JP2011075278A - 細胞核を構成する構造体の解析方法、及び細胞核の形態の解析方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】a)細胞核を構成する1種類又は複数種類の構造体と細胞核内の核酸とをそれぞれ標識し、b)a)で標識された細胞の核酸の標識画像を取得し、c)a)で標識された細胞の前記構造体の標識画像を、標識された構造体の種類ごとに別個に取得し、d)b)で取得された核酸の標識画像に基づいて細胞核領域を決定し、e)c)で取得された前記構造体の標識画像中の、d)で決定された細胞核領域中の各画素の輝度値を測定し、1画素当たりの輝度値が閾値以上である1又は複数の領域を決定し、当該領域中の各画素の輝度値の統計値、総面積、総周囲長からなる群より選択される1以上を測定し、f)e)で測定された統計値に基づき、前記構造体の細胞内における存在量、局在、及び形態からなる群より選択される少なくとも1種を解析する、細胞核を構成する構造体の解析方法。
【選択図】なし
Description
(1) 細胞核を構成する構造体を解析する方法であって、(a)細胞核を構成する1種類又は複数種類の構造体と細胞核内の核酸とをそれぞれ標識する工程と、(b)前記工程(a)において標識された細胞の、核酸の標識画像を取得する工程と、(c)前記工程(a)において標識された細胞の、前記構造体の標識画像を、標識された構造体の種類ごとに別個に取得する工程と、(d)前記工程(b)において取得された核酸の標識画像に基づいて、細胞核領域を決定する工程と、(e)前記工程(c)において取得された前記構造体の標識画像中の、前記工程(d)において決定された細胞核領域に含まれる各画素の輝度値を測定し、1画素当たりの輝度値が閾値以上である1又は複数の領域を決定し、当該領域中の各画素の輝度値の統計値、当該領域の総面積、及び当該領域の総周囲長からなる群より選択される1以上を測定する工程と、(f)前記工程(e)において測定された統計値に基づき、前記構造体の細胞内における存在量、局在、及び形態からなる群より選択される少なくとも1種を解析する工程と、を有することを特徴とする細胞核を構成する構造体の解析方法、
(2) さらに、(g)前記工程(b)において取得された核酸の標識画像の、前記工程(d)において決定された細胞核領域に含まれる各画素の輝度値の統計値を測定し、当該細胞核領域を含む細胞の細胞周期を判断する工程と、を有し、前記構造体の細胞内における存在量と細胞周期との相関関係を解析することを特徴とする前記(1)記載の細胞核を構成する構造体の解析方法、
(3) 前記構造体が、核膜、核スペックル、カハールボディ、及びPMLボディからなる群より選択される1種であることを特徴とする前記(1)又は(2)記載の細胞核を構成する構造体の解析方法、
(4) 前記構造体が核内構造体であり、前記工程(d)において、さらに、決定された細胞核領域に基づいて、各細胞における細胞質領域を決定し、前記工程(e)において、さらに、前記工程(c)において取得された前記構造体の標識画像中の、前記細胞質領域に含まれる各画素の輝度値の統計値を測定することを特徴とする前記(2)記載の細胞核を構成する構造体の解析方法、
(5) 前記構造体が核内構造体であり、前記工程(a)において、さらに、細胞質を標識し、前記工程(b)において、さらに、前記工程(a)において標識された細胞の、細胞質の標識画像を取得し、前記工程(d)において、さらに、取得された細胞質の標識画像に基づいて、各細胞における細胞質領域を決定し、前記工程(e)において、さらに、前記工程(c)において取得された前記核内構造体の標識画像中の、前記細胞質領域に含まれる各画素の輝度値を測定し、1画素当たりの輝度値が閾値以上である1又は複数の領域を決定し、当該領域中の各画素の輝度値の統計値、当該領域の総面積、及び当該領域の総周囲長からなる群より選択される1以上を測定することを特徴とする前記(2)記載の細胞核を構成する構造体の解析方法、
(6) さらに、(h)前記工程(d)において決定された細胞核領域の面積、当該細胞核領域の周囲長、当該細胞核領域の凸包面積及び凸包周囲長からなる群より選択される1以上を測定し、当該細胞核領域を含む細胞の細胞核の形態を解析する工程と、を有し、前記構造体の細胞内における存在量、局在、及び形態からなる群より選択される少なくとも1種と細胞核の形態と細胞周期との相関関係を解析することを特徴とする前記(4)又は(5)記載の細胞核を構成する構造体の解析方法、
