CN116686824A - 血液样本保存液及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请属于生物医学技术领域，尤其涉及一种血液样本保存液及其制备方法和应用。其中，血液样本保存液包括组分：抗凝剂、防腐剂、游离醛淬灭剂、血小板凝集抑制剂和膜蛋白保护剂，其中，所述膜蛋白保护剂包括细胞膜保护剂、代谢酶抑制剂、蛋白酶抑制剂的至少一种。本申请提供的血液样本保存液，通过血液样本保存液中各组分的共同作用，能够保持血液样本中细胞数量与完整性，同时可以减少血液中出现的红细胞和血小板的聚集，有利于后续对待测细胞的收集和检测，使得下游检测可以得到最准确的结果。血液样本保存48h后仍能保持较好状态，不影响后续筛分。
Description
技术领域
本申请属于生物医学技术领域，尤其涉及一种血液样本保存液及其制备方法和应用。
背景技术
近十几年来恶性肿瘤的发病率和死亡率均呈持续上升态势。传统的肿瘤筛查诊断方法如组织活检，由于检测效果有限，取样困难等多方面原因，无法有效灵活的对肿瘤的发展过程进行全程的监控。循环肿瘤细胞(CTCs)是一种从原发或转移肿瘤脱落到外周血中的癌细胞，这些细胞的数量和表型可以为癌症的预后和治疗提供重要的信息。然而，CTCs在血液中含量极为稀少，一般1mL血液中只有几个CTCs并包含数百万个白细胞以及数十亿个红细胞，这为CTCs的分离与分析带来了巨大的挑战。
传统的采血管并不能长时间保存CTCs，在长时间的运输过程中，CTCs会逐渐衰减，血液也会出现凝血或溶血现象，这进一步为CTCs的检测带来了困难。为了最大程度地保存CTCs的数量，降低储存和运输成本，在应用过程中需要特殊的保存液发挥下述作用：1、保持循环肿瘤细胞数量与完整性，使得下游检测可以得到最准确的结果；2、减少血液中出现的红细胞或血小板的聚集，防止在收集循环肿瘤细胞时影响收集效率。
目前，市面上使用较多的采血管包括乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管、枸橼酸-枸橼酸葡萄糖(ACD)抗凝管，但是这两种采血管中CTCs均会随保存时间，数量不断衰减。CellSave和Streck采血管虽然可以较好的维持CTCs在血液中的稳定性，但是这些血液管保存的全血通常在采血24h内就发生较为严重的凝血，无法用于样本的长时间保存，不利于中长途运输。故而急需一种采血管，能长时间存储血液样本，保持较好的血液状态，减少凝血，且在这个过程中CTCs也要保持较好的状态，以提高后续筛分效果。
发明内容
本申请的目的在于提供一种血液样本保存液及其制备方法和应用，旨在一定程度上解决现有血液样本中CTCs不能长时间保存，在长时间存储过程中CTCs会衰减，血液也会出现凝血或溶血现象的问题。
为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：
第一方面，本申请提供一种血液样本保存液，所述血液样本保存液包括组分：抗凝剂、防腐剂、游离醛淬灭剂、血小板凝集抑制剂和膜蛋白保护剂，其中，所述膜蛋白保护剂包括细胞膜保护剂、代谢酶抑制剂、蛋白酶抑制剂的至少一种。
在一些可能的实现方式中，所述细胞膜保护剂包括聚乙二醇、山梨醇、邻苯二甲酸二辛酯、聚乙烯乙二醇中的至少一种。
在一些可能的实现方式中，所述代谢酶抑制剂包括氟化钠、甘油醛中的至少一种。
在一些可能的实现方式中，所述蛋白酶抑制剂包括4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐、苯甲基磺酰氟、胃蛋白酶抑制剂中的至少一种。
在一些可能的实现方式中，所述抗凝剂包括EDTA钠盐、EDTA钾盐、枸橼酸、枸橼酸纳、乙二胺四乙酸中的至少一种。
在一些可能的实现方式中，所述防腐剂包括咪唑烷基脲、重氮烷基脲、二唑烷基脲中的至少一种。
在一些可能的实现方式中，所述游离醛淬灭剂包括甘氨酸。
在一些可能的实现方式中，所述血小板凝集抑制剂包括替罗非班、乙酰基水盐酸、茶碱、腺苷中的至少一种。
在一些可能的实现方式中，所述血液样本保存液中溶剂包括生理盐水。
在一些可能的实现方式中，所述血液样本保存液与待保存样品的体积比为1：(5～20)。
在一些可能的实现方式中，所述血液样本保存液与所述待保存样品混合后，所述抗凝剂的浓度为1mg/mL～5mg/mL，所述防腐剂的浓度为5mg/mL～20mg/mL，所述游离醛淬灭剂的浓度为0.5mg/mL～5mg/mL，所述血小板凝集抑制剂的浓度为10μg/mL～100μg/mL，所述膜蛋白保护剂的浓度为0.1mg/mL～20mg/mL。
