CN106377799A - 一种牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体的制备方法，经过人牙髓干细胞的分离与原代培养、牙髓干细胞成软骨分化鉴定、牙髓干细胞成脂分化鉴定、多孔壳聚糖支架的制备和共培养步骤完成牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体的制备；本发明制作的壳聚糖支架，通过电镜下观测牙髓干细胞与壳聚糖之间的黏附情况，从而有效证实了牙髓干细胞与壳聚糖支架具有良好的生物相容性，同时壳聚糖支架对牙髓干细胞无毒性反应。

Description

一种牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体的制备方法

技术领域

本发明涉及一种复合体的制备方法，具体涉及一种牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体的制备方法。

背景技术

目前用于神经组织再生工程研究较多的间充质干细胞主要为来自骨髓和脂肪组织的骨髓间充质干细胞及脂肪间充质干细胞。已研究表明，它们可以定向分化成SCs及具有形成髓鞘的能力。但这些间充质干细胞在临床上受其来源及获取方式的限制，临床应用前景有缺陷。近年来研究者从成人第三磨牙的牙髓组织中成功分离培养出一种新的间充质干细胞-牙髓干细胞，它是一种具有多向分化潜能、参与免疫调节、诱导免疫耐受、并具有组织修复能力的干细胞。关于牙髓干细胞的研究也日益增多。Daniel.L等人将来源于同一供体的牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞比较后发现，它们具有相似的细胞形态和流式细胞谱，并且都具有克隆集落形成能力及多向分化能力，然而，所不同的是牙髓干细胞较骨髓间充质干细胞相比，具有更高的增殖能力，并且在骨诱导基中显示了更高的碱性磷酸酶活性。更重要的是，从人体内提取骨髓间充质干细胞的过程是一种有创性的，并且给患者带来巨大的痛苦；而牙髓干细胞的获得相比就简单便捷，临床治疗过程中的一些丢弃的牙齿，例如埋伏阻生牙、因正畸拔出的牙齿以及不可逆性牙周炎丧失的牙齿，都可以作为干细胞库的可靠来源。

同时，在生物医用领域中，壳聚糖支架是一种成熟支架，已用于生物医学研究多年。具有可以给细胞的生长提供空间，使其在支架上生长、繁殖，最终形成具有一定功能的器官的特点。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，现提供一种能够有效维护和促进人体细胞和组织的生长，从而恢复、维持或提高受损组织或器官的功能的牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体的制备方法，其创新点在于：经过人牙髓干细胞的分离与原代培养、牙髓干细胞成软骨分化鉴定、牙髓干细胞成脂分化鉴定、多孔壳聚糖支架的制备和共培养步骤完成牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体的制备；所述具体步骤如下：

（1）人牙髓干细胞的分离与原代培养：取临床上被拔出的完整的第三磨牙，将离体牙置入碘伏中浸泡1分钟，用无菌生理盐水冲净牙齿表面血迹，用无菌咬骨钳沿釉牙骨质界打开髓腔，镊子取出牙髓，并剪除近根部牙髓组织，选用反应酶与剪碎的牙髓组织混合消化1小时，将消化后的组织置于离心机中以1000rpm/min转速，离心5分钟，弃去上清液，加入完全培养基中，吹打混匀，经70 µm的细胞金属网过滤，将获得的细胞悬浮液接种于10cm培养箱中，加入完全培养液进行培养，所述培养箱培养条件为相对湿度100%，5%CO₂，37℃；3天更换一次培养液，细胞融合达到70%-80%后，室温条件下，0.25%胰蛋白酶消化2分钟，1000rpm/min离心5分钟，弃除上清，吹打沉淀，混匀后以1:3比例传代，每3天换液1次，取第三代牙髓干细胞进行观察；

