WO2022059508A1 - 生体関連情報取得方法及び生体関連情報取得システム - Google Patents

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WO2022059508A1
WO2022059508A1 PCT/JP2021/032351 JP2021032351W WO2022059508A1 WO 2022059508 A1 WO2022059508 A1 WO 2022059508A1 JP 2021032351 W JP2021032351 W JP 2021032351W WO 2022059508 A1 WO2022059508 A1 WO 2022059508A1
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region
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優 高橋
北斗 田中
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コニカミノルタ株式会社
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers

Definitions

  • the present invention relates to a biological information acquisition method and an information acquisition system. More specifically, the present invention relates to a biological information acquisition method and a biological information acquisition system capable of accurately grasping the existence and amount of a target substance in a tissue piece.
  • biomarkers include substances also referred to as “biomarkers” or “biomarker compounds”
  • the malignancy of the lesion is determined based on the expression pattern such as the amount and the distribution in the cell. Further, it is known that the malignancy of a disease such as cancer depends not only on the expression level of a biomarker as a target substance but also on the bias of distribution.
  • the conventional method of analyzing only the region of interest in which the target substance is expressed can grasp the information related to the target substance in the region of interest, it cannot grasp the information related to the target substance in the tissue piece. If the expression status of the target substance differs between the regions, the difference cannot be grasped. For this reason, misjudgment and the like occur regarding the malignancy of the lesion, and accurate evaluation and judgment cannot be performed.
  • Patent Document 1 discloses a technique for calculating the expression level of a biological substance in one visual field, generating the expression pattern information, and classifying cells according to the expression pattern information. That is, information on the expression level of the target substance in a small range in the tissue piece (tissue specimen) is acquired, and the cells in the small range of the tissue piece are classified based on the information.
  • the present invention has been made in view of the above problems / situations, and the problem to be solved is a method for acquiring bio-related information capable of accurately grasping both the information of the target substance and the information related to the target substance in the tissue piece. And to provide a biological information acquisition system.
  • the present inventor has information on the distribution of the target substance in the tissue piece, for example, in the tissue piece, in order to evaluate the target substance in the living tissue.
  • the above-mentioned problems can be solved by acquiring information on the variation of the target substance in the above-mentioned materials and evaluating the target substance based on the information, and have reached the present invention. That is, the above-mentioned problem according to the present invention is solved by the following means.
  • the distribution information acquisition step is a step of acquiring first information which is information on the distribution of a target substance in an arbitrary first region in a tissue piece.
  • the target substance evaluation step acquires second information which is information for evaluating the existence or amount of the target substance in the first region based on the first information, or is in the first region.
  • a method for acquiring bio-related information which is a step of acquiring a third information which is information for evaluating the existence or amount of a target substance in an arbitrary second region narrower than the first region.
  • the second region is a negative region indicating a region in which a target substance does not exist, a cell region indicating a region occupied by a specific cell, a cell group region indicating a region occupied by a specific cell group, or a substance different from the target substance.
  • Items 1 to 5 include, in addition to each of the above steps, a determination step of determining whether or not there is a variation in the distribution of the target substance in the first region based on the first information.
  • the method for acquiring biological information according to any one of the above items.
  • Item 3. The item 6 is characterized in that, when it is determined in the determination step that there is no variation in the distribution of the target substance in the first region, the second information is acquired and evaluated in the target substance evaluation step. Biological information acquisition method.
  • the third information in the second region is acquired and evaluated in the target substance evaluation step.
  • An information acquisition system for acquiring information for evaluating a target substance in a living tissue, and providing a process means for implementing the biological information acquisition method according to any one of paragraphs 1 to 8.
  • a biological information acquisition system characterized by having.
  • a biological information acquisition method and a biological information acquisition system capable of accurately grasping the existence and amount of the target substance in the tissue piece are provided. can do.
  • the lesion is based on the expression level such as the expression level of a specific biological substance in a tissue sample and the intracellular distribution.
  • the malignancy of the disease was judged.
  • the conventional method of analyzing only the region of interest in which the target substance is expressed can grasp the information related to the target substance in the region of interest, it cannot grasp the information related to the target substance in the tissue piece. If the expression status of the target substance differs between the regions, the difference cannot be grasped. For this reason, misjudgment and the like occur regarding the malignancy of the lesion, and accurate evaluation and judgment cannot be performed.
  • the present invention as a method for acquiring information related to a living body for acquiring information for evaluating a target substance in a living tissue, information on the distribution of the target substance and its variation in an arbitrary region in a tissue piece is acquired, and the information is based on the information.
  • the biological information acquisition method of the present invention is a biological information acquisition method for acquiring information for evaluating a target substance in a biological tissue, and includes at least a distribution information acquisition step and a target substance evaluation step.
  • the distribution information acquisition step is a step of acquiring first information which is information on the distribution of the target substance in an arbitrary first region in the tissue piece
  • the target substance evaluation step is a step of acquiring the target substance based on the first information.
  • Obtain second information which is information for evaluating the presence or amount of the target substance in the first region, or the target substance in any second region within the first region and narrower than the first region.
  • It is a step of acquiring a third information which is information for evaluating the existence or quantity of the substance. This feature is a technical feature common to or corresponding to each of the following embodiments.
  • the first information is information on variations in the distribution of the target substance in the first region, from the viewpoint of being able to make a pathological diagnosis in relation to the region of interest.
  • the information regarding the variation in the distribution of the target substance in the first region is the uneven distribution of the target substance in the first region from the viewpoint of accurate pathological diagnosis.
  • the distribution information acquisition step it is preferable to acquire the first information based on an image in which the presence of the target substance in the first region is visualized, from the viewpoint of being able to make a visual judgment.
  • the second region is, for example, a negative region indicating a region in which a target substance does not exist, a cell region indicating a region occupied by a specific cell, a cell group region indicating a region occupied by a specific cell group, or a substance different from the target substance. It is an additional target area to be visualized, and a gene analysis area to be analyzed for genes related to the target substance.
  • having a determination step of determining whether or not there is a variation in the distribution of the target substance in the first region based on the first information enables more rapid and accurate pathological diagnosis. Preferred from the viewpoint.
  • acquiring and evaluating the second information in the target substance evaluation step is a viewpoint that enables more detailed pathological diagnosis. Is preferable.
  • the biological information acquisition method of the present invention is suitably used for a biological information acquisition system.
  • the biological information acquisition method of the present invention is a biological information acquisition method for acquiring information for evaluating a target substance in a biological tissue, and includes at least a distribution information acquisition step and a target substance evaluation step.
  • the distribution information acquisition step is a step of acquiring first information which is information on the distribution of the target substance in an arbitrary first region in the tissue piece
  • the target substance evaluation step is a step of acquiring the target substance based on the first information.
  • Obtain second information which is information for evaluating the presence or amount of the target substance in the first region, or the target substance in any second region within the first region and narrower than the first region. It is a step of acquiring a third information which is information for evaluating the existence or quantity of the substance.
  • Bio information refers to information related to biological tissue and drugs that act on the biological tissue.
  • the "living tissue” is a tissue in which a plurality of cells are assembled in a predetermined pattern in a living body including humans and animals, and refers to a tissue constituting a part of the living body.
  • Types of tissues include connective tissues such as bones, cartilage, muscles and tendons, blood vessels, nerves, skin, hair and various organs.
  • Various organs include the eyes, lungs, kidneys, heart, liver, pancreas, spleen, gastrointestinal tract including small intestine, bladder, ovaries and testes. It also includes tissues that are in the developmental stage or in the process of being organized (eg, embryonic tissue). Further, these tissues also include tissues mutated due to various circumstances, for example, lesioned tissues.
  • a “drug” is a substance derived from a substance or chemical substance in the natural world, which is artificially administered from outside the body or ingested, inhaled, and absorbed depending on a specific external environment, and has some medicinal effect and toxicity to the living body. It refers to substances derived from biologically active substances and bioactive chemical substances that exhibit bioactivity. Examples thereof include small molecule drugs, biopharmacy (antibody drugs, RNA, viruses, etc.) and the like.
  • tissue piece refers to a part (sample, sample) of the living tissue collected for acquiring the above-mentioned biological information, and is also referred to as a "living tissue piece”.
  • tissue section in which a part of a living tissue is sliced is also included in the "tissue piece" according to the present invention.
  • tissue piece include, in addition to the tissue piece itself collected from a living body, a tissue piece in which it is embedded in paraffin and a tissue piece in which it is deparaffinized after being embedded in paraffin.
  • Other examples include, but are not limited to, frozen sections, formalin sections, paraffin sections fixed under special conditions, cultured cells, tissue-derived details, and the like.
  • tissue piece when a living tissue is imaged, a part of the living tissue to be analyzed for acquiring bio-related information on the image is also referred to as a "tissue piece".
  • target substance refers to a biomolecule, a cell, a substance constituting a specific tissue part, a drug acting on these, or the like, which is to be observed / analyzed in a biological tissue.
  • Target substances include, for example, nucleic acids (DNA, RNA, polynucleotides, oligonucleotides, PNAs (peptide nucleic acids), etc., which may be single-stranded or double-stranded, or nucleosides, nucleotides, and modified molecules thereof). , Proteins (polypeptides, oligopeptides, receptors present on the cell membrane of cells, etc.), amino acids (including modified amino acids), sugars (oligosaccharides, polysaccharides, sugar chains, etc.), lipids, exosomes, and these. Examples include modified molecules and complexes. Further, the target substance is not unique to the living body, but may be introduced into the living body from the outside (for example, a constituent component of a drug).
  • Steps for constructing a bio-related information acquisition method In the bio-related information acquisition method of the present invention, the following steps 2 and 4 are at least necessary, but the method is configured to include various steps depending on other purposes. Is preferable. For example, as shown below, it is preferable that the method is configured to include each of the following steps including step 1 as a pre-step step of the bio-related information acquisition method of the present invention.
  • Step 1 Image acquisition process of biological tissue, etc.
  • Step 2 Distribution information acquisition process
  • Step 3 Variation determination process
  • Step 4 Target substance evaluation process
  • a form including a step of preparing a biological tissue specimen as a step before the image acquisition step of a biological tissue or the like is also preferable.
  • a form including a step of preparing a biological tissue specimen as a step before the image acquisition step of a biological tissue or the like is also preferable.
  • each step and components will be specifically described in sequence, but the present invention is not limited thereto.
  • FIG. 1 shows the flow of the process of the biological information acquisition method having the configuration including the variation determination step.
  • the biological information acquisition method shown in FIG. 1 includes a biological tissue image acquisition step (S10), a distribution information acquisition step (S11), a variation determination step (S13), and a target substance evaluation step (S15 and S17). Is.
  • the biological tissue image acquisition step (S10) for example, a specimen (tissue piece) of a biological tissue directly or collected from a human body tissue is photographed, and a biological tissue image in which the target substance in the specimen is visualized is acquired.
  • the distribution information acquisition step (S11) information on the distribution of the presence or amount of the target substance in the tissue piece is acquired as information on the distribution of the target substance based on the biological tissue image obtained in the above step.
  • information on the existence or amount of the target substance in the tissue piece may be further generated and obtained as information on the distribution of the target substance.
  • Information on the distribution of the target substance is obtained in the first region of the tissue piece. Ideally, the first region is the entire piece of tissue, but it may be only a part of the piece of tissue as long as it does not affect the evaluation of the distribution of the target substance in the piece of tissue.
  • the first region is set so that the distribution of the target substance in the tissue piece can be accurately grasped.
  • the variation determination step (S12) it is determined whether or not there is variation in the distribution of the target substance in the tissue piece. For example, based on the information (first information) regarding the distribution of the target substance in the tissue piece acquired in the distribution information acquisition step (S11), the variation in the presence or amount of the target substance in the tissue piece exceeds a predetermined reference value. Judge whether or not. If the presence or amount of the target substance varies below the predetermined judgment standard value or less than the predetermined judgment standard value, it is determined that there is no variation. In this case, since there is no variation in the distribution of the target substance in the tissue piece, in the next step, the target substance evaluation step (S13), the presence of the target substance in the first region acquired in the distribution information acquisition step (S11). Alternatively, the information regarding the amount is acquired as it is as the second information for evaluating the presence or amount of the target substance in the tissue piece.
  • the process proceeds to the target substance evaluation step (S14) to evaluate the presence or amount of the target substance in any second region within the first region and narrower than the first region.
  • the third information which is information, is newly acquired as information for evaluating the presence or amount of the target substance in the tissue piece.
  • the second information or the third information is used to determine the target substance in the tissue piece depending on whether or not the distribution of the target substance in the tissue piece varies. Evaluate the presence or quantity.
  • each step will be described in more detail, and then embodiments and examples will be described.
