CN102643781A - 一种优化的有核细胞体外分离试剂盒及使用方法 - Google Patents
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Abstract
一种优化的有核细胞体外分离试剂盒，由两种试剂组成，试剂1由红细胞沉淀剂、氯化钠或氯化钾构成；试剂2由泛影酸钠加聚蔗糖400#，或者泛影酸钠加右旋糖酐，或者珀库尔(Percoll)构成，其密度在1.076-1.090之间。使用方法：取100ml人类骨髓血、或脐带血或外周血，直接加入到200ml试剂1液体中静置10-30分钟，收取上清液，以2000转/分钟(1100xg)的速度离心5分钟，弃上清液，余物加入到装有试剂2液体的离心管中，进行密度梯度离心30分钟，转速控制在1500转/分，吸取有核细胞层，然后再离心清洗1～3次，再用50ml细胞保养液稀释备用，取100μl送检，或自检。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，属于一种从人类外周血、脐带血、骨髓血中分离提取有核细胞的试剂盒技术，特别是一种优化的有核细胞体外分离试剂盒及使用方法。
背景技术
人外周血、脐带血、骨髓血都属于人体的血液组织，它们共同的特点是含有红细胞、白细胞、血小板及血浆物质；同一类细胞的形态、直径和质量相同。而白细胞中除了淋巴细胞、粒细胞以外，还含有造血干细胞、间充质干细胞、类胚胎干细胞、多潜能成体祖细胞和少量的脂肪干细胞等成体干细胞。各系干细胞又因为各自表面所含有的抗原性不同，可以分为一百多种，如CD3、CD34、CD105、CD133、CD10、SCA-1、Lin-等。各系干细胞和成熟的白细胞均为有核细胞。有核细胞中包含单核细胞，淋巴细胞及各系干细胞/祖细胞。
人外周血、脐带血、骨髓血只是各自所含的各类细胞的数量不同，细胞种类相同。外周血、脐带血、骨髓血它们的血浆离子浓度相同，渗透压相同，物理性状也相同。所以在临床分离提取有核细胞或血浆物质时是以同一种组织对待，可以用相同的方法分离提取有核细胞。
截止目前国际国内从骨髓血、脐带血、外周血中分离提取有核细胞的方法有三类：
第一类是以除去红细胞的方法：如氯化铵裂解红细胞法，Percoll非连续密度梯度离心法、Ficoll-Hypaque密度梯度离心法等，但实际操作过程还是不能完全除去红细胞，最理想的还会有1％的红细胞残留。
第二类是利用细胞表面抗原性不同分离细胞的方法，如磁珠法，免疫荧光标记法，富选法，流式细胞仪等，是选择性的分离CD3、CD105、CD113、CD34等等。这些方法所存在的共同问题是：一是不能有效保留所有类型的有核细胞或干细胞；二是分离提取的细胞种类单一，不能有效保留所有的细胞种类；三是造价太贵；四是技术条件不符合临床使用，只适用于科学研究的方法。
第三类是利用细胞生长的某些特性分离细胞的方法，如间充质干细胞在培养时具有贴壁生长的特性，从而分离出间充质干细胞。
本发明人2006年发明了“一种有核细胞体外分离试剂盒及其应用方法》”(专利号ZL200610106875.9)已经获得授权。该发明中描述试剂盒“其特征是红细胞沉淀剂、泛影酸钠-聚蔗糖400#HISOPAQUE1077和细胞保养液，各试剂溶液分开保存。”实际试剂盒产品是分为A液、B液、C液各自瓶装，共同组成一个试剂盒，并且取得了食品药品监督局的注册，注册号：宁(银)食药监械(准)字2008第1400008号。该产品能有效的从骨髓血、脐带血、外周血中分离出有核细胞，供临床医生开展细胞治疗。
依据该专利生产的骨髓、脐带血细胞体外分离试剂盒，供临床医生从骨髓血、脐带血、外周血中分离出有核细胞。临床医生再拿有核细胞当做药品一样，用于临床治疗细胞损伤性疾病，取得了预想不到的效果。例如：在治疗失代偿期肝硬化，升高白蛋白的疗效非常肯定，有95％的病人白蛋白能升高到正常水平(≥34g/L)；能明显改善肝硬化病人的凝血机制。在治疗溃疡性结肠炎病人的有效率大于70％。在治疗糖尿病足有效率大于70％。
从骨髓血、脐带血、外周血中分离出有核细胞为临床医生治疗那些传统医疗手段认为难治或不治之症提供了一种新的治疗手段。比如传统医学认为神经是不可再生的，细胞治疗颠覆了这一观点，用干细胞治疗神经损伤性疾病有了突破性的进展；如糖尿病的胰岛β细胞坏死认为是不可逆的，而干细胞临床治疗性研究已经证明胰岛细胞可以再生，临床治疗已经证明有30-40％的病人可以脱离胰岛素达两年之久(还在临床观察中)。
依据该专利生产的骨髓、脐带血细胞体外分离试剂盒经过4年多的临床使用，我们对其从试剂盒的生产、包装、存储、运输、临床操作方面认真研究，总结经验发现还有还存在需要改进和优化的空间。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术缺陷，提供一种优化的有核细胞体外分离试剂盒及使用方法。
