JPWO2010013678A1

JPWO2010013678A1 - 子宮頸部異常細胞検出用試薬及びそれを用いる子宮頸部異常細胞検出方法

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Publication number: JPWO2010013678A1
Application number: JP2010522712A
Authority: JP
Inventors: 将且森田; 昭典河合; 幸夫辻野
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2008-07-30
Filing date: 2009-07-27
Publication date: 2012-01-12
Also published as: WO2010013678A1; AU2009277638A1; KR20110049830A; US20110124005A1; EP2320230A1; CN102112875A

Abstract

本発明は、一般式（Ｉ）の色素を含む、子宮頸部から採取された細胞を含む生体試料に含まれる異常細胞を検出するための子宮頸部異常細胞検出用試薬に関する。

Description

本発明は、子宮頸部から採取された生体試料中の異常細胞、例えば癌細胞又は異型細胞を検出するための試薬及びそれを用いる子宮頸部から採取された試料中の異常細胞の検出方法を提供する。

子宮頸癌は、子宮頸部の表層上皮に発生する癌であり、大部分は扁平上皮癌である。通常の子宮頸癌の検査では、まず、子宮頸部から採取した細胞を細胞診によりスクリーニング検査に供し、ここで異常と判断された場合に、組織診などの精密検査が行われる。

子宮頸部の組織診では、癌細胞が発生する前段階として、上皮内に出現してくる異型細胞の出現の程度により、軽度、中等度又は高度の３段階の異形成に分類する。高度異形成からさらに悪化すると、上皮内に癌細胞が出現する段階となる。そして、癌細胞が上皮内に限局する「上皮内癌」、及び癌細胞が上皮から皮下組織に浸潤する「浸潤癌（いわゆる子宮頸癌）」へと進行する。

このような診断を行うための組織診を実施するか否かを判断するためのスクリーニング検査として行われる細胞診は、子宮頸部からの生体試料をスライドグラスに塗抹し、顕微鏡などで観察することにより行われる。
細胞診は、検査士の観察に基づく判断が必要であり、例えば検査試料の調製によっては子宮頸癌を見逃す可能性がある。また、検査士の熟練した技術が必要となるので、多量の試料を迅速かつ高精度に検査することが困難である。さらに、熟練した技術を要する検査士は、不足する可能性が高い。

そこで、細胞診の補助として、子宮頸部からの生体試料に含まれる異常細胞の検出を自動化システムにより行うための試みがなされている。
自動化システムに用い得る異常細胞の検出方法として、蛍光色素で細胞の核に存在するＤＮＡを染色し、フローサイトメトリで蛍光を測定してＤＮＡ量を算出し、算出されたＤＮＡ含量に基づいて癌細胞を検出することが知られている。

W. A. Lindenら（非特許文献１）は、子宮頸部から採取した細胞のＤＮＡをエチジウムブロミドで染色して蛍光を測定して癌細胞を検出すること、及びＤＮＡをエチジウムブロミドで染色し、同時にタンパク質をフルオレセインイソチオシアネート（FITC）で染色して、ＤＮＡ量とタンパク質の量とから癌細胞を検出することを行っている。
B. J. Fowlkesら（非特許文献２）は、プロピジウムアイオダイド（PI）及びFITCで細胞の核及び細胞質をそれぞれ染色し、フローサイトメータで２種類の蛍光を測定し、これらの蛍光強度に基づいて癌細胞を検出している。

しかし、これらの方法は、擬陽性及び擬陰性の率が高く、子宮頸癌の自動化検出システムへの応用は実現していない。

米国特許第４８８３８６７号（特許文献１）には、以下の一般式：
（式中、ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ、Ｎ−アルキル（炭素数１〜６）又はＣ（ＣＨ₃）_nであり、Ｒ₁は炭素数１〜６のアルキルであり、Ｒ₂は炭素数１〜６のアルキルであり、Ｒ₃は縮合ベンゼン、炭素数１〜６のアルキル、メトキシ又は存在せず、Ｒ₄は炭素数１〜６のアルキル、メトキシ又は存在せず、ｎは０又は１〜６の整数である）
を用いて、網状赤血球を染色して検出することが記載されている。

米国特許第４８８３８６７号明細書

W. A. Lindenら、J. Histochem. Cytochem.、1979年、Vol. 27、p.529〜535 B. J. Fowlkesら、J. Histochem. Cytochem.、1976年、Vol. 24、p. 322〜331

本発明は、子宮頸部から採取した生体試料中に含まれる異常細胞をより高感度に検出できる試薬及びそのような試薬を用いる子宮頸部異常細胞検出方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記の課題を解決するために、以下の点に着目した。
すなわち、一般に、細胞が癌化すると、細胞の核に異常が生じることが知られている（例えば核の大きさの変化、ＤＮＡ量の増大、クロマチン凝集など）。そこで、本発明者らは、これらの現象に基づいて、癌細胞を正常細胞から区別できるのではないかと考えた。
そして、このような核の異常を検出するために、一般式（Ｉ）：

（式中、
Ｘは、Ｓ又はＯを示し、

は、
Ｒ¹及びＲ²は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を示し；

は、
Ｒ³及びＲ⁴は、同一又は異なって、置換基としてスルホン酸基を有してもよい炭素数１〜６の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を示す）
で表される化合物又はその塩を核酸染色色素として用いることにより、子宮頸部の異常細胞をより高感度に検出できることを見出して、本発明を完成した。

よって、本発明は、上記の一般式（Ｉ）の色素を含む、子宮頸部から採取された細胞を含む生体試料に含まれる異常細胞を検出するための子宮頸部異常細胞検出用試薬を提供する。
また、本発明は、
子宮頸部から採取された細胞を含む生体試料と、上記の子宮頸部異常細胞検出用試薬とを接触させ、測定用試料を調製する工程；
測定用試料をフローセルに流し、フローセルを流れる測定用試料に光を照射して、測定用試料からの蛍光を検出する工程；
検出された蛍光から生成される蛍光信号に基づいて、細胞の核に関する情報を取得する工程；及び
取得した核に関する情報に基づいて、前記試料中の異常細胞を検出する工程
を含む、生体試料中の異常細胞を検出する方法も提供する。