  • the distribution information acquisition step according to the present invention may include a step of acquiring an image by the following imaging means of living tissue, etc. as a first step thereof.
  • the "image of a living tissue or the like” is an image of the living tissue itself, an image of a state in which a drug is attached to a specific part of the living tissue, a fluorescent light-emitting compound, a radiation-labeled compound, or the like. It refers to an image or the like obtained by making it possible to detect a specific part of the above or a drug adhering to the specific part.
  • a bright-field image of a tissue section containing a target substance and stained with an immunostaining agent is acquired, and based on this, a hole, which will be described later, is used.
  • An imaging area to be created as a slide image (WSI) is set, and an image is acquired based on a bright-field image.
  • an immunostaining agent for example, a conjugate of an antibody and fluorescent substance-accumulated nanoparticles (PID) is used to irradiate the fluorescent substance-accumulated nanoparticles with excitation light, and the fluorescence bright spots of the detected PID are clarified. Fluorescent bright spot images can be obtained.
  • the "virtual microscope” refers to a system in which an image observed by an optical microscope is digitized and a tissue sample can be observed on a display as if the optical microscope was actually used.
  • the entire tissue sample on the slide glass is photographed, the obtained image is converted into digital data and saved in a database, and observation is performed using viewer software installed on a personal computer or the like.
  • the reason why it is called a virtual microscope is that it can be observed while performing operations such as moving up and down, left and right, and scaling, as in the case of observation using an optical microscope.
  • the entire tissue specimen on the slide glass is photographed by an image processing system called a whole slide image (WSI) creation system.
  • a whole slide image (WSI) creation system the digital image data of the entire tissue sample called a hall slide image (WSI) is stored in the database. Since the stored digital image data can be accessed via the Internet or the like, for example, a rapid pathological diagnosis by a pathologist at a remote location and a rare tissue specimen can be made available to anyone.
  • the WSI creation system includes a microscope device that captures a microscope image, a control device that creates a WSI based on the captured image, and the like.
  • a microscope device that captures a microscope image
  • a control device that creates a WSI based on the captured image
  • a partial image of a slide is captured by a scanner and obtained.
  • Image data of the entire tissue sample is created by pasting together the partial image data.
  • an immunostaining method that is, an immunostaining method will be described.
  • the immunostaining method refers to a method of staining tissues, cells, etc. by an immune reaction using a labeled antibody so that the tissues, cells, etc. can be observed with a microscope or the like.
  • a tissue piece containing the target substance for example, a receptor present on the cell membrane of a cell
  • the target substance is visualized by a fluorescent label or an enzyme label (immunostaining image). Images of living tissue, etc.) are obtained.
  • fluorescent label As the fluorescent label, phosphor-accumulated particles (fluorescent dye-accumulated particles) can be used.
  • Fluorescent integrated particles are a structure in which particles made of organic or inorganic substances are used as a base, and a plurality of fluorescent substances (for example, fluorescent dyes and semiconductor nanoparticles) are contained therein and / or adsorbed on the surface thereof. It is a nano-sized particle having.
  • fluorescent dyes constituting the fluorescent substance integrated particles include rhodamine-based dyes, Cy-based dyes, AlexaFluor (registered trademark) -based dyes, BODIPY-based dyes, squarylium-based dyes, cyanine-based dyes, aromatic ring-based dyes, and oxazine-based dyes. Includes dyes, carbopyronine dyes, and pyromesene dyes.
  • Fluorescent integrated particles can be produced according to a known method (see, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2013-57937).
  • a recognition substance for specifically binding to the target substance is added to the phosphor-accumulated particles.
  • the recognition substance is selected so that the phosphor-accumulated particles and the target substance are directly or indirectly bound to each other.
  • recognition substances include proteins such as nucleotide chains, avidin, streptavidin and antibodies, and low molecular weight compounds such as biotin.
  • an antibody (primary antibody) that specifically binds to the target substance can be used as the recognition substance.
  • an antibody (secondary antibody) that specifically binds to the antibody (primary antibody) that specifically binds to the target substance is used as the recognition substance.
  • a substance that specifically binds to the secondary antibody eg, avidin, streptavidin, biotin, etc.
  • an aptamer or SNAP-tag is used as a molecular recognition group to obtain a first image.
  • the distribution information acquisition step is a step of acquiring first information which is information on the distribution of a target substance in an arbitrary first region in a tissue piece.
  • the setting of the first area is as described above.
  • the distribution information acquisition step may include an image acquisition step of the above-mentioned biological tissue or the like as a pre-stage of the distribution information acquisition step.
  • the "first region” refers to a relatively wide region set so that the distribution of the target substance can be accurately grasped as an observation / analysis target in the tissue piece in order to obtain information on the distribution of the target substance. ..
  • it may be set so as not to interfere with the evaluation of the distribution of the target substance in the tissue piece, even if it is not the whole tissue piece or the whole tissue piece.
  • the first information according to the present invention is not particularly limited as long as it is information on the distribution of the target substance in any first region in the tissue piece, but for example, the distribution of the presence or amount of the target substance in the first region. It is preferable that the information is related to the variation of. Further, it is preferable that the information regarding the existence of the target substance and the variation in the distribution of the amount of the target substance in the first region is the degree of uneven distribution of the target substance in the first region.
  • information on the existence and amount distribution of the target substance means the target substance (specific biological tissue, cell, drug, etc.) to be analyzed or observed in the two-dimensional or three-dimensional biological tissue piece or its image.
  • Etc. for example, information on each distribution state (including changes over time such as coordinate position, area of distribution area, concentration, density, increase / decrease, accumulation / diffusion azimuth velocity, etc.) when expressed in a coordinate system. say.
  • distribution information frequency distribution, aggregated value such as average value, etc. aggregated from a statistical viewpoint regarding the concentration, density, etc. of a specific molecule, cell, drug, etc. is also included.
  • the concentration refers to a concentration that can be detected by a marker or the like bound to a specific molecule, cell, drug, etc. per predetermined section, region, or unit area in a biological tissue image.
  • the amount of the drug correlates with a general drug concentration ([L / kg], [ ⁇ g / L], [ppm], [mol / L], etc.), unit conversion is possible indirectly. Is.
  • Variation means the spread of distribution.
  • index of the variation that is, the degree of spread of the distribution (“unevenness”), for example, the standard deviation ( ⁇ ), the variance, and the coefficient of variation ((standard deviation / mean value) ⁇ 100%: “CV” are expressed. ), Maximum-minimum width, quartile width, and half-value width of the frequency distribution map.
  • the presence or absence of variation is determined by comparing the first information (for example, the presence or uneven distribution of the target substance) obtained in the distribution information acquisition step with a predetermined reference value (for example, the ratio of a predetermined CV value). For example, it is determined by the degree of uneven distribution of the above-mentioned target substance. Further, when the distribution is a normal distribution, it is also good to judge the variation by using 3 ⁇ as an index. As a result, it is determined whether to acquire the second information or the third information in the target substance evaluation process described later.
  • a predetermined reference value for example, the ratio of a predetermined CV value
  • Target substance evaluation step provides second information, which is information for evaluating the presence or amount of a target substance in the first region, based on the first information.
  • This is a step of acquiring, or acquiring third information, which is information for evaluating the presence or amount of a target substance in any second region within the first region and narrower than the first region. Further, as described above, in this step, how to evaluate the target substance is determined based on the information about the uneven distribution degree of the target substance obtained in the distribution information acquisition step.
  • the "second information" is information for evaluating the existence or amount of a target substance in the first region based on the first information. ..
  • the presence or amount of the target substance is based on the information on the presence or amount of the target substance in the first region acquired in the distribution information acquisition step.
  • the second information which is the information for evaluating is acquired.
  • the information may be the presence or amount of the target substance in the first region, or may be the presence or amount of the target substance in the smaller region in the first region.
  • the "third information” is information for evaluating the existence or amount of the target substance in the second region.
  • the third information is information for evaluating the existence or amount of the target substance as in the second information, but the evaluation area differs depending on whether the evaluation area is the first area or the second area.
  • the target substance evaluation step if there is a variation (large variation), for example, the amount of the target substance per section is calculated, and the top 10% of the calculated average amount of the target substance in each section.
  • a variation large variation
  • the target substance in any second region within the first region and narrower than the first region Acquire a third piece of information, which is information for evaluating the existence or quantity.
  • the "information for evaluating the existence or amount of the target substance” is the concentration of the target substance (specific biological tissue, cell, drug, etc.), the frequency distribution (histogram) of the concentration, the concentration average value, and the like. Includes statistical distribution information such as concentration representative value, concentration mode, drug distribution area area, drug distribution area density for a specific area of living tissue, drug effect space area ratio, and toxicity space area ratio.
  • An example of information on the existence of a target substance is the presence or absence of bright spots derived from fluorescent substance-accumulated nanoparticles (PID), an example of information on the amount of target substance is the number of bright spots derived from PID, and a PID corresponding to the bright spot. The number of bright spots or PIDs in a specific region such as a cell nucleus, a cell region, a tumor region, and the like.
  • each section corresponding to the top 10% having a high average brightness value of each calculated section is selected, and the lower limit of the brightness value of each section of these selected top 10% is twice or more the average value.
  • the time is evaluated as a large variation, and the number of bright spots or the number of particles per cell calculated by selecting a field (Hotspot) including the 10 sections having the highest luminance value is used as the third information.
  • the "second region” is a region that is set so that the distribution of the target substance within the first region and narrower than the first region can be accurately grasped, and the presence or amount of the target substance is to be evaluated. ..
  • the second region includes, for example, a region in which a target substance is expressed in a certain amount or more, a negative region in which a target substance does not exist, a cell region in which a specific cell occupies a region, and a region occupied by a specific cell group. It is a cell group region shown, an additional target region that is a target for visualizing a substance different from the target substance, and a gene analysis region that is a target for analyzing genes related to the target substance. That is, the second region can be freely set as a region to be represented by the presence or amount of the target substance in the living tissue, depending on the purpose of analysis or evaluation.
  • the “negative region” refers to a region in which the target substance does not exist.
  • Cell area refers to an area occupied by a particular cell.
  • cell group region refers to a region occupied by a specific cell group.
  • additional target area refers to a target area for further visualization of a substance different from the target substance.
  • the "gene analysis region” refers to a region to be further analyzed for genes related to a target substance.
  • a known gene detection method, nucleic acid amplification method, or the like can be used.
  • Various methods are known as a gene detection method and a nucleic acid amplification method, but the Invader method, the Sniper method, the TaqMan PCR method, the Hybridization Probe method, the SNPIT method, the Pyrominesis queuing method, the Denaturing High Performance Method, The MALDI-TOF / MS method, NanoChip method and the like can be mentioned as a method for rapid and high-throughput analysis.
  • the mutant nucleic acid can be obtained by determining the base sequence of the amplification product in the detection region. The presence or absence can be determined.
  • a fluorescently labeled photolinking probe containing photoresponsive nucleic acids complementary to a target site is conjugated and irradiated with light between the target nucleic acid and the photolinking probe.
  • Examples thereof include a method of detecting the gene by photolinking and detecting fluorescence.
  • a person skilled in the art can appropriately modify and carry out the optical linking method of the present invention according to the purpose of gene analysis, and can easily use it as a known gene detection method.
  • the nucleic acid amplification method refers to an amplification reaction of a template nucleic acid using a known polymerase reaction, and for example, an optical linkage method can be used in a known nucleic acid amplification suppression method disclosed in WO2012 / 033190. ..
  • the optical linkage method in the nucleic acid amplification method for example, when a known nucleic acid amplification method is carried out using a primer capable of amplifying a nucleic acid sequence (amplification nucleotide sequence) to be detected including a target site.
  • a primer capable of amplifying a nucleic acid sequence (amplification nucleotide sequence) to be detected including a target site.
  • amplification of a certain nucleic acid sequence for example, wild-type nucleic acid
  • only other nucleic acid sequences for example, mutant nucleic acid
  • wild-type nucleic acid or mutant nucleic acid is targeted for amplification suppression can be appropriately selected according to the purpose, and is not particularly limited. For example, when there is a large bias in the abundance ratio in a nucleic acid sample, amplification of a large amount of nucleic acid (for example, wild-type nucleic acid) is suppressed, and only a small amount of nucleic acid (for example, mutant nucleic acid) is selectively amplified. This makes it possible to detect the presence or absence of nucleic acid present in a trace amount.
  • nucleic acid for example, wild-type nucleic acid
  • mutant nucleic acid for example, mutant nucleic acid
  • the target substance is a target of immunostaining using a fluorescent label mainly for detection or quantification from the viewpoint of pathological diagnosis. It is a biological substance expressed in a tissue section, particularly a protein (antigen). Typical target substances include biological substances that are expressed in the cell membranes of various cancer tissues and can be used as biomarkers.