本发明的目的按照下述方案实现：
一种优化的有核细胞体外分离试剂盒，由两种试剂组成，试剂1由红细胞沉淀剂、氯化钠或氯化钾构成；试剂2由泛影酸钠加聚蔗糖400#，或者泛影酸钠加右旋糖酐，或者珀库尔(Percoll)构成，其密度在1.076-1.090之间；红细胞沉淀剂是羟乙基淀粉、甲基纤维素、羧甲基淀粉、琥珀酰明胶中的一种；
所述红细胞沉淀剂的重量浓度为1.0-6.0％；氯化钠或氯化钾的重量浓度为0.2-1.0％；
所述泛影酸钠加聚蔗糖400#是重量浓度为10％泛影酸钠和3％聚蔗糖400#的水溶液，主要技术指标是密度在1.076-1.090，pH值7.2-7.3，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌；
所述泛影酸钠加右旋糖酐是重量浓度为10％泛影酸钠和3％右旋糖酐的水溶液，主要技术指标是密度在1.076-1.090，PH值7.2-7.4，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌；
所述珀库尔(Percoll)是重量浓度为6-8％二氧化硅聚乙烯吡咯烷酮胶体的水溶液，主要技术指标是密度在1.076-1.090，pH值7.2-7.4，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌；
所述的优化的有核细胞体外分离试剂盒的使用方法，取100ml人类骨髓血、或脐带血或外周血，直接加入到200ml试剂1液体中静置10-30分钟，收取上清液，以2000转/分钟(1100xg)的速度离心5分钟，弃上清液，余物加入到装有试剂2液体的离心管中，进行密度梯度离心30分钟，转速控制在1500转/分，吸取有核细胞层，然后再离心清洗1～3次，再用50ml细胞保养液稀释备用，取100μl送检，或自检。
本发明的改进，降低了能耗，降低了生产成本，节省了原材料，改进了工艺。使用方法较以前更为简单，减少了操作步骤，更加方便了临床使用。
原有的骨髓、脐带血细胞分离试剂盒是由三种液体A液、B液、C液组成，本发明只用两种试剂。采用本发明提取分离的干细胞通过以下实验验证：
1、细胞总数检测，用血球计数仪或血球计数板在显微镜下计算出细胞总数。正常100ml骨髓血、脐带血或外周血分离提取的细胞总数不应少于5.9×107个细胞(血球计数仪打印出的是浓度0.59-1.18×109/L)。
2、细胞存活率检测，采用苔盼蓝检测法检测细胞存活率，常规细胞存活率≥98％。
3、细胞收集率检测，细胞分离前用血细胞分析仪或显微镜手工计算有核细胞总数(A)，分离后用同样的方法测定出有核细胞的总数(B)。回收率＝B/A×100％。常规细胞回收率≥90％
4、由于用本发明所分离的有核细胞中包含成体干细胞，所以可以用流式细胞仪检测干细胞。常见干细胞的含量CD34≤2％，CD38≤1.5％，CD133≤1.0％等等。
本发明能够分离骨髓血、也能分离脐带血和外周血，试剂盒临床使用按要求在无菌条件下操作，实验室洁净级别整体10000级(类似欧盟标准B级)，局部100级(类似欧盟标准A级)，以保证分离过程不会污染。
本发明与原有技术相比
第一从试剂盒生产制备角度来比较，节省33％的原料、辅料和包装材料；节省了1/3的生产耗能。
第二减轻了1/3的运输重量，降低了运输成本。
第三由于方法简单了，缩短了细胞分离提取的时间，大大方便了临床医生的使用，提高了工作效率。
第四由于缩短了体外分离的时间，简化了步骤能有效提高细胞存活率两个百分点，这一个百分点就是1×106个细胞，这在临床治疗中有非常重要的意义。
第五由于减少分离的步骤，从而减少了细胞丢失的几率，以及存活率的提高，相应细胞收集率也提高到90％，这是非常有意义的结果。
第六由于减少一个试剂，减少了分离的步骤降低了操作过程的污染几率，增强了临床使用的安全性。
具体实施方式
实施例1：
试剂盒组成：
1、试剂1配制浓度为1.0-6.0％的羟乙基淀粉和0.45％的氯化钠的水溶液，用10％的氢氧化钠和1％的稀盐酸调整pH值至7.4±0.1，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌。
2、试剂2配制浓度为10％泛影酸钠和3％聚蔗糖400#(SIGMA公司产品的商品名HISTOPAQUE1077)的水溶液，主要技术指标是密度在1.076-1.090，pH值7.2-7.3，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌。
上述两种试剂经无菌检测合格，内毒素含量测试≤0.5EU/ml，试剂1、试剂2各一瓶装入试剂盒，为合格产品出厂。
试剂盒使用方法：
