WO2013123734A1 - 一种优化的有核细胞体外分离试剂盒及使用方法 - Google Patents

一种优化的有核细胞体外分离试剂盒及使用方法 Download PDF

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WO2013123734A1
WO2013123734A1 PCT/CN2012/075972 CN2012075972W WO2013123734A1 WO 2013123734 A1 WO2013123734 A1 WO 2013123734A1 CN 2012075972 W CN2012075972 W CN 2012075972W WO 2013123734 A1 WO2013123734 A1 WO 2013123734A1
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reagent
sodium
cell
kit
bottle
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PCT/CN2012/075972
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English (en)
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Inventor
王怀林
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宁夏中联达生物有限公司
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic

Definitions

  • the invention relates to the field of biomedical technology, and belongs to a kit technology for separating and extracting nucleated cells from human peripheral blood, umbilical cord blood and bone marrow blood, in particular to an optimized nucleated cell in vitro isolation kit and a using method thereof. Background technique
  • Human peripheral blood, cord blood, and bone marrow blood belong to the blood tissue of the human body. They are characterized by the inclusion of red blood cells, white blood cells, platelets, and plasma substances; the same type of cells have the same morphology, diameter, and quality.
  • leukocytes contain adult stem cells such as hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, embryonic stem cells, pluripotent adult progenitor cells, and a small number of adipose stem cells.
  • the stem cells of each line can be divided into more than one hundred kinds according to the antigenicity of the respective surfaces, such as CD3, CD34, CD105, CD133, CD10, SCA-1, Lin- and the like.
  • Each line of stem cells and mature white blood cells are nucleated cells. Nucleated cells contain monocytes, lymphocytes and stem/progenitor cells.
  • Peripheral blood, cord blood, and bone marrow blood are only different in the number of cells involved, and the cell types are the same.
  • Peripheral blood, cord blood, and bone marrow blood have the same plasma ion concentration, the same osmotic pressure, and the same physical properties. Therefore, in the clinical isolation and extraction of nucleated cells or plasma substances, the same tissue is treated, and the nucleated cells can be isolated and extracted by the same method.
  • the first method is to remove red blood cells: such as ammonium chloride lysis red blood cell method, Percol l non-continuous density gradient centrifugation method , Ficoll flypaque density gradient centrifugation, etc., but the actual operation process can not completely remove red blood cells, and ideally there will be 1% red blood cell residue.
  • the second type is a method for separating cells by different cell surface antigenicity, such as magnetic bead method, immunofluorescence labeling method, rich selection method, flow cytometry, etc., which selectively separates CD3, CD105, CD113, CD34 and the like.
  • the common problems of these methods are as follows: First, all types of nucleated cells or stem cells cannot be effectively retained; Second, the isolated and extracted cells are single, and cannot effectively retain all cell types; third, the cost is too expensive; Not suitable for clinical use, only for scientific research methods.
  • the third type is a method of separating cells by using certain characteristics of cell growth, such as mesenchymal stem cells having the characteristics of adherent growth during culture, thereby isolating mesenchymal stem cells.
  • the present inventors invented "a nucleated cell in vitro separation kit and its application method" in 2006 (Patent No.
  • the kit described in the invention is characterized in that it is a red blood cell precipitant, a sodium sulphate-polysucrose 400#HIS0PAQUE1077 and a cell maintenance solution, and each reagent solution is separately stored.
  • the actual kit product is divided into A liquid, B liquid, C.
  • the liquids are bottled together, together form a kit, and obtained the registration of the Food and Drug Administration, registration number: Ning (Silver) Food and Drug Administration (quasi) word 2008 No. 1400008.
  • the product can effectively separate nucleated cells from bone marrow blood, cord blood, and peripheral blood for cell therapy by clinicians.
  • the in vitro isolation kit for bone marrow and umbilical cord blood cells is used for clinicians to separate nucleated cells from bone marrow blood, cord blood, and peripheral blood.
  • Clinical doctors have used nuclear cells as medicines for clinical treatment of cell-damaging diseases, and have achieved unexpected results.
  • the effect of increasing albumin is very positive, 95% of patients can raise albumin to normal levels (34g / L) ; can significantly improve the coagulation mechanism of patients with cirrhosis.
  • the effective rate in patients with ulcerative colitis is greater than 70%. It is more than 70% effective in treating diabetic foot.
  • nucleated cells from bone marrow, cord blood, and peripheral blood provides a new treatment for clinicians to treat refractory or incurable diseases.
  • traditional medicine believes that nerves are non-renewable.
  • Cell therapy has subverted this view. Breakthrough progress has been made in the treatment of nerve-damaged diseases with stem cells; for example, islet necrosis of diabetes is considered irreversible, and stem cell clinical therapeutic research It has been shown that islet cells can be regenerated, and clinical treatment has proven that 30-40% of patients can get rid of insulin for up to two years (still in clinical observation).
  • reagent 1 consisting of red blood cell precipitant, sodium chloride or potassium chloride
  • reagent 2 consisting of sodium sulphate plus polysucrose 400#, or phagocytosis Sodium or dextran, or Percoll, having a density between 1.076 and 1. 090
  • erythrocyte precipitant is hydroxyethyl starch, methylcellulose, carboxymethyl starch, succinylated gelatin a kind 2-1. 0%
  • the weight concentration of the sodium chloride or potassium chloride is 0. 2-1. 0%;
  • the physicochemical value is 1. 076 - 1. 090, PH value 7. 2 - 7. 4, with a concentration of 10% sodium sulphate and 3% dextran. 0. 22 After filtration and disinfection, separate bottle filling, or autoclave at 121 °C after bottle filling;
  • the sulphate (Percoll) is a water-soluble solution of 6-8% silica polyvinylpyrrolidone colloid.