在一些可能的实现方式中，所述血液样本保存液中，所述膜蛋白保护剂至少具有如下任一特征：
所述细胞膜保护剂的浓度为0.05mg/mL～0.5mg/mL；
所述代谢酶抑制剂的浓度为0.1mg/mL～1mg/mL；
所述蛋白酶抑制剂的浓度为0.01mg/mL～0.1mg/mL。
第二方面，本申请提供一种上述的血液样本保存液的制备方法，包括步骤：将抗凝剂、防腐剂、游离醛淬灭剂、血小板凝集抑制剂和膜蛋白保护剂溶解在溶剂中，得到血液样本保存液；其中，所述膜蛋白保护剂包括细胞膜保护剂、代谢酶抑制剂、蛋白酶抑制剂的至少一种。
在一些可能的实现方式中，所述溶剂包括生理盐水。
在一些可能的实现方式中，述血液样本保存液与待保存样品混合后，所述抗凝剂的浓度为1mg/mL～5mg/mL，所述防腐剂的浓度为5mg/mL～20mg/mL，所述游离醛淬灭剂的浓度为0.5mg/mL～5mg/mL，所述血小板凝集抑制剂的浓度为10μg/mL～100μg/mL，所述膜蛋白保护剂的浓度为0.1mg/mL～20mg/mL；其中，所述膜蛋白保护剂中，所述细胞膜保护剂的浓度为0.05mg/mL～0.5mg/mL；和/或，所述代谢酶抑制剂的浓度为0.1mg/mL～1mg/mL；和/或，所述蛋白酶抑制剂的浓度为0.01mg/mL～0.1mg/mL。
第三方面，本申请提供一种上述的血液样本保存液，上述方法制备的血液样本保存液在循环肿瘤细胞保存中的应用。
本申请第一方面提供的血液样本保存液中，抗凝剂能够阻止血液凝固，防腐剂能够稳定细胞形态，游离醛淬灭剂能够淬灭游离醛基，血小板凝集抑制剂能够抑制血小板凝集。膜蛋白保护剂中包括的细胞膜保护剂能够保护细胞膜及其上的蛋白位点，提高检验准确度，代谢酶抑制剂能够降低或抑制细胞自身代谢，防止因自身代谢等内部因素导致的细胞损失影响检测结果，蛋白酶抑制剂能够降低蛋白酶的活力，但不会使蛋白酶变性，使细胞表面的蛋白位点完整保存，提高检测准确性。通过血液样本保存液中各组分的共同作用，能够保持血液样本中细胞数量与完整性，同时可以减少血液中出现的红细胞和血小板的聚集，有利于后续对待测细胞的收集和检测，使得下游检测可以得到最准确的结果。血液样本保存48h后仍能保持较好状态，不影响后续筛分。
本申请第二方面提供的血液样本保存液的制备方法，将抗凝剂、防腐剂、游离醛淬灭剂、血小板凝集抑制剂和膜蛋白保护剂溶解在溶剂中，便能得到血液样本保存液。制备方法简单，适用于工业化大规模生产和应用。通过血液样本保存液中各组分的共同作用，能够保持血液样本中细胞数量与完整性，同时可以减少血液中出现的红细胞和血小板的聚集，有利于后续对待测细胞的收集和检测，使得下游检测可以得到最准确的结果。
本申请第三方面提供的应用，将上述血液样本保存液应用到循环肿瘤细胞保存中，通过血液样本保存液中各组分的共同作用，能够保持血液样本中循环肿瘤细胞(CTCs)数量与完整性，同时可以减少血液中出现的红细胞和血小板的聚集，有利于后续对循环肿瘤细胞的收集和检测，使得下游检测可以得到最准确的结果。血液样本在保存液中保存的48h内CTCs均呈现稳定状态，CTCs无衰减，CTCs表面蛋白位点保存完整，上皮细胞黏附分子(EpCAM)信号与0h时保持同等水平。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请实施例提供的血液样本保存液的制备方法的流程示意图；
图2是本申请实施例7提供的血液保存液对全血样本保存4h、24h、48h后的荧光成像检测图。
具体实施方式
为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a，b或c中的至少一项(个)”，或，“a，b和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a，b，c，a-b(即a和b)，a-c，b-c，或a-b-c，其中a，b，c分别可以是单个，也可以是多个。
应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
本申请说明书实施例中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本申请说明书实施例相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请说明书实施例公开的范围之内。具体地，本申请说明书实施例中所述的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本申请实施例范围的情况下，第一XX也可以被称为第二XX，类似地，第二XX也可以被称为第一XX。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
