CN109280641A - 增强间充质干细胞分化为神经细胞的方法 - Google Patents

增强间充质干细胞分化为神经细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种增强间充质干细胞分化为神经细胞的方法，通过分离羊胎盘细胞后通过反复冻融法破碎细胞并获取羊胎盘提取物；在干细胞培养液中加入适量的羊胎盘提取物；在干细胞培养的最适时期加入脑源神经营养因子，获得分化的神经细胞。本发明的优点在于操作过程简单易学，同时解决了骨髓间充质干细胞的增殖与定向分化为神经细胞的问题。

Description

增强间充质干细胞分化为神经细胞的方法
技术领域
本发明属于细胞培养及干细胞的增强分化领域，特别涉及一种增强间充质干细胞分化为神经细胞的方法。
背景技术
神经系统变性疾病属于临床中一类进行性中枢神经系统疾病，主要是由于系统性特殊神经细胞亚群发生变性后导致的一类疾病，常见的疾病类型包括帕金森病、遗传性舞蹈病、阿尔茨海默病等，其共同的特征为神经细胞功能缺失或者功能不良，干细胞在这些疾病的治疗方面具有很大的潜力。
间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，因此间充质干细胞可作为理想的种子细胞，在一定的诱导条件下，分化成神经细胞。但是人体内的间充质干细胞数量有限，而且间充质干细胞存在体外的传代和增殖过程中能力逐步的丢失的问题，这个问题对间充质干细胞的临床应用造成了很大的困难，因此要让神经系统疾病的干细胞治疗获得成功，首先要解决种子干细胞的增殖和分化问题。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种增强间充质干细胞分化为神经细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)：分离羊胎盘细胞后通过反复冻融法破碎细胞并获取羊胎盘提取物；
步骤(2)：将生长状况良好的人骨髓间充质干细胞用胰蛋白酶消化呈悬浮单细胞，再传至细胞培养板中加入培养基和羊胎盘提取物进行培养，以MTT法进行细胞生长状态监测；
步骤(3)：在人骨髓间充质干细胞培养7天后加入脑源神经营养因子继续培养21天，获得分化的神经细胞，弃去细胞培养液，再通过免疫荧光法对分化的神经细胞进行鉴定。
优选的是，步骤(1)中，所述的羊胎盘提取物为全羊胎盘提取物，所述羊胎盘提取物的制备步骤如下：
(1)将羊胎盘剪切成细小碎块，然后加入生理盐水，在匀浆机中粉碎羊胎盘获取羊胎盘细胞，羊胎盘质量与生理盐水体积之比(克/毫升)为1:2；
(2)通过离心方法在相对离心力为800xg的条件下收集羊胎盘细胞，弃上清液，为保证细胞完整性，最大相对离心力小于等于1000xg；
(3)羊胎盘细胞用生理盐水按质量体积比(克/毫升)1:1悬浮，离心收集羊胎盘细胞，弃上清液；重复洗涤1次；将羊胎盘细胞用生理盐水按质量体积比(克/毫升)1:1悬浮，分装后可冻存于-70℃冰箱；
(4)从-70℃冰箱取出冻存的羊胎盘细胞置于42℃水浴箱，复融15分钟，融化后每5分钟混匀一次，共两次；低温-70℃高温42℃的条件下重复冻融三次，使羊胎盘细胞充分破碎；高速离心(相对离心力8000xg以上)收集上清液，得全羊胎盘提取液；
(5)全羊胎盘提取液用0.22μm的滤膜进行过滤除菌，滤液用于干细胞表面受体诱导；或冷冻干燥后保存；
在上述任一方案中优选的是，步骤(2)中，所述的培养基为10.0％FBS、2 mmol·L- 1L-谷氨酰胺、100U·mL-1链霉素、100U·mL-1青霉素的αMEM培养基，培养条件为37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。
在上述任一方案中优选的是，步骤(2)中，所述羊胎盘提取物的添加量为 100-500μL，所述羊胎盘提取物浓度为50μg/mL。
在上述任一方案中优选的是，步骤(3)中，加入所述脑源神经营养因子为所述人骨髓间充质干细胞培养的5-8天。
在上述任一方案中优选的是，所述羊胎盘提取物能够选用孕周8周的乌珠穆沁羊新鲜胎盘。
在上述任一方案中优选的是，步骤(3)中，加入脑源神经营养因子继续培养的条件为37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。
在上述任一方案中优选的是，步骤(3)中，所述人骨髓间充质干细胞培养 7天后，能够观察到大量梭型细胞贴壁生长，培养21天后指标为：80％细胞具有突出样结构。
