CN108373998B - 一种通过蝾螈Oct4将人类血液细胞重编程为iPSC的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于细胞领域，具体涉及一种通过蝾螈Oct4将人类血液细胞重编程为iPSC的方法，包括如下步骤，S1、获取红细胞祖细胞；S2、将包含蝾螈Oct4转录因子和其他转录因子的游离型载体导入S1中获取的红细胞祖细胞；S3、将S2中获取的含有游离型载体的红细胞祖细胞经多能干细胞诱导培养基培养，在无饲养层体系中诱导成重编程中间态细胞；S4、待完全诱导后，更换S3中所述的多能干细胞诱导培养基为多能干细胞培养基维持培养，获得蝾螈Oct4转录因子、其他转录因子表达消失且内源多能性基因POU5F1、NANOG、TRA‑1‑60与TRA‑1‑81表达激活的细胞，该细胞即为iPSC。本发明的有益效果是可以高效诱导产生无外源基因成分的hiPSC，适用于临床前研究和临床应用。

Description

一种通过蝾螈Oct4将人类血液细胞重编程为iPSC的方法

技术领域

本发明属于细胞领域，具体涉及一种通过蝾螈Oct4将人类血液细胞重 编程为iPSC的方法。

背景技术

我国是世界人口大国，每年因为创伤、疾病、衰老、以及遗传所导致的 器官缺损、衰竭、功能障碍也居世界之首，以药物和手术治疗为基本支柱的 经典医学治疗手段已不能满足临床医学的巨大需求，所以对干细胞与再生医 学的研究受到了相当多科研单位以及社会各界的普遍重视。

细胞移植治疗是再生医学研究的一个重要方向，特定类型的细胞移植可 被用来治疗心脏损伤，神经系统退行性疾病，脊髓损伤，肾衰竭，血液系统 疾病等等。然而，细胞移植治疗面临着异体排斥、细胞来源有限等很多难以 解决的问题。

干细胞是一类具有自我复制能力的细胞，在一定条件下，它可以分化为 一种或多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干 细胞。根据干细胞的发育潜能分为：全能干细胞(尚未在体外建立)、多能 干细胞、专能干细胞、寡能干细胞和单能干细胞。成体干细胞，包括专能干 细胞、寡能干细胞和单能干细胞，具有有限的自我复制能力，在体内一般只 分化为其所在组织器官的功能细胞，分化潜力有限。成体干细胞，如血液干 细胞、间充质干细胞与角膜上皮干细胞是目前临床应用最多的细胞种类，但 因其来源于成体、体外扩增能力有限，无法满足临床应用需求。多能干细胞 具有无限自我复制的能力,同时可分化为人体所有功能细胞、组织、器官， 医学界称之为“万能细胞”。相对于成体干细胞有着更广阔的应用前景。胚 胎干细胞是一种多能干细胞，但其来源于胚胎发育早期囊胚的内细胞团，其 临床应用涉及到很多伦理问题、遗传多样性的有限、以及免疫配型问题。诱 导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)是利用重编程技 术，在体外将成体组织细胞“逆龄”而得到的类似于胚胎干细胞的多能干细 胞。iPSC可以从几乎所有的成体组织细胞制备获得,这项技术使得制备病人 自己的多能干细胞成为可能，且避免了胚胎干细胞临床应用的局限性，在疾 病机制研究、药物筛选、细胞治疗等领域有着广阔的应用前景。

iPSC最初于2006年由日本科学家Shinya Yamanaka研究组在小鼠皮肤 成纤维细胞中使用逆转录病毒表达Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc四个转录因子成 功获得(Takahashi andYamanaka 2006)，2007年，Yamanaka研究组使用了 同样的方法获得了人类诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cell,hiPSC)(Takahashi,et al.2007)，同时，来自于Thomson研究组的 俞君英博士使用慢病毒表达OCT4/SOX2/NANOG/LIN28也从人体成纤维细胞成 功的建立了hiPSC(Yu,et al.2007)。2009年，中国科学家周琪研究组、 高绍荣研究组以及美国Baldwin研究组通过四倍体补偿技术获得了完全由 iPSC发育而来的小鼠，证明了iPSC具有与胚胎干细胞同样的发育潜能 (Boland,et al.2009；Kang,et al.2009；zhao,etal.2009)

Takahashi,K.,and S.Yamanaka.Induction of pluripotent stem cells frommouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell 2006；126(4):663-76.