本発明の子宮頸部異常細胞検出用試薬を用いることにより、子宮頸部から採取された生体試料中の異常細胞を、より高感度に検出することができる。本発明の試薬を用いる異常細胞の検出方法は、異常細胞の検出感度が上昇し、より正確な子宮頸癌の診断に用いることができる。また、該方法は自動化することもできるので、子宮頸癌の検出を迅速かつ簡便に行うことを可能にする。

本発明の子宮頸部異常細胞検出用試薬(実施例１及び２)、及び比較試薬(比較例１)を用いて得られた異常細胞率を示す。本発明の子宮頸部異常細胞検出用試薬(実施例３)を用いて得られた異常細胞率を示す。本発明の子宮頸部異常細胞検出用試薬(実施例４)を用いて得られた異常細胞率を示す。フローサイトメータで検出される蛍光信号波形の例を示す。プロピジウムアイオダイド(ＰＩ)、又はＰＩ＋色素ＡによりＤＮＡを染色したときの蛍光強度を示す。（１）蛍光ピーク面積値に基づく判定(△)、（２）蛍光ピーク面積値及び蛍光ピーク値に基づく判定(◇)、及び（３）蛍光ピーク面積値、蛍光ピーク値及び蛍光パルス幅に基づく判定(●)のＲＯＣ解析の結果を示す。

本発明の子宮頸部異常細胞検出用試薬（以下、単に「試薬」ともいう）を用いることにより検出され得る異常細胞は、子宮頸部の疾患を反映すると考えられる病的な上皮細胞であり、癌細胞及び異型細胞を含む。本明細書において「異型細胞」とは、当該技術において知られている意味を有し、癌細胞ではないが、癌細胞に発展すると考えられる病的な上皮細胞である。これらの異常細胞は、細胞の核に異常が生じることが知られている（例えば核の大きさの変化、ＤＮＡ量の増大、クロマチン凝集など）。

本発明の試薬は、上記の一般式（Ｉ）の構造を有する色素を含む。
一般式（Ｉ）において、Ｘは、酸素原子又は硫黄原子である。
一般式（Ｉ）において、Ｒ¹及びＲ²は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を示す。
一般式（Ｉ）において、Ｒ³及びＲ⁴は、同一又は異なって、置換基としてスルホン酸基を有してもよい炭素数１〜６のアルキル基を示す。

本明細書において、「炭素数１〜６のアルキル基」とは、炭素原子を１〜６個有する直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を意味する。このようなアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、tert-ペンチル、ヘキシル、イソヘキシルなどが挙げられる。
本明細書において、「スルホン酸基」とは、−SO₃H又は−SO₃ ^-を意味する。

上記の一般式（Ｉ）において、Ａ基を有するチアゾリル又はオキサゾリル基を含む構造は、Ｂ基を有するピリジン環の窒素に関してオルト、メタ又はパラ位で結合可能であり、より好ましくはオルト又はパラ位で結合する。

上記の一般式（Ｉ）で表される化合物は、塩として存在してもよい。その場合、カウンターイオンとしては、ハロゲンイオン、トシレートアニオンなどのアニオン又はトリエチルアンモニウムカチオンなどのカチオンのいずれであってもよい。
より好ましくは、上記の一般式（Ｉ）で表される化合物は塩であり、カウンターイオンがアニオンである。また、アニオンとしては、ヨウ素アニオンが好ましい。

上記の一般式（Ｉ）の化合物又はその塩は、ＤＮＡの二重らせんの副溝に結合でき、ＤＮＡに対する特異性が高いと考えられている。このような性質から、該化合物は、本発明の試薬に含まれることにより、ＤＮＡを特異的に染色できると考えられる。

上記の式（Ｉ）の化合物の好ましい例は、以下のとおりである。
以下の式で表される色素Ａ（CAS番号：15941-82-9）：

色素Ｂ（CAS番号：24147-36-2；チアゾールオレンジ）：

色素Ｃ（CAS番号：143413-86-9；オキサゾールイエロー）：

色素Ｄ（CAS番号：223654-13-5）：

色素Ｅ（CAS番号：97214-99-8）：

色素Ｆ（CAS番号：16768-72-2）：

色素Ｇ

色素Ｈ

色素Ｊ

色素Ｋ

色素Ｌ

上記の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、一般的な有機化合物の合成手法を用いることにより、製造することができる。また、上記の具体的な色素Ａ〜Ｌは、株式会社林原生化学研究所から入手することもできる。なお、色素Ａ〜Ｌの具体的な製造例を実施例に記載する。

本発明の試薬は、上記の一般式（Ｉ）の色素に加えて、インターカレート色素をさらに含むことが好ましい。本明細書において、「インターカレート色素」とは、ＤＮＡの塩基対の間の水素結合間に入り込み、塩基と結合を形成し得る色素を意味する。インターカレート色素としては、プロピジウムアイオダイド（PI）、エチジウムブロミド及びアクリジンオレンジから選択される色素が好ましい。なかでも、PIがより好ましい。

上記の式（Ｉ）の色素及び所望により加えられるインターカレート色素の本発明の試薬中の濃度は、該試薬を子宮頸部からの細胞を含む生体試料と混合したときに合計で０．０１〜１００ｍｇ／ｍＬとなる濃度が好ましく、より好ましくは合計で０．０１〜１０ｍｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは合計で０．１〜１０ｍｇ／ｍＬである。

上記の式（Ｉ）の色素と、所望により加えられるインターカレート色素との混合比は、式（Ｉ）の色素：インターカレート色素＝１：０〜１００（重量比）であることが好ましく、より好ましくは１：１０〜３０である。

本発明の試薬は、６〜９のｐＨを有することが好ましく、より好ましくは７〜８．５のｐＨを有する。このようなｐＨを有することにより、細胞核の形態を保つことができ、該試薬により染色された細胞核からの蛍光を安定させ得る。