本发明的优点在于操作过程简单易学，同时解决了骨髓间充质干细胞的增殖与定向分化为神经细胞的问题。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述。以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。本发明所应用的化学试剂以及仪器如未经特别说明，均可从商业渠道购买。
实施例1
(1)取细胞传代至第3代且生长状况良好的人骨髓间充质干细胞，用0.25％胰蛋白酶消化呈悬浮单细胞，以4x104/mL的密度将骨髓间充质干细胞传至6孔细胞培养板中。
(2)骨髓间充质干细胞培养基为：10.0％FBS、2mmol·L-1L-谷氨酰胺、 100U·mL-1链霉素、100U·mL-1青霉素的αMEM培养基，每个培养孔羊胎盘提取物添加至终浓度为0.4μg/mL，培养条件为：37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。以MTT法进行细胞生长状态监测：去除培养基，用PBS缓冲液冲洗3次，在每个复孔中加入20μL的MTT试剂，继续在细胞培养箱中静置4h，再次去除培养基，用PBS缓冲液冲洗3次后，在每个复孔中加入150μL的DMSO试剂，轻轻震荡5min后在酶标仪上以490nm的波长检测光密度值，实验共重复3次。
(3)细胞分别在继续培养7天后添加脑源神经营养因子BDNF(10μg/ml)20 μL，培养条件为37℃、5％CO2细胞培养箱中培养21天。
(4)培养21天后的细胞，弃去细胞培养液，用PBS洗3遍以后加4％多聚甲醛固定30min，再用PBS冲洗3次，每次3min，用浓度为2％Tritox-100溶液室温破膜，PBS洗涤3次，每次3min，再用浓度5％的山羊血清室温封闭30min，PBS洗涤3次，每次3min，一抗Map-2(1：100)，40℃条件下孵育过夜，二抗DyLight 488AffiniPure GoatAnti-Rabbit IgG(H+L)(1：100)室温避光孵育1h，PBS冲洗2遍，封片，用荧光倒置显微镜下观察分化成神经元的数量结果如下：获得分化的神经细胞数为：2.7x104。
实施例2
(1)取细胞传代至第3代且生长状况良好的人骨髓间充质干细胞，用0.25％胰蛋白酶消化呈悬浮单细胞，以4x104/mL的密度将骨髓间充质干细胞传至6孔细胞培养板中。
(2)骨髓间充质干细胞培养基为：10.0％FBS、2mmol·L-1L-谷氨酰胺、 100U·mL-1链霉素、100U·mL-1青霉素的αMEM培养基，每个培养孔羊胎盘提取物添加至终浓度为0.4μg/mL，培养条件为：37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。以MTT法进行细胞生长状态监测：去除培养基，用PBS缓冲液冲洗3次，在每个复孔中加入20μL的MTT试剂，继续在细胞培养箱中静置4h，再次去除培养基，用PBS缓冲液冲洗3次后，在每个复孔中加入150μL的DMSO试剂，轻轻震荡5min后在酶标仪上以490nm的波长检测光密度值，实验共重复3次。
(3)细胞分别在继续培养7天后添加脑源神经营养因子BDNF(10μg/ml)20 μL，培养条件为37℃、5％CO2细胞培养箱中培养21天。
(4)培养21天后的细胞，弃去细胞培养液，用PBS洗3遍以后加4％多聚甲醛固定30min，再用PBS冲洗3次，每次3min，用浓度为2％Tritox-100溶液室温破膜，PBS洗涤3次，每次3min，再用浓度5％的山羊血清室温封闭30min，PBS洗涤3次，每次3min，一抗Map-2(1：100)，40℃条件下孵育过夜，二抗DyLight 488AffiniPure GoatAnti-Rabbit IgG(H+L)(1：100)室温避光孵育1h，PBS冲洗2遍，封片，用荧光倒置显微镜下观察分化成神经元的数量结果如下：获得分化的神经细胞数为：5.2x104。
实施例3
(1)取细胞传代至第3代且生长状况良好的人骨髓间充质干细胞，用0.25％胰蛋白酶消化呈悬浮单细胞，以4x104/mL的密度将骨髓间充质干细胞传至6孔细胞培养板中。
(2)骨髓间充质干细胞培养基为：10.0％FBS、2mmol·L-1L-谷氨酰胺、 100U·mL-1链霉素、100U·mL-1青霉素的αMEM培养基，每个培养孔羊胎盘提取物添加至终浓度为0.4μg/mL，培养条件为：37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。以MTT法进行细胞生长状态监测：去除培养基，用PBS缓冲液冲洗3次，在每个复孔中加入20μL的MTT试剂，继续在细胞培养箱中静置4h，再次去除培养基，用PBS缓冲液冲洗3次后，在每个复孔中加入150μL的DMSO试剂，轻轻震荡5min后在酶标仪上以490nm的波长检测光密度值，实验共重复3次。