  • Immunostaining agent (antibody-fluorescent nanoparticles conjugate)
  • antibody-fluorescent nanoparticles conjugate As an immunostaining agent, in order to improve the efficiency of fluorescent labeling and suppress the passage of time leading to deterioration of fluorescence as much as possible, the primary antibody and fluorescent nanoparticles indirectly, that is, using an antigen-antibody reaction or the like, other than covalent bonds. It is preferable to use a complex linked by the binding of. In order to simplify the staining operation, a complex in which fluorescent nanoparticles are directly linked to the primary antibody or the secondary antibody can also be used as the immunostaining agent.
  • immunostaining agent examples include [primary antibody against the target substance] ... [antibody against the primary antibody (secondary antibody)] to [fluorescent nanoparticles].
  • “...” Indicates that the bond is bound by an antigen-antibody reaction, and the mode of binding indicated by “ ⁇ ” is not particularly limited.
  • covalent bond ionic bond, hydrogen bond, coordination bond, antigen-antibody bond, and the like.
  • examples thereof include biotin avidin reaction, physical adsorption, chemical adsorption, and the like, and may be mediated by a linker molecule if necessary.
  • an antibody (IgG) that specifically recognizes and binds to a protein as a target substance as an antigen can be used.
  • an anti-HER2 antibody can be used
  • HER3 is the target substance
  • an anti-HER3 antibody can be used.
  • an antibody (IgG) that specifically recognizes and binds to the primary antibody as an antigen can be used.
  • Both the primary antibody and the secondary antibody may be polyclonal antibodies, but monoclonal antibodies are preferable from the viewpoint of quantitative stability.
  • the type of animal (immune animal) that produces an antibody is not particularly limited, and may be selected from mice, rats, guinea pigs, rabbits, goats, sheep, and the like as in the past.
  • Fluorescent nanoparticles are nano-sized particles that emit fluorescence when irradiated with excitation light, and are sufficient to represent the target substance as bright spots one by one. It is a particle that can emit intense fluorescence.
  • fluorescent nanoparticles in the present embodiment, phosphor integrated nanoparticles (PID: Phosphor Integrated Dot nanoparticles) are used.
  • the PID has a structure in which particles made of an organic substance or an inorganic substance are used as a base, and a plurality of fluorescent substances (for example, quantum dots, organic fluorescent dyes, etc.) are contained therein and / or adsorbed on the surface thereof. It is a nano-sized particle.
  • fluorescent substances for example, quantum dots, organic fluorescent dyes, etc.
  • quantum dot integrated nanoparticles, fluorescent dye integrated nanoparticles, or the like are used.
  • the fluorescent substance used for PID shows emission of visible to near-infrared light having a wavelength in the range of 400 to 900 nm when excited by ultraviolet to near infrared light having a wavelength in the range of 200 to 700 nm. It is preferable that the mother body and the fluorescent substance have substituents or sites having opposite charges to each other, and an electrostatic interaction acts.
  • the average particle size of the PID used in the present invention is not particularly limited, but it is preferably about 30 to 800 nm from the viewpoint of the amount of the fluorescent substance contained in the integrated particles and the ease of binding with the target substance.
  • the average particle size is more preferably in the range of 40 to 500 nm.
  • For the average particle size take an electron micrograph using a scanning electron microscope (SEM), measure the cross-sectional area of a sufficient number of particles, and use the diameter of the circle as the area of the circle as the area of each measured value. Can be obtained as.
  • thermosetting resins such as melamine resin, urea resin, aniline resin, guanamine resin, phenol resin, xylene resin and furan resin.
  • Resins resins generally classified as thermoplastic resins such as styrene resin, acrylic resin, acrylonitrile resin, AS resin (acrylonitrile-styrene copolymer), ASA resin (acrylonitrile-styrene-methyl acrylate copolymer).
  • Other resins such as polylactic acid; polysaccharides can be exemplified.
  • the inorganic substance in the mother body include silica and glass.
  • Fluorescent dye-accumulated nanoparticles are structures in which fluorescent dyes are contained in the mother body and / or adsorbed on the surface thereof. Have.
  • the fluorescent dye include organic fluorescent dyes such as rhodamine-based dye molecules, squarylium-based dye molecules, cyanine-based dye molecules, aromatic ring-based dye molecules, oxazine-based dye molecules, carbopyronine-based dye molecules, and pyrromesen-based dye molecules. can.
  • Alexa Fluor registered trademark, manufactured by Invigen
  • BODIPY registered trademark, manufactured by Invigen
  • Cy registered trademark, manufactured by GE Healthcare
  • the fluorescent dye When the fluorescent dye is contained in the mother body, the fluorescent dye may or may not be chemically bonded to the mother body itself as long as it is dispersed inside the mother body.
  • Fluorophore-accumulated nanoparticles can be produced by a known method.
  • silica nanoparticles encapsulating a fluorescent dye can be synthesized with reference to the synthesis of FITC-encapsulating silica particles described in Langmuir Vol. 8, p. 2921 (1992).
  • FITC-encapsulating silica particles described in Langmuir Vol. 8, p. 2921 (1992).
  • FITC-encapsulating silica particles described in Langmuir Vol. 8, p. 2921 (1992).
  • a desired fluorescent dye instead of FITC
  • various fluorescent dye-accumulated nanoparticles can be synthesized.
  • Polystyrene nanoparticles containing a fluorescent dye can be obtained by using a copolymerization method using an organic dye having a polymerizable functional group described in US Pat. No. 4,326,008 (1982) or polystyrene nanoparticles described in US Pat. No. 5,326,692 (1992). It can be produced by using a method of impregnating particles with a fluorescent dye.
  • Staining method for tissue sections An example of the staining method will be described.
  • the method for preparing a tissue section to which this staining method can be applied (also referred to simply as a “section” and including a section such as a pathological section) is not particularly limited, and a tissue section prepared by a known procedure can be used.
  • Specimen preparation step For example, a section is immersed in a container containing xylene to remove paraffin.
  • the temperature is not particularly limited, but it can be carried out at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or more and 30 minutes or less. Further, if necessary, xylene may be replaced during the immersion.
  • the temperature is not particularly limited, but it can be carried out at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or more and 30 minutes or less. Further, if necessary, ethanol may be replaced during the immersion.
  • the temperature is not particularly limited, but it can be carried out at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or more and 30 minutes or less. Further, if necessary, the water may be replaced during the immersion.
  • the activation treatment of the target biological substance is performed according to a known method.
  • the activation conditions are not particularly specified, but the activating solution includes 0.01 M citric acid buffer (pH 6.0), 1 mM EDTA solution (pH 8.0), 5% urea, and 0.1 M Tris-hydrochloric acid buffer.
  • a liquid or the like can be used.
  • the pH condition is such that a signal is output from the range of pH 2.0 to 13.0 depending on the tissue section to be used and the tissue roughness is such that the signal can be evaluated. Normally, it is performed at pH 6.0 to 8.0, but for special tissue sections, it is also performed at pH 3.0, for example.
  • As the heating device an autoclave, a microwave, a pressure cooker, a water bath, or the like can be used.
  • the temperature is not particularly limited, but it can be carried out at room temperature. The temperature can be 50 to 130 ° C. and the time can be 5 to 30 minutes.
  • the section after the activation treatment is immersed in a container containing PBS and washed.
  • the temperature is not particularly limited, but it can be carried out at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or more and 30 minutes or less. Further, if necessary, the PBS may be replaced during the immersion.
  • Immunostaining step In the immunostaining step, in order to stain the target substance, a solution of an immunostaining agent containing fluorescent nanoparticles having a site capable of directly or indirectly binding to the target substance is placed on a section. React with the target substance.
  • the solution of the immunostaining agent used in the immunostaining step may be prepared in advance before this step.
  • immunostaining is performed with a plurality of immunostaining agents corresponding to the target substances.
  • the plurality of immunostaining agents used in this case may be those containing at least one immunostaining agent (PID stain) using PID, and if the antibody and the fluorescent substance (fluorescent wavelength) are different from each other, PID staining may be used. It is also possible to detect multiple target substances by multiple staining using multiple agents or by combining PID staining and immunostaining using fluorescent labels such as organic fluorescent substances and quantum dots. be. In this case, a solution of each immunostaining agent is prepared, placed on a section, and reacted with a target substance.
  • each immunostaining agent may be mixed in advance when the solution is placed on a section, or separately. It may be placed sequentially in.
  • the conditions for performing the immunostaining step should be appropriately adjusted so as to obtain an appropriate signal according to the conventional immunostaining method. Can be done.
  • the temperature is not particularly limited, but it can be carried out at room temperature.
  • the reaction time is preferably 30 minutes or more and 24 hours or less. It is preferable to drop a known blocking agent such as PBS containing BSA or a surfactant such as Tween 20 before performing the treatment as described above.
  • tissue specimen after the immunostaining step is subjected to treatments such as immobilization / dehydration, permeation, and encapsulation so as to be suitable for observation.
  • the tissue section may be immersed in a fixing treatment solution (crosslinking agent such as formalin, paraformaldehyde, glutaraldehyde, acetone, ethanol, methanol).
  • a fixing treatment solution crosslinking agent such as formalin, paraformaldehyde, glutaraldehyde, acetone, ethanol, methanol.
  • the tissue sections that have been immobilized and dehydrated may be immersed in a permeation solution (xylene or the like).
  • the encapsulation treatment may be performed by immersing the tissue section that has been subjected to the permeation treatment in the encapsulation liquid.
  • the conditions for performing these treatments for example, the temperature and the soaking time when the tissue section is immersed in a predetermined treatment solution, may be appropriately adjusted so as to obtain an appropriate signal according to the conventional immunostaining method. can.
  • Bright visual field morphological observation staining step Separate from the immunostaining step, morphological observation staining is performed so that the morphology of cells, tissues, organs, etc. can be observed in the bright visual field.
  • the morphological observation dyeing step can be performed according to a conventional method. For morphological observation of the tissue specimen 50, staining with eosin, in which cytoplasm, stroma, various fibers, erythrocytes, and keratinized cells are stained in red to deep red, is standardly used.
  • hematoxylin which stains cell nuclei, lime, cartilage tissue, bacteria, and mucus in blue-blue to pale blue, is also standardly used (the method of performing these two stainings at the same time is hematoxylin / eosin staining). (Known as HE staining)).
  • morphological observation staining is performed by the HE staining method.
  • the cells appear to be stained in red, and the outline of the cells can be seen, so the size of the cells, the size of the nuclei, the number of nuclei, the stage of the cell cycle, the degree of canceration, and the cell population.
  • Information such as personality and relationships between groups can also be obtained.
  • such information can be obtained in more detail by immunostaining. That is, a staining method that combines an HE staining method and an immunostaining method can also be used in the morphological observation staining step.
  • images are acquired at high magnification for observing target substances, and images are acquired at medium magnification for identifying cell types and observing regions such as tumor regions and stromal regions. Images are acquired at low magnification for observing tissue structures such as blood vessels and lymph vessels, and hall slides are useful for acquiring, storing, and using all such information in the future.
  • the morphological observation staining step it may be performed after the immunostaining step or before the immunostaining step.
  • a bright field image of the tissue sample is acquired by the above-mentioned device for image acquisition, and a hole is obtained based on the image acquisition.
  • the tissue specimen is irradiated with excitation light of fluorescently labeled fluorescent substance-accumulated nanoparticles (PID), and more precise focusing is performed with reference to the detected fluorescence bright spot of the PID to achieve clear fluorescence. Get a point image.
  • the fluorescently labeled body labeled on the tissue specimen 50 is excited.
  • the excitation light source is controlled to irradiate the tissue specimen with excitation light that excites the labeled PID.
  • the captured partial images are combined to create a fluorescent image of the entire imaging region. That is, by pasting the partial images side by side, a high-resolution fluorescent image of the entire tissue specimen can be obtained.
  • the position of the drug can be identified by immunostaining (fluorescent dye, etc.) on the tissue sections collected from the living body after administration of the drug to be distributed, and an imaging device such as a fluorescence microscope can be used.
  • an imaging device such as a fluorescence microscope can be used.
  • Use to acquire an image For example, acquisition of a fluorescent image of a section stained with a drug using nanoparticles accumulating fluorescent substances.
  • pretreatment may be performed to improve the extraction accuracy of drug information. Further, at the time of fluorescence analysis, it is preferable to perform signal processing such as a high-pass filter (HPF: high-pass filter: high-pass filter) to remove autofluorescent noise.
  • HPF high-pass filter: high-pass filter
  • a marker stain for discriminating the region may be extracted, or discrimination may be performed using machine learning. Manual work is also acceptable.
