CN107091799A - 一种血液细胞稳定剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血液细胞稳定剂及其应用，属于细胞保护剂技术领域。该血液细胞稳定剂包括A液和B液，A液为用于维持细胞物理性质的保存液，B液为用于固定细胞的固定液；其中，A液包括以下质量百分数的组分：抗凝剂1‑10％、磷酸酶抑制剂1‑10％、蛋白酶抑制剂0.005‑1％；B液包括以下质量百分数的组分：醛类聚合物0.1‑5％、碱性盐0.1‑5％、HCl‑tris缓冲体系0.1‑5％。该血液细胞稳定剂使得血液中的血液成份和细胞能够保存192小时以上，并且无需低温处理，经处理的血液样品不会影响样品的后续分子检测，可广泛应用于血液样品中细胞成分的免疫分析、核酸分析或蛋白质分析相关实验。
Description
技术领域
本发明涉及细胞保护技术领域，具体涉及一种能够保持血液成分的形态、血液中细胞的表面抗原特性、细胞核的完整性和核酸稳定性的血液细胞稳定剂及其应用。
背景技术
全血样品采集时由于外周环境的温度、pH和氧气质量百分数发生了变化，血液离开人体后血小板会释放促凝因子，引起血液凝固，同时血液细胞也会由于环境的变化而丧失细胞的紧密度，从而死亡。这个过程中，血浆的各组分和血液中细胞成分的物理化学特性和生物标志物(包括蛋白、核酸、小分子等)也会发生改变，从而影响血液样本中具有诊断意义的检测结果。特别是在肿瘤疾病的体外诊断中，血液样本中的白细胞及肿瘤细胞的保存对检测结果具有十分关键的影响。因此，稳定血液样品，特别是稳定血液样本中的白细胞、肿瘤细胞，对于血样品的运输和临床试验流程的操作极为重要，必须对血液进行恰当的保存固定使得血液细胞呈现最好的状态。
目前，保存血液的经典方法是全血样品采集时加入普通抗血液抗凝试剂后，6小时内(最多不超过12小时)需对血液进行分析或者其他处理。目前常见的抗凝试剂有EDTA，EDTA主要用于螯合钙离子，阻止了许多的酶促反应而直接或者间接地防止了血液凝固。但是像EDTA这种常规的血液抗凝剂，对血液中的细胞没有保护作用：在加了抗凝剂的血液中细胞仍然会随着时间的推移而发生衰亡，不能保持血液细胞表面抗原的状态。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种血液细胞稳定剂及其应用，该血液细胞稳定剂使得血液中的血液成份和细胞能够保存192小时以上，并且无需低温处理，经处理的血液样品不会影响样品的后续分子检测，可广泛应用于血液样品中细胞成分的免疫分析、核酸分析或蛋白质分析的相关实验。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种血液细胞稳定剂，其包括A液和B液，其中，按A液总质量计，A液包括以下质量百分数的组分：抗凝剂1-10％、磷酸酶抑制剂1-10％、蛋白酶抑制剂0.005-1％，余量为水；按B液总质量计，B液包括以下质量百分数的组分：醛类聚合物0.1-5％、碱性盐0.1-5％、HCl-Tris缓冲体系(盐酸和三羟甲基氨基甲烷缓冲体系)0.1-5％，余量为水。其中，A液为用于维持细胞物理性质的保存液，B液为用于固定细胞的固定液；
作为本发明优选的实施方案，所述血液细胞稳定剂的渗透压为320-400mOsm/kg，pH值为4.5-8。
优选地，在本发明所述的血液细胞稳定剂中，所述抗凝剂选自EDTA、柠檬酸盐、氟化钾或肝素钠中的一种或多种的组合。更优选地，所述抗凝剂选自EDTA或柠檬酸盐。
优选地，在本发明所述的血液细胞稳定剂中，所述磷酸酶抑制剂选自氟化钠、原矾酸钠、甘油磷酸钠、焦磷酸钠或四咪唑盐酸盐中的一种或多种的组合。更优选地，所述磷酸酶抑制剂为四咪唑盐酸盐。
优选地，在本发明所述的血液细胞稳定剂中，所述蛋白酶抑制剂选自4-(2-氨乙基)苯磺酰氟、苯甲基磺酰氟、亮肽素、抑肽酶、胃蛋白酶抑制剂或EDTA-Na2中的一种或多种的组合。更优选地，所述蛋白酶抑制剂为4-(2-氨乙基)苯磺酰氟。
优选地，在本发明所述的血液细胞稳定剂中，所述醛类聚合物选自甲醛聚合物、乙醛聚合物或丙醛聚合物。
优选地，在本发明所述的血液细胞稳定剂中，所述碱性盐选自氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。