取上述合格出厂的试剂盒一个，再取100ml骨髓血(或脐带血，或外周血)，严格按无菌操作原则，将100ml骨髓血加到试剂1的瓶子里边，混匀后静置30分钟，收取上清液，以2000转/分钟(1100xg)的速度离心5分钟，弃上清液。收取浓缩液，用移液器加到含有试剂2的离心管中，进行密度梯度离心30分钟，离心力控制在720xg(转速大约1500转/分)。离心完成吸取有核细胞层，然后再离心清洗1～3次。最后一次离心清洗前将有核细胞溶解至50ml取100μl细胞悬液做检测。清洗完成后按临床医生的要求将细胞溶解至所需体积的注射用生理盐水中，送临床医生立即使用。
试剂盒检测方法：
1、细胞总数检测，用血球计数仪或血球计数板在显微镜下计算出细胞总数。正常100ml骨髓血、脐带血或外周血分离提取的细胞总数不应少于5.9×107个细胞(血球计数仪打印出的是浓度0.59-1.18×109/L)。
2、细胞存活率检测，采用苔盼蓝检测法检测细胞存活率，常规细胞存活率≥98％。
3、细胞收集率检测，细胞分离前用血细胞分析仪或显微镜手工计算有核细胞总数(A)，分离后用同样的方法测定出有核细胞的总数(B)。回收率＝B/A×100％。常规细胞回收率≥90％
4、由于用本发明所分离的有核细胞中包含成体干细胞，所以可以用流式细胞仪检测干细胞。常见干细胞的含量CD34≤2％，CD38≤1.5％，CD133≤1.0％等等。
实施例2：
试剂盒组成：
1、试剂1配制浓度为1.0-6.0％的羟乙基淀粉和0.45％的氯化钾的水溶液，用10％的氢氧化钠和1％的稀盐酸调整pH值至7.4±0.1，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌。
2、试剂2配制浓度为10％泛影酸钠和3％右旋糖酐的水溶液，主要技术指标是密度在1.076-1.090，pH值7.2-7.4，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌。
上述两种试剂经无菌检测合格，内毒素含量测试≤0.5EU/ml，试剂1、试剂2各一瓶装入试剂盒，为合格产品出厂。
试剂盒使用方法和检测方法同实施例1。
实施例3：
试剂盒组成：
1、试剂1配制浓度为1.0-6.0％的羟乙基淀粉和0.20％的氯化钠的水溶液，用10％的氢氧化钠和1％的稀盐酸调整PH值至7.4±0.1，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌。
2、试剂2配制浓度为6-8％珀库尔(Percoll二氧化硅聚乙烯吡咯烷酮胶体)的水溶液，主要技术指标是密度在1.076-1.090，PH值7.2-7.4，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌。
上述两种试剂经无菌检测合格，内毒素含量测试≤0.5EU/ml，试剂1、试剂2各一瓶装入试剂盒，为合格产品出厂。
试剂盒使用方法和检测方法同实施例1。
实施例4：
试剂盒组成：
1、试剂1配制浓度为1.0-6.0％羧甲基淀粉和0.30％的氯化钠的水溶液，用10％的氢氧化钠和1％的稀盐酸调整PH值至7.4±0.1，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌。
2、试剂2配制浓度为10％泛影酸钠和3％聚蔗糖400#(SIGMA公司产品的商品名 HISTOPAQUE1077)，的水溶液，主要技术指标是密度在1.076-1.090，pH值7.2-7.3，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌。
上述两种试剂经无菌检测合格，内毒素含量测试≤0.5EU/ml，试剂1、试剂2各一瓶装入试剂盒，为合格产品出厂。
试剂盒使用方法和检测方法同实施例1。
实施例5：
试剂盒组成：
1、试剂1配制浓度为1.0-6.0％羧甲基淀粉和1.0％的氯化钠的水溶液，用10％的氢氧化钠和1％的稀盐酸调整pH值至7.4±0.1，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌。
2、试剂2配制浓度为10％泛影酸钠和3％右旋糖酐的水溶液，主要技术指标是密度在1.076-1.090，PH值7.2-7.4，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌。
上述两种试剂经无菌检测合格，内毒素含量测试≤0.5EU/ml，试剂1、试剂2各一瓶装入试剂盒，为合格产品出厂。
试剂盒使用方法和检测方法同实施例1。
实施例6：
试剂盒组成：
1、试剂1配制浓度为1.0-6.0％羧甲基淀粉和0.2％的氯化钾的水溶液，用10％的氢氧化钠和1％的稀盐酸调整PH值至7.4±0.1，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌。