（2）牙髓干细胞成软骨分化鉴定：取第三代牙髓干细胞制成2×10⁵ 细胞/ml的细胞悬液，取1ml的步骤（1）中的细胞悬液加入到15ml离心管，在1000rpm/min转速下离心5分钟，分化组加入成软骨培养液, 对照组加入完全培养液，培养4周后取材检测成软骨分化情况，取材后将标本放入4%多聚甲醛中固定24小时，20%蔗糖固定2天，30%蔗糖固定3天，组织嵌入O.T.C.化合物包埋，切成5μm厚切片，取出切片，置于烘箱内，37℃下放置30分钟，0.01M PBS液中漂洗两次，每次漂洗5分钟，甲苯胺蓝染色观察细胞外基质中糖胺多糖分泌情况；

（3）牙髓干细胞成脂分化鉴定：取第三代牙髓干细胞以3,000个/cm²密度接种于6孔中，分化组加入成脂分化培养液，对照组加入完全培养液，2-3天更换一次培养基，诱导分化3周，吸弃细胞培养液，0.01 M PBS冲洗5min×3次，4%多聚甲醛中固定1小时，0.01 M PBS冲洗5 min×3次，吸干后油红染色30min，60%乙醇分色至背景清晰，蒸馏水冲洗后显微镜下观察见串珠状圆形透明脂滴形成；

（4）多孔壳聚糖支架的制备：将壳聚糖粉末溶于密度为1%的醋酸溶液中配制成密度为2%的溶液,向24孔培养板每孔中加入密度为2%壳聚糖醋酸溶液1ml置于4℃环境下，放置6h,再置于-28℃冷冻过夜后, 再放入-60℃下冷冻干燥24h，向培养板每孔中加入0.1 mol/L的NaOH溶液1ml碱化20 min,再用pH为7.2的0.01 mol/L的PBS清洗3次,最后再进行两次冷冻干燥，壳聚糖支架接种细胞前用70%的乙醇先灭菌, 再用无菌的生理盐水清洗3次,最后经紫外灯照射干燥20 min；

（5）共培养：细胞每次接种前先从培养皿中吹打下来，加入灭菌后的壳聚糖支架，吸取含有游离干细胞的培养液，最后将载有牙髓干细胞的壳聚糖支架放入培养箱中进行培养，培养箱培养条件为相对湿度100%、5%CO₂、37℃，24h后可检测细胞吸附情况及进行后续实验。

进一步的，所述步骤（1）中的反应酶为4mg/ml分散酶与3mg/mlI型胶原酶的混合物，所述分散酶与I型胶原酶的混合体积比为1:1,所述反应酶与剪碎的牙髓组织的混合体积为1:10。

进一步的，所述完全培养液为在DMEM基础培养基中加入10%胎牛血清、1%谷氨酸、1%青霉素或链霉素。

进一步的，所述步骤（2）中的成软骨培养液为DMEM基础培养基中加入10µg/mlITS-X,10ng/ml TGF-β3，1.0µg/ml地塞米松、5.35µg/ml亚油酸、10%胎牛血清、1%谷氨酸、1%青霉素或链霉素。

进一步的，所述步骤（3）中的成脂分化培养液为1.0 µg/ml地塞米松、5µg/ml胰岛素、0.5mmol/l IBMX和60µmol/l吲哚美辛。

本发明的有益效果如下：

（1）本发明选用的牙髓干细胞具有多向分化能力，可向成骨细胞、成牙本质细胞、成脂肪细胞和成神经细胞分化，为进一步的应用提供了有力的支持。

（2）本发明制作的壳聚糖支架，通过电镜下观测牙髓干细胞与壳聚糖之间的黏附情况，从而有效证实了牙髓干细胞与壳聚糖支架具有良好的生物相容性，同时壳聚糖支架对牙髓干细胞无毒性反应。