本申请实施例第一方面提供一种血液样本保存液，血液样本保存液包括组分：抗凝剂、防腐剂、游离醛淬灭剂、血小板凝集抑制剂和膜蛋白保护剂，其中，膜蛋白保护剂包括细胞膜保护剂、代谢酶抑制剂、蛋白酶抑制剂中的至少一种。
本申请实施例第一方面提供的血液样本保存液中，包括抗凝剂、防腐剂、游离醛淬灭剂、血小板凝集抑制剂和膜蛋白保护剂。其中，抗凝剂能够阻止血液凝固，防腐剂能够稳定细胞形态，游离醛淬灭剂能够淬灭游离醛基，血小板凝集抑制剂能够抑制血小板凝集。另外，膜蛋白保护剂中包括的细胞膜保护剂能够保护细胞膜及其上的蛋白位点，提高检验准确度，代谢酶抑制剂能够降低或抑制细胞自身代谢，防止因自身代谢等内部因素导致的细胞损失影响检测结果，蛋白酶抑制剂能够降低蛋白酶的活力，但不会使蛋白酶变性，使细胞表面的蛋白位点完整保存，提高检测准确性。通过血液样本保存液中各组分的共同作用，能够保持血液样本中细胞数量与完整性，同时可以减少血液中出现的红细胞和血小板的聚集，有利于后续对待测细胞的收集和检测，使得下游检测可以得到最准确的结果。血液样本保存48h后仍能保持较好状态，不影响后续筛分。尤其是针对血液样本中循环肿瘤细胞(CTCs)，血液样本在保存液中保存的48h内CTCs均呈现稳定状态，CTCs无衰减，CTCs表面蛋白位点保存完整，上皮细胞黏附分子(EpCAM)信号与0h时保持同等水平。
在一些可能的实现方式中，细胞膜保护剂包括聚乙二醇、山梨醇、邻苯二甲酸二辛酯、聚乙烯乙二醇中的至少一种。本申请实施例采用的这些细胞膜保护剂，均能够较好的保护血液样本中细胞膜及其表面的蛋白位点，尤其是使CTCs表面蛋白位点保存完整，提高检验准确度。在一些具体实施例中，聚乙二醇(PEG)的质均分子量可以是1000～10000，具体可以是，PEG1000、PEG2000、PEG3000、PEG4000、PEG5000、PEG6000、PEG7000、PEG8000、PEG9000、PEG10000等。
在一些可能的实现方式中，代谢酶抑制剂包括氟化钠、甘油醛中的至少一种；本申请实施例采用的这些代谢酶抑制剂，均能够降低或抑制细胞自身代谢，保持血液样本中细胞数量与完整性，防止因自身代谢等内部因素导致细胞损失，影响结果。
在一些可能的实现方式中，蛋白酶抑制剂包括4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐、苯甲基磺酰氟、胃蛋白酶抑制剂中的至少一种。本申请实施例采用的这些蛋白酶抑制剂，均能够降低血液样本中蛋白酶的活力，甚至使血液样本中蛋白酶的活力消失，但又不使酶蛋白变性。从而保护血液样本中细胞膜及其表面的蛋白位点，提高后续检测的准确度。
在一些可能的实现方式中，抗凝剂包括EDTA钠盐、EDTA钾盐、枸橼酸、枸橼酸纳、乙二胺四乙酸中的至少一种。本申请实施例采用的这些抗凝剂通过与水相中的钙离子形成稳定的螯合物达到阻止血液凝固的目的，从而维持血液样本中细胞的状态。
在一些可能的实现方式中，防腐剂包括咪唑烷基脲、重氮烷基脲、二唑烷基脲中的至少一种。本申请实施例采用的这些防腐剂能够对细胞进行固定，稳定细胞的形态，保持血液样本中循环肿瘤细胞等细胞的数量与完整性。
在一些可能的实现方式中，游离醛淬灭剂包括甘氨酸；本申请实施例采用的甘氨酸能够淬灭游离醛基。血液样本保存液中如咪唑烷基脲等防腐剂在使用过程中会缓慢释放游离醛基，释放的游离醛会改变细胞的密度，在后续样本前处理过程中，如进行密度梯度离心时，会导致部分肿瘤细胞等待测细胞不在PBMC层(白膜层)，进而导致检测出的细胞数目低于真实值。因而通过在血液样本保存液中添加甘氨酸等游离醛淬灭剂，维持血液样本中细胞密度，提高检测真实性。
在一些可能的实现方式中，血小板凝集抑制剂包括替罗非班、乙酰基水盐酸、茶碱、腺苷中的至少一种。本申请实施例采用的这些抑制剂均能够抑制血小板凝集，使血液样本保持较好的血液状态，减少凝血，能够长时间存储血液样本。
在一些可能的实现方式中，血液样本保存液中溶剂包括生理盐水。本申请实施例采用的生理盐水浓度为0.9％(0.9g/100mL)的氯化钠溶液，生理盐水的渗透压与人体血液的渗透压是基本相等的，生理盐水的渗透压以及细胞外液的渗透压是等渗的。细胞在生理盐水里面可以维持正常的形态不变，也可以维持正常的生存膜特性不改变，细胞没有被固定，有利于维持血液样本中细胞的形态和活性。在一些具体实施例中，生理盐水采用0.22μm滤膜过滤。
