CN107034186A - 一种从人脐带血中分离纯化干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从人脐带血中分离纯化干细胞的方法，先将人脐带血细胞液分离纯化得到单核细胞样本，该步骤用到的试剂盒包括试剂A和试剂B，其中试剂A为红细胞沉淀剂，由重量分数为6％的羟乙基淀粉溶液组成；试剂B为细胞分离液，由聚蔗糖400和泛影酸葡甲胺配制而成，是一种无菌水溶液。然后进行干细胞培养、增殖和纯化，用到的干细胞培养基由DMEM/F12基础培养基和优化的添加剂混合而成。本发明利用脐血干细胞体外培养以及在细胞培养基中添加组分，促进了间充质干细胞的增殖优势，排挤其他细胞生长，使干细胞自然纯化。单核细胞回收率≥95％，干细胞存活率≥98％，间充质干细胞数量≥5×10⁷，达到了临床治疗的质量要求。

Description

一种从人脐带血中分离纯化干细胞的方法

技术领域

本发明涉及医学实验技术领域，具体是一种从人脐带血中分离纯化间充质干细胞的方法，应用梯度离心原理快速分离大容量的脐带血以制备单核细胞，在此基础上利用细胞培养分选技术制备临床以及实验室所需的干细胞。

背景技术

随着单核细胞研究以及单核细胞临床应用的不断深入，造血干细胞移植已成为根治恶性血液病(白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤)、再生障碍性贫血、以及某些遗传性疾病的有效手段。近年来干细胞移植已逐步应用于心脏病、神经系统损伤、组织器官修复、糖尿病、血管疾病等临床治疗。此外单核细胞还有增强人体免疫力、修复病变或衰老的组织、延长人的寿命、改变人类生存状态等潜能，具有不可估量的医学价值。

然而，单核细胞的广泛临床应用须有充足的健康单核细胞来源。因此，有效的、高纯度的脐带血单核细胞提取试剂盒已成为满足患者需要、及时向患者提供健康单核细胞供临床使用的基本保障。

健康干细胞的临床运用的第一步即是脐带血、骨髓血、外周血的采集以及单核细胞的分离。能否将干细胞充分分离、提取、扩增并纯化，关系着干细胞数量的多少及纯化率，这些又是移植成功与否的关键因素。

目前分离提取脐带血造血干细胞的方法主要有流式细胞仪法，该方法的设备价格昂贵，临床应用成本高，不便推广；培养扩增法，该方法污染率高，时间长，不适合临床使用；免疫磁珠法，该方法细胞被标记，筛选范围小，活性低，标记物对人体的影响与否还未知。目前主流的分离方法由于存在代价昂贵、活性低、污染率高、有标记物等各种问题而不适用于医学临床使用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从人脐带血细胞中分离纯化干细胞的方法。用本发明的方法配合本发明的试剂盒以及新型细胞培养基，对人脐带血细胞进行分离提纯制备干细胞，单核细胞回收率≥95％；间充质干细胞存活率≥98％，间充质干细胞(MSCs)数量≥5×10⁷，达到了临床治疗的质量要求。本发明的试剂盒各成分配制简便，纯化操作针对性强，尤其是通过对脐血间充质干细胞(MSCs)的增殖培养，不仅去除了脐带血中的红细胞、死细胞等杂质，还可大量扩增MSCs细胞使之成为理想种子来源。

本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一种从人脐带血中分离纯化干细胞的方法，包括：将人脐带血分离纯化得到单核细胞样本；将单核细胞样本进行培养、扩增得到所需数量的干细胞；其特征在于具体包括以下步骤：

(1)将存放在含有肝素或枸橼酸钠抗凝剂采血袋中的脐带血倒入500毫升无菌试剂瓶中，按体积比为1:1比例加入注射用生理盐水，盖上瓶盖，上下轻轻颠倒混匀，得到稀释的细胞液，待混合均匀后按照试剂A与稀释的细胞液之比为1:0.8的比例加入试剂A，混合均匀后，于37℃下静置20～30分钟；