本发明还提供了一种用于稳定血液细胞，特别是稳定血液细胞中的白细胞、肿瘤细胞的试剂盒，其包括上述血液细胞稳定剂，其中A液和B液分开放置。
本发明还提供一种稳定血液细胞的方法，具体地，本发明所述血液细胞稳定剂的应用方法如下：在使用前先将A液和B液混合后静置15-120min，然后加入新鲜的血液中对血液细胞固定1-192h。
优选地，在本发明所述的方法中，A液和B液按照0.5-2∶0.5-2的体积比混合；更优选地，A液与B液按照1∶1的比例混合。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明所述的血液细胞稳定剂具有保护组织细胞的作用，对蛋白质、酶等缓慢固定的化学物质，具有稳定血液细胞、保持血液细胞原有的形态、维持血液细胞原有的物理性质，能够很好地固定血液中的细胞；特别是在稳定保护血液细胞中的白细胞、肿瘤细胞中，具有非常好的效果。该血液细胞稳定剂使得血液中的血液成份和细胞能够保存192小时以上，并且无需低温处理，经处理的血液样品不会影响后续的样品分子分析，可广泛应用于血液样品中细胞成分的免疫分析、核酸分析或蛋白质分析的相关实验。
附图说明
图1为本发明血液溶血实验中对照组于1h、24h、96h、192h的观察图；
图2为本发明血液溶血实验中实验组于1h、24h、96h、192h的观察图；
图3为本发明细胞完整实验中实验组MCF-7循环肿瘤细胞的FITC绿色荧光染色图；
图4为本发明细胞完整实验中实验组单组MCF-7循环肿瘤细胞的FITC绿色荧光染色图；
图5为本发明细胞完整实验中实验组MCF-7循环肿瘤细胞的细胞核DAPI染色图；
图6为本发明细胞完整实验中实验组白细胞的细胞核DAPI染色图；
图7为本发明细胞完整实验中实验组单个白细胞的细胞核DAPI染色图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
一种血液细胞稳定剂，其包括A液和B液，A液为用于维持细胞物理性质的保存液，B液为用于固定细胞的固定液；其中，A液包括以下质量百分数的组分：抗凝剂1-10％、磷酸酶抑制剂1-10％、蛋白酶抑制剂0.005-1％、余量为水；B液包括以下质量百分数的组分：醛类聚合物0.1-5％、碱性盐0.1-5％、缓冲剂0.1-5％、余量为水。
血液细胞稳定剂的渗透压为320～400mOsm/kg、pH值为4.5-8。抗凝剂选自EDTA、柠檬酸盐、氟化钾、肝素钠中的一种或多种的混合物。磷酸酶抑制剂选自氟化钠、原矾酸钠、甘油磷酸钠、焦磷酸钠、四咪唑盐酸盐中的一种或多种的混合物。蛋白酶抑制剂选自4-(2-氨乙基)苯磺酰氟、苯甲基磺酰氟、亮肽素、抑肽酶、胃蛋白酶抑制剂、EDTA-Na2中的一种或多种的混合物。醛类聚合物选自甲醛聚合物、乙醛聚合物或丙醛聚合物。碱性盐选自氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。所述水为MilliQ H2O。
本发明还提供了上述血液细胞稳定剂在稳定血液细胞中的应用。具体地，血液细胞稳定剂在使用前先将A液和B液混后静置合15-120min，然后加入新鲜的血液中对血液细胞固定1～192h。优选地，A液和B液按照0.5-2∶0.5-2的比例混合。
实施例1
一种血液细胞稳定剂，其包括A液和B液，A液为用于维持细胞物理性质的保存液，B液为用于固定细胞的固定液；其中，A液包括以下质量百分数的组分：EDTA 5％、氟化钠5％、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟0.5％、水89.5％；B液包括以下质量百分数的组分：甲醛聚合物2.5％、氢氧化钠溶液2.5％、HCl-tris缓冲体系2.5％、水92.5％。
实施例2
一种血液细胞稳定剂，其包括A液和B液，A液为用于维持细胞物理性质的保存液，B液为用于固定细胞的固定液；其中，A液包括以下质量百分数的组分：柠檬酸盐7％、原矾酸钠4％、苯甲基磺酰氟0.7％、水88.3％；B液包括以下质量百分数的组分：乙醛聚合物3％、氢氧化钾溶液4％、HCl-tris缓冲体系2％、水91％。
实施例3