附图说明

图1为本发明的牙髓干细胞外观图；

图2为本发明的牙髓干细胞成软骨分化4周鉴定图；

图3为本发明的牙髓干细胞成脂肪分化3周鉴定图；

图4为本发明的扫描电子显微镜观察到壳聚糖支架的形态结构图；

图5为本发明的牙髓干细胞粘附于壳聚糖支架上的形态结构图；

图6为本发明的与壳聚糖共培养过的牙髓干细胞的形态结构图；

图7为本发明的与壳聚糖共培养过的牙髓干细胞阴性对照图的形态结构图；

图8为本发明的与酒精共培养过的牙髓干细胞的形态结构图；

图9为本发明的壳聚糖支架的细胞毒性分析图；

图10为本发明的牙髓干细胞改善的脊髓损伤大鼠的生存曲线；

图11为本发明的牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体用于损伤大鼠恢复图；

图12为本发明的牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体8周后分别分析各组轴突计数图；

图13为本发明的牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体8周后分别分析各组动作电位图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

一种牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体的制备方法，经过人牙髓干细胞的分离与原代培养、牙髓干细胞成软骨分化鉴定、牙髓干细胞成脂分化鉴定、多孔壳聚糖支架的制备和共培养步骤完成牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体的制备；所述具体步骤如下：

（1）人牙髓干细胞的分离与原代培养：取临床上被拔出的完整的第三磨牙，将离体牙置入碘伏中浸泡1分钟，用无菌生理盐水冲净牙齿表面血迹，用无菌咬骨钳沿釉牙骨质界打开髓腔，镊子取出牙髓，并剪除近根部牙髓组织，选用反应酶与剪碎的牙髓组织混合消化1小时，反应酶为4mg/ml分散酶与3mg/mlI型胶原酶的混合物，所述分散酶与I型胶原酶的混合体积比为1:1,所述反应酶与剪碎的牙髓组织的混合体积为1:10，将消化后的组织置于离心机中以1000rpm/min转速，离心5分钟，弃去上清液，加入完全培养基中，吹打混匀，经70 µm的细胞金属网过滤，将获得的细胞悬浮液接种于10cm培养箱中，加入完全培养液进行培养，所述培养箱培养条件为相对湿度100%，5%CO₂，37℃；3天更换一次培养液，细胞融合达到70%-80%后，室温条件下，0.25%胰蛋白酶消化2分钟，1000rpm/min离心5分钟，弃除上清，吹打沉淀，混匀后以1:3比例传代，每3天换液1次，取第三代牙髓干细胞进行观察；

（2）牙髓干细胞成软骨分化鉴定：取第三代牙髓干细胞制成2×10⁵ 细胞/ml的细胞悬液，取1ml的步骤（1）中的细胞悬液加入到15ml离心管，在1000rpm/min转速下离心5分钟，分化组加入成软骨培养液, 成软骨培养液为DMEM基础培养基中加入10µg/ml ITS-X,10ng/mlTGF-β3，1.0µg/ml地塞米松、5.35µg/ml亚油酸、10%胎牛血清、1%谷氨酸、1%青霉素或链霉素，对照组加入完全培养液，培养4周后取材检测成软骨分化情况，取材后将标本放入4%多聚甲醛中固定24小时，20%蔗糖固定2天，30%蔗糖固定3天，组织嵌入O.T.C.化合物包埋，切成5μm厚切片，取出切片，置于烘箱内，37℃下放置30分钟，0.01M PBS液中漂洗两次，每次漂洗5分钟，甲苯胺蓝染色观察细胞外基质中糖胺多糖分泌情况；

（3）牙髓干细胞成脂分化鉴定：取第三代牙髓干细胞以3,000个/cm²密度接种于6孔中，分化组加入成脂分化培养液，成脂分化培养液为1.0 µg/ml地塞米松、5µg/ml胰岛素、0.5mmol/l IBMX和60µmol/l吲哚美辛，对照组加入完全培养液，2-3天更换一次培养基，诱导分化3周，吸弃细胞培养液，0.01 M PBS冲洗5min×3次，4%多聚甲醛中固定1小时，0.01 MPBS冲洗5 min×3次，吸干后油红染色30min，60%乙醇分色至背景清晰，蒸馏水冲洗后显微镜下观察见串珠状圆形透明脂滴形成；

