WO2019131727A1 - 医薬の評価方法 - Google Patents

医薬の評価方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2019131727A1
WO2019131727A1 PCT/JP2018/047759 JP2018047759W WO2019131727A1 WO 2019131727 A1 WO2019131727 A1 WO 2019131727A1 JP 2018047759 W JP2018047759 W JP 2018047759W WO 2019131727 A1 WO2019131727 A1 WO 2019131727A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
target
drug
antibody
molecule
target molecule
Prior art date
Application number
PCT/JP2018/047759
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
健 瀬戸川
高橋　優
Original Assignee
コニカミノルタ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by コニカミノルタ株式会社 filed Critical コニカミノルタ株式会社
Priority to EP18893563.9A priority Critical patent/EP3734277A4/en
Priority to US16/958,144 priority patent/US20200363389A1/en
Priority to JP2019562083A priority patent/JPWO2019131727A1/ja
Publication of WO2019131727A1 publication Critical patent/WO2019131727A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)

Definitions

  • the present invention relates to a method of evaluating a medicament.
  • aptamer drugs with similar properties to antibodies, which bind to specific target molecules are also attracting attention, and drugs that specifically recognize target molecules are considered as an effective means for cancer treatment .
  • HER2 protein which is a target molecule (antigen) of trastuzumab
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • the IHC method When the IHC method is used in a breast cancer test, a method of staining and detecting HER2 protein contained in a sample using DAB (3,3'-Diaminobenzidine; 3,3'-diaminobenzidine) is widely used. There is. However, since the criterion is a rough criterion based on only four steps where the staining level is scored as 0 to 3, it lacks quantitativity, and the judgment criterion is further influenced by the degree of proficiency of a pathologist. It is a clinical problem. When FISH method is used, a method of fluorescently staining the gene using a probe for detecting a gene encoding HER2 protein on chromosome 17 is widely used. Although FISH is a quantitative test, it is not a method to directly assess the amount or subcellular localization of HER2 protein.
  • DAB 3,3'-Diaminobenzidine
  • nano-sized fluorescent particles for example, particles obtained by accumulating fluorescent substances such as fluorescent dyes and quantum dots with a resin etc. as a matrix
  • fluorescent particles A staining method for labeling a target protein using Phosphor Integrated Dot (PID) has been proposed and is in practical use.
  • PID Phosphor Integrated Dot
  • the target protein is labeled using a phosphor-accumulating particle (sometimes referred to as "phosphor-accelerating nanoparticle", “phosphor-encapsulating particle” or the like in other documents), and the fluorescent substance is accumulated in the particle.
  • Patent Document 1 and Patent Document 2 describe a method of performing immunostaining using phosphor-accumulated particles.
  • Patent Document 3 describes a tissue staining method which is carried out by using an antibody drug (trastuzumab etc.) which is an antibody drug labeled by phosphor-accumulating particles and binding it to an antigen (HER 2 etc.) to be a target thereof. It is further described that such a method can be applied to a method of determining the efficacy of an antibody drug.
  • the present invention has been made in view of the above, and an object thereof is to provide a method for evaluating with high accuracy the efficacy of a drug that specifically recognizes a target molecule (hereinafter also referred to as drug X).
  • the present inventors have found that the therapeutic effect of the drug X can be evaluated by analyzing by combining information on target molecules, information on target related molecules, blood concentration of the drug X, and arrival cell rate of the drug X, and the like.
  • the present invention provides the following pharmaceutical evaluation method.
  • a method for evaluating a drug that specifically recognizes a target molecule comprising the step (P) of obtaining information on the target molecule, further comprising A method for evaluating a medicament, comprising at least one step selected from the following steps (A), (B) and (C) (provided that only step (A) and step (B) are excluded).
  • A) Step of obtaining information on target-related molecule (B) Step of measuring the blood concentration of the drug specifically recognizing the target molecule in the subject (C) Step of the drug specifically recognizing the target molecule Step of calculating the arrival cell rate
  • step (C) is a step of quantifying the blood concentration of the antibody drug using an ELISA.
  • Item 8 The method for evaluating a medicament according to Item 7, wherein the target molecule is PDGF-B, C5, MCP-1, SDF-1, Hepcidin, RTP801, Nucleocapsid, transthyretin or HSP47.
  • the therapeutic effect of the drug X can be predicted and evaluated, useful information for diagnosis or treatment using the drug X can be acquired, and patients to whom administration is applied can be more accurately selected. It is possible to develop an appropriate dosing schedule.
  • FIG. 1 is a graph in which the measurement result of the blood concentration of trastuzumab performed in Experimental Example 1 is plotted.
  • the results for the high concentration group are shown by black circles, and the results for the low concentration group are shown by white circles.
  • Figure 2 divides the sample into high concentration group and low concentration group based on trastuzumab blood concentration, and further divides high concentration group into HER3 high expression group and HER3 low expression group, proportion of HER2 + cells in each group and trastuzumab reaching cells The rates are plotted and graphed.
  • FIG. 3 is a graph plotting the achieved cell rate of trastuzumab and the treatment score of trastuzumab in each sample and graphed by linear approximation.
  • the drug (drug X) that specifically recognizes a target molecule in the present invention is a drug that utilizes a mechanism that recognizes a specific molecule such as a protein as a target, and as a typical example, antibody drug, nucleic acid drug, peptide aptamer Etc.
  • a nucleic acid drug or an antibody drug is preferable, and an antibody drug is more preferable, because the stability in a subject's blood is high.
  • the antibody drug of the present invention is a drug having an antibody (immunoglobulin) that recognizes an antigen as a main component.
  • antibody as used herein includes not only full-length antibodies but also antibody fragments such as Fab, F (ab) '2, Fv, scFv and chimeric antibodies (humanized antibodies etc.), multifunctional antibodies, Antibody -Includes derivatives such as Drug Conjugate (ADC).
  • ADC Drug Conjugate
  • the nucleic acid drug in the present invention is a drug having a natural or chemically modified nucleotide as a basic skeleton, and is characterized in that it directly acts on a living body without gene expression and is produced by chemical synthesis.
  • Nucleic acid medicines applicable to the present invention include nucleic acid aptamers, decoys, antisenses, siRNAs, ribozymes, miRNA-mimic and the like, but nucleic acid aptamers are preferable because they can specifically recognize a protein which is a target molecule.
  • Aptamers can be roughly classified into nucleic acid (DNA or RNA) aptamers and peptide aptamers, and in the present invention, any of nucleic acid aptamers and peptide aptamers can be used, but oligo nucleic acids are easily obtained when developing aptamer drugs. Thus, nucleic acid aptamers are preferred.
  • the present invention relates to a method for evaluating drug X, which comprises the step (P) of obtaining information on a target molecule, and further, the step (A) for obtaining information on a target related molecule, the blood of the drug X of the subject At least one process selected from the process (B) for measuring medium concentration, and the process (C) which measures the said arrival cell rate of medicine X.
  • the embodiment in which only the step (A) and the step (B) are performed is not included.
  • the step (P) and the step (A) are steps performed on a sample derived from a subject before administration of the drug X, and are preferably performed on the same sample (tissue section or the like).
  • Steps (B) and (C) are steps performed on a sample derived from a subject after administration of the drug X.
  • the samples in each step are samples derived from the same subject. In other words, after administering the drug X to the subject before administration of the drug X from which the sample for carrying out the step (P) and the step (A) was administered, the sample for performing the step (B) and step (C) is collected Do.
  • the fluorescent substance is used in view of being able to observe the target molecule, target related molecule and medicine X "quantitatively” instead of “qualitatively” It is preferable to carry out by the staining method using accumulated particles (PID), and in particular when the medicine X is an antibody medicine, it is preferable to carry out by the immunostaining method.
  • PID accumulated particles
  • immunostaining may be performed using an antibody in which a PID is attached to a target molecule, a target-related molecule, or an IgG that specifically recognizes and binds to an antibody drug, a target molecule, a target-related molecule, The immunostaining may be performed using an IgG that specifically recognizes and binds to the antibody drug and an IgG that specifically recognizes and binds to the antibody to which a PID is bound.
  • the subject in the present invention may be a human (cancer patient or a person suspected of having cancer) or a non-human animal.
  • non-human animals for example, experimental animals, typically tumor-bearing animals, preferably tumor-bearing mice can be used.
  • PDX tient derived xenograft
  • Immuno-avatar model mouse hematopoietic lymphoid system, produced by transplanting cancer cells or tumor tissue collected from human to acquired immunodeficient mice
  • CDX Cell-line derived xenograft created by transplanting cultured cells derived from humanized [Hemato-lymphoid humanized] model mice, Immune-PDX model mice, or tumor cells collected from subjects into acquired immunodeficient mice ] Model mice etc.
  • the tumor-bearing mouse is a 0th generation experimental animal to which a cultured cell derived from a tumor (cancer) tissue or a tumor cell taken from a human (cancer patient) or a tumor cell taken from a patient is transplanted, and Such as tumor tissue or tumor cells transplanted to the 0 th generation, n th generation (n ⁇ 1) where tumor tissue grown or expanded tumor cells in the body of n-1 experimental animals were implanted The experimental animal of) is included.
  • the drug X to be evaluated in the present invention is not particularly limited, it is preferably one that includes cancer as an indication disease, and it may be a drug X that has already been marketed and is used clinically. Alternatively, it may be a drug X as a candidate drug used in clinical trials or clinical trials.
  • humanized anti-HER2 antibody trastuzumab Herceptin (registered trademark)
  • anti-CD30 monoclonal antibody brentuximab anti-VEGF monoclonal antibody bevacizumab
  • humanized anti-CD33 antibody gemtuzumab
  • humanized anti PD-1 antibodies pembrolizumab and nivolumab anti-CTLA-4 ipilimumab monoclonal antibody and the like
  • nucleic acid aptamer drugs E10030 (Fovista®) targeting PDGF-B, ARC1905 (Zimura®) targeting C5, NOX-E36 targeting MCP-1 (Emaoticap Pegol), NOX-A12 (Olaptesed Pegol) targeting SDF-1, NOX-H94 (Lezapteid Pegol etc.) targeting Hepcidin.
  • siRNA agents include PF-655 targeting RTP801, ALN-RSV01 targeting Nucleocapsid, and ND-L02-s0201 targeting HSP47.
  • step (P) is a step of obtaining information on a target molecule in a sample derived from a tumor tissue, and preferably includes at least one of information on the expression amount of target molecule and information on localization of target molecule, More preferably,
  • the information on the expression level of the target molecule includes, for example, the type, number, and form of cells expressing the target molecule in the sample (tissue slide), the expression level per unit area of the target molecule in the sample or per cell, It includes a histogram or a curve represented by the amount of expression of the target molecule per cell and the corresponding number of cells.
  • the information on the localization of the target molecule includes the localization of the target molecule in a sample, the localization of a specific cell group (for example, a cancer cell group) in a region of interest (ROI), and the like.
  • the information is preferably information based on information acquired as an image (including one converted as a digital image), and more preferably quantitative.
  • the information on the expression state may be not only one of the above but also a plurality of combinations.
  • the target molecule is a biomolecule targeted by the drug X, and typically is a protein (antigen) that specifically binds to an antibody, a nucleic acid or the like that is a component of the drug X.
  • the target molecule is not particularly limited as long as it is a protein that can be present in tumor tissue, and, for example, immune system proteins, cancer cell growth factors, metastasis regulators, vascular growth factors, cytokines, cancer cell growth regulators, receptors, metastasis
  • a regulatory factor receptor, a vascular growth factor receptor, and a cytokine receptor may be mentioned, preferably a molecule involved in a signal transduction pathway, preferably a molecule involved in a growth signaling pathway.
  • the target molecule in the present invention include HER2, CTLA4, EGFR, PD-1, PDGFRA, PD-L1, VEGF, or VEGFR.
  • the drug X is a nucleic acid drug
  • the target molecule is specifically, for example, PDGF-B, C5, MCP-1, SDF-1, Hepcidin, RTP801, Nucleocapsid, transthyretin, or HSP47. Etc.
  • Step (A) in the present invention is a step of obtaining information on a target related molecule using a specimen derived from a tumor tissue, including at least one of information on the expression level of target related molecule and information on the localization of target related molecule. Is preferred, and it is more preferred to include both.
  • the same step (A) as the sample used in the step (P) may be used in the step (A), or another step may be used, but preferably a step using the sample used in the step (P) It is preferable to carry out (A).
  • the step (A) is carried out in combination with the above step (P) and at least one, preferably both of the step (B) and the step (C) described later.
  • the information on the expression level of the target related molecule includes, for example, the type, number, and form of cells expressing the target related molecule in a sample (tissue slide), per unit area of target related molecule in a sample or per cell.
  • the amount of expression, the amount of expression of target related molecule per cell and the corresponding histogram or curve represented by the number of cells can be mentioned.
  • Information on the localization of target related molecule includes the position of target related molecule in the sample. In addition, it includes localization within a region of interest (ROI) of a specific cell group (for example, a cancer cell group).
  • the information is preferably information based on information acquired as an image (including one converted as a digital image), and more preferably quantitative.
  • the information on the expression state may be not only one of the above but also a plurality of combinations.
  • a target-related molecule is a molecule involved in a signal transduction pathway in which a target molecule is involved, typically in tumor cells, and specifically, it is selected as follows.
  • the target-related molecule is preferably selected from HER3, EGF, GRB2, HRAS, KRAS, CTNNB1, PIK3CA, PTPN11, EGFR, GRB7, and BTC.
  • CTLA4 the target related molecule is preferably selected from CD86, CD80, FOXP3, FYN, PTPN11, LCK, NFATC2, AKT1, ICOSLG, and LYN.
  • the target-related molecule is preferably selected from EGF, KRAS, HRAS, GRB2, SHC1, TP53, CBL, PIK3CA, TGFA, and PTPN11.
  • the target-related molecule is preferably selected from CD274, PDCD1LG2, HLA-DRB5, HLA-DRA, PTPN11, PTPN6, HLA-DRB1, LCK, CD4 and CD3E.
  • the target-related molecule is preferably selected from PDGFA, PDGFC, PIK3R1, STAT3, CRKL, CRK, PDGFB, STAT1, PTPN11, and GRB2.
  • the target-related molecule is preferably selected from PDCD1, PTPN11, PDCD1LG2, LCK, CD3E, CD4, HLA-DRB1, HLA-DPB1, HLA-DRA, and CD3G.
  • the target related molecule is preferably selected from FLT1, KDR, HIF1A, FLT4, EGF, THBS1, IGF1, HGF, TGFB1, and PIK3CA.
  • the target-related molecule is preferably selected from VEGFC, VEGFA, CDH5, FIGF, NRP1, FGF2, PIK3CA, PIK3CB, CRK, and NOS3.
  • the step (B) in the present invention is a step of measuring the blood concentration of the drug X in a subject.
  • the step (B) is carried out in combination with the above step (P) and at least one, preferably both of the step (A) and the step (C).
  • the method of measurement is not particularly limited, and a general method can be used, and plasma separated from blood collected from a subject by centrifugation etc. is used as a sample, and the measured plasma concentration is regarded as blood concentration. More accurate blood levels can be obtained.
  • the medicine X is an antibody medicine, it is preferred to use ELISA.
  • the medicine X is a nucleic acid medicine, it is preferable to use a hybridization method utilizing the property that a nucleic acid forms a duplex with a complementary strand.
  • the concentration is determined by hybridizing the nucleic acid aptamer using a sequence complementary to the half sequence of the nucleic acid aptamer as the fixing probe and the remaining half sequence as the detection probe.
  • the step (C) in the present invention is a step of calculating the reaching cell rate of the medicine X.
  • the calculation of the reaching cell rate of the drug X be performed by visualizing the drug X taken into the tissue.
  • a phosphor-accumulated particle is used, which is a specimen prepared from a tissue of a lesion (for example, a tumor) associated with an indication disease of the antibody drug, which is collected from a subject to which the antibody drug has been administered.
  • it is performed by immunostaining.
  • a secondary antibody that specifically recognizes and binds to an antibody used as an antibody drug can be stained using a direct or indirect binding of a PID, and specifically, a humanized anti-HER2
  • trastuzumab which is an antibody
  • trastuzumab in a tissue can be stained by staining with an antibody bound to an anti-human IgG antibody.
  • nucleic acid aptamer that recognizes human HER2 when used as a nucleic acid drug, it can be stained using a nucleic acid probe having a sequence complementary to the nucleic acid aptamer bound to PID, or a first biological substance Can be stained using the nucleic acid probe to which is attached, and the second biological substance that specifically recognizes and binds to the first biological substance with the PID directly or indirectly.
  • the number of cells in the sample can be measured together.
  • the bright field observation staining method is not particularly limited, but typically, hematoxylin-eosin staining (HE staining) is performed. When such bright field observation staining is performed, it may be performed after the immunostaining step, or may be performed before the immunostaining step.
  • the cell number may be measured digitally using software or the like, or may be measured visually.
  • the number of trastuzumab-stained cells and the total number of cells included in the entire sample or unit area (or volume) are counted.