Takahashi,K.,et al.Induction of pluripotent stem cells from adulthuman fibroblasts by defined factors.Cell 2007；131(5):861-72.

Yu,J.,et al.Induced pluripotent stem cell lines derived from humansomatic cells.Science 2007；318(5858):1917-20.

Boland,M.J.,et al.Adult mice generated from induced pluripotent stemcells. Nature 2009；461(7260):91-4.

Kang,L.,et al.iPS cells can support full-term development oftetraploid blastocyst-complemented embryos.Cell Stem Cell 2009； 5(2):135-8.

Zhao,X.Y.,et al.iPS cells produce viable mice through tetraploidcomplementation.Nature 2009；461(7260):86-90.

在诱导iPSC过程中常借助于逆转录病毒、慢病毒将外源基因导入细胞， 通过这种方式可以得到很高的基因转导效率，但是由于病毒序列整合到细胞 的基因组中，会导致基因插入突变发生，甚至具有致癌性，所以这种具有潜 在危险性的基因导入方法显然不利于iPSC技术在再生医学领域的应用。2009 年，俞君英等人利用OriP/EBNA1游离型载体首次获得了无外源基因污染的 人类诱导多能干细胞(hiPSC)，即“无痕”hiPSC。此方法只需一次转染， 操作简单，而且游离型载体在hiPSC扩增时会自动的从细胞内去除。但初始 的OriP/EBNA1游离载体重编程方法效率低下，而且需滋养层细胞，不利于 hiPSC的规模化制备以及临床级hiPSC的制备。利用在重编程特定时间段添 加小分子化合物与相关细胞因子，OriP/EBNA1游离型载体重编程系统于 2011年，实现了从不同种类成体细胞高效制备“无痕”hiPSC，且无需滋养 层细胞(Yu,et al.2011)。

Yu,J.,et al.Efficient feeder-free episomal reprogramming with smallmolecules.PLoS One 2011；6(3):e17557.

Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4和Oct3/4，Sox2，Nanog，Lin28两种组合 都能够成功诱导iPSC产生，进一步的研究发现c-Myc不是重编程必需的， 重编程所用的转录因子中，Sox2和c-Myc都能够被同家族的其他成员所替 代，Sox1和Sox3能够提到Sox2；N-Myc和L-Myc能够替代c-Myc；但是Oct1 和Oct6并不能替代Oct4。Oct3/4是重编程过程中极为重要的一个转录因子。 2012年，Tapia等人使用逆转录病毒，发现在人类成纤维细胞重编程中人源POU5F1可以用蝾螈Oct4替代，但效率极低(Tapia,et al.2012)。使用 OriP/EBNA1游离型载体重编程人类成纤维细胞，我们也发现人源POU5F1可 以用蝾螈Oct4替代，但效率同样非常低。但在使用OriP/EBNA1游离型载体 重编程人类血液细胞时，和人源POU5F1相比，蝾螈Oct4能够更高效的诱导 获得iPSC。基于蝾螈Oct4的重编程方法有利于重编程机理的研究和重编程 技术的改进，降低国际专利对于hiPSC临床应用的限制。

Tapia,N,et al.Reportgramming to pluripotency is an ancient trait ofvertebrate Oct4and Pou2proteins.Nat Commun 2012；3:1279.

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种通过蝾螈Oct4将人类血 液细胞重编程为iPSC的方法，可以高效诱导产生无外源基因成分的hiPSC。

本发明提供了如下的技术方案：

一种通过蝾螈Oct4将人类血液细胞重编程为iPSC的方法，包括如下步 骤，

S1、从人类血液细胞中抽提单核细胞，通过扩增培养基进行选择性培养， 获取红细胞祖细胞；

S2、将包含蝾螈Oct4转录因子和其他转录因子的游离型载体导入S1中 获取的红细胞祖细胞；

S3、将S2中获取的含有游离型载体的红细胞祖细胞经多能干细胞诱导 培养基培养，在无饲养层体系中诱导成重编程中间态细胞；

S4、待完全诱导后，更换S3中所述的多能干细胞诱导培养基为多能干 细胞培养基维持培养，获得蝾螈Oct4转录因子、其他转录因子表达消失且 内源多能性基因POU5F1、NANOG、TRA-1-60与TRA-1-81表达激活的细胞， 该细胞即为iPSC。