（4）多孔壳聚糖支架的制备：将壳聚糖粉末溶于密度为1%的醋酸溶液中配制成密度为2%的溶液,向24孔培养板每孔中加入密度为2%壳聚糖醋酸溶液1ml置于4℃环境下，放置6h,再置于-28℃冷冻过夜后, 再放入-60℃下冷冻干燥24h，向培养板每孔中加入0.1 mol/L的NaOH溶液1ml碱化20 min,再用pH为7.2的0.01 mol/L的PBS清洗3次,最后再进行两次冷冻干燥，壳聚糖支架接种细胞前用70%的乙醇先灭菌, 再用无菌的生理盐水清洗3次,最后经紫外灯照射干燥20 min；

（5）共培养：细胞每次接种前先从培养皿中吹打下来，加入灭菌后的壳聚糖支架，吸取含有游离干细胞的培养液，最后将载有牙髓干细胞的壳聚糖支架放入培养箱中进行培养，培养箱培养条件为相对湿度100%、5%CO₂、37℃，24h后可检测细胞吸附情况及进行后续实验。

完全培养液为在DMEM基础培养基中加入10%胎牛血清、1%谷氨酸、1%青霉素或链霉素。

对上述方法制备得到的牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体进行以下检测：

1、多孔壳聚糖支架孔隙率的检测

采用乙醇替代法测定多孔壳聚糖支架的孔隙率， 将已制备好的壳聚糖多孔支架材料置于固定体积V1的乙醇中, 循环抽吸虑泡逸出, 测材料和乙醇的总体积记为V2, 所以(V2－V1) 为壳聚糖多孔支架固体的体积，将含乙醇的支架材料移出后视所剩乙醇的体积为V3, 所以材料中所含乙醇的体积( V1－V3)为材料中孔隙所占的体积, 故材料的总体积为: V = ( V2－V1 ) +(V 1－V3) = V2－V3；壳聚糖多孔支架的孔隙率P=( V1－V3)/(V2－V3)。

2、扫描电镜

扫描电子显微镜来分析牙髓干细胞黏附于壳聚糖支架表面的情况，用pH 7.4的PBS冲洗支架，然后用2%戊二醛和0.6%多聚甲醛在4℃固定24h，壳聚糖通过丙酮梯度系列进行脱酸，在2个临界点进行干燥， 再涂上目钯，在3个加速20千伏的电压下用扫描电子显微镜观察这些样品，重复7次这样的测试。 3、共培养细胞的活性测定牙髓干细胞与壳聚糖共培养24h、48h、72h后， 从6孔板中移出， 并且用PBS清洗两遍，黏附于壳聚糖上的细胞用0.25%胰酶进行消化， 离心5min并且收集，在随后的分析中，从壳聚糖支架上分离的细胞被称为壳聚糖细胞，未与壳聚糖支架共培养的细胞称为阴性细胞，壳聚糖细胞和阴性细胞以每孔6000个细胞的密度接种于96孔板， 每100 µl完培进行培养，然后将样品置于37℃、5% CO₂、95%湿度的细胞培养箱中培养，细胞活性通过细胞计数试剂盒 Kit-8(CCK-8)进行测试，壳聚糖组即含有壳聚糖细胞的，阳性组即培养液含有 0.01g/l醋酸铅为阳性对照，对照组即不含任何细胞的。在测试吸光度(A)之前，每孔加入10µl CCK-8，置于37℃孵育1h，多模酶标仪测量光密度，细胞活性测试如下列公式：细胞活性（%）=（Aexperiment－Acontrol）/Anormal ×100。

4、 蛋白质印迹法

（1）细胞总蛋白提取:倒掉培养皿中培养液，预冷的0.01 M PBS 1ml加入每孔，刮下细胞，于4℃、1 000 rpm/min离心15分钟，弃上清，加入1×SDS蛋白裂解液，震荡混匀，溶解细胞沉淀，冰浴20 min。置沸水煮10 min，4℃、12000 rpm/min离心10 min，弃上清，于-80 ℃低温冰箱保存。