  • the main technical index is 1. 076 - 1. 090, pH 7. 2 - 7. 4, After being sterilized by filtration with 0.22Hm, the bottle is filled, or autoclaved at 121 °C after being bottled;
  • the optimized nucleated cell in vitro isolation kit is used, and 100 ml of human bone marrow blood, or cord blood or peripheral blood is taken, directly added to 200 ml of reagent 1 liquid for 10-30 minutes, and the supernatant is collected to Centrifuge at 2000 rpm (l lOOxg) for 5 minutes, discard the supernatant, add the residue to a centrifuge tube containing the reagent 2 liquid, perform a density gradient centrifugation for 30 minutes, and control the rotation speed at 1500 rpm. The nuclear cell layer is then washed by centrifugation 1 to 3 times, diluted with 50 ml of cell maintenance solution, taken for ⁇ , or self-tested.
  • the improvement of the invention reduces energy consumption, reduces production costs, saves raw materials, and improves the process.
  • the method of use is simpler than before, reducing the number of steps and making it more convenient for clinical use.
  • the original bone marrow and cord blood cell separation kit is composed of three liquid sputum, B liquid, and C liquid, and only two reagents are used in the present invention.
  • the isolated stem cells extracted by the present invention were verified by the following experiments:
  • Total cell count the total number of cells is calculated under a microscope using a hemocytometer or a hemocytometer. The total number of cells extracted from normal 100 ml bone marrow blood, cord blood or peripheral blood should not be less than 5. 9 X 10 7 cells (the blood cell counter prints a concentration of 0. 59-1. 18 X 10 9 /L).
  • the stem cells can be detected by flow cytometry.
  • Common stem cell content CD34 2%, CD38 ⁇ 1. 5%, CD133 1. 0% and so on.
  • the invention can separate bone marrow blood, can also separate cord blood and peripheral blood, and the clinical use of the kit is operated under aseptic conditions as required, the laboratory cleanliness level is 10000 overall (similar to the EU standard B grade), and the local level 100 (similar to the EU Standard Class A) to ensure that the separation process is not contaminated.
  • the first one compares the production and preparation of the kit, saving 33% of raw materials, excipients and packaging materials; saving 1/3 of production energy.
  • the second reduced the transport weight by 1/3 and reduced the transportation cost.
  • This percentage point is IX 10 6 cells, which is very important in clinical treatment.
  • the step of reducing the separation reduces the risk of contamination during the operation and enhances the safety of clinical use.
  • the reagent 1 is prepared at a concentration of 1.0-6.0% hydroxyethyl starch and 0.45% sodium chloride in water, adjusted to pH 7 with 10% sodium hydroxide and 1% dilute hydrochloric acid. 4 ⁇ 0. 1, Filtered by 0.22 ⁇ after sterilizing, or autoclaved at 121 °C after bottling.
  • reagent 2 is prepared to a concentration of 10% sodium sulphate and 3% sucrose 400 # (the SIGMA company's product name HIST0PAQUE1077) aqueous solution, the main technical indicators are density of 1. 076 -1. 090, pH 7. 2—7. 3, sterilized by 0.22Hm and then filled in a bottle, or autoclaved at 121 °C after bottling.
  • the nucleated cell layer is aspirated by centrifugation, and then washed by centrifugation 1 to 3 times.
  • the nucleated cells were dissolved in 50 ml of the ⁇ cell suspension for detection before the last centrifugation. After the cleaning is completed, the cells are dissolved to the required volume of physiological saline for injection according to the clinician's request, and sent to the clinician for immediate use.
  • Total cell count the total number of cells is calculated under a microscope using a hemocytometer or a hemocytometer. The total number of cells extracted from normal 100 ml bone marrow blood, cord blood or peripheral blood should not be less than 5. 9 X 10 7 cells (the blood cell counter prints a concentration of 0. 59-1. 18 X 10 9 /L).
  • the stem cells can be detected by flow cytometry.
  • Common stem cell content CD34 2%, CD38 ⁇ 1. 5%, CD133 1. 0% and so on.
  • the reagent 1 is prepared at a concentration of 1.0-6.0% hydroxyethyl starch and 0.45% potassium chloride in water, adjusted to pH 7 with 10% sodium hydroxide and 1% dilute hydrochloric acid. 4 ⁇ 0. 1, Filtered by 0.22 ⁇ after sterilizing, or filled at 121 °C after autoclaving.
  • the disinfection of the solution is 10% sodium diatrizoate and 3% dextran aqueous solution, the main technical indicator is a density of 1. 076 -1. 090, pH 7. 2 - 7. 4, with 0. 22 ⁇ filter disinfection Post-bottle filling, or autoclaving at 121 °C after bottling.
  • the method of using the kit and the detection method are the same as those in the first embodiment.
  • the reagent 1 is prepared at a concentration of 1.0-6.0% hydroxyethyl starch and 0.2% sodium chloride aqueous solution, 10% sodium hydroxide and 1% dilute hydrochloric acid were adjusted to 7.4 ⁇ 0.1, filtered and sterilized by 0.22 ⁇ , or autoclaved at 121 °C after bottled.
  • Reagent 2 is prepared in an aqueous solution of 6-8% Percol (Percoll silica polyvinylpyrrolidone colloid).
  • the main technical indicators are density of 1.076-1.090, PH value of 7.2-7.4, and filtration by 0.22 ⁇ . Bottle filling, or autoclaving at 121 °C after bottle filling.
