CN102719396A

CN102719396A - 人体脂肪干细胞快速提取方法及其专用人脂肪组织消化剂

Info

Publication number: CN102719396A
Application number: CN2012101811620A
Authority: CN
Inventors: 焦阳
Original assignee: JIANGSU RE-STEM BIOTECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: JIANGSU RE-STEM BIOTECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2012-06-04
Filing date: 2012-06-04
Publication date: 2012-10-10
Anticipated expiration: 2032-06-04
Also published as: CN102719396B

Abstract

本申请公开了一种人体脂肪干细胞快速提取方法及其专用人脂肪组织消化剂，该方法包括人脂肪组织处理、液状的脂肪离心、人体脂肪干细胞提取，该方法中用到的专用人脂肪组织消化剂包含胶原酶IV型、胰蛋白酶-EDTA复合体、抗胰蛋白酶和二甲基亚砜。本发明具有使脂肪间充质干细胞充分游离出来，同时保护细胞不受伤害的效果。

Description

人体脂肪干细胞快速提取方法及其专用人脂肪组织消化剂

技术领域

本发明涉及细胞工程领域，特别涉及一种人体脂肪干细胞快速提取方法及其专用人脂肪组织消化剂。

背景技术

脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）是目前广泛应用于组织工程及再生医学领域的一种成体干细胞，与骨髓间充质干细胞一样具有多向分化潜能。ADSCs呈成纤维细胞样生长，胞浆和核仁丰富，呈平行或漩涡样排列。细胞周期分析显示G0/G1期的细胞占69%，S期占24%，G2/M期占8%。在胎牛血清的存在条件下传代培养2-3天细胞增殖1倍。多次传代(10-20代)后,细胞增殖速度无明显减慢，在传代6次后细胞群体中出现衰老细胞，第15代细胞群体中衰老细胞约占15%。ADSCs具有与骨髓间充质干细胞基本相同的细胞免疫表型，经流式细胞仪分析CD9,CD10,CD13,CD29,CD44,CD49d,CD49e,CD54,CD55,CD59,CD90,CD105,CD117,CD146,CD166,STRO-1均为阳性,而CD31,CD34,CD45均为阴性。最大的区别是ADSCs表达CD49d,不表达CD106;而正好相反,BMSCs表达CD106,不表达CD49d。

目前常用的ADSCs分离培养方法是从脂肪组织分离获取细胞，经机械和酶处理方法除去红细胞等成熟细胞后，利用饲养层细胞与含10%胎牛血清的培养基进行培养。这种培养干细胞方法的缺点是方法复杂，提取的干细胞数量少，纯度不高，继代增殖缓慢。

发明内容

本发明的一种人体脂肪干细胞快速提取方法，包括如下步骤：

人脂肪组织处理：将人脂肪组织块加入离心管中再加入等量生理盐水而后使用组织匀浆器处理成液状加入离心管中；

液状脂肪离心：将盛有液状脂肪的离心管置于离心机中2400rpm/min离心5min，使液状脂肪分为上层橙黄色透明的油层、中间层黄色脂肪层、底层沉积层；

脂肪层人脂肪干细胞提取：移取中间层脂肪至离心管中，加入等量的人脂肪组织消化剂混匀，置于恒温振荡器中，37℃、200rpm振荡30min，而后使用离心机2400rpm/min离心10min，倒掉浮游脂肪，吸除液体，加入Dulbecco’s磷酸盐缓冲液混匀，转移至另一离心管中离心后弃去上清液，加Dulbecco's磷酸盐缓冲液混匀，2400rpm/min离心3min，洗涤2次后吸除上层液体，下层沉积细胞即为人脂肪干细胞；

沉积层人脂肪干细胞提取：在留有沉积层细胞的离心管中加入等量的人脂肪组织消化剂混匀，置于恒温振荡器中，37℃、200rpm振荡5min，2400rpm/min离心10min,吸除上层液体，加入Dulbecco’s磷酸盐缓冲液,混匀，转移至另一离心管中，再离心机2400rpm/min离心5min，吸除上层液体下层沉积细胞即为人脂肪干细胞。

人体脂肪干细胞提取中所使用的人脂肪组织消化剂，包含胶原酶IV型0.15~2.5mg/mL、胰蛋白酶-EDTA复合体0.5~5mg/mL、α1抗胰蛋白酶0.1~1.5mg/mL和二甲基亚砜5~100μl/mL，胶原酶IV型的最优浓度为0.75mg/mL，胰蛋白酶-EDTA复合体最优浓度为2.5mg/mL，α1抗胰蛋白酶最优浓度为0.5mg/mL，二甲基亚砜最优浓度为30μl/mL，使用Dulbecco’s磷酸盐缓冲液作为溶剂。