  • [2] Acquisition of drug distribution information In order to identify the first region, which is a relatively wide analysis target region, in the acquired image of the biological tissue, etc., and to extract the spatial distribution information of the drug concentration from the drug staining intensity as the first information. Calculate the integrated brightness of fluorescent staining, detect the bright spots of fluorescent staining, and quantify the drug concentration by calculating fluorescent particles. For statistical calculation of drug spatial distribution and concentration distribution, evaluation of drug concentration uniformity / variation by histogram, drug efficacy space or toxicity space area ratio evaluation by concentration threshold processing, etc. are performed.
  • the drug concentration range that satisfies a predetermined frequency ratio (for example, 95 [%], etc.) based on the most frequent concentration value is defined as the drug concentration distribution variation performance.
  • the variation is determined based on the fluctuation coefficient value (CV value).
  • Target substance evaluation step When it is determined in the determination step that there is no variation in the distribution of the drug as the target substance in the first region, the second information is acquired in the target substance evaluation step. For example, information on the medicinal space or toxic space area ratio by concentration threshold processing is acquired, and the medicinal effect or toxicity is evaluated using the area ratio as a judgment standard.
  • the third information is acquired. For example, information on the relationship between a specific biological tissue (for example, a biomarker) and a drug concentration distribution is acquired, and the drug efficacy is evaluated.
  • Distribution information acquisition step The brightness value for each section was calculated with one section as a square with a side of 48.3 ⁇ m. In addition, it was decided not to convert the brightness of the sections in which the edges of each section do not include the analysis area.
  • the lower limit of the distribution of the top 10% (for example, the average luminance value corresponding to the top 10%, or the top 10% is the most. (Near average luminance value) was used as the reference value for determining the variation.
  • the section in which the lower limit of the distribution of the upper 10% was twice or more the average luminance value was evaluated as having a large variation (with variation).
  • the sections where the lower limit of the distribution of the top 10% was less than twice the average luminance value were evaluated as having small variation (none).
  • the ratio for example, 100%
  • the divisions whose average brightness value is equal to or higher than the predetermined ratio of the coefficient of variation are evaluated as having variations, and the divisions whose average brightness value is less than the predetermined ratio of the coefficient of variation are evaluated as having no variation. You can also.
  • Target substance evaluation process For cases with large variations, the field of view (Hotspot) including the 10 sections with the highest luminance values was selected as the second region, and Olympus BX-63 was used for imaging (objective 40 times). The number of particles per cell was calculated.
  • Hotspot field of view
  • Olympus BX-63 Olympus BX-63
  • PD-L1 Programmed cell Death 1-Ligand 1
  • PD-L1 +/- cutoff PD-L1 +/- cutoff
  • Examples 1 to 7 After determining the variation in PD-L1 expression by WSI using the tumor cases of each of the following organs, the evaluation in the narrow region, that is, the second region was performed (selecting a visual field including 10 compartments in an arbitrary (Hotspot) region, and performing cells. Evaluation was performed based on the number of particles per hit.
  • the examples have smaller p * values than the comparative examples, and are suitable for more accurate pathological diagnosis.
  • the second range is used as an "additional target region" for further visualizing a substance different from the target substance, and analysis is performed using a combination of PD-L1 utilizing WSI and another marker (CD8). rice field.
  • CD8 positive rate was quantitatively evaluated (WSI analysis). Image acquisition by WSI in each tumor case was automatically counted using Aprio for CD8 positive T cells. The CD8-positive T cell rate (number of CD8-positive T cells / total number of cells in ROI) for each Nanozoomer compartment was calculated.
  • the CD8-positive T cell rate in Hotspot was calculated as the third information.
  • second information a visual field (Hotspot) containing 10 compartments with a high CD8-positive T cell rate was selected and photographed with Olympus BX-63 (objective 40 times), and the number of particles per cell was taken. , CD8 positive rate was calculated.
  • a visual field including 10 compartments is arbitrarily selected without acquiring overall information, and the CD-positive cell rate and the number of particles per cell are calculated in the same manner.
  • Target substance evaluation step For the protein to be evaluated in the examples, the prognosis of the PD-L1 positive and CD8 positive group and the other groups was compared using the PD-L1 and CD8 positive T cell rates (p). The value ** ) was performed. Furthermore, the prognosis of the PD-L1 positive and CD8 positive group and the PD-L1 negative and CD8 negative group was compared (p value *** ). Regarding the cutoff value of the CD8 positive rate, the CD8 positive rate of 3% was set as the CD8 positive and negative cutoff value.
  • Example 8 to 14 After evaluating the variation in PD-L1 expression by WSI using the tumor cases of each organ, the evaluation in the narrow region, that is, the second region was performed by selecting a field including 10 compartments in PD-L1 or Hotspot of CD8-positive cells. Evaluation was performed based on the number of particles per cell and the CD8 positive rate. A significance test was performed and the p-values ** and p-values *** are summarized in Table II.
  • the p-values ** and p-values *** in Table II the p-values ** and p-values *** are smaller in the examples than in the comparative examples, for more accurate pathological diagnosis. It turns out to be suitable.
  • the distribution of the target substance in the tissue piece is also taken into consideration, it is possible to provide a biological information acquisition method and a biological information acquisition system capable of accurately grasping the existence and amount of the target substance in the tissue piece.

