JP2007327928A - 細胞周期弁別方法、その画像処理システム、及びそのプログラム - Google Patents

Abstract

【課題】 本発明は、細胞周期をより正確に弁別する方法を提供する。
【解決手段】 スライドグラス上に固定された細胞集団を所定の蛍光色素で染色し、所定の励起波長光を照射させることにより蛍光を発生させて、該細胞集団の観察を行うサイトメータを用いて、細胞集団内にある個々の細胞の細胞分裂周期を特定する細胞周期弁別方法は、異なる２つの蛍光波長に対応する画像を生成し、該画像に基づいて細胞の細胞質の領域と細胞核の領域と核小体の領域とを判別し、該画像から核ＤＮＡ量に対応する蛍光量を測定し、該画像から前記各細胞の大きさに対する該細胞の発する蛍光量の比または前記細胞核から発せられる蛍光のピーク値を測定し、該画像から各細胞核の領域内での核小体の数を検出し、該画像から細胞核の色調を計測し、該画像から前記細胞核または前記細胞質の分離度合いを計測することにより、上記課題の解決を図る。
【選択図】 図３

Description

本発明は、サイトメータによる細胞周期の弁別技術に関する。

特許文献１には、スライドグラス上の細胞集団に対して、レーザ（レーザビーム）を収束させたスポットで走査し、この細胞集団の個々の細胞が発する蛍光を検出し、走査画像データを画像処理して個々の細胞データを抽出して測定する「生物標本の複数の光学的特性を測定する方法及び装置」（「レーザ走査型サイトメータ（ＬＳＣ：Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）」）が開示されている。

ＬＳＣに限らず、従来からフローサイトメータも細胞診の重要なツールとして使用されてきた。両者ともそれぞれの特長を生かした機能を持っている。両者に共通の機能である細胞周期の分別は、以下に述べるようにサイトメトリの基本的な機能として様々な用途との関連が非常に強い機能である。

サイトメータの典型的な医学生物学的研究用途の１つとして、がん腫瘍の解析がある。がん腫瘍の解析では、がん腫瘍において、特に「増殖性」という性質が重要になる。この「増殖性」は、細胞分裂周期の安定期・ＤＮＡ合成期・分裂期に属する細胞個数比率によって統計的な数値指標として客観的に表現することができる。

また、サイトメータには、細胞の分裂周期の段階と、各種バイオセンサーを組み合わせてアポートーシスのメカニズムをより詳しく研究するという用途もある。
また、Ｓ期細胞を用いることによって、小核形成を効率よく定量的に測定でき、染色体異常の状況を正確に分析することもできる。
特開平３−２５５３６５号公報

走査型サイトメータ（ＬＳＣ）は、上述したように、統計的数値指標を提供することができる。また、ＬＳＣは、細胞分裂周期内の特定の期（例えば、分裂中期）に属する細胞データを指定して個々の細胞を顕微鏡視野内に順次呼び出すリコール観察機能により、形態的な検討を顕微鏡下で行うことができる。

しかし、ＬＳＣは、技術的にはフローサイトメータの手法を継承発展させたものであるために、ＬＳＣによる細胞周期の判定は、ＤＮＡ量とクロマチン（細胞核内染色質）凝集度のスキャッタグラムから判定するというレベルに留まっていた。

ここで、細胞周期のスキャッタグラムとは、図１１に示すような２次元グラフのことをいう。同図のスキャッタグラムにおいて、Ｘ座標軸は全蛍光光量（ＤＮＡ量）を表し、Ｙ
座標軸は核ＤＮＡ（クロマチン）の凝集度または細胞核の各点から発せられる蛍光のピーク値を表している。スキャッタグラム中の各点は、１つずつの細胞を表している。すなわち、各細胞の分裂周期に応じて、スキャッタグラム中の位置が決められる。

また、同図において、四角で囲んだ部分（Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期、Ｍ終期）の細胞群、あるいは１点ごとの細胞を指定すると、それらの細胞を順次顕微鏡の視野中心に持ってくることができる。前述したように、これをリコール機能と称する。この機能により、ある分裂周期にある細胞の光学的、形態的特長を詳細に調べることができる。

しかし、フローサイトメータ及び走査型サイトメータ（ＬＳＣ）のどちらに関しても、主に蛍光光量の測定精度がそのまま細胞周期の認識の精度を規定する要因とならざるを得ない。

すなわち、従来、フローサイトメトリーでは困難とされていたＧ２期とＭ期の区別をＬＳＣではクロマチンの凝集度がＭ期に入ると上昇することを利用して、蛍光強度のピーク値や面積比の高低で判断していたが、凝集度の変化は、分裂初期においては、それほどはっきりしないことが多かった。また、凝集度の測定では面積比率を算出する必要があるため、細胞の大きさが異なる場合などは誤差原因となっていた。

また、そもそも蛍光の強度はきわめて微弱であることから、光量測定のＳ／Ｎは、必ずしも満足のいくレベルに達しているとは言い難かった。また、同一周期の細胞でもその大きさに無視できない違いがあったり、細胞質、細胞核内部の物質の分布状態も違ったりするなど、蛍光光量は必ずしもＤＮＡ量だけに依るものではない。

すなわち、ピーク値の測定には、検出系に高Ｓ／Ｎが要求される。また核内外で、ＤＮＡ以外のたんぱく質等が同時に染色されたりする場合も有るなど、誤認識の原因が多く存在することになる。そのために、細胞領域の決定や、バックグラウンドが蛍光光量測定に与える影響を除去する為の難しい画像処理を必要としていた。

従って、光量測定だけからの細胞周期判定も十分に正確であるとはいえない状況であった。さらに、細胞領域の決定や、バックグラウンドの除去方法によっては、蛍光光量測定に悪影響を与えるので、難しい画像処理を必要としていた。

