CN101173921A

CN101173921A - 试剂、试剂盒及测定方法

Info

Publication number: CN101173921A
Application number: CNA2007101654671A
Authority: CN
Inventors: 森悠丞; 竹下浩生
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2006-10-30
Filing date: 2007-10-29
Publication date: 2008-05-07
Anticipated expiration: 2027-10-29
Also published as: JP4806330B2; CN101173921B; JP2008111717A

Abstract

本发明提供一种血小板分析用试剂。该血小板分析用试剂含有至少选自由卡布里蓝、尼罗蓝和灿烂甲酚蓝组成的组群中的一种的血小板染色用色素。本发明还提供一种含有所述血小板染色用色素的血小板分析用试剂盒。本发明还提供一种使用所述血小板染色用色素的血小板分析方法。

Description

试剂、试剂盒及测定方法

技术领域：

本发明涉及一种用于分析血小板的试剂、试剂盒及其方法。本发明还涉及一种分析血小板和网织红细胞用的试剂、试剂盒及其方法。

背景技术：

人的血液含有红细胞、白细胞、血小板等各种血细胞。其中血小板是直径2～3μm的无核细胞。正常人的血液中有15万～35万个/μl血小板。

但是，人们都知道，一旦患上特发性血小板减少性紫癜(IdiopathicThrombocytopenic Purpura：ITP)等血小板减少症和急性白血病等病症，血液中的血小板数就会减少。一般说来，血液中的血小板一旦低于10000个/μl，就要输血。因此，迅速、准确地测定血小板数在临床上是很重要的。

众所周知的血小板测定法之一是利用电阻抗法。此方法是测定含血小板的试样从两个电极间通过时的电阻脉冲，将其绘制成直方图进行分析。然而，利用电阻原理的方法有的标本得不到足够的测定精度。

因此，用对血小板表面抗原有特异性的标记抗体对血小板进行计数的方法应运而生(参照美国临床病理学杂志(2001)：115，p.460-464)。此文献的方法作为高精度的方法为人所知，但人们也知道，由于在测定中要使用抗原抗体反应，一般要得出结果需要花很长时间。因此，此方法作为判断是否要输血等需紧急作出判断的临床血小板测定方法不太适用。

另外，血液中含有网织红细胞。网织红细胞是骨髓中的晚幼红细胞脱核后刚释放到末梢血液中的尚未完全成熟的红细胞。网织红细胞的特点，比如有作为细胞成熟过程中的痕迹，其细胞内含有成熟红细胞已经不含的少量RNA、核糖体和线粒体等细胞小器官。

在临床检查领域，网织红细胞的分类和计数在把握患者的骨髓内造血状态上极为重要。骨髓造血功能正常的健康人其网织红细胞数占全红细胞的0.5～3.0％。对此，在骨髓造血异常的状态(比如骨髓造血功能受到限制的状态)下，网织红细胞数减少，在骨髓造血旺盛的状态下网织红细胞数增加。具体而言，在再生障碍性贫血和恶性肿瘤的化疗期间，网织红细胞数减少，而溶血性贫血等病症则网织红细胞数增加。

用流式细胞原理迅速测定血液中的细胞(即白细胞、网织红细胞和红细胞等血细胞)的方法已为人所知。作为这种测定方法，比如美国专利第6114173号中公开了全血试样中的网织红细胞、红细胞和血小板的计数和同定方法以及用于该方法的试剂组份。根据此文献公开的方法，将含阳离子型色素(特别是氧氮杂芑750)的试剂混合物与含网织红细胞的试样混合，再用流式细胞仪测定所得混合液的散射光和吸收光。以测得的散射光和荧光为参数对网织红细胞进行计数，并与红细胞和血小板区分开。

美国专利第4882284号公开了一种从红细胞和血小板中识别未溶解的全血中的白细胞的方法。据此文献记载，该文献中的方法是让含有吸收红色光的荧光染料的试剂与未溶解的全血接触。因为作为吸收红色光的荧光染料使用的氧氮染料能对白细胞染色，因此用流式细胞仪测定即可从红细胞和血小板中区分白细胞。

美国专利第5891731号公开了一种由至少能对一种网织红细胞特异性染色的色素和对白细胞特异性染色的色素组成的网织红细胞测定用试剂。该文献中也记述说氧氮类色素能对白细胞特异性染色。

血液中有时会出现破碎红细胞和脂质等。人们都知道，在血小板的测定中，由于出现在血液中的破碎红细胞和脂质等其大小与血小板类似，故会在测定时作为杂质影响血小板测定。特别是在测定需要输血的血小板低的标本时，这些杂质的影响会更大。然而，上述文献中没有关于降低这种杂质影响、提高血小板测定精度的记载。

由于上述原因，人们渴望开发出能够更明确地从其他血细胞和脂质粒子等血液中的杂质中区分出血小板加以测定的技术。

发明内容：

本发明的范围只由权利要求书所规定，其在任何程度上都不受这一节发明内容的陈述所限。

本发明提供一种在运用流式细胞技术的分析方法中能够明确地从其他血细胞和脂质粒子等血液中的杂质中区分出血小板并加以测定的试剂。

即，本发明提供一种血小板分析用试剂，该试剂中作为血小板染色用色素至少含有选自由卡布里蓝、尼罗蓝和灿烂甲酚蓝构成的组群中的一种色素。

所述的试剂还包括网织红细胞染色用第二色素，所述试剂可以分析血小板和网织红细胞。所述第二色素是能够对核酸染色的花青色素。

所述第二色素如结构式(I)所示：

其中，R₁为氢原子、碳原子数1～6的烷基或-CH₂(CHR₅)_xOR₆；R₂及R₃分别为氢原子、卤原子、氰基、碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烷氧基、芳基或芳烷基；