优选的，所述蝾螈Oct4转录因子表达产生的蛋白质所对应的氨基酸序 列如SEQID NO:1所示。

优选的，所述其他转录因子选自NANOG、SOX2、LIN28A、KLF4、MYCL、 MYCN、MYC、p53knockdown、MIR302/367cluster、ESRRB、REX1、GBX2、 DLX4、ZSCAN10、ZSCAN4、TBX3、GLIS1、NR5A1/2、RARG、BMI1、KDM2B、TET1 和SV40LT转录因子中的任意一种或者任意几种的组合。

优选的，所述其他转录因子选自NANOG、SOX2、LIN28A、MYCL和SV40LT 转录因子中的任意一种或者任意几种的组合。

优选的，所述其他转录因子来源于人类。

优选的，所述游离型载体包含DNA复制启动子和作用于此DNA复制启动 子的反式作用因子。

优选的，所述DNA复制启动子来源于EB病毒、Kaposi's肉瘤疱疹病毒、 松鼠猴疱疹病毒、马立克式病毒的oriP。

优选的，其特征在于，所述反式作用因子为一种EBV nuclear antigen 1 或其衍生物。

优选的，所述人类血液细胞来源于人外周血，脐带血和骨髓血中的任意 一种。

优选的，所述S1中的扩增培养基、S3中的多能干细胞诱导培养基和S4 中的多能干细胞培养基均为化学成分明确的培养基。

本发明还提供了一种通过蝾螈Oct4将人类血液细胞重编程为iPSC的方 法获取iPSC，通过该方法获取的iPSC无外源基因成分，适用于细胞再生医 疗的临床前研究和临床应用。

本发明的有益效果是为临床前研究与临床应用提供一种安全高效的诱 导人类多能干细胞(hiPSC)的方法，该方法是将包含蝾螈Oct4转录因子和 其他转录因子的游离型载体导入红细胞祖细胞内并培养回收蝾螈Oct4转录 因子、其他转录因子表达消失且内源多能性基因POU5F1、NANOG、TRA-1-60 与TRA-1-81表达激活的细胞，该细胞即为hiPSC，所述蝾螈Oct4转录因子 和其他转录因子承载于一个或多个游离型载体上，本发明所提及的游离型载 体不会稳定地整合到靶细胞DNA中，并且hiPSC中没有残余游离型载体成分。 因为反式作用因子在hiPSC中不表达，以及细胞分裂期间的不对称分布稀释 了游离型载体，所以容易地获得丢失了游离型载体的hiPSC。该方法在hiPSC 制备过程中产生的多潜能细胞可以在衍生期间瞬时表达一个或多个拷贝的 潜能性决定因子，但本方法通过针对hiPSC单克隆进行了筛选，可避免具有 整合载体的细胞。此外，本发明使用蝾螈Oct4转录因子替代人源的POU5F1 转录因子，与人源的其他重编程因子组合可以明显提高hiPSC的诱导效率， 更加有利于hiPSC细胞在临床上的应用，hiPSC直接来源于人外周血、新生 儿脐带血和人骨髓血等，意味着产生多潜能细胞的起始细胞类型是非多潜能 细胞或终末分化细胞，样本来源较为便捷，而且相对于皮肤来源的细胞，基 因突变积累较少。本方法获得的hiPSC与人类胚胎干细胞的特征非常相似， 表达多潜能细胞特异性标记物，例如，POU5F1、NANOG、SSEA-3、SSEA-4、 TRA-1-60与TRA-1-81。

附图说明

图1是进化树中Oct4在不同物种之间的保守性和同源序列分析图；

图2A是构建的含有人类OCT4转录因子的游离载体表达系统；

图2B是构建的含有蝾螈OCT4转录因子的游离载体表达系统；

图3是人类血细胞的hiPSC重编程方法流程图；

图4是利用流式细胞术对红细胞祖细胞的鉴定：扩增第10天红细胞祖 细胞CD71和CD235a的表达情况；

图5是蝾螈Oct4(AxOct4)和人源蝾螈OCT4(HuOCT4)诱导血液细胞 重编程为hiPSC的效率差异统计图；

图6是AxOct4实验组的hiPSC的形态图示，D1、D2、D3、D4分别为培 养第1、2、3、4天时显微镜下hiPSC的形态图，其中Scale bar为200μm；

