CN108148804A - 一种符合临床用脐血多能干细胞生产纯化方法 - Google Patents

一种符合临床用脐血多能干细胞生产纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种符合临床用脐血多能干细胞生产纯化方法，包括如下步骤：采集脐血放入血液保存袋中，并冷藏保存；采用HES分离法对脐血有核细胞进行分离处理，获得的脐血单核细胞进行冷冻处理；冷冻细胞复苏后用生理盐水洗涤，再用纯注射用水裂解红细胞，再用生理盐水洗涤，进行计数和活率测定，并留样进行内毒素和细菌检测，根据计数结果按临床需要将细胞与保存液按比例混匀待用，即可。该方法从原料采集开始直至细胞制备完成的全过程进行临床级监控，以实现脐血多能细胞的临床标准产品。且采用HES分离法，并进行改进，使得脐血中多能干细胞得到极大保留。

Description

一种符合临床用脐血多能干细胞生产纯化方法
技术领域
本发明属细胞生物学领域，具体涉及一种符合临床用脐血多能干细胞生产纯化方法。
背景技术
干细胞(Stem Cells，SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，是原始且未特化的细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能。干细胞存在所有多细胞组织里，能经由有丝分裂与分化来分裂成多种的特化细胞，而且可以利用自我更新来提供更多干细胞。干细胞的来源有很多，包括胎盘、脐带、脐带血与骨髓等。
目前公开的各类脐血单核细胞制备方法中，有不同的技术方案，但都不符合临床应用的标准。如专利文献CN105420191A中公开了一种富含造血干细胞的临床用脐血单核细胞的制备方法，但其采用Ficoll分离方法，分离单核细胞效度很低，大量单核细胞会丢失。
发明内容
针对现有技术缺陷，本发明提供一种符合临床用脐血多能干细胞生产纯化方法，从原料采集开始直至细胞制备完成的全过程进行临床级监控，以实现脐血单核细胞的临床标准产品。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种符合临床用脐血多能干细胞生产纯化方法，包括如下步骤：
步骤A，采集脐血放入血液保存袋中，并冷藏保存；
步骤B，采用HES分离法对脐血有核细胞进行分离处理，获得的脐血单核细胞进行冷冻处理；
步骤C，冷冻细胞复苏后用生理盐水洗涤，再用纯注射用水裂解红细胞，再用生理盐水洗涤，进行计数和活率测定，并留样进行内毒素和细菌检测，根据计数结果按临床需要将细胞与保存液按比例混匀待用，即可。
优选地，步骤A中，所述分离获得的脐带来源于健康产妇，年龄18-45岁，无急、慢性疾病和传染病(甲肝、乙肝、丙肝、艾滋、梅毒、巨细胞病毒)，肝功能检测正常，遗传病家族史检测正常，胎儿为成熟足月分娩，非死、畸胎，无新生儿窒息、水肿和黄疸。
优选地，步骤A中，所述脐带保存液采用医用输血保存袋，不含抗生素，符合临床输血标准。
优选地，步骤A中，所述冷藏保存的温度为4℃，并在24小时内进行分离处理。
优选地，步骤B中，所述HES分离法的具体处理步骤为：
B1、将输血袋中的脐血平均分配到离心管中，2000r/min离心10min；
B2、离心结束，取上层血浆备用；然后在离心管中加入25％HES混匀,低温离心1600r/min离心10min，离心温度维持4-6℃；吸出上层液体，弃离心管中最下层红细胞，加入8倍量的纯注射用水，裂解红细胞3min，离心取细胞沉淀，计数冻存。
将步骤B1离心的脐血血浆可用于细胞冷冻，作为细胞冷冻保护液，成分明确。
优选地，步骤B中，获得的脐血多能干细胞留样进行复检，复检项目为甲肝、甲肝、乙肝、丙肝、艾滋、梅毒、巨细胞病毒、巨细胞的病毒免疫学检测及基因检测。
