JP5302054B2 - Dnaが断片化されたアポトーシス細胞の検出方法、細胞画像解析装置、及びプログラム - Google Patents
Dnaが断片化されたアポトーシス細胞の検出方法、細胞画像解析装置、及びプログラム Download PDFInfo
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(1) 画像解析により、DNAが断片化されたアポトーシス細胞を検出する方法であって、(a)細胞観察用容器に固定された1又は複数の細胞に対して、蛍光性の二本鎖核酸染色剤を用いた核染色と、DNA鎖切断部位を蛍光標識するTUNEL染色とを行う工程と、(b)前記工程(a)において染色された細胞を、顕微鏡を用いて撮像し、各細胞の二本鎖核酸染色画像及びTUNEL染色画像を取得する工程と、(c)前記工程(b)において取得された二本鎖核酸染色画像を解析することにより、当該画像中の細胞の核が断片化されているか否かを判別する工程と、(d)前記工程(b)において取得されたTUNEL染色画像を解析することにより、当該画像中の細胞のDNA鎖の切断が生じているか否かを判別する工程と、(e)前記工程(c)において核が断片化されていると判別された細胞であって、かつ、前記工程(d)においてDNA鎖の切断が生じていると判別された細胞を、DNAが断片化されている細胞として検出する工程と、を有し、前記工程(c)における二本鎖核酸染色画像の解析を、細胞核用閾値、断片化細胞核用閾値、細胞核用面積閾値、及びTUNEL染色用閾値を予め記憶する閾値記憶部を備える細胞画像解析装置に、前記二本鎖核酸染色画像を入力する画像入力工程と、前記細胞画像解析装置が、入力された二本鎖核酸染色画像から、前記細胞核用閾値以上の輝度値を有する領域のうち細胞核用面積閾値以上の面積を有する領域を細胞核領域として抽出する細胞核領域抽出工程と、前記細胞画像解析装置が、前記細胞核領域から、断片化細胞核用閾値以上の輝度値を有する領域を断片化細胞核領域として抽出する断片化細胞核領域抽出工程と、前記細胞画像解析装置が、前記細胞核領域から抽出された断片化細胞核領域が、2個以上である場合に前記細胞核領域を含む細胞の核が断片化されており、1個又は0個である場合に前記細胞核領域を含む細胞の核は断片化されていないと判別する断片化細胞核判別工程と、により行い、前記工程(d)におけるTUNEL染色画像の解析を、前記細胞画像解析装置に、前記TUNEL染色画像を入力する画像入力工程と、前記細胞画像解析装置が、入力されたTUNEL染色画像の、前記二本鎖核酸染色画像において抽出された細胞核領域に相当する領域に含まれる画素の輝度値の統計値を測定するTUNEL染色輝度値測定工程と、前記細胞画像解析装置が、前記統計値が、前記TUNEL染色用閾値以上である場合に前記細胞核領域を含む細胞はDNA鎖の切断が生じており、前記TUNEL染色用閾値未満である場合に前記細胞核領域を含む細胞はDNA鎖の切断が生じていないと判別するDNA鎖切断判別工程と、により行うことを特徴とする、DNAが断片化されたアポトーシス細胞の検出方法、
(2) 前記細胞観察用容器が、スライドガラスまたはマルチウェルプレートであることを特徴とする前記(1)記載のDNAが断片化されたアポトーシス細胞の検出方法、
(3) 顕微鏡画像の取得および画像解析を、イメージングサイトメータを用いて行うことを特徴とする前記(1)又は(2)記載のDNAが断片化されたアポトーシス細胞の検出方法、
(5) 前記断片化細胞核領域抽出部は、前記細胞核領域から断片化細胞核用閾値以上の輝度値を有する領域を候補領域として抽出する候補領域抽出部と、前記候補領域において、各画素の輝度値の傾きに基づいた境界線検出処理を行うことによって境界線を検出し、検出された境界線によって囲まれる領域を断片化細胞核領域として抽出する領域決定部と、を備えることを特徴とする前記(4)記載の細胞画像解析装置、