上記の範囲のｐＨを有する試薬とするために、上記の試薬は、適切な緩衝剤を含み得る。緩衝剤としては、上記の範囲のｐＨ±２付近に緩衝能を持つ緩衝剤を用いることができる。該緩衝剤としては、Tris (トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)、HEPES (N-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N'-[2-エタンスルホン酸])、PBS (リン酸緩衝生理食塩水)などが挙げられる。
これらの緩衝剤の濃度は、用いる緩衝剤の種類及び所望のｐＨ範囲に応じて適宜決定できる。

本発明の試薬は、１５０〜５００mOsmの浸透圧を有することが好ましく、より好ましくは２００〜３５０mOsmである。このような浸透圧を有することにより、細胞核の形態を保つことができ、該試薬により染色された細胞核からの蛍光を安定させ得る。

上記の範囲の浸透圧を有する試薬とするために、適切な浸透圧調節剤を用い得る。浸透圧調整剤としては、糖類、アミノ酸、塩化ナトリウムなどが挙げられる。また、上記の緩衝剤の濃度を調節することによっても浸透圧を調整できる。
糖類としては、特に限定されないが、単糖類（例えばグルコース、フルクトースなど）、多糖類（例えばアラビノースなど）、糖アルコール（例えばキシリトール、ソルビトール、マンニトール、リビトールなど）などが挙げられる。これらの１種又は２種以上を用い得る。
上記のアミノ酸としては、バリン、プロリン、グリシン、アラニンなどが挙げられる。

上記の浸透圧調整剤の濃度は、用いる浸透圧調整剤の種類に応じて適宜決定できるが、例えば、塩化ナトリウムを用いる場合、０．０１〜１０ｇ／Ｌ程度であることが好ましい。

上記の試薬は、子宮頸部の細胞を含む生体試料と混合して用いることにより、該生体試料中の異常細胞を検出することができる。子宮頸部の細胞を含む生体試料は、子宮頸部を擦ることにより採取されたスワブ、子宮頸部から採取した組織、これらを適切に処理して得られた試料溶液などを含む。適切な処理とは、スワブを適切な処理液、例えば界面活性剤を好ましくは含む緩衝液に浸漬してスワブに付着した細胞を処理液中に懸濁させること、子宮頸部の組織を適切な処理液、例えば界面活性剤を好ましくは含む緩衝液に懸濁し、所望によりホモジナイズすることなどを含む。

上記の試薬は、上記の成分の他に、所望により他の成分を含み得る。他の成分としては、界面活性剤、キレート化剤、ＲＮａｓｅ、保存剤などが挙げられる。

界面活性剤としては、ノニオン界面活性剤が好ましい。該ノニオン界面活性剤は、ポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤が好ましく、ポリオキシエチレン（１５）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン（１５）セチルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルなど挙げられる。これらの１種又は２種以上を用いることができる。
上記の界面活性剤は、本発明の試薬を上記の生体試料と混合したときに、０．０１％〜２％となるような濃度で該試薬中に含まれることが好ましい。

上記のキレート化剤としては、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)カリウム塩、EDTAナトリウム塩などが挙げられる。
上記のキレート化剤は、本発明の試薬を上記の生体試料と混合したときに、１mM〜２００mMとなるような濃度で該試薬中に含まれることが好ましい。

上記のＲＮａｓｅは、生体試料中に存在し得るＲＮＡを分解するために本発明の試薬中に混合できる。ＲＮａｓｅは、市販で入手できるものを用いることができ、主にウシ由来のものが用いられる。
ＲＮａｓｅは、本発明の試薬を上記の生体試料と混合したときに、１ｕｎｉｔ〜２０ｕｎｉｔとなるような濃度で該試薬中に含まれることが好ましい。

上記の保存剤は、試薬中の微生物の繁殖を阻止する添加物である。具体的な保存剤としては、２−ピリジルチオ−１−オキシドナトリウム、β−フェネチルアルコールなどが挙げられる。

本発明の試薬は、上記の式（Ｉ）の色素、及び所望により任意成分を、適切な溶媒に溶解することにより得ることができる。適切な溶媒としては、これらの成分を溶解し得るものであれば特に限定されない。該溶媒は、水、メタノール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド（DMSO）、これらの混液などであり得る。
上記の試薬は、上記の適切な溶媒に式（Ｉ）の色素及び所望により任意成分を溶解した後に、凍結乾燥、噴霧乾燥などの乾燥方法により固体の形態で得られるものであってもよい。固体の形態の試薬は、用時に上記の適切な溶媒を加えることにより溶解して使用できる。

上記の式（Ｉ）の色素を含む本発明の試薬は、単独の試薬として提供され得るが、上記の式（Ｉ）の色素を少なくとも含む第１試薬と、上記の任意の成分のいずれかを含む第２試薬（又は複数の試薬）とからなる試薬キットとしても提供され得る。
上記の試薬キットの形態としては、例えば、上記の式（Ｉ）の色素を含む第１試薬と、上記の緩衝剤を含む第２試薬とからなる試薬キット；上記の式（Ｉ）の色素及びインターカレート試薬を含む第１試薬と、上記の緩衝剤を含む第２試薬と、上記のＲＮａｓｅを含む第３試薬とからなる試薬キット；上記の式（Ｉ）の色素を含む第１試薬と、上記のインターカレート試薬を含む第２試薬と、上記の緩衝剤を含む第３試薬と、上記のＲＮａｓｅを含む第４試薬とからなる試薬キットなどが挙げられる。

上記の本発明の試薬を用いる生体試料中の異常細胞を検出する方法も、本発明の一つである。
上記の方法は、子宮頸部から採取された細胞を含む生体試料と、上記の子宮頸部異常細胞検出用試薬とを接触させ、測定用試料を調製する工程；
測定用試料をフローセルに流し、フローセルを流れる測定用試料に光を照射して、測定用試料からの蛍光を検出する工程；
検出された蛍光から生成される蛍光信号に基づいて、細胞の核に関する情報を取得する工程；及び
取得した核の情報に基づいて、試料中の異常細胞を検出する工程
を含む。
本明細書において、「生体試料中の異常細胞を検出する」とは、生体試料中の異常細胞の存否を検出すること、異常細胞の数を計数すること、及び／又は異常細胞を正常細胞から区別することを意味する。