R₄为碳原子数1～6的烷基、-CH₂(CHR₇)_yOR₈、芳基或芳烷基；

R₅及R₇分别为氢原子或碳原子数1～3的羟烷基；

R₆及R₈分别为氢原子、酰基或碳原子数1～3的烷基；

Z为硫磺原子、氧原子、硒原子或CR₉R₁₀；

R₉及R₁₀分别为碳原子数1～3的烷基；

n为1或2的整数；

x和y分别为0～3的整数；

X^-为负离子。

所述的试剂还包括防止红细胞非特异性染色的多元负离子。

所述的试剂pH值为6.0～11.0。

所述试剂的渗透压为150～600mOsm/kg。

所述试剂还包括提高色素渗透性的染色促进剂，所述染色促进剂为阳离子型表面活性剂。

所述血小板染色用色素可从脂质粒子中识别出血小板，专对血小板染色。

所述血小板染色用色素可从破碎红细胞中识别出血小板，专对血小板染色。

本发明还提供一种含有第一试剂和第二试剂的血小板分析用试剂盒，该第一试剂含有为测定时保持一定pH值用的缓冲剂，第二试剂含有血小板染色用色素。此试剂盒的第二试剂所含上述色素选自由卡布里蓝、尼罗蓝和灿烂甲酚蓝组成的组群。

所述的试剂盒中所述第二试剂含有网织红细胞染色用第二色素，所述试剂盒可以对血小板和网织红细胞进行分析。

所述的试剂盒还包括含有网织红细胞染色用第二色素的第三试剂；所述试剂盒可以对血小板和网织红细胞进行分析。

所述的试剂盒中所述第二色素是能够对核酸染色的花青色素。

本发明还提供一种血小板分析方法，包括以下步骤：将血小板染色用色素与标本混合，制备测定用试样；光照上述测定用试样制备步骤中得到的测定用试样中的细胞，测定该细胞发出的散射光和荧光；以及根据上述测定步骤中测得的散射光和荧光检出血小板。此方法的测定用试样制备步骤中的所述色素选自由卡布里蓝、尼罗蓝和灿烂甲酚蓝组成的组群。

所述测定用试样制备步骤将所述血小板染色用第一色素、所述标本和网织红细胞染色用第二色素混合，制备所述测定用试样；

所述检出步骤根据测得的散射光和荧光检出血小板和网织红细胞。

所述测定用试样导入流式细胞仪的流动室，光照流经流动室的测定用试样中的细胞。

所述的方法还包括对所述检出的血小板计数的步骤。

所述的方法还包括对所述检出的血小板和网织红细胞计数的步骤。

附图说明：

图1A～1C为用所含氧氮色素不同的试剂对人血染色时的散点图。

图2为用各种卡布里蓝浓度不同的血小板测定用试剂对人血染色时的散点图。

图3A和3B为用各种尼罗蓝浓度不同的血小板测定用试剂对人血染色时的散点图。

图4A和4B为用各种灿烂甲酚蓝浓度不同的血小板测定用试剂对人血染色时的散点图。

图5A和5B为用本发明一个实施方式的方法测定的血小板数和用传统方法测定的血小板数的相关关系图。

图6A～6C为用含不同浓度的网织红细胞染色用色素的各种网织红细胞和血小板测定用试剂对人血染色时的散点图。

图7A～7C为用含不同浓度的网织红细胞染色用色素和含不同浓度的血小板染色用色素(卡布里蓝)的各种网织红细胞和血小板测定用试剂对人血染色时的散点图。

图8A～8C为用含不同浓度的网织红细胞染色用色素和血小板染色用色素(尼罗蓝)的各种网织红细胞和血小板测定用试剂对人血染色时的散点图。

图9A～9C为用含不同浓度的网织红细胞染色用色素和血小板染色用色素(灿烂甲酚蓝)的各种网织红细胞和血小板测定用试剂对人血染色时的散点图。

具体实施方式：

本发明人为了获得在应用流式细胞技术的测定方法中能够从其他血细胞和脂质粒子等血液中的杂质中更明确地区分出血小板加以测定的血小板测定用试剂，用100多种色素反复研究，终于发现能够特异性地对血小板染色的某种特定的氧氮色素，完成了本项发明。迄今为止人们还不知道此次作为血小板染色用而发现的特定的氧氮色素能够特异性地对血小板染色，使血小板从脂质粒子等杂质中区分出来。这种氧氮色素能够对血小板荧光染色。被该氧氮色素染色的血小板在用流式细胞仪测定时，可以发出高强度的荧光，因此可以区分血小板和杂质。

在本说明书中，所谓血液中的“杂质”指妨碍血小板正常测定的血液中的成份。作为这种杂质比如有血液中所含脂质粒子、破碎红细胞等。

本发明一实施方式的血小板测定用试剂(以后也称PLT试剂)含血小板染色用色素。该色素是可以特异性地对血小板进行染色的色素，是至少有一种选自于由卡布里蓝、尼罗蓝和灿烂甲酚蓝构成的组群中的氧氮色素。该色素以能够对血小板染色使其从脂质粒子中识别出来为宜。使用含该色素的PLT试剂，即使是含有妨碍血小板检测的杂质的标本，也能够排除这种杂质和血液中其他血细胞的影响，更精确、更迅速地测定血小板。

作为卡布里蓝，如由结构式(II)表示的卡布里蓝GON。

作为尼罗蓝，比如有下列分子式(III)表示的尼罗蓝。

式中，X^-是Cl^-或1/2SO₄ ^2-

作为灿烂甲酚蓝，如有下列分子式(IV)表示的灿烂甲酚蓝ALD。

上述对血小板染色的色素在市场上有销售。如卡布里蓝GON可以从Croma公司、尼罗蓝可以从东京化成和Sigma-Aldrich公司、灿烂甲酚蓝ALD可以从Sigma-Aldrich公司购得。

上述血小板染色用色素可以将血小板染色到可与破碎红细胞区分的程度。

已知使用含有可对网织红细胞特异性染色的色素和上述血小板染色用色素，能够更明确地将网织红细胞和血小板从其他血细胞和血液中的杂质中区分出来。因此，作为本发明的其他实施方式，还有包含血小板染色用第一色素和网织红细胞染色用第二色素的网织红细胞和血小板测定用试剂(以后也称RET·PLT试剂)。

RET·PLT试剂中所含第一色素可以使用上述血小板染色用色素。

RET·PLT试剂中所含第二色素只要是能将网织红细胞染色到能与其他血细胞或杂质区分开的试剂即可。作为第二色素，最好使用能对核酸染色的花青色素(以后也称核酸染色性花青色素)。作为核酸染色性花青色素，可以使用历来众所周知的色素。比如可以列举出美国专利第5891731号上公开的色素、WO98/26007上公开的色素、WO01/086264上公开的色素和美国专利第4957870号公开的色素等。其中以下列分子式(I)表示的色素为宜。