(6) 細胞核用閾値、断片化細胞核用閾値、細胞核用面積閾値、及びTUNEL染色用閾値を予め記憶する閾値記憶部を備えるコンピュータに対し、蛍光性の二本鎖核酸染色剤により染色された細胞が撮像された二本鎖核酸染色画像と、DNA鎖切断部位を蛍光標識するTUNEL染色された、前記二本鎖核酸染色画像と同一視野のTUNEL染色画像を入力する画像入力工程と、入力された二本鎖核酸染色画像から、前記細胞核用閾値以上の輝度値を有する領域のうち細胞核用面積閾値以上の面積を有する領域を細胞核領域として抽出する細胞核領域抽出工程と、前記細胞核領域から、断片化細胞核用閾値以上の輝度値を有する領域を断片化細胞核領域として抽出する断片化細胞核領域抽出工程と、前記細胞核領域から抽出された断片化細胞核領域が、2個以上である場合に前記細胞核領域を含む細胞の核が断片化されており、1個又は0個である場合に前記細胞核領域を含む細胞の核は断片化されていないと判別する断片化細胞核判別工程と、入力されたTUNEL染色画像の、前記二本鎖核酸染色画像において抽出された細胞核領域に相当する領域に含まれる画素の輝度値の統計値を測定するTUNEL染色輝度値測定工程と、前記統計値が、前記TUNEL染色用閾値以上である場合に前記細胞核領域を含む細胞はDNA鎖の切断が生じており、前記TUNEL染色用閾値未満である場合に前記細胞核領域を含む細胞はDNA鎖の切断が生じていないと判別するDNA鎖切断判別工程と、核が断片化されていると判定され、かつ、DNA鎖の切断が生じていると判定された細胞を、DNAが断片化されたアポトーシス細胞であると解析する解析工程と、を実行させるためのプログラム、
さらに、本発明の細胞画像解析装置を用いることにより、自動的に、DNA鎖に切断が生じているものの未だ断片化に至っていないステージのアポトーシス細胞と、DNA断片化がなされたステージのアポトーシス細胞とを区別して検出することが可能である。
また、「DNA鎖が切断する」とは、染色体を構成する二本鎖DNAのうちの少なくとも一方の鎖の1箇所が切断されることを意味する。つまり、DNA鎖が切断されている細胞には、DNAが断片化されている細胞が含まれるが、単に染色体DNAに切断が生じており、フラグメントに分解されていない、すなわちDNAが断片化されていない細胞も含まれる。
また、「核が断片化する」とは、一の細胞由来の染色体DNAが2以上の凝集領域を形成している状態を意味する。この凝集領域は、二本鎖核染色剤により強く染色される。つまり、二本鎖核染色をした場合に、核領域内に強く染色される領域が2以上ある場合に、「核が断片化されている」という。
本発明のアポトーシス細胞の検出方法は、画像解析により、二本鎖核酸染色剤を用いた核染色(二本鎖核酸染色)とTUNEL染色とを併用することにより、DNA鎖に切断が生じているものの未だ断片化に至っていないステージ(以下、「DNA鎖切断ステージ」という。)のアポトーシス細胞と、DNA断片化がなされたステージ(以下、「DNA断片化ステージ」という。)のアポトーシス細胞とを区別して検出することを特徴とする。TUNEL染色により、DNA鎖に切断が生じているか否かを判別することができる。TUNEL染色陽性細胞(TUNEL染色された細胞)には、二本鎖DNAのうちの一本鎖にのみニックが入り、未だ断片化まで至っていない細胞(以下、「DNA鎖切断細胞」ということがある。)と、二本鎖DNAの両方の鎖が切断されて断片化された細胞(以下、「DNA断片化細胞」ということがある。)のいずれもが含まれる。一方で、二本鎖核酸染色剤を用いた核染色により、核の断片化が生じているか否かを判別することができるが、核が断片化された細胞(以下、「核断片化細胞」ということがある。)では、DNAも断片化されている。そこで、二本鎖核酸染色とTUNEL染色とを併用することにより、TUNEL染色陽性細胞のうち、核断片化細胞をDNA断片化細胞とし、核の断片化が観察されなかった細胞をDNA鎖切断細胞として区別して検出することができる。
(a)細胞観察用容器に固定された1又は複数の細胞に対して、蛍光性の二本鎖核酸染色剤を用いた核染色と、DNA鎖切断部位を蛍光標識するTUNEL染色とを行う工程。
(b)前記工程(a)において染色された細胞を、顕微鏡を用いて撮像し、各細胞の二本鎖核酸染色画像及びTUNEL染色画像を取得する工程。
(c)前記工程(b)において取得された二本鎖核酸染色画像を解析することにより、当該画像中の細胞の核が断片化されているか否かを判別する工程。
(d)前記工程(b)において取得されたTUNEL染色画像を解析することにより、当該画像中の細胞のDNA鎖の切断が生じているか否かを判別する工程。
(e)前記工程(c)において核が断片化されていると判別された細胞であって、かつ、前記工程(d)においてDNA鎖の切断が生じていると判別された細胞を、DNAが断片化されている細胞として検出する工程。
以下、工程ごとに説明する。