图7A是利用流式细胞分析对AxOct4实验组的hiPSC(第10代)细胞表面 标志物SSEA4的检测，其中浅灰色线条为同种抗体阴性对照，黑线为iPSC 细胞表面标志物抗体；

图7B利用流式细胞分析对AxOct4实验组的hiPSC(第10代)细胞表面标 志物Tra-1-81的检测，其中浅灰色线条为同种抗体阴性对照，黑线为iPSC 细胞表面标志物抗体；

图8是利用qRT-PCR检测AxOct4实验组的hiPSC(第10代)多能性基因 OCT4+/NONOG+的表达；

图9是对AxOct4实验组的hiPSC(第10代)进行染色体核型检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做具体说明。

本发明所述的Oct4也被称为Oct3、POU5F1、OTF3或OTF4，是POU转录 因子家族中的一员，也是迄今为止人们发现最早也是最重要的维持胚胎干细 胞多潜能性和自我更新的关键基因。Oct4蛋白含有一个保守的DNA结合结构 域-POU结合域，POU结合域有两个亚单位：N端大约74-82个氨基酸残基构 成POU家族特有的保守结构域(POUs)，C端大约60个氨基酸残基构成传统 的同源异性结构域(POUH)，中间由15-55个非保守的氨基酸序列相连。POU结合域能与含八聚体基序(octamer motif)的DNA结合从而调控下游靶基 因的转录。

在脊椎动物中，有尾两栖类(如蝾螈)，爬虫类(如蜥蜴)和兽类(如 鼠和人)的哺乳动物在基因序列同源性上均有保留Oct4，并在不同种系之间 高度保守。蝾螈(Axolotl)是含有Oct4的最基础四足动物，也是相当先进的 进化中的物种，其Axolotl Oct4(简称AxOct4)基因是至今被认为最古老Oct4 同系物(见附图1中Oct4基因在不同物种之间的进化系)。图1a中不同物 种的Oct4和pou2同系物基于POU序列比对的系统发育树表明蝾螈同时具有 pou2和Oct4的同系物。分支显示其计算的相对长度，并在相应的节点上标 记后验概率。外类群，Oct1和OCT6序列和节点分支表明Oct4/pou2序列 的子树分割，虚线分支的长度是任意的。图1b中钝口螈属(学名：Ambystoma) 上Axpou2和Axoct4分别连锁染色体16和17，Axpou2定位于AxNpdc1(20cM) 的位置和AxOct4(76cM)定位于AxTcf19和AxCchrc1的位置。Pou2-Npdc1 和Oct4-TCf19-Cchcr1的连锁关系分别在鸡–斑马鱼和小鼠–人的保守共线性中观察得到。因此本发明利用蝾螈Oct4因子替代人Oct4(简称HuOCT4) 因子运用于人体血细胞中的重编程，能有效避免产生免疫原性，从而获得高 效率产生的hiPSC，此包含蝾螈Oct4因子的hiPSC诱导系统能有效解决科研 和临床上对hiPSC的大量需求。

本发明提供了不含外源遗传物质的诱导多能干细胞产生的方法，一般强 迫持续表达异位重编程因子可能与肿瘤形成有关，而解决这个问题的方法是 产生转基因无残留的hiPSC细胞。启动重编程过程中逐渐使细胞自身的内源 多能基因变得活跃，而引入的基因被沉默。本文使用的游离型载体属于非整 合递送方式来获得hiPSC细胞，即可以在单一重编程载体上提供一种或多种 转基因，可将多种重编程载体引入单个体细胞。一种强力的、构成性转录启 动子可以向多种转基因提供转录启动控制；所述转基因可以受独立强力的、 构成性启动子的转录控制；所述的启动子可能是多个拷贝的相同启动子，也 可能是不同的启动子。各种异源启动子是本领域已知的，并且可根据诸如潜 能决定因子的希望表达水平之类的因素来使用。对转录启动子选择的另一考 虑为启动子在靶标体细胞内保持沉默的比率。本发明中的启动子是人类 EF1α延伸因子启动子或是巨细胞病毒早期启动子(CMV)。通过单一载体而 非通过多种载体引入所有因子对效率更有利，但当总的载体大小增加时，则 变得越来越难以引入载体。本领域技术人员都了解，因子在载体上的位置能 影响其瞬时表达，以及所得重编程效率。这样，申请人在多种载体组合上使 用了各种因子组合，若干此类组合在此表明支持重编程。