そこで、上記課題に鑑み、本発明では、細胞周期をより正確に弁別する方法を提供する。

本発明にかかる、スライドグラス上に固定された細胞集団を所定の蛍光色素で染色して所定の励起光を照射させることにより得られる蛍光に基づいて該細胞集団の観察を行うサイトメータを用いて、該細胞集団内にある個々の細胞の細胞分裂周期を特定する細胞周期弁別方法は、前記得られる蛍光の波長は相互に異なる少なくとも２つの蛍光であって、該蛍光に対応する画像を生成し、前記画像に基づいて、該画像に含まれる前記各細胞の、細胞質領域と、細胞核領域と、核小体領域とを判別し、前記画像に基づいて、該画像に含まれる前記各細胞の核ＤＮＡ量に対応する蛍光量を測定し、前記画像に基づいて、前記各細胞核の大きさに対する該細胞核の発する蛍光量の比、または前記細胞核から発せられる蛍光のピーク値を測定することにより核ＤＮＡの凝集度を測定し、前記画像に基づいて、前記各細胞核の領域内での前記核小体の数を検出し、前記画像に基づいて、前記各細胞の前記細胞核の色調を計測し、前記画像に基づいて、前記各細胞の各前記細胞核または前記細胞質の分離度合いを計測することを特徴とする。

前記細胞周期弁別方法において、前記細胞質領域と前記細胞核領域と前記核小体領域との判別は、前記蛍光色素で染色することにより、前記細胞核領域から発せられる蛍光波長と前記核小体から発せられる蛍光波長が相互に異なることに基づいて、判別を行うことを特徴とする。

前記細胞周期弁別方法において、前記蛍光色素は、アクリジンオレンジであることを特徴とする。
前記細胞周期弁別方法において、前記画像に基づいて、前記各細胞核領域内での前記核小体の数の検出結果に基づいて、前記細胞周期のＧ２期にある細胞、Ｍ期の初期段階にある細胞、または多核細胞を判別することを特徴とする。

前記細胞周期弁別方法において、前記核小体の数の検出の結果、該核小体がない細胞であると判定された場合であって、前記各細胞の細胞核の大きさに対する該細胞核の発する蛍光量の比または前記細胞核から発せられる蛍光のピーク値によって測定される前記凝集度が所定値以下の場合、該細胞はＭ期初期であると判定することを特徴とする。

前記細胞周期弁別方法において、前記細胞核の色調の計測結果に基づいて、前記細胞周期のＳ期にある細胞のＤＮＡ複製の進行状態を判別することを特徴とする。
前記細胞周期弁別方法において、前記細胞核の色調の計測の結果、該色調が略同一である細胞群は、前記測定された前記核ＤＮＡ量に対応する前記蛍光量に応じて、Ｓ期の中でもＧ１期に近い段階かＧ２期に近い段階かの振り分けをすることを特徴とする。

前記細胞周期弁別方法において、前記細胞核または前記細胞質の分離度合いの計測結果により、Ｍ期の初期から中期にある細胞と、後期から最終期にある細胞の分裂進行度を判断することを特徴とする。

前記細胞周期弁別方法において、前記核小体の数に基づいて、前記Ｍ期の初期から中期にある細胞と、後期から最終期にある細胞と、多核細胞とを判別することを特徴とする。
前記細胞周期弁別方法において、前記Ｍ期の初期から中期にある細胞であって前記細胞核の領域が完全に分離していない段階、または前記Ｍ期の後期から最終期にある細胞であって前記細胞質の領域が完全に分離していない段階の場合には、ウォーターシェッド・アルゴリズムにより、該領域を分裂させることを特徴とする。

前記細胞周期弁別方法において、前記Ｍ期における細胞の分裂の進行度合いは、前記分裂させた領域間の距離に対応することを特徴とする。
本発明にかかる、スライドグラス上に固定された細胞集団を所定の蛍光色素で染色して所定の励起光を照射させることにより得られる蛍光に基づいて該細胞集団の観察を行うサイトメータを用いて、該細胞集団内にある個々の細胞の細胞分裂周期を特定する細胞周期弁別画像処理システムは、前記得られる蛍光の波長は相互に異なる少なくとも２つの蛍光であって、該蛍光に対応する画像を生成する画像生成手段と、前記画像に基づいて、該画像に含まれる前記各細胞の、細胞質領域と、細胞核領域と、核小体領域とを判別する領域判別手段と、前記画像に基づいて、該画像に含まれる前記各細胞の核ＤＮＡ量に対応する蛍光量を測定する核ＤＮＡ量測定手段と、前記画像に基づいて、前記各細胞の大きさに対する該細胞の発する蛍光量の比、または前記細胞核から発せられる蛍光のピーク値を測定することにより核ＤＮＡの凝集度を測定する凝集度測定手段と、前記画像に基づいて、前記各細胞核の領域内での前記核小体の数を検出する核小体検出手段と、前記画像に基づいて、前記各細胞の前記細胞核の色調を計測する色調測定手段と、前記画像に基づいて、前記各細胞の各前記細胞核または前記細胞質の分離度合いを計測する分離度合い計測手段と、を備えることを特徴とする。

本発明にかかる、スライドグラス上に固定された細胞集団を所定の蛍光色素で染色して所定の励起光を照射させることにより得られる蛍光に基づいて該細胞集団の観察を行うサイトメータを用いて、該細胞集団内にある個々の細胞の細胞分裂周期を特定する処理を、コンピュータに実行させる細胞周期弁別プログラムは、前記得られる蛍光の波長は相互に異なる少なくとも２つの蛍光であって、該蛍光に対応する画像を生成する画像生成処理と、前記画像に基づいて、該画像に含まれる前記各細胞の、細胞質領域と、細胞核領域と、核小体領域とを判別する領域判別処理と、前記画像に基づいて、該画像に含まれる前記各細胞の核ＤＮＡ量に対応する蛍光量を測定する核ＤＮＡ量測定処理と、前記画像に基づいて、前記各細胞の大きさに対する該細胞の発する蛍光量の比、または前記細胞核から発せられる蛍光のピーク値を測定することにより核ＤＮＡの凝集度を測定する凝集度測定処理と、前記画像に基づいて、前記各細胞核の領域内での前記核小体の数を検出する核小体検出処理と、前記画像に基づいて、前記各細胞の前記細胞核の色調を計測する色調測定処理と、前記画像に基づいて、前記各細胞の各前記細胞核または前記細胞質の分離度合いを計測する分離度合い計測処理と、をコンピュータに実行させる。