上述分子式(I)中的R₁为氢原子、碳原子数1～6的烷基或-CH₂(CHR₅)_xOR₆。R₂及R₃分别为氢原子、卤原子、氰基、碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烷氧基、芳基或芳烷基。R₄为碳原子数1～6的烷基、-CH₂(CHR₇)_yOR₈、芳基或芳烷基。R₅及R₇分别为氢原子或碳原子数1～3的羟烷基。R₆及R₈分别为氢原子、酰基或碳原子数1～3的烷基。Z为硫磺原子、氧原子、硒原子或CR₉R₁₀。R₉及R₁₀分别为碳原子数1～3的烷基。n为1或2的整数。x和y分别为0～3的整数。X^-为负离子。

上述分子式(I)的R₁中的碳原子数1～6的烷基为正链或侧链均可，作为R₁中的碳原子数1～6的烷基如有：甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基和己基。其中以甲基或乙基最好。

上述式(I)的R₂和R₃所表示的基也可取代为正、间和对位的某一个。作为R₂和R₃中的碳原子数1～6的烷基可举例同上。作为碳原子数1～6的烷氧基可列举出甲氧基、乙氧基和丙氧基等。其中以甲氧基或乙氧基为最好。作为R₂和R₃中的芳基可以列举出苯基等。作为R₂和R₃中的芳烷基可举出苄基等。式(I)的R₂和R₃所表示的基以氢更好。

作为式(I)的R₄中的碳原子数1～6的烷基、芳基或芳烷基可举例同上。

作为R₅及R₇中的碳原子数1～3的羟烷基，如有羟甲基、羟乙基和羟丙基。其中以羟甲基或羟乙基为宜。

R₆及R₈中的酰基以由脂肪族羧酸衍生的酰基为宜。这种酰基如有乙酰基和丙酰基，尤其以乙酰基为宜。作为R₆及R₈中的碳原子数为1～3的烷基可举例同上。

上述式(I)的Z是硫磺原子、氧原子、硒原子或CR₉R₁₀，其中尤以硫磺原子为宜。

上述R₉及R₁₀中的碳原子数为1～3的烷基也可举例同上。

上述式(I)的X^-中的负离子如有：卤离子、卤化硼离子、磷化合物离子、卤氧酸盐离子、氟硫酸离子、甲硫酸离子及苯中有卤原子或卤烷基作为取代基的四苯基硼化物离子等。作为卤离子如有氟离子、氯离子、溴离子或碘离子。作为卤化硼离子如有BF₄ ^-、BCl₄ ^-、BBR₄ ^-等。这些当中，尤以溴离子或BF₄ ^-为宜。

上述式(I)的色素例示如下：

上述式(I)的色素中，n＝1的色素例如可用以下方法合成。先将结构式式(V)表示的化合物与N，N-二甲基酰胺反应。

再用结构式(VI)表示的喹啉衍生物与上述反应所得生成物反应，然后用硼氟化钠处理。

如此即可合成上述式(I)色素中n＝1的色素。

在上述式(I)中n＝2的色素仅在合成上述n＝1的色素的反应中取代N，N-二甲基酰胺使用丙二醛双(苯亚胺)盐等即可合成。

除上述核酸染色性花青色素外，新亚甲蓝和氧氮杂芑750色素作为网织红细胞测定用色素已为人所知，也可用这些色素作为第二色素。

上述血小板染色用色素因色素种类和试剂种类而各异，但与标本混合时最好在试剂中所含浓度都为0.01～10ppm。

比如，在上述PLT试剂添加上述血小板染色用色素时，血小板染色用色素虽然因色素种类而不同，但与标本混合时最好PLT试剂中所含浓度达到0.01～5ppm，0.05～2.0ppm左右更好。特别是使用卡布里蓝GON作为血小板染色用色素从脂质粒子区分血小板时，血小板染色用色素与标本混合时其在PLT试剂中所含浓度以0.1～5.0ppm为宜，0.2～2.0ppm更好。当用卡布里蓝GON从破碎红细胞中区分血小板时，血小板染色用色素与标本混合时其在PLT试剂中所含浓度以0.1～2.0ppm为宜，0.2～1.0ppm更好。用尼罗蓝从脂质粒子中区分血小板时，血小板染色用色素与标本混合时其在PLT试剂中所含浓度以0.05～5.0ppm为宜，0.1～2.0ppm更好。用尼罗蓝从破碎红细胞中区分血小板时，血小板染色用色素与标本混合时其在PLT试剂中所含浓度以0.05～2.0ppm为宜，0.1～1.0ppm更好。用灿烂甲酚蓝ALD从脂质粒子中区分血小板时，血小板染色用色素与标本混合时其在PLT试剂中所含浓度以0.1～5.0ppm为宜，0.5～2.0ppm更好。用灿烂甲酚蓝ALD从破碎红细胞中区分血小板时，血小板染色用色素与标本混合时其在PLT试剂中所含浓度以0.2～5.0ppm为宜，0.5～2.0ppm更好。

只要在PLT试剂中的浓度为上述范围内，就能更好地将血小板从其他血细胞及杂质中区分出来，因此，此浓度较为理想。

另外，当以上述血小板染色用色素为第一色素添加到上述RET·PLT试剂中时，虽然因色素种类不同而各异，但和标本混合时在试剂中所含浓度以0.01～10ppm为宜，0.1～2.0ppm更好。特别是使用卡布里蓝GON作为血小板染色用色素从脂质粒子和破碎红细胞中区分血小板时，血小板染色用第一色素与标本混合时其在RET·PLT试剂中所含浓度以0.2～3.0ppm为宜，0.5～2.0ppm更好。用尼罗蓝从脂质粒子和破碎红细胞中区分血小板时，血小板染色用第一色素与标本混合时其在RET·PLT试剂中所含浓度以0.1～2.0ppm为宜。用灿烂甲酚蓝ALD从脂质粒子和破碎红细胞中区分血小板时，血小板染色用第一色素与标本混合时其在RET·PLT试剂中所含浓度以0.5～3.0ppm为宜，1.0～2.0ppm更好。

