin vitroで培養して、その中で前記T細胞またはCD34+造血始原細胞の細胞集団を増大させる、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記細胞集団がT細胞を含み、前記1つ以上のサイトカインがIL−2を含む、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記細胞集団がCD34+造血始原細胞を含み、前記1つ以上のサイトカインが、SCF、Flt3L、またはIL−3の少なくとも1つを含む、項目9に記載の方法。
(項目12)
前記T細胞がヒトT細胞である、項目1に記載の方法。
(項目13)
前記CD34+造血始原細胞が、ヒトCD34+造血始原細胞である、項目1に記載の方法。
(項目14)
前記T細胞が、CD4+T細胞またはCD8+T細胞である、項目1に記載の方法。
(項目15)
前記T細胞が、Tヘルパー1(TH1)細胞、Tヘルパー2(TH2)細胞、TH17細胞、細胞傷害性T細胞、調節性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、ナイーブT細胞、記憶T細胞、またはγδT細胞である、項目1に記載の方法。
(項目16)
前記細胞集団が、約90%〜約99%のT細胞を含む、項目1に記載の方法。
(項目17)
前記細胞集団が、約97%〜約99%のT細胞を含む、項目1に記載の方法。
(項目18)
前記細胞集団が、少なくとも1×103のT細胞を含む、項目1に記載の方法。
(項目19)
前記細胞集団が、少なくとも5×103のT細胞を含む、項目1に記載の方法。
(項目20)
前記細胞集団が、約1×106〜約2×106のT細胞を含む、項目1に記載の方法。
(項目21)
前記集団の前記T細胞またはCD34+造血始原細胞からiPS細胞を産生させる工程が、1つ以上のリプログラミング因子を前記T細胞またはCD34+造血始原細胞に導入する工程を含む、項目1に記載の方法。
(項目22)
前記リプログラミング因子が、Soxファミリータンパク質およびOctファミリータンパク質を含むリプログラミングタンパク質である、項目21に記載の方法。
(項目23)
1つ以上の前記リプログラミングタンパク質が、タンパク質形質導入ドメインに作用的に連結されている、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記リプログラミング因子が、1つ以上の発現カセットによってコードされ、Soxファミリータンパク質およびOctファミリータンパク質を含む、項目21に記載の方法。
(項目25)
前記1つ以上の発現カセットが、少なくとも1つのポリシストロニック転写単位を含む、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記ポリシストロニック転写単位が、少なくとも2つのリプログラミング遺伝子を含む、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記ポリシストロニック転写単位が、Sox遺伝子およびOct遺伝子を含む、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記ポリシストロニック転写単位が、cMyc遺伝子およびKlf4遺伝子を含む、項目26に記載の方法。
(項目29)
前記ポリシストロニック転写単位が、Nanog遺伝子およびLin28遺伝子を含む、項目26に記載の方法。
(項目30)
前記ポリシストロニック転写単位が、リプログラミング遺伝子および選択またはスクリーニングマーカーを含む、項目25に記載の方法。
(項目31)
前記ポリシストロニック転写単位が、内部リボソーム侵入部位(IRES)、または少なくとも1つのプロテアーゼ切断部位および/またはポリシストロニック転写のための自己切断ペプチドをコードする配列を含む、項目25に記載の方法。
(項目32)
前記1つ以上の発現カセットが、ウイルスベクター、エピソームベクター、またはトランスポゾンからなる群から選択されるリプログラミングベクターに含められている、項目24に記載の方法。
(項目33)
前記リプログラミングベクターが、レトロウイルスベクターである、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記Soxファミリータンパク質がSox2である、項目22または24のいずれかに記載の方法。
(項目35)
前記Octファミリータンパク質がOct4である、項目22または24のいずれかに記載の方法。
(項目36)
前記リプログラミングタンパク質が、Nanog、Lin28、c−Myc、Klf4、またはEsrrbをさらに含む、項目22または24のいずれかに記載の方法。
(項目37)
前記リプログラミングタンパク質が、Nanogをさらに含む、項目36に記載の方法。(項目38)
前記リプログラミングタンパク質が、Klf4およびc−Mycをさらに含む、項目36に記載の方法。
(項目39)
前記集団の前記T細胞またはCD34+造血始原細胞からiPS細胞を産生させる工程が、胚性幹細胞の1つ以上の特性について前記iPS細胞を選択する工程をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目40)
前記特性が、接着性、未分化形態、胚性幹細胞特異的マーカー、または多能性である、項目39に記載の方法。
(項目41)
前記特性が接着性である、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記特性が未分化形態である、項目40に記載の方法。
(項目43)
前記方法が、前記iPS細胞を分化細胞に分化させる工程を含む、項目1に記載の方法。(項目44)
前記分化細胞が、心筋細胞、造血細胞、ニューロン、線維芽細胞、または表皮細胞を含む、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記iPS細胞集団が、組み込まれた外来性ウイルス要素を本質的に含まない、項目1に記載の方法。
(項目46)
項目1〜45のいずれか1項に記載の方法に従って産生させた人工多能性幹細胞。
(項目47)
胚性幹細胞と比較して、不完全なセットのT細胞受容体遺伝子のV、D、およびJセグメントを含むゲノムを含む人工多能性幹細胞。
(項目48)
前記人工多能性幹細胞がヒト細胞である、項目47に記載の人工多能性幹細胞。
(項目49)
前記人工多能性幹細胞が、組み込まれた外来性ウイルス要素を含まない、または組み込まれた外来性ウイルス要素を本質的に含まない、項目47に記載の人工多能性幹細胞。