本発明を用いることにより、より正確に細胞周期を弁別することができる。

本発明では、スライドグラス上に固定された細胞集団を所定の蛍光色素で染色し、所定の励起波長で蛍光を発生させ、その細胞集団の２次元蛍光画像を撮像し、その２次元蛍光画像から各細胞の各種特徴を抽出するサイトメータを用いて、以下のことを行う。

まず、蛍光波長が異なった少なくとも２種類の２次元蛍光画像から、細胞の領域と核の領域と核小体の領域を区別する。
次に、核ＤＮＡ量にほぼ比例する蛍光量を測定する。細胞の大きさに対するその蛍光量の比または細胞核の各点から発せられる蛍光のピーク値（すなわち核ＤＮＡの凝集度）を測定する。

次に、１個の細胞核領域内に見出される核小体の有無、及びその数を検出する。次に、細胞核の色調を計測する。そして、細胞核及び／又は細胞質の分離度合いを計測する。
このようにすることにより、細胞集団内にある個々の細胞の細胞分裂周期を正確に特定することができる。

細胞の領域と、核の領域と、核小体の領域を区別する場合は、少なくとも細胞核と核小体が分離可能な程度に異なった波長の蛍光を発する蛍光色素で染色する。このようにすることにより、簡単かつ高Ｓ／Ｎ比を必要とせずに、細胞の領域と、核の領域と、核小体の領域を識別することができる。

蛍光色素として、例えばａｃｒｉｄｉｎｅ ｏｒａｎｇｅ（アクリジンオレンジ）を用いる。そうすると、１波長だけの励起光で、核領域についてはＤＮＡに起因して緑色の蛍光を発生させ、核小体領域についてはＲＮＡに起因して赤色の蛍光を発光させることができるので、両者の識別が簡単になる。そこで、まず、核小体の数に着目する。

Ｇ２期からＭ期に入ると核小体が消滅するので、１個の細胞核領域内に見出される核小体が１個であればＭ期最終段階かＧ１期かＳ期またはＧ２期の細胞、核小体が無ければＭ期の初期段階から中期にある細胞、２個以上の核小体があればＭ期最終段階または異常多核細胞であると大まかな分類ができる。

さらに、細かく分裂段階を決定するには、核小体がない細胞はＭ期の細胞であるが、分裂が進むと染色体が形成されて、クロマチン（核ＤＮＡ）の凝集度が上昇する。そこで、細胞の大きさに対する蛍光量の比または細胞核の各点から発せられる蛍光のピーク値（すなわち核ＤＮＡの凝集度）が、一定値以下の場合はＭ期初期の細胞であると判断でき、一定値以上の場合はＭ期中期から後期の細胞であると判断することができる。

核小体が１個の場合は、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、または２個の細胞に分裂し終わった直後のＭ期最終期である。Ｓ期にある細胞は、ＤＮＡ複製の進行過程で２本鎖のＤＮＡがほどけて、１本鎖のＤＮＡ（ＲＮＡ）となるので、緑色の蛍光中に赤色の蛍光が混じることになる。

従って、ＤＮＡ複製の進行に従って、細胞核領域が黄色味を帯びてくるので、赤色分光画像と緑色分光画像を重ね合わせて（合成画像を形成して）、その色調を調べることにより、Ｓ期の進行状態を判別することができる。

同一の色調にある細胞は、核ＤＮＡ量にほぼ比例する蛍光量の測定結果で得られた光量の多少により、Ｓ期の中でもＧ１期に近い段階かＧ２期に近い段階かに振り分けることができる。Ｍ期最終期と、Ｇ１期、Ｇ２期の区別は、核ＤＮＡの凝集度で判別できる。Ｇ１期とＧ２期の区別は、ＤＮＡ複製の前後なので、光量の圧倒的違いで判別できる。

さらに、核小体が２個ならば、細胞質のくびれの有無により、異常細胞であるか、または正常細胞の有糸分裂後期であるかを判断することができる。そのくびれがあれば後期から最終期にある細胞であり、そのくびれがなければ異常多核細胞である。

また、細胞核及び／又は細胞質の分離度合いを計測することによって、Ｍ期、すなわち有糸分裂周期の中期にある細胞と、有糸分裂周期の後期から最終期にある細胞の分裂進行度をさらに詳細に判断することができる。

有糸分裂周期の中期にある細胞であってその細胞核が完全に分離していない段階、または有糸分裂周期の後期から最終期にある細胞であってその細胞質が完全に分離していない段階では、ｗａｔｅｒｓｈｅｄ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ウォーターシェッド・アルゴリズム）を用いることにより、分裂すべき２領域を明確化することができる。そして、その細胞分裂の進行度合いはその２領域の距離によって測定することができる。Ｍ期中期で細胞核が完全に分離している場合は、単純にその距離を測定すればよい。

本発明の特徴は、細胞認識の指標として従来細胞全体の蛍光強度と発光凝集度（ピーク値で代表する場合も有る）だけを用いていたものを、（１）細胞の形状、特に核小体の存在の有無または数、（２）核の色調変化、を新たに加えるところにある。

