CN104357387B - 一种从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞工程技术领域，具体为一种从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞的方法。本发明通过在生理盐水中加入少量的低分子肝素钙，以此作为清洗液清洗人脂肪组织，可很好的去除人脂肪组织中残留的红细胞等杂质，从而可分离出纯度更高的人脂肪干细胞，杂细胞含量显著减少，有利于人脂肪干细胞的分化诱导，并且可减少Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶及无血清培养基的消耗量，降低工艺成本。此外，以150r/min的速度离心消化人脂肪组织1h，可得到活性明显较好的人脂肪干细胞。
Description
技术领域
本发明涉及细胞工程技术领域，尤其涉及一种从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞的方法。
背景技术
2001年，细胞生物学家通过脂肪抽吸术，在吸出的人体脂肪悬液中第一次分离得到了多向分化的干细胞，并发现它能分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、血管内皮、肝、胰、神经等细胞；这种从人脂肪组织中发现的具有分化潜能的成体干细胞，被称为人脂肪干细胞(Human Adipose Derived Mesnchymal Stem Cells，hADSCs)。相比于其它干细胞，hADSCs具有以下五方面的显著优势：(一)来源丰富，取材容易。(二)易于扩增，不易衰老。实验证明，传代后的hADSCs成纤维细胞样生长，多次传代后细胞生长速度也无减慢趋势，即可以继续保持结构和功能上的稳定性。(三)具有旁分泌功能，可分泌促进血管生成的相关因子，促进血管再生。同时，hADSCs也可通过旁分泌作用于成纤维细胞，促进皮肤表皮细胞的成熟，以利于创面愈合和疤痕缩小。这些特性预期在美容方面具有十分可观的应用前景。(四)具有较低的免疫原性，在进行自体或者异体移植时，不会引起强烈的免疫反应和后期的排斥反应。(五)经过多年的研究，科学家们发现hADSCs经血液系统进入人体以后，具有很好的调理全身的作用，可以显著地提高机体的灵活性及耐受性、调节机体的内分泌水平并改善神经系统对机体的支配功能，从而起到增强机体活力、改变精神面貌、延缓衰老和保持机体年轻状态的功效。也就是说，hADSCs可以有效地推动抗衰老治疗技术的发展，同时在组织工程、器官修复、基因治疗等多个医学领域也有着广阔的应用前景。
通常，人脂肪干细胞的分离和培养工艺流程如图1所示，经历了人体脂肪组织、细胞悬液、原代细胞、P1代细胞、P2代细胞以及可应用的人脂肪干细胞样品等六个阶段，涉及人脂肪干细胞的分离技术、收获技术、传代技术、冻存技术、复苏技术等关键工艺技术。其中，人脂肪干细胞的分离技术是整个人脂肪干细胞应用工艺的基础和关键步骤，很大程度地决定了最终所得人脂肪干细胞产品的收率、纯度和活性。特别地，如果经分离得到的人脂肪干细胞的纯度较低、含有组织微块等杂质，将不利于其进行分化诱导，从而严重地降低其抗衰老功效。
因此，人脂肪干细胞的分离技术一直都是本领域的研究热点。目前，从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞的基本方法是：首先，对所获得的人脂肪组织样品进行洗涤，除去血细胞；然后，进行脂肪破碎、消化，去掉其它杂细胞；接着，除去未消化的组织，获得含脂肪干细胞的滤液；最后，离心得到脂肪干细胞群，可用于后续的培养、传代以及冻存等。该基本方法所面临的技术难题包括：方法步骤复杂、制备过程难以进行质量控制、提取的干细胞数量少、样品纯度不高以及继代增殖缓慢等。多年以来，研究人员一直对现有技术进行改进和优化，以求开发出一种更加经济有效的人脂肪干细胞分离技术，从而为人脂肪干细胞的研究提供充足的高质量样品。