上述人脂肪组织消化剂中各成分作用如下：

胶原酶IV型作用的是消化连接脂肪细胞间的胶原组织，加速脂肪细胞解离出来，而且不对细胞产生破坏；

胰蛋白酶-EDTA复合体作用是消化脂肪细胞间基质蛋白组织，解离细胞间的连接，加速脂肪细胞从组织中游离出来，但过量胰酶复合体可以消化破坏脂肪干细胞本身需要优选；

α1抗胰蛋白酶作用是终止多余的胰蛋白酶作用，保护细胞本身不受到消化的损伤；

二甲基亚砜属于非质子极性溶剂，常用于细胞冷冻培养基内，可以保护细胞免受冰晶引起的机械性损伤，高浓度DMSO的细胞毒性是诱导细胞凋亡和影响细胞生长活力。

使用本发明提供的快速分离提取人脂肪干细胞方法及其使用的脂肪消化剂，可以使脂肪间充质干细胞充分游离出来同时保护细胞不受伤害，以获得充分游离存活率高的人脂肪干细胞。

附图说明

图1为本发明使用的三种优选浓度脂肪组织消化剂提取干细胞总量对比图。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下面对发明作进一步详细的说明。

实验中使用的胶原酶IV型，胰蛋白酶-EDTA复合体trypsin-EDTA，α1抗胰蛋白酶，二甲基亚砜均从Sigma公司购得。实验所用器具仪器试剂皆可通过商业途径获得。

实施例1：本发明所述的一种用于消化人脂肪组织的人脂肪消化剂A的制备

1）取900ml的Dulbecco’s磷酸盐缓冲液（Dulbecco’s PBS，Sigma，D-8537，以下相同），再加入青霉素和链霉素各90000U。

2）调pH值：用5％NaHCO₃溶液调节pH到7.2。

3）加入高效消化剂：将胶原酶IV型150mg，胰蛋白酶-EDTA复合体500mg，α1抗胰蛋白酶100mg和二甲基亚砜5000μL依次加入Dulbecco’s磷酸盐缓冲液中，使用振荡或超声助溶。

4）然后补加上述Dulbecco’s磷酸盐缓冲液至1000mL，即各个试剂组分取最低剂量配制而成的人脂肪消化剂A。

实施例2：本发明所述的一种用于消化人脂肪组织的人脂肪消化剂B的制备

1）取900ml的Dulbecco’s磷酸盐缓冲液（Dulbecco’s PBS，Sigma，D-8537），再加入青霉素和链霉素各90000U。

2）调pH值：用5％NaHCO₃溶液调节pH到7.2。

3）加入高效消化剂：将胶原酶IV型2500mg，胰蛋白酶-EDTA复合体5000mg，α1抗胰蛋白酶1500mg和二甲基亚砜100000μL依次加入Dulbecco’s磷酸盐缓冲液中，使用振荡或超声助溶。

4）然后补加上述Dulbecco’s磷酸盐缓冲液至1000mL，即各个试剂组分取最高剂量配制而成的人脂肪消化剂B。

实施例3：本发明所述的一种用于消化人脂肪组织的人脂肪消化剂C的制备

2）调pH值：用5％NaHCO₃溶液调节pH到7.2。

3）加入高效消化剂：将胶原酶IV型750mg，胰蛋白酶-EDTA复合体2500mg，α1抗胰蛋白酶500mg和二甲基亚砜30000μL依次加入Dulbecco’s磷酸盐缓冲液中，使用振荡或超声助溶。

4）然后补加上述Dulbecco’s磷酸盐缓冲液至1000mL，即各个试剂组分取最优剂量配制而成的人脂肪消化剂C。

实施例4：人体脂肪干细胞的快速提取

步骤1、取人脂肪组织块，置于500mL离心管中，加入等量生理盐水，用组织匀浆器（PRO200组织精密匀浆器，美国Pro Scientific公司）绞碎成为糜状后放入离心管中。

步骤2、将盛有脂肪的离心管置于8420离心机（久保田8420，日本KUBOTA久保田公司）中2400rpm离心5min后，分为3层：上层即油层、中间层即脂肪层、下层即沉积层。

步骤3、移取中间层等分至3个500mL离心管，分别加入与中间层等体积的不同类型的人脂肪组织消化剂，即A型消化剂、B型消化剂和C型消化剂，分别混匀，置于恒温振荡器中在37℃振速200rpm下振荡30min。

步骤4、取振荡后的3组中间层与消化剂的混合物分别用8420离心机（久保田8420，日本KUBOTA久保田公司）2400rpm/min离心10min,倒掉上层浮游脂肪吸除上层液体，分别加入20mL Dulbecco’s磷酸盐缓冲液（Dulbecco’s PBS，Sigma，D-8537）混匀，分别转移至50mL离心管，使用2420离心机（久保田2420，日本KUBOTA久保田公司）800rpm/min离心5min。吸除上清，分别加入Dulbecco’s磷酸盐缓冲液(Dulbecco’s PBS，Sigma，D-8537）混匀，使用2420离心机800rpm/min离心3min，吸除上层液体，同上再重复离心洗涤2次，根据细胞量剩余加5-15mL Dulbecco’s磷酸盐缓冲液（Dulbecco’s PBS，Sigma，D-8537）,使用10mL移液管混匀。