上記の方法において、上記の生体試料と上記の試薬とは、生体試料が液体である場合、生体試料：試薬＝１：１〜５０（容量比）で混合することが好ましく、より好ましくは１：８〜１５である。上記の試薬が試薬キットの形態である場合、生体試料と、試薬キット中の全ての試薬の合計との容量比が上記の範囲になるように混合され得る。
また、生体試料が細胞ペレットのように液体でない場合、上記の試薬は、試薬中の各成分が上記の好ましい範囲となるような量で加えられ得る。

上記の生体試料と試薬との接触は、２０〜４０℃の温度において０．５〜２０分間行うことが好ましい。反応温度が高いときは反応時間を短くし、反応温度が低いときは反応時間を長くすることができる。
上記の接触は、上記の生体試料と試薬とを混合し、所定の時間静置することにより行うことができる。

上記のように生体試料と試薬との接触により調製された測定用試料を、次いで、フローサイトメータのフローセルに供する。
フローサイトメータは、フローセル、光源、放射された光を検出する検出部、検出部から出力されるデータを分析する分析部などを備える従来公知のフローサイトメータを用いることができる。フローサイトメータの光源は、上記の色素の励起に好適な波長を有し得る光源を用い得る。光源としては、赤色半導体レーザ、青色半導体レーザ、アルゴンレーザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザなどが使用され得る。

上記のフローサイトメータを用いて、フローセルを流れる測定用試料に光を照射する。照射する光は、上記の色素の励起に好適な波長の光であり、好ましくは４００〜６００ｎｍの光である。
上記の波長の光を照射された測定用試料から発光される蛍光を、フローサイトメータの検出部で検出できる。蛍光の種類としては特に限定されず、側方蛍光、前方蛍光などが挙げられる。また、検出する蛍光の波長としては、５００〜７００ｎｍの蛍光が好ましい。

上記の方法においては、上記の光を照射された測定用試料から放射される散乱光を合わせて検出することもできる。散乱光の種類は特に限定されず、前方散乱光（例えば、受光角度０〜２０度付近）、側方散乱光（受光角度９０度付近）などの散乱光が挙げられる。一般に、前方散乱光は細胞の大きさの情報を反映し、側方散乱光は細胞の核や顆粒などの内部情報を反映することが知られている。これらの散乱光の散乱光幅（散乱光のパルス幅ともいう）、散乱光強度（散乱光のピーク値ともいう）などを散乱光情報として取得できる。

検出部で検出された蛍光は、蛍光信号としてフローサイトメータの分析部に出力され得る。このようにして得られる蛍光信号の波形に基づいて、細胞の核に関する情報を取得する。蛍光信号は、通常、検出される蛍光の強度を縦軸にとり、蛍光信号の検出時間を横軸にとることにより、信号波形を得ることができる。このような蛍光信号の波形の例を、図４に示す。

上記の核に関する情報は、細胞のＤＮＡ量に関する情報、細胞のクロマチン凝集に関する情報及び細胞の核径に関する情報から選択される少なくとも２つであるのが好ましい。より好ましくは、これらの３つの情報を取得することである。
細胞のＤＮＡ量に関する情報は、上記の蛍光信号の波形の面積に対応する値により提供され得る。細胞のクロマチン凝集に関する情報は、波形の高さに対応する値（ピーク強度ともいう）により提供され得る。細胞の核径に関する情報は、蛍光信号の波形の幅に対応する値（パルス幅ともいう）により提供され得る。
蛍光信号の波形からこれらの値を取得するための蛍光信号の波形の解析は、それ自体公知の方法により行うことができる。

上記のようにして取得した核の情報に基づいて、生体試料中に異常細胞が含まれている場合は、生体試料中の異常細胞を検出できる。
好ましくは、上記の核の情報を提供し得る２つ又は３つの値をグラフ上にプロットして、２次元又は３次元の解析を行うことにより、異常細胞の検出を行う。それ自体公知の細胞診の方法により判定された正常細胞を含む生体試料と、異常細胞を含む生体試料とについてこれらの解析の値を比較することにより、適切な閾値を設定できる。このような解析法は、当業者に公知である。そして、該閾値以上（又は以下）の値を示す細胞を、異常細胞と判定できる。このような方法により、生体試料中に異常細胞が存在するか否かを検出できる。

本発明の方法において用いられる試薬に含まれる式（Ｉ）の色素は、上記のように、細胞の核内のＤＮＡの副溝に結合すると考えられる。よって、該色素から発光される上記の蛍光は、細胞の核に関する情報を提供できると考えられる。上記のように、異常細胞は、核の大きさの変化、ＤＮＡ量の増大、クロマチン凝集などの核の異常を有することが知られているので、異常細胞から得られる上記の蛍光に基づく情報は、正常細胞のものとは異なると考えられる。本発明の方法は、このような違いを利用することにより、異常細胞を正常細胞から区別することを可能にする。

上記の核の情報に基づいて検出される異常細胞の数を計数することもできる。このようにして計数される異常細胞数の、全上皮細胞数に対する割合を算出し、この割合に基づいて、正常細胞を含む生体試料から異常細胞を含む生体試料を区別することもできる。
全上皮細胞数は、上記のようにして測定され得る散乱光に基づいて得ることができる。

以下に、本発明を実施例により説明するが、本発明は、以下の実施例により限定されない。
色素の製造例
本発明に用い得る色素は、以下のようにして製造した。
製造例１
上記の色素Ａを、以下のようにして製造した。
反応容器に、以下の式（１）：
で表される化合物（２−メルカプトベンゾチアゾール）７．６ｇと、以下の式（２）：
で表される化合物（４−メチルキノリン）６．５ｇを硫酸ジエチル中、５時間攪拌しながら加熱して反応させた。さらにアセトニトリルとトリエチルアミンを加え、２時間加熱して反応させた。反応混合物を冷却し析出した結晶を取り出し、ヨウ化ナトリウム６．８ｇとメタノール中で１時間加熱して反応させた。反応混合物を冷却し析出した結晶を濾取した。赤色のモノメチン化合物（色素Ａ）の結晶が８．４ｇ得られた。
λmax 503nm, m.p. 304℃
¹H-NMR δ（TMS,ppm） 1.37-1.51 (6H, dt, CH3), 4.67 (4H, m, CH2), 6.93 (1H, s, CH), 7.39-7.42 (2H, m, ArH), 7.62 (1H, t, ArH), 7.75-7.80 (2H, m, ArH), 7.98-8.17 (3H,m, ArH), 8.66-8.81 (2H, m, ArH).