  • the number of cells from which the bright spot is observed relative to the total number of cells is measured relative to the total number of cells (antibody drug).
  • the percentage of cells that have reached ie, the percentage of cells reached by the antibody drug
  • the brightness score per cell in the cells reached by the antibody drug may be calculated together.
  • sample The evaluation method of the present invention is carried out in vitro of a subject using the following samples.
  • the sample used in the step (B) (herein referred to as the sample (i) in the present specification) is derived from the blood of a subject to whom the drug X has been administered, and is used in the blood of the subject collected according to a conventional method. Preferably, it is plasma separated by centrifugation or scientific treatment.
  • the sample (i) is preferably one that has been appropriately treated according to the measurement method performed in step (B), and may contain an additive or the like suitable for optimization of storage and measurement. .
  • Step (P), a sample used in step (A) (herein referred to as sample (ii)), and a sample used in step (C) (herein referred to as sample (iii)) Is a tissue section collected from a subject, or a cell obtained by culturing cells contained in a tissue collected from a subject, and generally, when evaluating the expression level of a target protein by immunostaining, etc.
  • it takes the form of a specimen slide on which the tissue section or cells are mounted, as commonly used in the art.
  • a specimen slide on which a tissue section is placed is particularly referred to as a tissue slide.
  • Sample (ii) is derived from the subject prior to administration of drug X.
  • the sample (iii) is derived from the subject after administration of the drug X.
  • the sample is preferably from diseased tissue, in particular from tumor tissue.
  • a “tumor tissue” is a tissue containing cancer cells, collected from a subject according to a conventional method, and in addition to cancer cells, for example, normal cells, blood vessels, stromal cells (fibroblasts, endothelial cells, Leukocytes (lymphocytes, monocytes, neutrophils, eosinophils, basophils) and the like can be included.
  • the “tumor” is typically a solid tumor (cancer), and is not particularly limited.
  • cancer cancer
  • liver cancer, colon cancer, cervical cancer, prostate cancer, solid cancer such as bladder cancer, leukemia, lymphoma, and multiple myeloma.
  • tumor tissue-derived sample means a tumor tissue section or a cancer cell mass collected from a lesion of a subject having a tumor (or suspected of having a tumor), or a sample obtained from the subject It is a cultured cell of a tumor cell contained in a tumor tissue, preferably in the form of a specimen slide as described above.
  • tumor tissue-derived sample is a tumor tissue section
  • the sample may include not only tumor tissue but also surrounding normal tissue.
  • a region including tumor tissue (cancer cells) in a specimen derived from a tumor tissue is referred to as a “tumor region”.
  • the method for preparing the tissue section and the sample slide is not particularly limited.
  • a tissue collected from a subject is fixed using formalin or the like, dehydrated with alcohol, then subjected to xylene treatment, and high temperature Can be obtained by sectioning a tissue sample prepared by paraffin-embedding by immersing in paraffin of 3 to 4 .mu.m, and placing the tissue section on a slide glass and drying it. Slides (tissue slides) can be made.
  • the step (P) and the step (A) in the present invention are preferably performed by immunostaining using phosphor-accumulated particles (PID).
  • the medicine X is an antibody medicine
  • an example of an immunostaining method using PID will be described in more detail using a specimen derived from a tumor tissue, specifically, a tissue slide prepared from a tumor tissue section. .
  • the sections are immersed in a container containing xylene to remove paraffin.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or more and 30 minutes or less. If necessary, xylene may be replaced during immersion.
  • the sections are then immersed in a container containing ethanol to remove xylene.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or more and 30 minutes or less. If necessary, ethanol may be replaced during immersion.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or more and 30 minutes or less. Also, water may be exchanged during immersion if necessary.
  • the target substance is activated according to a known method.
  • the activation conditions are not particularly limited, as an activation solution, 0.01 M citrate buffer (pH 6.0), 1 mM EDTA solution (pH 8.0), 5% urea, 0.1 M Tris-HCl buffer A liquid etc. can be used.
  • the heating apparatus can use an autoclave, a microwave, a pressure cooker, a water bath etc.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the temperature can be 50 to 130 ° C., and the time can be 5 to 30 minutes.
  • the section after activation treatment is immersed in a container containing PBS and washed.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or more and 30 minutes or less. If necessary, the PBS may be replaced during immersion.
  • a stain in which phosphor-accumulating particles having a site capable of binding directly or indirectly to the target substance are dispersed in a diluent.
  • the solution is placed on a tissue section and reacted with the target substance.
  • a solution of primary antibody is dropped onto a tissue slide, and then a secondary antibody-biotin conjugate is used.
  • the solution may be dropped onto the tissue section, and finally the PID staining solution may be dropped onto the tissue section.
  • the target substance and the fluorescent substance-accumulating particles are [target substance] ... [primary antibody against target substance] ...
  • an appropriate signal is obtained according to the conventional immunostaining method. It can be adjusted as appropriate.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the reaction time is preferably 30 minutes or more and 24 hours or less.
  • a known blocking agent such as BSA-containing PBS or a surfactant such as Tween 20 before performing the above-described primary reaction process.
  • tissue slide which has been subjected to the immunostaining step is preferably subjected to treatments such as immobilization / dehydration, clearing and encapsulation so as to be suitable for observation.
  • the fixation / dehydration treatment may be performed by immersing the tissue slide in a fixation treatment solution (formalin, paraformaldehyde, glutaraldehyde, acetone, ethanol, methanol, or other crosslinking agent).
  • a fixation treatment solution formalin, paraformaldehyde, glutaraldehyde, acetone, ethanol, methanol, or other crosslinking agent.
  • the tissue slide which has been fixed and dehydrated may be immersed in clear solution (xylene or the like).
  • the sealing solution may be dropped onto the tissue slide which has been subjected to the clearing process.
  • the conditions for performing these treatments for example, the temperature and immersion time for immersing the tissue slide in a predetermined treatment solution, may be appropriately adjusted to obtain an appropriate signal according to the conventional immunostaining method. it can.
  • step (C) staining for bright field observation can be performed if necessary.
  • the bright field observation staining method is not particularly limited, but typically, hematoxylin-eosin staining (HE staining) is performed.
  • HE staining hematoxylin-eosin staining
  • the morphological observation staining step it may be performed after the immunostaining step, or may be performed before the immunostaining step.
  • the excitation light may be, for example, a light source such as an ultra-high pressure mercury lamp, Xe lamp, LED (light emitting diode), or laser device included in a fluorescence microscope, and an optical for excitation light that selectively transmits a predetermined wavelength as needed.
  • Irradiation can be performed by using a filter.
  • a filter When immunostaining is performed using a plurality of staining solutions containing different phosphor-accumulating particles, observation is performed while switching a plurality of types of filter sets corresponding to the respective phosphor-accumulating particles.
  • the imaging of the immunostaining image can be performed, for example, by a digital camera provided in a fluorescence microscope.
  • a fluorescent optical filter that selectively transmits a predetermined wavelength as necessary, excitation light that contains only the target fluorescence and is not the target fluorescence or noise And other light excluded immunostaining images can be taken.
  • a fluorescent labeling signal corresponding to a fluorescent labeling signal corresponding to the target substance is measured based on the image processing for the immunostaining image photographed for the target substance, and the target living body within the region of the cell membrane Identify the fluorescently labeled signal that corresponds to the substance. It is preferable to handle the fluorescent labeling signal as the number of bright spots of fluorescence.
  • Examples of software that can be used for image processing include "ImageJ” (open source).
  • image processing software bright spots of a predetermined wavelength (color) are extracted from the immunostained image, calculation of the sum of the brightness thereof, measurement of the number of bright spots having a predetermined brightness or more, plural A process of superimposing the images of (1), a process of measuring the number of cells contained in the images, etc. can be performed semiautomatically and rapidly.
  • the size is constant and can be recognized by microscopic observation.
  • a signal whose size is larger than a fixed value eg, the average value of observed phosphor-accumulating particles
  • the bright spots and the cohesive spots can be quickly distinguished semi-automatically using software.
  • a monoclonal antibody is preferably used from the viewpoint of specificity.
  • the type of animal producing the antibody is not particularly limited, and may be selected from mice, rats, guinea pigs, rabbits, goats, sheep and the like as in the prior art.
  • the antibody is not a natural full-length antibody but an antibody fragment or antibody fragment as long as it has the ability to specifically recognize and bind to a substance to be detected (eg, target protein in step (P)). It may be a derivative.
  • step (C) in the present invention is preferably performed by a staining method (FISH) using a nucleic acid probe reagent.
  • FISH staining method
  • a staining method using a nucleic acid probe reagent will be described in more detail using a specimen derived from a tumor tissue, specifically, a tissue slide prepared from a tumor tissue section.
  • the method of staining is not particularly limited, and known methods can be used.
  • the nucleic acid molecule may be DNA or RNA as long as it is a nucleic acid molecule having a sequence complementary to the target nucleic acid drug, and the length of the sequence may be appropriately selected so as to efficiently hybridize.
  • PCR labeling method As a method of binding the first biomolecule to the nucleic acid molecule, PCR labeling method, nick translation method, random prime method can be used using a nucleic acid substrate having the first biomolecule.
  • a nucleic acid molecule is subjected to PCR using a nucleic acid substrate (eg, dUTP-biotin etc.) labeled with a first biomolecule (eg, biotin etc.) using the nucleic acid molecule as a template. It can be labeled.
  • a nucleic acid molecule can be labeled with a first biomolecule by performing nick translation using a nucleic acid substrate (eg, dUTP-biotin etc.) labeled with a first biomolecule.
  • a nucleic acid substrate eg, dUTP-biotin etc.
  • a nucleic acid molecule serving as a template is formed into a double strand by using primers of different lengths, and a nucleic acid substrate (eg, dUTP-biotin) labeled with Klenow enzyme with a first biomolecule.
  • the nucleic acid molecule can be labeled with the first biomolecule by acting in the presence of
  • the first biomolecule examples include haptens such as low molecular weight biotin, FITC, Cy5, DNP, DIG and the like.
  • the temperature at this time is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or more and 30 minutes or less.
  • xylene may be replaced during immersion if necessary.
  • the sections are then immersed in a container containing ethanol to remove xylene.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or more and 30 minutes or less.
  • ethanol may be replaced during immersion.
  • the sections are then immersed in a water filled container to remove ethanol.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or more and 30 minutes or less.
  • water may be replaced during immersion if necessary.
  • sample slide pretreatment Prior to subjecting the probe to the hybridization reaction, perform pretreatment such as pretreatment (heat treatment, acid treatment), treatment with an enzyme treatment, etc., to allow the probe reagent to efficiently reach the nucleic acid on the tissue section. It has been known. The optimum conditions for these processing conditions and combinations differ depending on the type, thickness, slide adjustment conditions, etc. of the section, so it is necessary to appropriately determine the procedure. Not all treatments need to be performed, and there may be an option, for example, to not perform enzyme treatment.
  • the sample slide to be subjected to FISH is pretreated according to a known method.
  • the pretreatment conditions are not particularly limited, but can be performed, for example, by the following procedure.
  • the sample slide is immersed in hydrochloric acid (about 0.2 mol / L) for a fixed time. Then, it is immersed in water and further immersed and washed in a washing buffer (2 ⁇ SSC: standard sailine citrate). Next, it is immersed for a fixed time in a heated NaSCN solution (for example, about 1 N). Then, it is immersed in water, and further immersed in washing buffer to wash, and the same operation is repeated twice.
  • pre-treatment liquid 0.01 M citrate buffer (pH 6.0), 1 mM EDTA solution (pH 8.0), 5% urea, 0.1 M Tris-HCl buffer
  • a heating apparatus an autoclave, a microwave, a pressure cooker, a water bath or the like can be used.
  • the temperature is not particularly limited, but the temperature may be 50 to 130 ° C., and the time may be 5 minutes to 30 minutes.
  • hydrolase protease
  • a hydrolase protease
  • a hydrolase protease
  • an enzyme treatment to remove proteins of cell membrane and nuclear membrane, particularly collagen, in the following procedure, for example.
  • the specimen slide is immersed in the protease solution for a fixed time. It is then dipped and washed in washing buffer and this operation is repeated twice.
  • sample slide is dried by air drying or the like.
  • known dehydration treatment using 70 to 100% ethanol may be performed instead of air drying.
  • proteases proteinases suitable for protein hydrolysis, such as pepsin, proteinase K and the like are often used.
  • the efficiency of deproteinization can be determined by examining the combination of hybridization, that is, the protease concentration that maximizes the reaction with the target chromosome and the degradation time. It is performed with the condition settings that can not be lost. The optimum conditions differ depending on the tissue type and the fixation method. Also, additional immobilization after protease treatment is useful.
  • the following procedure is performed to fix the sample slide in each step of the pretreatment, if necessary after the above-mentioned enzyme treatment or the like.
  • the specimen slide is immersed in formalin solution for a fixed time. It is then dipped and washed in washing buffer and this operation is repeated twice. Thereafter, the sample slide is dried by air drying or the like.
  • Fixation treatment may not be carried out at all because it is added and improved as a process of carrying out fixation treatment after the step where it is thought that the section may be peeled off when staining is usually carried out without carrying out any fixation treatment. In some cases, it may be implemented in several places. Therefore, the fixation processing may be performed before and after the nuclear staining, as necessary, in steps other than each step other than the pretreatment. For example, fixation processing of the sample may be performed before and / or after hybridization.
  • the specimen slide is immersed in a denaturing solution (formamide / SSC solution or the like) at about 72 ° C. for a predetermined time. Thereafter, the specimen slide is taken out and immersed in several stages of ethanol (for example, 70% aqueous ethanol, 80% aqueous ethanol and 100% ethanol) with gradually increasing concentration to remove formamide. Thereafter, the sample slide is dried by air drying or the like.
  • a denaturing solution formamide / SSC solution or the like
  • ethanol for example, 70% aqueous ethanol, 80% aqueous ethanol and 100% ethanol
  • hybridization Using a probe reagent containing a nucleic acid molecule (nucleic acid probe) having a sequence complementary to the nucleic acid drug of interest, known FISH (for example, "Agilent FISH General Purpose Reagents protocol” or “Clinical FISH protocol-visible chromosomes ⁇ Hybridization processing can be carried out in the same manner as genetic diagnostic methods (Cell Engineering Supplement-Experimental Protocol Series etc.)
  • hybridization refers to two strands for the formation of double-stranded molecules. It refers to the binding process of DNA or DNA and RNA complementary strand, or a double-stranded molecule formed.
  • a probe reagent including a complex in which a nucleic acid probe and a fluorophore-accumulated particle are bound is prepared, and the complex is allowed to bind to a target nucleic acid drug, respectively. is there.
  • a probe reagent having a nucleic acid probe solution and a phosphor-accumulating particle dispersion separately is prepared, and only a nucleic acid probe is first hybridized to a target nucleic acid drug. After that, an anti-hapten antibody is bound to the first biomolecule hapten bound to the hybridized nucleic acid probe, and a fluorescent nanoparticle is added to the second biomolecule to which the antibody is bound.
  • Dynamic hybridization via antigen-antibody reaction which binds a third biomolecule bound to The second biomolecule can be selected from the haptens as the first biomolecule, and it is not good to select the same hapten.
  • the third biomolecule include streptavidin, avidin, neutravidin and the like which are polymers. Among these, strepavidin can be suitably used.
  • the type of nucleic acid molecule used for hybridization is not limited to one type, and may be two or more.
  • hybridization different from the above may be used as long as the fluorescent substance-accumulating particles can be bound to the nucleic acid probe in which the nucleic acid drug of interest and the complementary strand are formed.
  • each bond bond between hapten-anti-hapten antibody, bond between first biomolecule-second biomolecule of the probe, bond between first bond group-second bond group
  • the nucleic acid molecule and the fluorescent particle may be bound directly or dynamically by utilizing it.
  • nuclear staining process After the hybridization treatment, usually, a nuclear staining treatment to count the number of cells is further performed.
  • DAPI is generally used as a nuclear staining reagent
  • bisbenzimide derivatives such as Hoechst 33258 and Hoechst 33342 and other nuclear staining reagents may also be used.