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Abstract

本発明の課題は、組織片における標的物質の分布情報及び注目領域における標的物質に関わる情報の両方を正確に把握することができる生体関連情報取得方法及び情報取得システムを提供することである。　本発明は、生体組織における標的物質を評価するための情報を取得する生体関連情報取得方法であって、少なくとも、分布情報取得工程と標的物質評価工程とを有し、前記分布情報取得工程は、組織片中の任意の第１領域における標的物質の分布に関する情報である第１情報を取得する工程であり、前記標的物質評価工程は、前記第１情報に基づいて、前記第１領域における標的物質の存在又は量を評価するための情報である第２情報を取得し、又は前記第１領域内であってかつ前記第１領域よりも狭い任意の第２領域における標的物質の存在又は量を評価するための情報である第３情報を取得する工程であることを特徴とする。

Description

生体関連情報取得方法及び生体関連情報取得システム
　本発明は生体関連情報取得方法及び情報取得システムに関する。
　より詳しくは、組織片における標的物質の存在や量を正確に把握することができる生体関連情報取得方法及び生体関連情報取得システムに関する。
　病理診断において、病変の種類に応じて効果的な治療法を選択するために、組織標本中の特定の物質（「バイオマーカー」又は「生物指標化合物」とも称される物質を含む。）の発現量や細胞内での分布等の発現パターンに基づいて、病変の悪性度等が判断されている。
　また、例えば癌等の疾病の悪性度は、標的物質であるバイオマーカーの発現量だけでなく、分布の偏り等によって異なることが知られている。
　しかし、標的物質が発現されている注目領域のみを解析する従来の方法では、注目領域における標的物質に関わる情報を把握できるものの、組織片における標的物質に関わる情報は把握できず、例えば、各注目領域間において標的物質の発現状況等が異なる場合、その差異を把握することもできない。
　このため、病変の悪性度等について誤判断等が生じてしまい、正確な評価、判断を行うことができなかった。
　例えば特許文献１には、１つの視野における生体物質の発現量を算出し、当該発現パターン情報を生成し、それに応じた細胞のクラス分けを行う技術が開示されている。
　すなわち、組織片（組織標本）における小範囲における標的物質の発現量に関する情報を取得し、当該情報に基づいて、組織片の当該小範囲における細胞を分類している。
　しかし、観察した視野以外の組織片の領域や、それより広範囲の組織片の領域における標的物質に関わる情報を取得し、当該情報に基づき、標的物質の存在や量を評価した上での病理診断という点で改善の余地があった。
国際公開第２０１８／１４３４０６号
　本発明は、上記問題・状況に鑑みてなされたものであり、その解決課題は、組織片における標的物質の情報及び標的物質に関わる情報の両方を正確に把握することができる生体関連情報取得方法及び生体関連情報取得システムを提供することである。
　本発明者は、上記課題を解決すべく、上記問題の原因等について検討する過程において、生体組織における標的物質を評価するにあたり、組織片中における標的物質の分布に関する情報、例えば特に、組織片中における標的物質のバラつきに関する情報を取得し、その情報に基づいて標的物質を評価すること等により、上記課題を解決できることを見いだし、本発明に至った。
　すなわち、本発明に係る上記課題は、以下の手段により解決される。
　１．生体組織における標的物質を評価するための情報を取得する生体関連情報取得方法であって、
　少なくとも、分布情報取得工程と標的物質評価工程とを有し、
　前記分布情報取得工程は、組織片中の任意の第１領域における標的物質の分布に関する情報である第１情報を取得する工程であり、
　前記標的物質評価工程は、前記第１情報に基づいて、前記第１領域における標的物質の存在又は量を評価するための情報である第２情報を取得し、又は前記第１領域内であってかつ前記第１領域よりも狭い任意の第２領域における標的物質の存在又は量を評価するための情報である第３情報を取得する工程である
　ことを特徴とする生体関連情報取得方法。
　２．前記第１情報が、前記第１領域における前記標的物質の分布のバラつきに関する情報であることを特徴とする第１項に記載の生体関連情報取得方法。
　３．前記第１領域における前記標的物質の分布のバラつきに関する情報が、前記第１領域における前記標的物質の偏在度であることを特徴とする第１項又は第２項に記載の生体関連情報取得方法。
　４．前記分布情報取得工程において、前記第１領域における前記標的物質の存在が可視化された画像に基づいて前記第１情報を取得することを特徴とする第１項から第３項までのいずれか一項に記載の生体関連情報取得方法。
　５．前記第２領域が、標的物質が存在しない領域を示す陰性領域、特定の細胞が占有する領域を示す細胞領域、特定の細胞群が占有する領域を示す細胞群領域、標的物質とは異なる物質を可視化する対象となる追加標的領域、又は標的物質に関わる遺伝子を解析する対象となる遺伝子解析領域であることを特徴とする第１項から第４項までのいずれか一項に記載の生体関連情報取得方法。
　６．前記各工程に加えて、前記第１情報に基づいて前記第１領域における前記標的物質の分布にバラつきがあるか否かを判定する判定工程を有することを特徴とする第１項から第５項までのいずれか一項に記載の生体関連情報取得方法。
　７．前記判定工程において前記第１領域における標的物質の分布にバラつきがないと判定されたとき、前記標的物質評価工程において前記第２情報を取得し、評価することを特徴とする第６項に記載の生体関連情報取得方法。
　８．前記判定工程において前記第１領域における標的物質の分布にバラつきがあると判定されたとき、前記標的物質評価工程において前記第２領域における前記第３情報を取得し、評価することを特徴とする第６項に記載の生体関連情報取得方法。
　９．生体組織における標的物質を評価するための情報を取得する情報取得システムであって、第１項から第８項までのいずれか一項に記載の生体関連情報取得方法を実施するための工程手段を有することを特徴とする生体関連情報取得システム。
　本発明の上記手段により、組織片における標的物質の分布も考慮されるため、組織片における標的物質の存在や量を正確に把握することができる生体関連情報取得方法及び生体関連情報取得システムを提供することができる。
　本発明の効果の発現機構又は作用機構については、明確にはなっていないが、以下のように推察している。
　従来は、病理診断において、病変の種類に応じて効果的な治療法を選択するために、組織標本中の特定の生体物質の発現量や細胞内での分布等の発現パターンに基づいて、病変の悪性度等が判断されていた。
　しかし、標的物質が発現されている注目領域のみを解析する従来の方法では、注目領域における標的物質に関わる情報を把握できるものの、組織片における標的物質に関わる情報は把握できず、例えば、各注目領域間において標的物質の発現状況等が異なる場合、その差異を把握することもできない。
　このため、病変の悪性度等について誤判断等が生じてしまい、正確な評価、判断を行うことができなかった。
　本発明では、生体組織における標的物質を評価するための情報を取得する生体関連情報取得方法として、組織片中の任意の領域における標的物質の分布及びそのバラつきに関する情報を取得し、その情報に基づいて標的物質の存在又は量を評価するための情報を得て、さらに狭い任意の領域における標的物質の存在又は量を評価するための情報を得ることにより、従来よりも正確でより迅速な病理診断ができることを見出した。
生体関連情報取得方法の工程の流れの例を示す図
　本発明の生体関連情報取得方法は、生体組織における標的物質を評価するための情報を取得する生体関連情報取得方法であって、少なくとも、分布情報取得工程と標的物質評価工程とを有し、前記分布情報取得工程は、組織片中の任意の第１領域における標的物質の分布に関する情報である第１情報を取得する工程であり、前記標的物質評価工程は、前記第１情報に基づいて、前記第１領域における標的物質の存在又は量を評価するための情報である第２情報を取得し、又は前記第１領域内であってかつ前記第１領域よりも狭い任意の第２領域における標的物質の存在又は量を評価するための情報である第３情報を取得する工程であることを特徴とする。
　この特徴は、下記各実施形態に共通又は対応する技術的特徴である。
　本発明の実施形態としては、前記第１情報が、前記第１領域における前記標的物質の分布のバラつきに関する情報であることが、注目領域と関連づけて病理診断ができる観点からより好ましい。
　前記第１領域における前記標的物質の分布のバラつきに関する情報が、前記第１領域における前記標的物質の偏在度であることが、正確な病理診断ができる観点から好ましい。
　前記分布情報取得工程において、前記第１領域における前記標的物質の存在が可視化された画像に基づいて前記第１情報を取得することが、目視による判断ができる観点から好ましい。
　前記第２領域は、例えば標的物質が存在しない領域を示す陰性領域、特定の細胞が占有する領域を示す細胞領域、特定の細胞群が占有する領域を示す細胞群領域、標的物質とは異なる物質を可視化する対象となる追加標的領域、標的物質に関わる遺伝子を解析する対象となる遺伝子解析領域である。
　前記各工程に加えて、前記第１情報に基づいて前記第１領域における前記標的物質の分布にバラつきがあるか否かを判定する判定工程を有することが、より迅速に正確な病理診断ができる観点から好ましい。
　前記判定工程において前記第１領域における標的物質の分布にバラつきがないと判定されたとき、前記標的物質評価工程において前記第２情報を取得し、評価することが、より詳細な病理診断ができる観点から好ましい。
　前記判定工程において前記第１領域における標的物質の分布にバラつきがあると判定されたとき、前記標的物質評価工程において前記第２領域における前記第３情報を取得し、評価することが、迅速な病理診断ができる観点からより好ましい。
　本発明の生体関連情報取得方法は、生体関連情報取得システムに好適に用いられる。
　以下、本発明とその構成要素及び本発明を実施するための形態・態様について説明をする。なお、本願において、「～」は、その前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む意味で使用する。
［本発明の生体関連情報取得方法の概要］
　本発明の生体関連情報取得方法は、生体組織における標的物質を評価するための情報を取得する生体関連情報取得方法であって、少なくとも、分布情報取得工程と標的物質評価工程とを有し、前記分布情報取得工程は、組織片中の任意の第１領域における標的物質の分布に関する情報である第１情報を取得する工程であり、前記標的物質評価工程は、前記第１情報に基づいて、前記第１領域における標的物質の存在又は量を評価するための情報である第２情報を取得し、又は前記第１領域内であってかつ前記第１領域よりも狭い任意の第２領域における標的物質の存在又は量を評価するための情報である第３情報を取得する工程であることを特徴とする。
　（主要用語の定義）
　あらかじめ、以下において、本発明に係る主要な技術用語の意義について説明する。
　「生体関連情報」とは、生体組織及び当該生体組織に作用する薬物等に関連する情報をいう。
　「生体組織」とは、人間や動物等を含む生体において、複数の細胞が所定のパターンで集合してなる組織であり、生体の一部を構成する組織をいう。
　組織の種類としては、骨、軟骨、筋肉、腱などの結合組織、血管、神経、皮膚、毛髪、各種臓器が挙げられる。
　各種臓器は、眼、肺、腎臓、心臓、肝臓、膵臓、脾臓、小腸を含む消化管、膀胱、卵巣及び精巣などである。
　また、発生段階ないしは組織化の途中にある組織（例えば胚組織）も含まれる。
　さらに、これら組織には、種々の事情により変異した組織、例えば病変組織をも含まれる。
　「薬物」とは、自然界の物質又は化学物質に由来する物質であって、生体外から、人為的に投与又は特定の外部環境依存的に摂取・吸引・吸収され、生体に対し何らかの薬効及び毒性を発揮する生物活性物質及び生理活性を持つ生体内化学物質由来の物質のことをいう。
　例えば低分子医薬品、バイオ医薬品（抗体医薬品、ＲＮＡ、ウイルスなど）等が挙げられる。
　「組織片」とは、上記生体関連情報を取得するために採取された生体組織の一部分（試料、検体）をいい、「生体組織片」ともいう。
　また、特に生体組織の一部を薄く切った「組織切片」も本発明に係る「組織片」に含まれる。
　「組織片」の具体的例としては、生体から採取された組織片そのものに加えて、これをパラフィン包埋した組織片や、パラフィン包埋後脱パラフィンした組織片も含まれる。
　その他、凍結切片等、ホルマリン切片、特殊条件で固定したパラフィン切片、培養細胞、組織由来細部等が挙げられるが、これらに制限されることはない。
　なお、本発明においては、生体組織を画像化した場合、当該画像上で、生体関連情報を取得するための解析対象になった生体組織の一部分についても「組織片」と呼ぶことにする。
　「標的物質」とは、生体組織において観察・解析対象となる生体分子、細胞、特定組織部分を構成する物質及びこれらに作用する薬物等をいう。
　標的物質としては、例えば核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）など、又はヌクレオシド、ヌクレオチド及びそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド、細胞の細胞膜に存在する受容体など）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖など）、脂質、エクソソーム、及びこれらの修飾分子、複合体が挙げられる。
　また、標的物質は、生体内に固有するものでなく、外部から生体内に導入されたもの（例えば薬物の構成成分など）であっても良い。
１．生体関連情報取得方法を構成する工程
　本発明の生体関連情報取得方法においては、下記工程２及び工程４は最低限必要であるが、その他目的に応じて種々の工程を含めた構成の方法とすることが好ましい。
　例えば以下に示すように、本発明の生体関連情報取得方法の前段工程として工程１を含む下記各工程を含む構成の方法であることが好ましい。
　工程１：生体組織等の画像取得工程
　工程２：分布情報取得工程
　工程３：バラつき判定工程
　工程４：標的物質評価工程
　なお、上記工程以外に、種々の工程を含むことができる。
　例えば、生体組織等の画像取得工程の前段の工程として生体組織標本の作製工程を含む形態も好ましい。
　以下において、各工程及び構成要素について順次具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　（生体関連情報取得方法の工程の流れの例）
　上記バラつき判定工程を含む構成の生体関連情報取得方法の工程の流れを図１に示す。