そこでは、以下に本発明の形態の形態を説明する。
図１は、本実施形態におけるレーザ走査型の蛍光顕微鏡を示す。同図のレーザ走査型の蛍光顕微鏡は一般的なものであり、本実施形態では、このレーザ走査型の蛍光顕微鏡を用いることにする。なお、コントローラ、表示手段、及び信号経路等は一般に公知なので省略してある。

被検体２は、ＸＹステージ１の上に固定されている。励起光源であるレーザ光源３から
の光束は、集光レンズ４によってほぼ点光源とみなせる程度に絞られ、第１のコリメータレンズ５によってほぼ平行光とされる。

その平行光は第１のダイクロイックミラー６で反射され、対物レンズ９の瞳位置付近に置かれたガルバノミラー７によりＸ方向またはＸＹ方向（不図示）に走査され、瞳投影レ
ンズ８及び対物レンズ９を介して被検体２上で集光スポットとなり、被検体の所定範囲を走査する。なお、ガルバノミラー７の走査が一方向のみの場合は、他の方向はステージ１によって走査される。

瞳投影レンズ８は対物レンズ９の瞳をガルバノミラー７の回転中心付近に投影している。ガルバノミラー７による走査範囲が不足している場合にはＸＹステージ１が移動し、測
定に必要な範囲全体をカバーすることができる。

レーザ光源３からの照明光により被検体２で発生した蛍光は、対物レンズ９、瞳投影レンズ８、ガルバノミラー７を逆に進み、第１のダイクロイックミラー６を透過し、結像レンズ１０で一度集光され、第２のコリメータレンズ１１で所望の径を持った平行光に変換される。

第２のコリメータレンズ１１を通過した蛍光の平行光は、第２のダイクロイックミラー１２、第３のダイクロイックミラー１５で、所定の帯域の蛍光に分離される。色分離されたそれぞれの蛍光はＲ（赤色）フィルタ１３、Ｇ（緑色）フィルタ１６、Ｂ（青色）フィルタ１８を通過して、蛍光の赤色成分、緑色成分，青色成分の強度信号としてＰＭＴ（ホトマルチプライア）１４，１７，１９で検出される。

各ＰＭＴ１４，１７，１９で検出された蛍光の色成分の強度信号は、画像処理システム２０に出力される。画像処理システム２０は、例えば、ＣＰＵ（中央演算装置）、ＲＯＭ（リードオンリーメモリー）、ＲＡＭ（ランダムアクセスメモリー）、大容量記憶装置からなるコンピュータである。

画像処理システム２０では、各ＰＭＴ１４，１７，１９から出力された強度信号から、それぞれ赤色分光画像、緑色分光画像、青色分光画像が構築される。
なお、同図では、赤色分光画像、緑色分光画像、青色分光画像を構築する構成を図示したが必ずしもＲ，Ｇ，Ｂ３原色を必要とするわけではない。例えば、以下で説明する実施形態のように、２色分離の構成、すなわち、後述するアクリジンオレンジによる染色の場合は黄緑から青を透過するバンドパスフィルタと黄色から赤を透過するバンドパスフィルタを付加した２系統のＰＭＴ受光光路でよい。さらに、他の色素を用いたり、他の用途に使用する場合には４色以上の系統を用意してもよい。但し、各フィルタの透過帯域は重複部が無い方が望ましい。したがって、形成される画像の色は必ずしも試料の蛍光色そのものではなく、バンドパスフィルタで切り取られたスペクトル範囲の強度画像であるが、本発明の目的にとっては、色分離ができてさえいれば十分である。

また、本実施形態ではレーザ走査型の蛍光顕微鏡を用いるが、これに限定されず、例えば一般的な水銀ランプ等の照明、励起光による蛍光励起と、ＣＣＤカメラによる２次元画像取り込みのシステムを用いてもよい。この場合には、画像取得の時間を大幅に短縮することができる。

図２は、本実施形態における細胞同期弁別方法の概要を示すフローである。まず、細胞集団標本にアクリジンオレンジ（以下、「ＡＯ」と称する）による染色処理を施す（ステップ１。以下、ステップを「Ｓ」と称する）。

その染色処理を施した細胞集団標本について核小体に着目すると、各種ＲＮＡが集合・分散している核小体部分と細胞質領域が橙色から赤色の蛍光を発する。それに対して、ＤＮＡが集合・分散している核領域は、緑色の蛍光を発する。なお、Ｇ２期からＭ期に移ると、核小体が消滅する。

次に、Ｓ１で染色処理を施した細胞集団標本をスライドグラス上に固定して、走査型サイトメータを用いて２次元蛍光画像を取得する（Ｓ２）。画像処理システム２０は、本実施形態では、ＰＭＴ１４による検知信号に基づいて赤色分光画像を構築し、ＰＭＴ１７による検知信号に基づいて緑色分光画像を構築する。

次に、画像処理システム２０ではその赤色分光画像及び緑色分光画像に基づいて、図３の画像解析を行う（Ｓ３）。その画像解析の結果からその細胞集団標本に含まれる各細胞の細胞周期を判定することができる。その判別結果に基づいて、画像処理システム２０は図１１のスキャッタグラムを作成する。

次に、図４〜図１１を参照しながら、図３のフローについて説明する。
図３は、本実施形態における細胞同期弁別画像解析処理のフローを示す。図４〜図７は、Ｓ２で構築された２次元蛍光画像の解析過程を説明するための図である。図４は、核小体の個数を計測するための画像処理を説明するための図である。図５は、Ｍ期（初期）を特定するための画像処理を説明するための図である。図６は、Ｍ期（中期）を特定するための画像処理を説明するための図である。図７は、Ｍ期（完全最終段階）を特定するための画像処理を説明するための図である。

画像処理システム２０のＣＰＵは、ＲＯＭまたは大容量記憶装置から本実施形態にかかるプログラムを読み出して、Ｓ２で構築した２次元蛍光画像（赤色分光画像、緑色分光画像）に対して、図３のフローを実行する。