  • nuclear staining can be performed by the following procedure. First, the sample slide subjected to the hybridization treatment is sequentially washed with deionized water and phosphate buffered saline (PBS). Then, it is immersed in DAPI staining reagent (2 ⁇ g / PBS) for a fixed time.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the specimen slide is washed several times with PBS, air-dried or dehydrated, then the mounting medium is dropped on the tissue section, covered with a cover glass, and dried. I do.
  • a mounting agent known oil-based mounting agents (such as Entellan (registered trademark) new) or water-based mounting agents (such as Aquatex (registered trademark)) can be used.
  • the enclosed sample slide prepared by the above-described process becomes a preparation for pathological diagnosis and the like.
  • HE staining for example, immunostained sections are stained with Meyer's hematoxylin solution for 5 minutes to perform hematoxylin staining, and then the tissue sample is washed with running water at 45 ° C. for 3 minutes, and then 1% eosin solution Stain for 5 minutes and perform eosin staining.
  • eosin used for morphological observation staining can not only be observed in a bright field but also emit autofluorescence when irradiated with excitation light of a predetermined wavelength, it is possible to use tissue samples stained with excitation light of an appropriate wavelength and output. By irradiation, it can also be observed by a fluorescence microscope.
  • the phosphor-accumulated particles (PID) used in the present invention have a plurality of phosphors accumulated (encapsulated) inside the matrix with particles made of organic or inorganic substances as a matrix, and / or adsorbed on the matrix surface It is a nano-sized particle which has the structure which is doing.
  • the fluorescent substance may be dispersed in the matrix, and may or may not be chemically bonded to the matrix itself.
  • the matrix (eg, resin) and the fluorescent substance may be bound by electrostatic interaction or may be covalently bound.
  • the “phosphor” in the present specification is irradiated with an electromagnetic wave (X-ray, ultraviolet light or visible light) of a predetermined wavelength and absorbs the energy thereof to excite electrons and return from the excited state to the ground state Material that emits excess energy as electromagnetic waves, ie, emits "fluorescence", directly with a biological substance recognition substance (such as a substance capable of specifically recognizing a biological substance, eg, biotin, avidin, or an antibody) It refers to a substance that can be bound indirectly or indirectly.
  • a biological substance recognition substance such as a substance capable of specifically recognizing a biological substance, eg, biotin, avidin, or an antibody
  • fluorescence has a broad meaning, and includes phosphorescence with a long emission lifetime in which light emission continues even if irradiation of an electromagnetic wave for excitation is stopped, and narrow-defined fluorescence with a short emission lifetime.
  • thermosetting resins such as melamine resin, urea resin, aniline resin, guanamine resin, phenol resin, xylene resin, furan resin
  • styrene Resins generally classified as thermoplastic resins, such as resin, acrylic resin, acrylonitrile resin, AS resin (acrylonitrile-styrene copolymer), ASA resin (acrylonitrile-styrene-methyl acrylate copolymer); polylactic acid, etc.
  • other resins, and polysaccharides, and examples of inorganic substances include silica, glass and the like.
  • a semiconductor nanoparticle and organic fluorescent pigment are used suitably.
  • the semiconductor nanoparticles include those containing a II-VI compound, a III-V compound, or a Group IV element, and specifically, CdSe, CdS, CdTe, ZnSe, ZnS, ZnTe, InP. , InN, InAs, InGaP, GaP, GaAs, Si, Ge and the like.
  • fluorescent dyes examples include rhodamine-based dye molecules, squarylium-based dye molecules, cyanine-based dye molecules, aromatic ring-based dye molecules, oxazine-based dye molecules, carbopyronin-based dye molecules, pyromecene-based dye molecules, and the like. Registered trademark, Invitrogen's) dye, BODIPY (registered trademark, Invitrogen's) dye, Cy (registered trademark, GE Healthcare) 's dye, DY (registered trademark, DYOMICS's) dye, HiLyte (HiLyte) Registered trademark, anaspec Inc.
  • DyLight registered trademark, manufactured by Thermo Scientific Co., Ltd.
  • ATTO registered trademark, manufactured by ATTO-TEC company
  • MFP registered trademark, manufactured by Mobitec company
  • the generic name of such a dye is named based on the main structure (backbone) in the compound or a registered trademark, and the range of the fluorescent dye belonging to each of them is a person skilled in the art without requiring excessive trial and error. It can be understood properly.
  • the phosphor to be contained in the phosphor accumulation particle for example, “long decay light having Y 2 O 3 , Zn 2 SiO 4 etc. as a main component and Mn 2+ , Eu 3+ etc. as an activator "Phosphor” can be mentioned.
  • the phosphor-accumulated particles can be produced according to a known method (see, for example, JP-A-2013-57937).
  • a phosphor-accumulated silica particle having silica as a base and phosphors accumulated therein is a phosphor such as inorganic semiconductor nanoparticles, organic fluorescent dye, and tetraethoxysilane.
  • a solution in which a silica precursor is dissolved can be dropped into a solution in which ethanol and ammonia are dissolved, and the solution can be prepared by hydrolyzing the silica precursor.
  • a solution or dispersion of fine particles of such resin is prepared first. It can be produced by adding a phosphor such as inorganic semiconductor nanoparticles and an organic fluorescent dye thereto and stirring the mixture. Alternatively, after the fluorescent dye is added to the solution of the resin raw material, the polymerization reaction may be allowed to proceed to produce resin particles including the fluorescent substance.
  • thermosetting resin such as a melamine resin
  • the raw material of the resin (monomer or oligomer or prepolymer, for example, methylolmelamine which is a condensate of melamine and formaldehyde) and an organic fluorescent dye
  • the reaction mixture containing a surfactant and a polymerization reaction accelerator such as an acid
  • the polymerization reaction is allowed to proceed by emulsion polymerization, whereby organic fluorescent dye-containing resin particles can be produced.
  • thermoplastic resin such as a styrenic copolymer
  • the raw material of the resin, the organic fluorescent dye and (the raw material monomer of the resin, the organic fluorescent dye is bonded beforehand by covalent bond etc.
  • a polymerization monomer eg, benzoyl peroxide, azobisisobutyronitrile, etc.
  • the average particle size of the phosphor-accumulated particles is not particularly limited as long as it is a particle size suitable for immunostaining of a sample slide, but in view of ease of detection as a bright spot etc., usually 10 to 500 nm, preferably 50 to 200 nm. Further, the variation coefficient indicating the dispersion of the particle diameter is usually 20% or less, preferably 5 to 15%. Phosphor accumulated particles satisfying such conditions can be manufactured by adjusting the manufacturing conditions.
  • the particle size can be adjusted by the amount of surfactant added, and in general, the surfactant relative to the amount of base material of phosphor accumulation particles When the amount of is relatively large, the particle size decreases, and when the amount is relatively small, the particle size tends to increase.
  • the particle size of the phosphor-accumulated particles is determined by taking a cross-sectional area of the phosphor-accumulated particles by taking an electron micrograph with a scanning electron microscope (SEM) and assuming that the cross-sectional shape is a circle, It can be calculated as the diameter of a circle corresponding to the cross-sectional area.
  • the average particle diameter and coefficient of variation of a group of a plurality of phosphor accumulation particles are calculated as described above for a sufficient number (for example, 1000) of phosphor accumulation particles, and then the average particle diameter is Calculated as an average, the coefficient of variation is calculated by the formula: 100 ⁇ standard deviation of particle size / average particle size.
  • An antibody solution was prepared by dissolving 200 ⁇ L of the total amount of purified antibody in 50 mM Tris solution.
  • the linker reagent "Maleimide-PEG2-Biotin” (Thermo Scientific, product number 21901) was adjusted to be 0.4 mM with DMSO.
  • This anti-rabbit IgG antibody was coupled with biotin via a PEG chain by adding 8.5 ⁇ L of this linker reagent solution to the antibody solution, mixing, and reacting at 37 ° C. for 30 minutes.
  • the reaction solution was purified through a desalting column.
  • the concentration of a protein (biotin-modified IgG antibody) in the reaction solution was calculated by measuring the absorbance at a wavelength of 300 nm using a spectrophotometer (“F-7000” manufactured by Hitachi) for the desalted reaction solution, and the 50 mM Tris solution.
  • concentration of biotin-modified anti-rabbit IgG antibody was adjusted to 250 ⁇ g / mL using
  • a biotin-modified anti-mouse IgG antibody is prepared in the same manner as described above except that an anti-mouse IgG antibody (Abcam: ab99601) is used instead of the anti-rabbit IgG antibody, and the concentration of the biotin-modified anti-mouse IgG antibody is 250 ⁇ g / mL Adjusted to
  • the solution after cooling was divided into a plurality of tubes for centrifugation and centrifuged at 12,000 rpm for 20 minutes to precipitate Texas red dye-containing melamine resin particles contained in the solution as a mixture.
  • the supernatant was removed and the precipitated particles were washed with ethanol and water.
  • SEM observation was performed about 1000 pieces of obtained resin particles, and when an average particle diameter was measured as mentioned above, it was an average particle diameter 152 nm.
  • the Texas Red dye-containing melamine resin particles produced in this manner were surface-modified according to the following procedure.
  • 0.1 mg of the particles obtained were dispersed in 1.5 mL of EtOH, 2 ⁇ L of aminepropyltrimethoxysilane LS-3150 (manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) was added, and reaction was carried out for 8 hours to carry out surface amination treatment.
  • the surface aminated particles are adjusted to 3 nM with PBS (phosphate buffered saline) containing 2 mM of EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) to give a final concentration of 10 mM in this solution.
  • SM (PEG) 12 succinimidyl-[(N-maleimidopropionamido) -dodecaethyleneglycol] ester
  • PBS containing 2 mM EDTA was added to disperse the precipitate, and centrifugation was performed again.
  • the maleimide-modified Texas red accumulated melamine particles were obtained by washing three times according to the same procedure.
  • the maleimide-modified Texas Red accumulation melamine particles described above and thiol-modified streptavidin were mixed in PBS containing 2 mM EDTA, and allowed to react at room temperature for 1 hour. The reaction was stopped by adding 10 mM mercaptoethanol. The resulting solution was concentrated using a centrifugal filter, and unreacted streptavidin and the like were removed using a gel filtration column for purification, and the resulting streptavidin-bound Texas red accumulated melamine particles were recovered. The obtained streptavidin-bound Texas Red accumulated melamine particles were diluted to 0.06 nM using a dilution liquid for phosphor accumulation particles, and used as a red PID staining solution in Experimental Examples 2 and 3.
  • FITC dye-containing melamine resin particles were prepared by using FITC in place of Texas Red dye molecule “Sulforhodamine 101” (Sigma-Aldrich Co.).
  • the obtained streptavidin-conjugated FITC-aggregated melamine resin particles were diluted to 0.06 nM using a diluent for phosphor-accumulating particles, and used as a green PID staining solution in Experimental Examples 2 and 3.
  • Preparation Example 1 7- (Diethylamino) -3-Phenylcoumarin dye-integrated melamine resin particles maleimide-modified in the same manner as Preparation Example 1 and Streptavidin instead of anti-trastuzumab antibody (Bio-rad; HCA 177)
  • Preparation Example 1 An anti-trastuzumab antibody-bound 7- (Diethylamino) -3-phenylcoumarin dye-integrated melamine resin particle is produced by reacting and treating with the same method as in Production Example 1 with a thiol-modified one, What diluted to 0.06nM using the dilution liquid for fluorescent substance accumulation particles was used as a blue PID staining liquid in example 2 of an experiment.
  • trastuzumab trade name; HERCEPTIN®
  • mice were PDX mouse corresponding to each patient, and the mouse
  • step (II) For the tissue slide prepared in step (II), PBS prepared to contain 5 ⁇ g / ⁇ L of anti-HER2 rabbit monoclonal antibody (Roche; 4B5) is dropped onto the tissue slide subjected to the sample pretreatment step, 4 The reaction was carried out overnight at C and then washed with PBS. The tissue slide after washing was diluted with the biotin-modified anti-rabbit IgG antibody prepared in Preparation Example 1 to 2 ⁇ g / mL using the diluent for fluorescent substance accumulation particles, and reacted at room temperature for 30 minutes. The tissue slide was further washed with PBS, and then the red PID staining solution prepared in Preparation Example 2 was dropped, and allowed to react at room temperature for 2 hours.
  • PBS prepared to contain 5 ⁇ g / ⁇ L of anti-HER2 rabbit monoclonal antibody (Roche; 4B5) is dropped onto the tissue slide subjected to the sample pretreatment step, 4 The reaction was carried out overnight at C and then washed
  • PBS prepared so as to contain 5 ⁇ g / ⁇ L of anti-HER3 antibody mouse monoclonal antibody (Novus Biologicals; RTJ2) was dropped on the tissue slide, and reacted overnight at 4 ° C. It was then washed with PBS.
  • the tissue slide after washing was diluted with the biotin-modified anti-mouse IgG antibody prepared in Preparation Example 1 to 2 ⁇ g / mL using the diluent for a fluorescent substance accumulation particle, and allowed to react at room temperature for 30 minutes.
  • the green PID staining solution prepared in Preparation Example 2 was dropped, and allowed to react at room temperature for 2 hours.
  • tissue slide on which the immunostaining A or B was performed was stained with Mayer's hematoxylin solution for 5 minutes to perform hematoxylin staining, and then washed with running water for 10 minutes.
  • the sample is irradiated with excitation light corresponding to Texas Red used for the fluorescent labeling of HER2 to emit fluorescence, and an immunostaining image of the state is photographed, Texas Red Among the bright spots representing the accumulated melamine particles, the number of bright spots having a predetermined value or more was measured.
  • the wavelength of excitation light was set to 575 to 600 nm using the optical filter for excitation light provided in a fluorescence microscope, and the wavelength of fluorescence to be observed was set to 612 to 692 nm using the optical filter for fluorescence.
  • the sample is irradiated with excitation light corresponding to FIFC used for the fluorescent label of HER3 to emit fluorescence, a fluorescence image of that state is taken, and the luminance is a predetermined value among the bright spots representing the FIFC accumulated melamine particles.
  • the number of things above was counted.
  • the wavelength of the excitation light was set to 470 to 495 nm using the excitation light optical filter provided in the fluorescence microscope, and the wavelength of the observed fluorescence was set to 510 to 550 nm using the fluorescence optical filter.
  • the sample is irradiated with excitation light corresponding to Phenylcoumarin used for fluorescent labeling of trastuzumab to cause the sample to emit fluorescence, and a fluorescence image of that state is photographed to show accumulated melamine particles Of the points, the number of points whose luminance was equal to or greater than a predetermined value was measured.
  • the wavelength of excitation light was set to 340 to 390 nm using the optical filter for excitation light provided in the fluorescence microscope, and the wavelength of fluorescence to be observed was set to 420 to 460 nm using the optical filter for fluorescence.
  • the intensity of excitation light at the time of observation with a fluorescent microscope and image shooting is adjusted so that the irradiation energy near the center of the field of view is 900 W / cm 2, and the exposure time at the time of image shooting is such that the image brightness is not saturated.
  • Range for example, 4000 .mu.sec.
  • the acquired fluorescence image and bright field image were superimposed by image processing, and the number of cells contained in each image and the bright spot indicating phosphor-accumulated particles labeled with HER2, HER3, or trastuzumab were measured, respectively.
  • the ratio of the number of cells including bright spots indicating phosphor-accumulated particles labeled with HER2 and HER3 or trastuzumab to the total number of cells included in the image was calculated.
  • the tumor volume increase rate is compared with the tumor volume increase rate of the control group (control mouse) derived from the same patient respectively, the ratio is calculated, and the treatment effect of trastuzumab is evaluated by the four-step treatment score based on the following criteria did.
  • FIG. 3 shows a graph in which the reaching cell rate of trastuzumab calculated in Experimental Example 2 is plotted on the horizontal axis, and the therapeutic effect of trastuzumab is plotted on the vertical axis.
  • the therapeutic effect in addition to quantifying HER2 (target molecule) in the tumor tissue before antibody drug administration, the therapeutic effect can be obtained by combining the expression level of target related molecule, blood concentration, and the arrival rate of antibody drug. It can be inferred that it can be evaluated. Specifically, since the arrival cell rate of the antibody drug and the treatment result are correlated, it is possible to predict the therapeutic effect with high accuracy by the arrival cell rate of the antibody drug. Moreover, in addition to the quantification of the target molecule, it is possible to more accurately predict the cell arrival rate of the antibody drug from the expression level of the target-related molecule and the blood concentration.
  • a tissue slide is prepared in the same manner as step (II), and HE is prepared in the same manner as in immunostaining A. Immunostaining was performed for R-2 and HER-3. A tissue slide was prepared in the same manner as step (III) and stained in the following procedure.
  • sample pretreatment The prepared FFPE tissue slide was deparaffinized and then washed with water. Thereafter, protease enzyme treatment (30 ° C., 5 min) and dehydration treatment were performed. To the tissue slide subjected to the sample pretreatment step, a particle solution prepared by mixing the blue PID staining solution prepared in Preparation Example 5, the above-mentioned detection side (detect) probe, and the denaturation solution (formamide / SSC solution etc.) is dropped. The hybridization reaction was carried out at 75 ° C. for 5 minutes and then at 37 ° C. for 16 hours. After stringency washing, it was sealed with DAPI solution, and the next step was observed. In the same manner as in Experimental Example 2, (observation, photographing, image processing) was performed.
  • the therapeutic effect of the antibody drug can be evaluated from the expression level of target molecule, the expression level of target related molecule, the blood concentration, and the arrival rate of drug X, and also based on such evaluation It can be said that the selection of the drug X in the field and the construction of a dosage plan can be made possible.