　図１に示した生体関連情報取得方法は、生体組織画像取得工程（Ｓ１０）、分布情報取得工程（Ｓ１１）、バラつき判定工程（Ｓ１３）及び標的物質評価工程（Ｓ１５及びＳ１７）を有する構成の方法である。
　生体組織画像取得工程（Ｓ１０）では、例えば人体の組織を直接的又は採取した生体組織の標本（組織片）を撮影し、当該標本における標的物質が可視化された生体組織画像を取得する。
　分布情報取得工程（Ｓ１１）では、前記工程により得た生体組織画像に基づいて、当該組織片における標的物質の存在又は量の分布に関する情報を、標的物質の分布に関する情報として取得する。
　また、当該組織片における標的物質の存在又は量のバラつきに関する情報を更に生成し、それを標的物質の分布に関する情報として取得しても良い。
　標的物質の分布に関する情報は、組織片における第１領域において取得する。
　第１領域は、組織片全体とするのが理想的であるが、組織片における標的物質の分布の評価に影響しない限り、組織片の一部のみとすることもできる。
　例えば、組織片の周辺部など、そもそも標的物質が存在しないと推定する領域、又は当該標本における標的物質の評価の対象としない領域などをあらかじめ除いた領域としても良い。
　すなわち、第１領域は、組織片中の標的物質の分布を正確に把握できるように設定される。
　バラつき判定工程（Ｓ１２）では、組織片における標的物質の分布にバラつきがあるか否かを判定する。
　例えば分布情報取得工程（Ｓ１１）において取得した、組織片における標的物質の分布に関する情報（第１情報）に基づいて、組織片における標的物質の存在又は量のバラつきが所定の判断基準値を超えているか否かを判定する。
　標的物質の存在又は量のバラつきが所定の判断基準値未満又は所定の判断基準値以下である場合は、バラつきがないと判定する。
　この場合、組織片における標的物質の分布にバラつきがないことから、次工程である標的物質評価工程（Ｓ１３）においては、分布情報取得工程（Ｓ１１）において取得した前記第１領域における標的物質の存在又は量に関する情報を、そのまま組織片における標的物質の存在又は量を評価するための第２情報として取得する。
　一方、標的物質の存在又は量のバラつきが所定の判断基準値以上である又は所定の判断基準値を超えている場合は、バラつきがあると判定する。
　この場合、次工程としては標的物質評価工程（Ｓ１４）に進み、前記第１領域内であってかつ前記第１領域よりも狭い任意の第２領域における標的物質の存在又は量を評価するための情報である第３情報を、組織片における標的物質の存在又は量を評価するための情報として新たに取得する。
　以上の通りに、標的物質評価工程（Ｓ１３又はＳ１４）においては、組織片における標的物質の分布にバラつきがあるか否かによって、第２情報又は第３情報を用いて、組織片における標的物質の存在又は量を評価する。
　以下において、より詳しく各工程について説明し、その後に実施形態及び実施例について説明する。
　（１．１）生体組織等の画像取得工程
　本発明に係る分布情報取得工程には、その一環の前段として下記のような生体組織等の画像化手段により画像を取得する工程を含んでも良い。
　ここで、「生体組織等の画像」とは、生体組織そのものの画像及び、例えば生体組織の特定個所に薬物が付着した状態の画像、蛍光発光性化合物や放射線標識化合物等を利用して生体組織の特定個所、又はそれに付着した薬物を検出可能にして得た画像等をいう。
　例えば生体組織標本の画像取得工程の一例としては、まず、標的物質を含む組織切片であって免疫染色剤で染色した生体組織標本の明視野画像を取得し、これに基づいて、後述するホール・スライド・イメージ（ＷＳＩ）の作成対象となる撮像領域を設定し、明視野画像を基準に画像を取得する。
　なお、免疫染色剤として、例えば抗体と蛍光物質集積ナノ粒子（ＰＩＤ）の結合体を用いて、当該蛍光物質集積ナノ粒子に励起光を照射し、検出されたＰＩＤの蛍光輝点を基に明確な蛍光輝点画像を取得することができる。
　また、取得した画像を観察する方法として、例えばバーチャル顕微鏡を用いる方法が挙げられる。
　ここで、「バーチャル顕微鏡」とは、光学顕微鏡によって観察される画像をデジタルデータ化し、ディスプレイ上で、実際に光学顕微鏡を用いているかのように組織標本を観察可能なシステムをいう。
　詳細には、スライドガラス上の組織標本全体を撮影し、得られた画像をデジタルデータ化してデータベースに保存し、パーソナルコンピューター等にインストールされたビューアーソフトを用いて観察を行う。
　この時、光学顕微鏡を用いた観察と同様に、上下左右の移動や拡大縮小などの操作を行いながら観察することができるのが、バーチャル顕微鏡と呼ばれる所以である。
　ところで、スライドガラス上の組織標本全体の撮影は、ホール・スライド・イメージ（ｗｈｏｌｅ　ｓｌｉｄｅ　ｉｍａｇｅ：ＷＳＩ）作成システムと呼ばれる画像処理システムによって行われる。
　そして、ホール・スライド・イメージ（ＷＳＩ）と呼ばれる組織標本全体のデジタル画像データは、データベースに保存される。
　保存されたデジタル画像データは、インターネット等によってアクセスすることができるため、例えば遠隔地にいる病理医による迅速な病理診断や、希少な組織標本を誰もが閲覧可能にすることができる。
　ＷＳＩ作成システムは、顕微鏡画像を撮影する顕微鏡装置、撮影された画像をもとにＷＳＩを作成する制御装置等を備え、例えば特許文献１のように、スキャナーによってスライドの部分画像を撮影し、得られた部分画像データを張り合わせて組織標本全体の画像データを作成する。
　以下において、免疫染色剤を用いて染色する方法すなわち免疫染色法について説明する。
　（免疫染色法）
　本発明において免疫染色法とは、標識化抗体を用いる免疫反応により組織・細胞等を顕微鏡等で観察することができるように染色する方法をいう。
　免疫染色法による標的物質の可視化方法では、標的物質（例えば細胞の細胞膜に存在する受容体）を含む組織片を免疫染色して、標的物質が蛍光標識又は酵素標識により可視化された免疫染色像（生体組織等の画像）を得る。
　（蛍光標識）
　蛍光標識としては、蛍光体集積粒子（蛍光色素集積粒子）を使用できる。
　（蛍光体集積粒子（蛍光色素集積粒子））
　蛍光体集積粒子とは、有機物又は無機物でできた粒子を母体とし、複数の蛍光体（例えば蛍光色素や半導体ナノ粒子）がその中に内包されている及び／又はその表面に吸着している構造を有する、ナノサイズの粒子である。
　蛍光体集積粒子を構成する蛍光色素の例には、ローダミン系色素、Ｃｙ系色素、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）系色素、ＢＯＤＩＰＹ系色素、スクアリリウム系色素、シアニン系色素、芳香環系色素、オキサジン系色素、カルボピロニン系色素、ピロメセン系色素が含まれる。
　蛍光体集積粒子は、公知の方法（例えば特開２０１３－５７９３７号公報参照）に従って作製できる。
　蛍光体集積粒子には、標的物質と特異的に結合するための認識物質が付加される。
　認識物質は、蛍光体集積粒子と標的物質とが直接的に、又は間接的に結合するように選択される。
　認識物質の例には、ヌクレオチド鎖、アビジン、ストレプトアビジン、抗体等のタンパク質や、ビオチン等の低分子化合物が含まれる。
　蛍光体集積粒子と標的物質とが直接的に結合する場合、標的物質と特異的に結合する抗体（一次抗体）を認識物質として用いることができる。
　一方、蛍光体集積粒子と標的物質とが間接的に結合する場合、認識物質としては、標的物質と特異的に結合する抗体（一次抗体）と特異的に結合する抗体（二次抗体）を用いることもできれば、二次抗体と特異的に結合する物質（例えばアビジン、ストレプトアビジンやビオチン等）を用いることもできる。
　抗体に類似の分子認識基を用いた染色法により標的物質を可視化する方法では、例えば分子認識基として、アプタマー、ＳＮＡＰ－ｔａｇを用いて第１像を得る。
　（１．２）分布情報取得工程
　本発明に係る分布情報取得工程は、組織片中の任意の第１領域における標的物質の分布に関する情報である第１情報を取得する工程である。
　なお、第１領域の設定については前述した通りである。
　また、当該分布情報取得工程には、その一環の前段として前述した生体組織等の画像取得工程を含むこともできる。
　（第１領域）
　本発明において「第１領域」とは、標的物質の分布に関する情報を得るために、組織片中において観察・解析対象として標的物質の分布を正確に把握できるように設定した比較的広い領域をいう。
　例えば組織片全体又は組織片全体でなくとも、組織片中の標的物質の分布の評価を妨げないように設定しても良い。
　（第１情報）
　本発明に係る第１情報は、組織片中の任意の第１領域における標的物質の分布に関する情報であれば、特に制限はないが、例えば前記第１領域における前記標的物質の存在や量の分布のバラつきに関する情報であることが好ましい。
　また、前記第１領域における前記標的物質の存在や量の分布のバラつきに関する情報が、前記第１領域における前記標的物質の偏在度であることが好ましい。
　ここで、「標的物質の存在や量の分布に関する情報」とは、二次元又は三次元の生体組織片又はその画像における、解析又は観察対象である標的物質（特定の生体組織、細胞、薬物等）等の状態を、例えば座標系で表現したときの、それぞれの分布状態（座標位置、分布領域の面積、濃度、密度、増減、集積／拡散方位速度などの経時変化も含む。）に関する情報をいう。
　なお、例えば特定分子、細胞、薬物等の濃度、密度等について統計学的観点から集約した分布情報（頻度分布、平均値等の集約値等）も含む。
　ここで、「濃度」とは、生体組織画像における、所定の区画当たり若しくは領域当たり又は単位面積当たりの特定分子、細胞、薬物等に結合したマーカー等で検出可能とした濃度をいう。
　ただし、当該薬物量が、一般的な薬物濃度（［Ｌ／ｋｇ］、［μｇ／Ｌ］、［ｐｐｍ］、［ｍｏｌ／Ｌ］など）と相関する場合には、間接的に単位変換が可能である。
　（１．３）バラつき判定工程
　本発明において、「バラつき」とは、分布の広がりをいう。
　当該バラつき、すなわち分布の広がりの度合（「偏在度」）の指標としては、例えば標準偏差（σ）、分散、変動係数（（標準偏差／平均値）×１００％：「ＣＶ」と表記する。）、最大－最小幅、四分位幅、及び度数分布図の半値幅などで表すことができる。
　上記分布情報取得工程にて得た第１情報（例えば標的物質の存在や量の偏在度）を、所定の基準値（例えば所定のＣＶ値の割合など）と比較してバラつきの有無を決定し、例えば上記の標的物質の偏在度により決定する。
　また、分布が正規分布である場合は、３σを指標として、バラつきの判定をすることも良い。
　これにより、後述する標的物質評価工程における第２情報を取得するか第３情報を取得するかが決定される。
　（１．４）標的物質評価工程
　本発明に係る標的物質評価工程は、前記第１情報に基づいて、前記第１領域における標的物質の存在又は量を評価するための情報である第２情報を取得し、又は前記第１領域内であってかつ前記第１領域よりも狭い任意の第２領域における標的物質の存在又は量を評価するための情報である第３情報を取得する工程である。
　また、前述した通りに、前記分布情報取得工程において得た標的物質の偏在度についての情報に基づいて、本工程では、標的物質をどう評価するかを決定する。
　（１．４．１）第２情報
　本発明に係る「第２情報」とは、前記第１情報に基づいて、前記第１領域における標的物質の存在又は量、を評価するための情報である。
　前述した通りに、標的物質の存在や量の分布にバラつきがない場合は、上記分布情報取得工程において取得した第１領域における標的物質の存在や量に関する情報に基づいて、標的物質の存在又は量を評価するための情報である第２情報を取得する。
　なお、この場合、標的物質の存在や量の分布にバラつきがないため、標的物質の存在又は量については組織片のどの部分を観察しても同様の結果が得られると考えられることから、第２情報として第１領域における標的物質の存在又は量としても良いし、第１領域においてより小さい領域における標的物質の存在又は量としても良い。
　（１．４．２）第３情報
　「第３情報」とは、前記第２領域における標的物質の存在又は量を評価するための情報である。
　なお、第３情報は第２情報と同様に標的物質の存在又は量を評価するための情報であるが、評価の領域が第１領域か第２領域かで異なる。
　上記標的物質評価工程においては、バラつきがある（バラつきが大きい）場合、例えば１区画あたりの標的物質の量を算出して、算出された各区画の標的物質の平均量に対して、上位１０％の分布の下限値が平均値の２倍以上となったときをバラつき大と評価した場合には、第１領域内であって、かつ第１領域よりも狭い任意の第２領域における標的物質の存在又は量を評価するための情報である第３情報を取得する。
　ここで、「標的物質の存在又は量を評価するための情報」とは、標的物質（特定の生体組織、細胞、薬物等）の濃度やその濃度の頻度分布（ヒストグラム）や、濃度平均値、濃度代表値、濃度最頻値、薬物分布領域面積、生体組織の特定領域に対する薬物分布領域密度、薬効空間面積率、及び毒性空間面積率などの統計分布情報を含む。
　標的物質の存在に関する情報の例としては蛍光物質集積ナノ粒子（ＰＩＤ）由来の輝点の有無、標的物質の量に関する情報の例としてはＰＩＤ由来の輝点の数、前記輝点に対応するＰＩＤの数、細胞核、細胞領域、腫瘍領域など特定の領域における輝点又はＰＩＤの数などが挙げられる。
　例えばこの場合、算出された各区画の平均輝度値が高い上位１０％にあたる各区画を選択し、これら選択された上位１０％の各区画の輝度値の下限値が平均値の２倍以上となったときをバラつき大と評価し、その中から最も輝度値が高い１０区画を含む視野（Ｈｏｔｓｐｏｔ）を選択して算出された細胞当たりの輝点数又は粒子数を第３情報とする。
　（第２領域）
　「第２領域」とは、前記第１領域内であってかつ前記第１領域よりも狭い標的物質の分布を正確に把握できるように設定され、標的物質の存在又は量を評価したい領域である。
　第２領域は、例えば標的物質が一定量以上発現している領域、標的物質が存在しない領域を示す陰性領域、特定の細胞が占有する領域を示す細胞領域、特定の細胞群が占有する領域を示す細胞群領域、標的物質とは異なる物質を可視化する対象となる追加標的領域、標的物質に関わる遺伝子を解析する対象となる遺伝子解析領域である。
　即ち、第２領域は、生体組織における標的物質の存在又は量の代表としたい領域として、解析や評価の目的に応じて自由に設定することができる。
　ここで、「陰性領域」とは、標的物質が存在しない領域をいう。
　「細胞領域」とは、特定の細胞が占有する領域をいう。
　「細胞群領域」とは、特定の細胞群が占有する領域をいう。
　「追加標的領域」とは、標的物質とは異なる物質を更に可視化する対象となる領域をいう。
　「遺伝子解析領域」とは、標的物質に関わる遺伝子を更に解析する対象となる領域をいう。
　なお、本発明で使用可能な遺伝子解析方法としては、公知の遺伝子検出方法や核酸増幅方法等が使用できる。