下列实施例举例了发明人的标准实验室实践，用于示例本发明的模式， 而不应将本发明理解为限定于这些实施例的范围。这些实施例，根据本文公 开和本领域技术人员的普通水平，技术人员将理解下列仅用于示例，可以在 不超过本发明的范围内进行各种变动、修饰和改造。其中所涉及的技术，除 非特别说明，均是本领域技术人员熟知的分子生物学、细胞生物学、生物化 学等各个领域的常规技术。为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本 发明的具体实施例。

实施例1

蝾螈Oct4转录因子编码序列的获得

从http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed获取蝾螈Oct4基因编码的氨 基酸序列信息。蝾螈Oct4基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，见序列表 1，通过商业化公司合成相应的编码序列。

实施例2

含有OCT4编码转录因子的游离载体表达系统的构建

1、pEP4-E-OCT4/AxOct4、pEP4-E-SCLM2L和pCEP4-ENET游离型载体的 构建

使用传统方法，通过聚合酶链式反应扩增转录因子基因中的ORF序列， 插入到含有OriP/EBNA1的哺乳动物表达载体pCEP4中构建重编程载体，上 述载体上包含至少一个内部核糖体进入位点，其中pEP4-E-OCT4/AxOct4游 离型载体依次包含Amp抗性基因、第一启动子、OCT4/AxOc4、第二启动子、 HcRed，其中pEP4-E-SCLM2L游离型载体依次包含Amp抗性基因、第三启动 子、SOX2、第四启动子、MYCL、IRES2、LIN28A、并且其中pCEP4-ENET游离 型载体依次包含Amp抗性基因、第五启动子、NANOG、第六启动子、SV40LT； 其中第一、第三、第五和第六启动子均是延伸因子1α基因启动子(EF1α)， 第二启动子、第四启动子是巨细胞病毒启动子(CMV)。见附图2中 pEP4-E-OCT4、pEP4-E-SCLM2L和pCEP4-ENET游离型载体构建系统和 pEP4-E-AxOct4、pEP4-E-SCLM2L和pCEP4-ENET游离型载体构建系统。 pEP4-E-OCT4表示含有人源POU5F1/OCT4转录因子的表达系统， pEP4-E-AxOct4表示含有蝾螈Oct4转录因子的表达系统；Amp抗性基表示氨 苄青霉素抗性基因；HcRed表示红荧光蛋白的编码序列；“E-SCLM2L”是指 一种具有位于SOX2编码区下游、MYCL及LIN28A编码区上游且其间有IRES2的CMV启动子的表达序列。“ENET”是指一种具有位于NANOG和SV40LT编 码区上游且其间EF1α启动子的表达序列。

实施例3

对人血细胞来源的多能干细胞的重编程

1、红细胞祖细胞的获取

采集至少10μl的血样，转移到淋巴细胞分离管中，离心，取单核细 胞层，该单核细胞群包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴 细胞、红细胞祖细胞等，用DPBS离心洗涤两遍，取样计数，根据计数结果 取3×10⁶细胞分3孔接种于6孔板中，加红细胞祖细胞扩增培养基2ml/孔， 置于37℃、5％CO2培养箱中培养。分别于扩增第4天和第8天每孔补加2ml 新鲜的扩增培养基。

本实施例的扩增培养基，具体配方为：每升扩增培养基包含ITS添加剂 10ml、GlutaMAX 10ml、Lipid Concentrate 1ml、L-抗坏血酸2-磷酸化半 镁盐水合物250μmol、硫酸亚铁3μmol、硝酸铁0.2μmol、硫辛酸1μmol、 氢化可的松1μmol、干细胞因子100μg、促红细胞生成素20μg、白细胞介 素-3 5μg、剩余补充IMDM基础培养基。