(2)待观察到有明显的红细胞沉淀至最下层时，用移液管收集上层血清至第一支50毫升无菌离心管中，设置离心条件为：1100g×5min；离心分离后弃去上清液，用含有质量浓度为2％人血白蛋白的注射用生理盐水洗涤沉淀并将洗涤后的产物转移至第二支50毫升无菌离心管中，得到悬浮细胞液，该悬浮细胞液含有单核细胞；

(3)将试剂B加入第三支50毫升无菌离心管中，然后将第二支离心管中的悬浮细胞液缓缓注入盛有试剂B的第三支50毫升无菌离心管中，使悬浮细胞液铺在试剂B的液面上，其中，悬浮细胞液与试剂B的体积比为0.8:1；

(4)设置离心条件为700g×30min进行离心分离，离心后分为4层，从上到下依次是：稀释的血浆、单核细胞、粒细胞、红细胞；其中单核细胞层为云雾状薄细胞层，将该单核细胞层吸取出来放入第四支50毫升无菌离心管中，用移液器加入注射用生理盐水进行稀释，轻轻混匀后进行离心分离，离心条件设置为700g×5min；离心后再用注射用生理盐水洗涤下层沉淀两次，每次洗涤后离心分离，洗涤用的生理盐水中含有质量浓度为2％的人血白蛋白，前后两次离心分离的条件分别为570g×5min和450g×5min，最后收集离心管底部的单核细胞样本以备用；

(5)将步骤(4)得到的细胞样本用1ml～2ml干细胞培养基悬浮后接种于装有10毫升干细胞培养基的T25cm²的培养瓶中，置于温度为37℃、二氧化碳体积浓度为5％、饱和湿度的培养箱中，培养3天后换新的干细胞培养基，去除未贴壁的细胞；之后每两天换一次新的干细胞培养基，并每天在倒置显微镜下观察细胞状态，记录其形态，待细胞生长达到80％～90％汇合度时，于37℃用质量分数为0.25％的胰酶消化贴壁细胞3～5分钟后进行传代培养或冻存，冻存条件为：-196℃液氮冻存。

本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。

前述的分离纯化单核细胞的方法，其中，所述试剂A为红细胞沉淀剂，由重量分数为6％的羟乙基淀粉溶液组成，该溶液以9％的生理盐水为溶剂，以羟乙基淀粉为溶质，该试剂A为医用制剂，在洁净条件下使用医用无菌包装试剂瓶分装。

前述的分离纯化单核细胞的方法，其中，所述试剂B为细胞分离液，由聚蔗糖400和泛影酸葡甲胺配制而成，是一种无菌水溶液。

前述的分离纯化单核细胞的方法，其中，所述试剂B由聚蔗糖400和泛影酸葡甲胺配制而成，通过以下方法制备：

在室温18～25℃，将密度为340g/ml的泛影酸葡甲胺溶液与重量分数为9％的聚蔗糖溶液充分混合均匀，最终所得混合液的密度为1.075g/ml，然后过滤除菌，经检测，其毒素含量≤0.5EU/ml,PH为7～7.8，装瓶于4℃避光保存。

前述的分离纯化单核细胞的方法，其中，所述干细胞培养基由DMEM/F12基础培养基和添加剂组成；所述添加剂的成分包括成分A和成分B，其中，成分A包括：超氧化物歧化酶、地塞米松和植物血凝素；成分B为自体富血小板血浆；

先将DMEM培养基加入添加剂的成分A，混合均匀后，与F12培养基按照体积比为1:1的比例混合，得到DMEM/F12基础培养基，在使用干细胞培养基时再临时加入添加剂的成分B，最终得到所述的干细胞培养基；

添加的成分B的体积占DMEM/F12基础培养基体积的5％～10％；

最终所得干细胞培养基中超氧化物歧化酶、地塞米松和植物血凝素的浓度分别为：30μmol/L、0.1μmol/L、2μg/ml。

借由上述技术方案，本发明的优点和效果在于：

由于脐带血中单核细胞所含的间充质干细胞数量最多，本发明所提供的工艺路径及其所用的技术参数又经过优化处理，所以成效显著。虽然市面上同类试剂盒利用Ficol l分离方法制备的脐带血单核细胞通过检测CD34判断其回收率达到85％以上，但在所分离的单核细胞中，间充质干细胞(MSCs)的数量极少，不到细胞总数的0.01‰～0.1‰，而且在制备的单核细胞悬液中存在少量的细胞血浆、血小板、粒细胞以及死细胞组分，分离的细胞种类以淋巴细胞居多。由于干细胞数量少，其所具备的自我更新和分化的潜能能力较弱起不到临床治疗作用。人体细胞治疗所需细胞数量为10⁶/kg，所以MSCs运用于临床之前需要在体外进行扩增。