　遺伝子検出方法や核酸増幅方法としては、様々な方法が知られているが、Ｉｎｖａｄｅｒ法、Ｓｎｉｐｅｒ法、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｂｅ法、ＳＮＰＩＴ法、Ｐｙｒｏｍｉｎｉｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＤＨＰＬＣ）法、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ法、ＮａｎｏＣｈｉｐ法などが迅速且つハイスループットで解析する方法として挙げられる。
　また、本発明で使用可能な別の遺伝子解析方法としては、例えば標的部位に未知の変異型核酸があると思われる場合に、検出領域の増幅産物について塩基配列を決定することで変異型核酸の有無を判定することができる。
　遺伝子検出方法の利用としては、例えば標的部位に対して相補的で光応答性核酸類を含む光連結プローブを蛍光標識したものをハイブリダイゼーションさせ、光照射により該標的核酸と該光連結プローブ間で光連結させ、蛍光を検出することにより、該遺伝子を検出する方法が挙げられる。
　当業者であれば、本発明の光連結方法を、遺伝子解析の目的に応じて適宜変更して実施することができ、また、公知の遺伝子検出方法に容易に使用することができる。
　核酸増幅方法とは、公知のポリメラーゼ反応を利用した鋳型核酸の増幅反応をいい、例えばＷＯ２０１２／０３３１９０号公報に開示されている公知の核酸の増幅抑制方法において、光連結方法を利用することができる。
　核酸の増幅方法における光連結方法の利用としては、例えば標的部位を含む検出対象である核酸配列（増幅用ヌクレオチド配列）を増幅可能なプライマーを用いて、公知の核酸増幅方法を実施する際に、検出対象である遺伝子の核酸の変異に基づいて、ある核酸配列（例えば、野生型核酸）の増幅を抑制する一方、それ以外の核酸配列（例えば変異型核酸）のみを選択的に増幅させる方法における利用が挙げられる。
　野生型核酸又は変異型核酸のいずれを増幅抑制の対象とするかは、その目的に応じて適宜選択することができ、特に限定されるものではない。
　例えば核酸サンプル中の存在比に大きな偏りがある場合、大量に存在する核酸（例えば野生型核酸）の増幅を抑制し、微量に存在する核酸（例えば、変異型核酸）のみを選択的に増幅することにより、微量に存在する核酸の有無を検出することができる。
２．実施形態例
　［生体組織等の画像取得の実施形態例］
　（２．１）生体組織標本の作製
　生体組織標本（「組織標本」ともいう。）として、標的物質（「目的生体物質」ともいう。）を含む組織切片であって免疫染色剤で染色した標本を下記事項を考慮して作成する。
　（２．１．１）標的物質
　本実施形態において、標的物質（目的生体物質）とは、主に病理診断の観点からの検出又は定量のために、蛍光標識体を用いた免疫染色の対象とするものをいい、組織切片に発現している生体物質、特にタンパク質（抗原）である。
　典型的な標的物質としては、各種の癌組織の細胞膜で発現しており、バイオマーカーとして利用することができる生体物質が挙げられる。
　（２．１．２）免疫染色剤（抗体－蛍光ナノ粒子の結合体）
　免疫染色剤としては、蛍光標識の効率を向上させて蛍光の劣化につながる時間経過をなるべく抑えるために、一次抗体及び蛍光ナノ粒子が間接的に、つまり抗原抗体反応などを利用した、共有結合以外の結合によって連結される複合体を用いることが好ましい。
　染色操作を簡便にするため、免疫染色剤として、一次抗体又は二次抗体に蛍光ナノ粒子が直結している複合体を用いることもできる。
　免疫染色剤の一例として、［標的物質に対する一次抗体］…［一次抗体に対する抗体（二次抗体）］～［蛍光ナノ粒子］が挙げられる。
　“…”は抗原抗体反応により結合していることを表し、“～”が示す結合の態様としては特に限定されず、たとえば、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、抗原抗体結合、ビオチンアビジン反応、物理吸着、及び化学吸着などが挙げられ、必要に応じてリンカー分子を介していてもよい。
　（２．１．３）抗体
　一次抗体には、標的物質としてのタンパク質を抗原として特異的に認識して結合する抗体（ＩｇＧ）を用いることができる。例えばＨＥＲ２を標的物質とする場合は抗ＨＥＲ２抗体を、ＨＥＲ３を標的物質とする場合は抗ＨＥＲ３抗体を、それぞれ用いることができる。
　二次抗体には、一次抗体を抗原として特異的に認識して結合する抗体（ＩｇＧ）を用いることができる。
　一次抗体及び二次抗体はいずれも、ポリクローナル抗体であってもよいが、定量の安定性の観点から、モノクローナル抗体が好ましい。抗体を産生する動物（免疫動物）の種類は特に限定されるものではなく、従来と同様、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどから選択すればよい。
　（２．１．４）蛍光ナノ粒子
　「蛍光ナノ粒子」とは、励起光の照射を受けて蛍光発光するナノサイズの粒子であって、標的物質を１分子ずつ輝点として表すのに十分な強度の蛍光を発光しうる粒子である。
　蛍光ナノ粒子として、本実施形態においては、蛍光物質集積ナノ粒子（ＰＩＤ：Ｐｈｏｓｐｈｏｒ　Ｉｎｔｅｇａｔｅｄ　Ｄｏｔ　ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を使用する。
　（蛍光物質集積ナノ粒子）
　ＰＩＤは、有機物又は無機物でできた粒子を母体とし、複数の蛍光物質（例えば量子ドット、有機蛍光色素など）がその中に内包されている及び／又はその表面に吸着している構造を有する、ナノサイズの粒子である。
　ＰＩＤとしては、量子ドット集積ナノ粒子又は蛍光色素集積ナノ粒子などが使用される。
　ＰＩＤに用いられる蛍光物質としては、２００～７００ｎｍの範囲内の波長の紫外～近赤外光により励起されたときに、４００～９００ｎｍの範囲内の波長の可視～近赤外光の発光を示すことが好ましく、母体と蛍光物質とが、互いに反対の電荷を有する置換基又は部位を有し、静電的相互作用が働くものであることが好適である。
　本発明で用いられるＰＩＤの平均粒径は特に限定されないが、集積粒子に含まれる蛍光物質の量及び標的物質との結合の容易性等の観点から３０～８００ｎｍ程度のものを用いることが好ましい。
　なお、平均粒径は、４０～５００ｎｍの範囲内であることがより好ましい。
　なお、粒径のバラつきを示す変動係数（＝（標準偏差／平均値）×１００％）は特に限定されないが、１５％以下のものを用いることが好ましい。
　粒径のバラつきは小さい程、蛍光輝点の輝度のバラつきが小さく、後述するように蛍光輝度をもとに目的生体物質の発現量を定量的に評価することができる。
　平均粒径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、各計測値を円の面積としたときの円の直径を粒径として求めることができる。
　（２．１．４．１）母体
　母体のうち、有機物としては、メラミン樹脂、尿素樹脂、アニリン樹脂、グアナミン樹脂、フェノール樹脂、キシレン樹脂、フラン樹脂など、一般的に熱硬化性樹脂に分類される樹脂；スチレン樹脂、アクリル樹脂、アクリロニトリル樹脂、ＡＳ樹脂（アクリロニトリル－スチレン共重合体）、ＡＳＡ樹脂（アクリロニトリル－スチレン－アクリル酸メチル共重合体）など、一般的に熱可塑性樹脂に分類される樹脂；ポリ乳酸等のその他の樹脂；多糖を例示することができる。
　母体のうち、無機物としては、シリカ、ガラスなどを例示することができる。
　（２．１．４．２）蛍光色素集積ナノ粒子
　「蛍光色素集積ナノ粒子」とは、蛍光色素が、上記母体の中に内包されている、及び／又はその表面に吸着している構造を有する。
　蛍光色素としては、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、芳香環系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、ピロメセン系色素分子などの有機蛍光色素を例示することができる。
　具体的には、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、Ｃｙ（登録商標、ＧＥヘルスケア社製）系色素分子、ＨｉＬｙｔｅ（登録商標、アナスペック社製）系色素分子、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標、サーモサイエンティフィック社製）系色素分子、ＡＴＴＯ（登録商標、ＡＴＴＯ－ＴＥＣ社製）系色素分子、ＭＦＰ（登録商標、Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）系色素分子、ＣＦ（登録商標、Ｂｉｏｔｉｕｍ社製）系色素分子、ＤＹ（登録商標、ＤＹＯＭＩＣＳ社製）系色素分子、ＣＡＬ（登録商標、ＢｉｏＳｅａｒｃｈ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）系色素分子などを用いることができる。
　なお、蛍光色素が母体に内包されている場合、蛍光色素は母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していてもよいし、していなくてもよい。
　蛍光色素集積ナノ粒子は、公知の方法により作製することが可能である。
　例えば蛍光色素を内包したシリカナノ粒子は、ラングミュア　８巻　２９２１ページ（１９９２）に記載されているＦＩＴＣ内包シリカ粒子の合成を参考に合成することができる。ＦＩＴＣの代わりに所望の蛍光色素を用いることで種々の蛍光色素集積ナノ粒子を合成することができる。
　蛍光色素を内包したポリスチレンナノ粒子は、米国特許４３２６００８（１９８２）に記載されている重合性官能基をもつ有機色素を用いた共重合法や、米国特許５３２６６９２（１９９２）に記載されているポリスチレンナノ粒子への蛍光色素の含浸法を用いて作製することができる。
　（２．２）組織切片の染色方法
　染色方法の一例について説明する。
　この染色方法が適用できる組織切片（単に「切片」ともいい、病理切片などの切片も含まれる。）の作製法は特に限定されず、公知の手順により作製されたものを用いることができる。
　［１］標本作製工程
　［１．１］脱パラフィン処理
　例えばキシレンを入れた容器に、切片を浸漬させ、パラフィン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
　次いでエタノールを入れた容器に切片を浸漬させ、キシレン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
　水を入れた容器に、切片を浸漬させ、エタノール除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
　［１．２］賦活化処理
　公知の方法に倣い、目的生体物質の賦活化処理を行う。
　賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、０．０１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）、５％尿素、０．１Ｍのトリス塩酸緩衝液などを用いることができる。
　ｐＨ条件は用いる組織切片に応じてｐＨ２．０～１３．０の範囲から、シグナルが出て、組織の荒れがシグナルを評価できる程度となる条件で行う。
　通常はｐＨ６．０～８．０で行うが、特殊な組織切片では、例えばｐＨ３．０でも行う。
　加熱機器はオートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバスなどを用いることができる。
　温度は、特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は５０～１３０℃、時間は５～３０分で行うことができる。
　次いで、ＰＢＳを入れた容器に、賦活処理後の切片を浸漬させ、洗浄を行う。
　温度は、特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。
　浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。
　また、必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。
　［２］免疫染色工程
　免疫染色工程では、標的物質を染色するために、標的物質に直接的又は間接的に結合しうる部位を有する蛍光ナノ粒子を含む免疫染色剤の溶液を、切片に載せ、標的物質との反応を行う。
　免疫染色工程に用いる免疫染色剤の溶液については、この工程の前にあらかじめ調製しておけばよい。
　なお、複数の標的物質を検出しようとする場合は、標的物質に対応した複数の免疫染色剤によって免疫染色を行う。
　この場合に用いる複数の免疫染色剤は、ＰＩＤを用いた免疫染色剤（ＰＩＤ染色剤）を少なくとも１種含むものであればよく、抗体と蛍光物質（蛍光波長）とが互いに異なれば、ＰＩＤ染色剤を複数用いた多重染色や、ＰＩＤ染色剤と有機蛍光物質や量子ドット等の蛍光標識体を用いた免疫染色剤とのを組み合わせた多重染色によって、複数の標的物質を検出することも可能である。
　この場合は、各免疫染色剤の溶液をそれぞれ調製し、切片に載せ、標的物質との反応を行うが、切片に載せる際にそれぞれの免疫染色剤の溶液をあらかじめ混合してもよいし、別々に順次載せてもよい。
　複数の免疫染色剤を用いる場合、ＰＩＤの励起／発光波長と、他の免疫染色剤の蛍光標識体の励起／発光波長は、クロストークを無視できる程度に離れていることが望ましい。
　免疫染色工程を行う上での条件、すなわち免疫染色剤の溶液に組織切片を浸漬する際の温度及び浸漬時間は、従来の免疫染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。
　温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、３０分以上２４時間以下であることが好ましい。
　上述したような処理を行う前に、ＢＳＡ含有ＰＢＳなど公知のブロッキング剤やＴｗｅｅｎ２０などの界面活性剤を滴下することが好ましい。
　［３］標本後処理工程
　免疫染色工程を終えた組織標本は、観察に適したものとなるよう、固定化・脱水、透徹、封入などの処理を行うことが好ましい。
　固定化・脱水処理は、組織切片を固定処理液（ホルマリン、パラホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、アセトン、エタノール、メタノールなどの架橋剤）に浸漬すればよい。
　透徹処理は、固定化・脱水処理を終えた組織切片を透徹液（キシレンなど）に浸漬すればよい。
　封入処理は、透徹処理を終えた組織切片を封入液に浸漬すればよい。
　これらの処理を行う上での条件、例えば組織切片を所定の処理液に浸漬する際の温度及び浸漬時間は、従来の免疫染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。
　［４］明視野形態観察染色工程
　免疫染色工程とは別に、明視野において細胞、組織、臓器などの形態を観察することができるようにするための、形態観察染色を行う。
　形態観察染色工程は、常法にしたがって行うことができる。