  • reagent 1 and reagent 2 are each filled into the kit, and the qualified products are shipped.
  • the method of using the kit and the detection method are the same as those in the first embodiment.
  • Reagent 1 Prepare an aqueous solution of 1.0-6.0% carboxymethyl starch and 0.30% sodium chloride, adjust the value of ⁇ 3 ⁇ 4 to 7.4 ⁇ 0.1 with 10% sodium hydroxide and 1% dilute hydrochloric acid, filter with 0.22 ⁇ After disinfection, bottle filling, or autoclaving at 121 °C after bottle filling.
  • Reagent 2 is prepared with an aqueous solution of 10% sodium sulphate and 3% polysucrose 400# (trade name HIST0PAQUE1077 from SIGMA).
  • the main technical indicators are density between 1.076 and 1.090 and pH 7.2 to 7.3. After 0.22Hm filtration and disinfection, the bottle is filled, or autoclaved at 121 °C after bottled.
  • reagent 1 and reagent 2 are each filled into the kit, and the qualified products are shipped.
  • the method of using the kit and the detection method are the same as those in the first embodiment.
  • Reagent 1 Prepare an aqueous solution of 1.0-6.0% carboxymethyl starch and 1.0% sodium chloride, adjust the pH to 7.4 ⁇ 0.1 with 10% sodium hydroxide and 1% dilute hydrochloric acid, filter with 0.22 ⁇ After disinfection, bottle filling, or autoclaving at 121 °C after bottle filling.
  • Reagent 2 is prepared with an aqueous solution of 10% sodium diatrid and 3% dextran.
  • the main technical indicators are density of 1.076-1.090, PH value of 7.2-7.4, filtration by 0.22 ⁇ , bottle filling, or bottled Autoclaved at 121 °C.
  • the above two reagents were tested by sterility test, the endotoxin content test was 0.5EU/ml, and one bottle of reagent 1 and reagent 2 were loaded into the kit to be qualified products.
  • the kit using method and detection method are the same as those in Example 1.
  • Reagent 1 is prepared with an aqueous solution of 1.0-6.0% carboxymethyl starch and 0.2% potassium chloride. Adjust the value of ⁇ 3 ⁇ 4 to 7.4 ⁇ 0.1 with 10% sodium hydroxide and 1% dilute hydrochloric acid, filter with 0.22 ⁇ After disinfection, bottle filling, or autoclaving at 121 °C after bottle filling.
  • Reagent 2 is prepared in an aqueous solution of 6-8% Percol (Percoll silica polyvinylpyrrolidone colloid).
  • the main technical indicators are density of 1.076-1.090, pH 7.2-7.4, and filtration by 0.22 ⁇ . Bottle filling, or autoclaving at 121 °C after bottle filling.
  • reagent 1 and reagent 2 are each filled into the kit, and the qualified products are shipped.
  • the method of using the kit and the detection method are the same as those in the first embodiment.
  • Reagent 1 Prepare an aqueous solution of 1.0-6.0% methylcellulose and 0.30% potassium chloride, adjust the value of ⁇ 3 ⁇ 4 to 7.4 ⁇ 0.1 with 10% sodium hydroxide and 1% dilute hydrochloric acid, filter with 0.22 ⁇ After disinfection, bottle filling, or autoclaving at 121 °C after bottle filling.
  • Reagent 2 is prepared with an aqueous solution of 10% sodium sulphate and 3% polysucrose 400# (trade name HIST0PAQUE1077 from SIGMA).
  • the main technical indicators are density 1.076-1.090, pH 7. 2-7. ⁇ 3, After 0.22Hm filter disinfection, fill the bottle, or autoclave at 121 °C after bottle.
  • reagent 1 and reagent 2 are each filled into the kit, and the qualified products are shipped.
  • the method of using the kit and the detection method are the same as those in the first embodiment.
  • Reagent 1 is prepared with an aqueous solution of 1.0-6.0% methylcellulose and 1% potassium chloride. Adjust the value of ⁇ 3 to 7.4 ⁇ 0.1 with 10% sodium hydroxide and 1% dilute hydrochloric acid, and filter with 0.22 ⁇ . After disinfection, bottle filling, or autoclaving at 121 °C after bottle filling.
  • Reagent 2 is prepared with an aqueous solution of 10% sodium diatrid and 3% dextran.
  • the main technical indicator is density.
  • the method of using the kit and the detection method are the same as those in the first embodiment.
  • the reagent 1 is prepared at a concentration of 1.0-6.0% aqueous solution of 0% methylcellulose and 0.45% sodium chloride, adjusted to ⁇ 3 by using 10% sodium hydroxide and 1% dilute hydrochloric acid. 4 ⁇ 0. 1, Filtered by 0.22 ⁇ and then filled in a bottle, or autoclaved at 121 °C after bottled.
  • the method of using the kit and the detection method are the same as those in the first embodiment.
  • the reagent 1 is prepared at a concentration of 1. 0-6. 0% succinylated gelatin and 0.45% sodium chloride aqueous solution, with 10% sodium hydroxide and 1% dilute hydrochloric acid adjusted ⁇ 3 ⁇ 4 value to 7.4 ⁇ 0. 1, Filtered by 0.22 ⁇ after sterilizing, or bottled at 121 °C after bottling.
  • Reagent 2 is prepared in an aqueous solution of 10% diatrizoate and 3% sucrose 400# (trade name HIST0PAQUE1077 of SIGMA).
  • the main technical index is density 1.07 - 1. 090, pH 7 2— 7. 3, Filtered and disinfected with 0.22Hm, and filled in a bottle, or autoclaved at 121 °C after bottled.