スライドガラス又はマルチウェルプレートを用いて、イメージングサイトメータ等を用いることにより、多数の検体も迅速かつ簡便に処理することが可能となる。
二本鎖核酸染色剤としては、二本鎖DNAを染色し得る蛍光物質からなる染色剤であれば特に限定されるものではなく、公知の蛍光性核染色剤の中から、適宜選択して用いることができる。本発明においては、インタカレーターであることが好ましい。公知の蛍光性の二本鎖核酸染色剤として、例えば、DAPI(4‘,6−diamino−2−phenylindole)、PI(propidium iodide)、Hoechst、DRAQ5(登録商標)(Biostatus社製)、Sytox(登録商標)(インビトロジェン社製)、YOYO(登録商標)(インビトロジェン社製)等が挙げられる。
さらに、抽出された細胞核領域から、断片化細胞核用閾値以上の輝度値を有する領域を断片化細胞核領域として抽出する。細胞核領域から抽出された断片化細胞核領域が2個以上である場合に、当該細胞核領域を含む細胞の核は断片化されており、当該細胞核領域から抽出された断片化細胞核領域が1個又は0個である場合には、当該細胞核領域を含む細胞の核は断片化されていない、と判別する。
このため、発明のアポトーシス細胞の検出方法を用いることにより、ある試験化合物で細胞を処理した場合のアポトーシスに対する影響を評価することも可能であり、よって、アポトーシスの誘導剤や抑制(阻害)剤等のスクリーニングを効率よく行うことができる。また、試験化合物の毒性試験にも応用することができる。
例えば、活性型カスペース3に対する特異的抗体を用いて免疫染色を行った場合、染色された細胞(陽性細胞)はアポトーシス細胞であると判別することができる。このように、アポトーシスシグナルに関連する生体分子の免疫染色を組み合わせることにより、より精確にアポトーシス細胞を検出することができる。
工程(c)、(d)、及び(e)は、これらの工程を実現可能な一の画像解析装置を用いて解析することができる。
図1は、このような細胞画像解析装置の一実施形態である細胞画像解析装置1の機能構成を表す概略ブロック図である。細胞画像解析装置1は、画像入力部101、閾値記憶部102、細胞核領域抽出部103、断片化細胞核領域抽出部104a、断片化細胞核判別部111、TUNEL染色輝度値測定部112、DNA鎖切断判別部113、解析部114、及び解析結果出力部107を備える。細胞画像解析装置1aは、パーソナルコンピューターやワークステーション等の情報処理装置を用いて構成されても良いし、顕微鏡などに組み込まれた専用装置として構成されても良い。
・細胞核領域の数
・断片化細胞核領域の数
・内部から断片化細胞核領域が抽出されなかった細胞核領域の数
・内部から断片化細胞核領域が抽出された細胞核領域の数
・細胞核領域の面積の総和
・断片化細胞核領域の面積の総和
・細胞核領域の面積の総和と断片化細胞核領域の面積の総和との比
・二本鎖核酸染色画像における細胞核領域の輝度値の平均値と断片化細胞核領域の輝度値の平均値との比
・TUNEL染色画像における細胞核領域の輝度値の平均値
・TUNEL染色画像における細胞核領域の輝度値の合計値
・各細胞核領域の核の断片化の有無
・各細胞核領域のDNA鎖の切断の有無
・DNA鎖が切断されていると判別された細胞核領域の数
・DNA鎖が切断されていないと判別された細胞核領域の数
・核が断片化されており、かつDNA鎖が切断されていると判別された細胞核領域の数
・核が断片化されており、かつDNA鎖が切断されていないと判別された細胞核領域の数
・核が断片化されておらず、かつDNA鎖が切断されていると判別された細胞核領域の数
・核が断片化されておらず、かつDNA鎖が切断されていないと判別された細胞核領域の数
図3(b)において、符号Xで表される破線で囲まれた領域が、細胞核領域抽出部103によって抽出された細胞核領域を表す。なお、図3を含む本願図面では、図面作成の都合により輝度値が低いほど白く表し、輝度値が高いほど黒く表す。
断片化細胞核領域抽出部104aは、ステップS201の処理において抽出された候補領域の全てを、ステップS202及びステップS203の処理を行うことなく、断片化細胞核領域としてそのまま抽出しても良い。言い換えれば、断片化細胞核領域抽出部104aは、細胞核領域から断片化細胞核用閾値以上の輝度値を持つ領域を断片化細胞核領域として抽出するように構成されても良い。