Abstract

本発明は、標的分子を特異的に認識する医薬の有効性を高精度に評価する方法を提供することを課題とする。標的分子に関する情報を得る工程（Ｐ）を含み、さらに、標的関連分子に関する情報を得るための工程（Ａ）、被験体の前記医薬の血中濃度を測定するための工程（Ｂ）、および前記医薬の到達細胞率を計測する工程（Ｃ）から選択される少なくとも１つの工程を含む（但し、工程（Ａ）のみ、および工程（Ｂ）のみを除く）評価方法により医薬の治療効果を評価することができる。

Description

医薬の評価方法
　本発明は、医薬を評価する方法に関する。
　がんの治療薬としては従来から低分子医薬品が広く用いられてきたが、近年ではより血漿中での安定性が高く、選択性や治療効果が高く副作用の少ない抗体医薬が数多く開発され、臨床に用いられている。中でもＩｇＧ型の抗体医薬は多数上市されており、これらはがん細胞に発現している抗原に上記ＩｇＧが結合すると、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、シグナル伝達の変化等により抗がん活性を発揮するという作用機序を有する。このようながん治療のための抗体医薬としては、これまでＣＤ２０抗原に対するリツキサン、ＥＧＦＲ抗原に対するセツキシマブ、ＨＥＲ２抗原に対するハーセプチン等が承認されている。
　また、特定の標的分子と結合するという、抗体と類似の性質を有するアプタマー医薬も注目されており、標的分子を特異的に認識する医薬はがん治療のための有効な手段と考えられている。
　標的分子を特異的に認識する医薬の有効性を判定する方法としては、標的となるがん細胞上の標的分子と医薬との相互作用等の情報を特定することが望まれる。例えば、乳がん治療における代表的な抗体医薬であるトラスツズマブ（ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）登録商標）の有効性の判定方法として、トラスツズマブの標的分子（抗原）であるＨＥＲ２タンパク質の発現情報の解析が広く行われており、その方法としては、例えば、標的生体物質のタンパク質を染色する免疫組織染色〔Immunohistochemistry；ＩＨＣ〕法および、標的生体物質遺伝子を染色するＦＩＳＨ〔Fluorescence in situ hybridization〕法などが用いられている。乳がんの検査においてＩＨＣ法を用いる場合には、検体に含まれるＨＥＲ２タンパク質をＤＡＢ（3,3'-Diaminobenzidine；３，３’－ジアミノベンジジン）を用いて染色して検出する方法が広く用いられている。しかし、その判定基準は染色レベルをスコア０～３とした４段階のみによる大雑把な判定基準であるため、定量性に欠けており、さらに病理医の熟練度により判定基準が左右されることから、臨床的に問題となっている。また、ＦＩＳＨ法を用いる場合には、１７番染色体上のＨＥＲ２タンパク質をコードする遺伝子を検出するプローブを用いて当該遺伝子を蛍光染色する方法が広く用いられている。ＦＩＳＨ法は定量的検査法ではあるが、ＨＥＲ２タンパク質の量や細胞内局在を直接評価する方法ではない。
　近年、タンパク質の発現量や細胞内局在をより正確に評価するため、ナノサイズの蛍光粒子、例えば樹脂等を母体として蛍光色素や量子ドットなどの蛍光体を集積させた粒子（蛍光体集積粒子、Phosphor Integrated Dot：ＰＩＤ）を用いて目的タンパク質を標識する染色方法が提案され、実用化が進められている。蛍光体集積粒子（他の文献において「蛍光体集積ナノ粒子」、「蛍光体内包粒子」等と呼ばれることもある。）を用いて目的タンパク質を標識し、粒子内に集積している蛍光体に適合する励起光を照射することで目的タンパク質を輝度の高い輝点として観察することが可能であり、また褪色しにくいため比較的長時間にわたって観察や撮像が可能となる。特許文献１、特許文献２には、蛍光体集積粒子を用いた免疫染色を行う方法が記載されている。
　さらに特許文献３には、蛍光体集積粒子により標識化した抗体医薬である抗体（トラスツズマブ等）を用い、その標的とする抗原（ＨＥＲ２等）に結合させることで行う、組織染色法が記載されており、さらにこのような方法が抗体医薬の有効性を判定する方法に応用できることが記載されている。
国際公開第２０１３／０３５７０３号 国際公開第２０１２／０２９７５２号 国際公開第２０１２／１３３０４７号
　本発明は、上記に鑑みてなされたものであり、標的分子を特異的に認識する医薬（以下、医薬Ｘともいう）の有効性を高精度に評価する方法を提供することを目的とする。
　本発明者は、標的分子に関する情報、標的関連分子に関する情報、医薬Ｘの血中濃度、および医薬Ｘの到達細胞率などを組み合わせて解析を行うことにより、医薬Ｘの治療効果を評価できることを見出した。
　すなわち、本発明は次のような医薬の評価方法を提供する。
　[項１]
　標的分子を特異的に認識する医薬の評価方法であって、前記標的分子に関する情報を求める工程（Ｐ）を含み、さらに、
　下記工程（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）から選択される少なくとも１つの工程（但し、工程（Ａ）のみ、および工程（Ｂ）のみを除く）を含む、医薬の評価方法。
（Ａ）標的関連分子に関する情報を得る工程
（Ｂ）被験体における前記標的分子を特異的に認識する医薬の血中内濃度を測定する工程
（Ｃ）前記標的分子を特異的に認識する医薬の到達細胞率を算出する工程
　[項２]
　前記標的関連分子に関する情報が、標的関連分子の発現量に関する情報および標的関連分子の局在に関する情報の少なくとも一方を含む、項１に記載の医薬の評価方法。
　[項３]
　前記標的分子に関する情報が標的分子の発現量に関する情報および標的分子の局在に関する情報の少なくとも一方を含む、項１または２に記載の医薬の評価方法。
　[項４]
　前記標的分子が、ＨＥＲ２、ＣＴＬＡ４、ＥＧＦＲ、ＰＤ－１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＶＥＧＦ、またはＶＥＧＦＲである、項１～３のいずれか一項に記載の医薬の評価方法。
　[項５]
　前記標的分子を特異的に認識する医薬が抗体医薬である項１～４のいずれか一項に記載の医薬の評価方法。
　[項６]
　前記工程（Ｃ）が、ＥＬＩＳＡを用いて抗体医薬の血中濃度を定量化する工程である、項１～５のいずれか一項に記載の医薬の評価方法。
　[項７]
　前記標的分子を特異的に認識する医薬が核酸医薬である項１～４のいずれか一項に記載の医薬の評価方法。
　[項８]
　前記標的分子が、ＰＤＧＦ－Ｂ、Ｃ５、ＭＣＰ－１、ＳＤＦ－１、Ｈｅｐｃｉｄｉｎ、ＲＴＰ８０１、Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ、トランスサイレチン、またはＨＳＰ４７である、項７に記載の医薬の評価方法。
　本発明の評価方法により、医薬Ｘの治療効果を予測・評価することができ、医薬Ｘを用いた診断または治療のための有用な情報を取得できるようになり、投与適応患者をより正確に選定することが可能となり、また適切な投薬計画を構築することが可能となる。
図１は実験例１で行ったトラスツズマブの血中濃度の測定結果をプロットしたグラフである。高濃度群の結果はそれぞれ黒丸で示され低濃度群の結果はそれぞれ白丸で示されている。 図２は検体をトラスツズマブ血中濃度に基づき高濃度群および低濃度群に分け、さらに高濃度群についてＨＥＲ３高発現群およびＨＥＲ３低発現群に分け、それぞれの群においてＨＥＲ２＋細胞の割合とトラスツズマブ到達細胞率をプロットしてグラフ化したものである。実線（太）が血中濃度高－ＨＥＲ３低発現群における線形近似曲線、実線（細）が血中濃度高－ＨＥＲ３高発現群における線形近似曲線、点線が血中濃度低濃度群における線形近似曲線を示す。 図３は各検体におけるトラスツズマブの到達細胞率とトラスツズマブの治療スコアをプロットし、線形近似によりグラフ化したものである。
＜標的分子を特異的に認識する医薬＞
　本発明における標的分子を特異的に認識する医薬（医薬Ｘ）は、タンパク質などの特定の分子を標的として認識する仕組みを利用した医薬であり、典型的な例として抗体医薬、核酸医薬、ペプチドアプタマーなどが挙げられる。中でも被験体血中での安定性が高いことから、核酸医薬、または抗体医薬が好ましく、抗体医薬がより好ましい。
　本発明における抗体医薬は、抗原を認識する抗体（免疫グロブリン）を主成分とする医薬品である。本明細書における「抗体」という用語には、全長の抗体だけでなく、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの抗体断片およびキメラ抗体（ヒト化抗体等）、多機能抗体、Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＡＤＣ）などの誘導体が包含される。
　本発明における核酸医薬は、天然型または化学修飾型ヌクレオチドを基本骨格とする医薬であり、遺伝子発現を介さずに直接生体に作用し、化学合成により製造されることを特徴とする。本発明に適応可能な核酸医薬は核酸アプタマー、デコイ、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、ｍｉＲＮＡ－ｍｉｍｉｃなどがあげられるが、標的分子であるタンパク質を特異的に認識できることから核酸アプタマーが好ましい。
　アプタマーは、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）アプタマーとペプチドアプタマーに大別することができ、本発明では核酸アプタマー、ペプチドアプタマーのいずれであっても用いることができるが、アプタマー医薬開発に際してオリゴ核酸が入手容易であることから、核酸アプタマーが好ましい。
＜医薬Ｘの評価方法＞
　本発明は、医薬Ｘの評価方法であって、標的分子に関する情報を得る工程（Ｐ）を含み、さらに、標的関連分子に関する情報を得るための工程（Ａ）、被験体の前記医薬Ｘの血中濃度を測定するための工程（Ｂ）、および医薬Ｘの前記到達細胞率を計測する工程（Ｃ）から選択される少なくとも１つの工程を含む。ただし本発明においては、工程（Ａ）のみ、および工程（Ｂ）のみを行う様態のものは含まれない。
　工程（Ｐ）および工程（Ａ）は医薬Ｘ投与前の被験体に由来する検体に対して行われる工程であり、それぞれ同一の検体（組織切片等）に対して行われることが好ましい。工程（Ｂ）および工程（Ｃ）は医薬Ｘ投与後の被験体に由来する検体に対して行われる工程である。なお、各工程における検体は同一の被験体に由来する検体である。換言すると工程（Ｐ）および工程（Ａ）を行うための検体を採取した医薬Ｘ投与前の被験体に医薬Ｘを投与した後、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）を行うための検体を採取する。
　本発明における工程（Ｐ）、工程（Ａ）および、工程（Ｃ）は、それぞれ標的分子、標的関連分子、医薬Ｘを「定性的」ではなく「定量的」に観察できるという観点から、蛍光体集積粒子（ＰＩＤ）を用いた染色法により行うことが好ましく、特に医薬Ｘが抗体医薬である場合には免疫染色法により行うことが好ましい。具体的には標的分子、標的関連分子、抗体医薬を特異的に認識して結合するＩｇＧに、ＰＩＤを結合させたものを用いて免疫染色を行ってもよいし、標的分子、標的関連分子、抗体医薬を特異的に認識して結合するＩｇＧおよび抗体を特異的に認識して結合するＩｇＧにＰＩＤを結合させたものを用いて免疫染色を行ってもよい。
　工程（Ｐ）、工程（Ａ）および、工程（Ｃ）のうち複数の工程においてＰＩＤを用いた免疫染色を行う場合、各工程においてはそれぞれ異なる波長の蛍光を発するＰＩＤを用いることが好ましい。
　本発明における被験体はヒト（がん患者またはがんの罹患が疑われる者）であってもよいし、またヒト以外の動物であってもよい。ヒト以外の動物としては、例えば実験動物、典型的には担腫瘍動物、好ましくは担腫瘍マウスを用いることができる。担腫瘍マウスとして具体的には、ヒトから採取したがん細胞または腫瘍組織を獲得免疫不全マウスに移植することにより作製する、ＰＤＸ［Patient derived xenograft］モデルマウス、Ｉｍｍｕｎｏ－ａｖａｔａｒモデルマウス、造血リンパ系ヒト化［Hemato-lymphoid humanized］モデルマウス、Ｉｍｍｕｎｅ－ＰＤＸモデルマウスや、被験体から採取した腫瘍細胞に由来する培養細胞を獲得免疫不全マウスに移植することにより作製する、ＣＤＸ［Cell-line derived xenograft］モデルマウスなどが挙げられる。
　前記担腫瘍マウスは、ヒト（がん患者）から採取した腫瘍（がん）組織または腫瘍細胞、あるいは患者から取り出した腫瘍細胞に由来する培養細胞が移植された第０世代の実験動物、およびそのような第０世代に移植された腫瘍組織または腫瘍細胞を起源とする、第ｎ－１世代の実験動物の体内で生長した腫瘍組織または増殖した腫瘍細胞が移植された第ｎ世代（ｎ≧１）の実験動物を包含する。
　なお、本発明において評価の対象となる医薬Ｘは特に限定されるものではないが、適応疾患としてがんが含まれるものが好ましく、すでに上市され、臨床において用いられている医薬Ｘでもよいし、または臨床試験や治験において用いられる候補医薬としての医薬Ｘでもよい。
　例えば抗体医薬の上市品として具体的には、ヒト化抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、抗ＣＤ３０モノクローナル抗体ブレンツキシマブ、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体ベバシズマブ、ヒト化抗ＣＤ３３抗体ゲムツズマブ、ヒト化抗ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブとニボルマブ、抗ＣＴＬＡ－４イピリムマブモノクローナル抗体等が挙げられる。
　核酸アプタマー医薬としては具体的には、ＰＤＧＦ－Ｂを標的とするＥ１００３０（Ｆｏｖｉｓｔａ（登録商標））、Ｃ５を標的とするＡＲＣ１９０５（Ｚｉｍｕｒａ（登録商標））、ＭＣＰ－１を標的とするＮＯＸ－Ｅ３６（Ｅｍａｏｔｉｃａｐ　Ｐｅｇｏｌ）、ＳＤＦ－１を標的とするＮＯＸ－Ａ１２（Ｏｌａｐｔｅｓｅｄ　Ｐｅｇｏｌ）、Ｈｅｐｃｉｄｉｎを標的とするＮＯＸ－Ｈ９４（Ｌｅｚａｐｔｅｉｄ　Ｐｅｇｏｌ等が挙げられる。
　ｓｉＲＮＡ医薬としては具体的には、ＲＴＰ８０１を標的とするＰＦ－６５５、Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄを標的とするＡＬＮ－ＲＳＶ０１、ＨＳＰ４７を標的とするＮＤ－Ｌ０２－ｓ０２０１等が挙げられる。
　＜工程（Ｐ）＞
　本発明において工程（Ｐ）は、腫瘍組織由来の検体における標的分子に関する情報を得る工程であり、標的分子の発現量に関する情報および標的分子の局在に関する情報の少なくとも一方を含むことが好ましく、両方を含むことがより好ましい。前記標的分子の発現量に関する情報としては、例えば検体（組織スライド）における、標的分子を発現している細胞の種類・数・形態、検体における標的分子の単位面積あたりまたは１細胞あたりの発現量、標的分子の細胞あたりの発現量とそれに対応する細胞数によって表されるヒストグラムや曲線、などが挙げられる。前記標的分子の局在に関する情報としては、検体中における標的分子の局在、特定細胞群（例えば、がん細胞群）の注目領域内(ROI：region of interest) における局在などが挙げられる。これらの情報は、画像（デジタル画像として変換されたものを含む）として取得された情報に基づく情報であることが好ましく、さらに定量的なものであることが好ましい。発現状態の情報は上記のいずれか一つだけでなく、複数が組み合わされたものであってもよい。
　本明細書において標的分子は、医薬Ｘの標的となる生体分子であり、典型的には医薬Ｘの構成成分である抗体や核酸等と特異的に結合するタンパク質（抗原）である。標的分子は腫瘍組織に存在し得るタンパク質であれば特に限定されず、例えば、免疫系タンパク質、がん細胞増殖因子，転移制御因子、血管増殖因子、サイトカイン、がん細胞増殖制御因子受容体、転移制御因子受容体、血管増殖因子受容体、およびサイトカイン受容体が挙げられ、好ましくシグナル伝達経路に関与する分子であることが好ましく、増殖シグナル伝達経路に関与する分子であることがより好ましい。本発明において標的分子としては、具体的には例えば、ＨＥＲ２、ＣＴＬＡ４、ＥＧＦＲ、ＰＤ－１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＶＥＧＦ、またはＶＥＧＦＲ等が挙げられる。また、医薬Ｘが核酸医薬である場合には、標的分子としては、具体的には例えば、ＰＤＧＦ－Ｂ、Ｃ５、ＭＣＰ－１、ＳＤＦ－１、Ｈｅｐｃｉｄｉｎ、ＲＴＰ８０１、Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ、トランスサイレチン、またはＨＳＰ４７等が挙げられる。
　＜工程（Ａ）＞
　本発明における工程（Ａ）は、腫瘍組織由来の検体を用いて標的関連分子に関する情報を得る工程であり、標的関連分子の発現量に関する情報および標的関連分子の局在に関する情報の少なくとも一方を含むことが好ましく、両方を含むことがより好ましい。前記工程（Ａ）は前記工程（Ｐ）で用いた検体と同じものを用いてもよいし、別のものを用いてもよいが、好ましくは前記工程（Ｐ）で用いた検体を用いて工程（Ａ）を行うことが好ましい。
　なお、本発明の医薬Ｘの評価方法において工程（Ａ）は上記工程（Ｐ）と、後述する工程（Ｂ）および工程（Ｃ）の少なくとも一方、好ましくは両方と、組み合わせて行われる。
　前記標的関連分子の発現量に関する情報としては、例えば検体（組織スライド）における、標的関連分子を発現している細胞の種類・数・形態、検体における標的関連分子の単位面積あたりまたは１細胞あたりの発現量、標的関連分子の細胞あたりの発現量とそれに対応する細胞数によって表されるヒストグラムや曲線、などが挙げられ、標的関連分子の局在に関する情報としては、検体中における標的関連分子の局在、特定細胞群（例えば、がん細胞群）の注目領域内(ROI：region of interest) における局在などが挙げられる。これらの情報は、画像（デジタル画像として変換されたものを含む）として取得された情報に基づく情報であることが好ましく、さらに定量的なものであることが好ましい。発現状態の情報は上記のいずれか一つだけでなく、複数が組み合わされたものであってもよい。