其中，中国专利CN201210018269.3公开了一种脂肪干细胞的获取方法，该方法采用混合胶原酶(即I型胶原酶、II型胶原酶与IV型胶原酶的混合物)对脂肪组织进行消化，从而克服了传统的细胞分离方法中存在的胶原酶消化细胞不够彻底、所得细胞纯度不够高的问题。中国专利CN201210181162.0公开了一种人体脂肪干细胞快速提取方法，该方法使用了专用的人脂肪组织消化剂，其成分包含胶原酶IV型、胰蛋白酶-EDT复合体、抗胰蛋白酶和二甲基亚砜，从而可以使脂肪间充质干细胞充分游离出来同时保护细胞不受伤害，最终获得充分游离且存活率高的人脂肪干细胞。中国专利CN201110154507.9公开了一种脂肪干细胞的分离方法，该方法主要包括四个步骤：(1)用洗涤液行洗涤；(2)用胶原酶进行消化；(3)进行过滤，获得含脂肪干细胞的滤液；(4)进行离心，所得沉淀即为脂肪干细胞群。上述前两种方法，因应用了混合胶原酶或者专门的消化剂，将不可避免地增加了人脂肪干细胞分离工艺的技术难度和经济成本。而第三种方法，其洗涤脂肪组织的步骤过于简单，样品中的血细胞等杂质难以完全清除干净，不利于人脂肪干细胞的分化诱导，影响人脂肪干细胞产品的收率、纯度和活性。
发明内容
本发明针对现有的人脂肪干细胞分离技术存在分离不干净、纯度低从而影响人脂肪干细胞的分化诱导，导致人脂肪干细胞产品的收率、纯度和活性低的问题，通过优化清洗人脂肪组织步骤和胶原酶硝化步骤而提供一种从人脂肪组织中有效分离人脂肪干细胞方法，使传代细胞生长状态好，人脂肪干细胞得率高，工艺成本低。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案，一种从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞的方法，包括清洗人脂肪组织步骤、胶原酶消化步骤和收集人脂肪干细胞步骤；所述清洗人脂肪组织步骤为：用清洗液反复冲洗人脂肪组织两遍以上，以除去人脂肪组织中的血液；所述清洗液为含低分子肝素钙的生理盐水，所述清洗液中低分子肝素钙的质量百分比为0.4-0.6％。
优选的，所述清洗液中低分子肝素钙的质量百分比为0.5％。
所述胶原酶消化步骤为：将清洗后的人脂肪组织和Ⅰ型胶原酶溶液置于离心管中，然后将离心管置于36.5-37.5℃下，以100-150r/min的离心速率消化0.5-1h。
优选的，将清洗后的人脂肪组织和Ⅰ型胶原酶溶液置于离心管中，然后将离心管置于37℃下，以150r/min的离心速率消化1h。
所述胶原酶消化步骤中，Ⅰ型胶原酶溶液中Ⅰ型胶原酶的浓度为1.5g％(m/v)；离心管内人脂肪组织与Ⅰ型胶原酶溶液的体积比为1:1。
所述收集人脂肪干细胞步骤为：取离心管底层含单个核细胞的液体并经网孔孔径为100μm的滤网过滤，得过滤液；然后向过滤液中加入生理盐水并离心分离，除去上层清液后得人脂肪干细胞。
所述收集人脂肪干细胞步骤中，以1500r/min的速率离心10min。
以上所述的从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞的方法，在收集人脂肪干细胞步骤后，还包括依次进行的细胞原代培养步骤和细胞传代培养步骤，获得传代培养后的人脂肪干细胞。
所述的细胞原代培养步骤为：将人脂肪干细胞接种于培养瓶中并加入无血清培养基，然后将培养瓶置于37℃，CO2含量为5％的培养箱中培养；培养24h后进行第一次全量换液，再培养48h后进行第二次全量换液，再培养5天后进行第三次全量换液，继续培养至细胞生长融合度为88-92％；然后向培养瓶中加入质量百分浓度为0.25％的胰蛋白酶-EDTA进行消化，终止消化后离心收集原代人脂肪干细胞。
所述的细胞传代培养步骤为：将原代人脂肪干细胞接种到培养瓶中并加入无血清培养基，然后将培养瓶置于37℃，CO2含量为5％的培养箱中培养至细胞融合度为88-92％；然后向培养瓶中加入质量百分浓度为0.25％的胰蛋白酶-EDTA进行消化，终止消化后离心收集P1代人脂肪干细胞。重复上述步骤进行P2代人脂肪干细胞培养，获得P2代人脂肪干细胞。