製造例２
上記の色素Ｂを、以下のようにして製造した。
上記の式（１）で表される化合物と式（２）で表される化合物を用い、硫酸ジメチル中、製造例１と同様に反応させたところ、暗赤色のモノメチン化合物（色素Ｂ）の結晶が得られた。
λmax 502nm, m.p. 288℃
¹H-NMR δ（TMS,ppm） 3.98 (3H, s, CH3), 4.15 (3H, s, CH3), 6.87 (1H, s, CH), 7.29 (1H, dd, ArH), 7.39 (1H, t, ArH), 7.58 (1H, t, ArH), 7.71-7.78 (2H, m, ArH), 7.96-8.02 (3H, m, ArH), 8.59 (1H, d, ArH), 8.78 (1H, d, ArH).

製造例３
色素Ｃを、以下のようにして製造した。
式（１）で表される化合物に代えて、以下の式（４）：
で表される化合物を用い、硫酸ジメチル中で、製造例１と同様に反応させたところ、橙色のモノメチン化合物（色素Ｃ）の結晶が得られた。
λmax 476nm, m.p. 298℃
¹H-NMR δ（TMS,ppm） 3.86 (3H, s, CH3), 4.16 (3H, s, CH3), 6.27 (1H, s, CH), 7.38 (1H, t, ArH), 7.48 (1H, t, ArH), 7.64 (1H, d, ArH), 7.72-7.81 (2H, m, ArH), 7.92-8.05 (3H, m, ArH), 8.46 (1H, d, ArH), 8.79 (1H, d, ArH).

製造例４
上記の色素Ｄを、以下のようにして製造した。
式（２）で表される化合物に代えて、以下の式（７）：
で表される化合物を用い、硫酸ジメチル中で、製造例１と同様に反応させたところ、黄色のモノメチン化合物（色素Ｄ）の結晶が得られた。
λmax 445nm, m.p. 299℃
¹H-NMR δ（TMS,ppm） 3.72 (3H, s, CH3), 3.98 (3H, s, CH3), 6.25 (1H, s, CH), 7.30 (1H, t, ArH), 7.41 (2H, d, ArH), 7.49 (1H, t, ArH), 7.58 (1H, d, ArH), 7.90 (1H, d, ArH), 8.28 (2H, d, ArH).

製造例５
上記の色素Ｅを、以下のようにして製造した。
式（２）で表される化合物に代えて、以下の式（３）：
で表される化合物を用い、硫酸ジメチル中で、製造例１と同様に反応させたところ、赤橙色のモノメチン化合物（色素Ｅ）の結晶が得られた。
λmax 436nm, m.p. 305℃
¹H-NMR δ（TMS,ppm） 3.78 (3H, s, CH3), 4.07 (3H, s, CH3), 5.83 (1H, s, CH), 7.22-7.34 (2H, m, ArH), 7.52 (1H, t, ArH), 7.61 (1H, d, ArH), 7.89 (2H, dd, ArH), 8.16 (1H, t, ArH), 8.53 (1H, d, ArH).

製造例６
上記の色素Ｆを、以下のようにして製造した。
式（２）で表される化合物に代えて、以下の式（８）：
で表される化合物を用い、硫酸ジメチル中で、製造例１と同様に反応させたところ、黄橙色のモノメチン化合物（色素Ｆ）の結晶が得られた。
λmax 482nm, m.p. 280℃
¹H-NMR δ（TMS,ppm） 3.95 (3H, s, CH₃), 4.13 (3H, s, CH₃), 6.16 (1H, s, CH), 7.42 (1H, t, ArH), 7.58 (2H, t, ArH), 7.79 (2H, d, ArH), 7.90 (1H, t, ArH), 7.93-8.15 (4H, m, ArH), 8.46 (1H, d, ArH).

製造例７
上記の色素Ｇを、以下のようにして製造した。
式（１）で表される化合物と式（２）で表される化合物を用い、ｐ−トルエンスルホン酸エチル中で、製造例１と同様に反応させたところ、赤橙色のモノメチン化合物（色素Ｇ）の結晶が得られた。
λmax 503nm, m.p. 221℃
¹H-NMR δ（TMS,ppm） 1.39 (3H, t, CH3), 1.48 (3H, t, CH3), 2.28 (3H, s, CH3), 4.66 (4H, m, CH2), 6.93 (1H, s, CH), 7.11 (2H, d, ArH), 7.34-7.50 (4H, m, ArH), 7.63 (1H, t, ArH), 7.76 (2H, m, ArH), 7.97-8.05 (2H, m, ArH), 8.16 (1H, d, ArH), 8.66 (1H, d, ArH), 8.80 (1H, d, ArH).

製造例８
上記の色素Ｈを、以下のようにして製造した。
式（１）で表される化合物と式（２）で表される化合物を用い、プロパンサルトン中で、製造例１と同様に反応させたところ、赤橙色のモノメチン化合物（色素Ｈ）の結晶が得られた。
λmax 504nm, m.p. 303℃
¹H-NMR δ（TMS,ppm） 1.17 (9H, t, CH3), 2.14-2.21 (4H, m, CH2), 2.54 (2H, t, CH2), 2.71 (2H, t, CH2), 3.05-3.14 (6H, m, CH2), 4.73-4.82 (4H, m, CH2), 7.16 (1H, s, CH), 7.39 (2H, m, ArH), 7.61 (1H, t, ArH), 7.68 (1H, t, ArH), 7.85 (1H, d, ArH), 7.87-8.02 (2H, m, ArH), 8.23 (1H, d, ArH), 8.64 (1H, d, ArH), 8.88 (1H, br, OH),
9.08 (1H, d, ArH).