(7) 前記核内構造体が、核スペックル、カハールボディ、及びPMLボディからなる群より選択される1種であることを特徴とする前記(4)〜(6)のいずれか記載の細胞核を構成する構造体の解析方法、
(8) 細胞核を構成する構造体を解析する方法であって、(a2)核膜と細胞核内の核酸とを、それぞれ標識する工程と、(b2)前記工程(a2)において標識された細胞の、核酸の標識画像を取得する工程と、(c2)前記工程(a2)において標識された細胞の、核膜の標識画像を取得する工程と、(d2−1)前記工程(b2)において取得された核酸の標識画像に基づいて、各細胞における細胞核領域を決定する工程と、(d2−2)前記工程(d2−1)において決定された細胞核領域及び前記工程(c2)において取得された核膜の標識画像に基づいて、各細胞における核膜領域を決定する工程と、(e2)前記工程(c2)において取得された核膜の標識画像中の、前記工程(d2−2)において決定された核膜領域に含まれる各画素の輝度値の統計値を測定する工程と、(f2)前記工程(e2)において測定された統計値に基づき、前記核膜領域を含む細胞の細胞核の形態又は核膜の状態を解析する工程と、を有することを特徴とする細胞核を構成する構造体の解析方法、
(9) 前記工程(d2−2)において、前記工程(c2)において取得された核膜の標識画像に基づいて、各細胞における核膜領域を決定することを特徴とする前記(8)記載の細胞核を構成する構造体の解析方法、
(10) さらに、(g2)前記工程(b2)において取得された核酸の標識画像中の、前記工程(d2−1)において決定された細胞核領域に含まれる各画素の輝度値の統計値を測定し、当該細胞核領域を含む細胞の細胞周期を判断する工程と、を有し、核膜の状態と細胞核の形態と細胞周期との相関関係を解析することを特徴とする前記(8)又は(9)記載の細胞核を構成する構造体の解析方法、
(11) 細胞核の形態を解析する方法であって、(a3)細胞核内の核酸を標識する工程と、(b3)前記工程(a3)において標識された細胞の、核酸の標識画像を取得する工程と、(d3)前記工程(b3)において取得された核酸の標識画像に基づいて、各細胞における細胞核領域を決定する工程と、(h3)前記工程(d3)において決定された細胞核領域の面積、当該細胞核領域の周囲長、当該細胞核領域の凸包面積及び凸包周囲長からなる群より選択される1以上を測定し、当該細胞核領域を含む細胞の細胞核の形態を解析する工程と、を有することを特徴とする細胞核の形態の解析方法、
を、提供するものである。
特に、本発明の細胞核を構成する構造体の解析方法は、画像解析を利用しているため、細胞同士が近接している組織切片などの標本を対象とした場合であっても、ソフトウェア上で個々の細胞を判断したり、解析対象である構造体の細胞内における局在等を、画像を見ながら判断することができる。
本発明の細胞核を構成する構造体の解析方法(以下、「本発明の構造体解析方法」と略記載することがある。)は、解析対象とする構造体の標識画像を取得し、この標識画像を画像解析することにより、当該構造体の細胞内における存在量や局在、細胞核の形態等を多数の細胞で一度に解析するハイスループット解析であることが特徴である。
(a)細胞核を構成する1種類又は複数種類の構造体と細胞核内の核酸とをそれぞれ標識する工程と、
(b)前記工程(a)において標識された細胞の、核酸の標識画像を取得する工程と、
(c)前記工程(a)において標識された細胞の、前記構造体の標識画像を、標識された構造体の種類ごとに別個に取得する工程と、
(d)前記工程(b)において取得された核酸の標識画像に基づいて、細胞核領域を決定する工程と、
(e)前記工程(c)において取得された前記構造体の標識画像中の、前記工程(d)において決定された細胞核領域に含まれる各画素の輝度値を測定し、1画素当たりの輝度値が閾値以上である1又は複数の領域を決定し、当該領域中の各画素の輝度値の統計値、当該領域の総面積、及び当該領域の総周囲長からなる群より選択される1以上を測定する工程と、