　組織標本５０の形態観察に関しては、細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤～濃赤色に染色される、エオジンを用いた染色が標準的に用いられている。
　細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色～淡青色に染色される、ヘマトキシリンを用いた染色も標準的に用いられている（これら２つの染色を同時に行う方法はヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）として知られている）。
　本実施形態においては、ＨＥ染色法により形態観察染色を行うものとする。
　このＨＥ染色画像は赤色などに細胞が染まって見えるとともに、細胞の輪郭を見て取ることができるので、細胞の大きさや核の大きさ核の数、細胞サイクルの段階や癌化の程度、細胞集団の性格や集団同士の関係といった情報も得ることができる。
　また、このような情報は、免疫染色法によりさらに詳細に得ることもできる。
　すなわち、形態観察染色工程には、ＨＥ染色法と免疫染色法とを組み合わせた染色方法も用いることができる。
　一般的には、標的物質の観察には高倍率で画像を取得し、細胞種の特定や腫瘍領域・間質領域などの領域の観察には中倍率で画像を取得し、領域や各領域における血管・リンパ管などの組織構造の観察には低倍率で画像を取得することになるが、このような情報をすべて獲得し、保管し、将来にわたって利用するのにホール・スライドは有用である。
　なお、形態観察染色工程を含める場合は、免疫染色工程の後に行うようにしてもよいし、免疫染色工程の前に行うようにしてもよい。
　（２．３）生体組織標本の画像取得
　本実施形態においては、生体組織標本の画像取得工程において、前述の画像取得のための装置によって組織標本の明視野画像を取得し、これに基づいてホール・スライド・イメージ（ＷＳＩ）の作成対象となる撮像領域を設定し、明視野画像を基準に焦点を合わせた（フォーカシングした）明確な画像を取得する。
　さらに、組織標本に蛍光標識された蛍光物質集積ナノ粒子（ＰＩＤ）に励起光を照射し、検出されたＰＩＤの蛍光輝点を基準にしてさらに厳密な焦点合わせ（フォーカシング）を行い明確な蛍光輝点画像を取得する。
　［ホール・スライド・イメージ（ＷＳＩ）の作成方法］
　上述のように焦点合わせ（フォーカシング）が完了すると、組織標本全体の蛍光画像の作成、すなわちＷＳＩの作成に移行する。
　以下において、ＷＳＩ作成方法の手順の概要について説明する。
　［１］まず、組織標本５０に標識された蛍光標識体を励起させる。
　具体的には、励起光源を制御して、組織標本に標識されたＰＩＤを励起させる励起光を照射させる。
　［２］次に、組織標本の小領域ごとの画像を撮像し、部分画像を取得する。
　［３］次に、撮像された部分画像を合成して、撮像領域の全体の蛍光画像を作成させる。
　すなわち、部分画像並べて貼り合わせることで、組織標本の全体の高解像度の蛍光画像が得られる。
　［４］さらに、得られた撮像領域の全体の蛍光画像をデジタル画像化する。
　（２．４）生体関連情報取得方法の実施形態例
　生体組織と特定組織領域に付着された薬物分布解析対象の標的物質とした場合の生体関連情報取得方法について説明する。
　［１］生体組織等の画像取得
　分布解析対象の薬物の投与後の生体から採材した組織切片に対し免疫染色（蛍光色素等）等により薬物位置を特定可能にし、蛍光顕微鏡などの撮像装置を用いて画像取得する。
　例えば蛍光物質集積ナノ粒子による薬物の染色切片の蛍光画像取得である。
　薬物シグナルを検出する際には、薬物情報の抽出精度を上げるために前処理を行っても良い。また、蛍光解析時はハイパスフィルタ（ＨＰＦ：ｈｉｇｈ－ｐａｓｓ　ｆｉｌｔｅｒ：高域通過濾波器）等の信号処理による自家蛍光ノイズの除去処理を行うことが好ましい。
　切片輪郭、腫瘍領域及び浸潤領域など特定の領域に解析対象を限定する処理として、領域を判別するためのマーカー染色を抽出しても良いし、機械学習を用いた識別を行ってもよいし、手作業でも良い。
　［２］薬物分布情報取得
　取得した生体組織等の画像において、比較的広い解析対象領域である第１領域を特定して、第１情報として薬物染色強度から薬物濃度の空間分布情報を抽出するため蛍光染色の輝度積分値算出、蛍光染色の輝点検出・蛍光粒子算出による薬物濃度定量等を行う。
　薬物の空間分布及び濃度分布の統計算出については、ヒストグラムによる薬物濃度の均一性・バラつき評価、濃度閾値処理による薬効空間又は毒性空間面積率評価等を行う。
　［３］バラつき判定
　ヒストグラムによる薬物濃度の均一性・バラつき評価例としては、濃度最頻値を基準として既定の頻度割合（例えば９５［％］等）を満たす薬物濃度幅を薬物濃度分布バラつき性能とし、例えば変動係数値（ＣＶ値）に基づき、バラつき判定を行う。
　［４］標的物質評価工程
　前記判定工程において前記第１領域における標的物質としての薬物の分布にバラつきがないと判定されたとき、前記標的物質評価工程において第２情報を取得する。
　例えば濃度閾値処理による薬効空間又は毒性空間面積率についての情報を取得し、当該面積率を判断基準として薬効又は毒性の評価をする。
　一方、前記第１領域における標的物質の分布にバラつきがあると判定されたとき、第３情報を取得する。
　例えば特定生体組織（例えばバイオマーカー）と薬物濃度分布との関係に関する情報を取得し、薬効を評価する。
　以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
　［ＰＤ－Ｌ１による解析］
　＜生体組織画像取得工程＞
　下記各腫瘍症例における標的物質を含む組織標本全体のホール・スライド・イメージ（ＷＳＩ）による画像取得を、バーチャルスライドスキャナＮａｎｏｚｏｏｍｅｒ　Ｓ６０（浜松ホトニクス製）の非圧縮モードにて実施し、明視野画像を取得し、これに基づいてホール・スライド・イメージ（ＷＳＩ）の作成対象となる腫瘍領域を注目する解析領域（ＲＯＩ）すなわち第１領域として指定して、全体的情報を取得した。
　なお、蛍光ナノ粒子としては蛍光物質集積ナノ粒子（ＰＩＤ）を用いた。
　＜１＞分布情報取得工程
　１区画を１辺が４８．３μｍの正方形として、区画ごとの輝度値を算出した。
　なお、各区画におけるエッジが解析領域を含まない区画については輝度換算しないこととした。
　＜１－１＞第１領域の第１情報取得
　各区画ごとの平均輝度値を算出し、ヒストグラム化して表示した。
　＜１－２＞バラつき判定工程
　また、各区画ごとの平均輝度値を降順に並べた時に、上位１０％の分布の下限値（例えば上位１０％に該当する平均輝度値、又は上位１０％に最も近い平均輝度値）を、バラつきを判定するための基準値とした。各区画の平均輝度値について、上位１０％の分布の下限値が当該平均輝度値の２倍以上の区画をバラつき大（バラつきあり）と評価した。
　また、上位１０％の分布の下限値が当該平均輝度値の２倍未満の区画をバラつき小（なし）と評価した。
　なお、代わりに、各区画の平均輝度値の変動係数（ＣＶ＝（標準偏差／平均値）×１００％）を第１情報として更に算出し、各区画の平均輝度値を、変動係数の所定の割合（例えば１００％）と比較し、平均輝度値が変動係数の所定の割合以上の区画をバラつきありと評価し、平均輝度値が変動係数の所定の割合未満の区画をバラつきなしと評価することもできる。
　＜２＞標的物質評価工程
　バラつき大の症例に関しては、最も輝度値が高い１０区画を含む視野（Ｈｏｔｓｐｏｔ）を第２領域として選択してＯｌｙｍｐｕｓ　ＢＸ－６３による撮影を実施し（対物４０倍）、細胞当たり粒子数を算出した。
　各症例における比較例としては、全体情報取得なしに、任意に１０区画を含む視野を選択し、実施例と同様に細胞当たり粒子数の算出を行った。
　実施例における、評価するタンパク質についてはＰＤ－Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　１－　Ｌｉｇａｎｄ　１）を用いて、ＰＤ－Ｌ１陽性群とＰＤ－Ｌ１陰性群との予後の比較（ＰＤ－Ｌ１　＋／－　カットオフ値にて実施。）を実施した。
　なお、ＰＤ－Ｌ１陽性、陰性のカットオフ値に関しては、各臓器に対して陰性コントロール染色を実施して（１次抗体なし）、陰性コントロールの平均値に、バラつき標準偏差であるσの３倍を加えたものをＰＤ－Ｌ１陽性及び陰性のカットオフ値とした。
　［実施例１～７］
　下記各臓器の腫瘍症例を用いて、ＰＤ－Ｌ１発現のバラつきをＷＳＩで判定後、狭領域すなわち第２領域における評価を（任意の（Ｈｏｔｓｐｏｔ）領域において１０区画を含む視野を選択して、細胞当たり粒子数による評価を行った。
　［比較例１～７］
　各臓器の腫瘍症例を用いて、狭領域における評価を行った。
　実施例同様に細胞当たり粒子数による評価を行った。
　ＰＤ－Ｌ１陽性患者群と陰性患者群の有意差検定を実施し、そのｐ値＊を表Ｉにまとめた。
　表Ｉに示す結果は、各腫瘍症例におけるＰＤ－Ｌ１発現解析の結果である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表Ｉのｐ＊値を見ても分かるように、実施例の方が比較例に比べてｐ＊値が小さく、より正確な病理診断に適していることがわかる。
　［ＰＤ－Ｌ１とＣＤ８による解析］
　さらに、本実施例においては、第２範囲を、標的物質とは異なる物質を更に可視化する「追加標的領域」として、ＷＳＩを活用したＰＤ－Ｌ１と他マーカー（ＣＤ８）との組み合わせによる解析を行った。
　また、さらにＣＤ８陽性率の評価を定量的に行った（ＷＳＩ解析）。
　各腫瘍症例におけるＷＳＩによる画像取得は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞については、Ａｐｅｒｉｏを用いて自動カウントした。
　Ｎａｎｏｚｏｏｍｅｒ区画ごとのＣＤ８陽性Ｔ細胞率（ＣＤ８陽性Ｔ細胞数／ＲＯＩ全体の細胞数）を算出した。
　＜１－２＞バラつき判定工程
　バラつき大の症例に関しては、第３情報として、ＨｏｔｓｐｏｔにおけるＣＤ８陽性Ｔ細胞率を算出した。
　バラつき小の症例に関しては、第２情報として、ＣＤ８陽性Ｔ細胞率の高い１０区画を含む視野（Ｈｏｔｓｐｏｔ）を選択してＯｌｙｍｐｕｓ　ＢＸ－６３による撮影を実施し（対物４０倍）、細胞当たり粒子数、ＣＤ８陽性率を算出した。
　各症例における比較例としては、全体情報取得なしに、任意に１０区画を含む視野を選択し、同様にＣＤ陽性細胞率、細胞当たり粒子数の算出を行う。
　＜２＞標的物質評価工程
　実施例における、評価するタンパク質についてはＰＤ－Ｌ１及びＣＤ８陽性Ｔ細胞率を用いて、ＰＤ－Ｌ１陽性、かつＣＤ８陽性群とそれ以外の群との予後の比較（ｐ値＊＊）を行った。
　さらにはＰＤ－Ｌ１陽性、かつＣＤ８陽性群とＰＤ－Ｌ１陰性、かつＣＤ８陰性群の予後の比較（ｐ値＊＊＊）を行った。
　ＣＤ８陽性率のカットオフ値に関しては、ＣＤ８陽性率３％をＣＤ８陽性、陰性のカットオフ値とした。
　［実施例８～１４］
　各臓器の腫瘍症例を用いて、ＰＤ－Ｌ１発現のバラつきをＷＳＩで評価後、狭領域すなわち第２領域における評価をＰＤ－Ｌ１、若しくはＣＤ８陽性細胞のＨｏｔｓｐｏｔにおいて１０区画を含む視野を選択し、細胞当たり粒子数、ＣＤ８陽性率による評価を行った。
　有意差検定を実施し、そのｐ値＊＊及びｐ値＊＊＊を表ＩＩにまとめた。
　［比較例８～１４］
　各臓器の腫瘍症例を用いて、狭領域すなわち第２領域における評価を任意領域において行った。
　実施例同様に細胞当たり粒子数、ＣＤ８陽性率による評価を行った。
　有意差検定を実施し、そのｐ値＊＊及びｐ値＊＊＊を表ＩＩにまとめた。
　表ＩＩは、各腫瘍症例におけるＰＤ－Ｌ１×ＣＤ８発現解析の結果である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表ＩＩのｐ値＊＊及びｐ値＊＊＊を見ても分かるように、実施例の方が比較例に比べてｐ値＊＊及びｐ値＊＊＊が小さく、より正確な病理診断に適していることがわかる。
　組織片における標的物質の分布も考慮されるため、組織片における標的物質の存在や量を正確に把握することができる生体関連情報取得方法及び生体関連情報取得システムを提供することができる。

Claims (9)

  1. 　生体組織における標的物質を評価するための情報を取得する生体関連情報取得方法であって、
    　少なくとも、分布情報取得工程と標的物質評価工程とを有し、
    　前記分布情報取得工程は、組織片中の任意の第１領域における標的物質の分布に関する情報である第１情報を取得する工程であり、
    　前記標的物質評価工程は、前記第１情報に基づいて、前記第１領域における標的物質の存在又は量を評価するための情報である第２情報を取得し、又は前記第１領域内であってかつ前記第１領域よりも狭い任意の第２領域における標的物質の存在又は量を評価するための情報である第３情報を取得する工程である
    　ことを特徴とする生体関連情報取得方法。
  2. 　前記第１情報が、前記第１領域における前記標的物質の分布のバラつきに関する情報であることを特徴とする請求項１に記載の生体関連情報取得方法。
  3. 　前記第１領域における前記標的物質の分布のバラつきに関する情報が、前記第１領域における前記標的物質の偏在度であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の生体関連情報取得方法。
  4. 　前記分布情報取得工程において、前記第１領域における前記標的物質の存在が可視化された画像に基づいて前記第１情報を取得することを特徴とする請求項１から請求項３までのいずれか一項に記載の生体関連情報取得方法。
  5. 　前記第２領域が、標的物質が存在しない領域を示す陰性領域、特定の細胞が占有する領域を示す細胞領域、特定の細胞群が占有する領域を示す細胞群領域、標的物質とは異なる物質を可視化する対象となる追加標的領域、又は標的物質に関わる遺伝子を解析する対象となる遺伝子解析領域であることを特徴とする請求項１から請求項４までのいずれか一項に記載の生体関連情報取得方法。
  6. 　前記各工程に加えて、前記第１情報に基づいて前記第１領域における前記標的物質の分布にバラつきがあるか否かを判定する判定工程を有することを特徴とする請求項１から請求項５までのいずれか一項に記載の生体関連情報取得方法。
  7. 　前記判定工程において前記第１領域における標的物質の分布にバラつきがないと判定されたとき、前記標的物質評価工程において前記第１領域における前記第２情報を取得し、評価することを特徴とする請求項６に記載の生体関連情報取得方法。
  8. 　前記判定工程において前記第１領域における標的物質の分布にバラつきがあると判定されたとき、前記標的物質評価工程において前記第２領域における前記第３情報を取得し、評価することを特徴とする請求項６に記載の生体関連情報取得方法。
  9. 　生体組織における標的物質を評価するための情報を取得する情報取得システムであって、請求項１から請求項８までのいずれか一項に記載の生体関連情報取得方法を実施するための工程手段を有することを特徴とする生体関連情報取得システム。
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