在RET·PLT试剂中只要浓度在此范围内，就能够更好地从其他血细胞及杂质区分出血小板，因此是比较理想的浓度。关于RET·PLT试剂中所含上述第二色素，虽然因色素种类不同而各异，但与标本混合时，其在试剂中所含浓度以0.1～50ppm为宜，0.5～10ppm更好。在RET·PLT试剂中只要浓度在此范围内，就能够将网织红细胞从其他血细胞和杂质中区分出来。

上述网织红细胞染色用第二色素在RET·PLT的组份中能够迅速渗透到网织红细胞中，对细胞内的RNA染色。

RET·PLT试剂最好还含有多元负离子，以抑制红细胞的非特异性染色。作为多元负离子如有硫酸离子、磷酸离子、碳酸离子、多元羧酸离子等。作为可提供这种离子的化合物如有柠檬酸、硫酸、烯酸、EDTA以及这些化合物的碱金属盐。RET·PLT试剂可以含有这些化合物的一种或二种以上作为多元负离子。

上述多元负离子在试剂所有负离子成份中所占比例为50％以上。上述多元负离子最好在试剂中所占比例为70％以上。

由于含有上述多元负离子，可以抑制红细胞的非特异性染色，更易于区分网织红细胞及血小板与红细胞。

PLT试剂和RET·PLT试剂中可以含有缓冲剂以保持一定pH值。缓冲剂浓度可以是数mM～100mM。作为缓冲剂可以是通用的东西，无特别限定，可以按照所期望的pH值使用羧酸盐类、磷酸盐、GOOD缓冲剂、牛磺酸、三乙醇胺等。

PLT试剂和RET·PLT试剂的pH值以6.0～11.0为宜，7.0～10.0更好，最好是8.0～9.5。pH值低于上述范围太多，红细胞就易于脆化、溶血，杂质破碎红细胞量也可能增加。而pH值过高，则红细胞膜上的酸性官能基易离解与阳离子型色素结合，从而增加破碎红细胞非特异性染色的机会。

在RET·PLT试剂中，如果可提供上述多元负离子的化合物有缓冲功能的话，可以将这种化合物作为缓冲剂使用。

PLT试剂和RET·PLT试剂的渗透压以150～600mOSm/kg为宜，200～300mOSm/kg更好。此范围内的渗透压更接近生理渗透压，可以防止红细胞低渗溶血。

为保持上述渗透压，PLT试剂和RET·PLT试剂可以含有渗透压调节剂。作为渗透压调节剂可以使用一般用品，比如丙酸等碱金属盐、葡萄糖和甘露糖等糖类。诸如NaCl等碱金属卤化物和碱土类金属卤化物也可使用。上述渗透压调节剂可以使用一种或二种以上。如果所用上述缓冲剂可以将试剂的渗透压调节到上述范围，也可不用渗透压调节剂。

PLT试剂和RET·PLT试剂可以含有染色促进剂，以提高色素对细胞的渗透性。作为染色促进剂如有表面活性剂等，特别是以阳离子型表面活性剂为佳。理想的阳离子型表面活性剂如结构式(VII)表示：

式(VII)中，R₁₁为碳原子数8～12的烷基。R₁₂、R₁₃和R₁₄分别为碳原子数1～6的烷基。Y^-为阴离子。

上述式(VII)的R₁₁中的碳原子数8～12的烷基可以是正链或侧链。作为R₁₁中的碳原子数8～12的烷基如有：辛基、癸基、月桂基、十六烷基、十四烷基等。

上述式(VII)的R₁₂、R₁₃和R₁₄中的碳原子数1～6的烷基可以是正链或侧链。作为R₁₂、R₁₃和R₁₄中的碳原子数1～6的烷基如有：甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基和己基。其中以甲基或乙基最好。

作为上述式(VII)的Y^-阴离子最好是溴离子或氯离子。

上述式(VII)的理想的阳离子型表面活性剂有十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)、辛基三甲基溴化铵(OTAB)、月桂三甲基氯化铵(LTAC)、十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)、十四烷基三甲基溴化铵(MTAB)等。这些阳离子型表面活性剂可以使用其中一种或二种以上。

当将PLT试剂或RET·PLT试剂与标本混合时，上述阳离子型表面活性剂可以促进血小板或网织红细胞和血小板染色，其在PLT试剂或RET·PLT试剂中所含浓度以不引起红细胞溶血为宜。这种浓度因阳离子型表面活性剂种类不同而异，通常在50～20000ppm左右。比如，使用DTAB时，在试剂中的浓度以500～3000ppm为宜。使用LTAC时以100～500ppm为宜。

PLT试剂和RET·PLT试剂除以上成份外，比如还可以含有2-吡啶硫-1-氧撑钠、β-本乙醇等防腐剂。

PLT试剂可以通过以上述适当浓度在适当溶剂中溶解上述血小板染色用色素和任意成份(缓冲剂、渗透压调节剂、染色促进剂和防腐剂等)来配制。作为溶剂只要能够稳定溶解上述成份即可，无特别限定。溶剂可以是水、水溶性有机溶剂等。作为水溶性有机溶剂可以使用乙醇、二甲亚砜、乙二醇或这些混合液。

对将上述各成份溶解到溶剂中的顺序无特别限定，可以以任意顺序溶解。可以事先分别将上述各成份溶解到适当溶剂，用时将各溶液混合，作为PLT试剂使用。这种形态也属本发明范围内。比如：当上述血小板染色用色素在水溶液中不稳定时，可以先将该色素溶解到水溶性有机溶剂中，使用时再与含其他成份的水溶液混合作为PLT试剂使用。

RET·PLT试剂可以通过以上述适当浓度在适当溶剂中溶解上述血小板染色用第一色素和网织红细胞染色用第二色素以及任意成份(多元负离子、缓冲剂、渗透压调节剂、染色促进剂和防腐剂等)来配制。作为溶剂只要能够稳定溶解上述成份即可，无特别限定。溶剂可以是水、水溶性有机溶剂等。作为水溶性有机溶剂可以使用乙醇、二甲亚砜、乙二醇或这些混合液。