(3)细胞分别在继续培养7天后添加脑源神经营养因子BDNF(10μg/ml)20 μL，培养条件为37℃、5％CO2细胞培养箱中培养21天。
(4)培养21天后的细胞，弃去细胞培养液，用PBS洗3遍以后加4％多聚甲醛固定30min，再用PBS冲洗3次，每次3min，用浓度为2％Tritox-100溶液室温破膜，PBS洗涤3次，每次3min，再用浓度5％的山羊血清室温封闭30min，PBS洗涤3次，每次3min，一抗Map-2(1：100)，40℃条件下孵育过夜，二抗DyLight 488AffiniPure GoatAnti-Rabbit IgG(H+L)(1：100)室温避光孵育1h，PBS冲洗2遍，封片，用荧光倒置显微镜下观察分化成神经元的数量结果如下：获得分化的神经细胞数为：6.6x104。
实施例4
(1)取细胞传代至第3代且生长状况良好的人骨髓间充质干细胞，用0.25％胰蛋白酶消化呈悬浮单细胞，以4x104/mL的密度将骨髓间充质干细胞传至6孔细胞培养板中。
(2)骨髓间充质干细胞培养基为：10.0％FBS、2mmol·L-1L-谷氨酰胺、 100U·mL-1链霉素、100U·mL-1青霉素的αMEM培养基，每个培养孔羊胎盘提取物添加至终浓度为0.4μg/mL，培养条件为：37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。以MTT法进行细胞生长状态监测：去除培养基，用PBS缓冲液冲洗3次，在每个复孔中加入20μL的MTT试剂，继续在细胞培养箱中静置4h，再次去除培养基，用PBS缓冲液冲洗3次后，在每个复孔中加入150μL的DMSO试剂，轻轻震荡5min后在酶标仪上以490nm的波长检测光密度值，实验共重复3次。
(3)细胞分别在继续培养7天后添加脑源神经营养因子BDNF(10μg/ml)20 μL，培养条件为37℃、5％CO2细胞培养箱中培养21天。
(4)培养21天后的细胞，弃去细胞培养液，用PBS洗3遍以后加4％多聚甲醛固定30min，再用PBS冲洗3次，每次3min，用浓度为2％Tritox-100溶液室温破膜，PBS洗涤3次，每次3min，再用浓度5％的山羊血清室温封闭30min，PBS洗涤3次，每次3min，一抗Map-2(1：100)，40℃条件下孵育过夜，二抗DyLight 488AffiniPure GoatAnti-Rabbit IgG(H+L)(1：100)室温避光孵育1h，PBS冲洗2遍，封片，用荧光倒置显微镜下观察分化成神经元的数量结果如下：获得分化的神经细胞数为：5.5x104。
实施例5
(1)取细胞传代至第3代且生长状况良好的人骨髓间充质干细胞，用0.25％胰蛋白酶消化呈悬浮单细胞，以4x104/mL的密度将骨髓间充质干细胞传至6孔细胞培养板中。
(2)骨髓间充质干细胞培养基为：10.0％FBS、2mmol·L-1L-谷氨酰胺、 100U·mL-1链霉素、100U·mL-1青霉素的αMEM培养基，每个培养孔内添加羊胎盘提取物500每个培养孔羊胎盘提取物添加至终浓度为0.4μg/mL，培养件为：37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。以MTT法进行细胞生长状态监测：去除培养基，用PBS缓冲液冲洗3次，在每个复孔中加入20μL的MTT试剂，继续在细胞培养箱中静置4h，再次去除培养基，用PBS缓冲液冲洗3次后，在每个复孔中加入150μL的DMSO试剂，轻轻震荡5min后在酶标仪上以490nm的波长检测光密度值，实验共重复3次。
(3)细胞分别在继续培养7天后添加脑源神经营养因子BDNF(10μg/ml)20 μL，培养条件为37℃、5％CO2细胞培养箱中培养21天。
(4)培养21天后的细胞，弃去细胞培养液，用PBS洗3遍以后加4％多聚甲醛固定30min，再用PBS冲洗3次，每次3min，用浓度为2％Tritox-100溶液室温破膜，PBS洗涤3次，每次3min，再用浓度5％的山羊血清室温封闭30min，PBS洗涤3次，每次3min，一抗Map-2(1：100)，40℃条件下孵育过夜，二抗DyLight 488AffiniPure GoatAnti-Rabbit IgG(H+L)(1：100)室温避光孵育1h，PBS冲洗2遍，封片，用荧光倒置显微镜下观察分化成神经元的数量结果如下：获得分化的神经细胞数为：4.2x104。