本发明的方法将分离提纯后的单核细胞经过本公司发明的新型干细胞培养液进行选育培养后，单核细胞回收率≥95％；干细胞存活率≥98％，间充质干细胞(MSCs)数量≥5×10⁷，达到了临床治疗的质量要求。

本发明技术方案中所使用的新型干细胞培养基是以DMEM/F12基础培养基和添加剂构成，是以DMEM培养基加入添加剂后无菌过滤和F12培养基以体积比为1:1比例混合，添加剂包含成分A和成分B，成分A包括30μmol/L超氧化物歧化酶(SOD)、0.1μmol/L地塞米松、2μg/ml植物血凝素(PHA)，先将成分A与基础培养基混合均匀；在使用时再添加成分B，成分B为自体富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)，成分B添加体积占基础培养基体积的为5％～10％。

在实际使用过程中该新型培养基在体外培养干细胞过程中较常规培养基扩增速度提高2倍以上。PRP来源于人类，输注人体不会引起异种蛋白免疫反应，尤其是PRP含有的血小板源性生长因子、表皮生长因子、转化生长因子β、β、胰岛素样生长因子Ⅰ、胰岛素样生长因子Ⅱ、血管内皮生长因子等多种因子，可以迅速刺激间充质干细胞的增殖，扩增的间充质干细胞在其组织修复、成骨分化等方面能力更强。是在临床大规模培养间充质干细胞所使用的培养基替代胎牛血清最适宜的人源化替代品。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述优势和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，详细说明如下。

附图说明

图1是试剂A沉淀全血中的红细胞分层后的示意图；

图2是试剂B与悬浮细胞液离心后的分层示意图；

图3是为单核细胞用注射用生理盐水洗涤离心后单核细胞分布图；

图4是单核细胞培养初期的照片；

图5是间充质干细胞培养5D的照片；

图6是间充质干细胞培养10D的照片；

图7是间充质干细胞培养20D的照片；

图8是脐血间充质干细胞CD90阳性表达，CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR阴性表达；

图9是脐血间充质干细胞CD105阳性表达，CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR阴性表达；

图10是脐血间充质干细胞CD73阳性表达，CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR阴性表达。

【元件及符号说明】

图1：a：血清 b：红细胞

图2：c：稀释的血浆 d：单核细胞层 e:粒细胞 f：红细胞

图3：g：上清液 h:单核细胞样本

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提出的一种从人脐带血或胎盘组织细胞中分离纯化干细胞的方法，其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。

实施例：

将存放在含有肝素或枸橼酸钠抗凝剂采血袋中的脐带血倒入500毫升无菌试剂瓶中，按体积比为1:1比例加入注射用生理盐水，盖上瓶盖，上下轻轻颠倒混匀，得到稀释的细胞液，待混合均匀后按照试剂A与稀释的细胞液之比为1:0.8的比例加入试剂A，混合均匀后，于37℃下静置20～30分钟；待观察到有明显的红细胞沉淀至最下层时(如图1)，用移液管收集上层血清至第一支50毫升无菌离心管中，离心条件设置为：1100g×5min；离心后弃去上清液，用含有质量浓度为2％人血白蛋白的注射用生理盐水洗涤沉淀并将洗涤后的产物转移至第二支50毫升无菌离心管中，得到悬浮细胞液，该悬浮细胞液含有单核细胞。