（2）核浆分离：细胞质、细胞核蛋白提取:细胞核蛋白提取按照Beyotime细胞核蛋白抽提试剂盒说明说进行。

（3）凝胶电泳和蛋白质免疫检测：利用改良Lowry法进行蛋白定量后，将蛋白量:2×SDS、裂解液、DTT以4:1:5比例混匀，沸水煮5min，使蛋白质变性，将胶板用蒸馏水冲洗干净，晾干，进行配胶，根据蛋白分子量大小确定胶的浓度。在电泳槽中加入稀释后电泳缓冲液，取出上样，调整电泳时间。安装电极，接上电源，恒压80 V，使蛋白质跑到同一条起跑线上，蛋白质跑至分离胶上时改为110V。切胶，放入转膜缓冲液。将PVDF膜放置在甲醇中极化，蒸馏水中水化后放入转膜液，PVDF膜、棉垫及滤纸一起放入转膜缓冲液中平衡15 min。将PVDF膜、胶、棉垫及滤纸制作成“三明治”结构，第一层为棉垫，第二层为滤纸，第三层为胶，第四层为PVDF膜，第五层为滤纸，第六层为棉垫，夹紧。将作成“三明治”放入转膜槽内，加入转膜液和冰盒，转膜槽放在装满冰水的盆里，安装电极、接好电源，转膜条件设定为恒流350mA，150 min，转膜结束后取出PVDF膜，进行标记，放在摇床上，TBST洗5min×3次，5%脱脂牛奶封闭2 h。TBST洗膜5min×3次。一抗孵育，室温1 h后4℃过夜。TBST洗膜10 min×3次。二抗孵育，室温2h。TBST洗10min×3次。LumiGLO Regent and Peroxide显影，冲洗胶片，胶片予扫描仪扫描后分析其灰度；对比目的蛋白与GAPDH的灰度值，所得的比值为目的蛋白的相对表达量。

5、免疫荧光

小圆片置于24孔板内，牙髓干细胞接种至小圆片上，贴壁后给予相应的刺激，有牙髓干细胞的小圆片用0.01M PBS洗3次，4℃条件下，4%多聚甲醛固定30 min，0.01M PBS洗涤5min×3次，室温0.1%TritonX-100通透10 min，预冷的0.01 M PBS洗涤5 min×3次。加二抗正常封闭血清，室温孵育2 h，弃除封闭液，勿洗；加一抗，一抗采用1:100的稀释比例进行稀释后使用，4 ℃孵育过夜，预冷的0.01 M PBS洗涤5 min×3次。加荧光二抗，二抗采用1:100的稀释比例进行稀释后使用，避光4℃孵育1 h，0.01 M PBS洗涤5 min×3次，缓冲甘油封片，避光并在荧光显微镜下观察。

6、逆转录多聚酶链反应

细胞 mRNA 的制备（1）弃细胞培养液，0.01 M PBS冲洗1遍；（2） 每个样品加1 mlTrizol裂解液，接着冰浴、 然后匀浆， 最后室温静置5 min；（3）先加入0.5 ml氯仿，然后混匀、接着振荡 15 s，最后室温静置5 min后可分层；（4）4℃，12000 rpm/min 离心15 min，然后取上清移至新的EP管中；（5）EP管中加入 0.5 ml 异丙醇， 先轻轻混匀， 然后室温静置10 min；（6）4℃，12000 rpm/min 离心10 min， 然后弃除上清， 最后保留管底部微量RNA沉淀。（7） 加入预冷的1ml75%乙醇，轻轻弹起沉淀，接着充分震荡、最后洗涤沉淀；（8）4℃，7500rpm/min离心5min，再弃除上清，然后用滤纸轻轻吸出EP管中残留液体；（9）晾干EP管中沉淀，可透明的RNA，接着加入RNA-freeH2O 30ml，65℃促溶10-15 min；（10）紫外分光光度计测定并记录OD260/OD280值，计算RNA浓度(µg/µL)，-80℃保存。

