CN106032529A - 胎盘间充质干细胞体外分离、扩增和诱导分化的方法 - Google Patents

胎盘间充质干细胞体外分离、扩增和诱导分化的方法 Download PDF

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Abstract

一种胎盘间充质干细胞体外分离、扩增和诱导分化的方法，利用II型胶原酶消化法和贴壁培养法从胎盘分离制备间充质干细胞，并应用bFGF、EGF、BDNF、PDGF、NGF和RA诱导人胎盘间充质干细胞(hPMSCs)分化为神经样细胞。本发明使用的胎盘间充质干细胞来源充足，且诱导过程采用的细胞因子成分明确、分化效率高、耗时较短，诱导分化的神经样细胞可以用来移植治疗多种神经性疾病，在临床有很好的应用前景。

Description

胎盘间充质干细胞体外分离、扩增和诱导分化的方法
技术领域
本发明涉及一种干细胞的分离和培养方法，尤其涉及一种胎盘间充质干细胞的体外培养、扩增和诱导分化的方法。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)是一群中胚层来源的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，在适宜的培养条件下可被诱导分化成各种组织细胞，包括骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等。最新研究表明MSCs易于外源基因导入表达，而且具有调节免疫系统的功能，因此MSCs不仅可作为组织工程的种子细胞，也为基因治疗提供了一个可靠的工具，同时在诱导移植耐受和治疗自身免疫性疾病中具有广泛的应用前景。目前报道的MSCs主要来源于骨髓，但骨髓中的含量很低，仅占骨髓中单个核细胞的1/106～1/105，且有时因病毒感染或因衰老使骨髓中细胞数量显著降低或骨髓增生分化功能降低，使骨髓来源的MSCs受到了限制。另外的牙髓、脂肪、脐血源的间充质干细胞也有报道，但它们的MSC含量稀少，分离困难，不适合规模化操作。
胎盘绒毛膜富含间充质干细胞，是一个可能优于骨髓和其它组织的种子细胞源泉，具备以下优点：(1)来源充足，取材方便，作为一种分娩废弃物，其采集不存在任何伦理问题；(2)细胞数量丰富，增殖能力强；(3)分离出的MSC免疫表型不成熟，具有较弱的免疫细胞抗原性；(4)具有与BMSCs相似的干细胞特性，具有良好的自我更新和多向分化增殖能力，因此可在较短的时间内可获得更多的细胞数量，以满足临床需求。
目前文献报道的运用间充质干细胞体外诱导分化为神经细胞的研究报道非常多，主要有：(1)传统的化学诱导剂(抗氧化剂)法，如：β-ME(β-巯基乙醇)、二甲基亚砜(DMSO)、丁基羟基茴香醚(BHA)联合诱导等；(2)生长因子诱导法，如：神经生长因子(NGF)、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和维甲酸(RA)单独或者联合诱导等；(3)生长因子与化学诱导剂联合；(4)共培养或用接近生理状态的条件培养基；(5)中药成分如丹参、黄芩苷等。化学诱导剂毒性大，细胞死亡率高；中药成分不确定，难于保证分化的稳定性；神经细胞共培养存在目标细胞难以分离和潜在外源病原体的问题。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种胎盘间充质干细胞体外定向诱导方法，集体外分离、扩增和诱导分化于一体，实施简便。
本发明的另一个目的在于提供一种胎盘间充质干细胞体外定向诱导方法，以胎盘来源的已分离和扩增的间充质干细胞(hPMSCs)作为种子细胞，定向分化为神经细胞的诱导方法。
本发明的另一个目的在于提供一种胎盘间充质干细胞体外定向诱导方法，采用成分明确的诱导剂细胞因子，提高分化效率，缩短时间。
本发明提供的一种胎盘间充质干细胞体外定向诱导方法，其包括如下步骤：
步骤1：将所采集的胎盘脐带侧的羊膜去除，分离得到绒毛膜；
步骤2：再去除绒毛膜表面黏附的结缔组织；
步骤3：将绒毛膜剪碎成小块(如；体积约为1mm3)，加入等体积Ⅱ型胶原酶消化；
步骤4：分离得到hPMSCs(如：采用离心方式去除组织块和胶原酶)，接种于细胞培养瓶(如：T25型)，进行原代培养和传代培养；
步骤5：取第二代或第三代细胞进行流式表面抗原鉴定；
步骤6：取第三代或第四代细胞接种(如：接种于6孔板)：
步骤7：培养至间充质干细胞愈合度达60％～80％时弃掉培养基，更换含有细胞因子的诱导培养基进行诱导培养；
步骤8：诱导培养后进行细胞形态观察，2天～3天后进行免疫荧光染色鉴定。
本发明方法，其Ⅱ型胶原酶的终浓度0.1w/v％～0.2w/v％，消化时间为90分钟～100分钟，消化温度为37℃。消化采用振荡消化，速率为200rpm～300rpm。
本发明方法，原代培养和传代培养所用培养基以DMEM培养基为基础培养基，还含有10v/v％胎牛血清、1v/v％青霉素、1v/v％链霉素和1v/v％谷氨酰胺。原代培养过程中每隔3天更换一次培养基，直至细胞愈合度达到80％进行消化传代培养。
本发明方法，流式表面抗原鉴定使用的抗体为下列鼠抗人单克隆抗体：CD90-FITC、CD105-PE、CD73-APC、CD14-/CD20-/CD34-/CD45-PerCP，以鼠抗人的IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-APC、IgG1-PerCP、IgG2a-PerCP作为同型对照。
本发明方法，优先选择hPMSCs愈合度为70％时进行诱导培养。
本发明方法，所使用的细胞因子及其浓度分别为20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、20ng/ml表皮生长因子(EGF)、10ng/ml脑源性神经营养因子(BDNF)、10ng/ml血小板衍生因子(PDGF)、100ng/ml神经生长因子(NGF)和10μM维甲酸(RA)。
本发明技术方案实现的有益效果：
本发明提供的一种胎盘间充质干细胞体外定向诱导方法，将分离自胎盘的间充质干细胞进行体外扩增后，载定向分化成神经样细胞。间充质干细胞具有分化能力强和免疫原性低等特点，诱导过程不使用具有细胞毒性的化学物质，不会引起假阳性反应和细胞凋亡，也不使用神经细胞共培养，因此不存在目标细胞难以分离和潜在外源病原体的问题。同时，本发明方法诱导培养基中诱导因子的使用，最大程度地模拟了神经细胞在发育过程中所处的微环境。因此，本发明不仅能够获得丰富的高质量MSC，并且能够更加有效地促进MSC向神经细胞的分化。