优选地，步骤B中，所述冷冻处理采用的细胞冷冻保护液由质量百分数为80％脐血自体血浆、10％人血白蛋白和10％DMSO配制而成。所述细胞冷冻保护液成分明确符合临床标准，没有其他动物蛋白，便于临床应用。
优选地，所述脐血自体血浆为经步骤B1离心后所得的上清血浆。
优选地，步骤C中，所述细胞的混入量为1×107个/ml；所述生理盐水、人血白蛋白溶液和脐血自体血浆的混合比例为：8:1:1。
优选地，所述脐血自体血浆为经步骤B1离心后所得的上清血浆。
本发明用脐血本身自体血浆作为冻存保护剂，用于保护冷冻细胞的活性。完全不用培养基，避免了由于目前市面的基础培养基和血清替代物以及添加的因子中含有的不明动物源蛋白进入人体引起的潜在风险。
本发明制备的脐血单核细胞，富含脐血多能干细胞，可用于替代骨髓干细胞进行疾病修复研究和临床替代其他造血干细胞移植。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、全过程全面质量监控，从脐带采集前的筛选开始直至细胞制备成成品中间品及终产品的质量全部受控。
2、无培养基，不使用抗生素，避免异源蛋白及抗生素可能引起的疾病或过敏风险。
3、避免回输时红细胞引起的负面作用。
4、保持细胞的活性及干细胞的干性。
5、本发明采用HES分离法，并进行改进，使得脐血中多能干细胞得到极大保留，细胞回收率可高达82％，红细胞也可以极大的剔除。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供一种符合临床用脐血多能干细胞生产纯化方法，具体包括如下步骤：
步骤一，从合作医院获得合格的脐血(样本1)，采集放入血液保存袋中，并冷藏保存；
步骤二，进行脐血多能干细胞分离处理使用方法“HES分离法”，获得脐血多能细胞，进行冷冻处理；具体处理步骤为：将输血袋中的脐血平均分配到50ml离心管中，每管35ml；2000r/min离心10min；离心结束，取上层血浆备用(即得脐血自体血浆)；然后在离心管中加入25％HES混匀,低温离心1600r/min离心10min，离心温度维持4-6℃；吸出上层液体，弃最下层红细胞(去掉的下层红细胞为吸出上清液后离心管中的最下层红细胞)，加入8倍量的纯注射用水，裂解红细胞3min，离心取细胞沉淀，计数收集细胞并计数和活率(细胞仪计数)，细胞计数结果如表1所示，按5×107/ml/管进行冷冻保存，采用80％的脐血自体血浆、10人血白蛋白和10％的二甲基亚砜作为冷冻保护剂；将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，检测结果如表2所示。
步骤三，脐血多能干细胞成分鉴定：脐血单个核细胞CD34/CD45抗原表达及HSC-CFU培养。细胞CD34表达和CFU集落形成结果如表3所示。
步骤四，临床用脐血多能干细胞使用：冷冻细胞复苏后用生理盐水洗涤一遍，再用纯注射用水50ml裂解红细胞一遍，再用生理盐水洗涤细胞一次，后再次计数和活率，并留样进行内毒素和细菌检测，结果如表4所示。再按照1*107个/ml装入80％生理盐水、10％人血白蛋白和10％脐血自体血浆保存液中，待用。
表1冷冻前细胞计数仪计数结果
表2冻存前细胞无菌检测及支原体检测
检测指标 无菌检测 支原体检测
样本1 合格 合格
表3冻存前细胞CD34表达和CFU集落形成结果
检测指标 CD34/CD45的百分率 CFU-集落数
样本1 0.92％ 58个/105
表4复苏后细菌检测、内毒素检测以及细胞数和活率
从表1和4的检测结果可知，细胞冷冻复苏后的有核细胞总数及活率与冷冻前的细胞总数(40.32×107)和活率(96％)无明显下降。
实施例2
本实施例提供一种符合临床用脐血多能干细胞生产纯化工艺，具体包括如下步骤：