在一些可能的实现方式中，血液样本保存液与待保存样品的体积比为1：(5～20)。在这种情况下，血液样本保存液的用量确保了对待保存样品的有效保存，既避免了血液样本保存液配比过高导致血液样本中细胞溶血的风险，又避免了血液样本保存液配比过低导致凝血等风险，无法有效保存样品。在一些具体实施例中，血液样本保存液与待保存样品的体积比典型但非限制性的可以是1：(5～10)、1：(10～15)、1：(15～20)等。
在一些可能的实现方式中，血液样本保存液与待保存样品混合后，抗凝剂的浓度为1mg/mL～5mg/mL，防腐剂的浓度为5mg/mL～20mg/mL，游离醛淬灭剂的浓度为0.5mg/mL～5mg/mL，血小板凝集抑制剂的浓度为10μg/mL～100μg/mL，膜蛋白保护剂的浓度为0.1mg/mL～20mg/mL。本申请实施例血液样本保存液与待保存样品混合后，抗凝剂、防腐剂、游离醛淬灭剂、血小板凝集抑制剂和膜蛋白保护剂等组分的浓度，能够有效维持血液样本中细胞数量与完整性，同时可以减少血液中出现的红细胞和血小板的聚集，有利于后续对待测细胞的收集和检测，使得下游检测可以得到最准确的结果。其中，抗凝剂的浓度同时避免了血液样本溶血和血液凝集的风险；防腐剂的浓度有利于维持循环肿瘤细胞等细胞的稳定性，维持细胞的形貌、密度等物理性质；游离醛淬灭剂的浓度能够有效淬灭血液样本中游离醛；血小板凝集抑制剂能够有效维持血液样本中血小板及白细胞的活性，减少血小板和白细胞的凝集；膜蛋白保护剂的浓度充分确保了血液样本中细胞检测信号的活性，有利于提高血液样本保存液中保存的待测样本的检测准确度和灵敏度。
在一些具体实施例中，血液样本保存液与待保存样品混合后，抗凝剂的浓度可以是1mg/mL～2mg/mL、2mg/mL～3mg/mL、3mg/mL～4mg/mL、4mg/mL～5mg/mL等，防腐剂的浓度为5mg/mL～7mg/mL、7mg/mL～10mg/mL、10mg/mL～13mg/mL、13mg/mL～15mg/mL、15mg/mL～18mg/mL、18mg/mL～20mg/mL等，游离醛淬灭剂的浓度为0.5mg/mL～1mg/mL、1mg/mL～2mg/mL、2mg/mL～3mg/mL、3mg/mL～4mg/mL、4mg/mL～5mg/mL等，血小板凝集抑制剂的浓度为10μg/mL～20μg/mL、20μg/mL～30μg/mL、30μg/mL～40μg/mL、40μg/mL～50μg/mL、50μg/mL～60μg/mL、60μg/mL～70μg/mL、70μg/mL～80μg/mL、80μg/mL～90μg/mL、90μg/mL～100μg/mL等，膜蛋白保护剂的浓度为0.1mg/mL～0.5mg/mL、0.5mg/mL～1mg/mL、1mg/mL～5mg/mL、5mg/mL～10mg/mL、10mg/mL～15mg/mL、15mg/mL～20mg/mL等。
在一些可能的实现方式中，血液样本保存液中，膜蛋白保护剂至少具有如下任一特征：
细胞膜保护剂的浓度为0.05mg/mL～0.5mg/mL；该浓度的细胞膜保护剂能够保护细胞膜及其上的蛋白位点，提高检验准确度。
代谢酶抑制剂的浓度为0.1mg/mL～1mg/mL；该浓度的代谢酶抑制剂能够降低或抑制细胞自身代谢，防止因自身代谢等内部因素导致的细胞损失影响检测结果。
蛋白酶抑制剂的浓度为0.01mg/mL～0.1mg/mL。该浓度的蛋白酶抑制剂能够降低蛋白酶的活力，但不会使蛋白酶变性，使细胞表面的蛋白位点完整保存，提高检测准确性。
在一些实施例中，血液样本保存液中膜蛋白保护剂包括细胞膜保护剂、代谢酶抑制剂或蛋白酶抑制剂中的一种。也可以是膜蛋白保护剂包含细胞膜保护剂、代谢酶抑制剂、蛋白酶抑制剂中的两种，如同时包含细胞膜保护剂和代谢酶抑制剂、代谢酶抑制剂和蛋白酶抑制剂、细胞膜保护剂和蛋白酶抑制剂等。也可以是膜蛋白保护剂同时包含细胞膜保护剂、代谢酶抑制剂、蛋白酶抑制剂三种。
在一些可能的实现方式中，血液样本保存液与待保存样品混合后，抗凝剂的浓度为1mg/mL～5mg/mL，防腐剂的浓度为5mg/mL～20mg/mL，游离醛淬灭剂的浓度为0.5mg/mL～5mg/mL，血小板凝集抑制剂的浓度为10μg/mL～100μg/mL，细胞膜保护剂的浓度为0.05mg/mL～0.5mg/mL；代谢酶抑制剂的浓度为0.1mg/mL～1mg/mL；蛋白酶抑制剂的浓度为0.01mg/mL～0.1mg/mL。