(f)前記工程(e)において測定された統計値に基づき、前記構造体の細胞内における存在量、局在、及び形態からなる群より選択される少なくとも1種を解析する工程。
まず、工程(a)として、1種類又は複数種類の構造体と細胞核内の核酸とをそれぞれ標識する。なお、標識方法は、細胞内成分(細胞核を構成する構造体や核酸)を、適当な波長の光を照射して撮像された画像上で、他の細胞内成分と視覚的に区別し得るように標識し得る方法であれば特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知のいずれの手法を用いてもよい。例えば、構造体を構成するタンパク質等の物質や核酸と特異的に結合する抗体やリガンド等を用いた免疫染色法を行ってもよく、構造体や核酸に集積し得る色素を用いた色素染色法を行ってもよい。また、免疫染色法では、蛍光物質を結合させた一次抗体や二次抗体を用いた蛍光免疫染色法であってもよく、DAB法、ニッケルDAB法、NBT/BCIP法等の酵素抗体法であってもよい。なお、これらの染色法は、当該技術分野において汎用されている染色法であり、常法により行うことができる。また、本発明においては、検出感度が良好であるため、各構造体や核酸は、蛍光物質により標識することが好ましい。
スライドガラス又はマルチウェルプレートを用いて、イメージングサイトメータ等を用いることにより、多数の検体も迅速かつ簡便に処理することが可能となる。
(g)前記工程(b)において取得された核酸の標識画像の、前記工程(d)において決定された細胞核領域に含まれる各画素の輝度値の統計値を測定し、当該細胞核領域を含む細胞の細胞周期を判断する工程。
解析対象である細胞の細胞周期を判断することにより、構造体の細胞内における存在量、局在、及び形態と、細胞周期との相関関係を解析することができる。
(h)前記工程(d)において決定された細胞核領域の面積、当該細胞核領域の周囲長、当該細胞核領域の凸包面積及び凸方周囲長からなる群より選択される1以上を測定し、当該細胞核領域を含む細胞の細胞核の形態を解析する工程。
ここで、凸包面積及び凸包周囲長は、当該領域中の各画素の任意の2要素を結ぶ閉線分を内部に含む、最小の凸多角形の面積及び周囲長として測定する。
(a2)核膜と細胞核内の核酸とを、それぞれ標識する工程と、
(b2)前記工程(a2)において標識された細胞の、核酸の標識画像を取得する工程と、
(c2)前記工程(a2)において標識された細胞の、核膜の標識画像を取得する工程と、
(d2−1)前記工程(b2)において取得された核酸の標識画像に基づいて、各細胞における細胞核領域を決定する工程と、
(d2−2)前記工程(d2−1)において決定された細胞核領域及び前記工程(c2)において取得された核膜の標識画像に基づいて、各細胞における核膜領域を決定する工程と、
(e2)前記工程(c2)において取得された核膜の標識画像中の、前記工程(d2−2)において決定された核膜領域に含まれる各画素の輝度値の統計値を測定する工程と、
(f2)前記工程(e2)において測定された統計値に基づき、前記核膜領域を含む細胞の細胞核の形態又は核膜の状態を解析する工程。
前述したように、核酸標識画像に基づいて細胞核領域を決定した場合、この細胞核領域のみから、細胞核の形態を解析することができる。具体的には、下記工程を行うことにより、細胞核の形態を解析することができる。
(a3)細胞核内の核酸を標識する工程と、
(b3)前記工程(a3)において標識された細胞の、核酸の標識画像を取得する工程と、
(d3)前記工程(b3)において取得された核酸の標識画像に基づいて、各細胞における細胞核領域を決定する工程と、
(h3)前記工程(d3)において決定された細胞核領域の面積、当該細胞核領域の周囲長、当該細胞核領域の凸包面積及び凸包周囲長からなる群より選択される1以上を測定し、当該細胞核領域を含む細胞の細胞核の形態を解析する工程。
本発明において、工程(a)〜(c)以外の工程は、これらの工程を実現可能な一の画像解析装置を用いて解析することができる。例えば、画像解析の分野において一般的に用いられている公知の画像解析装置又はこれを適宜改変した装置を用いることにより、解析することができる。細胞画像解析装置1は、パーソナルコンピュータやワークステーション等の情報処理装置を用いて構成されても良いし、顕微鏡などに組み込まれた専用装置として構成されても良い。例えば、顕微鏡やCCDカメラ等の細胞画像の撮像手段をさらに備える画像解析装置を用いることにより、工程(a)以外の全工程を、一の装置を用いて行うこともできる。