步骤一，从合作医院获得合格的脐血(样本2)，采集放入血液保存袋中，并冷藏保存；
步骤二，进行脐血多能干细胞分离处理使用方法“HES分离法”，获得脐血多能细胞，进行冷冻处理；具体处理步骤为：将输血袋中的脐血平均分配到50ml离心管中，每管35ml；2000r/min离心10min；离心结束，取上层血浆备用(即得脐血自体血浆)；然后在离心管中加入25％HES混匀,低温离心1600r/min离心10min，离心温度维持4-6℃；吸出上层液体，弃最下层红细胞(去掉的下层红细胞为吸出上清液后离心管中的最下层红细胞)，加入8倍量的纯注射用水，裂解红细胞3min，离心取细胞沉淀，计数收集细胞并计数和活率(细胞仪计数)，细胞计数结果如表1所示，按5×107/ml/管进行冷冻保存，采用80％的脐血自体血浆、10人血白蛋白和10％的二甲基亚砜作为冷冻保护剂；将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，检测结果如表2所示。
步骤三，脐血多能干细胞成分鉴定：脐血单个核细胞CD34/CD45抗原表达及HSC-CFU培养。细胞CD34表达和CFU集落形成结果如表3所示。
步骤四，临床用脐血多能干细胞使用：冷冻细胞复苏后用生理盐水洗涤一遍，再用纯注射用水50ml裂解红细胞一遍，再用生理盐水洗涤细胞一次，后再次计数和活率，并留样进行内毒素和细菌检测，结果如表4所示。再按照1*107个/ml装入80％生理盐水、10％人血白蛋白和10％脐血自体血浆保存液中，待用。
表5冷冻前细胞计数仪计数结果
表6冻存前细胞无菌检测及支原体检测
检测指标 无菌检测 支原体检测
样本2 合格 合格
表7冻存前细胞CD34表达和CFU集落形成结果
检测指标 CD34/CD45的百分率 CFU-集落数
样本2 0.93％ 62个/105
表8复苏后细菌检测、内毒素检测以及细胞数和活率
从表5和8的检测结果可知，细胞冷冻复苏后的有核细胞总数及活率与冷冻前的细胞总数(45.97×107)和活率(97％)无明显下降。
实施例3
本实施例提供一种符合临床用脐血多能干细胞生产纯化方法，具体包括如下步骤：
步骤一，从合作医院获得合格的脐血(样本3)，采集放入血液保存袋中，并冷藏保存；
步骤二，进行脐血多能干细胞分离处理使用方法“HES分离法”，获得脐血多能细胞，进行冷冻处理；具体处理步骤为：将输血袋中的脐血平均分配到50ml离心管中，每管35ml；2000r/min离心10min；离心结束，取上层血浆备用(即得脐血自体血浆)；然后在离心管中加入25％HES混匀,低温离心1600r/min离心10min，离心温度维持4-6℃；吸出上层液体，弃最下层红细胞(去掉的下层红细胞为吸出上清液后离心管中的最下层红细胞)，加入8倍量的纯注射用水，裂解红细胞3min，离心取细胞沉淀，计数收集细胞并计数和活率(细胞仪计数)，细胞计数结果如表1所示，按5×107/ml/管进行冷冻保存，采用80％的脐血自体血浆、10人血白蛋白和10％的二甲基亚砜作为冷冻保护剂；将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，检测结果如表2所示。
步骤三，脐血多能干细胞成分鉴定：脐血单个核细胞CD34/CD45抗原表达及HSC-CFU培养。细胞CD34表达和CFU集落形成结果如表3所示。
步骤四，临床用脐血多能干细胞使用：冷冻细胞复苏后用生理盐水洗涤一遍，再用纯注射用水50ml裂解红细胞一遍，再用生理盐水洗涤细胞一次，后再次计数和活率，并留样进行内毒素和细菌检测，结果如表4所示。再按照1*107个/ml装入80％生理盐水、10％人血白蛋白和10％脐血自体血浆制得的保存液中，待用。
表9冷冻前细胞计数仪计数结果