一种血液细胞稳定剂，其包括A液和B液，A液为用于维持细胞物理性质的保存液，B液为用于固定细胞的固定液；其中，A液包括以下质量百分数的组分：氟化钾4％、甘油磷酸钠6％、亮肽素1％、水89％；B液包括以下质量百分数的组分：丙醛聚合物2％、氢氧化钠溶液5％、HCl-tris缓冲体系1％、水92％。
实施例4
一种血液细胞稳定剂，其包括A液和B液，A液为用于维持细胞物理性质的保存液，B液为用于固定细胞的固定液；其中，A液包括以下质量百分数的组分：肝素钠8％、焦磷酸钠6％、抑肽酶0.6％、水85.4％；B液包括以下质量百分数的组分：甲醛聚合物1％、氢氧化钾溶液5％、HCl-tris缓冲体系4％、水90％。
实施例5
一种血液细胞稳定剂，其包括A液和B液，A液为用于维持细胞物理性质的保存液，B液为用于固定细胞的固定液；其中，A液包括以下质量百分数的组分：EDTA 4％、四咪唑盐酸盐7％、胃蛋白酶抑制剂0.8％、水88.2％；B液包括以下质量百分数的组分：乙醛聚合物4％、氢氧化钾溶液3％、HCl-tris缓冲体系2％、水91％。
实施例6
一种血液细胞稳定剂，其包括A液和B液，A液为用于维持细胞物理性质的保存液，B液为用于固定细胞的固定液；其中，A液包括以下质量百分数的组分：肝素钠3％、原矾酸钠8％、EDTA-Na2 1％、水88％；B液包括以下质量百分数的组分：丙醛聚合物5％、氢氧化钠溶液1％、HCl-tris缓冲体系1％、水93％。
实施例7
血液溶血实验
将实施例1中的A液和B液按1∶1的体积比预先混合后静置15min得到的血液细胞稳定剂作为实验组，配制0.9％生理盐水作为对照组。取新鲜血液分成2组，每组8ml，向两组血液中分别加入8ml已经混合好的血液细胞稳定剂和0.9％生理盐水，血液样本在常温保存。分别于保存后的1h，24h，96h，192h四个不同的时间点，将固定后样本颠倒混匀后，目视观察是否有血液凝固；若无凝固，将血液样本进行离心，离心后，观察是否出现溶血现象，结果见图1、图2及表1。
表1实验组和对比组血液溶血实验离心结果
由图1、图2及表1可知，对比组24小时内出现了溶血现象并随着时间加深、96h内开始出现血液现象，而加了血液细胞稳定剂的实验组可保存血液至192小时并且不会出现溶血和血液凝固现象，能够较好地维持血液细胞的原有形态和物理性质。
实施例8
细胞完整性实验
将实施例1中的A液和B液按1∶1的体积比预先混合后静置15min以上作为实验组，配制0.9％生理盐水作为对照组。取新鲜血液8组，每组8ml。其中4组加入8ml已经混合好的血液细胞稳定剂并混匀，另取4组加入8ml 0.9％生理盐水并混匀。向8组样本均投入240个已经计数好的MCF-7循环肿瘤细胞。将上述8组血液样本置于常温下保存，然后按照保存后的1h，24h，96h，192h四个不同的时间点固定后，将血液样本进行离心，将离心后的血浆移除，然后加入红细胞裂解液进行红细胞裂解；裂解后进行离心，移除上清液后，用细胞结合缓冲液对细胞进行清洗，然后再次离心；用细胞结合缓冲液重悬白细胞，然后加入FcR封闭剂，冰上反应10min，然后加入已标记生物素捕获抗体进行低温孵育30分钟。孵育后，使用细胞清洗液对细胞进行清洗，以洗脱多余的未结合的抗体；接着进行离心，移除上清液后加入磁珠、染色剂(DAPI)，然后在鞘流环境中捕获MCF-7循环肿瘤细胞和白细胞，在荧光显微镜下观察回收的细胞细胞核是否完整，对MCF-7循环肿瘤细胞进行计数，计算回收率。结果见图3～图7及表2。
表2MCF-7循环肿瘤细胞的细胞回收率对比
由图3-图5可知，FITC绿色荧光染色和DAPI染色显示下的MCF-7循环肿瘤细胞形态完整、清楚，说明细胞是完整的，并可以与抗体抗-细胞角蛋白(CK+)结合；由图6和图7可知，DAPI染色显示下的白细胞的细胞膜完整且可以被抗体结合并染色；通过计算细胞回收率，实验组的血液白细胞的细胞核与MCF-7循环肿瘤细胞的细胞核是完整的，且回收率达80％以上；而对照组的保存1h后细胞回收率低于30％，并且24h后已经捕获不到MCF-7循环肿瘤。
综上所述，本发明的血液细胞稳定剂可保存血液192h，且不会出现溶血和血液凝固现象，并保持细胞表面抗原特性和细胞核完整性，利于对细胞进行血液样品中细胞成分的免疫分析、核酸分析或蛋白质分析实验。
实施例9