2、红细胞祖细胞的鉴定

培养红细胞祖细胞第10天时，利用流式细胞术检测其表面分子CD71和 CD235a的表达情况，分别检测其阳性率和平均荧光强度指标，实验结果如 附图4所示，数据显示红细胞祖细胞特异性标志CD71+比例占99.6％，CD235a+ 比例占77.8％。

实施例4

游离型载体诱导重编程

a、待实施例3中红细胞祖细胞扩增6～16天后，取0.5～4×10⁶细胞 于转染杯中，分为2组，其中1组为AxOct4试验组，将实施例2构建的携 带重编程因子的质粒pEP4-E-AxOct4：pEP4-E-SCLM2L：pCEP4-ENET＝1:1:1 电转染上述AxOct4试验组细胞。另1组为HuOCT4对照组，将实施例2构建 的携带重编程因子的质粒pEP4-E-OCT4：pEP4-E-SCLM2L：pCEP4-ENET＝1:1:1 电转染上述HuOCT4对照组细胞，之后将上述2组细胞接种于Matrigel或玻 连蛋白或其它细胞基质包被的96,48,24,2或6孔板中进行培养，整个操作 流程图如附图3所示。

b、48小时后更换新鲜的多能干细胞诱导培养基，继续培养至10天，隔 天进行换液，添加与起始培养基同样体积的新鲜的多能干细胞诱导培养基， 即在无饲养层体系上进行重编程。

本实施例的多能干细胞诱导培养基，其组分为：在每升实施例2红细胞 祖细胞扩增培养基的基础上添加一种或多种以下小分子：CHIR99021 3μmol、A-83-01 0.5μmol和PD0325901 0.5μmol。

实施例5

重编程细胞的维持培养

10天后，将诱导多能干细胞更换为多能干细胞培养基，继续培养。重编 程15天后，挑取形态类似于人胚胎干细胞的克隆至新的培养皿中进行扩增。

干细胞培养基：本实施例的干细胞培养基选自TeSR1和E8培养基中的 任意一种。

实施例4：目的hiPSC的鉴定

1.方法

1.1hiPSCs的重编程效率

培养至15天时分别对电转染pEP4-E-AxOct4：pEP4-E-SCLM2L： pCEP4-ENET＝1:1:1实验组和电转染pEP4-E-OCT4：pEP4-E-SCLM2L： pCEP4-ENET＝1:1:1对照组的hiPSC克隆进行计数，经计数实验组每200万个 起始红细胞祖细胞中可获得250～300个诱导多能干细胞；对照组每200万 个起始红细胞祖细胞中可获得0～70个诱导多能干细胞。其实验结果见图5， 图5是hiPSC效率差异的统计图，该图表明：AxOct4比HuOCT4可以明显地 提高hiPSC诱导效率。

1.2hiPSCs的细胞形态

通过显微镜观察电转染pEP4-E-AxOct4：pEP4-E-SCLM2L：pCEP4-ENET实 验组获得的hiPSC细胞在第1、2、3、4天中形态的变化过程，并对其拍照保 存，实验结果如附图6所示，显微镜的比例尺(Scale bar)为200μm。

1.3hiPSC细胞表面标志物的检测

采用培养至第10代的hiPSC细胞(AxOct4实验组)，用Accutase收集 细胞密度达80-90％的hiPSC，离心弃上清，重悬后加入SSEA4-PE、 TRA-1-81-PE以及相应Isotype，避光孵育，加FACS buffer，重悬离心弃上 清，再加入FACS buffer重悬，使用流式细胞仪进行分析(实验结果如附图 7所示)，其中灰色线条为同种抗体阴性对照，黑线为hiPSC细胞表面标志 物抗体。

1.4hiPSC的多能性基因鉴定情况

采用培养直第10代的hiPSC细胞(AxOct4实验组)，分别提取各hiPSC 以及原代间充质干细胞(阴性对照组)的总RNA，将总RNA反转录为cDNA， 用多能性基因引物POU5F1(OCT4)、NANOG进行QPCR，导出数据并分析，实验 结果如附图8。

