CN112251401A - 一种牙髓干细胞大规模常温消化方法 - Google Patents

一种牙髓干细胞大规模常温消化方法 Download PDF

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Abstract

一种牙髓干细胞大规模常温消化方法,通过比较几种消化方式对细胞的影响，优化消化方式，在常温条件下实现大规模消化生产，整个消化操作在生物安全柜中进行，减少细胞污染的风险，操作更加连贯；节省了耗材和培养基用量，降低成本；且无需占用培养箱和显微镜；无需离心，提高了细胞的增殖活力；提升了单次处理瓶数；缩短了细胞消化操作时间；提高了牙髓干细胞消化工艺的生产效率。

Description

一种牙髓干细胞大规模常温消化方法
技术领域
本发明涉及牙髓干细胞技术领域，具体涉及一种牙髓干细胞大规模常温消化方法。
背景技术
牙髓干细胞是一种存在于人牙髓组织中具有高度增殖能力和多向分化潜能的间充质干细胞，来源丰富、取材安全方便、不涉及伦理学问题、免疫原性低，较其他间充质干细胞更具有优势，已成功用于牙齿、骨、神经、肌肉、角膜等组织重建及再生等临床应用研究，在组织工程修复和再生医学中有广泛的应用前景。尤其在牙周组织再生方面，“人牙髓间充质干细胞注射液”已获国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）临床默示许可，有望为人类慢性牙周炎的再生治疗提供新的治疗药物和方法。
牙髓干细胞作为再生医学重要的细胞来源之一，体外培养获得大量质量稳定的干细胞是牙髓干细胞进入临床应用的前提条件。然而牙髓组织量少，需在体外进行大量扩增得到足量的细胞。牙髓干细胞呈贴壁生长，每扩增一代需进行一次消化。消化是利用消化酶通过在特定位置上降解蛋白，使细胞间结合处蛋白降解，这时细胞在自身内部细胞骨架的张力作用下成为球形，从而使细胞间分离。因而细胞消化是影响细胞生长状态好坏的关键因素之一。
目前牙髓干细胞常规的消化方法，是在生物安全柜中加入胰酶后，放入37℃培养箱进行消化，然后在倒置相差显微镜下观察细胞消化情况，再转移至生物安全柜中吹打，收集细胞悬液离心去除胰酶，加培养基用于后续培养。在消化过程中，细胞来回进出生物安全柜，人员频繁走动，增加细胞污染的风险，而且消化过程占用培养箱和显微镜，因37℃胰酶作用时间短使得单次处理瓶数有限，消化后需离心去除胰酶，造成一定的细胞损耗和离心对细胞的损伤。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明提供一种牙髓干细胞大规模常温消化方法，减少细胞污染的风险，操作更加连贯；节省了耗材和培养基用量，降低成本；且无需占用培养箱和显微镜；无需离心，提高了细胞的增殖活力；提升了单次处理瓶数；缩短了细胞消化操作时间；提高了牙髓干细胞消化工艺的生产效率。
本发明采用的技术解决方案是：一种牙髓干细胞大规模常温消化方法，包括以下步骤：
（1）从培养箱中取出具有牙髓干细胞的培养瓶喷酒精后放至生物安全柜；
（2）倒液弃培养基上清液；
（3）加入DPBS清洗培养瓶并倒液弃除；
（4）加入重组胰酶，温和摇动培养瓶使重组胰酶浸润细胞后立即弃除重组胰酶；
（5）放倒培养瓶在生物安全柜台面上，常温消化至大部分细胞开始皱缩、细胞边界明显时，轻轻拍打培养瓶细胞面；
（6）倒入培养基终止消化；
（7）水平方向前后摇晃培养瓶使细胞从培养瓶上脱落，倒液转移至储液瓶，用移液管吹打细胞悬液至单细胞，即完成消化。
所述的培养瓶内的牙髓干细胞为传代的牙髓干细胞。
所述的步骤（4）中弃除重组胰酶采用浸润后倒液弃除的方式。
所述的步骤（3）中加入DPBS的量为2-10ml。
所述步骤（4）中加入的重组胰酶的量为1-5ml。
所述步骤（5）中常温消化至大部分细胞开始皱缩、细胞边界明显的时间为60-180s。