　本明細書において標的関連分子は、典型的には腫瘍細胞において標的分子が関与しているシグナル伝達経路に関与する分子であり、具体的には以下のように選択される。標的分子としてＨＥＲ２を選択するとき、標的関連分子は、ＨＥＲ３、ＥＧＦ、ＧＲＢ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＰＮ１１、ＥＧＦＲ、ＧＲＢ７、およびＢＴＣから選択されることが好ましい。標的分子としてＣＴＬＡ４を選択するとき、標的関連分子は、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＦＯＸＰ３、ＦＹＮ、ＰＴＰＮ１１、ＬＣＫ、ＮＦＡＴＣ２、ＡＫＴ１、ＩＣＯＳＬＧ、およびＬＹＮから選択されることが好ましい。標的分子としてＥＧＦＲを選択するとき、標的関連分子は、ＥＧＦ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＧＲＢ２、ＳＨＣ１、ＴＰ５３、ＣＢＬ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＴＧＦＡ、およびＰＴＰＮ１１から選択されることが好ましい。標的分子としてＰＤ－１を選択するとき、標的関連分子は、ＣＤ２７４、ＰＤＣＤ１ＬＧ２、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰＮ６、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＬＣＫ、ＣＤ４、およびＣＤ３Ｅから選択されることが好ましい。標的分子としてＰＤＧＦＲＡを選択するとき、標的関連分子は、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＣ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＳＴＡＴ３、ＣＲＫＬ、ＣＲＫ、ＰＤＧＦＢ、ＳＴＡＴ１、ＰＴＰＮ１１、およびＧＲＢ２から選択されることが好ましい。標的分子としてＰＤ－Ｌ１を選択するとき、標的関連分子は、ＰＤＣＤ１、ＰＴＰＮ１１、ＰＤＣＤ１ＬＧ２、ＬＣＫ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ４、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ、およびＣＤ３Ｇから選択されることが好ましい。標的分子としてＶＥＧＦを選択するとき、標的関連分子は、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＨＩＦ１Ａ、ＦＬＴ４、ＥＧＦ、ＴＨＢＳ１、ＩＧＦ１、ＨＧＦ、ＴＧＦＢ１、およびＰＩＫ３ＣＡから選択されることが好ましい。標的分子としてＶＥＧＦＲを選択するとき、標的関連分子は、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＡ、ＣＤＨ５、ＦＩＧＦ、ＮＲＰ１、ＦＧＦ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＣＲＫ、およびＮＯＳ３から選択されることが好ましい。
　＜工程（Ｂ）＞
　本発明における工程（Ｂ）は、被験体の前記医薬Ｘの血中濃度を測定する工程である。
　なお、本発明の医薬Ｘの評価方法において工程（Ｂ）は上記工程（Ｐ）と、工程（Ａ）および工程（Ｃ）の少なくとも一方、好ましくは両方と、組み合わせて行われる。
　測定方法は特に限定されず、一般的な方法を用いることができ、被験体から採取した血液から遠心分離等により分離した血漿を検体として用い、測定された血漿内濃度を血中濃度とみなすことで、より正確な血中濃度を得ることができる。
　前記医薬Ｘが抗体医薬である場合は、ＥＬＩＳＡを用いることが好ましい。
　前記医薬Ｘが核酸医薬である場合は、核酸が相補鎖と二本鎖を形成する特性を利用するハイブリダイゼーション法を用いることが好ましい。核酸アプタマーの場合、核酸アプタマーの半分の配列と相補的な配列を固定用プローブ、残りの半分の配列を検出用プローブとして用いて、核酸アプタマーをハイブリダイゼーションさせることにより、その濃度を求める。
　＜工程（Ｃ）＞
　本発明における工程（Ｃ）は、医薬Ｘの到達細胞率を算出する工程である。
　前記医薬Ｘの到達細胞率の算出は、組織内に取り込まれた医薬Ｘを可視化することにより行われることが好ましい。例えば、抗体医薬を投与した被験体から採取した、該抗体医薬の適応疾患に係る病変部（例えば腫瘍部）の組織から作製した組織切片を検体とした、蛍光体集積粒子（ＰＩＤ）を用いた免疫染色法により行われることが好ましい。例えば、抗体医薬として用いられる抗体を特異的に認識して結合する二次抗体にＰＩＤを直接的または間接的に結合させたものを用いて染色することができ、具体的にはヒト化抗ＨＥＲ２抗体であるトラスツズマブを抗体医薬として用いる場合には抗ヒトＩｇＧ抗体にＰＩＤを結合させたものを用いて染色を行うことで組織内のトラスツズマブを染色することができる。また、ヒトＨＥＲ２を認識する核酸アプタマーを核酸医薬として用いる場合には、核酸アプタマーに相補的な配列を有する核酸プローブにＰＩＤを結合させたものを用いて染色することができ、または第一生体物質を結合させた前記核酸プローブと、前記第一生体物質を特異的に認識して結合する第二生体物質にＰＩＤを直接的または間接的に結合させたものとを用いて染色することができる。
　さらに、前記蛍光体集積粒子（ＰＩＤ）によって染色した検体に対してさらに明視野観察用の染色を行うことで、検体中の細胞数を併せて測定することができる。明視野観察用染色方法としては特に限定されないが、典型的にはヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）が行われる。このような明視野観察用染色を行う場合は、免疫染色工程の後に行うようにしてもよいし、免疫染色工程の前に行うようにしてもよい。細胞数の計測はソフトウェア等を用いてデジタル的に計測してもよいし、また目視で計測してもよい。このように検体全体または単位面積（または体積）に含まれる、トラスツズマブが染色された細胞数および全細胞数を計測することで、そこから全細胞数に対する輝点が観察された細胞数（抗体医薬が到達した細胞）の割合、すなわち抗体医薬の到達細胞率を算出することができる。また、抗体医薬が到達した細胞における、一細胞あたりの輝点数を併せて算出してもよい。
　（検体）
　本発明の評価方法は、以下のような検体を用いて、被験体の生体外において実施される。
　工程（Ｂ）において用いられる検体（本明細書においては検体（ｉ）とする）は、医薬Ｘを投与された被験体の血液に由来するものであり、常法に従って採取した被験体の血液に対し遠心分離または科学的処理を行うことで分離した血漿であることが好ましい。検体（ｉ）は、さらに工程（Ｂ）で行う測定方法に従い適宜処理を行われたものであることが好ましく、また保存や測定の最適化のために適当な添加剤等を含んでいてもよい。
　工程（Ｐ）、工程（Ａ）において用いられる検体（本明細書においては検体（ｉｉ）とする）、および工程（Ｃ）において用いられる検体（本明細書においては検体（ｉｉｉ）とする）とは、被験体から採取された組織切片や、被験体から採取された組織に含まれる細胞を培養した細胞であって、一般的には、免疫染色法により目的タンパク質の発現量を評価する場合などで慣用されているような、前記組織切片や細胞を載置した標本スライドの形態をとることが好ましい。なお、本明細書においては組織切片を載置した標本スライドを特に組織スライドと称する。
　検体（ｉｉ）は医薬Ｘ投与前の被験体に由来する。
　検体（ｉｉｉ）は医薬Ｘ投与後の被験体に由来する。
　前記検体は、好ましくは病変組織由来、特に腫瘍組織由来である。「腫瘍組織」は、被験体から常法にしたがって採取した、がん細胞を含む組織であって、がん細胞に加えて、例えば正常細胞、血管、間質細胞（線維芽細胞、内皮細胞、白血球（リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球）等）等が含まれ得る。
　「腫瘍」は、典型的には固形腫瘍（がん）であり、特に限定されるものではないが、例えば、細胞腫、黒色腫、肉腫、脳腫瘍、頭頸部がん、胃がん、肺がん、乳がん、肝がん、大腸がん、子宮頸がん、前立腺がん、膀胱がんなどの固形がん、白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫、などが挙げられる。
　なお、「腫瘍組織由来の検体」とは、腫瘍を有する（または腫瘍を有する疑いのある）被験体の病変部から採取された腫瘍組織切片やがん細胞塊、または前記被験体から採取された腫瘍組織に含まれる腫瘍細胞を培養した細胞であり、好ましくは上述したような標本スライドの形態をとる。「腫瘍組織由来の検体」が腫瘍組織切片である場合、該検体には腫瘍組織に加えて周辺の正常組織も含まれ得る。本明細書においては腫瘍組織由来の検体中における腫瘍組織(がん細胞)を含む領域を「腫瘍領域」と称する。
　組織切片および標本スライドの作製法は特に限定されず、一般的には、例えば、被験体から採取した組織を、ホルマリン等を用いて固定し、アルコールで脱水処理した後、キシレン処理を行い、高温のパラフィン中に浸すことでパラフィン包埋を行うことで作製した組織試料を３～４μｍの切片にすることで得ることができ、該組織切片をスライドガラス上に載置して乾燥することで標本スライド（組織スライド）を作製することができる。
　（免疫染色）
　上述したように本発明における工程（Ｐ）、工程（Ａ）は、蛍光体集積粒子（ＰＩＤ）を用いた免疫染色法によりおこなわれることが好ましい。また、医薬Ｘが抗体医薬である場合、工程（Ｐ）、工程（Ａ）だけでなく、工程（Ｃ）も蛍光体集積粒子（ＰＩＤ）を用いた免疫染色法によりおこなわれることが好ましい。以下、本発明における実施態様の1例として、腫瘍組織由来の検体、具体的には腫瘍組織切片から作製した組織スライドを使用して、ＰＩＤを用いた免疫染色法の一例についてさらに詳細に説明する。
　（１．標本スライド前処理工程）
　　（１－１．脱パラフィン処理）
　キシレンを入れた容器に、切片を浸漬させ、パラフィン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
　次いでエタノールを入れた容器に切片を浸漬させ、キシレン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
　水を入れた容器に、切片を浸漬させ、エタノール除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
　　（１－２．賦活化処理）
　公知の方法に倣い、目的物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、０．０１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）、５％尿素、０．１Ｍのトリス塩酸緩衝液などを用いることができる。加熱機器はオートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバスなどを用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は５０～１３０℃、時間は５～３０分で行うことができる。
　次いでＰＢＳを入れた容器に、賦活化処理後の切片を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。
　（２．免疫染色工程）
　免疫染色工程では、目的物質（例えば工程（Ｐ）における標的分子）を染色するために、目的物質に直接的または間接的に結合しうる部位を有する蛍光体集積粒子を希釈液に分散させた染色液を、組織切片に載せて、目的物質との反応を行う。
　例えば、［アビジン］－［蛍光体集積粒子］を含有した染色液を用いる実施形態の場合、最初に一次抗体の溶液を組織スライドに滴下する処理を行い、次に二次抗体－ビオチン結合体の溶液を組織切片に滴下する処理を行い、最後にＰＩＤ染色液剤を組織切片に滴下する処理を行えばよい。このとき、染色後においては目的物質と蛍光体集積粒子とが、［目的物質］…［目的物質に対する一次抗体］…［一次抗体に対する抗体（二次抗体）］－［ビオチン］／［アビジン］－［蛍光体集積粒子］（ここで“…”は抗原抗体反応により結合していることを表し、“－”は必要に応じてリンカー分子を介していてもよい共有結合により結合していることを表し、“／”はアビジン・ビオチン反応により結合していることを表す。）となる。
　免疫染色工程を行う上での条件、例えば組織スライドに染色液を滴下して反応させる際の温度および時間、組織スライドの洗浄時間などは、従来の免疫染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。
　温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、３０分以上２４時間以下であることが好ましい。
　上述したような１次反応処理を行う前に、ＢＳＡ含有ＰＢＳなど公知のブロッキング剤やＴｗｅｅｎ２０などの界面活性剤を滴下することが好ましい。
　（３．標本後処理工程）
　免疫染色工程を終えた組織スライドは、観察に適したものとなるよう、固定化・脱水、透徹、封入などの処理を行うことが好ましい。
　固定化・脱水処理は、組織スライドを固定処理液（ホルマリン、パラホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、アセトン、エタノール、メタノール等の架橋剤）に浸漬すればよい。透徹は、固定化・脱水処理を終えた組織スライドを透徹液（キシレン等）に浸漬すればよい。封入処理は、透徹処理を終えた組織スライドに封入液を滴下すればよい。これらの処理を行う上での条件、例えば組織スライドを所定の処理液に浸漬する際の温度および浸漬時間は、従来の免疫染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。
　（４．任意工程）
　本発明の一実施形態として工程（Ｃ）を行わない場合においても、もしも必要であれば、明視野観察用の染色を行うことができる。明視野観察用染色方法としては特に限定されないが、典型的にはヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）が行われる。形態観察染色工程を含める場合は、免疫染色工程の後に行うようにしてもよいし、免疫染色工程の前に行うようにしてもよい。
　（５．評価工程）
　　（５－１．観察・撮影）
　観察・撮影工程では、所望の倍率における顕微鏡の同一視野において、免疫染色工程に用いられた目的物質を蛍光標識している蛍光体集積粒子に対応した励起光それぞれを標本サンプルに照射し、それらの蛍光体集積粒子から発せられた蛍光による免疫染色像それぞれを観察・撮影する。これらの励起光は、例えば、蛍光顕微鏡が備える超高圧水銀灯、Ｘｅランプ、ＬＥＤ（light emitting diode）、レーザー装置等の光源と、必要に応じて所定の波長を選択的に透過させる励起光用光学フィルターを用いることで照射することができる。互いに異なる蛍光体集積粒子を含む複数の染色液をもちいて免疫染色を行なったときは、それぞれの蛍光体集積粒子に対応した複数種類のフィルターセットを切り替えながら観察を行なう。免疫染色像の撮影は、例えば、蛍光顕微鏡が備えるデジタルカメラによって行うことができる。免疫染色像の撮影の際には、必要に応じて所定の波長を選択的に透過させる蛍光用光学フィルターを用いることで、目的とする蛍光のみを含み、目的としない蛍光やノイズとなる励起光およびその他の光を排除した免疫染色像を撮影することができる。
　　（５－２．画像処理・シグナル計測）
　画像処理・計測工程では、目的物質に関して撮影された免疫染色像について、画像処理に基づき、目的物質に対応する蛍光標識シグナルに対応する蛍光標識シグナルを計測し、細胞膜の領域内にある前記目的生体物質に対応する蛍光標識シグナルを特定する。蛍光標識シグナルは、蛍光の輝点数として扱うことが好ましい。
　画像処理に用いることができるソフトウェアとしては、例えば「ＩｍａｇｅＪ」（オープンソース）が挙げられる。このような画像処理ソフトウェアを利用することにより、免疫染色像から、所定の波長（色）の輝点を抽出してその輝度の総和の算出、所定の輝度以上の輝点の数の計測、複数の画像を重ね合わせる処理、画像に含まれる細胞数を計測する処理などを半自動的に、迅速に行うことができる。
　また、輝点は蛍光体集積粒子１個に由来するので、大きさが一定であり顕微鏡観察で認識できる。大きさが一定値（例；観測される蛍光体集積粒子の平均値）より大きなシグナルは凝集輝点と判断する。この輝点と凝集輝点は、ソフトウェアを用いて半自動的に迅速に区別することができる。
　（抗体）
　本発明の評価方法における各工程において上述したような免疫染色を行う場合、用いる抗体は特異性の観点からモノクローナル抗体が好ましく用いられる。抗体を産生する動物（免疫動物）の種類は特に限定されるものではなく、従来と同様、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどから選択すればよい。
　また前記抗体は、検出の目的となる物質（例えば工程（Ｐ）においては標的タンパク質）を特異的に認識して結合する能力を有するものであれば、天然の全長の抗体でなく、抗体断片または誘導体であってもよい。
　（医薬Ｘが核酸医薬である場合の組織染色）
　医薬Ｘが核酸医薬である場合、本発明における工程（Ｃ）は、核酸プローブ試薬を用いた染色法（ＦＩＳＨ）によりおこなわれることが好ましい。以下、本発明における実施態様の1例として、腫瘍組織由来の検体、具体的には腫瘍組織切片から作製した組織スライドを使用して、核酸プローブ試薬を用いた染色法の一例についてさらに詳細に説明するが、染色の方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。
　（１．核酸プローブの調製）
　目的とする核酸医薬に対して相補的な配列を有する核酸分子であれば、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、また効率的にハイブリダイズするように配列の長さも適宜選択することができる。
　（２．第１生体分子が結合した核酸プローブの調製）
　第１生体分子を核酸分子に結合させる方法としては、第１生体分子を有する核酸基質を使用した、ＰＣＲラベリング法、ニックトランスレーション法、ランダムプライム法を使用することができる。ＰＣＲラベリング法では、核酸分子を鋳型として第１生体分子（例；ビオチン等）で標識された核酸基質（例；ｄＵＴＰ－ビオチン等）を使用したＰＣＲを行うことで核酸分子を第１生体分子で標識することができる。ニックトランスレーション法では、第１生体分子で標識された核酸基質（例；ｄＵＴＰ－ビオチン等）を使用してニックトランスレーションを行うことにより核酸分子を第１生体分子で標識することができる。または、ランダムプライム法では、長さの異なるプライマーを鋳型となる核酸分子に２本鎖を形成させて、これにクレノー酵素を第１生体分子で標識された核酸基質（例；ｄＵＴＰ－ビオチン）等の存在下で作用させることにより、核酸分子を第１生体分子で標識することができる。
　第一生体分子としては低分子であるビオチン・FITC・Cy5・DNP・DIG等のハプテンを挙げることができる。
　（３．脱パラフィン処理工程）
　キシレンまたはその他の脱パラフィン剤を入れた容器に検体スライド上の組織切片を浸漬させ、パラフィンを除去する。このときの温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。次いで、エタノールを入れた容器に該切片を浸漬させ、キシレンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。次いで、水を入れた容器に該切片を浸漬させ、エタノールを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