1.5hiPSC的核型鉴定

采用培养第10代的hiPSC(AxOct4实验组)，待hiPSC融合度为80％～ 90％时，加入秋水仙碱处理细胞3小时，后用Accutase消化细胞，离心收集 细胞，用KCl溶液重悬细胞，加入新鲜配制的固定液(冰乙酸：甲醇＝1:3) 固定细胞，重复固定1次，离心，用固定液重悬细胞后滴于玻片上，置烘箱 烘烤。将玻片置于2.5g/L胰蛋白酶消化液处理10s，Giemsa染液染色10min， 室温晾干后在显微镜下观察分裂中期相染色体，并用IMSTAR全自动智能染 色体核型扫描分析系统对染色体进行分析，实验结果如附图9所示。

2.结果：

AxOct4实验组的hiPSC克隆挑出来后进行扩增和传代，传代后得到的 hiPSCs克隆细胞仍保持高核质比，轮廓清晰、中心紧凑(图6-D4)。显微 镜(Scale bar：200μm)观察获得的hiPSC在第1、2、3、4天中形态的变 化过程，hiPSC由梭形转变为圆形，聚集成团，核质比增大，中心部分排列 紧密(图6-D2)。4d时可见成簇的hiPSCs克隆形成。

AxOct4实验组的hiPSC细胞(第10代)表达了多能性细胞表面标志物 SSEA-4、与Tra-1-81(图7)；AxOct4实验组的hiPSC细胞(第10代)PCR 结果显示其表达细胞多能性相关基因POU5F1、NANOG(图8)；该AxOct4实 验组的hiPSC(第10代)可以维持正常的核型(图9)。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参 照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其 依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术 特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同 替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 安徽中盛溯源生物科技有限公司

<120> 一种通过蝾螈Oct4将人类血液细胞重编程为hiPSC的方法

<141> 2018-02-10

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 398

<212> PRT

<213> 蝾螈(Salamander)

<400> 1

Met Ala Gly His Leu Gly Gln Glu Ile Gly Arg Ala Ala Tyr Gly Phe

1 5 10 15

Gly Ala Gln Ala Leu His Leu Gly Ala Gly Gly Leu Glu Ala Gly Gly

20 25 30

Pro Gly Phe Leu Ser Glu Ser Tyr Gly Pro Tyr Ala Gly Phe Lys Ala

35 40 45

Leu Glu Tyr Ala His Gly Gly Ala Glu Gly Glu Gly Arg Pro Gly Ala

50 55 60

His Gly Leu Ala Arg Ala Trp Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Trp Gly Pro