7、脊髓损伤模型建立

切口以第11胸椎为中心，切开皮肤和肌肉，以刀柄向两侧钝性分离肌肉，小弯钳拉开软组织，无菌纱布擦去棘突和椎板附着的肌肉，暴露第10-12胸椎棘突和椎板，用止血钳咬除第11胸椎棘突和椎板以及部分胸10、12棘突和椎板，充分暴露脊髓，质量5g的祛码在17cm高度处通过玻璃试管自由下落，对大鼠脊髓进行定量打击，打击头面积为3.0mm²，打击能量为85gcm，打击后可见大鼠双后肢抽动、甩尾，随后完全松弛，大鼠脊髓硬脊膜下可见充血，致伤后迅速移去祛码，生理盐水冲洗伤口后，覆以明胶海绵局部止血，防止脊髓组织与周围组织粘连从而为细胞移植或取脊髓组织时造成困难，逐层缝合肌肉、皮肤，碘伏消毒后放入笼中。

8、面神经损伤模型建立

腹腔注射40mg/kg戊巴比妥钠麻醉大鼠后，手术显微镜下切断左侧面神经，面神经单纯切断组：面神经出茎乳孔后刚发出耳后支的远端，用1mm丝线结扎面神经，在结扎处的远端切除一段5mm的神经干，防止断端重新吻合。分为四组，正常对照组，损伤对照组，空白支架组，及载有牙髓干细胞的壳聚糖支架组，分别植入模型中缺损部位，并在无菌条件下与损伤部位断端吻合，固位良好，关闭创口。

9、统计学处理

测试数据所得的数据以均数±标准差表示，采用SPASS18.0软件进行One-Way-ANOVA分析，两两比较采用Student-Newman-Keuls检验。

通过上述检测，得到以下结果：

1、牙髓干细胞成软骨、成脂肪、成脂分化的鉴定

观察P3代牙髓干细胞形态，可见其呈成纤维细胞样外观如图1所示，接着对牙髓干细胞进行成软骨和成脂分化诱导，成软骨分化4周后，甲苯胺蓝染色明显如图2所示，细胞成脂分化7天左右可见脂滴形成，诱导分化3周进行油红O染色，可见细胞内含大量圆形红色脂滴，如图3所示。

由图1可得，牙髓干细胞形态，呈纺锤状；由图2可得牙髓干细胞成软骨分化分化4周鉴定：甲苯胺蓝染色；由图3可得牙髓干细胞成脂肪分化3周鉴定：脂滴的油红O染色。

2、壳聚糖支架特征

24孔板做模板制做壳聚糖支架，壳聚糖支架直径16mm，厚度5mm，通过在温度为 37℃的PBS中的吸附试验，我们得出壳聚糖的吸附率为 84.33±10.92%，此实验表明壳聚糖支架是一种亲水材料， 并且能适应于盐溶液。通过冷冻干燥法制成的三维壳聚糖支架呈线性排列、 有多孔性微结构。通过SEM我们也可观察到壳聚糖的微结构。 通过这些试验，我们发现壳聚糖支架是多种多孔性，并且孔之间紧密相连，孔的表面光滑，如图4所示。通过进一步的检查我们得出壳聚糖的孔径平均约为 269.87±18.55 µm。SEM 同样可以观察到牙髓干细胞紧紧地粘附于壳聚糖支架上，如图5所示。

3、牙髓干细胞 与壳聚糖支架的生物相容性

通过酶消化收集支架上的细胞，并且以相同的细胞密度种于96 孔板，然后再测定细胞的健康和生存能力。如图所示6所示为与壳聚糖共培养过的牙髓干细胞的形态是梭形的,类似于正常组，如图7所示。 另外，在阳性细胞组中的细胞，即采用牙髓干细胞与酒精共培养，丧失了它的梭形形态，牙髓干细胞变成了圆形，一部分细胞开始死亡的，并且漂浮于培养液中，如图8所示。CCK-8测试用来评估生物材料壳聚糖支架对牙髓干细胞毒性。我们发现，与正常组（用新鲜细胞进行培养）相比，壳聚糖支架未影响壳聚糖细胞的活性。正如我们所预想的，与酒精进行培养明显降低了牙髓干细胞的活性，如图9所示，可得，牙髓干细胞在壳聚糖支架上可以共存并且生存良好。