規定の因子、例えば、SOX2、OCT4、NANOG、およびLIN28、またはSOX2、OCT4、c−Myc、およびKLF4(Yuら、2007;Takahashiら、2007b)などのウイルスによる輸送によるin vitroでの体細胞の未分化多能性状態へのリプログラミングは、複数の細胞型を用いた患者固有のヒトiPSC細胞の作製の道を開いた(Lohら、2009;Aasenら、2008)。この前提は、遺伝子の一過性の発現によるiPSCの誘導によって、または適切な転写因子のタンパク質による形質導入によってさらに前進した(Yuら、2009;Zhouら、2009)。今日まで、ヒトにおけるiPSC研究の大部分は、細胞供給源として線維芽細胞に焦点を当ててきた。線維芽細胞は、市販されていることと遺伝子送達の容易さから出発材料として特定の利点を提供するが、侵襲性の皮膚生検が必要であり、かつ一次組織から安定した系を樹立するのが困難であるため、iPSC系の大量の臨床での誘導には最適以下である。非動員末梢血は、患者サンプルを入手しやすいため恐らくリプログラミングのための理想的な細胞供給源である(MaheraliおよびHochedlinger、2008)。加えて、生体ドナーおよび死亡したドナーからの多数の凍結血液サンプルが、世界中の生物保管施設(biorepository)に保存されている(Kleebergerら、1999)。
「リプログラミング」は、リプログラミングを行わない同じ条件下よりも、培養下またはin vivoで少なくとも1つの新たな細胞型の子孫を形成する、測定可能に増大した能力を細胞に付与するプロセスである。より具体的には、リプログラミングは、体細胞に多能性潜在能力を付与するプロセスである。これは、リプログラミングの前には新たな細胞型の表現型特性を有する子孫が本質的に形成できなくても、十分な増殖後に、測定可能な割合の子孫が新たな細胞型の表現型特性を有すること、別な方法では、新たな細胞型の特性を有する子孫の割合が、リプログラミングの前よりも測定可能な程度に多いことを意味する。特定の条件下で、新たな細胞型の特性をもつ子孫の割合は、少なくとも約1%、5%、25%、またはそれより多くであり得、この順序で優先度が増している。
本発明の特定の実施形態では、リプログラミング因子を体細胞に導入することによって体細胞、特にT細胞をリプログラミングする方法が開示される。これらの細胞の子孫は、以下に記載する様々な態様で胚性幹細胞と同一であり得るが、外来性遺伝要素を本質的に含まない。胚性幹細胞の特性を理解することが、人工多能性幹細胞の選択に役立ち得る。幹細胞のリプログラミングの研究から公知のリプログラミング因子を、これらの新規な方法に使用することができる。胚性幹細胞の使用に対する倫理的ハードルのために、これらの人工多能性幹細胞を、治療および研究用途として胚性幹細胞の代わりに潜在的に使用できることをさらに意図する。
幹細胞は、すべてではないにしても殆どの多細胞生物で見られる細胞である。幹細胞は、有糸細胞分裂によって自身を再生する能力、および様々な特殊化した細胞型への分化によって特徴付けられる。広義の2種類の哺乳動物幹細胞は、胚盤胞で見られる胚性幹細胞および成体の組織で見られる成体幹細胞である。発達中の胚では、幹細胞は、特殊化した胚組織のすべてに分化することができる。成体生物では、幹細胞および始原細胞は、体の修復系として機能して、特殊化した細胞を補充するだけではなく、血液、皮膚、または腸組織などの再生器官の正常な代謝回転を維持する。
胚性幹細胞系(ES細胞系)は、胚盤胞または初期桑実期胚の内細胞塊(ICM)の胚盤葉上層組織由来の細胞の培養物である。胚盤胞は、ヒトでは約4〜5日齢の初期胚であり、50〜150の細胞からなっている。ES細胞は、多能性であり、発達中に3つの主要な胚葉:外胚葉、内胚葉、および中胚葉のすべての誘導体を発生させる。言い換えれば、ES細胞は、特定の細胞型にとって十分かつ必要な刺激が与えられると、成体の体の200を超える細胞型のそれぞれに発達することができる。ES細胞は、胚外膜または胎盤に寄与しない。
iPS細胞の作製には、誘導のために使用されるリプログラミング因子が極めて重要である。以下の因子またはそれらの組合せは、本発明に開示される方法に使用することができる。特定の態様では、SoxおよびOct(特にOct3/4)をコードする核酸が、リプログラミングベクターに導入される。例えば、1つ以上のリプログラミングベクターは、Sox2、Oct4、Nanog、および必要に応じてLin28をコードする発現カセット、またはSox2、Oct4、Klf4、および必要に応じてc−Mycをコードする発現カセット、またはSox2、Oct4、および必要に応じてEsrrbをコードする発現カセット、またはSox2、Oct4、Nanog、Lin28、Klf4、c−Myc、および必要に応じてSV40ラージT抗原をコードする発現カセットを含み得る。これらのリプログラミング因子をコードする核酸は、同じ発現カセット、異なる発現カセット、同じリプログラミングベクター、または異なるリプログラミングベクターの中に含められ得る。
当技術分野で一般に使用される皮膚線維芽細胞に加えて、代替の供給源からiPS細胞を提供するために、T細胞を含む細胞集団をリプログラミングする方法を提供する。特定の実施形態では、リプログラミングのためにかなりの数のT細胞を提供するためにT細胞を活性化して増殖させる。
用語「T細胞」は、当技術分野で定義されるTリンパ球を指し、胸腺細胞、未成熟Tリンパ球、成熟Tリンパ球、休止Tリンパ球、または活性化Tリンパ球を含むものとする。T細胞は、CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD4+CD8+T細胞、またはCD4−CD8−細胞とすることができる。T細胞はまた、Tヘルパー細胞、例えば、Tヘルパー1(TH1)またはTヘルパー2(TH2)細胞、またはTH17細胞、および細胞傷害性T細胞、調節性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、ナイーブT細胞、記憶T細胞、またはγδT細胞とすることもできる(Wilsonら、2009;Wynn、2005;Ladiら、2006)。少なくとも1つのマーカー、例えば、CD4などによって互いに異なるT細胞を、本明細書ではT細胞の「サブセット」と呼ぶ。
.305%±4.7;CD3+CD45RA=45.00%±7.19;CD3+CD45RO+=27.21%±7.34。