实施例6
(1)取细胞传代至第3代且生长状况良好的人骨髓间充质干细胞，用0.25％胰蛋白酶消化呈悬浮单细胞，以4x104/mL的密度将骨髓间充质干细胞传至6孔细胞培养板中。
(2)骨髓间充质干细胞培养基为：10.0％FBS、2mmol·L-1L-谷氨酰胺、 100U·mL-1链霉素、100U·mL-1青霉素的αMEM培养基，每个培养孔羊胎盘提取物添加至终浓度为0.4μg/mL，培养条件为：37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。以MTT法进行细胞生长状态监测：去除培养基，用PBS缓冲液冲洗3次，在每个复孔中加入20μL的MTT试剂，继续在细胞培养箱中静置4h，再次去除培养基，用PBS缓冲液冲洗3次后，在每个复孔中加入150μL的DMSO试剂，轻轻震荡5min后在酶标仪上以490nm的波长检测光密度值，实验共重复3次。
(3)细胞分别在继续培养8天后添加脑源神经营养因子BDNF(10μg/ml)20 μL，培养条件为37℃、5％CO2细胞培养箱中培养21天。
(4)培养21天后的细胞，弃去细胞培养液，用PBS洗3遍以后加4％多聚甲醛固定30min，再用PBS冲洗3次，每次3min，用浓度为2％Tritox-100溶液室温破膜，PBS洗涤3次，每次3min，再用浓度5％的山羊血清室温封闭30min，PBS洗涤3次，每次3min，一抗Map-2(1：100)，40℃条件下孵育过夜，二抗DyLight 488AffiniPure GoatAnti-Rabbit IgG(H+L)(1：100)室温避光孵育1h，PBS冲洗2遍，封片，用荧光倒置显微镜下观察分化成神经元的数量结果如下：获得分化的神经细胞数为：6.3x104。
实施例7
(1)取细胞传代至第3代且生长状况良好的人骨髓间充质干细胞，用0.25％胰蛋白酶消化呈悬浮单细胞，以4x104/mL的密度将骨髓间充质干细胞传至6孔细胞培养板中。
(2)骨髓间充质干细胞培养基为：10.0％FBS、2mmol·L-1L-谷氨酰胺、 100U·mL-1链霉素、100U·mL-1青霉素的αMEM培养基，每个培养孔羊胎盘提取物添加至终浓度为0.4μg/mL，培养条件为：37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。以MTT法进行细胞生长状态监测：去除培养基，用PBS缓冲液冲洗3次，在每个复孔中加入20μL的MTT试剂，继续在细胞培养箱中静置4h，再次去除培养基，用PBS缓冲液冲洗3次后，在每个复孔中加入150μL的DMSO试剂，轻轻震荡5min后在酶标仪上以490nm的波长检测光密度值，实验共重复3次。
(3)细胞分别在继续培养5天后添加脑源神经营养因子BDNF(10μg/ml)20 μL，培养条件为37℃、5％CO2细胞培养箱中培养8天。
(4)培养21天后的细胞，弃去细胞培养液，用PBS洗3遍以后加4％多聚甲醛固定30min，再用PBS冲洗3次，每次3min，用浓度为2％Tritox-100溶液室温破膜，PBS洗涤3次，每次3min，再用浓度5％的山羊血清室温封闭30min，PBS洗涤3次，每次3min，一抗Map-2(1：100)，40℃条件下孵育过夜，二抗DyLight 488AffiniPure GoatAnti-Rabbit IgG(H+L)(1：100)室温避光孵育1h，PBS冲洗2遍，封片，用荧光倒置显微镜下观察分化成神经元的数量结果如下：获得分化的神经细胞数为：6.7x104。
实施例8
(1)取细胞传代至第6代且生长状况良好的人骨髓间充质干细胞，用0.25％胰蛋白酶消化呈悬浮单细胞，以4x104/mL的密度将骨髓间充质干细胞传至6孔细胞培养板中。
(2)骨髓间充质干细胞培养基为：10.0％FBS、2mmol·L-1L-谷氨酰胺、 100U·mL-1链霉素、100U·mL-1青霉素的αMEM培养基，每个培养孔羊胎盘提取物添加至终浓度为0.4μg/mL，培养条件为：37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。以MTT法进行细胞生长状态监测：去除培养基，用PBS缓冲液冲洗3次，在每个复孔中加入20μL的MTT试剂，继续在细胞培养箱中静置4h，再次去除培养基，用PBS缓冲液冲洗3次后，在每个复孔中加入150μL的DMSO试剂，轻轻震荡5min后在酶标仪上以490nm的波长检测光密度值，实验共重复3次。
(3)细胞分别在继续培养7天后添加脑源神经营养因子BDNF(10μg/ml)20 μL，培养条件为37℃、5％CO2细胞培养箱中培养21天。