从中吸取10uL液体经过100um滤网过滤，计数细胞，计算出中间层脂肪液提取出的原代干细胞（X）数量。

步骤5、步骤2中沉积层等分移至3个500mL离心管中，分别加入与沉积层等体积的不同类型的人脂肪组织消化剂，即A型消化剂、B型消化剂和C型消化剂，混匀置于恒温振荡器中，在37℃振速200rpm振荡5min。8420离心机800rpm/min离心10min,吸除上层液体，分别加入20mLDulbecco’s磷酸盐缓冲液（Dulbecco’s PBS，Sigma，D-8537），分别混匀，转移至50mL离心管，2420离心机（久保田2420，日本KUBOTA久保田公司）800rpm/min离心5min，吸除上层液体。根据细胞量剩余量加5-10mlDulbecco’s磷酸盐缓冲液（Dulbecco’s PBS，Sigma，D-8537）,使用10ml移液管混匀；

从中吸取10uL液体100um滤网过滤，计数细胞，计算出沉积层提取出的原代干细胞（Y）数量。

实施例5：结果及分析

将中间层提取的脂肪干细胞总量（X）和沉积层收获的干细胞总量（Y）合并，根据公式(X+Y)/总液量，计算出提取的人体脂肪干细胞浓度及细胞总量。使用本发明A型消化剂、B型消化剂和C型消化剂实际提取的人体脂肪干细胞总量见图1。如图1所示用三种不同浓度消化剂都取得预期效果，其中最优浓度的脂肪组织消化剂消化组织提取的细胞数量最多，与预期相同。低浓度的配方消化作用低消化不完全所以提取的细胞数量较少，而高浓度的配方对细胞有较大的损伤作用所以最后提取的细胞数量反而是3组中最低。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改变和改进，例如用于消化人脂肪组织的人体脂肪消化剂使用的Dulbecco’s磷酸盐缓冲液可由其他有类似作用的缓冲液溶或者培养液代替，其并非所述的人体脂肪消化剂中的有效成分，这些都属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种人体脂肪干细胞快速提取方法，包括如下步骤：

人脂肪组织处理：将人脂肪组织块加入离心管中，再加入等量的生理盐水而后使用组织匀浆器处理成液状的脂肪，再将已成为液状的脂肪加入离心管中；

将液状的脂肪离心：使用离心机分离离心管中的液状脂肪使之分为三层，上层即油层、中间层即脂肪层、底层即沉积层；

脂肪层中人体脂肪干细胞提取：移取中间层脂肪至离心管中，加入与脂肪层相等体积的人脂肪组织消化剂混匀，该消化剂包含胶原酶IV型、胰蛋白酶-EDTA复合体、α1抗胰蛋白酶、二甲基亚砜，然后置于恒温振荡器中振荡，接着离心分离后去浮游脂肪取上层液体；而后再向取出的上层液体中加入Dulbecco’s磷酸盐缓冲液然后离心，弃去离心后的上清液取下层沉积细胞，再使用Dulbecco’s磷酸盐缓冲液重复离心洗涤2次，下层沉积细胞即为人体脂肪干细胞；

沉积层中人脂肪干细胞提取：在留有沉积层细胞的离心管中加入等体积的人脂肪组织消化剂混匀，该消化剂包含胶原酶IV型、胰蛋白酶-EDTA复合体、α1抗胰蛋白酶、二甲基亚砜，然后置于恒温振荡器中振荡后离心机离心,其后吸除上层液体，下层沉积细胞即为人脂肪干细胞。

2.人体脂肪干细胞快速提取中使用的人脂肪组织消化剂，其特征在于：包含胶原酶IV型、胰蛋白酶-EDTA复合体、α1抗胰蛋白酶、二甲基亚砜，所述胶原酶IV型浓度为0.15~2.5mg/mL，所述胰蛋白酶-EDTA复合体浓度为0.5~5mg/mL，所述α1抗胰蛋白酶浓度为0.1~1.5mg/mL，所述二甲基亚砜浓度为5~100μl/mL。

3.根据权利要求2所述的人脂肪组织消化剂，其特征在于：胶原酶IV型的最优浓度为0.75mg/mL，胰蛋白酶-EDTA复合体最优浓度为2.5mg/mL，α1抗胰蛋白酶最优浓度为0.5mg/mL，二甲基亚砜最优浓度为30μl/mL。

4.根据权利要求2或3所述的人脂肪组织消化剂，其特征在于：制备所述的一种人脂肪组织消化剂时使用Dulbecco’s磷酸盐缓冲液作为溶剂。