作为将上述各成份溶解到溶剂中的顺序无特别限定，可以以任意顺序溶解。事先分别将上述各成份溶解到适当溶剂，用时将各溶液混合，也可以作为RET·PLT试剂使用。这种形态也属本发明范围内。比如：当上述第一色素和第二色素在水溶液中不稳定时，可以先将各色素溶解到水溶性有机溶剂中，使用时再与含其他成份的水溶液混合作为RET·PLT试剂使用。第一色素和第二色素既可以溶解在同一水溶性有机溶剂中，也可以溶解在不同的水溶性有机溶剂中。

如此配制的PLT试剂与标本混合、反应，制备成测定用试样，即可对有可能含在标本中的血小板染色。如此配制的RET·PLT试剂与标本混合、反应，制备成测定用试样，即可对有可能含在标本中的网织红细胞和血小板染色。在本说明书中，所谓标本指从生物(特别是包括人在内的哺乳动物)采集的血液(全血、富血小板血浆(PRP)等)、骨髓液以及将其以缓冲液等适当溶液稀释所得试样等。

PLT试剂和RET·PLT试剂与标本的混合比例(容量比)以试剂：标本＝100∶1～1000∶1为宜。PLT试剂和RET·PLT试剂与标本的反应温度以25～50℃为宜，35～45℃更好。反应时间因色素种类不同而异，但以10秒～5分钟为宜，20秒～2分钟更好，最好是20秒～60秒左右。

接下来，用光照射上述制备的测定用试样，测定该测定用试样中的细胞发出的散射光和荧光。作为照射光的装置，以流式细胞仪为宜。使用流式细胞仪时，该测定用试样导入该流式细胞仪的流动室，光照流经流动室内的测定用试样中的细胞。

对所用流式细胞仪的光源无特别限定，可以使用适于上述血小板染色用色素或血小板染色用第一色素和网织红细胞染色用第二色素励起的波长(如600～680nm附近)的光源。作为光源如有红色半导体激光、He-Ne激光等。半导体激光比气体激光便宜，很适用。

在上述流式细胞仪的光照下细胞发出的散射光既可以是前向散射光(受光角度在0～20°附近)也可以是侧向散射光(受光角度在90°附近)。前向散射光可以是前向小角度散射光(受光角度在1～5°附近)或前向大角度散射光(受光角度在6～20°附近)。已知散射光是反映有关细胞大小的信息的参数。

关于在上述流式细胞仪的光照下细胞发出的荧光则可以根据所用色素选择适当受光波长。

根据用PLT试剂如上得出的散射光和荧光，绘制出散点图，即可将其他血细胞和脂肪粒子等杂质与血小板分开，检出血小板。也可以对如此检测出的血小板进行计数。血小板的检测及/或计数推荐使用适当的分析用软件。

根据用RET·PLT试剂如上得出的散射光和荧光，绘制出散点图，即可将其他血细胞和脂肪粒子等杂质与网织红细胞和血小板分开，检出网织红细胞和血小板。也可以对如此检测出的网织红细胞和血小板进行计数。网织红细胞和血小板的检测及/或计数推荐使用适当的分析用软件。

本发明的另一个方面提供一种血小板测定用试剂盒(以后也称PLT试剂盒)。此试剂盒包括含有用于测定时保持一定pH值的缓冲剂的第一试剂和含有血小板染色用色素的第二试剂，该色素至少选自于由卡布里蓝、尼罗蓝和灿烂甲酚蓝构成的组群中的一种。

PLT试剂盒的第一试剂中的缓冲剂可以使用上述同样的成份。

PLT试剂盒的第一试剂和第二试剂也可以是上述缓冲剂和血小板染色用色素分别溶解在适当的溶剂中的试剂。

上述PLT试剂盒还可含有可任意添加到上述PLT试剂盒中的成份一渗透压调节剂、染色促进剂和防腐剂等。这些成份可以含在PLT试剂盒中的第一试剂或第二试剂中，也可以作为除此之外的试剂成份含在试剂盒中。

PLT试剂盒的各种试剂与标本混合，即可制备出测定用试样。作为PLT试剂盒的各种试剂与标本混合的顺序无特别限定。其混合比(容量比)为试剂盒的各种试剂合计∶标本＝100∶1～1000∶1。

关于用PLT试剂盒制备测定用试样、从测定用试样中测定散射光和荧光、再根据散射光和荧光检出血小板的方法与上述PLT试剂完全相同。

本发明的另一个方面提供一种网织红细胞和血小板测定用试剂盒(以后也称RET·PLT试剂盒)，包括：含有血小板染色用第一色素(至少选自于由卡布里蓝、尼罗蓝和灿烂甲酚蓝构成的组群中的一种)的第一试剂和含有网织红细胞染色用第二色素的第二试剂。RET·PLT试剂盒还可包括含用于在测定时保持一定pH值的缓冲剂的第三试剂。

该缓冲剂可以使用上述同样的成份。

此RET·PLT试剂盒中的第一试剂、第二试剂和第三试剂也可以是上述第一色素、第二色素及缓冲剂分别溶解在适当的溶剂中的试剂。

本发明的另一个方面提供一种RET·PLT试剂盒，包括含有在测定时保持一定pH值的缓冲剂的第一试剂和含有血小板染色用第一色素(至少选自由卡布里蓝、尼罗蓝和灿烂甲酚蓝构成的组群中的一种)和网织红细胞染色用第二色素的第二试剂。

该缓冲剂可以使用上述同样的成份。

此RET·PLT试剂盒中的第一试剂和第二试剂也可以是上述缓冲剂及第一色素和第二色素分别溶解在适当溶剂中的试剂。

上述RET·PLT试剂盒还可以含有可以在RET·PLT试剂中任意含有的成份—多元负离子、渗透压调节剂、染色促进剂和防腐剂等。这些成份可以含在上述第一试剂、第二试剂或第三试剂中，也可以作为其他试剂成份含在试剂盒中。

将RET·PLT试剂盒的各试剂与标本混合可以制备测定用试样。对于RET·PLT试剂盒的各试剂与标本混合的顺序没有特别限定。这些成份的混合比(容量比)最好为试剂盒各试剂合计∶标本＝100∶1～1000∶1。