まず、図２のＳ１で説明したように、細胞集団標本にＡＯによる染色処理を施して核小体に着目すると、各種ＲＮＡが集合・分散している核小体部分と細胞質領域が橙色から赤色の蛍光を発する。それに対して、ＤＮＡが集合・分散している核領域は緑色の蛍光を発する。また、Ｇ２期からＭ期に移ると、核小体が消滅する。

そこで、本実施形態では、上述の各光量パラメータを参考にしながら、核小体の有無を検出する。これにより、Ｇ１期、Ｇ２期、及びＭ期初期の区別を行うことができ、その区別の正確さを格段に向上させることができる。

具体的には、Ｇ１期〜Ｇ２期での核小体の様子は、赤色分光画像Ｉ_rと緑色分光画像Ｉ_gとの合成画像Ｉ_cの緑色の核内に、はっきりとした赤い領域として認識できる（図４（ａ））。Ｍ期に入ると、図５に示すように核膜と核小体がなくなるか、はっきりしなくなり、染色体が現れる。染色体は高解像でなければはっきりとは見えないが、核領域のテクスチヤーのきめが粗くなる。

そこで、細胞質を含む赤色分光画像Ｉ_rから所定の閾値１（以下、「ＴＨｒ１」と称する）によって、領域の境界線ｒｅｇｉｏｎ ｏｎ ｉｎｔｅｒｅｓｔ１（以下、ｒｅｇｉｏｎ ｏｎ ｉｎｔｅｒｅｓｔを「ＲＯＩ」と称する）を抽出し（図４（ｂ））、細胞領域として認識する（Ｓ１１）。

次に、緑色分光画像Ｉ_gから所定の閾値ＴＨｇ１（ＴＨｇ１は全蛍光光量についての閾値よりも凝集度についての閾値とした方が良い）により、前記ＲＯＩ１内にある核の境界線ＲＯＩ２を決定する（図４（ｃ）、Ｓ１２）。

最後に、再び赤色分光画像Ｉ_rから核境界線ＲＯＩ２内にあり、かつ所定の閾値２（以下、「ＴＨｒ２」（ＴＨｒ１＜ＴＨｒ２）と称する）以上の赤色領域ＲＯＩ３、すなわち核小体の領域を決定し（図４（ｄ））、核小体の有無または数を数える（Ｓ１３）。

Ｓ１３における核小体の個数のカウントの結果、ＲＯＩ３が２以上である場合（図４（ｅ）参照）（Ｓ１４で「≧２」へ進む）、Ｓ２２へ進む。Ｓ２２において、核小体の個数が３個以上である場合（Ｓ２２で「≧３」へ進む）には、多核異常細胞として無視するか、必要ならば別の座標位置に別途分類する（Ｓ２５）。

ただし、核小体が２個の場合（Ｓ２２で「＝２」へ進む）は、Ｍ期後期の場合もあるので弁別作業を続けるが、これについては後述する（Ｓ２３〜Ｓ２５）。
Ｓ１３における核小体の個数のカウントの結果、ＲＯＩ３が「０」である場合（Ｓ１４で「＝０」へ進む）、Ｓ１５へ進む。そして、緑色分光画像Ｉ_gの輝度値が所定の閾値２（以下、「ＴＨｇ２」と称する。）より小さい場合、すなわち、極端なクロマチン（ＤＮＡ）の凝集が無ければ（Ｓ１５で「Ｎ」へ進む）、その細胞はＭ期の初期にある細胞であると判断する。

そうして、従来のパラメータ（図１１のスキャッタグラムの縦軸（蛍光ピーク値又は凝集度）と横軸（蛍光総量）を示す。）のうち、ＤＮＡ量由来の緑色蛍光の凝集度に応じて、スキャッタグラムでＭ期初期に相当する座標に位置付ける（Ｓ１６）。すなわち、ここでは、「Ｍ期初期」と確定したので、その２つのパラメータのうち蛍光総量は使用せずに、蛍光凝集度によってスキャッタグラム上の座標を決定する。

Ｓ１５において、ＤＮＡ凝集度がＴＨｇ２以上の場合は（Ｓ１５で「Ｙ」へ進む）、細胞周期は分裂中期であると判定できる。したがって、図６に示すように、従来のピーク値の変化または凝集度の変化（図１１のスキャッタグラムにおいて、Ｍ期の進行に伴って、総蛍光量はほぼ一定のままピーク値又は凝集度だけが上昇していくことを意味する。）に加えて、染色体が分裂の進行に従って２つの領域に分かれていく過程が見られる。

図６（ａ１）〜（ｃ１）には、前記２枚の画像を合成した画像においてＲＮＡその他の蛋白質領域が高い凝集度を示す濃い赤色領域６０中で、引き離されつつある緑色の染色体集団が色の重なりにより黄色となって表された領域６１の形状変化の様子が示されている。

従って、同図では引き離されつつある緑色の染色体集団は黄色領域６１の形状変化として現れる。そこで、緑色分光画像Ｉ_gを用いて、図６の（ａ２）〜（ｃ２）に示すように、上述した方法で検出された細胞領域ＲＯＩ１内の核領域ＲＯＩ２の状態変化を調べる。

例えば、図６の緑色分光画像Ｉ_gの（ｂ２）及び（ｃ２）に示すように、緑色領域が２つに分離している場合は、それぞれの緑色領域の中心または重心間の距離を測定することによって、Ｍ期中期の所定の位置座標を確定する（Ｓ１７）。また、２個の領域に分かれていない場合は、図５のａ２のように、例えば「ｗａｔｅｒｓｈｅｄ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ」などにより、核領域のくびれ方から２領域を決定し、その中心または重心間の距離を測定することによって、Ｍ期中期の所定の位置座標を確定する（Ｓ１７）。なお、緑色領域が２つに分離している場合は両領域の互いに向き合う縁辺の距離からを測定することによって、Ｍ期中期の所定の位置座標を確定してもよい。