表10冻存前细胞无菌检测及支原体检测
检测指标 无菌检测 支原体检测
样本3 合格 合格
表11冻存前细胞CD34表达和CFU集落形成结果
检测指标 CD34/CD45的百分率 CFU-集落数
样本3 0.91％ 60个/105
表12复苏后细菌检测、内毒素检测以及细胞数和活率
从表9和12的检测结果可知，细胞冷冻复苏后的有核细胞总数及活率与冷冻前的细胞总数(40.05×107)和活率(97％)无明显下降。
上述检测结果及表13的结果显示，本发明方法制备的脐血单核细胞的各项标准均符合临床应用要求。
表13传统脐血单核细胞分离效果对比
方法 单核细胞回收率 红细胞残留量 活率
淋巴分离液 行业平均值35％ 行业平均值5％ >90％
HES 行业平均值90％ 行业平均值30％ >90％
本实验方式 本实验室平均值80％ 本实验室平均值8％ >90％
本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种符合临床用脐血多能干细胞生产纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤A，采集脐血放入血液保存袋中，并冷藏保存；
步骤B，采用HES分离法对脐血有核细胞进行分离处理，获得的脐血单核细胞进行冷冻处理；
步骤C，冷冻细胞复苏后用生理盐水洗涤，再用纯注射用水裂解红细胞，再用生理盐水洗涤，进行计数和活率测定，并留样进行内毒素和细菌检测，根据计数结果按临床需要将细胞与保存液按比例混匀待用，即可。
2.如权利要求1所述符合临床用脐血多能干细胞生产纯化方法，其特征在于，步骤A中，所述分离获得的脐带来源于健康产妇，年龄18-45岁，无急、慢性疾病和传染病，肝功能检测正常，遗传病家族史检测正常，胎儿为成熟足月分娩，非死、畸胎，无新生儿窒息、水肿和黄疸。
3.如权利要求1所述的符合临床用脐血多能干细胞生产纯化方法，其特征在于，步骤A中，所述血液保存袋采用医用输血保存袋，不含抗生素，符合临床输血标准。
4.如权利要求1所述的符合临床用脐血多能干细胞生产纯化方法，其特征在于，步骤A中，所述冷藏保存的温度为4℃，并在24小时内进行分离处理。
5.如权利要求1所述的符合临床用脐血多能干细胞生产纯化方法，其特征在于，步骤B中，所述HES分离法的具体处理步骤为：
B1、将输血袋中的脐血平均分配到离心管中，2000r/min离心10min；
B2、离心结束，取上层血浆备用；然后在离心管中加入25％HES混匀,低温离心1600r/min离心10min，离心温度维持4-6℃；吸出上层液体，并弃离心管中最下层红细胞，加入8倍量的纯注射用水，裂解红细胞3min，再离心取细胞沉淀，计数冻存。
6.如权利要求1所述的符合临床用脐血多能干细胞生产纯化方法，其特征在于，步骤B中，获得的脐血多能干细胞留样进行复检，复检项目为甲肝、甲肝、乙肝、丙肝、艾滋、梅毒、巨细胞病毒、巨细胞的病毒免疫学检测及基因检测。
7.如权利要求1所述的符合临床用脐血多能干细胞生产纯化方法，其特征在于，步骤B中，所述冷冻处理采用的细胞冷冻保护液由质量百分数为80％脐血自体血浆、10％人血白蛋白和10％DMSO配制而成。
8.如权利要求7所述的符合临床用脐血多能干细胞生产纯化方法，其特征在于，所述脐血自体血浆为经步骤B1离心后所得的上清血浆。
9.如权利要求1所述的符合临床用脐血多能干细胞生产纯化方法，终产品其特征在于，步骤C中，所述细胞按1×107个/ml与保存液混合；所述保存液包括生理盐水、人血白蛋白溶液和脐血自体血浆形成的混合液，所述生理盐水、人血白蛋白溶液和脐血自体血浆的混合比例为：8:1:1。
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