在进一步可能的实现方式中，血液样本保存液与待保存样品混合后，抗凝剂的浓度为1.5mg/mL～2.0mg/mL，防腐剂的浓度为5mg/mL～20mg/mL，游离醛淬灭剂的浓度为0.5mg/mL～5mg/mL，血小板凝集抑制剂的浓度为20μg/mL～100μg/mL，细胞膜保护剂的浓度为0.05mg/mL～0.5mg/mL；代谢酶抑制剂的浓度为0.1mg/mL～1mg/mL；蛋白酶抑制剂的浓度为0.01mg/mL～0.1mg/mL。
本申请实施例第二方面提供一种上述的血液样本保存液的制备方法，包括步骤：将抗凝剂、防腐剂、游离醛淬灭剂、血小板凝集抑制剂和膜蛋白保护剂溶解在溶剂中，得到血液样本保存液；其中，膜蛋白保护剂包括细胞膜保护剂、代谢酶抑制剂、蛋白酶抑制剂的至少一种。
本申请实施例第二方面提供的血液样本保存液的制备方法，将抗凝剂、防腐剂、游离醛淬灭剂、血小板凝集抑制剂和膜蛋白保护剂溶解在溶剂中，便能得到血液样本保存液。制备方法简单，适用于工业化大规模生产和应用。通过血液样本保存液中各组分的共同作用，能够保持血液样本中细胞数量与完整性，同时可以减少血液中出现的红细胞和血小板的聚集，有利于后续对待测细胞的收集和检测，使得下游检测可以得到最准确的结果。
本申请实施例制备的血液样本保存液，血液样本保存48h后仍能保持较好状态，不影响后续筛分。尤其是针对血液样本中循环肿瘤细胞(CTCs)，血液样本在保存液中保存的48h内CTCs均呈现稳定状态，CTCs无衰减，CTCs表面蛋白位点保存完整，上皮细胞黏附分子(EpCAM)信号与0h时保持同等水平。
在一些可能的实现方式中，溶剂包括生理盐水；生理盐水的渗透压与人体血液的渗透压是基本相等的，生理盐水的渗透压以及细胞外液的渗透压是等渗的。细胞在生理盐水里面可以维持正常的形态不变，也可以维持正常的生存膜特性不改变，有利于维持血液样本中细胞的形态和活性。在一些具体实施例中，生理盐水采用0.22μm滤膜过滤。
在一些可能的实现方式中，血液样本保存液与待保存样品混合后，抗凝剂的浓度为1mg/mL～5mg/mL，防腐剂的浓度为5mg/mL～20mg/mL，游离醛淬灭剂的浓度为0.5mg/mL～5mg/mL，血小板凝集抑制剂的浓度为10μg/mL～100μg/mL，膜蛋白保护剂的浓度为0.1mg/mL～20mg/mL；其中，膜蛋白保护剂中，细胞膜保护剂的浓度为0.05mg/mL～0.5mg/mL；和/或，代谢酶抑制剂的浓度为0.1mg/mL～1mg/mL；和/或，蛋白酶抑制剂的浓度为0.01mg/mL～0.1mg/mL。本申请实施例血液样本保存液与待保存样品混合后，各组分的浓度，能够有效维持血液样本中细胞数量与完整性，同时可以减少血液中出现的红细胞和血小板的聚集，有利于后续对待测细胞的收集和检测，使得下游检测可以得到最准确的结果。
在一些可能的实现方式中，血液样本保存液与待保存样品的体积比为1：(5～20)。
在一些可能的实现方式中，细胞膜保护剂包括聚乙二醇、山梨醇、邻苯二甲酸二辛酯、聚乙烯乙二醇中的至少一种。
在一些可能的实现方式中，代谢酶抑制剂包括氟化钠、甘油醛中的至少一种。
在一些可能的实现方式中，蛋白酶抑制剂包括4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐、苯甲基磺酰氟、胃蛋白酶抑制剂中的至少一种。
在一些可能的实现方式中，抗凝剂包括EDTA钠盐、EDTA钾盐、枸橼酸、枸橼酸纳、乙二胺四乙酸中的至少一种。
在一些可能的实现方式中，防腐剂包括咪唑烷基脲、重氮烷基脲、二唑烷基脲中的至少一种。
在一些可能的实现方式中，游离醛淬灭剂包括甘氨酸。
在一些可能的实现方式中，血小板凝集抑制剂包括替罗非班、乙酰基水盐酸、茶碱、腺苷中的至少一种。
本申请上述实施例的技术效果在前文具有详细论述，在此不再赘述。
本申请实施例第三方面提供一种上述的血液样本保存液，或者上述方法制备的血液样本保存液在循环肿瘤细胞保存中的应用。
本申请实施例第三方面提供的应用，将上述血液样本保存液应用到循环肿瘤细胞保存中，通过血液样本保存液中各组分的共同作用，能够保持血液样本中循环肿瘤细胞(CTCs)数量与完整性，同时可以减少血液中出现的红细胞和血小板的聚集，有利于后续对循环肿瘤细胞的收集和检测，使得下游检测可以得到最准确的结果。血液样本在保存液中保存的48h内CTCs均呈现稳定状态，CTCs无衰减，CTCs表面蛋白位点保存完整，上皮细胞黏附分子(EpCAM)信号与0h时保持同等水平。
在一些可能的实现方式中，上述血液样本保存液在循环肿瘤细胞保存中的应用形式包括但不限于采血管等。
为使本申请上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本申请实施例血液样本保存液及其制备方法的进步性能显著的体现，以下通过多个实施例来举例说明上述技术方案。