  • the method of using the kit and the detection method are the same as those in the first embodiment.
  • Kit composition I.
  • the reagent 1 is prepared at a concentration of 1. 0-6. 0% succinylated gelatin and 0.4% sodium chloride aqueous solution, with 10% sodium hydroxide and 1% diluted hydrochloric acid to adjust the ra value to 7.4.
  • ⁇ 0. 1 Filtered with 0.22 ⁇ after sterilizing, or bottled at 121 °C after bottling.
  • the disinfection of the solution is 10% sodium diatrizoate and 3% dextran aqueous solution, the main technical indicators are density of 1. 076 -1. 090, PH value of 7. 2 - 7. 4, with 0. 22 ⁇ filter disinfection Post-bottle filling, or autoclaving at 121 °C after bottling.
  • the method of using the kit and the detection method are the same as those in the first embodiment.
  • the reagent 1 is prepared at a concentration of 1. 0-6. 0% succinylated gelatin and 0.45% sodium chloride aqueous solution, with 10% sodium hydroxide and 1% dilute hydrochloric acid adjusted ⁇ 3 ⁇ 4 value to 7.4 ⁇ 0. 1, Filtered with 0.22 ⁇ after sterilizing, or bottled at 121 °C after bottling.
  • the kit using method and detection method are the same as those in Example 1.

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Abstract

一种优化的有核细胞体外分离试剂盒，由两种试剂组成，试剂1由红细胞沉淀剂、氯化钠或氯化钾构成；试剂2由泛影酸钠加聚蔗糖400#，或者泛影酸钠加右旋糖酐，或者珀库尔（Percoll）构成，其密度在I.076—I.090之间。使用方法：取100ml人类骨髓血、或脐带血或外周血，直接加入到200ml试剂1液体中静置10-30分钟，收取上清液，以2000转/分钟（1100xg）的速度离心5分钟，弃上清液，余物加入到装有试剂2液体的离心管中，进行密度梯度离心30分钟，转速控制在1500转/分，吸取有核细胞层，然后再离心清洗1〜3次，再用50ml细胞保养液稀释备用，取100μl送检，或自检。

Description

说明书
一种优化的有核细胞体外分离试剂盒及使用方法 技术领域
本发明涉及生物医药技术领域， 属于一种从人类外周血、 脐带血、 骨髓血中分离 提取有核细胞的试剂盒技术， 特别是一种优化的有核细胞体外分离试剂盒及使用方法。 背景技术
人外周血、 脐带血、 骨髓血都属于人体的血液组织， 它们共同的特点是含有红细 胞、 白细胞、 血小板及血浆物质； 同一类细胞的形态、 直径和质量相同。 而白细胞中 除了淋巴细胞、 粒细胞以外， 还含有造血干细胞、 间充质干细胞、 类胚胎干细胞、 多 潜能成体祖细胞和少量的脂肪干细胞等成体干细胞。 各系干细胞又因为各自表面所含 有的抗原性不同， 可以分为一百多种， 如 CD3、 CD34、 CD105、 CD133、 CD10、 SCA- 1、 Lin-等。 各系干细胞和成熟的白细胞均为有核细胞。 有核细胞中包含单核细胞， 淋巴 细胞及各系干细胞 /祖细胞。
人外周血、 脐带血、 骨髓血只是各自所含的各类细胞的数量不同， 细胞种类相同。 外周血、 脐带血、 骨髓血它们的血浆离子浓度相同， 渗透压相同， 物理性状也相同。 所以在临床分离提取有核细胞或血浆物质时是以同一种组织对待， 可以用相同的方法 分离提取有核细胞。
截止目前国际国内从骨髓血、 脐带血、 外周血中分离提取有核细胞的方法有三类: 第一类是以除去红细胞的方法： 如氯化铵裂解红细胞法， Percol l非连续密度梯度 离心法、 Ficoll flypaque密度梯度离心法等， 但实际操作过程还是不能完全除去红细 胞， 最理想的还会有 1%的红细胞残留。