本发明提供的方法不使用具有细胞毒性的化学物质、不使用神经细胞共培养、不使用中药成分作用、诱导剂细胞因子成分明确、分化效率高、耗时较短的胎盘间充质干细胞。本发明提供的方法能简便和稳定地获得大量神经样细胞，为治疗神经退行性疾病提供可能。
附图说明
图1为原代hPMSCs光学显微镜下形态；
图2为hPMSCs表面抗原分子的流式细胞仪鉴定图；
图3为hPMSCs经诱导后神经元树突标志物微管相关蛋白(MAP2)免疫荧光图；
图4为hPMSCs诱导为经星形胶质细胞特异标记胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光图。
具体实施方式
以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
本发明实施例其它所用的试剂若未经说明，均购自西格玛－奥德里奇(Sigma－Aldrich)公司。
实施例1胎盘间充质干细胞分离制备
使用经产妇同意授权的新生儿胎盘作为间充质干细胞的来源。
无菌条件下取产后新鲜胎盘，采用胎盘保存液(参见中国发明专利第ZL201410028687.X号)和胎盘采集保存装置(参见中国实用新型专利第ZL2014203904164号)进行胎盘的保存运输。48h内无菌条件下采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离，然后小心剪取胎盘绒毛膜，尽量多的去除掉黏附在绒毛膜上的结缔组织，用含1v/v％P/S的PBS浸泡漂洗3次～5次，将漂洗后的绒毛膜用眼科剪剪成约1mm3碎块，加入Ⅱ型胶原酶(酶消化终浓度0.1％)37℃消化90min，并于200rpm振荡。加入培养基500rpm离心5min(去除组织块和胶原酶)，取上清加入培养基2,000rpm离心10min(进一步去除胶原酶)，弃上清，加入培养基2,000rpm离心10min(更进一步去除胶原酶)，弃上清，加入培养基吹打均；取20μl细胞悬液加入到80μl红细胞裂解液中，室温下裂解5min,计数。调整细胞浓度为1.0×106细胞/ml，接种于T25cm2型细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，相差显微镜动态观察；培养2天～3天后全量换液，弃去未贴壁细胞，以后每2-3d全量换液一次；观察细胞贴壁生长至80-90％汇合时，以0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化，所得细胞为原代细胞(参见图1)。
观察原代hPMSCs细胞贴壁生长至80％～90％汇合时，吸弃培养瓶内原有培养液，吸取10ml0.01M PBS缓冲液轻轻加入培养瓶内洗涤，弃去洗液；加入0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化液1.0ml，浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察；加入1.0mlFBS中止胰酶消化；加入10ml 0.01M PBS反复吹打冲洗，在室温下1200rpm离心5min；弃去上清液，加入5ml DMEM重悬细胞，按1∶2～1∶3比例传代培养；置37℃，5％CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，计为第1代hPMSCs(P1)，待细胞生长至80％～90％汇合时，重复上述操作进行P2、P3、P4…代细胞培养扩增。
实施例2胎盘间充质干细胞免疫表型鉴定
取培养第2或第3代hPMSCs，首先用0.25％的胰蛋白酶消化离心，然后用含1％小牛血清白蛋白的PBS调整细胞浓度至1×107/ml；分别加入鼠抗人单克隆标记抗体CD90-FITC、CD105-PE、CD73-APC、CD14-/CD20-/CD34-/CD45-PerCP，以鼠抗人的IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-APC、IgG1-PerCP、IgG2a-PerCP作为同型对照，室温避光孵育10min，利用流式细胞仪检测，FlowJo软件分析结果。结果显示分离制备所得细胞表达间充质干细胞表面抗原CD73、CD90和CD105均在99％以上，而不表达CD14、CD20、CD34和CD45等表面抗原，结果见图2。由图2可见，制备所得的胎盘间充质干细胞纯度很高。
实施例3胎盘间充质干细胞成神经样细胞诱导培养
取3～4代培养细胞，5×104接种于6孔板，待hPMSCs生长密度达到70％时，换成诱导培养基；培养基成分为：DMEM为基础培养基，还加入10％FBS、1％P/S、1％Glu、20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、20ng/ml表皮生长因子、10ng/ml脑源性神经营养因子、10ng/ml血小板衍生因子、100ng/ml神经生长因子和10μM维甲酸，37℃，5％CO2，饱和湿度静置培养。
实施例4胎盘间充质干细胞成神经样细胞诱导分化为神经样细胞的检测
加入诱导液2小时后细胞形态即明显变化，光镜下hPMSCs的细胞质向核收缩，呈典型的核周体形态，3小时～5小时后多数细胞能形成神经元样细胞形态，胞体呈圆形，突起较长，在突起末端出现分支，部分相邻细胞的突起连接成网，但细胞数目无明显增加；3天后大多数细胞转变为双极或多极神经元细胞样形态，伸出突触(类似轴突或树突)，部分细胞之间拉成网状。
hPMSCs在诱导分化3天后采用免疫荧光染色。贴壁细胞去培养基，用PBS洗3次，经4％的多聚甲醛固定30分钟，PBS洗涤3次，0.3％TritonX-100处理20分钟，PBS漂洗3次，10％羊血清室温封20分钟，吸出血清，分别加入鼠抗人MAP2(1∶500)、GFAP(1∶1000)，4℃过夜，然后PBS洗3次，加入羊抗鼠-FITC(1∶500)孵30分钟，染色可见50％～70％MAP2(参见图3)、25％～50％GFAP阳性(参见图4)。结果表明成功诱导产生了神经样细胞。