核スペックルに特異的に局在するSC35を免疫染色することにより、核スペックルを標識し、正常及び変異細胞群における核スペックルの形態を定量解析した。核膜孔複合体構成タンパク質で、細胞核内構造体の形成に関与するRanBP2(RAN binding protein 2)が減弱したHeLa細胞を変異細胞として用いた。
HeLa細胞を96ウェルプレートに播種後、RanBP2、及びコントロールとしてホタルルシフェラーゼ(GL3)を標的としたsiRNA (日本バイオサービス社製)をRNAiMAX (Invitrogen社製)でトランスフェクションしノックダウン処理を行い、72時間培養した。各細胞をPBSで1回洗浄し、4%パラホルムアルデヒド溶液で室温15分間固定処理した後、PBSで3回洗浄し、0.2%のTritonX−100で氷上5分間浸透処理した。その後、各ウェルに対して、0.5%のNGS(Normal Goat Serum)で3回洗浄・ブロッキング操作を行った後、一次抗体として抗SC35抗体(mouse、BD Pharmingen社製、カタログ番号:556363)及び抗RanBP2抗体(Rabbit、九州大学西本毅治教授より供与)を0.2%のBSAで希釈した溶液を添加し、1時間インキュベートした。さらに0.2%のNGSで3回洗浄を行った後、二次抗体としてcy3標識抗mouse抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories社製、カタログ番号:715−165−151)及びAlexa488標識抗Rabbit抗体(Invitrogen社製、カタログ番号:A11034)を0.2%のNGSで希釈した溶液を添加し、1時間インキュベートすることにより、細胞中のSC35及びRanBP2を標識(ラベル化)した。ラベル化した細胞を、PBSで1回洗浄した後、1μg/mlDAPI−PBS溶液中で5分間インキュベートし、核酸を染色した。PBSで1回洗浄後、ウェル中にPBSを満たした状態で撮像を行った。核酸標識画像(以下、「DAPI染色画像」)、核スペックル標識画像(以下、「Cy3(SC35)染色画像」)、及び核膜標識画像(以下、「Alexa488(RanBP2)染色画像」)は、CELAVIEW(オリンパス社製)を使用し、20倍対物レンズを用いて撮像し、CELAVIEW Analysis Soft(オリンパス社製)を用いて解析を行った。各標識画像を図6に示す。図中、「Contorol」がRanBP2ノックダウン未処理細胞を、「Knockdown」がRanBP2ノックダウン処理細胞を、それぞれ示す。
カハールボディに特異的に局在しているcoilinを免疫染色することにより、細胞中のカハールボディを標識し、細胞内における存在量や局在等を解析した。解析対象とする細胞としては、実施例1と同様に、RanBP2及びコントロールとしてホタルルシフェラーゼ(GL3)を標的とするsiRNAでノックダウン処理したHeLa細胞を用いた。
具体的には、HeLa細胞を35mm細胞培養ディッシュ中に設置したカバースリップ上に播種後、RanBP2、及びコントロールとしてホタルルシフェラーゼ(GL3)を標的としたsiRNA (日本バイオサービス社製)をRNAiMAX (Invitrogen社製)でトランスフェクションしノックダウン処理を行い、72時間培養した。各細胞をPBSで1回洗浄し、4%パラホルムアルデヒド溶液で室温15分間固定処理した後、PBSで3回洗浄し、0.2%のTritonX−100で氷上5分間浸透処理した。その後、各ウェルに対して、0.5%のNGS(Normal Goat Serum)で3回洗浄・ブロッキング操作を行った後、一次抗体として抗coilin抗体(mouse、BD Transduction Laboratories社製、カタログ番号:612074)を用い、二次抗体として抗cy3標識抗mouse抗体(Jackson Immuno Research Laboratories社製、カタログ番号:715−165−151)を用いて実施例1と同様に細胞をラベル化した。