第二类是利用细胞表面抗原性不同分离细胞的方法， 如磁珠法， 免疫荧光标记法， 富选法， 流式细胞仪等， 是选择性的分离 CD3、 CD105、 CD113、 CD34等等。 这些方法 所存在的共同问题是： 一是不能有效保留所有类型的有核细胞或干细胞； 二是分离提 取的细胞种类单一， 不能有效保留所有的细胞种类； 三是造价太贵； 四是技术条件不 符合临床使用， 只适用于科学研究的方法。
第三类是利用细胞生长的某些特性分离细胞的方法， 如间充质干细胞在培养时具 有贴壁生长的特性， 从而分离出间充质干细胞。 本发明人 2006年发明了 "一种有核细胞体外分离试剂盒及其应用方法》"（专利号
ZL200610106875. 9) 已经获得授权。 该发明中描述试剂盒 "其特征是红细胞沉淀剂、 泛影酸钠-聚蔗糖 400#HIS0PAQUE1077和细胞保养液， 各试剂溶液分开保存。"实际试 剂盒产品是分为 A液、 B液、 C液各自瓶装， 共同组成一个试剂盒， 并且取得了食品药 品监督局的注册， 注册号： 宁 （银）食药监械 （准） 字 2008第 1400008号。 该产品能 有效的从骨髓血、 脐带血、 外周血中分离出有核细胞， 供临床医生开展细胞治疗。
依据该专利生产的骨髓、 脐带血细胞体外分离试剂盒， 供临床医生从骨髓血、 脐 带血、 外周血中分离出有核细胞。 临床医生再拿有核细胞当做药品一样， 用于临床治 疗细胞损伤性疾病， 取得了预想不到的效果。 例如： 在治疗失代偿期肝硬化， 升高白 蛋白的疗效非常肯定， 有 95%的病人白蛋白能升高到正常水平（ 34g/L); 能明显改善 肝硬化病人的凝血机制。在治疗溃疡性结肠炎病人的有效率大于 70%。在治疗糖尿病足 有效率大于 70%。
从骨髓血、 脐带血、 外周血中分离出有核细胞为临床医生治疗那些传统医疗手段 认为难治或不治之症提供了一种新的治疗手段。 比如传统医学认为神经是不可再生的， 细胞治疗颠覆了这一观点， 用干细胞治疗神经损伤性疾病有了突破性的进展； 如糖尿 病的胰岛 β细胞坏死认为是不可逆的， 而干细胞临床治疗性研究已经证明胰岛细胞可 以再生， 临床治疗已经证明有 30— 40%的病人可以脱离胰岛素达两年之久（还在临床观 察中）。
依据该专利生产的骨髓、 脐带血细胞体外分离试剂盒经过 4年多的临床使用， 我 们对其从试剂盒的生产、 包装、 存储、 运输、 临床操作方面认真研究， 总结经验发现 还有还存在需要改进和优化的空间。
发明内容 本发明的目的是克服现有技术缺陷， 提供一种优化的有核细胞体外分离试剂盒及 使用方法。
本发明的目的按照下述方案实现：
一种优化的有核细胞体外分离试剂盒， 由两种试剂组成， 试剂 1由红细胞沉淀剂、 氯化钠或氯化钾构成； 试剂 2由泛影酸钠加聚蔗糖 400#， 或者泛影酸钠加右旋糖酐， 或者珀库尔（Percoll)构成， 其密度在 1. 076— 1. 090之间； 红细胞沉淀剂是羟乙基淀 粉、 甲基纤维素、 羧甲基淀粉、 琥珀酰明胶中的一种； 所述红细胞沉淀剂的重量浓度为 1. 0— 6. 0 % ; 氯化钠或氯化钾的重量浓度为 0. 2-1. 0%；
所述泛影酸钠加聚蔗糖 400#是重量浓度为 10%泛影酸钠和 3%聚蔗糖 400#的水溶 液， 主要技术指标是密度在 1. 076— 1. 090， pH值 7. 2— 7. 3， 用 0. 22Hm过滤消毒后分 瓶灌装， 或是瓶装后 121 °C高压灭菌；
所述泛影酸钠加右旋糖酐是重量浓度为 10%泛影酸钠和 3%右旋糖酐的水溶液， 主 要技术指标是密度在 1. 076—1. 090， PH值 7. 2—7. 4，用 0. 22 过滤消毒后分瓶灌装， 或是瓶装后 121 °C高压灭菌；
所述珀库尔（Percoll)是重量浓度为 6— 8%二氧化硅聚乙烯吡咯烷酮胶体的水溶 液， 主要技术指标是密度在 1. 076— 1. 090， pH值 7. 2— 7. 4， 用 0. 22Hm过滤消毒后分 瓶灌装， 或是瓶装后 121 °C高压灭菌；
所述的优化的有核细胞体外分离试剂盒的使用方法， 取 100ml人类骨髓血、 或脐 带血或外周血，直接加入到 200ml试剂 1液体中静置 10-30分钟，收取上清液， 以 2000 转 /分钟 （l lOOxg) 的速度离心 5分钟， 弃上清液， 余物加入到装有试剂 2液体的离心 管中， 进行密度梯度离心 30分钟，转速控制在 1500转 /分， 吸取有核细胞层， 然后再 离心清洗 1〜3次，再用 50ml细胞保养液稀释备用， 取 Ιθθμΐ送检， 或自检。
本发明的改进， 降低了能耗， 降低了生产成本， 节省了原材料， 改进了工艺。 使 用方法较以前更为简单， 减少了操作步骤， 更加方便了临床使用。
原有的骨髓、 脐带血细胞分离试剂盒是由三种液体 Α液、 B液、 C液组成， 本发明 只用两种试剂。 采用本发明提取分离的干细胞通过以下实验验证：
1、 细胞总数检测， 用血球计数仪或血球计数板在显微镜下计算出细胞总数。 正 常 100ml骨髓血、 脐带血或外周血分离提取的细胞总数不应少于 5. 9 X 107个细胞 （血 球计数仪打印出的是浓度 0. 59—1. 18 X 109/L)。