Ｓ１３においてカウントした結果、ＲＯＩ３が１個ならば（Ｓ１４で「＝１」へ進む）、その細胞周期は、正常細胞のＧ１期、Ｇ２期、Ｓ期、またはＭ期最終段階のいずれかであるので、次のような方法により、Ｇ１期以降Ｇ２期までの間またはＭ期最終段階の座標値を決定する。

まず、Ｇ１期とＧ２期であれば、核ＤＮＡは、ＤＮＡ複製期（Ｓ期）の前後なので全て２本鎖である。従って、Ｇ２期の緑色光量はＧ１期の２倍前後となるので、Ｇ１期とＧ２期とでは緑色光量に大きな違いがある。また、Ｇ１期及びＧ２期には１本鎖のＤＮＡが無いので、前記合成画像Ｉ_cにおけるＲＯＩ２の色調は黄色味がかっていない（赤色成分が無い）。従って、従来のＤＮＡ光量測定でも簡単に分類することができる。

そこで、赤色分光画像Ｉ_rと緑色分光画像Ｉ_gの合成画像Ｉ_cから、色調が完全に緑の細胞を抽出する（Ｓ１８）。
そして、緑色分光画像Ｉ_gから核ＤＮＡ量を測定することにより、上述の通り緑色光量の相違によりＧ２期にある細胞を決定する。そのＧ２期にある細胞を、スキャッタグラム上でＧ２期に対応する座標領域のうち、その緑色光量に応じた座標位置に位置付ける（Ｓ１９）。

次に、緑色分光画像Ｉ_gからＧ１期とＭ期の最終段階とを判別する。Ｍ期の完全最終段階とＧ１とでは、ＤＮＡを示す緑色の蛍光輝点の集積の程度（凝集度）が異なる。緑色の蛍光輝点が集まって存在する（＝凝集度が高い）場合はＤＮＡが集積されている（すなわち染色体がほぐれきっていない段階）と判定し、緑色の蛍光輝点が細胞核内に散在する（＝凝集度が低い）場合は、ＤＮＡが離散している（染色体がほぐれて、クロマチンとして分散している状態）と判定する。Ｍ期の完全最終段階では、その凝集度が徐々に減少してくるので、それを目安にＧ１期に落ち着く前の座標を決めることができる（Ｓ２０）。なお、凝集度や蛍光総量による判定は、従来のレーザ走査型サイトメトリにおける判定方法と同じである。

なお、本来、Ｇ１，Ｇ２期は間期なので、蛍光光量はそれぞれの期で全てが同じであるはずだが、前述したように、核内成分の違いや大きさの微妙な違いにより、光量の総量には多少のばらつきが生じる。この光量の微小な違いも何らかの情報を持つ可能性が有るので、座標位置は異なったものとしておき、後にリコール機能を用いて精査できるようにしておくことが望ましい。

次に、Ｓ１８で「Ｎ」へ進んだ場合、すなわち、Ｓ期の進行状況の判別について説明する。ＡＯにより染色された場合には２本鎖のＤＮＡは緑色の蛍光を発し、１本鎖のＤＮＡ（ＲＮＡ）は赤色の蛍光を発する。Ｓ期ではＤＮＡの複製が行われるので、２本鎖のＤＮＡがほどけて１本鎖のＤＮＡ（ＲＮＡ）が活発に生じる。したがって、図８に示すように、Ｓ期では、Ｇ１期及びＧ２期に比べ、より赤色の蛍光を発する。

そこで、Ｓ期の進行に従って、１本鎖のＤＮＡの量が始めは少量、中間では大量、終わりには少量と変化する。すると、２本鎖を表す緑色と１本鎖を表す赤色の比率が変化するので、前記緑色分光画像Ｉ_gと赤色分光画像Ｉ_rを重ねた合成画像Ｉ_cにより、核の色調が「緑勝ち」→「赤が混じって黄緑」→「緑勝ち」というように変化していく。その様子を実物画像と色度図上での座標位置変化として図９に示しておく。

図９は、ＣＩＥ表色系を示す図である。色度図の座標ｘ，ｙと画像信号Ｒ，Ｇ，Ｂの関係は、例えば１９９０年にＣＩＥ（国際照明委員会）推奨値として公表されたＣＣＩＲ７０９によると、以下のようになっている。γ補正も同じ標準に従うと、２．２になる。

Ｘ＝０．４１２Ｒ＋０．３５８Ｇ＋０．１８０Ｂ
Ｙ＝０．２１３Ｒ＋０．７１５Ｇ＋０．０７２Ｂ
Ｚ＝０．０１９Ｒ＋０．１１９Ｇ＋０．９５１Ｂ
ｘ＝Ｘ／（Ｘ＋Ｙ＋Ｚ）、ｙ＝Ｙ／（Ｘ＋Ｙ＋Ｚ）
図１０は、Ｓ期における核の色調の変化を示す。上述の通り、核の色調は、「緑勝ち」→「赤が混じって黄緑」→「緑勝ち」と変化する。したがって、同図に示すように、核の色調の変化量はＳ期中期をピークとしてほぼ対照的になる。よって、合成画像Ｉ_cからこの色調変化と従来のＤＮＡ量増加の割合に応じた光量により、Ｇ１期側とＧ２期側に振り分けができる（Ｓ２１）。

よって、従来の光量だけでは除去されない、細胞の大きさの微妙な違いや厚みの違い、さらに細胞内物質の分布状態の違いによるＤＮＡ複製の進行度合いの判定誤差を抑えることができ、より正確なＳ期のスキャッタグラムを作ることができる。