造血幹細胞および造血始原細胞が医療用途においてかなりの将来性があるため、造血始原細胞の胚性幹細胞からの分化の改善された方法を試すために相当な研究が行われてきた。ヒト成人では、主に骨髄に存在する造血幹細胞が、血液系のあらゆる細胞に分化する、活発に分裂する造血(CD34+)始原細胞の不均一な集団を産生する。CD34+内皮細胞をiPS細胞に変換できると予測されるが、特定の実施形態では、内皮細胞ではない造血細胞を使用するのが望ましいことがある:例えば、場合によっては、CD31やVEカドヘリンを発現しない造血始原細胞または造血前駆細胞を使用するのが望ましいことがある。他のマーカー、例えば、CD43および/またはCD45マーカーも、造血始原細胞の同定を容易にするために使用することができる(例えば、Kadaja−Saarepuuら、2008;Vodyanikら、2006)。造血細胞は、CD43(+)CD235a(+)CD41a(+/−)(赤血球−巨核球形成)細胞、lin(−)CD34(+)CD43(+)CD45(−)(多能性)細胞、およびlin(−)CD34(+)CD43(+)CD45(+)(骨髄性スキュー)細胞を含む始原造血細胞の様々なサブセットを含む。ヒト成人では、造血始原細胞は、増殖して分化し、数千億の成熟血液細胞を毎日産生する。造血始原細胞は、臍帯血にも存在する。in vitroで、ヒト胚性幹細胞は、造血始原細胞に分化し得る。造血始原細胞はまた、末梢血のサンプルから増大または富化することができる。造血細胞は、ヒト起源、ネズミ起源、または任意の他の哺乳動物種起源であり得る。
造血幹細胞(HSC)は、通常は骨髄に存在するが、末梢血でかなりの数のHSCを採取するために臨床的に使用される動員と呼ばれるプロセスで血液中に強制的に移動させることができる。1つの動員剤の選択は、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)である。
特定の態様では、T細胞を、T細胞受容体に結合してT細胞活性化のシグナル伝達カスケードを作動させる作用物質によって活性化する。例えば、CD3抗体を使用することができる。T細胞をかなりの数に増大させてリプログラミングのための増殖状態にするために、IL−2などのサイトカインを用いることもできる。
本発明者らは、T細胞受容体でのV(D)J組換えがT細胞のリプログラミングを阻害しないことを見出した。T細胞由来のiPS細胞の特定の再構成は、特定の態様において、iPS細胞を追跡してiPS細胞の様々な集団を同定するための固有の「バーコード」として役立ち得る。さらなる態様では、V、D、J遺伝子セグメントの原型のセットを有する胚性幹細胞と比較して、V、D、J遺伝子セグメントの不完全なセットを有するiPS細胞を提供することもできる。これらのiPS細胞のV、D、J遺伝子セグメントの再構成は、クローン集団内では同じであり得るが、異なるクローン集団間では異なり得る。具体的な態様では、γ/δTCR+T細胞は、本方法でリプログラミングすることもできる。このT細胞集団の1つを起源とするiPSクローンは、生殖細胞系の構成に酷似したゲノムを有し得、したがって、例えば、より強健なレパートリーのT細胞また他の分化細胞に再分化できる場合があるため有利であり得る。
本発明の特定の態様では、リプログラミング因子を、1つ以上のベクター、例えば、組み込み型ベクターまたはエピソームベクターに含まれる発現カセットから発現させる。さらなる態様では、リプログラミングタンパク質を、タンパク質形質導入によって体細胞に直接導入することができる(参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第61/172,079号を参照されたい)。
iPS細胞は、本発明では、リプログラミングタンパク質をコードする特定の核酸または遺伝子の非多能性細胞、例えば、T細胞または造血前駆細胞へのトランスフェクションによって得ることができる。トランスフェクションは、典型的には、現行方式ではレトロウイルスなどの組み込み型ウイルスベクターによって達成される。トランスフェクトされた遺伝子は、マスター転写調節因子Oct4(Pouf51)およびSox2を含み得るが、他の遺伝子も誘導効率を高めることが示唆されている。臨界期の後、少数のトランスフェクトされた細胞が、多能性幹細胞に形態学的および生化学的に類似し始め、形態学的選択、倍加時間によって、またはレポーター遺伝子および抗生物質感染によって単離することができる。
これらのリプログラミング法は、染色体外で複製するベクター(すなわち、エピソームベクター)を使用することもでき、エピソームベクターは、エピソームとして複製して外来ベクターまたはウイルス要素を本質的に含まないiPS細胞を作製できるベクターである(参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第61/058,858号を参照されたい;Yuら、2009)。多数のDNAウイルス、例えば、アデノウイルス、サル空胞形成ウイルス40(SV40)またはウシ・パピローマ・ウイルス(BPV)、または出芽酵母ARS(自己複製配列)含有プラスミドは、哺乳動物細胞おいて染色体外で、またはエピソームとして複製する。これらのエピソームプラスミドは、組み込みベクターに関連したこれらのすべての不都合(Bodeら、2001)が本質的にない。例えば、上記定義されたように、エプスタイン・バー・ウイルス(EBV)を含むリンパ球指向性ヘルペスウイルスをベースとしたものは、染色体外で複製し、体細胞にリプログラミング遺伝子を送達するのに役立ち得る。
外来性遺伝子改変が標的細胞に導入されるのを回避する1つの可能な方法は、送達される遺伝子の転写に依存するのではなく、リプログラミングタンパク質を直接細胞に導入することである。以前の研究により、タンパク質形質導入を媒介する短ペプチド、例えば、HIV tatおよびポリアルギニンを様々なタンパク質に結合することによって、in
vitroおよびin vivoでこれらのタンパク質を細胞に送達できることが実証されている。近年の研究により、組換えリプログラミングタンパク質を直接送達することによって、マウス線維芽細胞を多能性幹細胞に完全にリプログラミングできることが実証された(Zhouら、2009)。タンパク質形質導入で細胞をリプログラミングする方法をさらに詳細にまとめたものが、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第61/172,079号に開示されている。
特定の実施形態では、リプログラミングベクターは、細胞内で、上記されたリプログラミング因子をコードする核酸配列に加えて追加の要素を含むように構築することができる。これらのベクター成分および送達方法の詳細は以下に開示される。
当業者であれば、標準的な組換え技術によってベクターを構築する十分な能力を備えているであろう(例えば、それぞれ参照により本明細書に組み入れられるManiatisら、1988、およびAusubelら、1994を参照されたい)。