将试剂B加入第三支50毫升无菌离心管中，然后将第二支离心管中的悬浮细胞液缓缓注入盛有试剂B的第三支50毫升无菌离心管中，使悬浮细胞液铺在试剂B的液面上，其中，悬浮细胞液与试剂B的体积比为0.8:1；离心条件设置为700g×30min；离心后分为4层，从上到下依次是：稀释的血浆、单核细胞、粒细胞、红细胞(如图2)；其中单核细胞层呈云雾状薄细胞层，将该单核细胞层吸取出来放入第四支50毫升无菌离心管中，用移液器加入注射用生理盐水进行稀释，轻轻混匀后进行离心分离，离心条件设置为700g×5min；离心后再用注射用生理盐水洗涤下层沉淀两次，洗涤用的生理盐水中含有质量浓度为2％的人血白蛋白。每次洗涤后离心分离，前后两次离心分离的条件分别为570g×5min和450g×5min，最后收集离心管底部的单核细胞样本以备用(如图3)；

将得到的单核细胞样本用少量(1～2ml)新型干细胞培养基悬浮后接种于装有10毫升干细胞培养基的T25cm²的培养瓶中，置于温度为37℃、二氧化碳体积浓度为5％、饱和湿度的培养箱中，培养3天后换液(换新的干细胞培养基)，去除未贴壁的细胞；之后每两三天换液一次，每天在倒置显微镜下观察细胞状态，记录其形态，待细胞生长达到80％～90％汇合度时，于37℃用质量分数为0.25％的胰酶消化贴壁细胞3～5分钟后进行传代培养或冻存，冻存条件为：-196℃液氮冻存。

具体的，试剂A由重量分数为6％的羟乙基淀粉溶液组成，该溶液以9％的生理盐水为溶剂，以羟乙基淀粉为溶质，在洁净条件下使用医用无菌包装试剂瓶分装。

试剂B为细胞分离液，由聚蔗糖400和泛影酸葡甲胺配制而成：在室温18～25℃，将密度为340g/ml的泛影酸葡甲胺溶液与重量分数为9％的聚蔗糖溶液充分混合均匀，最终所得混合液的密度为1.075g/ml，然后过滤除菌，经检测，其毒素含量≤0.5EU/ml,PH为7～7.8，装瓶于4℃避光保存。

新型干细胞培养基由DMEM/F12基础培养基和添加剂混合而成；所述添加剂的成分包括成分A和成分B，其中，成分A包超氧化物歧化酶(SOD)、地塞米松和植物血凝素(PHA)；成分B为自体富血小板血浆；

先将DMEM培养基加入添加剂的成分A，混合均匀后，与F12培养基按照体积比为1:1的比例混合，得到DMEM/F12基础培养基；在使用干细胞培养基时再临时加入添加剂的成分B，添加的成分B的体积占DMEM/F12基础培养基体积的5％～10％；最终所得干细胞培养基中超氧化物歧化酶(SOD)、地塞米松和植物血凝素的浓度分别为30μmol/L、0.1μmol/L、2μg/ml；

培养过程中细胞分化增值结果如图4～图7所示，在实验过程中细胞不断增殖，MSCs细胞活性及细胞性状经倒置显微镜下观察无明显差异。MSCs细胞一般传至3代时可获得纯度高且形态均一的长梭形间充质干细胞(如图7所示)，其生物学特性通过流式细胞仪检测结果确认(如图8～图10所示)。脐血MSCs稳定地表达间充质细胞相关抗原的标记：CD90、CD105、CD73，同时不表达与造血有关的表面抗原CD34、CD45、HLA-DR。

图4～图7是实施例用干细胞培养基对单核细胞进行培养的周期照片。可以看出，在培养初期干细胞数量非常少，随着培养周期的延长，干细胞数量不断增殖、纯化，干细胞活性及细胞性状经倒置显微镜下观察无明显差异。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (5)

1.一种从人脐带血中分离纯化干细胞的方法，包括：将人脐带血分离纯化得到单核细胞样本；将单核细胞样本进行培养、扩增得到所需数量的干细胞；其特征在于具体包括以下步骤：

(1)将存放在含有肝素或枸橼酸钠抗凝剂采血袋中的脐带血倒入500毫升无菌试剂瓶中，按体积比为1:1比例加入注射用生理盐水，盖上瓶盖，上下轻轻颠倒混匀，得到稀释的细胞液，待混合均匀后按照试剂A与稀释的细胞液之比为1:0.8的比例加入试剂A，混合均匀后，于37℃下静置20～30分钟；