65 70 75 80

Val Tyr Gly Gln Ser Gly Ala Gly Ala Gly Phe Glu Ser Ser Arg Val

85 90 95

Glu Val Lys Val Glu Arg Pro Asp Lys Glu Ala Gly Tyr Gly Gln Gln

100 105 110

His Gln Gln Ala Trp Ala Gly Tyr Phe Val Pro Gln Leu Ala Val Pro

115 120 125

Ala Arg Ser Pro Ala Ser Val Ala Ser Gly Gly Gln Val Pro Ala Ala

130 135 140

Pro Ala Ser Pro Ser Asp Asp Ser Pro His Ser Ser Thr Ala Ser Ser

145 150 155 160

Ser Ser Ala Ser Pro Asp Leu Gly Ala Gly Gly Ala Pro Arg Asp Leu

165 170 175

Asp Ser Gly Asp Glu Glu Gly Gly Thr Ser Ala Asp Leu Glu Gln Phe

180 185 190

Ala Lys Glu Leu Lys Gln Lys Arg Ile Thr Leu Gly Phe Thr Gln Ala

195 200 205

Asp Val Gly Leu Ala Leu Gly Ala Leu Tyr Gly Lys Met Phe Ser Gln

210 215 220

Thr Thr Ile Cys Arg Phe Glu Ala Leu Gln Leu Ser Phe Lys Asn Met

225 230 235 240

Cys Lys Leu Arg Pro Leu Leu Gln Arg Trp Leu Val Glu Ala Asp Thr

245 250 255

Asn Glu Asn Leu Gln Glu Leu Cys Asn Leu Glu Asn Ala Leu Gln Gln

260 265 270

Ala Arg Lys Arg Lys Arg Thr Ser Ile Glu Asn Ser Val Lys Asp Asn

275 280 285

Leu Glu Ala Phe Phe Leu Lys Cys Pro Lys Pro Thr His Gln Glu Ile

290 295 300

Ala His Ile Ser Glu Asp Leu Asn Leu Glu Lys Asp Val Val Arg Val

305 310 315 320

Trp Phe Cys Asn Arg Arg Gln Lys Gly Lys Arg Ser Ile Cys Arg Glu

325 330 335

Glu Tyr Asp Gly Phe Gln Gln Tyr Pro Gly Met Gln Pro Gly Pro Pro

340 345 350

Ala Leu Ser His Leu Pro Thr Ser Tyr Ile Ala Gln Gly Tyr Asn Gly

355 360 365

Ala Ala Ala Ala Phe Ala Ala Val Tyr Met Gln Pro Phe His Asp Ser

370 375 380

Glu Met Tyr Ser Gln Thr Val Ser Arg His Leu His Ser Asn

385 390 395

Claims (9)

1.一种通过蝾螈Oct4将人类血液细胞重编程为iPSC的方法，其特征在于，包括如下步骤，

S1、从人类血液细胞中抽提单核细胞，通过扩增培养基进行选择性培养，获取红细胞祖细胞；

S2、将包含蝾螈Oct4转录因子和其他转录因子的游离型载体导入S1中获取的红细胞祖细胞；

S3、将S2中获取的含有游离型载体的红细胞祖细胞经多能干细胞诱导培养基培养，在无饲养层体系中诱导成重编程中间态细胞；

S4、待完全诱导后，更换S3中所述的多能干细胞诱导培养基为多能干细胞培养基维持培养，获得蝾螈Oct4转录因子、其他转录因子表达消失且内源多能性基因POU5F1、NANOG、TRA-1-60与TRA-1-81表达激活的细胞，该细胞即为iPSC；

所述蝾螈Oct4转录因子表达产生的蛋白质所对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述其他转录因子选自NANOG、SOX2、LIN28A、KLF4、MYCL、MYCN、MYC、p53 knockdown、MIR302/367 cluster、ESRRB、REX1、GBX2、DLX4、ZSCAN10、ZSCAN4、TBX3、GLIS1、NR5A1/2、RARG、BMI1、KDM2B、TET1和SV40LT转录因子中的任意一种或者任意几种的组合。

2.根据权利要求1所述的一种通过蝾螈Oct4将人类血液细胞重编程为iPSC的方法，其特征在于，所述其他转录因子选自NANOG、SOX2、LIN28A、MYCL和SV40LT转录因子中的任意一种或者任意几种的组合。

3.根据权利要求2所述的一种通过蝾螈Oct4将人类血液细胞重编程为iPSC的方法，其特征在于，所述其他转录因子来源于人类。

4.根据权利要求1所述的一种通过蝾螈Oct4将人类血液细胞重编程为iPSC的方法，其特征在于，所述游离型载体包含DNA复制启动子和作用于此DNA复制启动子的反式作用因子。

5.根据权利要求4所述的一种通过蝾螈Oct4将人类血液细胞重编程为iPSC的方法，其特征在于，所述DNA复制启动子来源于EB病毒、Kaposi's肉瘤疱疹病毒、松鼠猴疱疹病毒、马立克式病毒的oriP。

6.根据权利要求5所述的一种通过蝾螈Oct4将人类血液细胞重编程为iPSC的方法，其特征在于，所述反式作用因子为一种EBV nuclear antigen 1。

7.根据权利要求1所述的一种通过蝾螈Oct4将人类血液细胞重编程为iPSC的方法，其特征在于，所述人类血液细胞来源于人外周血，脐带血和骨髓血中的任意一种。

8.根据权利要求1所述的一种通过蝾螈Oct4将人类血液细胞重编程为iPSC的方法，其特征在于，所述S1中的扩增培养基、S3中的多能干细胞诱导培养基和S4中的多能干细胞培养基均为化学成分明确的培养基。

9.一种如权利要求1-8中任一项所述通过蝾螈Oct4将人类血液细胞重编程为iPSC的方法，其特征在于，通过该方法获取的iPSC无外源基因成分，适用于细胞再生医疗的临床前研究和临床应用。