冻存P2代人脂肪干细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过在生理盐水中加入少量的低分子肝素钙，以此作为清洗液清洗人脂肪组织，可很好的去除人脂肪组织中残留的红细胞等杂质，从而可分离出纯度更高的人脂肪干细胞，杂细胞含量显著减少，有利于人脂肪干细胞的分化诱导，并且可减少Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶及无血清培养基的消耗量，降低工艺成本。此外，以150r/min的速度离心消化人脂肪组织1h，可得到活性明显较好的人脂肪干细胞。
附图说明
图1为人脂肪干细胞的分离和培养工艺流程；
图2为实施例7中P0代人脂肪干细胞(培养4天)的显微镜观察结果；
图3为实施例7中P1代人脂肪干细胞(培养3天)的显微镜观察结果；
图4为实施例7中P2代人脂肪干细胞(消化收获前)的显微镜观察结果；
图5为实施例7中P2代人脂肪干细胞的流式细胞分析仪的检测结果(CD29)；
图6为实施例7中P2代人脂肪干细胞的流式细胞分析仪的检测结果(CD73)；
图7为实施例7中P2代人脂肪干细胞的流式细胞分析仪的检测结果(CD49d)；
图8为实施例7中P2代人脂肪干细胞的流式细胞分析仪的检测结果(CD90)；
图9为实施例7中P2代人脂肪干细胞的流式细胞分析仪的检测结果(CD14)；
图10为实施例7中P2代人脂肪干细胞的流式细胞分析仪的检测结果(CD45)；
图11为实施例7中P2代人脂肪干细胞的流式细胞分析仪的检测结果(CD34)；
图12为实施例7中P2代人脂肪干细胞的流式细胞分析仪的检测结果(Act in)；
图13为实施例7中P2代人脂肪干细胞的流式细胞分析仪的检测结果(HLA-DR)。
具体实施方式
为了更充分理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。
以下实施例中使用的I型胶原酶来自美国GIBCO公司，使用时在100mL的无血清培养基中加入1.5g的I型胶原酶，配制成Ⅰ型胶原酶浓度为1.5g％(m/v)的I型胶原酶溶液。
实施例1
本实施例提供一种从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞的方法，并且对分离得到的人脂肪干细胞进行培养。具体如下：
(1)从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞
清洗：取15mL人脂肪组织，用生理盐水反复冲洗人脂肪组织三遍，以除去人脂肪组中的血液。
胶原酶消化：将清洗后的人脂肪组织放入50mL的离心管中，然后向离心管中加入等体积量的Ⅰ型胶原酶溶液，混匀。放入恒温振荡器中，在37℃下，以150r/min的离心速率消化1h。离心管内的液体分为三层，上层为黄色油状脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含单个核细胞的液体。
收集：吸出离心管中的下层液体，下层液体用网孔孔径为100μm的滤网过滤，得过滤液。向过滤液中加入生理盐水(30mL)，以1500r/min的速率离心10min，除去上层清液后，得到人脂肪干细胞。
(2)细胞原代培养(P0代)
接种：向装有上述人脂肪干细胞的离心管中加入5mL的无血清培养基，用移液管轻轻吹打离心管内的无血清培养基10-20次，制成细胞悬液；然后将细胞接种至75cm2的培养瓶中，再向培养瓶中加入10mL无血清培养基，轻摇培养瓶以混匀瓶内液体。将培养瓶放入37℃，CO2含量为5％的培养箱中进行培养。
第一次全量换液：细胞原代培养24小时后，将培养瓶从培养箱中取出，进行全量换液。即将旧的无血清培养基吸出，加入12mL新的无血清培养基，然后将培养瓶放回培养箱中继续进行培养。
第二次全量换液：继续培养第48小时后，将培养瓶从培养箱中取出，进行全量换液。即将旧无血清培养基吸出，加入12mL新的无血清培养基，然后将培养瓶放回培养箱中继续进行培养。
第三次全量换液：继续培养第5天后，将培养瓶从培养箱中取出，无血清培养基的颜色改变，呈浅黄色，进行全量换液。即将旧的无血清培养基吸出，加入12mL新的无血清培养基，然后将培养瓶放回培养箱中继续进行培养。培养至细胞生长融合度达到88-92％。