(2)待观察到有明显的红细胞沉淀至最下层时，用移液管收集上层血清至第一支50毫升无菌离心管中，设置离心条件为：1100g×5min；离心分离后弃去上清液，用含有质量浓度为2％人血白蛋白的注射用生理盐水洗涤沉淀并将洗涤后的产物转移至第二支50毫升无菌离心管中，得到悬浮细胞液，该悬浮细胞液含有单核细胞；

(3)将试剂B加入第三支50毫升无菌离心管中，然后将第二支离心管中的悬浮细胞液缓缓注入盛有试剂B的第三支50毫升无菌离心管中，使悬浮细胞液铺在试剂B的液面上，其中，悬浮细胞液与试剂B的体积比为0.8:1；

(4)设置离心条件为700g×30min进行离心分离，离心后分为4层，从上到下依次是：稀释的血浆、单核细胞、粒细胞、红细胞；其中单核细胞层为云雾状薄细胞层，将该单核细胞层吸取出来放入第四支50毫升无菌离心管中，用移液器加入注射用生理盐水进行稀释，轻轻混匀后进行离心分离，离心条件设置为700g×5min；离心后再用注射用生理盐水洗涤下层沉淀两次，洗涤用的生理盐水中含有质量浓度为2％的人血白蛋白，每次洗涤后离心分离，前后两次离心分离的条件分别为570g×5min和450g×5min，最后收集离心管底部的单核细胞样本以备用；

(5)将步骤(4)得到的细胞样本用1ml～2ml干细胞培养基悬浮后接种于装有10毫升干细胞培养基的T25cm²的培养瓶中，置于温度为37℃、二氧化碳体积浓度为5％、饱和湿度的培养箱中，培养3天后换新的干细胞培养基，去除未贴壁的细胞；之后每两天换一次新的干细胞培养基，每天在倒置显微镜下观察细胞状态，记录其形态，待细胞生长达到80％～90％汇合度时，于37℃用质量分数为0.25％的胰酶消化贴壁细胞3～5分钟后进行传代培养或冻存，冻存条件为：-196℃液氮冻存。

2.如权利要求1所述的从人脐带血中分离纯化干细胞的方法，其特征在于所述试剂A为红细胞沉淀剂，由重量分数为6％的羟乙基淀粉溶液组成，该溶液以9％的生理盐水为溶剂，以羟乙基淀粉为溶质，该试剂A为医用制剂，在洁净条件下使用医用无菌包装试剂瓶分装。

3.如权利要求1所述的从人脐带血中分离纯化干细胞的方法，其特征在于所述试剂B为细胞分离液，由聚蔗糖400和泛影酸葡甲胺配制而成，是一种无菌水溶液。

4.如权利要求1所述的从人脐带血中分离纯化干细胞的方法，其特征在于所述试剂B由聚蔗糖400和泛影酸葡甲胺配制而成，通过以下方法制备：

在室温18～25℃，将密度为340g/ml的泛影酸葡甲胺溶液与重量分数为9％的聚蔗糖溶液充分混合均匀，最终所得混合液的密度为1.075g/ml，然后过滤除菌，经检测，其毒素含量≤0.5EU/ml,PH为7～7.8，装瓶于4℃避光保存。

5.如权利要求1所述的从人脐带血中分离纯化干细胞的方法，其特征在于所述干细胞培养基由DMEM/F12基础培养基和添加剂组成；所述添加剂的成分包括成分A和成分B，其中，成分A包括：超氧化物歧化酶、地塞米松和植物血凝素；成分B为自体富血小板血浆；

先将DMEM培养基加入添加剂的成分A，混合均匀后，与F12培养基按照体积比为1:1的比例混合，得到DMEM/F12基础培养基，在使用干细胞培养基时再临时加入添加剂的成分B，最终得到所述的干细胞培养基；

添加的成分B的体积占DMEM/F12基础培养基体积的5％～10％；

最终所得干细胞培养基中超氧化物歧化酶、地塞米松和植物血凝素的浓度分别为：30μmol/L、0.1μmol/L、2μg/ml。