ベクター内に含められる真核生物発現カセットは、特に、タンパク質コード配列、介在配列を含むスプライシングシグナル、および転写停止/ポリアデニル化配列に作動可能に連結された真核生物転写プロモーターを含む(5’から3’方向に)。
「プロモーター」は、転写の開始および速度が制御される核酸配列の領域である制御配列である。プロモーターは、調節タンパク質および分子がRNAポリメラーゼおよび他の転写因子などに結合して核酸配列の特異的な転写を開始することができる遺伝要素を含み得る。句「作用的に配置された」、「作用的に連結された」、「制御下」および「転写制御下」は、プロモーターが、核酸配列に対して正確な機能位置および/または向きにあって、核酸配列の転写開始および/または発現を制御することを意味する。
本発明による特定の態様では、マーカーまたはリプログラミングタンパク質をコードする遺伝子を、プロテアーゼ切断部位(すなわち、プロテーゼ認識部位を含む配列)または少なくとも1つの自己切断ペプチドをコードする配列(2つ以上存在し得る)によって互いに連結することができる。
ベクターは、複数のクローニング部位(MCS)を含み得、このMCSは、複数の制限酵素部位を含む核酸領域であり、どの制限酵素部位も、標準的な組換え技術とともに使用してベクターを消化することができる(例えば、参照により本明細書に組み入れられるCarbonelliら、1999、Levensonら、1998、およびCocea、1997を参照されたい)。「制限酵素消化」は、核酸分子の特定の位置でのみ機能する酵素を用いた核酸分子の触媒的切断を指す。これらの制限酵素の多くは市販されている。このような酵素の使用は、当業者には広く理解されている。しばしば、ベクターは、MCS内で切断して外来性配列のベクターへのライゲーションを可能にする制限酵素を使用して線状化または断片化される。「ライゲーション」とは、2つの核酸断片間にホスホジエステル結合を形成するプロセスを指し、これらの断片は互いに連続していても良いし、連続していなくても良い。制限酵素およびライゲーション反応を伴う技術は、組換え技術の当業者には周知である。
殆どの転写された真核生物RNA分子は、一次転写物からイントロンを除去するためのRNAスプライシングを受ける。真核生物ゲノム配列を含むベクターは、タンパク質発現のための転写物の適切なプロセシングを確実にするためにドナースプライシング部位および/またはアクセプタースプライシング部位を必要とし得る(例えば、参照により本明細書に組み入れられるChandlerら、1997を参照されたい)。
本発明のベクターまたは構築物は、一般に、少なくとも1つの終結シグナルを含む。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、RNAポリメラーゼによるRNA転写物の特異的な終結に関与するDNA配列から構成されている。したがって、特定の実施形態では、RNA転写物の産生を終了させる終結シグナルを意図している。ターミネーターは、望ましいメッセージのレベルを達成するためにin vivoで必要であり得る。
発現、特に真核生物の発現では、典型的には、ターミネーターは、転写物の適切なポリアデニル化を生じさせるポリアデニル化シグナルを含む。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実施の成功にとって重要であるとは考えられていないが、任意のこのような配列を利用することができる。好ましい実施形態は、様々な標的細胞で十分に機能することが知られている便利なSV40ポリアデニル化シグナルまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む。ポリアデニル化は、転写物の安定性を向上させることができ、または細胞質輸送を容易にすることができる。
宿主細胞でベクターを増殖させるために、ベクターは、複製部位の1つ以上の起点(しばしば「ori」と呼ばれる)、例えば、上記のEBVのoriPまたは遺伝子組換えoriPに一致する核酸配列を含むことができ、この遺伝子組換えoriPは、分化プログラミングでの機能が同じまたは向上した、複製が開始される特定の核酸配列である。別法では、上記の他の染色体外複製ウイルスの複製起点または自己複製配列(ARS)を利用することができる。
本発明の特定の実施形態では、本発明の核酸構築物を含む細胞は、発現ベクターにマーカーを含めることによって、in vitroまたはin vivoで同定することができる。このようなマーカーは、識別可能な変化を細胞に付与して、発現ベクターを含む細胞の容易な同定を可能にすることができる。一般に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するマーカーである。陽性選択マーカーは、そのマーカーの存在がその選択を可能にするマーカーであるのに対して、陰性選択マーカーは、そのマーカーの存在がその選択を妨げるマーカーである。陽性選択マーカーの例は、薬剤耐性マーカーである。
本発明を用いたリプログラミングベクターの体細胞内への導入では、本明細書に記載された、または当業者に公知である細胞の形質転換のための核酸送達の任意の適切な方法を使用することができる。このような方法には、限定されるものではないが、ex vivoトランスフェクション(Wilsonら、1989、Nabelら、1989)、微量注入(HarlandおよびWeintraub、1985;参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,789,215号)を含む注入(それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,994,624号、同第5,981,274号、同第5,945,100号、同第5,780,448号、同第5,736,524号、同第5,702,932号、同第5,656,610号、同第5,589,466号、および同第5,580,859号);エレクトロポレーション(参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,384,253号;Tur−Kaspaら、1986;Potterら、1984);リン酸カルシウム沈殿(GrahamおよびVan Der