关于用RET·PLT试剂盒制备测定用试样、从测定用试样中测定散射光和荧光、再根据散射光和荧光检出网织红细胞和血小板的方法与上述RET·PLT试剂完全相同。

本发明还提供一种血小板测定方法，其包括：将选自于由卡布里蓝、尼罗蓝和灿烂甲酚蓝构成的组群中的至少一种血小板染色用色素与标本混合，制备测定用试样；

光照所得测定用试样中的细胞，测定从该细胞发出的散射光和荧光；

根据测得的散射光和荧光检出血小板。

具体而言，通过混合上述PLT试剂和标本，可以制备测定用试样。然后用具备光源的众所周知的血液分析仪(如流式细胞仪等)分析所得测定用试样即可从测定用试样中获得散射光强度和荧光强度。再用适当的分析软件，根据散射光强度和荧光强度，即可将血小板与其他血细胞和脂肪粒子等杂质区分开，对血小板进行分类。还可以用适当的分析软件对分类的血小板计数。作为散射光强度可以列举出前向散射光强度和侧向散射光强度。

本发明还提供一种网织红细胞和血小板测定方法，包括：将选自于由卡布里蓝、尼罗蓝和灿烂甲酚蓝构成的组群中的至少一种血小板染色用第一色素和网织红细胞染色用第二色素与标本混合，制备测定用试样；

根据测得的散射光和荧光检出网织红细胞和血小板。

具体而言，可以通过混合上述RET·PLT试剂和标本，制备测定用试样。然后用具备光源的众所周知的血液分析仪(如流式细胞仪等)分析所得测定用试样，即可从测定用试样中获得散射光强度和荧光强度。再用适当的分析软件，根据散射光强度和荧光强度，即可将网织红细胞和血小板与其他血细胞和脂肪粒子等杂质区分开，分别对网织红细胞和血小板进行分类。还可以用适当的分析软件对分类的网织红细胞和血小板分别计数。作为散射光强度可以举出前向散射光强度和侧向散射光强度。

下面根据以下实施例，详细说明本发明，但这些实施例并非对本发明范围的限制。

实施例1～3和比较例1～12

(试剂)

制备下列组份的血小板测定用试剂。

(1)色素液

血小板染色用色素后述浓度

乙二醇 1L

(2)稀释液

三(羟甲基)甲基甘氨酸(缓冲剂)(Tricine) 1.8g

柠檬酸三钠二水合物(多元负离子) 29g

月桂三甲基氯化铵(LTAC) 0.15g

蒸馏水 1L

(调节为pH9.0、渗透压200mOSm/Kg·H₂O)

作为血小板染色用色素以如下浓度使用如下色素。括号内表示试剂与标本混合时的最终浓度。这些色素的化学式如图1所示。

实施例

1卡布里蓝GON(CROMA公司生产) 20.5ppm(0.4ppm)

2尼罗蓝氯化物(东京化成公司生产) 20.5ppm(0.4ppm)

3灿烂甲酚蓝ALD(希格玛公司生产) 51.25ppm(1ppm)

比较例

1天青A(希格玛公司生产) 102.5ppm(2ppm)

2天青D(希格玛公司生产) 102.5ppm(2ppm)

3天青C(希格玛公司生产) 102.5ppm(2ppm)

4亚甲蓝NNX(希格玛公司生产) 102.5ppm(2ppm)

5烯酯(cresylvioletacetate)(希格玛公司生产) 1025ppm(20ppm)

6基础绿5(东京化成公司生产) 1025ppm(20ppm)

7丁烯蓝(希格玛公司生产) 102.5ppm(2ppm)

8新丁烯蓝(CROMA公司生产) 1025ppm(20ppm)

9甲苯胺蓝(东京化成公司生产) 102.5ppm(2ppm)

10氧氮杂芑750(NACALAI公司生产) 102.5ppm(2ppm)

11氧氮杂芑1(Exciton公司生产) 1025ppm(20ppm)

12氧氮杂芑4(Exciton公司生产) 1025ppm(20ppm)

(方法)

将稀释液1mL注入试管，在40℃水槽加热。

在此稀释液中添加色素液20μL和作为标本的健康人全血5μL，40℃培养25秒，制备测定用试样。然后将测定用试样导入有633nm励起光源的流式细胞仪的检测器，在检测器用励起光照射测定用试样中的细胞，检测从该细胞发出的散射光信号和荧光信号。分析所得信号，测定测定用试样中的血小板。

(结果)

用上述各种色素液测定所得散点图如图1A、图1B和图1C所示。散点图1纵轴为前向散射光强度、横轴为荧光强度。散点图2将散点图1的纵轴换为log值。在散点图2用实线表示血小板出现区域。

从图1A、图1B和图1C的结果可以看出，当使用卡布里蓝、尼罗蓝或灿烂甲酚蓝作为血小板染色用色素时，血小板荧光强度比使用其他色素时强，可以更好地与其他血细胞区分。当血液中混有脂质粒子等杂质时，杂质团出现在散点图上荧光强度低的位置。因此得知，用卡布里蓝、尼罗蓝或灿烂甲酚蓝作为血小板染色用色素，可以区分血小板和杂质。

实施例4

关于血小板测定用试剂中的卡布里蓝适用浓度的探讨

在此，在实施例1的血小板测定用试剂的色素液中含有卡布里蓝GON作为血小板染色用色素。卡布里蓝GON在色素液中的含量为混合试剂和标本时的最终浓度为0.1～5.0ppm。其他均与实施例1相同，测定血小板。标本使用的分别是健康人的全血、含破碎红细胞血液和含脂质血液。

(结果)

所得散点图如图2所示。散点图1纵轴为前向散射光强度、横轴为荧光强度。散点图2将散点图1的纵轴换为log值。散点图3为将散点图2的血小板出现区域四周放大后的图。在散点图3用实线表示血小板出现的区域。由此结果可以看出，卡布里蓝GON浓度为0.1～5.0ppm时，即使脂质作为杂质存在，也能够明确识别血小板。还可看出，当卡布里蓝GON浓度为0.1～2.0ppm时，即使作为杂质存在破碎红细胞，也可以明确识别血小板。

实施例5

关于血小板测定用试剂中的尼罗蓝适用浓度的探讨

在此，在实施例2的血小板测定用试剂的色素液中含有尼罗蓝氯化物作为血小板染色用色素。尼罗蓝氯化物在色素液中的含量为混合试剂和标本时的最终浓度为0.05～5ppm。其他均与实施例2相同，测定血小板。标本使用的分别是健康人的全血、增加了破碎红细胞的含破碎红细胞血液和含脂质血液。