实施例1
研究抗凝剂浓度的影响：
称取抗凝剂EDTA-K2，用生理盐水将其分别配制成浓度为1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL、5.0mg/mL的溶液(生理盐水已经用0.22μm滤膜过滤)。将血液分别与不同浓度的抗凝剂按照一定比例混合，观察其在室温存放下4h、24h、48h及72h的血液状态，结果如下表1所示：
表1
从上述表1测试结果可见，在抗凝剂浓度为1mg/mL～5mg/mL时，血液样本均表现出较好的存储稳定性，存储48h内血液样本基本没有发生凝血或溶血。尤其是在抗凝剂浓度为1.5mg/mL～2.0mg/mL时，血液样本表现出更好的存储稳定性，血液样本在72h后仍正常，没有发生凝血或溶血。
实施例2
研究血小板凝集抑制剂浓度的影响：
称取血小板凝集抑制剂替罗非班(tirofiban)，用生理盐水将其分别配制成浓度为0ug/mL、10ug/mL、20ug/mL、50ug/mL、100ug/mL的溶液(生理盐水已经用0.22μm滤膜过滤)。将血液分别与不同浓度的血小板凝集抑制剂按照一定比例混合，观察其在室温存放下4h、24h、48h及72h的白细胞状态，结果如下表2所示：
表2
由上述表2测试结果可见，在血小板凝集抑制剂tirofiban浓度为10μg/mL～100μg/mL时，血液中白细胞均表现出较好的稳定性，存储48h内血液样本中白细胞没有发生团聚。尤其是在血小板凝集抑制剂tirofiban浓度为20μg/mL～100μg/mL时，血液中白细胞表现出更好的存储稳定性，血液中的白细胞在72h后仍正常或轻微团聚现象。
实施例3
研究抗凝剂、防腐剂、游离醛淬灭剂、血小板凝集抑制剂组分对血液样本保存的影响：
取6支普通采血管，分别编号为1、2、3、4、5、6，向管1加入下表3中的成分1，向管2加入表3中的成分2，向管3加入表3中的成分3，向管4加入表3中的成分4，向管5加入表3中的成分5，向管6加入表3中的成分6。
表3
| 组成 | 成分1 | 成分2 | 成分3 | 成分4 | 成分5 | 成分6 |
| EDTA·Na2(mg/mL) | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 |
| 替罗非班(μg/mL) | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
| 咪唑烷基脲(mg/mL) | 0 | 5 | 5 | 10 | 20 | 50 |
| 甘氨酸(mg/mL) | 0 | 0 | 0.5 | 1 | 2 | 5 |
分别采血，加入约100个Hela细胞(人宫颈癌细胞)并在室温条件下静置4h、24h、48h、72h后筛分制片测细胞回收率。测试结果如下表4所示：
表4
由上述表4测试结果可知，通过比较细胞回收率，当采血管中同时添加抗凝剂EDTA·Na2、血小板凝集抑制剂替罗非班、防腐剂咪唑烷基脲和游离醛淬灭剂甘氨酸的成分3～成分6时，表现出更高的细胞回收率。说明游离醛淬灭剂的浓度为0.5mg/mL～5mg/mL时有利于提高细胞回收率。其中，管4中添加有浓度为1mg/mL的游离醛淬灭剂的成分4，在细胞保存72h后回收率仍然与0h接近，稳定性最好。管5中添加有浓度为2mg/mL的游离醛淬灭剂的成分5，在4h时表现出最高的细胞回收率。另外，由于咪唑烷基脲需要和甘氨酸配合使用，单独使用咪唑烷基脲，会导致目标细胞密度变高，在血液前处理(密度梯度离心)过程造成较大损失，从而导致回收率下降。因此，成分1仅添加EDTA·Na2和替罗非班，相对于成分2额外添加有咪唑烷基脲，表现出更好的回收率。
实施例4
研究抗凝剂、防腐剂、游离醛淬灭剂、血小板凝集抑制剂、细胞膜保护剂组分对血液样本保存的影响：
取5支普通采血管，分别编号为1、2、3、4、5，向管1加入表5中的成分1，向管2加入表5中的成分2，向管3加入表5中的成分3，向管4加入表5中的成分4，向管5加入表5中的成分5。
表5
| 组成 | 成分1 | 成分2 | 成分3 | 成分4 | 成分5 |
| EDTA·Na2(mg/mL) | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 |
| 替罗非班(μg/mL) | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