一种血液细胞稳定剂，其包括A液和B液，A液为用于维持细胞物理性质的保存液，B液为用于固定细胞的固定液；其中，A液包括以下质量百分数的组分：柠檬酸盐5％、四咪唑盐酸盐5％、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟0.5％、水89.5％；B液包括以下质量百分数的组分：丙醛聚合物2.5％、氢氧化钠溶液2.5％、HCl-tris缓冲体系2.5％、水92.5％。
实施例10
一种血液细胞稳定剂，其包括A液和B液，A液为用于维持细胞物理性质的保存液，B液为用于固定细胞的固定液；其中，A液包括以下质量百分数的组分：EDTA 5％、四咪唑盐酸盐5％、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟0.5％、水89.5％；B液包括以下质量百分数的组分：甲醛聚合物2.5％、氢氧化钠溶液2.5％、HCl-tris缓冲体系2.5％、水92.5％。
实施例11
一种血液细胞稳定剂，其包括A液和B液，A液为用于维持细胞物理性质的保存液，B液为用于固定细胞的固定液；其中，A液包括以下质量百分数的组分：EDTA5％、氟化钠5％、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟0.5％、水89.5％；B液包括以下质量百分数的组分：甲醛铵(formaldehyde-ammonium)2.5％、氢氧化钠溶液2.5％、HCl-tris缓冲体系2.5％、水92.5％。
实施例12
一种血液细胞稳定剂，其包括A液和B液，A液为用于维持细胞物理性质的保存液，B液为用于固定细胞的固定液；其中，A液包括以下质量百分数的组分：EDTA5％、氟化钠5％、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟0.5％、水89.5％；B液包括以下质量百分数的组分：丙醛聚合物8％、氢氧化钠溶液2.5％、HCl-tris缓冲体系2.5％、水87％。
实施例13
一种血液细胞稳定剂，其包括A液和B液，A液为用于维持细胞物理性质的保存液，B液为用于固定细胞的固定液；其中，A液包括以下质量百分数的组分：EDTA12％、氟化钠5％、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟0.5％、水82.5％；B液包括以下质量百分数的组分：丙醛聚合物2.5％、氢氧化钠溶液2.5％、HCl-tris缓冲体系2.5％、水92.5％。
实施例14
一种血液细胞稳定剂，其包括A液和B液，A液为用于维持细胞物理性质的保存液，B液为用于固定细胞的固定液；其中，A液包括以下质量百分数的组分：柠檬酸盐5％、四咪唑盐酸盐5％、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟2％、水88％；B液包括以下质量百分数的组分：丙醛聚合物2.5％、氢氧化钠溶液2.5％、HCl-tris缓冲体系2.5％、水92.5％。
实施例15
一种血液细胞稳定剂，其包括A液和B液，A液为用于维持细胞物理性质的保存液，B液为用于固定细胞的固定液；其中，A液包括以下质量百分数的组分：柠檬酸盐5％、四咪唑盐酸盐5％、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟4％、水86％；B液包括以下质量百分数的组分：丙醛聚合物2.5％、氢氧化钠溶液2.5％、HCl-tris缓冲体系2.5％、水92.5％。
血液溶血实验(对比)
表3实验组及其组分
| 实验组 | 组分(体积比) |
| Ⅰ | 按照实施例9制备，A液∶B液为1∶4 |
| Ⅱ | 按照实施例9制备，A液∶B液为4∶1 |
| Ⅲ | 按照实施例9制备，A液∶B液为1∶1 |
| Ⅳ | 按照实施例9制备，A液∶B液为1∶5 |
| Ⅴ | 按照实施例9制备，A液∶B液为5∶1 |
| VI | 按照实施例10制备，A液∶B液为1∶1 |
| VII | 按照实施例10制备，A液∶B液为1∶2 |
表4对照组及其组分
| 对照组 | 组分 |
| ① | 按照实施例11制备，A液∶B液为1∶1 |
| ② | 按照实施例12制备，A液∶B液为1∶1 |
| ③ | 按照实施例13制备，A液∶B液为1∶1 |