4、壳聚糖⽀架上 牙髓干细胞 神经分化

测定了牙髓干细胞向神经元、星型胶质细胞，少突胶质神经细胞分化的标记物，通过RT-PCR测定了在mRNA水平检测基因表达的情况。测试发现前神经元标记物 Nestin 表达水平都是很低的， 在NIM神经分化培养液培养后，Nestin的表达从50%降到10%，相反，神经元分化标记物CNP，GFAP， MAP-2 神经元在分化前表达是低的，经过NIM诱导、在壳聚糖支架上培养后它们表达水平都增加；western blotting试验显示在未分化牙髓干细胞组的Nestin表达量是有的， 且经神经诱导分化后表达是降低的，神经元细胞特型标记物CNP、GFAP、MAP-2表达在分化过后表达都是增加的，通过以GAPDH为参照计算蛋白质的光学密度。在经神经诱导分化后，Nestin表达是降低的，CNP、GFAP、MAP-2的表达是增加的，由此可得：壳聚糖支架不会影响多潜能的牙髓干细胞及其分化成不同类型的神经细胞的能力。经神经诱导后，四个实验组都被标记了免疫荧光 CNP、 GFAP、 MAP-2抗体，用来鉴定牙髓干细胞分化的神经元细胞。在未分化的四组中， 大约只有1%的阳性CNP细胞，在牙髓干细胞＋NIM组、S＋牙髓干细胞＋NIM组分别有3%、5%的阳性CNP 细胞，在未分化的四组细胞中， 只有少量的 MAP-2 阳性细胞,在经过神经诱导后，上升到8-12%，最后，尽管未分化的牙髓干细胞不表达GFAP，经神经诱导后，大约有 70-80%的细胞分化为GFAP 阳性的星形胶质细胞。

5、牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体能改善脊髓损伤大鼠的运动功能恢复

牙髓干细胞改善脊髓损伤大鼠的运动功能恢的生存曲线如图10所示，可得接受载有牙髓干细胞的壳聚糖支架植入后，大鼠后下肢运动能力较其他组恢复明显，组织分析大鼠脊髓损伤接受牙髓干细胞治疗30天后，对照组无损害，可在灰质周围见到大量典型的神经元凋亡导致的神经元碎片、液化液泡,不规则空泡以及轴突讲解可在白色组织中见到，组织减少、凋亡细胞增多及轴突降解在支架及细胞治疗组较其他组明显减少，Bar 50μm。

6、牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体能改善面神经损伤大鼠功能恢复

如图11所示为牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体修复面神经损伤大鼠的四组示意图；所述A为对照组，B为神经损伤空白对照组，C为载有空白支架组，D为载有牙髓干细胞及壳聚糖支架组。如图12所示为四组8周后轴突计数图，如图13所示为四组8周后动作电位图；由此可知，壳聚糖支架加牙髓干细胞组效果优于空白支架组，经过壳聚糖支架加牙髓干细胞治疗后，大鼠轴突计数增加明显，动作电位改善明显。

上述实施例只是本发明的较佳实施例，并不是对本发明技术方案的限制，只要是不经过创造性劳动即可在上述实施例的基础上实现的技术方案，均应视为落入本发明专利的权利保护范围内。

Claims (5)

1.一种牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体的制备方法，其特征在于：经过人牙髓干细胞的分离与原代培养、牙髓干细胞成软骨分化鉴定、牙髓干细胞成脂分化鉴定、多孔壳聚糖支架的制备和共培养步骤完成牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体的制备；所述具体步骤如下：