次に、Ｓ２３〜２５について説明する。Ｍ期の最終段階では、図７に示すように、核小体が再び現れるが、Ｇ１期、Ｇ２期、または２核細胞は、１個の細胞の中に２個の核小体があるかどうかと、細胞質にくびれが有るか無いかで判別ができる。図７（ｃ）のように、１個の細胞に１個の核小体ならば、Ｍ期の完全最終段階、Ｇ１期、Ｓ期、またはＧ２期なので、Ｓ１８〜Ｓ２１で述べたようなフローに従って判定すればよい。すなわち、Ｓ１８〜Ｓ２０で述べたように、Ｇ１期の細胞（Ｍ期の完全最終段階の細胞も含んでいる）とＧ２期の細胞は、その蛍光光量差に基づいて振り分けることができる。また、Ｓ２１で述べたように、Ｍ期の完全最終段階では、凝集度（細胞における、緑色の蛍光輝点の集積度）が徐々に減少してくるので、その凝集度に基づいてＧ１期に落ち着く状態前の細胞の座標を決めることができる。また、Ｓ期は、Ｓ２１で述べたように、色調とＤＮＡ量で座標を決定する。

図７の（ａ）または（ｂ）のように、１個の細胞に２個の核小体が存在する場合、Ｍ期の最終段階であるか２核細胞である。そこで、上述した分裂中期の進行状態判定方法（例えば、「ｗａｔｅｒｓｈｅｄ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ」など）を核領域ではなく細胞質領域のくびれの有無に適応すれば、赤色分光画像Ｉ_rからＭ期の最終段階であるか２核細胞であるかを分類する（Ｓ２３）。

細胞質領域にくびれがある場合は（Ｓ２３で「Ｙ」へ進む）、Ｍ期最終段階である。よって、赤色分光画像Ｉ_rに対して、細胞質中心または重心位置や細胞核の中心または重心位置を考慮しながら前述したようなアルゴリズムを用いて細胞間の距離を測定し、スキャッタグラム中の位置座標まで決めることができる（Ｓ２４）。

細胞質領域にくびれが無い場合は（Ｓ２３で「Ｎ」へ進む）、異常細胞（２核細胞）なので前述したように処理すればよい（Ｓ２５）。
このように画像処理システム２０は、図３のフローに基づいて、細胞同期弁別を行い、さらに、図１１に示すスキャッタグラムを作成する。

本実施形態によれば、サイトメトリにおける重要な機能である細胞周期の判別が、従来にない高精度で実現できる。この精度向上によって、引き続き究明すべき細胞の諸特徴抽出が、混じりけのきわめて少ない目的周期の細胞または細胞群から、正確にかつ正しく実行できるので、正確な診断をすることが可能になる。

なお、本実施形態では、蛍光色素してアクリジンオレンジを用いたが、これに限定されず、細胞の領域と核の領域と核小体の領域とを判別できる蛍光色素であればよい。また、この蛍光色素の特性に応じて用いるフィルタの種類及び数を決定してもよい。すなわち、本実施形態では、アクリジンオレンジの特性に応じて、ＲフィルタとＧフィルタを用いたが、用いる蛍光色素に応じてさらに多種多様のフィルタを用いて、複数色の分光画像を生成してもよい。

以上、本発明の実施形態を説明したが、本発明は、上述した各実施形態に限定されることなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内で種々の改良・変更が可能である。

本実施形態におけるレーザ走査型の蛍光顕微鏡を示す。 本実施形態における細胞同期弁別方法の概要を示すフローである。 本実施形態における細胞同期弁別画像解析処理のフローを示す。 核小体の個数を計測するための画像処理を説明するための図である。 Ｍ期（初期）を特定するための画像処理を説明するための図である。 Ｍ期（中期）を特定するための画像処理を説明するための図である。 Ｍ期（完全最終段階）を特定するための画像処理を説明するための図である。 １本鎖ＤＮＡ（ＲＮＡ）か２本鎖ＤＮＡかによる蛍光の発色の相違によりＳ期と、Ｇ１期及びＧ２期が特定されることを説明する図である。 ＣＩＥ表色系を示す図である。 Ｓ期における核の色調の変化を示す図である。 スキャッタグラムを示す図である。

符号の説明

１ ＸＹステージ
２ 被検体
３ レーザ光源
４ 集光レンズ
５ 第１のコリメータレンズ
６ 第１のダイクロイックミラー
７ ガルバノミラー
８ 瞳投影レンズ
９ 対物レンズ
１０ 結像レンズ
１１ 第２のコリメータレンズ
１２ 第２のダイクロイックミラー
１３ Ｒフィルタ
１４，１７，１９ ＰＭＴ
１５ 第３のダイクロイックミラー
１６ Ｇフィルタ
１８ Ｂフィルタ
２０ 画像処理システム

Claims (13)