　（４．検体スライドの前処理）
　プローブをハイブリダイゼーション反応に供する前に、前処理（加熱処理、酸処理）、酵素処理による処理など、プローブ試薬が効率的に組織切片上の核酸に到達できるようにするための前処理を施すことが知られている。これらの処理条件や組合せは、切片の種類・厚さ・スライド調整条件などにより、最適条件が異なるので、適宜手順を決定する必要がある。すべての処理を必ず実施する必要があるわけではなく、例えば酵素処理を実施しないという選択肢もありうる。
　まず、公知の方法にならい、ＦＩＳＨを行う検体スライドの前処理を行う。前処理条件に特に定めはないが、例えば次のような手順で行うことができる。まず、検体スライドを塩酸（０．２ｍоｌ／Ｌ程度）に一定時間浸漬する。その後、水に浸漬し、さらに洗浄緩衝液（２×ＳＳＣ：ｓｔａｎｄａｒｄ　ｓａｉｌｉｎｅ　ｃｉｔｒａｔｅ）に浸漬して洗浄する。次に、加熱したＮａＳＣＮ溶液（例えば１Ｎ程度）に一定時間浸漬する。その後、水に浸漬し、さらに洗浄緩衝液に浸漬して洗浄し、これと同じ操作を２回繰り返す。また、前処理液として、上記のような２種類の溶液に変えて、０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）、５％尿素、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液等を用い、加熱下に行うこともできる。加熱機器は、オートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバス等を用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、温度は５０－１３０℃、時間は５分以上３０分以下で行うことができる。
　続いて、加水分解酵素（プロテアーゼ）を用いて、例えば以下のような手順で、細胞膜および核膜のタンパク質、特にコラーゲンを除去する酵素処理を行う。
　まず、検体スライドをプロテアーゼ溶液に一定時間浸漬する。次いで、洗浄緩衝液に浸漬して洗浄し、この操作を２回繰り返す。
　その後、検体スライドを風乾等により乾燥させる。なお、風乾に代えて７０～１００％のエタノールを使用した公知の脱水処理を行ってもよい。
　プロテアーゼとしては、タンパク質の加水分解に適したプロテイナーゼ、例えばペプシン、プロテイナーゼＫ等がしばしば使用される。なお、脱タンパク質の効率をどうするかは、ハイブリダイゼーション、すなわち、目的とする染色体との反応を最高にするプロテアーゼ濃度と分解時間との組合せを検討した上で、形態学的詳細(morphological detail)が損なわれないような条件設定で行われる。なお、最適の条件は組織型及び固定方法により異なる。また、プロテアーゼ処理後の付加的固定は有用である。
　上記の酵素処理の後など必要であれば前処理の各ステップで、検体スライドを固定するため、例えば以下のような手順の処理を行う。まず、検体スライドをホルマリン溶液に一定時間浸漬する。次いで、洗浄緩衝液に浸漬して洗浄し、この操作を２回繰り返す。その後、検体スライドを風乾等により乾燥させる。
　なお、固定処理は、通常、固定処理を全く実施せずに染色してみて、切片が剥がれたと思われる工程の後ろで固定処理を実施するプロセスとして追加し改善するため、全く実施しなくともよい場合もあれば、数か所で実施する場合もありうる。したがって、前処理以外の各ステップ以外のステップでも、必要に応じて核染色の前後で固定処理を実施しても構わない。例えば、ハイブリダイゼーションの前および/または後に検体の固定処理を行ってもよい。
　（５．染色工程）
　　（５－１．ＤＮＡ変性処理）
　上記の固定処理の後、切片上に存在するＤＮＡを変性する（二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡにする）ため、例えば以下のような手順の処理を行う。まず、検体スライドを変性溶液（ホルムアミド／ＳＳＣ溶液等）に７２℃程度で所定の時間、浸漬する。その後、検体スライドを取り出し、ホルムアミドを除去するため、濃度を徐々に高めた数段階のエタノール（例えば７０％エタノール水溶液、８０％エタノール水溶液および１００％エタノール）に浸漬する。その後、検体スライドを風乾等により乾燥させる。
　（５－２．ハイブリダイゼーション処理）
　目的の核酸医薬に対して相補的な配列を有する核酸分子（核酸プローブ）を含むプローブ試薬を用いて、公知のＦＩＳＨ（例えば「アジレントＦＩＳＨ Ｇｅｎｅｒａｌ ＰｕｒｐｏｓｅＲｅａｇｅｎｔｓプロトコル」や、「臨床ＦＩＳＨプロトコール―目で見る染色体・遺伝子診断法 (細胞工学別冊―実験プロトコールシリーズ」等）と同様に、ハイブリダイゼーション処理を行うことができる。ここで、用語「ハイブリダイゼーション」は、二本鎖分子の形成のための二本のＤＮＡ又はＤＮＡとＲＮＡ相補鎖の結合過程、または形成された２本鎖の分子を意味する。
　上記ハイブリダイゼーションの１つの態様としては、先ず、核酸プローブと蛍光体集積粒子とが結合した複合体を含むプローブ試薬を用意し、該複合体をそれぞれ目的の核酸医薬に対して結合させるハイブリダイゼーションである。
　上記ハイブリダイゼーションの別の１つの態様としては、核酸プローブ溶液と蛍光体集積粒子分散液とを分けて有するプローブ試薬を用意して核酸プローブのみを最初に目的の核酸医薬に対してハイブリダイゼーションさせた後に、ハイブリダイズした核酸プローブに結合している前記第一生体分子であるハプテンに対して抗ハプテン抗体を結合させ、さらに該抗体の結合している第二生体分子に対して、蛍光体ナノ粒子に結合している第三生体分子を結合させる、抗原抗体反応を介した動的なハイブリダイゼーションである。第二生体分子は第一生体分子と同様にハプテンから選択することができ、同じハプテンを選択することはこのましくない。　第三生体分子としては、例えば、高分子であるストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジン等が挙げられる。このうち、ストレプアビジンを好適に用いることができる。
　なお、ハイブリダイゼーションに使用する核酸分子の種類は１種に限定されず、２種以上でもよい。
　また、目的の核酸医薬と相補鎖を形成した核酸プローブに対して蛍光体集積粒子をそれぞれ結合させることができれば、上記とは別のハイブリダイゼーションの態様であっても構わない。例えば、各結合（ハプテンー抗ハプテン抗体間の結合、前記プローブの第１生体分子－第２生体分子間の結合、第１結合基―第２結合基間の結合）、またはこれらの結合の組合せを利用して、核酸分子と蛍光体集積粒子とを直接にあるいは動的に結合してもよい。
　（５－３．核染色処理）
　ハイブリダイゼーション処理の後、通常はさらに、細胞数をカウントするための核染色処理を行う。核染色試薬としてはＤＡＰＩが一般的であるが、これ以外にもＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２などのビスベンズイミド誘導体やその他の核染色試薬を用いてもよい。例えば、核染色試薬としてＤＡＰＩを用いる場合は、次のような手順で核染色を行うことができる。まず、ハイブリダイゼーション処理を行った検体スライドを脱イオン水、リン酸液緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で順次洗浄する。次いで、ＤＡＰＩ染色試薬（２μｇ／ＰＢＳ）に一定時間浸漬する。
　（５－４．封入処理）
　ＦＩＳＨによる染色処理および核染色処理を終えた検体スライドは、ＰＢＳで数回洗浄し、風乾または脱水処理を行った後、組織切片上に封入剤を滴下し、カバーガラスを被せ、乾燥させる封入処理を行う。封入剤としては公知の油系封入剤（Entellan（登録商標）new等）または水系封入剤（Aquatex（登録商標）等）を使用することができる。以上の処理により作製された封入済みの検体スライドが、病理診断等を行うためのプレパラートとなる。
　（６．観察工程）
　（６－１．明視野観察）
　明視野観察は、細胞または組織内の染色対象とする細胞器官の分布情報を取得するために必要に応じて行われる。明視野観察は、一般的な方法として、例えば、上記染色後、ヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）や前述したようなＤＡＰＩ染色を行った後に顕微鏡で観察を行うことが好ましい。
　ＨＥ染色を行う場合、例えば、免疫染色した切片をマイヤーヘマトキシリン液で５分間染色してヘマトキシリン染色を行い、その後、該組織試料を４５℃の流水で３分間洗浄し、次に、１％エオシン液で５分間染色してエオシン染色を行う。
　なお、形態観察染色に用いられるエオジンは、明視野において観察できるだけでなく、所定の波長の励起光を照射した時に自家蛍光も発するので、適切な波長および出力の励起光を染色された組織試料に照射することで、蛍光顕微鏡によっても観察できる。
　一方、前記その他の染色として、例えば、乳がんにおけるＨＥＲ２タンパク質を検出対象の抗原として組織化学染色（ＤＡＢ染色等）をおこなった場合の明視野観察においては、適切な照明光の照射下で、光学顕微鏡の４倍対物レンズを使用して、検体組織内の癌細胞のＨＥＲ２タンパク陽性染色像、陽性染色の強度、陽性細胞率を観察する。次に対物レンズを１０倍に切り替え、陽性所見が細胞膜か細胞質に局在するかを確認し、必要に応じてさらに対物レンズ２０倍で検索する。
　（６－２．蛍光観察）
（免疫染色）の（５－２．画像処理・シグナル計測）と同様に実施することができる。
　（蛍光体集積粒子）
　本発明における用いられる蛍光体集積粒子（ＰＩＤ）は、有機物または無機物でできた粒子を母体として、複数の蛍光体が母体内部に集積している（内包されている）および／または母体表面に吸着している構造を有する、ナノサイズの粒子である。蛍光体が母体に内包されている場合、蛍光体は母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していても、していなくてもよい。例えば、母体（例えば樹脂）と蛍光体が静電的相互作用により結合していてもよいし、共有結合していてもよい。
　なお、本明細書における「蛍光体」は、所定の波長の電磁波（Ｘ線、紫外線または可視光線）が照射されてそのエネルギーを吸収することで電子が励起し、その励起状態から基底状態に戻る際に余剰のエネルギーを電磁波として放出する、つまり「蛍光」を発する物質であって、生体物質認識物質（生体物質を特異的に認識可能な物質、例；ビオチン、アビジン、抗体等）と直接的、あるいは間接的に結合させることのできる物質を指す。また、「蛍光」は広義的な意味を持ち、励起のための電磁波の照射を止めても発光が持続する発光寿命の長い燐光と、発光寿命が短い狭義の蛍光とを包含する。
　蛍光体集積粒子を形作る母体のうち、有機物としては、メラミン樹脂、尿素樹脂、アニリン樹脂、グアナミン樹脂、フェノール樹脂、キシレン樹脂、フラン樹脂など、一般的に熱硬化性樹脂に分類される樹脂；スチレン樹脂、アクリル樹脂、アクリロニトリル樹脂、ＡＳ樹脂（アクリロニトリル－スチレン共重合体）、ＡＳＡ樹脂（アクリロニトリル－スチレン－アクリル酸メチル共重合体）など、一般的に熱可塑性樹脂に分類される樹脂；ポリ乳酸等のその他の樹脂；多糖を例示することができ、無機物としてはシリカ、ガラスなどを例示することができる。
　前記蛍光体としては半導体ナノ粒子や有機蛍光色素が好適に用いられる。半導体ナノ粒子としては、例えば、ＩＩ－ＶＩ族化合物、ＩＩＩ－Ｖ族化合物、またはＩＶ族元素を含有するものが挙げられ、具体的には、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅなどが挙げられる。蛍光色素としては、例えば、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、芳香環系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、ピロメセン系色素分子などが挙げられ、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素、Ｃｙ（登録商標、ＧＥヘルスケア社製）系色素、ＤＹ（登録商標、ＤＹＯＭＩＣＳ社製）系色素、ＨｉＬｙｔｅ（登録商標、アナスペック社製）系色素、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標、サーモサイエンティフィック社製）系色素、ＡＴＴＯ（登録商標、ＡＴＴＯ－ＴＥＣ社製）系色素、ＭＦＰ（登録商標、Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）系色素などを用いることができる。なお、このような色素の総称は、化合物中の主要な構造（骨格）または登録商標に基づき命名されており、それぞれに属する蛍光色素の範囲は当業者であれば過度の試行錯誤を要することなく適切に把握できるものである。
　蛍光体集積粒子に内包させる蛍光体の他の例としては、例えば、Ｙ2Ｏ3、Ｚｎ2ＳｉＯ4等を主成分とし、Ｍｎ2+，Ｅｕ3+等を賦活剤とする「長残光蛍光体」を挙げることができる。
　蛍光体集積粒子は、公知の方法（例えば特開２０１３－５７９３７号公報参照）に従って作製することができる。
　より具体的には、例えば、シリカを母体とし、その中に蛍光体が集積している蛍光体集積シリカ粒子は、無機半導体ナノ粒子、有機蛍光色素などの蛍光体と、テトラエトキシシランのようなシリカ前駆体とが溶解している溶液を、エタノールおよびアンモニアが溶解している溶液に滴下し、シリカ前駆体を加水分解することにより作製することができる。
　一方、樹脂を母体とし、蛍光体を樹脂粒子の表面に吸着させるか、樹脂粒子中に内包させるかした蛍光体集積樹脂粒子は、それらの樹脂の溶液ないし微粒子の分散液を先に用意しておき、そこに無機半導体ナノ粒子、有機蛍光色素などの蛍光体を添加して撹拌することにより作製することができる。あるいは、樹脂原料の溶液に蛍光色素を添加した後、重合反応を進行させることにより、蛍光体を内包した樹脂粒子を作製することもできる。例えば、母体となる樹脂としてメラミン樹脂のような熱硬化性樹脂を用いる場合、その樹脂の原料（モノマーまたはオリゴマーないしプレポリマー、例えばメラミンとホルムアルデヒドの縮合物であるメチロールメラミン）と、有機蛍光色素と、好ましくはさらに界面活性剤および重合反応促進剤（酸など）とを含有する反応混合物を加熱し、乳化重合法によって重合反応を進行させることにより、有機蛍光色素内包樹脂粒子を作製することができる。また、母体となる樹脂としてスチレン系共重合体のような熱可塑性樹脂を用いる場合、その樹脂の原料と、有機蛍光色素と（樹脂の原料モノマーとして、あらかじめ有機蛍光色素を共有結合などで結合させたモノマーを用いるようにしてもよい）、重合開始剤（過酸化ベンゾイル、アゾビスイソブチロニトリルなど）を含有する反応混合物を加熱し、ラジカル重合法またはイオン重合法によって重合反応を進行させることにより、有機蛍光色素内包樹脂粒子を作製することができる。
　蛍光体集積粒子の平均粒径は、標本スライドの免疫染色に適した粒径であれば特に限定されないが、輝点としての検出のしやすさなどを考慮すると、通常は１０～５００ｎｍ、好ましくは５０～２００ｎｍである。また、粒径のばらつきを示す変動係数は、通常は２０％以下であり、好ましくは５～１５％である。このような条件を満たす蛍光体集積粒子は、製造条件を調整することにより製造することができる。例えば、乳化重合法により蛍光体集積粒子を作製する場合は、添加する界面活性剤の量によって粒径を調節することができ、一般的に、蛍光体集積粒子の母体原料の量に対する界面活性剤の量が相対的に多ければ粒径は小さくなり、その量が相対的に少なければ粒径は大きくなる傾向にある。
　なお、蛍光体集積粒子の粒径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影して蛍光体集積粒子の断面積を計測し、その断面形状を円と仮定したときに、その断面積に相当する円の直径として算出することができる。複数の蛍光体集積粒子からなる集団の平均粒径および変動係数は、十分な数（例えば１０００個）の蛍光体集積粒子について上記のようにして粒径を算出した後、平均粒径はその算術平均として算出され、変動係数は式：１００×粒径の標準偏差／平均粒径、により算出される。
　以下、実施例に基づいて本発明の好適な態様をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
　［作製例１］
　（ビオチン修飾ＩｇＧ抗体の作製）
　５０ｍＭＴｒｉｓ溶液に、２次抗体として用いる抗ウサギＩｇＧ抗体（Gene Tex社： GTX40383）５０μｇを溶解した。この溶液に、最終濃度３ｍＭとなるようにＤＴＴ（ジチオトレイトール）溶液を添加、混合し、３７℃で３０分間反応させた。その後、反応溶液を脱塩カラム「Ｚｅｂａ　Ｄｅｓａｌｔ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎｓ」（サーモサイエンティフィック社、Ｃａｔ．＃８９８８２）に通して、ＤＴＴで還元した２次抗体を精製した。精製した抗体全量のうち２００μＬを５０ｍＭＴｒｉｓ溶液に溶解して抗体溶液を調製した。その一方で、リンカー試薬「Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ－ＰＥＧ２－Ｂｉｏｔｉｎ」（サーモサイエンティフィック社、製品番号２１９０１）を、ＤＭＳＯを用いて０．４ｍＭとなるように調整した。このリンカー試薬溶液８．５μＬを前記抗体溶液に添加、混合し、３７℃で３０分間反応させることにより、抗ウサギＩｇＧ抗体にＰＥＧ鎖を介してビオチンを結合させた。この反応溶液を脱塩カラムに通して精製した。脱塩した反応溶液について、波長３００ｎｍにおける吸光度を分光高度計（日立製「Ｆ－７０００」）を用いて測定することにより、反応溶液中のタンパク質（ビオチン修飾ＩｇＧ抗体）の濃度を算出し、５０ｍＭＴｒｉｓ溶液を用いて、ビオチン修飾抗ウサギＩｇＧ抗体の濃度を２５０μｇ／ｍＬに調整した。
　また、抗ウサギＩｇＧ抗体の代わりに抗マウスＩｇＧ抗体（Abcam社：ab99601）を用いる以外は上記と同じ手法でビオチン修飾抗マウスＩｇＧ抗体を作製し、ビオチン修飾抗マウスＩｇＧ抗体の濃度を２５０μｇ／ｍＬに調整した。
　［作製例２］