所述步骤（6）中加入的培养基为5-10ml。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种牙髓干细胞大规模常温消化方法, 通过比较几种消化方式对细胞的影响，优化消化方式，在常温条件下实现大规模消化生产，整个消化操作在生物安全柜中进行，减少细胞污染的风险，操作更加连贯；节省了耗材和培养基用量，降低成本；且无需占用培养箱和显微镜；无需离心，提高了细胞的增殖活力；提升了单次处理瓶数；缩短了细胞消化操作时间；提高了牙髓干细胞消化工艺的生产效率。
附图说明
图1为细胞消化前后细胞状态图；其中常规消化(A)，含胰酶常温消化(B)，弃胰酶常温消化不离心(C)，弃胰酶常温消化离心(D)。
图2为不同消化方式对细胞状态的影响；其中常规消化(A)，含胰酶常温消化(B)，弃胰酶常温消化不离心(C)，弃胰酶常温消化离心(D)。
图3为不同消化方式牙髓干细胞胰酶作用时间比较；其中常规消化(A)，含胰酶常温消化(B)，弃胰酶常温消化不离心(C)，弃胰酶常温消化离心(D)。
图4为不同消化方式牙髓干细胞收获细胞量结果；其中常规消化(A)，含胰酶常温消化(B)，弃胰酶常温消化不离心(C)，弃胰酶常温消化离心(D)。
图5为不同消化方式对牙髓干细胞增殖曲线的影响；其中常规消化(A)，含胰酶常温消化(B)，弃胰酶常温消化不离心(C)，弃胰酶常温消化离心(D)。
图6为大规模消化操作步骤用时比较（s）；其中常规消化(A)，弃胰酶常温消化不离心(C)。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例，可以更好地说明本发明。
一、筛选最适的常温消化方式
1、细胞复苏培养：从细胞库中取1管P2代的牙髓干细胞，进行复苏，加入无血清培养基接种至1个T25，置于37℃，5% CO2培养箱中培养。待牙髓干细胞融合度达到90%左右时，用常规消化方式消化，P4代接种1个T75培养瓶，P5代接种12个T25培养瓶。
2、不同消化方式：
取P5代12瓶T25细胞，按表1随机分为A、B、C、D 四组，每组3瓶，消化前对细胞进行拍照。
表1 不同消化方式分组情况
分组 分组名称 消化环境 消化时是否弃胰酶 消化后是否离心去除胰酶
A 常规消化 37℃培养箱 否 是
B 含胰酶常温消化 常温 否 是
C 弃胰酶常温消化（不离心） 常温 是 否
D 弃胰酶常温消化（离心） 常温 是 是
每组具体消化方式为：
A组常规消化：弃培养基上清，加入2mlDPBS清洗细胞，加入1 ml重组胰酶浸润，放至37℃ CO2培养瓶，消化约40s，移至倒置相差显微镜下至大部分细胞开始皱缩、细胞边界明显时，拍照，记录每瓶胰酶作用时间，轻轻拍打培养瓶细胞面，加入5 ml培养基终止消化，吹打细胞成单细胞悬液，离心弃上清去除残留的重组胰酶，加入培养基重悬；
B组含胰酶常温消化：弃培养基上清，加入2mlDPBS清洗细胞，加入1 ml重组胰酶浸润，放至倒置相差显微镜下，常温消化至大部分细胞开始皱缩、细胞边界明显时，拍照，记录每瓶胰酶作用时间，轻轻拍打培养瓶细胞面，加入5 ml培养基终止消化，吹打细胞成单细胞悬液，离心弃上清去除残留的重组胰酶，加入培养基重悬；
C组弃胰酶常温消化（不离心）：弃培养基上清，加入2mlDPBS清洗细胞，加入1 ml重组胰酶浸润后立即弃除重组胰酶，放至倒置相差显微镜下，常温消化至大部分细胞开始皱缩、细胞边界明显时，拍照，记录每瓶胰酶作用时间，轻轻拍打培养瓶细胞面，加入5 ml培养基终止消化，吹打细胞成单细胞悬液；
D组弃胰酶常温消化（离心）：弃培养基上清，加入2mlDPBS清洗细胞，加入1 ml重组胰酶浸润后立即弃除重组胰酶，放至倒置相差显微镜下，常温消化至大部分细胞开始皱缩、细胞边界明显时，拍照，记录每瓶胰酶作用时间，轻轻拍打培养瓶细胞面，加入5 ml培养基终止消化，吹打细胞成单细胞悬液，离心弃上清去除残留的重组胰酶，加入培养基重悬。