Eb、1973;ChenおよびOkayama、1987;Rippeら、1990);DEAE−デキストランの使用およびこれに続くポリエチレングリコールの使用(Gopal、1985);直接超音波負荷(Fechheimerら、1987);リポソーム媒介トランスフェクション(NicolauおよびSene、1982;Fraleyら、1979;Nicolauら、1987;Wongら、1980;Kanedaら、1989;Katoら、1991)、および受容体媒介トランスフェクション(WuおよびWu、1987;WuおよびWu、1988);微粒子銃(それぞれ参照により本明細書に組み入れられる国際出願第94/09699号および同第95/06128号;米国特許第5,610,042号、同第5,322,783号、同第5,563,055号、同第5,550,318号、同第5,538,877号、および同第5,538,880号);炭化ケイ素繊維を用いた攪拌(Kaepplerら、1990;それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,302,523号および同第5,464,765号);Agrobacterium媒介形質転換(それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,591,616号および同第5,563,055号);プロトプラストのPEG媒介形質転換(Omirullehら、1993;それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,684,611号および同第4,952,500号);乾燥/阻害媒介DNA取り込み(Potrykusら、1985)、およびこのような方法の任意の組み合わせなどによるDNAの直接送達が含まれる。これらのような技術の適用によって、細胞小器官(複数可)、細胞(複数可)、組織(複数可)、または生物(複数可)を安定的または一過性に形質転換することができる。
本発明の特定の実施形態では、核酸は、例えば、リポソームなどの脂質複合体の中に閉じ込めることができる。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部の水性媒体によって特徴付けられる小胞構造物である。多重膜リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。多重膜リポソームは、リン脂質が過剰の水溶液中で懸濁されると自然に生じる。脂質成分は、密閉構造物が形成される前に自己再構成され、脂質二重層間に水および溶解した溶質を閉じ込める(GhoshおよびBachhawat、1991)
。また、Lipofectamine(Gibco BRL)またはSuperfect(Qiagen)と複合体を形成した核酸も意図している。使用されるリポソームの量は、リポソームの性質ならびに使用される細胞によって様々であり得、例えば、細胞1,000,000〜10,000,000に対して約5〜約20μgのベクターDNAを意図し得る。
本発明の特定の実施形態では、核酸は、エレクトロポレーションによって細胞に導入される。エレクトロポレーションは、細胞の懸濁液およびDNAの高電圧放電への曝露を含む。レシピエント細胞は、機械的創傷によってさらに形質転換しやすくすることができる。また、使用されるベクターの量は、使用される細胞の性質によって様々であり得、例えば、細胞1,000,000〜10,000,000に対して約5〜約20μgのベクターDNAを意図し得る。
本発明の他の実施形態では、核酸は、リン酸カルシウム沈殿を用いて細胞に導入される。ヒトKB細胞が、この技術を用いてアデノウイルス5DNA(GrahamおよびVan Der Eb、1973)をトランスフェクトされた。同様に、この方式で、マウスL(A9)、マウスC127、CHO、CV−1、BHK、NIH3T3、およびHeLa細胞が、ネオマイシンマーカー遺伝子(ChenおよびOkayama、1987)をトランスフェクトされ、ラット肝細胞が、様々なマーカー遺伝子(Rippeら、1990)をトランスフェクトされた。
別の実施形態では、核酸は、DEAE−デキストラン、続いてポリエチレングリコールを用いて細胞に送達される。この方式で、レポータープラスミドが、マウス骨髄腫細胞および赤白血病細胞に導入された(Gopal、1985)。
なおさらに、核酸は、受容体媒介送達ビヒクルによって標的細胞に送達することができる。受容体媒介送達ビヒクルは、標的細胞で起こる受容体媒介エンドサイトーシスによる高分子の選択的な取り込みを利用している。様々な受容体の細胞型特異的分布から見て、この送達方法は、別の程度の特異性を本発明に付加する。
微粒子銃技術は、少なくとも1つの細胞小器官、細胞、組織、または生物に核酸を導入するために使用することができる(それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,550,318号;同第5,538,880号;同第5,610,042号;および国際出願第94/09699号)。この方法は、細胞を殺滅することなくDNA被覆微粒子を、細胞膜を貫通して細胞内に侵入させることができる高速度までDNA被覆微粒子を加速させる能力に依存する(Kleinら、1987)。当技術分野で公知の様々な微粒子銃技術が存在し、その多くが本発明に適用可能である。
本発明の特定の態様では、1つ以上のリプログラミング因子が体細胞に導入された後、細胞が、増大のために培養される(必要に応じて、トランスフェクト細胞を濃縮するために陽性選択またはスクリーニングマーカーのようなベクター要素の存在について選択される)。リプログラミングベクターが、これらの細胞でリプログラミング因子を発現し、細胞分裂と共に複製および分割することができる。別法では、リプログラミングタンパク質を、リプログラミングタンパク質を含む培地を補充することによってこれらの細胞および子孫細胞に侵入させることができる。これらのリプログラミング因子は体細胞ゲノムをリプログラミングして自律多能性状態を確立するので、この間またはベクターの存在の陽性選択の除去後に外来性遺伝要素が徐々に消失するか、またはリプログラミングタンパク質を添加する必要がなくなる。
以前の研究で作製に成功したiPSCは、以下に示す点で自然に分離される多能性幹細胞(それぞれ、マウス胚性幹細胞mESCおよびヒト胚性幹細胞hESCなど)に著しく類似しているため、自然に分離される多能性幹細胞に対するiPSCの同一性、真正性、および多能性が確認された。したがって、本発明で開示される方法で作製される人工多能性幹細胞は、1つ以上の以下の胚性幹細胞の特性に基づいて選択することができる。
形態:iPSCは、ESCに形態学的に類似している。各細胞は、丸い形状、二重核小体または大きい核小体、および少ない細胞質を有することができる。iPSCのコロニーも同様に、ESCのコロニーに類似し得る。ヒトiPSCは、hESCに類似した縁が鋭く平坦な密集したコロニーを形成し、マウスiPSCは、mESCに類似し、hESCよりも平坦ではなく、より塊状のコロニーを形成する。