その後PBSで1回洗浄した後、1μg/mlDAPI−PBS溶液中で5分間インキュベートし、核酸を染色した。ラベル化した細胞が付着したカバースリップを80%グリセロール−DABCO(1,4−diacobicyclo−[2,2,2]−octane)溶液中で封入し、蛍光顕微鏡IX−71(オリンパス社製)で撮像を行った。画像取得には20倍対物レンズ、CCDカメラC4742−95−12ERG(浜松ホトニクス社製)及び画像取得ソフトウェアLuimina vision Version 2.4(三谷商事)を用いた。核酸標識画像(以下、「DAPI染色画像」)及びカハールボディ標識画像(以下、「Cy3(coilin)染色画像」)について、TIFFフォーマットにて保存した画像を、CELAVIEW Analysis Soft(オリンパス社製)を用いて解析を行った。各標識画像を図12に示す。図中、「Contorol」及び「Knockdown」は図6と同様である。この結果、coilinは、未処理細胞では細胞核内に点状の像を示し、RanBP2ノックダウン処理細胞では細胞核全体に斑状の像を示した。
次に、各細胞の細胞核領域内に存在するカハールボディの形状を、面積を指標として解析した。具体的には、各細胞の細胞核領域内中の、1画素当たりのCy3(coilin)の蛍光強度が予め定められた閾値以上である画素数を、Cy3(coilin)が局在する構造体(カハールボディ)の総面積とした。図13は、各細胞の細胞核領域に存在するカハールボディの総面積(Area coilin)を横軸とし、各面積の細胞数(Counts)を縦軸として示した図である。この結果、RanBP2ノックダウン細胞とコントロール細胞とでは、カハールボディの総面積に顕著な差があることが確認された。すなわち、総面積を指標とした画像解析により、撮像された標識画像と同様に、構造体の形状の差を解析し得ることが明らかとなった。
細胞核領域の形態から、各細胞の細胞核の形態を解析した。解析対象とする細胞としては、実施例1と同様に、RanBP2ノックダウン、及びコントロールHeLa細胞を用いた。細胞の培養、ラベル化と撮像は、一次抗体として抗LaminA/C抗体(mouse、Santa Cruz社製、カタログ番号:sc−7292)、二次抗体としてCy3標識抗mouse抗体(Jackson Immuno Research Laboratories社製、社製、カタログ番号:715−165−151)を使用した以外は実施例2と同様である。各標識画像を図14に示す。図中、「Contorol」及び「Knockdown」は図6と同様である。
Claims (11)
- 細胞核を構成する構造体を解析する方法であって、
(a)細胞核を構成する1種類又は複数種類の構造体と細胞核内の核酸とをそれぞれ標識する工程と、
(b)前記工程(a)において標識された細胞の、核酸の標識画像を取得する工程と、
(c)前記工程(a)において標識された細胞の、前記構造体の標識画像を、標識された構造体の種類ごとに別個に取得する工程と、
(d)前記工程(b)において取得された核酸の標識画像に基づいて、細胞核領域を決定する工程と、
(e)前記工程(c)において取得された前記構造体の標識画像中の、前記工程(d)において決定された細胞核領域に含まれる各画素の輝度値を測定し、1画素当たりの輝度値が閾値以上である1又は複数の領域を決定し、当該領域中の各画素の輝度値の統計値、当該領域の総面積、及び当該領域の総周囲長からなる群より選択される1以上を測定する工程と、
(f)前記工程(e)において測定された統計値に基づき、前記構造体の細胞内における存在量、局在、及び形態からなる群より選択される少なくとも1種を解析する工程と、
を有することを特徴とする細胞核を構成する構造体の解析方法。 - さらに、
(g)前記工程(b)において取得された核酸の標識画像の、前記工程(d)において決定された細胞核領域に含まれる各画素の輝度値の統計値を測定し、当該細胞核領域を含む細胞の細胞周期を判断する工程と、
を有し、前記構造体の細胞内における存在量と細胞周期との相関関係を解析することを特徴とする請求項1記載の細胞核を構成する構造体の解析方法。 - 前記構造体が、核膜、核スペックル、カハールボディ、及びPMLボディからなる群より選択される1種であることを特徴とする請求項1又は2記載の細胞核を構成する構造体の解析方法。