1. スライドグラス上に固定された細胞集団を所定の蛍光色素で染色して所定の励起光を照射させることにより得られる蛍光に基づいて該細胞集団の観察を行うサイトメータを用いて、該細胞集団内にある個々の細胞の細胞分裂周期を特定する細胞周期弁別方法において、
   前記得られる蛍光の波長は相互に異なる少なくとも２つの蛍光であって、該蛍光に対応する画像を生成し、
   前記画像に基づいて、該画像に含まれる前記各細胞の、細胞質領域と、細胞核領域と、核小体領域とを判別し、
   前記画像に基づいて、該画像に含まれる前記各細胞の核ＤＮＡ量に対応する蛍光量を測定し、
   前記画像に基づいて、前記各細胞核の大きさに対する該細胞核の発する蛍光量の比、または前記細胞核から発せられる蛍光のピーク値を測定することにより核ＤＮＡの凝集度を測定し、
   前記画像に基づいて、前記各細胞核の領域内での前記核小体の数を検出し、
   前記画像に基づいて、前記各細胞の前記細胞核の色調を計測し、
   前記画像に基づいて、前記各細胞の各前記細胞核または前記細胞質の分離度合いを計測する
   ことを特徴とする細胞周期弁別方法。
2. 前記細胞質領域と前記細胞核領域と前記核小体領域との判別は、前記蛍光色素で染色することにより、前記細胞核領域から発せられる蛍光波長と前記核小体から発せられる蛍光波長が相互に異なることに基づいて、判別を行う
   ことを特徴とする請求項１に記載の細胞周期弁別方法。
3. 前記蛍光色素は、アクリジンオレンジである
   ことを特徴とする請求項２に記載の細胞周期弁別方法。
4. 前記画像に基づいて、前記各細胞核領域内での前記核小体の数の検出結果に基づいて、前記細胞周期のＧ２期にある細胞、Ｍ期の初期段階にある細胞、または多核細胞を判別する
   ことを特徴とする請求項１に記載の細胞周期弁別方法。
5. 前記核小体の数の検出の結果、該核小体がない細胞であると判定された場合であって、前記各細胞の細胞核の大きさに対する該細胞核の発する蛍光量の比または前記細胞核から発せられる蛍光のピーク値によって測定される前記凝集度が所定値以下の場合、該細胞はＭ期初期であると判定する
   ことを特徴とする請求項４に記載の細胞周期弁別方法。
6. 前記細胞核の色調の計測結果に基づいて、前記細胞周期のＳ期にある細胞のＤＮＡ複製の進行状態を判別する
   ことを特徴とする請求項１に記載の細胞周期弁別方法。
7. 前記細胞核の色調の計測の結果、該色調が略同一である細胞群は、前記測定された前記核ＤＮＡ量に対応する前記蛍光量に応じて、Ｓ期の中でもＧ１期に近い段階かＧ２期に近い段階かの振り分けをする
   ことを特徴とする請求項６に記載の細胞周期弁別方法。
8. 前記細胞核または前記細胞質の分離度合いの計測結果により、Ｍ期の初期から中期にある細胞と、後期から最終期にある細胞の分裂進行度を判断する
   ことを特徴とする請求項１に記載の細胞周期弁別方法。
9. 前記核小体の数に基づいて、前記Ｍ期の初期から中期にある細胞と、後期から最終期にある細胞と、多核細胞とを判別する
   ことを特徴とする請求項８に記載の細胞周期弁別方法。
10. 前記Ｍ期の初期から中期にある細胞であって前記細胞核の領域が完全に分離していない段階、または前記Ｍ期の後期から最終期にある細胞であって前記細胞質の領域が完全に分離していない段階の場合には、ウォーターシェッド・アルゴリズムにより、該領域を分裂させる
    ことを特徴とする請求項８に記載の細胞周期弁別方法。
11. 前記Ｍ期における細胞の分裂の進行度合いは、前記分裂させた領域間の距離に対応する
    ことを特徴とする請求項９に記載の細胞周期弁別方法。
12. スライドグラス上に固定された細胞集団を所定の蛍光色素で染色して所定の励起光を照射させることにより得られる蛍光に基づいて該細胞集団の観察を行うサイトメータを用いて、該細胞集団内にある個々の細胞の細胞分裂周期を特定する細胞周期弁別画像処理システムであって、
    前記得られる蛍光の波長は相互に異なる少なくとも２つの蛍光であって、該蛍光に対応する画像を生成する画像生成手段と、
    前記画像に基づいて、該画像に含まれる前記各細胞の、細胞質領域と、細胞核領域と、核小体領域とを判別する領域判別手段と、
    前記画像に基づいて、該画像に含まれる前記各細胞の核ＤＮＡ量に対応する蛍光量を測定する核ＤＮＡ量測定手段と、
    前記画像に基づいて、前記各細胞の大きさに対する該細胞の発する蛍光量の比、または前記細胞核から発せられる蛍光のピーク値を測定することにより核ＤＮＡの凝集度を測定する凝集度測定手段と、
    前記画像に基づいて、前記各細胞核の領域内での前記核小体の数を検出する核小体検出手段と、
    前記画像に基づいて、前記各細胞の前記細胞核の色調を計測する色調測定手段と、
    前記画像に基づいて、前記各細胞の各前記細胞核または前記細胞質の分離度合いを計測する分離度合い計測手段と、
    を備えることを特徴とする細胞周期弁別画像処理システム。
13. スライドグラス上に固定された細胞集団を所定の蛍光色素で染色して所定の励起光を照射させることにより得られる蛍光に基づいて該細胞集団の観察を行うサイトメータを用いて、該細胞集団内にある個々の細胞の細胞分裂周期を特定する処理を、コンピュータに実行させる細胞周期弁別プログラムであって、
    前記得られる蛍光の波長は相互に異なる少なくとも２つの蛍光であって、該蛍光に対応する画像を生成する画像生成処理と、
    前記画像に基づいて、該画像に含まれる前記各細胞の、細胞質領域と、細胞核領域と、核小体領域とを判別する領域判別処理と、
    前記画像に基づいて、該画像に含まれる前記各細胞の核ＤＮＡ量に対応する蛍光量を測定する核ＤＮＡ量測定処理と、
    前記画像に基づいて、前記各細胞の大きさに対する該細胞の発する蛍光量の比、または前記細胞核から発せられる蛍光のピーク値を測定することにより核ＤＮＡの凝集度を測定する凝集度測定処理と、
    前記画像に基づいて、前記各細胞核の領域内での前記核小体の数を検出する核小体検出処理と、
    前記画像に基づいて、前記各細胞の前記細胞核の色調を計測する色調測定処理と、
    前記画像に基づいて、前記各細胞の各前記細胞核または前記細胞質の分離度合いを計測する分離度合い計測処理と、
    をコンピュータに実行させる細胞周期弁別プログラム。