2、试剂2配制浓度为6-8％珀库尔(Percoll二氧化硅聚乙烯吡咯烷酮胶体)的水溶液，主要技术指标是密度在1.076-1.090，pH值7.2-7.4，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌。
上述两种试剂经无菌检测合格，内毒素含量测试≤0.5EU/ml，试剂1、试剂2各一瓶装入试剂盒，为合格产品出厂。
试剂盒使用方法和检测方法同实施例1。
实施例7：
试剂盒组成：
1、试剂1配制浓度为1.0-6.0％甲基纤维素和0.30％的氯化钾的水溶液，用10％的氢氧化钠和1％的稀盐酸调整PH值至7.4±0.1，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌。
2、试剂2配制浓度为10％泛影酸钠和3％聚蔗糖400#(SIGMA公司产品的商品名 HISTOPAQUE1077)，的水溶液，主要技术指标是密度在1.076-1.090，PH值7.2-7.3，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌。
上述两种试剂经无菌检测合格，内毒素含量测试≤0.5EU/ml，试剂1、试剂2各一瓶装入试剂盒，为合格产品出厂。
试剂盒使用方法和检测方法同实施例1。
实施例8：
试剂盒组成：
1、试剂1配制浓度为1.0-6.0％甲基纤维素和1％的氯化钾的水溶液，用10％的氢氧化钠和1％的稀盐酸调整PH值至7.4±0.1，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌。
2、试剂2配制浓度为10％泛影酸钠和3％右旋糖酐的水溶液，主要技术指标是密度在1.076-1.090，PH值7.2-7.4，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌。
上述两种试剂经无菌检测合格，内毒素含量测试≤0.5EU/ml，试剂1、试剂2各一瓶装入试剂盒，为合格产品出厂。
试剂盒使用方法和检测方法同实施例1。
实施例9：
试剂盒组成：
1、试剂1配制浓度为1.0-6.0％甲基纤维素和0.45％的氯化钠的水溶液，用10％的氢氧化钠和1％的稀盐酸调整PH值至7.4±0.1，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌。
2、试剂2配制浓度为6-8％珀库尔(Percoll二氧化硅聚乙烯吡咯烷酮胶体)的水溶液，主要技术指标是密度在1.076-1.090，PH值7.2-7.4，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌。
上述两种试剂经无菌检测合格，内毒素含量测试≤0.5EU/ml，试剂1、试剂2各一瓶装入试剂盒，为合格产品出厂。
试剂盒使用方法和检测方法同实施例1。
实施例10：
试剂盒组成：
1、试剂1配制浓度为1.0-6.0％琥珀酰明胶和0.45％的氯化钠的水溶液，用10％的氢氧化钠和1％的稀盐酸调整PH值至7.4±0.1，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌。
2、试剂2配制浓度为10％泛影酸钠和3％聚蔗糖400#(SIGMA公司产品的商品名 HISTOPAQUE1077)，的水溶液，主要技术指标是密度在1.076-1.090，pH值7.2-7.3，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌。
上述两种试剂经无菌检测合格，内毒素含量测试≤0.5EU/ml，试剂1、试剂2各一瓶装入试剂盒，为合格产品出厂。
试剂盒使用方法和检测方法同实施例1。
实施例11：
试剂盒组成：
1、试剂1配制浓度为1.0-6.0％琥珀酰明胶和0.45％的氯化钠的水溶液，用10％的氢氧化钠和1％的稀盐酸调整PH值至7.4±0.1，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌。
2、试剂2配制浓度为10％泛影酸钠和3％右旋糖酐的水溶液，主要技术指标是密度在1.076-1.090，PH值7.2-7.4，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌。
上述两种试剂经无菌检测合格，内毒素含量测试≤0.5EU/ml，试剂1、试剂2各一瓶装入试剂盒，为合格产品出厂。
试剂盒使用方法和检测方法同实施例1。
实施例12：
试剂盒组成：