| ④ | 按照实施例14制备，A液∶B液为1∶1 |
| ⑤ | 按照实施例15制备，A液∶B液为1∶1 |
实验方法同实施例7。
实验结果如表5所示。
表5实验组血液溶血实验结果
由实验组结果可知，实施例9，A液∶B液为1∶5时，96h内出现了溶血和192小时内出现血液凝固现象，溶血现象随着时间加深，但细胞回收率均＞70％；A液∶B液为5∶1时，192h内无溶血和血液凝固现象，细胞回收率24h后＜70％，并持续下降；A液∶B液为1∶4时，192h内无溶血和血液凝固现象，细胞回收率仅＞70％；A液∶B液为4∶1时，192h内无溶血和血液凝固现象，细胞回收率仅＞70％；A液∶B液为1∶1时，192h内无溶血和血液凝固现象，细胞回收率均＞90％，条件最佳。实施例10中，A液∶B液为1∶1时，192h内无溶血和血液凝固现象，细胞回收率均＞90％；A液∶B液为1∶2时，192h内无溶血和血液凝固现象，细胞回收率＞80％。故A液∶B液为1∶1条件优于A液∶B液为1∶2。
表6对照组血液溶血实验结果
由对照组实验①结果可知，192h内无溶血和血液凝固现象，细胞回收率24h后＜20％，说明未对循环肿瘤细胞起固定效果，未能保持细胞表面抗原特性；
由对照组实验②结果可知，醛聚合物浓度达到8％时，192h内无溶血和血液凝固现象，细胞回收率均＜70％，说明醛聚合物浓度过高会影响细胞回收率；
由对照组实验③结果可知，EDTA浓度达到12％时，192h内无溶血和血液凝固现象，细胞回收率均＜70％，说明血液抗凝剂浓度过高会影响细胞回收率；
由对照组实验④和⑤的结果可知，4-(2-氨乙基)苯磺酰氟浓度达到2％以上时，192h内无溶血和血液凝固现象，但细胞回收率均＜70％，并且浓度越高影响越大。说明蛋白酶抑制剂浓度过高会影响细胞回收率。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种血液细胞稳定剂，其特征在于：包括A液和B液；其中，A液包括以下组分：抗凝剂、磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂；B液包括以下组分：醛类聚合物、碱性盐、缓冲剂；其中，A液和B液按照0.5-2∶0.5-2的体积比混合。
2.根据权利要求1所述的血液细胞稳定剂，其特征在于：A液和B液按照1∶1的体积比混合。
3.根据权利要求2所述的血液细胞稳定剂，其特征在于：所述抗凝剂选自EDTA、柠檬酸盐、氟化钾或肝素钠中的一种或多种的组合。
4.根据权利要求3所述的血液细胞稳定剂，其特征在于：所述磷酸酶抑制剂选自氟化钠、原矾酸钠、甘油磷酸钠、焦磷酸钠或四咪唑盐酸盐中的一种或多种的组合。
5.根据权利要求4所述的血液细胞稳定剂，其特征在于：所述蛋白酶抑制剂选自4-(2-氨乙基)苯磺酰氟、苯甲基磺酰氟、亮肽素、抑肽酶、胃蛋白酶抑制剂或EDTA-Na2中的一种或多种的组合。
6.根据权利要求5所述的血液细胞稳定剂，其特征在于：所述醛类聚合物选自甲醛聚合物、乙醛聚合物或丙醛聚合物。
7.根据权利要求1所述的血液细胞稳定剂，其特征在于，按A液总质量计，A液包括以下质量百分数的组分：抗凝剂1-10％、磷酸酶抑制剂1-10％、蛋白酶抑制剂0.005-1％；
按B液总质量计，B液包括以下质量百分数的组分：醛类聚合物0.1-5％、碱性盐0.1-5％、缓冲剂0.1-5％；
优选地，所述缓冲剂为HCl-Tris的缓冲体系。
8.根据权利要求1中所述的血液细胞稳定剂在稳定血液中白细胞、肿瘤细胞中的应用。
9.一种用于稳定血液细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-7中任一项所述的血液细胞稳定剂，其中A液和B液分开放置。
10.一种稳定血液细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以上步骤：在使用前先将A液和B液混合后静置15-120min，然后加入新鲜的血液中对血液细胞固定1-192h；
优选地，在所述方法中，A液和B液按照0.5-2∶0.5-2的体积比混合；更优选地，A液与B液按照1∶1的体积比混合。
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