| 咪唑烷基脲(mg/mL) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 甘氨酸(mg/mL) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| PEG2000(mg/mL) | 0 | 0.05 | 0.1 | 0.2 | 0.5 |
分别采血，加入100个Hela细胞并在室温条件下静置4h、24h、48h、72h后筛分制片，用人上皮细胞粘附分子EpCAM染色，测试其细胞回收率及荧光强度。测试结果如下表6所示：
表6
由上述表6测试结果可见，在保存液中添加浓度为0.05mg/mL～0.5mg/mL的细胞膜保护剂PEG2000后，显著提高了检测的荧光强度，同时也表现出较高的细胞回收率。综合细胞回收率及荧光强度比较，其中，管3中添加有成分3的保存液，在细胞保存4h后回收率达到86.2％，荧光强度达到65.5，保存72h仍然回收率仍有80.1％，荧光强度仍有51.2。管4中添加有成分4的保存液，在细胞保存4h后回收率达到84.5％，荧光强度达到62，保存72h仍然回收率仍有82.4％，荧光强度仍有52.4。
另外，需要说明的是，在保存液中添加的PEG2000的作用是保护细胞表面膜蛋白，但若PEG2000浓度过高会造成整体回收率下降。成分5中单独添加PEG2000的浓度达到0.5mg/mL，仅在采血4h内回收率＞70％，满足要求。成分1～4在4h回收率分别为85.8％，83.5％，86.2％，84.5％，这些回收率在同一水平，该差异属于仪器检测波动。另外，成分4中回收率表现出降低升高又降低的趋势，属于仪器测试导致的波动。
实施例5
研究抗凝剂、防腐剂、游离醛淬灭剂、血小板凝集抑制剂、细胞膜保护剂、代谢酶抑制剂和蛋白酶抑制剂组分对血液样本保存的影响：
取5支普通采血管，分别编号为1、2、3、4、5，向管1加入表7中的成分1，向管2加入表7中的成分2，向管3加入表7中的成分3，向管4加入表7中的成分4，向管5加入表7中的成分5。
表7
分别采血，加入100个Hela细胞并在室温条件下静置4h、24h、48h、72h后筛分制片，用EpCAM染色，测其细胞回收率及荧光强度。测试结果如下表8所示：
表8
由上述表8测试结果可见，在保存液中添加浓度为0.1mg/mL～1mg/mL的代谢酶抑制剂甘油醛和浓度为0.01mg/mL～0.1mg/mL的蛋白酶抑制剂4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐后，显著提高了检测的荧光强度和回收率。综合细胞回收率及荧光强度比较，其中，管3中添加有成分3的保存液，在细胞保存4h后回收率达到88.1％，荧光强度达到71.3，保存72h仍然回收率仍有81.1％，荧光强度仍有61.2。管4中添加有成分4的保存液，在细胞保存4h后回收率达到83.6％，荧光强度达到75，保存72h仍然回收率仍有81.1％，荧光强度仍有66.2。成分5中由于甘油醛浓度过高，造成整体回收率下降。
实施例6
取普通采血管，向管中加入表9中的成分1。
表9
采血后加入100个Hela细胞并在室温与4℃条件下静置24h、48h后筛分制片，计算其回收率。测试结果如下表10所示：
表10
由上述表10测试结果可知，血液样本保存液中同时添加抗凝剂、防腐剂、游离醛淬灭剂、血小板凝集抑制剂、细胞膜保护剂、代谢酶抑制剂和蛋白酶抑制剂组分，血液样本保存在该保存液中，细胞在室温条件下与4℃条件下回收率相似，表明细胞可以在含有成分1的全血中室温保存或运输。
实施例7
取普通采血管，向管中加入表9中的成分1。
取五个采血管分别采五个含有癌细胞的临床全血样本，依次编号为样本1、样本2、样本3、样本4和样本5，分别保存4h、24h、48h后筛分制片，进行荧光成像。测试结果如下表11所示，荧光成像如附图2所示，附图2中BF为显微镜明场通道，显示细胞在明场下的形貌；DAPI为细胞核荧光信号通道，显示细胞核的荧光信号；CD45为CD45蛋白表达通道，显示细胞是否表达CD45蛋白；Pan CK为细胞角蛋白表达通道，显示细胞是否表达细胞角蛋白：
表11
由上述表11和附图2测试结果可知，血液样本保存液中同时添加抗凝剂、防腐剂、游离醛淬灭剂、血小板凝集抑制剂、细胞膜保护剂、代谢酶抑制剂和蛋白酶抑制剂组分，临床血液样本保存在该保存液中，48h内可以富集到循环肿瘤细胞，通过免疫荧光染色，细胞仍然具有较高的荧光信号，表明临床样本在含有血液样本保存液的采血管中可以至少可以保存48h，而且不影响回收效率与信号强度。