(4)培养21天后的细胞，弃去细胞培养液，用PBS洗3遍以后加4％多聚甲醛固定30min，再用PBS冲洗3次，每次3min，用浓度为2％Tritox-100溶液室温破膜，PBS洗涤3次，每次3min，再用浓度5％的山羊血清室温封闭30min，PBS洗涤3次，每次3min，一抗Map-2(1：100)，40℃条件下孵育过夜，二抗DyLight 488AffiniPure GoatAnti-Rabbit IgG(H+L)(1：100)室温避光孵育1h，PBS冲洗2遍，封片，用荧光倒置显微镜下观察分化成神经元的数量结果如下：获得分化的神经细胞数为：4.2x104。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种增强间充质干细胞分化为神经细胞的方法，包括以下步骤：
步骤(1)：分离羊胎盘细胞后破碎细胞并获取羊胎盘提取物；
步骤(2)：将生长状况良好的人骨髓间充质干细胞用胰蛋白酶消化呈悬浮单细胞，再加入培养基和羊胎盘提取物进行培养，以MTT法进行细胞生长状态监测；
步骤(3)：在人骨髓间充质干细胞培养7天后加入脑源神经营养因子继续培养21天，获得分化的神经细胞，弃去细胞培养液，再通过免疫荧光法对分化的神经细胞进行鉴定。
2.根据权利要求1所述的增强间充质干细胞分化为神经细胞的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的羊胎盘提取物为全羊胎盘提取物，所述羊胎盘提取物的制备步骤如下：
(1)将羊胎盘剪切成细小碎块，然后加入生理盐水，在匀浆机中粉碎羊胎盘获取羊胎盘细胞，羊胎盘质量与生理盐水体积之比(克/毫升)为1:2；
(2)通过离心方法在相对离心力为800xg的条件下收集羊胎盘细胞，弃上清液，为保证细胞完整性，最大相对离心力小于等于1000xg；
(3)羊胎盘细胞用生理盐水按质量体积比(克/毫升)1:1悬浮，离心收集羊胎盘细胞，弃上清液；重复洗涤1次；将羊胎盘细胞用生理盐水按质量体积比(克/毫升)1:1悬浮，分装后可冻存于-70℃冰箱；
(4)从-70℃冰箱取出冻存的羊胎盘细胞置于42℃水浴箱，复融15分钟，融化后每5分钟混匀一次，共两次；低温-70℃高温42℃的条件下重复冻融三次，使羊胎盘细胞充分破碎；高速离心收集上清液，得全羊胎盘提取液；
5)全羊胎盘提取液用0.22μm的滤膜进行过滤除菌，滤液用于干细胞表面受体诱导；或冷冻干燥后保存。
3.根据权利要求1所述的增强间充质干细胞分化为神经细胞的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的培养基为10.0％FBS、2mmol·L-1L-谷氨酰胺、100U·mL-1链霉素、100U·mL-1青霉素的αMEM培养基，培养条件为37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。
4.根据权利要求1所述的增强间充质干细胞分化为神经细胞的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述羊胎盘提取物的添加量为100-500μL，所述羊胎盘提取物浓度为50μg/mL。
5.根据权利要求1所述的一种增强间充质干细胞分化为神经细胞的方法，其特征在于，步骤(3)中，加入所述脑源神经营养因子为所述人骨髓间充质干细胞培养的5-8天。
6.根据权利要求1所述的一种增强间充质干细胞分化为神经细胞的方法，其特征在于，所述羊胎盘提取物能够选用孕周8周的乌珠穆沁羊新鲜胎盘。
7.根据权利要求1所述的一种增强间充质干细胞分化为神经细胞的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，加入脑源神经营养因子继续培养的条件为37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。
8.根据权利要求1所述的一种增强间充质干细胞分化为神经细胞的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述破碎细胞采用反复冻融法。
9.根据权利要求1所述的一种增强间充质干细胞分化为神经细胞的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述人骨髓间充质干细胞培养7天后，能够观察到大量梭型细胞贴壁生长，培养21天后指标为：80％细胞具有突出样结构。
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