消化收获：轻轻晃动培养瓶，将旧的无血清培养基转移至50mL离心管中，用4-5mL氯化钠注射液轻轻冲洗培养瓶1-2遍，洗涤后的氯化钠注射液弃去。按照每75cm2加入2mL浓度为0.25％的胰蛋白酶-EDTA的比例向培养瓶中加入浓度为0.25％的胰蛋白酶-EDTA(胰蛋白酶使用前放置在20-25℃下)，轻轻摇动培养瓶，使胰蛋白酶-EDTA流遍所有细胞表面，消化时间为2-2.5min(同时用倒置显微镜观察，观察到大部分细胞的形状由梭形变为圆形并脱落时完成消化)。然后向离心管中加入旧的无血清培养基以终止消化。用移液管反复吹打培养瓶的瓶底至大部分细胞从瓶壁脱落，然后将无血清培养基转移到50mL的离心管中，并向原培养瓶中加入4-5mL氯化钠注射液冲洗瓶壁，洗涤液并入离心管中。用移液管吹打悬浮细胞后，用网孔孔径为100μm的无菌滤网过滤，将过滤液收集到50mL的离心管中，离心洗涤(离心力设为210g，离心时间设为10min)。弃去离心管内的上层清液，然后再加入适量的氯化钠注射液，用移液管轻轻吹打重悬浮细胞，然后用氯化钠注射液定容至30mL，再用移液管吹打混匀并进行二次离心(离心力设为210g，离心时间设为10min)。上层清液送检，检测上层清液是否有菌；下层为细胞沉淀。
(3)传代培养
在上述装有细胞沉淀(P0代人脂肪干细胞)的离心管中加入适量的无血清培养基(10mL)，用移液管轻轻吹打重悬浮细胞，然后用无血清培养基定容至30mL并接种到新的培养瓶中，细胞密度为5000-6000/cm2。将培养瓶放入37℃，CO2含量为5％的培养箱中进行培养。培养至细胞生长融合度达到88-92％。
如上述步骤(2)中的消化收获操作，收获P1代人脂肪干细胞。
在上述装有细胞沉淀(P1代人脂肪干细胞)的离心管中加入适量的无血清培养基(10mL)，用移液管轻轻吹打重悬浮细胞，然后用无血清培养基定容至30mL并接种到新的培养瓶中，细胞密度为5000-6000/cm2。将培养瓶放入37℃，CO2含量为5％的培养箱中进行培养。培养至细胞生长融合度达到88-92％。
再如上述步骤(2)中的消化收获操作，收获P2代人脂肪干细胞，并且在进行二次离心(210g，10min)前，对已经过第一次离心并定容至30mL的细胞溶液进行过滤处理，用100μm的细胞过滤器将细胞和溶液滤至另一支50mL的离心管中，再用移液管轻轻吹打离心管内的液体。至此，得到传代后的人脂肪干细胞。
在上述的培养过程中，对P0、P1、P2代的人脂肪干细胞进行连续性的观察。
P0代人脂肪干细胞培养48h后，在倒置显微镜下观察，可见有少量的细胞开始贴壁生长，无血清培养基中悬浮有杂细胞。经过一系列的换液、消化传代后，P1代的无血清培养基中悬浮的杂细胞数量明显减少；传代至P2代，人脂肪干细胞呈梭形，细胞生长状态十分好，杂细胞基本不存在。
实施例2
本实施例提供一种从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞的方法，并且对分离得到的人脂肪干细胞进行培养。具体操作与实施例1的基本相同，不同之处在于：将步骤(1)中的胶原酶消化时的离心速率(150r/min)改为100r/min。其它的操作及参数与实施例1的完全一致。
在上述的培养过程中，对P0、P1、P2代的人脂肪干细胞进行连续性的观察。
P0代人脂肪干细胞培养48h后，在倒置显微镜下观察，无细胞贴壁生长，72h后方有极少量的细胞贴壁生长，同时无血清培养基中悬浮有大量的杂细胞。经过一系列的换液、消化传代后，P1代的无血清培养基中悬浮的杂细胞数量有所减少；传代至P2代，杂细胞进一步减少，细胞生长状态较好。
实施例3
本实施例提供一种从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞的方法，并且对分离得到的人脂肪干细胞进行培养。具体操作与实施例1的基本相同，不同之处在于：将步骤(1)中的胶原酶消化时的离心消化时间(1h)改为0.5h。其它的操作及参数与实施例1的完全一致。