（1）人牙髓干细胞的分离与原代培养：取临床上被拔出的完整的第三磨牙，将离体牙置入碘伏中浸泡1分钟，用无菌生理盐水冲净牙齿表面血迹，用无菌咬骨钳沿釉牙骨质界打开髓腔，镊子取出牙髓，并剪除近根部牙髓组织，选用反应酶与剪碎的牙髓组织混合消化1小时，将消化后的组织置于离心机中以1000rpm/min转速，离心5分钟，弃去上清液，加入完全培养基中，吹打混匀，经70 µm的细胞金属网过滤，将获得的细胞悬浮液接种于10cm培养箱中，加入完全培养液进行培养，所述培养箱培养条件为相对湿度100%，5%CO₂，37℃；3天更换一次培养液，细胞融合达到70%-80%后，室温条件下，0.25%胰蛋白酶消化2分钟，1000rpm/min离心5分钟，弃除上清，吹打沉淀，混匀后以1:3比例传代，每3天换液1次，取第三代牙髓干细胞进行观察；

（2）牙髓干细胞成软骨分化鉴定：取第三代牙髓干细胞制成2×10⁵ 细胞/ml的细胞悬液，取1ml的步骤（1）中的细胞悬液加入到15ml离心管，在1000rpm/min转速下离心5分钟，分化组加入成软骨培养液, 对照组加入完全培养液，培养4周后取材检测成软骨分化情况，取材后将标本放入4%多聚甲醛中固定24小时，20%蔗糖固定2天，30%蔗糖固定3天，组织嵌入O.T.C.化合物包埋，切成5μm厚切片，取出切片，置于烘箱内，37℃下放置30分钟，0.01M PBS液中漂洗两次，每次漂洗5分钟，甲苯胺蓝染色观察细胞外基质中糖胺多糖分泌情况；

（3）牙髓干细胞成脂分化鉴定：取第三代牙髓干细胞以3,000个/cm²密度接种于6孔中，分化组加入成脂分化培养液，对照组加入完全培养液，2-3天更换一次培养基，诱导分化3周，吸弃细胞培养液，0.01 M PBS冲洗5min×3次，4%多聚甲醛中固定1小时，0.01 M PBS冲洗5 min×3次，吸干后油红染色30min，60%乙醇分色至背景清晰，蒸馏水冲洗后显微镜下观察见串珠状圆形透明脂滴形成；

（4）多孔壳聚糖支架的制备：将壳聚糖粉末溶于密度为1%的醋酸溶液中配制成密度为2%的溶液,向24孔培养板每孔中加入密度为2%壳聚糖醋酸溶液1ml置于4℃环境下，放置6h,再置于-28℃冷冻过夜后, 再放入-60℃下冷冻干燥24h，向培养板每孔中加入0.1 mol/L的NaOH溶液1ml碱化20 min,再用pH为7.2的0.01 mol/L的PBS清洗3次,最后再进行两次冷冻干燥，壳聚糖支架接种细胞前用70%的乙醇先灭菌, 再用无菌的生理盐水清洗3次,最后经紫外灯照射干燥20 min；

（5）共培养：细胞每次接种前先从培养皿中吹打下来，加入灭菌后的壳聚糖支架，吸取含有游离干细胞的培养液,最后将载有牙髓干细胞的壳聚糖支架放入培养箱中进行培养，培养箱培养条件为相对湿度100%、5%CO₂、37℃，24h后可检测细胞吸附情况及进行后续实验。

2.根据权利要求1所述的一种牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中的反应酶为4mg/ml分散酶与3mg/ml I型胶原酶的混合物，所述分散酶与I型胶原酶的混合体积比为1:1,所述反应酶与剪碎的牙髓组织的混合体积为1:10。

3.根据权利要求1所述的一种牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体的制备方法，其特征在于：所述完全培养液为在DMEM基础培养基中加入10%胎牛血清、1%谷氨酸、1%青霉素或链霉素。

4.根据权利要求1所述的一种牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的成软骨培养液为DMEM基础培养基中加入10µg/ml ITS-X,10ng/mlTGF-β3，1.0µg/ml地塞米松、5.35µg/ml亚油酸、10%胎牛血清、1%谷氨酸、1%青霉素或链霉素。

5.根据权利要求1所述的一种牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中的成脂分化培养液为1.0 µg/ml地塞米松、5µg/ml胰岛素、0.5mmol/lIBMX和60µmol/l吲哚美辛。