由上述测试结果可知，本申请实施例提供的血液样本保存液，能够在室温条件下储存血液样本48h以上，而且并未影响微流控芯片筛分效果，保证样本在经过长时间存储后的细胞数量及表面膜蛋白表达水平无显著下降。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种血液样本保存液，其特征在于，所述血液样本保存液包括组分：抗凝剂、防腐剂、游离醛淬灭剂、血小板凝集抑制剂和膜蛋白保护剂，其中，所述膜蛋白保护剂包括细胞膜保护剂、代谢酶抑制剂、蛋白酶抑制剂的至少一种。
2.如权利要求1所述的血液样本保存液，其特征在于，所述细胞膜保护剂包括聚乙二醇、山梨醇、邻苯二甲酸二辛酯、聚乙烯乙二醇中的至少一种；
和/或，所述代谢酶抑制剂包括氟化钠、甘油醛中的至少一种；
和/或，所述蛋白酶抑制剂包括4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐、苯甲基磺酰氟、胃蛋白酶抑制剂中的至少一种。
3.如权利要求1或2所述的血液样本保存液，其特征在于，所述抗凝剂包括EDTA钠盐、EDTA钾盐、枸橼酸、枸橼酸纳、乙二胺四乙酸中的至少一种；
和/或，所述防腐剂包括咪唑烷基脲、重氮烷基脲、二唑烷基脲中的至少一种；
和/或，所述游离醛淬灭剂包括甘氨酸；
和/或，所述血小板凝集抑制剂包括替罗非班、乙酰基水盐酸、茶碱、腺苷中的至少一种。
4.如权利要求3所述的血液样本保存液，其特征在于，所述血液样本保存液中溶剂包括生理盐水。
5.如权利要求4所述的血液样本保存液，其特征在于，所述血液样本保存液与待保存样品的体积比为1：(5～20)。
6.如权利要求5所述的血液样本保存液，其特征在于，所述血液样本保存液与所述待保存样品混合后，所述抗凝剂的浓度为1mg/mL～5mg/mL，所述防腐剂的浓度为5mg/mL～20mg/mL，所述游离醛淬灭剂的浓度为0.5mg/mL～5mg/mL，所述血小板凝集抑制剂的浓度为10μg/mL～100μg/mL，所述膜蛋白保护剂的浓度为0.1mg/mL～20mg/mL。
7.如权利要求6所述的血液样本保存液，其特征在于，所述血液样本保存液中，所述膜蛋白保护剂至少具有如下任一特征：
所述细胞膜保护剂的浓度为0.05mg/mL～0.5mg/mL；
所述代谢酶抑制剂的浓度为0.1mg/mL～1mg/mL；
所述蛋白酶抑制剂的浓度为0.01mg/mL～0.1mg/mL。
8.一种如权利要求1～7任一项所述的血液样本保存液的制备方法，其特征在于，包括步骤：将抗凝剂、防腐剂、游离醛淬灭剂、血小板凝集抑制剂和膜蛋白保护剂溶解在溶剂中，得到血液样本保存液；其中，所述膜蛋白保护剂包括细胞膜保护剂、代谢酶抑制剂、蛋白酶抑制剂的至少一种。
9.如权利要求8所述的血液样本保存液的制备方法，其特征在于，所述溶剂包括生理盐水；
和/或，所述血液样本保存液与待保存样品混合后，所述抗凝剂的浓度为1mg/mL～5mg/mL，所述防腐剂的浓度为5mg/mL～20mg/mL，所述游离醛淬灭剂的浓度为0.5mg/mL～5mg/mL，所述血小板凝集抑制剂的浓度为10μg/mL～100μg/mL，所述膜蛋白保护剂的浓度为0.1mg/mL～20mg/mL；其中，所述膜蛋白保护剂中，所述细胞膜保护剂的浓度为0.05mg/mL～0.5mg/mL；和/或，所述代谢酶抑制剂的浓度为0.1mg/mL～1mg/mL；和/或，所述蛋白酶抑制剂的浓度为0.01mg/mL～0.1mg/mL。
10.如权利要求1～7任一项所述的血液样本保存液，或者如权利要求8～9任一项所述方法制备的血液样本保存液在循环肿瘤细胞保存中的应用。
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| CN202310666209.0A CN116686824A (zh) | 2023-06-07 | 2023-06-07 | 血液样本保存液及其制备方法和应用 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117562049A (zh) * | 2023-11-22 | 2024-02-20 | 深圳泽医细胞治疗集团有限公司 | 基于γδT细胞培养的血液保存液及其应用 |
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2023
- 2023-06-07 CN CN202310666209.0A patent/CN116686824A/zh active Pending
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