製造例９
上記の色素Ｊを、以下のようにして製造した。
式（１）で表される化合物に代えて、以下の式（５）：
で表される化合物を用い、硫酸ジメチル中で、製造例１と同様に反応させたところ、朱色のモノメチン化合物（色素Ｊ）の結晶が得られた。
λmax 507nm, m.p. 340℃
¹H-NMR δ（TMS,ppm） 2.41 (3H, s, CH3), 3.82 (3H, s, CH3), 4.00 (3H, s, CH3), 6.73 (1H, s, CH), 6.91 (1H, d, ArH), 7.20 (1H, s, ArH), 7.61-7.66 (1H, br, ArH), 7.87-7.92 (2H, m, ArH), 8.26 (1H, d, ArH), 8.65 (1H, d, ArH).

製造例１０
上記の色素Ｋを、以下のようにして製造した。
式（１）で表される化合物に代えて、以下の式（６）：
で表される化合物を用い、硫酸ジメチル中で、製造例１と同様に反応させたところ、茶色のモノメチン化合物（色素Ｋ）の結晶が得られた。
λmax 523nm, m.p. 253℃
¹H-NMR δ（TMS,ppm） 4.04 (3H, s, CH3), 4.38 (3H, s, CH3), 6.87 (1H, s, CH), 7.15 (1H, d, ArH), 7.61-7.71 (3H, m, ArH), 7.83-8.04 (5H, m, ArH), 8.45 (1H, d, ArH), 8.62 (1H, d, ArH), 8.70 (1H, d, ArH).

製造例１１
上記の色素Ｌを、以下のようにして製造した。
式（１）で表される化合物に代えて、式（４）で表される化合物を用いた以外は、製造例１と同様に反応させたところ、朱色のモノメチン化合物（色素Ｌ）の結晶が得られた。λmax 477nm, m.p. 276℃
¹H-NMR δ（TMS,ppm） 1.39 (3H, t, CH3), 1.47 (3H, t, CH3), 4.48 (2H, q, CH2), 4.64 (2H, q, CH2), 6.32 (1H, s, CH), 7.39 (1H, t, ArH), 7.48 (1H, t, ArH), 7.66-7.82 (3H, m, ArH), 7.96-8.02 (2H, m, ArH), 8.14 (1H, d, ArH), 8.53 (1H, d, ArH), 8.82 (1H, d, ArH).

以下のようにしてそれぞれの溶液を調製した。
（１）希釈液
以下の成分：
Tris（和光純薬工業株式会社：207-06275） 2.422g（20 mM）
塩化ナトリウム（和光純薬工業株式会社：191-01665） 5.1427g
EDTA-2K（同仁化学：K001） 16.178g（40 mM）
ポリオキシエチレン(20)オレイルエーテル（BO-20：日光ケミカル） 0.5g（0.05％）を秤量し、milli-Q水を約800ml加えてこれらを溶解した。NaOHを加えて、pH8.0+0.05に調整し、水で1000mlにフィルアップし、0.22μlのフィルタでろ過した。得られた希釈液は、300mOsmの浸透圧であった。

（２）色素液
（2-1）プロピジウムアイオダイド（PI）液
インターカレート色素であるPIの粉末（Sigma、P4170、lot 037K3676）を100 mg秤量し、メタノール50 mlに溶解した、これを、milli-Q水で500 mlまでメスアップし、PI液とした。
（2-2）色素Ａ液
上記の製造例１のようにして製造した色素Ａを約100 mg秤量し、ジメチルスルホキシド（DMSO）50 mlに溶解した。そこから10mlを取り出し、milli-Q水で1000 mlまでメスアップして、色素Ａ液を得た。
（2-3）PI+色素Ａ液
上記のようにして調製したPI液と色素Ａ液を等容量ずつ混合して、PI+色素Ａ液を得た。

（３）ＲＮａｓｅ液
ＲＮａｓｅ（Sigma：R4642）を、Tris HCl (pH8.0)溶液で希釈し、6.6ｕｎｉｔに調整した。

実施例１及び２、比較例１
対象の子宮頸部からスワブにより採取され、緩衝液に懸濁された検体（ｎ＝３８）を用いた。このうち、３３検体が正常細胞を含み、５検体が異常細胞を含むことが、通常の細胞診の方法であるパパニコロウ染色により確認されている。
これらの検体中の細胞数を計数し、１０⁵細胞を含む検体をチューブに移し、10,000 rpmで１分間、室温にて遠心した。上清をアスピレータで吸引し、（１）で作製した希釈液を1 mL加えた。ピペッティングを５回行うことにより細胞を懸濁し、10,000 rpmで１分間、室温にて遠心した。上清をアスピレータで吸引し、細胞の洗浄を行った。

以下のそれぞれの溶液を上記の細胞（生体試料）に加え（但し、希釈液は３７℃に加温）、ピペットで混合し、遮光して３７℃にて５分間静置して、細胞を染色した。

なお、色素液としては、比較例１はPI液、実施例１は色素Ａ液、実施例２はPI+色素Ａ液を用いた。また、生体試料と混合したときの色素の濃度は、比較例１では10μg/mL、実施例１では1μg/mL、実施例２ではPI 10μg/mL及び色素Ａ 1μg/mLであった。

得られた測定用試料を、473 nmの波長の光を照射する半導体レーザを光源とするフローサイトメータに供して、前方散乱光及び蛍光を測定し、前方散乱光パルス幅、前方散乱光ピーク値、蛍光ピーク値及び蛍光パルス幅を取得した。まず、前方散乱光のパルス幅と前方散乱光のピーク値とに基づいてスキャッタグラムを作製し、子宮頸部の上皮細胞を、その他の細胞から区別して計数した（「上皮細胞数」とする）。次いで、蛍光ピーク値及び蛍光パルス幅に基づいてスキャッタグラムを作製し、所定の閾値以上の領域に出現する細胞を異常細胞とし、その細胞の数を計数した（「異常細胞数」とする）。そして、異常細胞数を上皮細胞数で除した値を異常細胞率として算出した。得られた結果を、図１に示す。