Claims (7)

1.一种胎盘间充质干细胞体外定向诱导方法，其步骤如下：
步骤1：将所采集的胎盘脐带侧的羊膜去除，分离得到绒毛膜；
步骤2：再去除绒毛膜表面黏附的结缔组织；
步骤3：将绒毛膜剪碎成小块，加入等体积II型胶原酶消化；
步骤4：分离得到hPMSCs，接种于细胞培养瓶，进行原代培养和传代培养；
步骤5：取第二代或第三代细胞进行流式表面抗原鉴定；
步骤6：取第三代或第四代细胞接种：
步骤7：培养至间充质干细胞愈合度达60％～80％时弃掉培养基，更换含有细胞因子的诱导培养基进行诱导培养；
步骤8：诱导培养后进行细胞形态观察，2天～3天后进行免疫荧光染色鉴定。
2.根据权利要求1所述的胎盘间充质干细胞体外定向诱导方法，其特征在于II型胶原酶的终浓度0.1w/v％～0.2w/v％，消化时间为90分钟～100分钟，消化温度为37℃。消化采用振荡消化，速率为200rpm～300rpm。
3.根据权利要求1所述的胎盘间充质干细胞体外定向诱导方法，其特征在于所述原代培养和传代培养所用培养基以DMEM培养基为基础培养基，还含有10v/v％胎牛血清、1v/v％青霉素、lv/v％链霉素和1v/v％谷氨酰胺。
4.根据权利要求1所述的胎盘间充质干细胞体外定向诱导方法，其特征在于所述的原代培养过程中每隔3天更换一次培养基，直至细胞愈合度达到80％进行消化传代培养。
5.根据权利要求1所述的胎盘间充质干细胞体外定向诱导方法，其特征在于所述的流式表面抗原鉴定使用的抗体为下列鼠抗人单克隆抗体：CD90-FITC、CD105-PE、CD73-APC、CD14-/CD20-/CD34-/CD45-PerCP，以鼠抗人的IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-APC、IgG1-PerCP和IgG2a-PerCP作为同型对照。
6.根据权利要求1所述的胎盘间充质干细胞体外定向诱导方法，其特征在于hPMSCs愈合度为70％时进行诱导培养。
7.根据权利要求1所述的胎盘间充质干细胞体外定向诱导方法，其特征在于所述的细胞因子选自于20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、20ng/ml表皮生长因子、10ng/ml脑源性神经营养因子、10ng/ml血小板衍生因子、100ng/ml神经生长因子和10μM维甲酸之一种或几种。
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