2、细胞存活率检测，采用苔盼蓝检测法检测细胞存活率，常规细胞存活率 98%。
3、 细胞收集率检测， 细胞分离前用血细胞分析仪或显微镜手工计算有核细胞总 数 （A)， 分离后用同样的方法测定出有核细胞的总数 （B)。 回收率 = Β/Αχ100%。 常规 细胞回收率 90%
4、 由于用本发明所分离的有核细胞中包含成体干细胞， 所以可以用流式细胞仪 检测干细胞。 常见干细胞的含量 CD34 2%， CD38^ 1. 5%, CD133 1. 0%等等。 本发明能够分离骨髓血、 也能分离脐带血和外周血， 试剂盒临床使用按要求在无 菌条件下操作， 实验室洁净级别整体 10000级 （类似欧盟标准 B级）， 局部 100级 （类 似欧盟标准 A级）， 以保证分离过程不会污染。
本发明与原有技术相比
第一从试剂盒生产制备角度来比较， 节省 33%的原料、 辅料和包装材料； 节省了 1/3的生产耗能。
第二减轻了 1/3的运输重量， 降低了运输成本。
第三由于方法简单了， 縮短了细胞分离提取的时间， 大大方便了临床医生的使用， 提高了工作效率。
第四由于縮短了体外分离的时间， 简化了步骤能有效提高细胞存活率两个百分点， 这一个百分点就是 I X 106个细胞， 这在临床治疗中有非常重要的意义。
第五由于减少分离的步骤， 从而减少了细胞丢失的几率， 以及存活率的提高， 相 应细胞收集率也提高到 90%， 这是非常有意义的结果。
第六由于减少一个试剂， 减少了分离的步骤降低了操作过程的污染几率， 增强了 临床使用的安全性。
具体实施方式
实施例 1 :
试剂盒组成：
1、 试剂 1配制浓度为 1. 0— 6. 0 %的羟乙基淀粉和 0. 45 %的氯化钠的水溶液， 用 10%的氢氧化钠和 1%的稀盐酸调整 pH值至 7. 4 ± 0. 1， 用 0. 22μπι过滤消毒后分瓶灌装， 或是瓶装后 121 °C高压灭菌。
2、 试剂 2配制浓度为 10%泛影酸钠和 3%聚蔗糖 400# ( SIGMA公司产品的商品名 HIST0PAQUE1077 ) 的水溶液， 主要技术指标是密度在 1. 076—1. 090， pH值 7. 2—7. 3， 用 0. 22Hm过滤消毒后分瓶灌装， 或是瓶装后 121 °C高压灭菌。
上述两种试剂经无菌检测合格， 内毒素含量测试 0. 5EU/ml， 试剂 1、试剂 2各一 瓶装入试剂盒， 为合格产品出厂。
试剂盒使用方法：
取上述合格出厂的试剂盒一个， 再取 100ml骨髓血 （或脐带血， 或外周血）， 严 格按无菌操作原则， 将 100ml骨髓血加到试剂 1的瓶子里边， 混匀后静置 30分钟， 收 取上清液， 以 2000转 /分钟 （l lOOxg) 的速度离心 5分钟， 弃上清液。 收取浓縮液， 用移液器加到含有试剂 2的离心管中，进行密度梯度离心 30分钟，离心力控制在 720xg (转速大约 1500转 /分）。 离心完成吸取有核细胞层， 然后再离心清洗 1〜3次。 最后 一次离心清洗前将有核细胞溶解至 50ml取 Ιθθμΐ细胞悬液做检测。清洗完成后按临床 医生的要求将细胞溶解至所需体积的注射用生理盐水中， 送临床医生立即使用。
试剂盒检测方法：
1、 细胞总数检测， 用血球计数仪或血球计数板在显微镜下计算出细胞总数。 正 常 100ml骨髓血、 脐带血或外周血分离提取的细胞总数不应少于 5. 9 X 107个细胞 （血 球计数仪打印出的是浓度 0. 59—1. 18 X 109/L)。
2、细胞存活率检测，采用苔盼蓝检测法检测细胞存活率，常规细胞存活率 98%。
3、 细胞收集率检测， 细胞分离前用血细胞分析仪或显微镜手工计算有核细胞总 数 （A)， 分离后用同样的方法测定出有核细胞的总数 （B)。 回收率 = Β/Αχ100%。 常规 细胞回收率 90%
4、 由于用本发明所分离的有核细胞中包含成体干细胞， 所以可以用流式细胞仪 检测干细胞。 常见干细胞的含量 CD34 2%， CD38^ 1. 5%, CD133 1. 0%等等。
实施例 2:
试剂盒组成：
1、 试剂 1配制浓度为 1. 0— 6. 0%的羟乙基淀粉和 0. 45 %的氯化钾的水溶液， 用 10%的氢氧化钠和 1%的稀盐酸调整 pH值至 7. 4 ±0. 1， 用 0. 22μπι过滤消毒后分瓶灌装， 或是瓶装后 121 °C高压灭菌。
2、 试剂 2配制浓度为 10%泛影酸钠和 3%右旋糖酐的水溶液， 主要技术指标是密度 在 1. 076—1. 090， pH值 7. 2—7. 4， 用 0. 22μπι过滤消毒后分瓶灌装， 或是瓶装后 121 °C高压灭菌。
上述两种试剂经无菌检测合格， 内毒素含量测试 0. 5EU/ml， 试剂 1、试剂 2各一 瓶装入试剂盒， 为合格产品出厂。
试剂盒使用方法和检测方法同实施例 1。
实施例 3:
试剂盒组成：
1、 试剂 1配制浓度为 1. 0— 6. 0%的羟乙基淀粉和 0. 20%的氯化钠的水溶液， 用 10%的氢氧化钠和 1%的稀盐酸调整 ίΉ值至 7.4 ±0.1， 用 0.22μπι过滤消毒后分瓶灌装， 或是瓶装后 121°C高压灭菌。