(结果)

所得散点图如图3A和图3B所示。散点图1纵轴为前向散射光强度、横轴为荧光强度。散点图2将散点图1的纵轴换为log值。散点图3为将散点图2的血小板出现区域四周放大后的图。在散点图3用实线表示血小板出现的区域。由此结果可以看出，尼罗蓝氯化物浓度为0.05～5.0ppm时，即使脂质作为杂质存在，也能够明确识别血小板。还可看出，当尼罗蓝氯化物浓度为0.05～2.0ppm时，即使作为杂质存在破碎红细胞，也可以明确识别血小板。

实施例6

关于血小板测定用试剂中的灿烂甲酚蓝适用浓度的探讨

在此，在实施例3的血小板测定用试剂的色素液中含有灿烂甲酚蓝ALD作为血小板染色用色素。灿烂甲酚蓝ALD在色素液中的含量为混合试剂和标本时的最终浓度为0.1～10ppm。其他均与实施例3相同，测定血小板。标本使用的分别是健康人的全血、含破碎红细胞血液和含脂质血液。

(结果)

所得散点图如图4A和图4B所示。散点图1纵轴为前向散射光强度、横轴为荧光强度。散点图2将散点图1的纵轴换为log值。散点图3为将散点图2的血小板出现区域四周放大后的图。在散点图3用实线表示血小板出现的区域。由此结果可以看出，灿烂甲酚蓝ALD浓度为0.1～10.0ppm时，即使脂质作为杂质存在，也能够明确识别血小板。还可看出，当灿烂甲酚蓝ALD浓度为0.2～2.0ppm时，即使作为杂质存在有破碎红细胞，也可以明确识别血小板。

实施例7

本发明的测定方法与传统方法(免疫染色法)的比较

为了检验本发明测定方法与运用免疫染色传统技术的方法的相关关系，实施了本实施例。

(用免疫染色法测定血小板)

作为传统技术方法，按照美国临床病理学杂志(2001)：115，p.460-464上记载的国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐的标准方法，对血小板数量进行测定。此方法基于使用对血小板表面抗原有特异性的抗体进行免疫染色。即，在试管中注入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的人CD41a抗体(BECTONDICKINSON(BD)公司生产)5μL、FITC标记的人CD61抗体(BD公司生产)5μL和磷酸缓冲生理盐水(PBS、pH7.2～7.4、和光公司生产)100μL。加入标本(血液)5μL，轻轻搅拌。将所得混合液在阴暗处室温培养15分钟。在该混合液中添加PBS4.85mL。用FACS Canto(BD公司制)测定所得混合液，得血小板测定结果(a)和红细胞测定结果(b)。再用自动血细胞计数仪XE-2100(希森美康公司制)测定在此使用的标本(血液)，求红细胞数(c)，最后利用以下公式算出使用传统方法时的血小板数。

血小板数＝红细胞数(c)×(血小板测定结果(a)/红细胞测定结果(b))

(本发明的测定方法)

在此，实施例1的血小板测定用试剂的色素液中含有卡布里蓝GON作为血小板染色用色素。卡布里蓝GON在色素液中的含量为混合试剂和标本时的最终浓度为1.2ppm。实施例2的血小板测定用试剂的色素液中含有尼罗蓝氯化物作为血小板染色用色素。尼罗蓝氯化物在色素液中的含量为混合试剂和标本时的最终浓度为0.5ppm。除此之外，其他均分别与实施例1、实施例2相同，测定血小板，计算血小板数量。标本使用的是与免疫染色法所用相同的血液。

(结果)

与使用免疫染色法测得的血小板数相对照地绘制使用本发明测定方法测得的血小板数的图如图5A和图5B所示。图5A为本发明方法使用卡布里蓝GON时的结果。图5B为本发明方法使用尼罗蓝氯化物时的结果。

从图5A和图5B可以看出，比较用传统免疫染色法测得的结果，与本发明方法测得的结果无差别，显示出良好的相关性。

实施例8

在此，用血小板染色用第一色素和网织红细胞染色用第二色素配制网织红细胞和血小板测定用试剂，测定网织红细胞和血小板。

(试剂)

试剂成份如下：

(1)色素液

血小板染色用第一色素后述浓度

网织红细胞染色用第二色素后述浓度

(2)稀释液

三(羟甲基)甲基甘氨酸(缓冲剂)(Tricine) 1.8g

柠檬酸三钠二水合物(多元负离子) 29g

月桂三甲基氯化铵(LTAC) 0.15g

蒸馏水 1L

(调节为pH9.0、渗透压200mOSm/Kg·H₂O)

作为网织红细胞染色用第二色素使用如下色素。第二色素在色素液中的含量为混合试剂和标本时的最终浓度达到0.5ppm、6ppm或10ppm。

作为上述血小板染色用第一色素使用的是卡布里蓝GON、尼罗蓝氯化物或灿烂甲酚蓝ALD。第一色素在色素液中的含量为，混合试剂和标本时的最终浓度达到卡布里蓝GON 1ppm、尼罗蓝氯化物0.5ppm或灿烂甲酚蓝ALD 1.5ppm。

标本分别使用的是健康人的全血、含破碎红细胞血液和含脂质血液。测定与实施例1同样。

(结果)

所得散点图如图6A、图6B和图6C所示。散点图1纵轴为前向散射光强度、横轴为荧光强度。散点图2将散点图1的纵轴换为log值。散点图3为将散点图2的血小板出现区域四周放大后的图。在散点图1用实线表示网织红细胞出现的区域。在散点图3用实线表示血小板出现的区域。

作为比较，色素液中未添加血小板染色用第一色素时的散点图也一并展示在图6A、图6B和图6C。

从图6A～图6C的结果可以看出，当网织红细胞染色用第二色素的浓度在0.5～10ppm范围内时，试剂中含有血小板染色用第一色素比起试剂中不添加血小板染色用第一色素来，试剂中含有血小板染色用第一色素即使存在破碎红细胞和脂质，也可以明确识别血小板和网织红细胞。