プロモーターの脱メチル化:メチル化は、メチル基のDNA塩基への転移、典型的には、CpG部位(シトシン/グアニン配列の近傍)のシトシン分子へのメチル基の転移である。遺伝子の広範なメチル化は、発現タンパク質の活性の抑制または発現に干渉する酵素の動員によって発現に干渉する。したがって、遺伝子のメチル化は、転写を防止することによって効率的に遺伝子を抑制する。Oct4、Rex1、およびNanogを含む多能性関連遺伝子のプロモーターは、iPSC内で脱メチル化され得、それらのプロモーター活性ならびにiPSC内の多能性関連遺伝子の活発な促進および発現を示す。
開示された方法を用いてリプログラミング因子が体細胞に導入されたら、これらの細胞を、多能性を維持するのに十分な培地で培養することができる。本発明で作製された人工多能性幹(iPS)細胞の培養は、霊長類多能性幹細胞、より具体的には、米国特許出願第20070238170号および同第20030211603号に記載されている胚性幹細胞を培養するために開発された技術および様々な培地を用いることができる。当業者には公知である、ヒト多能性幹細胞の培養および維持の別の方法も、本発明に使用できることを理解されたい。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含められている。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能するように本発明者によって発見された技術の代表であり、したがって、本発明の実施にとって好ましい方式を構成すると見なすことができることを当業者であれば理解するべきである。しかしながら、当業者であれば、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施形態で多くの変更が可能であり、変更しても同様または類似の結果が得られることを本開示から理解できよう。
白血球除去法によるPBMCのアリコートの作製
白血球除去サンプル(leukopak)を、8リットルの末梢血を遠心力場によって循環させるプロセスから得、単核細胞を濃縮して得られる約125mlの容量中で赤血球の量を制限した。leukopakをさらに次のように処理した:leukopakバッグの一端をアルコールスワブで拭き取り、剃刀の刃でカットしてフラスコ内に注いだ。この容量を、ハンクス液で約500mlに希釈し、次いで50mlの容量の16〜29本の試験管に、試験管1本あたり30mlずつ分注した。試験管を、ブレーキおよび加速を行わずに400gで30分間回転させた。白色液を吸引し、新たな50ml管に半分まで入れ、25mlのPBSで一杯にした。この処理手順をさらに2回繰り返して、合計3回洗浄した。最後の洗浄の前に細胞を血球計でカウントした。収量は、30〜60本の試験管で、1本の試験管当たり1×108細胞であった。
T細胞の活性化および増大
末梢血単核細胞(PBMC)を、Biological Specialty Corp(Colmar、PA)ドナー#33231(「ドナーA」)から得た。白血球パックをLymphocyte Separation Medium(Cellgro)で処理して、上記されたようにPBMCを得て、これを次にはアリコートにして凍結させ、液体窒素中に保存した。アリコートを解凍し、300IU/mlのrhIL2(Peprotech)および10ng/mlの可溶性抗CD3抗体(OKT3クローン、eBiosciences)を添加した新たに調製したAIM−V培地+pen/strep/グルタミン(AIV−V/ps/s/g培地)(Invitrogen)で増殖させた。活性化から数日後に、指数関数的な増殖をCEDEX細胞カウンターで確認した。培養3日後に、細胞をT細胞表現型についてアッセイし、次いでリプログラミング因子で形質導入した。一実験では、T細胞表現型を、プレーティングの前または形質導入の後に確認しなかった。このT細胞活性化実験を複数回繰り返したところ、一貫して同じ結果が得られた。T細胞は、活性化後および形質導入後に培養物の90%以上を占めた。T細胞がリプログラミング因子(複数可)で形質導入されたことが確認された。
レトロウイルスの生産
レトロウイルスベクターNanog RFP、Lin28 RFP、Oct4 eGFP、およびSox2 eGFPを、既に記載されているように構築した(参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第61/088,054号を参照されたい)。レトロウイルスベクターc−Myc RFP、Klf4 RFP、Oct4 eGFP、およびSox2 eGFPを同様に構築した。c−Mycの発現の潜在的な毒作用を中和するために、レトロウイルスベクターSV40ラージT遺伝子(SV40LT)−RFPを構築し、一部の組み合わせに使用することができる(Yuら、2009)。
T細胞のレトロウイルス形質導入(第0日目)
IL2およびOKT3による活性化および増大の3日後に、細胞集団は、97〜99%がT細胞からなっていた。これらのT細胞を、レトロウイルス含有培地、300IU/mlのrhIL2(組換えヒトIL−2)、および4μg/mlのポリブレンが添加された2mlのDMEM(Invitrogen)+10%FBS(Hyclone)の容量中に1×106細胞/ウェルで再懸濁した。レトロウイルス含有培地は、リプログラミングに関与することが知られている数種の転写因子の1つと組み合わせたMMLVパッケージング要素での293T細胞のトランスフェクションによって調製した。ウイルスを個々に調製した後に、培地を2つの異なるカクテルに混合してT細胞に曝露し;セット1は、転写因子Sox2、Oct4、c−Myc、およびKlf−4を発現するウイルスを含み、セット2は、Sox2、Oct4、Nanog、およびLin28を発現するウイルスを使用した。別々に、細胞を、コントロール形質導入として機能する6つのウイルスの1つに曝露した。細胞培養培地を、ウイルス含有培地に交換し、1000×g、32℃で1.5時間遠心分離した(スピンフェクション(spinfection))。続いて、細胞を37℃で4時間インキュベートした。インキュベーション後に、1mlの培地を慎重に吸引して、新鮮なDMEM+10%FBSに交換した。細胞を徐々に粉砕して混合し、均等な再懸濁液にした。粉砕後、培養物を、スピンフェクションの開始から18時間インキュベートした。18時間後に細胞を回収し、10%FBS+IL2+ポリブレンが添加された新鮮なウイルス上清+DMEMに再懸濁し、新たな24ウェルプレートに再プレーティングし、上記のように2回目のスピンフェクションを行った。
形質導入T細胞のMEFへのプレーティング
MEFプレーティング:形質導入細胞またはiPSコロニーを導入する1日〜3日前に、ゼラチン被覆6ウェルプレートまたは10cm皿にMEFをプレーティングした(MEFのプレーティングは、形質導入の1日前が最適であり得る)。