2、 试剂 2配制浓度为 6— 8%珀库尔 （Percoll二氧化硅聚乙烯吡咯烷酮胶体） 的 水溶液， 主要技术指标是密度在 1.076—1.090， PH值 7.2—7.4， 用 0.22μπι过滤消毒 后分瓶灌装， 或是瓶装后 121°C高压灭菌。
上述两种试剂经无菌检测合格， 内毒素含量测试 0.5EU/ml， 试剂 1、试剂 2各一 瓶装入试剂盒， 为合格产品出厂。
试剂盒使用方法和检测方法同实施例 1。
实施例 4:
试剂盒组成：
1、试剂 1配制浓度为 1.0—6.0%羧甲基淀粉和 0.30%的氯化钠的水溶液，用 10% 的氢氧化钠和 1%的稀盐酸调整 ί¾值至 7.4 ±0.1， 用 0.22μπι过滤消毒后分瓶灌装， 或 是瓶装后 121°C高压灭菌。
2、 试剂 2配制浓度为 10%泛影酸钠和 3%聚蔗糖 400# (SIGMA公司产品的商品名 HIST0PAQUE1077), 的水溶液， 主要技术指标是密度在 1.076— 1.090， pH值 7.2— 7.3， 用 0.22Hm过滤消毒后分瓶灌装， 或是瓶装后 121°C高压灭菌。
上述两种试剂经无菌检测合格， 内毒素含量测试 0.5EU/ml， 试剂 1、试剂 2各一 瓶装入试剂盒， 为合格产品出厂。
试剂盒使用方法和检测方法同实施例 1。
实施例 5:
试剂盒组成：
1、 试剂 1配制浓度为 1.0—6.0%羧甲基淀粉和 1.0%的氯化钠的水溶液， 用 10% 的氢氧化钠和 1%的稀盐酸调整 pH值至 7.4 ±0.1， 用 0.22μω过滤消毒后分瓶灌装， 或 是瓶装后 121°C高压灭菌。
2、 试剂 2配制浓度为 10%泛影酸钠和 3%右旋糖酐的水溶液， 主要技术指标是密度 在 1.076—1.090， PH值 7.2—7.4， 用 0.22μω过滤消毒后分瓶灌装， 或是瓶装后 121 °C高压灭菌。
上述两种试剂经无菌检测合格， 内毒素含量测试 0.5EU/ml， 试剂 1、试剂 2各一 瓶装入试剂盒， 为合格产品出厂。 试剂盒使用方法和检测方法同实施例 1。
实施例 6:
试剂盒组成：
1、 试剂 1配制浓度为 1.0—6.0%羧甲基淀粉和 0.2%的氯化钾的水溶液， 用 10% 的氢氧化钠和 1%的稀盐酸调整 ί¾值至 7.4 ±0.1， 用 0.22μπι过滤消毒后分瓶灌装， 或 是瓶装后 121°C高压灭菌。
2、 试剂 2配制浓度为 6— 8%珀库尔 （Percoll二氧化硅聚乙烯吡咯烷酮胶体） 的 水溶液， 主要技术指标是密度在 1.076—1.090， pH值 7.2—7.4， 用 0.22μπι过滤消毒 后分瓶灌装， 或是瓶装后 121°C高压灭菌。
上述两种试剂经无菌检测合格， 内毒素含量测试 0.5EU/ml， 试剂 1、试剂 2各一 瓶装入试剂盒， 为合格产品出厂。
试剂盒使用方法和检测方法同实施例 1。
实施例 7:
试剂盒组成：
1、试剂 1配制浓度为 1.0—6.0%甲基纤维素和 0.30%的氯化钾的水溶液，用 10% 的氢氧化钠和 1%的稀盐酸调整 ί¾值至 7.4 ±0.1， 用 0.22μπι过滤消毒后分瓶灌装， 或 是瓶装后 121°C高压灭菌。
2、 试剂 2配制浓度为 10%泛影酸钠和 3%聚蔗糖 400# (SIGMA公司产品的商品名 HIST0PAQUE1077), 的水溶液， 主要技术指标是密度在 1.076— 1.090， PH值 7· 2— 7· 3， 用 0.22Hm过滤消毒后分瓶灌装， 或是瓶装后 121°C高压灭菌。
上述两种试剂经无菌检测合格， 内毒素含量测试 0.5EU/ml， 试剂 1、试剂 2各一 瓶装入试剂盒， 为合格产品出厂。
试剂盒使用方法和检测方法同实施例 1。
实施例 8:
试剂盒组成：
1、 试剂 1配制浓度为 1.0—6.0%甲基纤维素和 1%的氯化钾的水溶液， 用 10%的 氢氧化钠和 1%的稀盐酸调整 ί¾值至 7.4 ±0.1， 用 0.22μω过滤消毒后分瓶灌装， 或是 瓶装后 121°C高压灭菌。
2、 试剂 2配制浓度为 10%泛影酸钠和 3%右旋糖酐的水溶液， 主要技术指标是密度 在 1. 076—1. 090， PH值 7. 2—7. 4， 用 0. 22μπι过滤消毒后分瓶灌装， 或是瓶装后 121
°C高压灭菌。
上述两种试剂经无菌检测合格， 内毒素含量测试 0. 5EU/ml， 试剂 1、试剂 2各一 瓶装入试剂盒， 为合格产品出厂。
试剂盒使用方法和检测方法同实施例 1。
实施例 9:
试剂盒组成：
1、试剂 1配制浓度为 1. 0—6. 0%甲基纤维素和 0. 45 %的氯化钠的水溶液，用 10% 的氢氧化钠和 1%的稀盐酸调整 ί¾值至 7. 4 ±0. 1， 用 0. 22μπι过滤消毒后分瓶灌装， 或 是瓶装后 121 °C高压灭菌。
2、 试剂 2配制浓度为 6— 8%珀库尔 （Percoll二氧化硅聚乙烯吡咯烷酮胶体） 的 水溶液， 主要技术指标是密度在 1. 076—1. 090， PH值 7. 2—7. 4， 用 0. 22μπι过滤消毒 后分瓶灌装， 或是瓶装后 121 °C高压灭菌。