- 前記構造体が核内構造体であり、
前記工程(d)において、さらに、決定された細胞核領域に基づいて、各細胞における細胞質領域を決定し、
前記工程(e)において、さらに、前記工程(c)において取得された前記構造体の標識画像中の、前記細胞質領域に含まれる各画素の輝度値の統計値を測定することを特徴とする請求項2記載の細胞核を構成する構造体の解析方法。 - 前記構造体が核内構造体であり、
前記工程(a)において、さらに、細胞質を標識し、
前記工程(b)において、さらに、前記工程(a)において標識された細胞の、細胞質の標識画像を取得し、
前記工程(d)において、さらに、取得された細胞質の標識画像に基づいて、各細胞における細胞質領域を決定し、
前記工程(e)において、さらに、前記工程(c)において取得された前記核内構造体の標識画像中の、前記細胞質領域に含まれる各画素の輝度値を測定し、1画素当たりの輝度値が閾値以上である1又は複数の領域を決定し、当該領域中の各画素の輝度値の統計値、当該領域の総面積、及び当該領域の総周囲長からなる群より選択される1以上を測定することを特徴とする請求項2記載の細胞核を構成する構造体の解析方法。 - さらに、
(h)前記工程(d)において決定された細胞核領域の面積、当該細胞核領域の周囲長、当該細胞核領域の凸包面積及び凸包周囲長からなる群より選択される1以上を測定し、当該細胞核領域を含む細胞の細胞核の形態を解析する工程と、
を有し、前記構造体の細胞内における存在量、局在、及び形態からなる群より選択される少なくとも1種と細胞核の形態と細胞周期との相関関係を解析することを特徴とする請求項4又は5記載の細胞核を構成する構造体の解析方法。 - 前記核内構造体が、核スペックル、カハールボディ、及びPMLボディからなる群より選択される1種であることを特徴とする請求項4〜6のいずれか記載の細胞核を構成する構造体の解析方法。
- 細胞核を構成する構造体を解析する方法であって、
(a2)核膜と細胞核内の核酸とを、それぞれ標識する工程と、
(b2)前記工程(a2)において標識された細胞の、核酸の標識画像を取得する工程と、
(c2)前記工程(a2)において標識された細胞の、核膜の標識画像を取得する工程と、
(d2−1)前記工程(b2)において取得された核酸の標識画像に基づいて、各細胞における細胞核領域を決定する工程と、
(d2−2)前記工程(d2−1)において決定された細胞核領域及び前記工程(c2)において取得された核膜の標識画像に基づいて、各細胞における核膜領域を決定する工程と、
(e2)前記工程(c2)において取得された核膜の標識画像中の、前記工程(d2−2)において決定された核膜領域に含まれる各画素の輝度値の統計値を測定する工程と、
(f2)前記工程(e2)において測定された統計値に基づき、前記核膜領域を含む細胞の細胞核の形態又は核膜の状態を解析する工程と、
を有することを特徴とする細胞核を構成する構造体の解析方法。 - 前記工程(d2−2)において、前記工程(c2)において取得された核膜の標識画像に基づいて、各細胞における核膜領域を決定することを特徴とする請求項8記載の細胞核を構成する構造体の解析方法。
- さらに、
(g2)前記工程(b2)において取得された核酸の標識画像中の、前記工程(d2−1)において決定された細胞核領域に含まれる各画素の輝度値の統計値を測定し、当該細胞核領域を含む細胞の細胞周期を判断する工程と、
を有し、核膜の状態と細胞核の形態と細胞周期との相関関係を解析することを特徴とする請求項8又は9記載の細胞核を構成する構造体の解析方法。 - 細胞核の形態を解析する方法であって、
(a3)細胞核内の核酸を標識する工程と、
(b3)前記工程(a3)において標識された細胞の、核酸の標識画像を取得する工程と、
(d3)前記工程(b3)において取得された核酸の標識画像に基づいて、各細胞における細胞核領域を決定する工程と、
(h3)前記工程(d3)において決定された細胞核領域の面積、当該細胞核領域の周囲長、当該細胞核領域の凸包面積及び凸包周囲長からなる群より選択される1以上を測定し、当該細胞核領域を含む細胞の細胞核の形態を解析する工程と、
を有することを特徴とする細胞核の形態の解析方法。
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