　テキサスレッド色素分子「Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ　１０１」（シグマアルドリッチ社）２．５ｍｇを純水２２．５ｍＬに溶解した後、ホットスターラーにより溶液の温度を７０℃に維持しながら２０分間撹拌した。撹拌後の溶液に、メラミン樹脂「ニカラックＭＸ－０３５」（日本カーバイド工業株式会社）１．５ｇを加え、さらに同一条件で５分間加熱撹拌した。撹拌後の溶液にギ酸１００μＬを加え、溶液の温度を６０℃に維持しながら２０分間攪拌した後、その溶液を放置して室温まで冷却した。冷却した後の溶液を複数の遠心用チューブに分注して、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、溶液に混合物として含まれるテキサスレッド色素内包メラミン樹脂粒子を沈殿させた。上澄みを除去し、沈殿した粒子をエタノールおよび水で洗浄した。得られた樹脂粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行い、上述のように平均粒子径を測定したところ、平均粒子径１５２ｎｍであった。このようにして作製されたテキサスレッド色素内包メラミン樹脂粒子を次の手順で表面修飾した。
　得られた粒子０．１ｍｇをＥｔＯＨ１．５ｍＬ中に分散し、アミンプロピルトリメトキシシランＬＳ－３１５０（信越化学工業社製）２μＬを加えて８時間反応させて表面アミノ化処理を行なった。
　次いで、上記表面アミノ化処理を行なった粒子をＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）12（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－［（Ｎ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）－ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し、１時間反応させた。この混合液を１０，０００Ｇで２０分間遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことでマレイミド修飾されたテキサスレッド集積メラミン粒子を得た。
　一方、ストレプトアビジン（和光純薬社製）をＮ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　Ｓ－ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ（ＳＡＴＡ）を用いてチオール基付加処理を行ったのち、ゲルろ過カラムによるろ過を行い、チオール修飾されたストレプトアビジンを得た。
　上記のマレイミド修飾されたテキサスレッド集積メラミン粒子とチオール修飾されたストレプトアビジンとを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ中で混合し、室温で１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去し、得られたストレプトアビジン結合テキサスレッド集積メラミン粒子を回収した。得られたストレプトアビジン結合テキサスレッド集積メラミン粒子を蛍光体集積粒子用希釈液を用いて、０．０６ｎＭに希釈したものを実験例２、３における赤色ＰＩＤ染色液として使用した。
　［作製例３］
　作製例２に記載の手順に準じ、テキサスレッド色素分子「Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ　１０１」（シグマアルドリッチ社）に代えてＦＩＴＣを用いることでＦＩＴＣ色素集積メラミン樹脂粒子を作製した。得られたストレプトアビジン結合ＦＩＴＣ集積メラミン樹脂粒子を蛍光体集積粒子用希釈液を用いて、０．０６ｎＭに希釈したものを実験例２、３における緑色ＰＩＤ染色液として使用した。
　［作製例４］
　作製例２に記載の手順に準じ、テキサスレッド色素分子「Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ　１０１」（シグマアルドリッチ社）に代えて7-(Diethylamino)-３－Ｐｈｅｎｙｌｃｏｕｍａｒｉｎを用いることで7-(Diethylamino)-３－Ｐｈｅｎｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ色素集積メラミン樹脂粒子を作製した。作製例１と同様の手法でマレイミド修飾を行った7-(Diethylamino)-３－Ｐｈｅｎｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ色素集積メラミン樹脂粒子と、ストレプトアビジンに代えて抗トラスツズマブ抗体（Bio-rad社；HCA177）を作製例１と同様の手法でチオール修飾したものとを、作製例１と同様の手法で反応、処理させることで、抗トラスツズマブ抗体結合7-(Diethylamino)-３－Ｐｈｅｎｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ色素集積メラミン樹脂粒子を作製し、これを蛍光体集積粒子用希釈液を用いて、０．０６ｎＭに希釈したものを実験例２における青色ＰＩＤ染色液として使用した。
　［作製例５］
　作製例２に記載の手順に準じ、テキサスレッド色素分子「Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ　１０１」（シグマアルドリッチ社）に代えて7-(Diethylamino)-３－Ｐｈｅｎｙｌｃｏｕｍａｒｉｎを用いることで7-(Diethylamino)-３－Ｐｈｅｎｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ色素集積メラミン樹脂粒子を作製した。得られたストレプトアビジン結合7-(Diethylamino)-３－Ｐｈｅｎｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ集積メラミン樹脂粒子を蛍光体集積粒子用希釈液を用いて、０．０６ｎＭに希釈したものを実験例４における青色ＰＩＤ染色液として使用した。
＜評価準備１＞
　乳がん患者複数名から採取した腫瘍組織を購入し、それぞれの患者に対応する２ｍｍ角の腫瘍組織を獲得免疫不全マウスの腰部皮下に移植することで、ＰＤＸモデルマウスを作製した。約３００ｍｍ3まで腫瘍組織が成長した時（移植１か月後）にトラスツズマブ(商品名;ハーセプチン（登録商標））の投与を開始した。投与条件は投与量３０ｍｇ／ｋｇ；投与回数１日１回、週２回とした。
　投与前後のマウスについてそれぞれ以下の工程を行った。なお、各患者に対応するＰＤＸマウスであってトラスツズマブの代わりにＰＢＳを同条件で投与したマウスをコントロールマウスとして用いている。
（Ｉ）投与４０日後にマウスより採血し、ヘパリンNa注1万単位/10mL「モチダ」（持田製薬株式会社）を吸い上げたのちに吐出した注射針(テルモ株式会社)を用いて採血し、１２００ｇで２０分間遠心分離を行うことで血漿を分離した。0.3% BSA/0.05% tween20/140mM NaCl/25mM sodium phosphate（ｐＨ７．２）を希釈液として前記血漿を１００倍に希釈した。
（ＩＩ）初回投与直前に腫瘍の一部を針生検により採取して、各マウスにつきＦＦＰＥ（ホルマリン固定パラフィン包埋）組織スライドをそれぞれ数枚ずつ作成した。
（ＩＩＩ）投与４０日後に腫瘍の一部を針生検により採取して、各マウスにつきＦＦＰＥ（ホルマリン固定パラフィン包埋）組織スライドをそれぞれ数枚ずつ作成した。
（ＩＶ）初回投与直前、および投与４０日後の腫瘍体積を測定した。
［実験例１］
　工程（Ｉ）で取得した希釈した血漿を検体として、Anti-Trastuzumab, ELISA Kit, ADA ELISA(somrubioscience)を用いて試験を行うことで、トラスツズマブの血中濃度を測定した。検体ごとの抗体医薬の血中濃度をプロットした図を図１に示す。各検体はトラスツズマブ血中濃度から高濃度群と低濃度群に分類できることがわかる。
［実験例２］
　上記工程（ＩＩ）、工程（ＩＩＩ）で作製した組織スライドに関して、以下の手順で免疫染色を行った。
(標本の前処理）
　作製したＦＦＰＥ組織スライドを脱パラフィン処理した後、水に置換する洗浄を行った。洗浄した組織スライドを１０ｍＭクエン酸緩衝液中（ｐＨ６．０）中で９５℃、４０分間加熱することで抗原の賦活化処理を行った。賦活化処理後の組織スライドをＰＢＳにより洗浄した。洗浄後の組織スライドに対して蛍光ナノ粒子用希釈液［（カゼイン（組成＝α－カゼイン：５０ｗ／ｗ％、β－カゼインＢＳＡ：５０ｗ／ｗ％）とＢＳＡを１％含有する溶液］を滴下することにより１５分間ブロッキング処理を行った。
(免疫染色Ａ)
　工程（ＩＩ）で作製した組織スライドについては、前記標本前処理工程を行った組織スライドに、抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体(Roche社；4B5)を５μｇ／μＬ含むように調製したＰＢＳを滴下し、４℃で１晩反応させた後ＰＢＳで洗浄した。洗浄後の組織スライドに作製例１で作製したビオチン修飾抗ウサギＩｇＧ抗体をさらに蛍光体集積粒子用希釈液を用いて２μｇ／ｍＬに希釈したものを滴下し、室温で３０分間反応させた。さらに組織スライドをＰＢＳで洗浄した後、作製例２で作製した赤色ＰＩＤ染色液を滴下し、室温で２時間反応させた。
　ストレプトアビジン－ビオチンブロック処理をした後、前記組織スライドに、抗ＨＥＲ３抗体マウスモノクローナル抗体(Novus Biologicals社；RTJ2)を５μｇ／μＬ含むように調製したＰＢＳを滴下し、４℃で１晩反応させた後ＰＢＳで洗浄した。洗浄後の組織スライドに作製例１で作製したビオチン修飾抗マウスＩｇＧ抗体をさらに蛍光体集積粒子用希釈液を用いて２μｇ／ｍＬに希釈したものを滴下し、室温で３０分間反応させた。さらに組織スライドをＰＢＳで洗浄した後、作製例２で作製した緑色ＰＩＤ染色液を滴下し、室温で２時間反応させた。
(免疫染色Ｂ)
　工程（ＩＩＩ）で作製した組織スライドについては、前記標本前処理工程を行った組織スライドに、作製例３で作製した青色ＰＩＤ染色液を滴下し、４℃で１晩反応させた。
(形態観察用染色処理)
　前記免疫染色ＡまたはＢを行った組織スライドを、マイヤーヘマトキシリン液で5分間染色してヘマトキシリン染色を行った後、流水で10分間洗浄した。
(標本の後処理)
　免疫染色を終えた組織スライドに対して、純エタノールに浸漬する操作を4回行う固定化・脱水処理を行った。続いて、キシレンに浸漬する操作を3回行う透徹処理を行った。最後に封入剤「マリノール」(武藤化学株式会社)を載せて、カバーガラスをかぶせる封入処理を行い、観察に用いる標本とした。
(観察・撮影・画像処理)
　工程（ＩＩ）で作製した組織スライドについては、ＨＥＲ２の蛍光標識に用いたテキサスレッドおよびＨＥＲ３の蛍光標識に用いたＦＩＦＣ、工程（ＩＩＩ）で作製した組織スライドについては、トラスツズマブの蛍光標識に用いた7-(Diethylamino)-３－Ｐｈｅｎｙｌｃｏｕｍａｒｉｎについて、蛍光輝点数の測定を行った。
　蛍光の観察には蛍光顕微鏡「BX-63」(オリンパス株式会社)を用い、蛍光画像(400倍)の撮影は、当該蛍光顕微鏡に取り付けた顕微鏡用デジタルカメラ「DP80」(オリンパス株式会社)を用いて、1つの組織スライドにつき５視野ずつ行った。
　工程（ＩＩ）で作製した組織スライドについて、まず、ＨＥＲ２の蛍光標識に用いたテキサスレッドに対応する励起光を標本に照射して蛍光を発光させ、その状態の免疫染色像を撮影し、テキサスレッド集積メラミン粒子を表す輝点のうち輝度が所定の値以上のものの数を計測した。この際、励起光の波長は、蛍光顕微鏡が備える励起光用光学フィルターを用いて５７５～６００ｎｍに設定し、観察する蛍光の波長は、蛍光用光学フィルターを用いて６１２～６９２ｎｍに設定した。次にＨＥＲ３の蛍光標識に用いたＦＩＦＣに対応する励起光を標本に照射して蛍光を発光させ、その状態の蛍光画像を撮影し、ＦＩＦＣ集積メラミン粒子を表す輝点のうち輝度が所定の値以上のものの数を計測した。
この際、励起光の波長は、蛍光顕微鏡が備える励起光用光学フィルターを用いて４７０～４９５ｎｍに設定し、観察する蛍光の波長は、蛍光用光学フィルターを用いて５１０～５５０ｎｍに設定した。
　工程（ＩＩＩ）で作製した組織スライドについて、トラスツズマブの蛍光標識に用いたＰｈｅｎｙｌｃｏｕｍａｒｉｎに対応する励起光を標本に照射して蛍光を発光させ、その状態の蛍光画像を撮影し、集積メラミン粒子を表す輝点のうち輝度が所定の値以上のものの数を計測した。この際、励起光の波長は、蛍光顕微鏡が備える励起光用光学フィルターを用いて３４０～３９０ｎｍに設定し、観察する蛍光の波長は、蛍光用光学フィルターを用いて４２０～４６０ｎｍに設定した。
　蛍光顕微鏡による観察および画像撮影時の励起光の強度はいずれも、視野中心部付近の照射エネルギーが９００Ｗ／ｃｍ2となるように調整し、画像撮影時の露光時間は画像の輝度が飽和しないような範囲、例えば４０００μ秒に設定した。
　上記蛍光観察および蛍光画像の撮影をおこなった同一の視野において、明視野における観察および画像撮影によりヘマトキシリン染色による染色画像を撮影した。
　取得した蛍光画像および明視野画像を画像処理により重ねあわせ、各画像に含まれる細胞数、およびＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはトラスツズマブを標識した蛍光体集積粒子を示す輝点をそれぞれ計測した。また、画像に含まれる全細胞数に対し、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３、またはトラスツズマブを標識した蛍光体集積粒子を示す輝点が含まれる細胞数の割合を算出した。
　この工程における画像処理には、画像処理ソフトウェア「Ｉｍａｇｅ　Ｊ」（オープンソース）を用いた。
（評価工程）
　各検体における実験例１および２の結果を表１に示す。ＨＥＲ２を標識した蛍光体集積粒子を示す輝点が含まれる細胞をＨＥＲ２＋細胞、ＨＥＲ３を標識した蛍光体集積粒子を示す輝点が含まれる細胞をＨＥＲ３＋細胞、トラスツズマブを標識した蛍光体集積粒子を示す輝点が含まれる細胞を薬剤到達細胞とする。
　また、実験例１におけるトラスツズマブ血中濃度に基づき検体を高濃度群および低濃度群に分け、さらに高濃度群についてＨＥＲ３高発現群およびＨＥＲ３低発現群に分けたそれぞれの群において、ＨＥＲ２＋細胞の割合とトラスツズマブ到達細胞率をプロットしてグラフ化したものを図２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 ［実験例３］
　前記工程（ＩＶ）で測定した初回投与直前の腫瘍体積および投与４０日後の腫瘍体積から、それぞれ初回投与直前の腫瘍体積に対する投与４０日後の腫瘍体積の割合を算出し、腫瘍体積増加率を算出した。
　腫瘍体積増加率をそれぞれ同じ患者に由来する対照群（コントロールマウス）の腫瘍体積増加率と比較してその割合を算出し、以下の基準に基づいた４段階の治療スコアによりトラスツズマブの治療効果を評価した。
　投与４０日後において腫瘍の完全退縮がみられたものを３、腫瘍体積増加率が対照群の５０％未満であるものを２、腫瘍体積増加率が対照群の５０％以上７５％未満であるものを１、腫瘍体積増加率が対照群の７５％～１００％であるものを０とした。各検体における治療スコアを実験例１および２の結果と共に表２に示す。
　また、横軸に実験例２で算出したトラスツズマブの到達細胞率を、縦軸にトラスツズマブの治療効果をプロットしたグラフを図３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 （結果・考察）
　図１からは、検体ごとにトラスツズマブの血中濃度が大きく異なることがわかる。これは検体ごとに抗体医薬に対する代謝速度がそれぞれ異なっていることに起因すると考えられる。
　図２からは、ＨＥＲ２に対応するトラスツズマブ到達細胞率の上昇はＨＥＲ３低発現群、高発現群ともに観察されるが、ＨＥＲ２に対応するトラスツズマブ到達細胞率の上昇率はＨＥＲ３高発現群では抑えられていることがわかる。
　これらの結果から、ＨＥＲ２の発現量が多くなることでそれを標的とするトラスツズマブが組織内に取り込まれやすくなることで到達細胞率が増加する、すなわち薬剤の到達細胞率が高くなるが、このＨＥＲ２によるトラスツズマブの取り込みはＨＥＲ３によって抑制されていると推測できる。また表１からは、同程度ＨＥＲ２を発現し、同程度のトラスツズマブの血中濃度が測定された検体間において、ＨＥＲ３が多い場合（Ｅ～Ｈ）ではＨＥＲ３が少ない場合（Ａ～Ｄ）に比べて到達細胞率が低いことが確認された。
　以上より、抗体医薬投与前の腫瘍組織内におけるＨＥＲ２（標的分子）を定量することに加えて、標的関連分子の発現量、血中濃度、抗体医薬の到達細胞率を組み合わせることで、治療効果を評価できると推測することができる。具体的には、抗体医薬の到達細胞率と治療結果は相関しているため、抗体医薬の到達細胞率によって、治療効果を高精度に予想することが可能である。また、標的分子の定量に加えて、標的関連分子の発現量および、血中濃度から、抗体医薬の到達細胞率をより正確に予測することが可能である。
〔実験例４〕
＜評価準備２＞
トラスツズマブ(商品名;ハーセプチン（登録商標））の代わりにanti-HER2 aptamer-Aを投与した以外は評価準備１と同様に行った。
anti-HER2 aptamer-A（ＨＥＲ２抗原認識ＲＮＡアプタマー、RNA 5-AGCCGCGAGGGGAGGGAUAGGGUAGGGCGCGGCU-3、北海道システムサイエンス社に合成依頼して入手）を、ＰＤＸモデルマウスに３ｍｇ／ｋｇで投与した。
　上記マウスから工程（Ｉ）と同様にして採血し、ハイブリダイゼーション法により、血中のanti-HER2 aptamer-Aを検出した。具体的には、以下の固相側（capture）プローブ（5’-NH2- GCGCUCCC-3、北海道システムサイエンス社に合成依頼して入手）を９６穴プレートにスポッターを用いて打ち付けて作成したハイブリダイゼーション用プレートに、NH2残基を有する検出側(detect)プローブ（5’-biotin-CCCGCGCC-3、北海道システムサイエンス社に合成依頼して入手）液を添加した。そこにマウス血漿を加えて反応させることにより、血中のanti-HER2 aptamer-Aを検出した。
　また、工程（II）と同様にして組織スライドを作製し、免疫染色Ａと同様にしてＨＥ
Ｒ-２およびＨＥＲ－３について免疫染色を行った。
　工程（III）と同様にして組織スライドを作製し、次の手順で染色を行った。
(標本の前処理）
　作製したＦＦＰＥ組織スライドを脱パラフィン処理した後、水に置換する洗浄を行った。その後、プロテアーゼ酵素処理（30℃, 5min）、脱水処理を行った。
前記標本前処理工程を行った組織スライドに、作製例５で作製した青色ＰＩＤ染色液と上記検出側(detect)プローブと変性溶液（ホルムアミド／ＳＳＣ溶液等）とを予め混合した粒子溶液を滴下し、７５℃で5分続けて３７℃で16時間ハイブリダイゼーション反応を行った。stringency洗浄ののち、DAPI溶液で封入し、次工程の観察を行った。
実験例2と同様に(観察・撮影・画像処理)を実施した。
産業上の利用の可能性
　以上の結果から、標的分子の発現量、標的関連分子の発現量、血中濃度、医薬Ｘの到達細胞率から抗体医薬の治療効果を評価することができ、またそのような評価に基づいて臨床現場における医薬Ｘの選択や投薬計画の構築が可能になり得るといえる。