在上述的培养过程中，对P0、P1、P2代的人脂肪干细胞进行连续性的观察。
P0代人脂肪干细胞培养48h后，在倒置显微镜下观察，无细胞贴壁生长，96h后方有极少量的细胞贴壁生长，同时无血清培养基中悬浮有大量的杂细胞。经过一系列的换液、消化传代后，P1代的无血清培养基中悬浮的杂细胞数量有所减少；传代至P2代，杂细胞进一步减少，细胞生长状态较好。
实施例4
本实施例提供一种从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞的方法，并且对分离得到的人脂肪干细胞进行培养。具体操作与实施例1的基本相同，不同之处在于：将步骤(1)中的胶原酶消化时的离心速率(150r/min)改为100r/min，离心消化时间(1h)改为0.5h。其它的操作及参数与实施例1的完全一致。
在上述的培养过程中，对P0、P1、P2代的人脂肪干细胞进行连续性的观察。
P0代人脂肪干细胞培养48h后，在倒置显微镜下观察，无细胞贴壁生长，144h后方有极少量的细胞贴壁生长，同时无血清培养基中悬浮有大量的杂细胞。经过一系列的换液、消化传代后，P1代的无血清培养基中悬浮的杂细胞数量有所减少，细胞生长状况一般；传代至P2代，杂细胞进一步减少，细胞生长状态一般。
根据以上实施例1-4的实验结果可知，步骤(1)中的胶原酶消化时的离心速率和离心消化时间对最终所得的人脂肪干细胞的纯度与活性有重要的影响，而最佳的离心速率是150r/min，离心消化时间是1h。
实施例5
本实施例提供一种从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞的方法，并且对分离得到的人脂肪干细胞进行培养。具体操作与实施例1的基本相同，不同之处在于：1、步骤(1)中清洗的人脂肪组织样品不同，本实施例所清洗的人脂肪组织样品带有较多的血液成分(肉眼可直接观察到血液)；2、用于清洗人脂肪组织的清洗液为含低分子肝素钙的生理盐水，并且清洗液中低分子肝素钙的质量百分比为0.5％。
其它操作及参数与实施例1的完全一致。
在上述的培养过程中，对P0、P1、P2代的人脂肪干细胞进行连续性的观察。
P0代人脂肪干细胞培养48h后，在倒置显微镜下观察，可见有少量的细胞开始贴壁生长，无血清培养基中悬浮的杂细胞量极少。经过一系列的换液、消化传代后，传代至P2代，人脂肪干细胞呈梭形，细胞生长状态十分好，杂细胞基本不存在。本实施例的细胞培养情况与实施例1的细胞培养情况基本一致。
在其它实施方案中，用于清洗人脂肪组织的清洗液还可以是含有0.4-0.6％(质量百分比)低分子肝素钙的生理盐水。
实施例6
本实施例提供一种从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞的方法，并且对分离得到的人脂肪干细胞进行培养。具体操作与实施例5的基本相同，不同之处在于：步骤(1)中用于清洗的人脂肪组织样品的清洗液不同，本实施例所用的清洗液为生理盐水，即清洗液中不含低分子肝素钙。
其它操作及参数与实施例1的完全一致。
在上述的培养过程中，对P0、P1、P2代的人脂肪干细胞进行连续性的观察。
P0代人脂肪干细胞培养48h后，在倒置显微镜下观察，无血清培养基中悬浮有较多的杂细胞。经过一系列的换液、消化传代后，传代至P2代，细胞生长状态一般。
根据以上实施例5-6的实验结果可知，对于含有较多的血液成分的人脂肪组织样品，使用含有少量低分子肝素钙的生理盐水进行清洗，可显著地提高清洗效果，有利于后续的细胞培养传代，保证最终所得的人脂肪干细胞具有良好的纯度与活性。
实施例7
本实施例提供一种从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞的方法，并且对分离得到的人脂肪干细胞进行培养和冻存。具体如下：
(1)从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞
该步骤的处理方法与实施例1的分离方法完全相同。
(2)细胞原代培养(P0代)