MEFがプレーティングされた形質導入細胞の維持および栄養補給
第5〜9日目:100ng/mlのゼブラフィッシュFGFが添加されたhES培地(CM)を用いて、各リプログラミング10cmプレートに対して半分の培地交換を行った。細胞の懸濁ロスを最小限にすると共に培地補充の正の効果を最大限にするために、新たな栄養補給戦略を開発した。簡単に述べると、5つの10cm皿の蓋を、皿を傾けるための支持体として使用した(そしてすべての後の栄養補給のために再使用した)。皿は、軽く付着したどの細胞も乱さないようにインキュベーターから慎重に取り出した。プレートを、確保しておいた(reserved)蓋の上に、MEF/細胞が一切露出しない一定角度でセットした。細胞を10分間沈降させた。沈降期間の後、各蓋を取り外して、7.5mlを、プレートの底部に対して水平な培地の最上部から慎重に/ゆっくりと吸引した。この取り出された培地を収集し、1200rpmで4分間遠心分離し、1mlの培地に再懸濁し、CEDEXでカウントして、細胞ロスが1%未満であることを確認した。次いで、7.5mlの新鮮な培地を、細胞を乱さないように慎重に円を描くように滴下添加し、皿をインキュベーターに戻した。この方法は、定期的な培地交換を可能にすると共に細胞ロスを最小限にするという目的を果たす。第9〜30日目:100ng/mlのゼブラフィッシュbFGFが添加されたMEF順化hES培地(MEF−CM)を用いて、各リプログラミング10cmプレートに対して半分の培地交換を行った。
iPSコロニーの同定および採取
活性化され増大しているT細胞は、特徴的な細胞形態およびクラスター形成挙動を示した。レトロウイルス形質導入効率の検出を、初めの形質導入から72時間後のGFPおよびRFP発現によって判定し、約3週間にわたって導入遺伝子が抑制され、hES細胞表現型を示した。明確なiPS細胞コロニーが、第23日目に出現し始めた。GFPおよびRFPサイレンシングは、蛍光顕微鏡によって検証され、コロニーを、ピペットチップで採取して剥離フードに入れた。次いで、コロニーの断片を、照射MEFを含む新たな6ウェルプレートに移した。コロニーの数をカウントして、プレーティングされた投入細胞数を考慮してリプログラミング効率を推定した。この時点から、クローンコロニーに毎日栄養補給し、手作業でもう1回継代し、次いで詳細が後述されるように増大させた。
ヒト末梢血Tリンパ球からの人工多能性幹細胞の誘導
1×106細胞を含む活性化されたT細胞が富化された集団を、蛍光マーカー遺伝子に連結されたリプログラミング因子(SOX2、OCT4、c−Myc、またはKLF4)の1つをそれぞれがコードする4つの別個のベクターでレトロウイルス形質導入を2回(第0日目と第1日目)行った(代表的なベクターマップが図10に示されている)。形質導入効率を、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーで第3日目に評価した。CD3の染色は、形質導入集団が99%±1%CD3+であることを示した(図2A)。
TCRβ鎖再構成のマルチプレックスPCR検出によりTiPS系のT細胞の起源が確認された(図2C)。T細胞は、TCRβ鎖における1つの増殖性V−J再構成を有し、TiPS細胞になった後はこの特徴的な遺伝子配列を維持するはずであり;最も一般的なβ鎖再構成PCR増幅用の様々なプライマーを組み合わせるマスターミックスの使用により、ABI 3730 DNAアナライザーでの断片分析エレクトロフェログラムによる決定で、固有のサイズおよび配列の1つのバンドが示された。線維芽細胞由来iPS細胞、「Fib−iPS」を陰性コントロールとして用いた。
細胞増殖培地および塩基性線維芽細胞成長因子−iPSC系を、既に記載された方法を用いて維持した(Yuら、2007)。ゼブラフィッシュbFGFを、既に記載されているようにすべての実験でヒトbFGFの代わりに使用した(Ludwigら、2006a)。
凍結保存ヒト末梢血患者サンプル由来のT細胞のレトロウイルスリプログラミング
この実施例は、「10人のドナー」実験に使用されたプロトコルを表す。この実験では、リプログラミングを、10の患者サンプルに対して試験として行い、10の患者サンプルのそれぞれが、リプログラミングに成功した。図6A〜図6Bに示されているように、少数の投入T細胞を含む96ウェル形式内のMEF上のIPSコロニーのTra−1−60染色。これは、T細胞手法の効率を実証している。
末梢血サンプルの注文および/または受け取りの前に、接着293T細胞の活発に増殖する培養物および非接着Jurkat細胞の別個の培養物を樹立して維持する。293T細胞は、増殖してウイルス生産の要求を満たす。ウイルス生産では、以下の「MMLVリプログラミング・ウイルス・ベクターの調製」に記載されている数種のベクターおよびヘルパープラスミドを使用する必要がある。この工程を進める前に、これらのDNAサンプルを用意する必要がある。最後に、「MMLVリプログラミングウイルスベクターを調製する」前にMEF順化培地の過剰供給の用意しておくことも推奨される。
以下に、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)をヒト末梢血が入っているVacutainers(登録商標)CPT(商標)管から単離して、PBMCを凍結保存する手順を記載する。この手順は、iPS細胞の誘導を促進すること目的とし、血液を別個の(SST)管に吸引し、この管を、感染性疾患の検査のために適切な研究施設に送付した。血液サンプルがCPT Vacutainer(著作権)に収集され、本発明者らに送付された。サンプルを受け取ると、そのサンプルを適切な生物封じ込めデバイス内に4℃で保管した。ドナー情報をデータベースに記録し、識別する文字または数字をこのドナーに割り当てた。陰性を証明する感染性疾患の検査データの受け取りも、安全委員会によって規定されたように文書で記録した。
最適なウイルス活性を維持するために、ウイルス上清は、使用前に4℃で4日以上保存しないことが推奨されている。このプロトコルは、MMLVをベースとしたリプログラミングバイシストロニックベクターOct4−Sox2、cMyc−Klf4、およびNanog−Lin28(ベクターマップは図11A〜図11Cに示されている)の一過性のトランスフェクションによるレトロウイルス含有培地の生産について記載する。これらのベクターの2つまたは3つの組み合わせを用いて、96ウェル形式内のヒトT細胞のレトロウイルス形質導入によってiPS細胞の誘導を促進することを目的とする。