図１では、（Ａ）比較例１、（Ｂ）実施例１、（Ｃ）実施例２の結果を示す。また、「正常」は、パパニコロウ染色で正常細胞を含むと判定された生体試料の結果を示し、「異常」は、パパニコロウ染色で異常細胞を含むと判定された生体試料の結果を示す。

比較例１の結果によると、従来のPIを用いる方法では、正常細胞を含む生体試料と異常細胞を含む生体試料とを区別するための閾値を「0.10％」と設定すると、１検体について、異常細胞を含む生体試料であるにも関わらず、「正常」と判定してしまう可能性がある。そして、この異常検体を「異常」と判定するために閾値の値を下げると、ほとんどの正常細胞を含む生体試料を「異常」と判定してしまうおそれがある。
これに対して、本発明の試薬を用いた実施例１及び２では、異常細胞を含む生体試料すべてを、異常細胞を含むと判定することが可能であり、しかも、正常細胞を含む生体試料のほとんどを正常であると判定することもできる。

実施例３
実施例２と同様にして、３６４検体について測定を行った。これらのうち、細胞診（パパニコロウ染色）により、３２１検体は正常、４３検体は異常細胞を含むと判定されている。
結果を、図２及び表２に示す。

図２及び表２の結果から、異常細胞を含む生体試料と正常細胞を含む生体試料とを区別する閾値を0.5％と設定することにより、３２１個の組織診による正常検体のうち、２８８個を正常検体、３３個を異常検体と判定し得ることがわかった。また、４３個の組織診による異常検体のうち、３８個を異常検体、５個を正常検体と判定し得ることがわかった。
よって、本発明の試薬を用いることにより、異常検体を「異常」と判定した割合に相当する方法の「感度」は８８％（＝３８／４３）であり、正常検体を「正常」と判定した割合に相当する方法の「特異度」は９０％（＝２８８／３２１）であった。

実施例４
以下のようにしてそれぞれの溶液を調製した。
（１）希釈液
以下の成分：
Tris（和光純薬工業株式会社：207-06275） 2.422g（20 mM）
EDTA-2K（同仁化学：K001） 16.178g（40 mM）
ポリオキシエチレン(20)オレイルエーテル（BO-20：日光ケミカル） 0.5g（0.05％）を秤量し、milli-Q水を約800ml加えてこれらを溶解した。NaOHを加えて、pH7.2+0.05に調整し、水で1000mlにフィルアップし、0.22μlのフィルタでろ過した。得られた希釈液は、230mOsmの浸透圧であった。

（２）色素液（PI+色素Ａ液）
PIの粉末200 mgを秤量し、メタノール50 mlに溶解した、これを、milli-Q水で500 mlまでメスアップし、PI液とした。また、色素Ａを約100 mg秤量し、DMSO 50 mlに溶解した。そこから10mlを取り出し、milli-Q水で1000 mlまでメスアップして、色素Ａ液を得た。これらを等容量混合することにより、PI+色素Ａ液を得た。

（３）ＲＮａｓｅ液
実施例２と同様にして調製した。

本実施例では、１３７検体を用いた。このうち、１１３検体が正常細胞を含み、２３検体が異常細胞を含むことが、細胞診（パパニコロウ染色）により確認されている。
実施例２と同様の手順により洗浄した細胞（生体試料）に、３７℃に温めた希釈液330μl、ＲＮａｓｅ液20μl及び色素液20μlを加え、ピペットで混合し、遮光して３７℃にて５分間静置して、細胞を染色した。生体試料と混合したときの色素の濃度は、PI 10μg/mL、色素Ａ 0.5μg/mLであった。

得られた測定用試料を、473 nmの波長の光を照射する半導体レーザを光源とするフローサイトメータに供して、前方散乱光及び蛍光を測定し、前方散乱光パルス幅、前方散乱光ピーク値、蛍光ピーク面積値、蛍光ピーク値及び蛍光パルス幅を取得した。前方散乱光のパルス幅と前方散乱光のピーク値とに基づいてスキャッタグラムを作製し、子宮頸部の上皮細胞を、その他の細胞から区別して計数した（「上皮細胞数」とする）。次いで、蛍光ピーク面積値、蛍光ピーク値及び蛍光パルス幅に基づいて３次元のスキャッタグラムを作製し、所定の閾値以上の領域に出現する細胞を異常細胞とし、その細胞の数を計数した（「異常細胞数」とする）。そして、異常細胞数を上皮細胞数で除した値を異常細胞率として算出した。得られた結果を、図３及び表３に示す。

図３及び表３の結果から、異常細胞を含む生体試料と正常細胞を含む生体試料とを区別する閾値を0.05％と設定することにより、１１３個の組織診による正常検体のうち、１０９個を正常検体、４個を異常検体と判定し得ることがわかった。また、２３個の組織診による異常検体のうち、２１個を異常検体、２個を正常検体と判定し得ることがわかった。
よって、本発明の試薬を用いることにより、異常検体を「異常」と判定した割合に相当する方法の「感度」は９１％（＝２１／２３）であり、正常検体を「正常」と判定した割合に相当する方法の「特異度」は９６％（＝１０９／１１３）であった。

本発明の試薬を用いることにより、子宮頸部から採取された生体試料中の異常細胞をより正確に、そして迅速かつ簡便に検出できることがわかる。

実施例５
トリスホウ酸緩衝液(ＴＢＳ；ｐＨ８．０）中のサケ精子ＤＮＡ（０．０９ｍｇ／ｍｌ）を、
（１）ＰＩ（２５μｇ／ｍｌ）を用いて、染色した場合の蛍光強度；および
（２）ＰＩ（２５μｇ／ｍｌ）と色素Ａ（１μｇ／ｍｌ）を用いて、染色した場合の蛍光強度を、図５に示す。

図５の結果から、ＰＩと色素Ａを用いてＤＮＡを染色した場合、ＰＩの染色で確認される蛍光信号が増加していることが分かる。すなわち、色素Ａは、ＰＩの蛍光に対し、増感作用があることが示された。このことから、ＰＩと色素Ａの両方を含む試薬は、より高感度に子宮頸部から採取された生体試料中の異常細胞を検出できることが示唆される。