实施例9

在此，实施例8使用的网织红细胞和血小板测定用试剂的色素液中含有实施例8使用的网织红细胞染色用第二色素。第二色素在色素液中的含量为混合试剂和标本时的最终浓度为0.5ppm、6ppm或10ppm。此色素液中还含有卡布里蓝GON作为血小板染色用第一色素。卡布里蓝GON在色素液中的含量为混合试剂和标本时的最终浓度为0.5ppm、1ppm或2ppm。标本与实施例8相同。并与实施例8一样进行测定。

(结果)

所得散点图如图7A、图7B和图7C所示。散点图1纵轴为前向散射光强度、横轴为荧光强度。散点图2将散点图1的纵轴换为log值。散点图3为将散点图2的血小板出现区域四周放大后的图。散点图1用实线表示网织红细胞出现的区域。散点图3用实线表示血小板出现的区域。由此结果可以看出，当网织红细胞染色用第二色素为0.5ppm～10ppm、卡布里蓝GON为0.5ppm～2.0ppm时，即使作为杂质存在脂质和破碎红细胞，也可以将网织红细胞和血小板与杂质明确区分开。

实施例10

在此，实施例8使用的网织红细胞和血小板测定用试剂的色素液中含有实施例8使用的网织红细胞染色用第二色素。第二色素在色素液中的含量为混合试剂和标本时的最终浓度为0.5ppm、6ppm或10ppm。此色素液中还含有尼罗蓝氯化物作为血小板染色用第一色素。尼罗蓝氯化物在色素液中的含量为混合试剂和标本时的最终浓度为0.1ppm、0.5ppm或2ppm。标本与实施例8相同。并与实施例8一样进行测定。

(结果)

所得散点图如图8A、图8B和图8C所示。散点图1纵轴为前向散射光强度、横轴为荧光强度。散点图2将散点图1的纵轴换为log值。散点图3为将散点图2的血小板出现区域四周放大后的图。散点图1用实线表示网织红细胞出现的区域。散点图3用实线表示血小板出现的区域。由此结果可以看出，当网织红细胞染色用第二色素为0.5ppm～10ppm、尼罗蓝氯化物为0.5ppm～2.0ppm时，即使作为杂质存在脂质和破碎红细胞，也可以将网织红细胞和血小板与杂质明确区分开。

实施例11

在此，实施例8使用的网织红细胞和血小板测定用试剂的色素液中含有实施例8使用的网织红细胞染色用第二色素。第二色素在色素液中的含量为混合试剂和标本时的最终浓度为0.5ppm、6ppm或10ppm。此色素液中还含有灿烂甲酚蓝ALD作为血小板染色用第一色素。灿烂甲酚蓝ALD在色素液中的含量为混合试剂和标本时的最终浓度为1ppm、1.5ppm或2ppm。标本与实施例8相同。并与实施例8一样进行测定。

(结果)

所得散点图如图9A、图9B和图9C所示。在这些图中，“BCB”表示灿烂甲酚蓝ALD。散点图1纵轴为前向散射光强度、横轴为荧光强度。散点图2将散点图1的纵轴换为log值。散点图3为将散点图2的血小板出现区域四周放大后的图。散点图1用实线表示网织红细胞出现的区域。散点图3用实线表示血小板出现的区域。由此结果可以看出，当网织红细胞染色用第二色素为0.5ppm～10ppm、灿烂甲酚蓝ALD为1.0ppm～2.0ppm时，即使作为杂质存在脂质和破碎红细胞，也可以将网织红细胞和血小板与杂质明确区分开。

Claims

1.一种分析血小板的试剂，包括：血小板染色用色素，所述血小板染色用色素选自于由卡布里蓝、尼罗蓝和灿烂甲酚蓝构成的组群中的至少一种色素。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：还包括网织红细胞染色用第二色素，所述试剂可以分析血小板和网织红细胞。

3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于：所述第二色素是能够对核酸染色的花青色素。

4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：所述第二色素如结构式(I)所示：

R₅及R₇分别为氢原子或碳原子数1～3的羟烷基；

R₆及R₈分别为氢原子、酰基或碳原子数1～3的烷基；

Z为硫磺原子、氧原子、硒原子或CR₉R₁₀；

R₉及R₁₀分别为碳原子数1～3的烷基；

n为1或2的整数；

x和y分别为0～3的整数；

X^-为负离子。

5.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于：还包括防止红细胞非特异性染色的多元负离子。

6.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：pH值为6.0～11.0。

7.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：渗透压为150～600mOsm/kg。

8.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：还包括提高色素渗透性的染色促进剂。

9.根据权利要求8所述的试剂，其特征在于：所述染色促进剂为阳离子型表面活性剂。

10.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：所述血小板染色用色素可从脂质粒子中识别出血小板，专对血小板染色。

11.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：所述血小板染色用色素可从破碎红细胞中识别出血小板，专对血小板染色。

12.一种血小板分析用试剂盒，包括：

含有用于测定时保持一定pH值的缓冲剂的第一试剂；及

含有血小板染色用色素的第二试剂，所述血小板染色用色素选白于由卡布里蓝、尼罗蓝和灿烂甲酚蓝组成的组群中的至少一种色素。

13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于：所述第二试剂含有网织红细胞染色用第二色素，所述试剂盒可以对血小板和网织红细胞进行分析。

14.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于：还包括含有网织红细胞染色用第二色素的第三试剂；所述试剂盒可以对血小板和网织红细胞进行分析。

15.根据权利要求13或14所述的试剂盒，其特征在于：所述第二色素是能够对核酸染色的花青色素。

16.一种血小板分析方法，包括以下步骤：

测定用试样制备步骤，将血小板染色用色素与标本混合，制备测定用试样，所述色素选自于由卡布里蓝、尼罗蓝和灿烂甲酚蓝组成的组群；

测定步骤，光照所述测定用试样制备步骤中得到的测定用试样中的细胞，测定该细胞发出的散射光和荧光；以及

检出步骤，根据所述测定步骤中测得的散射光和荧光检出血小板。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于：

18.根据权利要求16所述的方法，其特征在于：所述测定用试样导入流式细胞仪的流动室，光照流经流动室的测定用试样中的细胞。

19.根据权利要求16所述的方法，其特征在于：还包括对所述检出的血小板计数的步骤。

20.根据权利要求17所述的方法，其特征在于：还包括对所述检出的血小板和网织红细胞计数的步骤。