用血球计数板检测消化后每瓶细胞的密度，计算每瓶的细胞总数。每组取适量细胞，P6代接种1个T25培养瓶，P7代接种1个T75培养瓶，P8代接种2个T150培养瓶和1个T75培养瓶，置于37℃，5% CO2培养箱中培养。待牙髓干细胞融合度达到90%左右时，分别用上述4种消化方式进行消化，观察拍照连续传3代后的细胞状态并检测细胞表面标志物，筛选出最适的常温消化方法。
3、生长曲线检测（CCK-8法）
P5代时取适量细胞铺96孔板，平行4孔，放入37 ℃，5% CO2培养箱中进行培养，每3 d更换一次培养基。分别于铺板后1d、2d、3d、4d、5d，每孔加入10 μlCCK-8试剂，继续培养1 h，在酶标仪上检测450 nm处的OD值，根据检测结果绘制OD值与时间的生长曲线，比较各组细胞增殖能力的差异。
4、表面标志物检测
P8代时各组取适量细胞，分别加入CD105，CD73，CD90，CD45，CD34，CD14，CD19，HLA-DR流式抗体，4℃避光孵育30min，流式细胞仪检测。
根据以上实验结果，C组消化方式为最佳的常温消化方式。并在大规模常温消化实验中采用此常温消化方式进行实验。
二、大规模常温细胞消化
以常规消化方式为对照，准备14个 T150模拟大规模消化，采用实验一中最适的常温消化方式进行大规模消化。
A常规消化方式为：从培养箱中取出培养瓶喷酒精后放至生物安全柜(1)→用移液管吸弃上清(2)→用移液管吸取10 mlDPBS加入培养瓶清洗并吸液弃除(3)→用移液管吸取6 ml 重组胰酶加入培养瓶(4)→直立培养瓶移至CO2培养箱前，打开培养箱门，温和摇动培养瓶使重组胰酶浸润细胞，放至培养箱中，关门，开始计时，消化约40 s (5)→打开培养箱，取出培养瓶，在倒置相差显微镜下观察细胞消化状态，拍打细胞面 (6)→培养瓶喷酒精放入生物安全柜，用移液管吸取培养基加入6 ml培养瓶终止消化(7)→吹打每个培养瓶中的细胞悬液成单细胞，用移液管转移至储液瓶(8)；
C常温消化方式为：从培养箱中取出培养瓶喷酒精后放至生物安全柜(1)→倒液弃上清(2)→倒入约10 mlDPBS清洗培养瓶并倒液弃除(3)→用移液管吸取5 ml 重组胰酶加入培养瓶(4)→温和摇动培养瓶使重组胰酶浸润细胞，用移液管吸弃重组胰酶，放倒培养瓶在生物安全柜台面上，开始计时，消化约90 s (5)→拍打培养瓶细胞面 (6)→倒入约10 ml培养基终止消化(7)→水平方向前后摇晃培养瓶，倒液转移至储液瓶，用移液管吹打细胞悬液至单细胞 (8)。
主要比较两种消化方式在大规模培养时的可操作性以及操作时间方面。分别取1瓶、3瓶T150准备常规消化，取1瓶、3瓶、6瓶T150准备常温消化。由于常规消化需要将培养瓶置于培养箱中消化，6瓶同时消化无法实验，最多只能同时消化3瓶细胞，因此，6瓶常规消化所需时间为3瓶时间的2倍。记录消化各个步骤的用时，比较两种消化方式的用时差异。
两种消化方式操作过程对比：
操作步骤 常规消化 大规模常温消化 大规模常温消化优势
弃液 用移液管吸弃 倒液弃去 节省操作时间和耗材
加液 用移液管吸取 倒液加入 节省操作时间和耗材
重组胰酶用量 每个T150培养瓶需6 ml 每个T150培养瓶需5ml（能浸没细胞表面即可，可更少） 节省重组胰酶用量
消化过程 直立培养瓶移至CO<sub>2</sub>培养箱前，打开培养箱门，温和摇动培养瓶使重组胰酶浸润细胞，水平放至培养箱中，关门，开始计时，消化约40 s 。打开培养箱，取出培养瓶，在倒置相差显微镜下观察细胞至消化充分。 温和摇动培养瓶使重组胰酶浸润细胞，用移液管吸弃重组胰酶，放倒培养瓶在生物安全柜台面上，开始计时，消化约90 s 在生物安全柜中连贯操作，缩短操作时间，减少人员走动，减少细胞风险的风险，无需占用CO<sub>2</sub>培养箱和显微镜，减少因消化频繁打开培养箱对正在箱中培养的细胞造成的影响。