実施例６
実施例４と同様の希釈液、染色液及びＲＮａｓｅ液により、２１１検体を用いて測定用試料を調製した。ここで、２１１検体のうち、１８５検体が異常細胞を含まず、２６検体が異常細胞を含むことが、細胞診（パパニコロウ染色）により確認されている。

得られた測定用試料を、473 nmの波長の光を照射する半導体レーザを光源とするフローサイトメータに供して、前方散乱光及び蛍光を測定し、蛍光ピーク面積値、蛍光ピーク値及び蛍光パルス幅を取得した。

蛍光ピーク面積値が、上記の異常細胞を含まない１８５検体における蛍光ピーク面積値の最頻値の２．５倍以上の測定用試料を陽性（＋）とし、２．５倍未満の測定用試料を陰性（−）と判定した。この蛍光ピーク面積値のみに基づく判定と、細胞診の判定の比較結果を、表４に示す。

表４の結果から、蛍光ピーク面積値のみに基づく判定では、感度８５％（２２／２６）、特異度８１％（１４９／１８５）であることが分かった。

次に、蛍光ピーク面積値及び蛍光ピーク値のそれぞれについて、上記の異常細胞を含まない１８５検体における蛍光ピーク面積値及び蛍光ピーク値の最頻値の２．５倍以上の測定用試料を陽性（＋）とし、２．５倍未満の測定用試料を陰性（−）と判定した。この蛍光ピーク面積値及び蛍光ピーク値に基づく判定と、細胞診の判定の比較結果を、表５に示す。

表５の結果から、蛍光ピーク面積値及び蛍光ピーク値に基づく判定では、感度８９％（２２／２６）、特異度７９％（１４９／１８５）であることが分かった。

次に、蛍光ピーク面積値及び蛍光ピーク値のそれぞれについて、上記の異常細胞を含まない１８５検体における蛍光ピーク面積値及び蛍光ピーク値の最頻値の２．５倍以上であり、蛍光パルス幅の値が６０以上である測定用試料を陽性（＋）とし、それ以外の測定用試料を陰性（−）と判定した。この蛍光ピーク面積値、蛍光ピーク値及び蛍光ピーク値に基づく判定と、細胞診の判定の比較結果を、表６に示す。

表５の結果から、蛍光ピーク面積値、蛍光ピーク値及び蛍光パルス幅に基づく判定では、感度９６％（２５／２６）、特異度７９％（１４７／１８５）であることが分かった。

上述の（１）蛍光ピーク面積値に基づく判定（△）、（２）蛍光ピーク面積値及び蛍光ピーク値に基づく判定（◇）、及び（３）蛍光ピーク面積値、蛍光ピーク値及び蛍光パルス幅に基づく判定（●）を、受信者動作特性（ＲＯＣ）解析により解析した結果を図６に示す。

図６の結果から、（１）蛍光ピーク面積値に基づく判定、（２）蛍光ピーク面積値及び蛍光ピーク値に基づく判定、及び（３）蛍光ピーク面積値、蛍光ピーク値及び蛍光パルス幅に基づく判定の順に、異常細胞の検出精度が向上することが示された。このことから、子宮頸部から採取された生体試料中の異常細胞を検出する場合、蛍光ピーク面積値、蛍光ピーク値及び蛍光パルス幅からの一つのパラメータを用いるよりも、複数のパラメータを用いることで、より高感度に異常細胞を検出することができることが示唆された。特に、蛍光ピーク面積値、蛍光ピーク値及び蛍光パルス幅の全てのパラメータを使用することで、さらに高感度に異常細胞を検出することができることが分かった。

本発明は、２００８年７月３０日に出願された日本国特許出願特願２００８−１９６３７２号に関し、この特許請求の範囲、明細書、図面及び要約書の全ては本明細書中に参照として組み込まれる。

Claims

子宮頸部から採取された細胞を含む生体試料に含まれる異常細胞を検出するための子宮頸部異常細胞検出用試薬であって、
一般式（Ｉ）：
（式中、
Ｘは、Ｓ又はＯを示し、
は、
Ｒ¹及びＲ²は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を示し；
は、
Ｒ³及びＲ⁴は、同一又は異なって、置換基としてスルホン酸基を有してもよい炭素数１〜６のアルキル基を示す）
で表される化合物又はその塩を含有することを特徴とする、子宮頸部異常細胞検出用試薬。
プロピジウムアイオダイド、エチジウムブロミド及びアクリジンオレンジから選択されるインターカレート色素をさらに含む、請求項１に記載の子宮頸部異常細胞検出用試薬。
７〜８．５のｐＨを有する請求項１に記載の子宮頸部異常細胞検出用試薬。
２００〜３５０ mOsmの浸透圧を有する請求項１に記載の子宮頸部異常細胞検出用試薬。
式（Ｉ）の化合物が塩であり、カウンターイオンがアニオンである請求項１に記載の子宮頸部異常細胞検出用試薬。
異常細胞が、癌細胞又は異型細胞である請求項１に記載の子宮頸部異常細胞検出用試薬。
子宮頸部から採取された細胞を含む生体試料と、請求項１に記載の子宮頸部異常細胞検出用試薬とを接触させ、測定用試料を調製する工程；
測定用試料をフローセルに流し、フローセルを流れる測定用試料に光を照射して、測定用試料からの蛍光を検出する工程；
検出された蛍光から生成される蛍光信号に基づいて、細胞の核に関する情報を取得する工程；及び
取得した核の情報に基づいて、前記試料中の異常細胞を検出する工程
を含む、生体試料中の異常細胞を検出する方法。
細胞の核に関する情報が、細胞のＤＮＡ量に関する情報、細胞のクロマチン凝集に関する情報及び細胞の核径に関する情報から選択される少なくとも２つである請求項７に記載の方法。
細胞のＤＮＡ量に関する情報が、蛍光信号の波形の面積に対応する値であり、
細胞のクロマチン凝集に関する情報が、蛍光信号の波形の高さに対応する値であり、
細胞の核径に関する情報が、蛍光信号の波形の幅に対応する値である
請求項８に記載の方法。
異常細胞が、癌細胞又は異型細胞である請求項７に記載の方法。