上述两种试剂经无菌检测合格， 内毒素含量测试 0. 5EU/ml， 试剂 1、试剂 2各一 瓶装入试剂盒， 为合格产品出厂。
试剂盒使用方法和检测方法同实施例 1。
实施例 10:
试剂盒组成：
1、试剂 1配制浓度为 1. 0—6. 0%琥珀酰明胶和 0. 45 %的氯化钠的水溶液，用 10% 的氢氧化钠和 1%的稀盐酸调整 ί¾值至 7. 4 ±0. 1， 用 0. 22μπι过滤消毒后分瓶灌装， 或 是瓶装后 121 °C高压灭菌。
2、 试剂 2配制浓度为 10%泛影酸钠和 3%聚蔗糖 400# (SIGMA公司产品的商品名 HIST0PAQUE1077), 的水溶液， 主要技术指标是密度在 1. 076— 1. 090， pH值 7. 2— 7. 3， 用 0. 22Hm过滤消毒后分瓶灌装， 或是瓶装后 121 °C高压灭菌。
上述两种试剂经无菌检测合格， 内毒素含量测试 0. 5EU/ml， 试剂 1、试剂 2各一 瓶装入试剂盒， 为合格产品出厂。
试剂盒使用方法和检测方法同实施例 1。
实施例 11 :
试剂盒组成： 1、试剂 1配制浓度为 1. 0—6. 0 %琥珀酰明胶和 0. 45 %的氯化钠的水溶液，用 10% 的氢氧化钠和 1%的稀盐酸调整 ra值至 7. 4 ± 0. 1， 用 0. 22μπι过滤消毒后分瓶灌装， 或 是瓶装后 121 °C高压灭菌。
2、 试剂 2配制浓度为 10%泛影酸钠和 3%右旋糖酐的水溶液， 主要技术指标是密度 在 1. 076—1. 090， PH值 7. 2—7. 4， 用 0. 22μπι过滤消毒后分瓶灌装， 或是瓶装后 121 °C高压灭菌。
上述两种试剂经无菌检测合格， 内毒素含量测试 0. 5EU/ml， 试剂 1、试剂 2各一 瓶装入试剂盒， 为合格产品出厂。
试剂盒使用方法和检测方法同实施例 1。
实施例 12:
试剂盒组成：
1、试剂 1配制浓度为 1. 0—6. 0 %琥珀酰明胶和 0. 45 %的氯化钠的水溶液，用 10% 的氢氧化钠和 1%的稀盐酸调整 ί¾值至 7. 4 ± 0. 1， 用 0. 22μπι过滤消毒后分瓶灌装， 或 是瓶装后 121 °C高压灭菌。
2、 试剂 2配制浓度为 6— 8%珀库尔 （Percol l二氧化硅聚乙烯吡咯烷酮胶体） 的 水溶液， 主要技术指标是密度在 1. 076—1. 090， PH值 7. 2—7. 4， 用 0. 22μπι过滤消毒 后分瓶灌装， 或是瓶装后 121 °C高压灭菌。
上述两种试剂经无菌检测合格， 内毒素含量测试 0. 5EU/ml， 试剂 1、试剂 2各一 瓶装入试剂盒， 为合格产品出厂。
试剂盒使用方法和检测方法同实施例 1。
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Claims

权利要求书
1、 一种优化的有核细胞体外分离试剂盒， 由两种试剂组成， 试剂 1由红细胞沉 淀剂、 氯化钠或氯化钾构成； 试剂 2 由泛影酸钠加聚蔗糖棚, 或者泛影酸钠 加右旋糖酐， 或者珀库尔（Percol l)构成， 其密度在 1. 076— 1. 090之间； 红细胞 沉淀剂是羟乙基淀粉、 甲基纤维素、 羧甲基淀粉、 琥珀酰明胶中的一种。
2、如权利要求 1所述的试剂盒，其特征在于所述红细胞沉淀剂的重量浓度为 1. 0 —6. 0 %； 氯化钠或氯化钾的重量浓度为 0. 2-1. 0%。
3、 如权利要求 1所述的试剂盒， 其特征在于所述泛影酸钠加聚蔗糖 400#是重量 浓度为 10%泛影酸钠和 3%聚蔗糖 400#的水溶液， 主要技术指标是密度在 1. 076 — 1. 090， PH值 7. 2—7. 3， 用 0. 22μω过滤消毒后分瓶灌装， 或是瓶装后 121 °C 高压灭菌。
4、 如权利要求 1所述的试剂盒， 其特征在于所述泛影酸钠加右旋糖酐是重量浓 度为 10%泛影酸钠和 3%右旋糖酐的水溶液， 主要技术指标是密度在 1. 076— 1. 090， PH值 7. 2—7. 4， 用 0. 22μω过滤消毒后分瓶灌装， 或是瓶装后 121 °C高 压灭菌。
5、如权利要求 1所述的试剂盒，其特征在于所述珀库尔（Percol l)是重量浓度为 6— 8%二氧化硅聚乙烯吡咯烷酮胶体的水溶液， 密度在 1. 076— 1. 090， pH值 7. 2 —7. 4, 用 0. 22Hm过滤消毒后分瓶灌装， 或是瓶装后 121 °C高压灭菌。
6、 如权利要求 1所述的试剂盒的使用方法， 取 100ml人类骨髓血、 或脐带血或 外周血，直接加入到 200ml试剂 1液体中静置 10-30分钟， 收取上清液， 以 2000 转 /分钟 （l lOOxg ) 的速度离心 5分钟， 弃上清液， 余物加入到装有试剂 2液体 的离心管中，进行密度梯度离心 30分钟，转速控制在 1500转 /分， 吸取有核细胞 层， 然后再离心清洗 1〜3次，再用 50ml细胞保养液稀释备用， 取 Ιθθμΐ送检， 或自检。
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