Claims (8)

  1. 　標的分子を特異的に認識する医薬の評価方法であって、前記標的分子に関する情報を求める工程（Ｐ）を含み、さらに、
    　下記工程（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）から選択される少なくとも１つの工程（但し、工程（Ａ）のみ、および工程（Ｂ）のみを除く）を含む、医薬の評価方法。
    （Ａ）標的関連分子に関する情報を得る工程
    （Ｂ）被験体における前記標的分子を特異的に認識する医薬の血中濃度を測定する工程
    （Ｃ）前記標的分子を特異的に認識する医薬の到達細胞率を算出する工程
  2. 　前記標的関連分子に関する情報が、標的関連分子の発現量に関する情報および標的関連分子の局在に関する情報の少なくとも一方を含む、請求項１に記載の医薬の評価方法。
  3. 　前記標的分子に関する情報が標的分子の発現量に関する情報および標的分子の局在に関する情報の少なくとも一方を含む、請求項１または２に記載の医薬の評価方法。
  4. 　前記標的分子が、ＨＥＲ２、ＣＴＬＡ４、ＥＧＦＲ、ＰＤ－１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＶＥＧＦ、またはＶＥＧＦＲである、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体医薬の評価方法。
  5. 　前記標的分子を特異的に認識する医薬が抗体医薬である請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬の評価方法。
  6. 　前記工程（Ｃ）が、ＥＬＩＳＡを用いて抗体医薬の血中濃度を定量化する工程である、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬の評価方法。
  7. 　前記標的分子を特異的に認識する医薬が核酸医薬である請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬の評価方法。
  8. 前記標的分子が、ＰＤＧＦ－Ｂ、Ｃ５、ＭＣＰ－１、ＳＤＦ－１、Ｈｅｐｃｉｄｉｎ、ＲＴＰ８０１、Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ、トランスサイレチン、またはＨＳＰ４７である、請求項７に記載の医薬の評価方法。
PCT/JP2018/047759 2017-12-27 2018-12-26 医薬の評価方法 WO2019131727A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18893563.9A EP3734277A4 (en) 2017-12-27 2018-12-26 PROCESS FOR EVALUATING A MEDICINAL PRODUCT
US16/958,144 US20200363389A1 (en) 2017-12-27 2018-12-26 Method for Assessing Medicine
JP2019562083A JPWO2019131727A1 (ja) 2017-12-27 2018-12-26 医薬の評価方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017-250937 2017-12-27
JP2017250937 2017-12-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019131727A1 true WO2019131727A1 (ja) 2019-07-04

Family

ID=67067455

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/047759 WO2019131727A1 (ja) 2017-12-27 2018-12-26 医薬の評価方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20200363389A1 (ja)
EP (1) EP3734277A4 (ja)
JP (1) JPWO2019131727A1 (ja)
WO (1) WO2019131727A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022059601A1 (ja) * 2020-09-16 2022-03-24 コニカミノルタ株式会社 可視化方法および情報取得方法
WO2022059510A1 (ja) * 2020-09-18 2022-03-24 コニカミノルタ株式会社 薬物分布情報処理装置、薬物分布情報処理方法及び薬物分布情報処理プログラム
EP3912995A4 (en) * 2019-01-18 2022-06-15 Konica Minolta, Inc. NANOPARTICLES INTEGRATED WITH PHOSPHORUS FOR THE DETECTION OF A TARGET SUBSTANCE

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003508447A (ja) * 1999-08-27 2003-03-04 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗ＥｒｂＢ２抗体を用いた治療のためのドーセージ
JP2011504457A (ja) * 2007-11-08 2011-02-10 大塚製薬株式会社 核酸複合体、及び核酸送達用組成物
WO2012029752A1 (ja) 2010-08-31 2012-03-08 コニカミノルタエムジー株式会社 生体物質検出方法
WO2012133047A1 (ja) 2011-03-25 2012-10-04 コニカミノルタエムジー株式会社 免疫組織染色法、およびこれを用いた抗体医薬の有効性を判定する方法
JP2012533738A (ja) * 2009-07-15 2012-12-27 ネステク ソシエテ アノニム 抗体ベースのアレイを使用する胃癌療法のための薬物選択
WO2013035703A1 (ja) 2011-09-09 2013-03-14 コニカミノルタエムジー株式会社 生体物質検出方法
JP2013057937A (ja) 2011-09-07 2013-03-28 Xerox Corp 能動型オゾンスクラバ
WO2014010640A1 (ja) * 2012-07-10 2014-01-16 国立大学法人東京農工大学 アプタマーの製造方法
US20150361503A1 (en) * 2014-06-17 2015-12-17 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Methods for selecting therapeutics for treatment of her2+ cancers

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110402391A (zh) * 2017-02-28 2019-11-01 柯尼卡美能达株式会社 抗体-药物复合体的构成成分的检测方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003508447A (ja) * 1999-08-27 2003-03-04 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗ＥｒｂＢ２抗体を用いた治療のためのドーセージ
JP2011504457A (ja) * 2007-11-08 2011-02-10 大塚製薬株式会社 核酸複合体、及び核酸送達用組成物
JP2012533738A (ja) * 2009-07-15 2012-12-27 ネステク ソシエテ アノニム 抗体ベースのアレイを使用する胃癌療法のための薬物選択
WO2012029752A1 (ja) 2010-08-31 2012-03-08 コニカミノルタエムジー株式会社 生体物質検出方法
WO2012133047A1 (ja) 2011-03-25 2012-10-04 コニカミノルタエムジー株式会社 免疫組織染色法、およびこれを用いた抗体医薬の有効性を判定する方法
JP2013057937A (ja) 2011-09-07 2013-03-28 Xerox Corp 能動型オゾンスクラバ
WO2013035703A1 (ja) 2011-09-09 2013-03-14 コニカミノルタエムジー株式会社 生体物質検出方法
WO2014010640A1 (ja) * 2012-07-10 2014-01-16 国立大学法人東京農工大学 アプタマーの製造方法
US20150361503A1 (en) * 2014-06-17 2015-12-17 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Methods for selecting therapeutics for treatment of her2+ cancers

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3734277A4

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3912995A4 (en) * 2019-01-18 2022-06-15 Konica Minolta, Inc. NANOPARTICLES INTEGRATED WITH PHOSPHORUS FOR THE DETECTION OF A TARGET SUBSTANCE
WO2022059601A1 (ja) * 2020-09-16 2022-03-24 コニカミノルタ株式会社 可視化方法および情報取得方法
WO2022059510A1 (ja) * 2020-09-18 2022-03-24 コニカミノルタ株式会社 薬物分布情報処理装置、薬物分布情報処理方法及び薬物分布情報処理プログラム

Also Published As

Publication number Publication date
US20200363389A1 (en) 2020-11-19
EP3734277A1 (en) 2020-11-04
JPWO2019131727A1 (ja) 2021-02-12
EP3734277A4 (en) 2021-07-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5900489B2 (ja) 免疫組織染色法、およびこれを用いた抗体医薬の有効性を判定する方法
JP5843054B1 (ja) 多重免疫染色法に基づく生体物質の定量方法
JP6648842B2 (ja) 抗体−薬物複合体の構成成分の検出方法
US10509039B2 (en) Integrated phosphor nanoparticle marking agent, and fluorescent immunostaining employing same
WO2019131727A1 (ja) 医薬の評価方法
JP6614161B2 (ja) 蛍光観察に使用する蛍光体集積ナノ粒子
WO2015045961A1 (ja) 蛍光ナノ粒子標識体、多重免疫染色剤キットおよび多重免疫染色法
JP6725045B2 (ja) 蛍光ナノ粒子用希釈液、これを用いた蛍光免疫染色用キット、蛍光免疫染色用溶液、および蛍光免疫染色法、遺伝子染色法
JP6658330B2 (ja) 組織切片から蛍光ナノ粒子の解離を防止する方法
JP6922444B2 (ja) 蛍光ナノ粒子を用いた、病理学的完全奏効（ｐＣＲ）の予測を支援するための検査支援方法
JP6443581B2 (ja) がんまたは免疫系が関係する疾患の診断または治療のための情報取得方法
WO2018164262A1 (ja) 治療有効性の予測方法
WO2020148985A1 (ja) 標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子
JP7238792B2 (ja) 情報取得方法
JP6398419B2 (ja) ソラフェニブを含有する標識剤
JPWO2020066336A1 (ja) 検出方法および評価方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18893563

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2019562083

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018893563

Country of ref document: EP

Effective date: 20200727