将分离得到的人脂肪干细胞接种到培养瓶中，以及培养过程中的第一次全量换液、第二次全量换液和第三次全量换液的操作与实施例1的完全相同。P0代人脂肪干细胞培养四天后，用显微镜观察的结果如图2所示，所得P0代人脂肪干细胞贴壁生长，呈长条形或纺锤形，符合人脂肪干细胞的外形特征。
经第三次全量换液并培养5天后，进行半量换液。即，吸出一半旧的无血清培养基，再向培养瓶中补充等量的新的无血清培养基，然后将培养瓶放回培养箱中继续进行培养。培养至细胞生长融合度达到88-92％。
然后，如实施例1的消化收获步骤所述方法进行消化，收获得到P0代人脂肪干细胞。
(3)传代培养(P1代、P2代)
该步骤的处理方法与实施例1的传代培养方法完全相同。得到传代后的人脂肪干细胞。其中，P1代人脂肪干细胞培养72h后，用倒置显微镜观察的结果如图3所示，细胞的生长融合度达到90％；消化收获P2代人脂肪干细胞前，用倒置显微镜观察的结果如图4所示，细胞的生长融合度达到90％。
并且取经100μm的细胞过滤器过滤后的P2代人脂肪干细胞，用流式细胞分析仪检测，检测结果如下表1和图5-13所示。
(4)用细胞计数仪测量P2代人脂肪干细胞的数量，并根据P2代人脂肪干细胞的数量加入适量的无血清培养基，使P2代人脂肪干细胞的密度为冻存密度的2倍。然后再加入与无血清培养基等体积的细胞冻存液，用移液管轻轻吹打液体使液体混合均匀，使细胞密度与指定要求一致。将细胞悬液分装于冻存管内，每管1mL，在冻存管上做好标记，粘贴细胞标签等信息。
将需冻存的P2代人脂肪干细胞置于装有异丙醇的程序降温盒中(每次使用前应注意异丙醇的量以及异丙醇的使用次数，按规定及时添加与更换异丙醇)，并将降温盒置于-80℃的冰箱内过夜，次日移入液氮罐中。
表1 P2代人脂肪干细胞的流式细胞分析仪检测结果
表1中，CD29、CD73、CD49d、CD90均为人脂肪干细胞的阳性指标，CD14、CD45、CD34、Actin、HLA-DR均为阴性指标。
以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。
Claims (5)
1.一种从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞的方法，包括清洗人脂肪组织步骤、胶原酶消化步骤和收集人脂肪干细胞步骤，其特征在于，所述清洗人脂肪组织步骤为：用清洗液反复冲洗人脂肪组织两遍以上，以除去人脂肪组织中的血液；所述清洗液为含低分子肝素钙的生理盐水，所述清洗液中低分子肝素钙的质量百分比为0.5％；所述胶原酶消化步骤为：将清洗后的人脂肪组织和Ⅰ型胶原酶溶液置于离心管中，然后将离心管置于37℃下，以150r/min的离心速率消化1h；所述Ⅰ型胶原酶溶液中Ⅰ型胶原酶的浓度为1.5％(m/v)，所述胶原酶消化步骤中，离心管内人脂肪组织与Ⅰ型胶原酶溶液的体积比为1:1。
2.根据权利要求1所述一种从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞的方法，其特征在于，所述收集人脂肪干细胞步骤为：取离心管底层含单个核细胞的液体并经孔径为100μm的滤网过滤，得过滤液；然后向过滤液中加入生理盐水并离心分离，除去上层清液后得人脂肪干细胞。
3.根据权利要求1所述一种从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞的方法，其特征在于，所述收集人脂肪干细胞步骤中，以1500r/min的速率离心10min。
4.根据权利要求1-3任一项所述一种从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞的方法，其特征在于，收集人脂肪干细胞步骤后，还包括细胞原代培养步骤。
5.根据权利要求4所述一种从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞的方法，其特征在于，细胞原代培养步骤后，还包括细胞传代培养步骤，获得传代培养后的人脂肪干细胞。
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