293T細胞をPBSで洗浄し、単層を覆うのに十分なトリプシンを添加する。室温で10分間インキュベートし、次いで皿の側面を軽く叩いて細胞を移動させる。細胞を50ml管(複数可)に集める。各プレートを少容量のD10Fで洗浄する。洗浄培地と細胞を収集して混合する。完全に混合して、300μlのアリコートをCedexカップに移し、細胞をカウントする。別法では、トリパンブルーおよび血球計を使用する。350×gで10分間遠心分離する。上清を吸引し、ペレットを新たなD10Fに再懸濁する。各ウイルスに必要な293T細胞のプレート数(P)の計算工程からプレートの総数(POS+PCK,+PNL+PGFP)を計算する。表(以下)の播種密度を使用して、各プレートに必要な数の293T細胞を蒔く。D10Fで、約24時間、37℃/5%CO2でインキュベートする。培養物が過剰または過少コンフルエントである場合は、トランスフェクション効率、したがってウイルス生産が減少する。顕微鏡下で細胞を可視化して、密集度が最適(約90〜95%)であることを確認する。
このプロトコルは、MMLVベクター:Oct4−Sox2およびc−Myc−Klf4、またはOct4−Sox2およびNanog−Lin28、またはコントロールSox2−GFPベクターでの細胞の形質導入による形質導入効率を評価する方法を記載する。これらのアッセイは、iPS細胞の誘導の促進に使用されることを目的とする。
ヒトT細胞の効率的なリプログラミングは、ウイルス上清の生産および送達が標的細胞の活性化と慎重に調和された場合にのみ、MMLVベクターで達成することができる。ここで、PBMCの混合集団由来のCD3+細胞の増殖におけるサイトカイン誘導バーストとしての活性化の成功が、培養の48〜72時間の間に巨視的な「芽球」コロニーの形成をもたらすことを開示する。MMLVをベースとしたリプログラミングベクターを用いたこの活性化プロトコルを利用するために、MMLV上清が不安定であることに留意するのが重要である。したがって、芽球コロニー形成の1日前に新鮮なウイルスをT細胞培養物に添加できるように厳しく管理されたスケジュールでウイルスを調製するべきである。このプロトコルは、上記のように凍結保存された細胞の再活動化、および芽球コロニーの誘導を記載する。PBMCの代替の供給源を利用することもできる。
このプロトコルは、リプログラミングベクターの組み合わせ(Oct4−Sox2とcMyc−Klf4またはNanog−Lin28;代表的なベクターマップは図11A〜図11Cに示されている)を用いたトランスフェクションの後に293T細胞から収集したレトロウイルス上清を濃縮することによってMMLVベクターの力価を上げる2つの別個の方法を記載する。T細胞のレトロウイルス形質導入によってiPS細胞の誘導を促進することを目的とする。ウイルス上清の力価は、上記のようにMMLVベクターの品質管理アッセイにしたがってアッセイすることが推奨される。
この手順は、濃縮MMLVをベースとしたリプログラミングベクターを用いたヒト末梢血Tリンパ球の形質導入についてである。このプロトコルは、MMLVをベースとしたリプログラミングベクターOct4−Sox2、c−Myc−Klf4、Nanog−Lin28、またはSox2−GFP、またはこれらの組み合わせを含む96ウェルプレートでのT細胞の形質導入を記載する。上記の品質管理アッセイでは、このプロトコルの使用の前にウイルス活性を評価することが推奨されている。
このセクションは、iPS細胞の誘導を促進することを目的とする、ゼラチン被覆ウェルにマウス胎仔性線維芽細胞(MEF)をプレーティングする方法を記載する。
この手順は、ヒト末梢血T細胞のMMLV形質導入を評価するための品質管理アッセイを記載する。このアッセイは、Oct4−Sox2、c−Myc−Klf4、Oct4−Sox2、およびNanog−Lin28の組み合わせを含む濃縮MMLVベクターに細胞が曝露されてから48時間後に標的T細胞集団に存在する導入遺伝子またはリプログラミング因子の存在を検出することを目的とする。
この手順は、マウス胎仔性線維芽細胞(MEF)上でのリプログラミング因子が形質導入されたヒトT細胞の共培養についての手順を記載する。このプロトコルは、接着MEF上での形質導入T細胞の共培養、およびこれらの細胞に再び栄養補給する方法を記載する。
手順は、リプログラミング条件下、MEF共培養で増殖したTra1−60+コロニーを識別して採取するためのガイドラインを記載する。適切な条件下で、iPS細胞のコロニーが、リプログラミング因子の一次ヒト細胞への導入後に形成される。このプロトコルは、Tra1−60に対する抗体を利用して、MEF共培養で形成される推定iPSCコロニーに蛍光標識するものである。コロニーの蛍光標識パターンおよびコロニーの形態を比較することにより、多能性の質的評価基準であるスコアをコロニーに割り当てる。このスコア化システムは、さらなる特徴付けのための推定iPS細胞の選択的な増大を容易にする。
実施例1〜9で使用される材料が、表5〜表7に示されている。
CD34+造血細胞からのiPS細胞の作製
PBMCを、実施例1に記載されているようにleukopakまたは新たに採血された血液サンプルから単離した。製造者の取扱説明書にしたがって、間接CD34マイクロビーズキット(Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、Germany)、直接CD34マイクロビーズキット、または系統細胞枯渇キット(lineage depletion kit)(Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、Germany)を用いてCD34+細胞のMACS分離を行った。CD34+MACS精製細胞の画分をFACS分析のために収集し、残った細胞を、以下に示すCD34+細胞増大培地を用いて低接着6ウェルプレートに再プレーティングした。CD34+細胞富化を、CD34直接マイクロビーズまたは間接CD34ハプテン抗体染色キットを用いて行うことができる。
以下に示す参照文献は、本明細書の記載を補足する例示的な手順または他の詳細を提供する程度に、参照により本明細書に明確に組み入れられる。
Claims (3)
- 胚性幹細胞と比較して、不完全なセットのT細胞受容体遺伝子のV、D、およびJセグメントを含むゲノムを含み、組み込まれた外来性ウイルス要素を含まない、または組み込まれた外来性ウイルス要素を本質的に含まない、末梢血由来の人工多能性幹細胞。
- 前記人工多能性幹細胞がヒト細胞である、請求項1に記載の人工多能性幹細胞。
- 1つ以上のリプログラム因子をT細胞に導入する工程を含む方法によって製造される、請求項1又は2に記載の人工多能性幹細胞。
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