细胞吹打 每个培养瓶将细胞悬液一一吹打成单细胞，再转移至储液瓶。 水平方向前后摇晃培养瓶，倒液转移至储液瓶后，统一吹打细胞悬液至单细胞 节省操作时间
相关实验结果：
图1细胞消化前后细胞状态
常规消化(A)，含胰酶常温消化(B)，弃胰酶常温消化不离心(C)，弃胰酶常温消化离心(D)实验结果可知，A组与B组比较，常温下重组胰酶的消化能力仍较好；B、C、D三组相比，常温下含胰酶消化和浸润细胞后弃除胰酶后消化能力无明显差异。
图2不同消化方式对细胞状态的影响。观察四组细胞在P6、P7、P8时细胞形态变化。牙髓干细胞培养后，贴壁细胞呈短梭形，涡旋状排列。四组细胞的生长状态无明显差异。
图3不同消化方式牙髓干细胞胰酶作用时间比较。胰酶作用时间表示从胰酶开始浸润→大部分细胞皱缩成圆形的时间。结果表示，P5四组胰酶作用时间无统计学差异。
图4不同消化方式牙髓干细胞收获细胞量结果，四组收获的细胞量无统计学差异。
图5不同消化方式对牙髓干细胞增殖曲线的影响。其中B、C、D三组分别与A组比较是否有统计学差异。实验结果显示，C组牙髓干细胞的增殖活性显著高于其他实验组。
表2 不同消化方式连续传3代后细胞表面标志物鉴定结果。实验结果表示，四种消化细胞方式处理后的细胞，均符合间充质干细胞表面标记物的鉴定标准。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
表3大规模消化操作步骤用时记录（s）。实验结果表明，常温消化（C）与常规消化（A）相比，不仅缩短操作时间，节省移液管耗材，并且在操作过程中减少操作人员走动并无需占用培养箱和显微镜等仪器。培养瓶也不需要拿出生物安全柜，并减少了细胞污染的风险，使操作更加连贯一气呵成。
Figure DEST_PATH_IMAGE004
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种牙髓干细胞大规模常温消化方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）从培养箱中取出具有牙髓干细胞的培养瓶喷酒精后放至生物安全柜；
（2）倒液弃培养基上清液；
（3）加入DPBS清洗培养瓶并倒液弃除；
（4）加入重组胰酶，温和摇动培养瓶使重组胰酶浸润细胞后立即弃除重组胰酶；
（5）放倒培养瓶在生物安全柜台面上，常温消化至大部分细胞开始皱缩、细胞边界明显时，轻轻拍打培养瓶细胞面；
（6）倒入培养基终止消化；
（7）水平方向前后摇晃培养瓶使细胞从培养瓶上脱落，倒液转移至储液瓶，用移液管吹打细胞悬液至单细胞，即完成消化。
2.根据权利要求1所述的一种牙髓干细胞大规模常温消化方法，其特征在于，所述的培养瓶内的牙髓干细胞为传代的牙髓干细胞。
3.根据权利要求1所述的一种牙髓干细胞大规模常温消化方法，其特征在于，所述的步骤（4）中弃除重组胰酶采用浸润后倒液弃除的方式。
4.根据权利要求1所述的一种牙髓干细胞大规模常温消化方法，其特征在于，所述的步骤（3）中加入DPBS的量为2-10ml。
5.根据权利要求1所述的一种牙髓干细胞大规模常温消化方法，其特征在于，所述步骤（4）中加入的重组胰酶的量为1-5ml。
6.根据权利要求1所述的一种牙髓干细胞大规模常温消化方法，其特征在于，所述步骤（5）中常温消化至大部分细胞开始皱缩、细胞边界明显的时间为60-180s。
7.根据权利要求1所述的一种牙髓干细胞大规模常温消化方法，其特征在于，所述步骤（6）中加入的培养基为5-10ml。
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