1、试剂1配制浓度为1.0-6.0％琥珀酰明胶和0.45％的氯化钠的水溶液，用10％的氢氧化钠和1％的稀盐酸调整PH值至7.4±0.1，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌。
2、试剂2配制浓度为6-8％珀库尔(Percoll二氧化硅聚乙烯吡咯烷酮胶体)的水溶液，主要技术指标是密度在1.076-1.090，PH值7.2-7.4，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌。
上述两种试剂经无菌检测合格，内毒素含量测试≤0.5EU/ml，试剂1、试剂2各一瓶装入试剂盒，为合格产品出厂。
试剂盒使用方法和检测方法同实施例1。
Claims (6)
1.一种优化的有核细胞体外分离试剂盒，由两种试剂组成，试剂1由红细胞沉淀剂、氯化钠或氯化钾构成；试剂2由泛影酸钠加聚蔗糖400#，或者泛影酸钠加右旋糖酐，或者珀库尔(Percoll)构成，其密度在1.076-1.090之间；红细胞沉淀剂是羟乙基淀粉、甲基纤维素、羧甲基淀粉、琥珀酰明胶中的一种。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述红细胞沉淀剂的重量浓度为1.0-6.0％；氯化钠或氯化钾的重量浓度为0.2-1.0％。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述泛影酸钠加聚蔗糖400#是重量浓度为10％泛影酸钠和3％聚蔗糖400#的水溶液，主要技术指标是密度在1.076-1.090，PH值7.2-7.3，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述泛影酸钠加右旋糖酐是重量浓度为10％泛影酸钠和3％右旋糖酐的水溶液，主要技术指标是密度在1.076-1.090，PH值7.2-7.4，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述珀库尔(Percoll)是重量浓度为6-8％二氧化硅聚乙烯吡咯烷酮胶体的水溶液，密度在1.076-1.090，pH值7.2-7.4，用0.22μm过滤消毒后分瓶灌装，或是瓶装后121℃高压灭菌。
6.如权利要求1所述的试剂盒的使用方法，取100ml人类骨髓血、或脐带血或外周血，直接加入到200ml试剂1液体中静置10-30分钟，收取上清液，以2000转/分钟(1100xg)的速度离心5分钟，弃上清液，余物加入到装有试剂2液体的离心管中，进行密度梯度离心30分钟，转速控制在1500转/分，吸取有核细胞层，然后再离心清洗1～3次，再用50ml细胞保养液稀释备用，取100μl送检，或自检。
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| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 750011 Innovation Park, 78 Development Zone, the Ningxia Hui Autonomous Region, Yinchuan Applicant after: AVIC (NINGXIA) BIOLOGY CO., LTD. Address before: 750011 Innovation Park, 79 Development Zone, the Ningxia Hui Autonomous Region, Yinchuan Applicant before: Ningxia Zhonglianda Biotech Co., Ltd. |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: NINGXIA ZHONGLIANDA BIOLOGICAL CO., LTD. TO: AVIC (NINGXIA) BIOLOGY LLC |
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Address after: 750011 Innovation Park, 78 Development Zone, the Ningxia Hui Autonomous Region, Yinchuan Patentee after: AVIC (Ningxia) biological Limited by Share Ltd Address before: 750011 Innovation Park, 78 Development Zone, the Ningxia Hui Autonomous Region, Yinchuan Patentee before: AVIC (NINGXIA) BIOLOGY CO., LTD. |