本発明の検出方法に、さらに他のアポトーシス細胞を検出する方法を組み合わせることにより、一の測定試料中に含まれる複数の細胞のそれぞれに対して、アポトーシスのステージを評価することが可能になる。本発明においては、アポトーシスの特定のステージの細胞を特異的に検出する方法を組み合わせることが好ましく、中でも、初期のアポトーシス細胞を検出する方法と組み合わせることが好ましい。
また、ミトコンドリア膜電位検出用プローブ染色画像を取得した場合には、当該ミトコンドリア膜電位検出用プローブ染色画像を解析する。この画像解析の結果、ミトコンドリア膜に脱分極が生じていると判別された細胞をアポトーシス細胞であると評価し、脱分極が生じていないと判別された細胞を非アポトーシス細胞であると評価する。
細胞膜透過性検出用プローブ染色画像を取得した場合には、当該細胞膜透過性プローブ染色画像を解析する。この画像解析の結果、当該細胞膜透過性プローブにより染色されたと判別された細胞をアポトーシス細胞であると評価し、染色されなかったと判別された細胞を非アポトーシス細胞であると評価する。
例えば、活性型カスペース3は、比較的アポトーシスの初期ステージから検出される。このため、活性型カスペース3の免疫染色を組み合わせた場合、活性型カスペース3陽性細胞(免疫染色により活性型カスペース3が検出された細胞)であって、DNA断片化されていないと判断された細胞は、初期のアポトーシス細胞であると評価することができる。
スタウロスポリンによってアポトーシスを誘導したHL60細胞を、TUNEL染色した後、二本鎖核酸染色剤で染色し、画像解析を行い、DNAが断片化された細胞を検出した。具体的には、以下のように行った。なお、HL60細胞の培養は、10%FBS(ウシ胎児血清、GIBCO社製)含有RPMI培地(GIBCO社製)を用いて、35cm2フラスコに、1〜9×105cells/mLとなるように播種して、37℃、CO2インキュベータ中で行った。
24well plateに0.5×106cells/wellとなるように播種したHL60細胞に、最終濃度がそれぞれ0、0.1、0.25、0.5、1.0μMとなるように、スタウロスポリン(CALBIOCHEM社製)を添加し、5時間インキュベートした。
インキュベート後、wellから細胞を培地ごと15mLチューブに移し、培地を除去した後、4%パラホルムアルデヒド(和光純薬社製)溶液を添加して室温で20分間静置することにより、細胞を固定した。その後、遠心処理を行って4%パラホルムアルデヒド溶液を除去し、PBSで1回洗浄した後、PBSを添加して細胞懸濁液を調製した。
この細胞懸濁液を、96well plateに、5×104cells/wellとなるように加えた。当該プレートを、600rpm、10分間の遠心処理を行った後、プレート向きを逆にして再度600rpm、10分間の遠心処理を行って溶液を除去し、30分間おいて自然乾燥させた。その後、70%冷エタノールを100μL/wellずつ加えて−20℃で1晩置いて細胞を固定した。その後、エタノールを除去し、PBSで洗浄した。
各wellに、1%TritonXを100μL/wellずつ加え、氷上で10分間静置した後、PBSで1回洗浄した。各wellに、50μLのLabeling Reaction Mixを加えて37℃で1時間インキュベートした。次いで、Rinsing Buffer(0.1%TritonX及び0.5%BSA含有PBS)で3回洗浄した後、各wellに、anti−BrdU抗体(CALBIOCHEM社製)をIncubation Buffer(1%BSA及び0.1%Tween20含有PBS)で200倍に希釈した溶液を100μL/wellずつ加え、室温で1時間インキュベートした。各wellを、Washing Buffer(0.1%Tween20含有PBS)で2回洗浄した後、anti−mouse−Alexa647抗体(Alexa Fluor 647 goat anti−mouse IgG(H+L)、Invitrogen社製)をIncubation Bufferで250倍に希釈した溶液を100μL/wellずつ加え、室温遮光下で30分間インキュベートした。さらに、Washing Bufferで2回洗浄した後、PBSで1μg/mLに希釈したDAPI(Roche社製)溶液を、100μL/wellずつ加え、室温で10分間インキュベートした後、PBSで2回洗浄した。なお、Labeling Reaction Mixは、10μLの×5TdT Buffer(Roche社製)、2μLの25mM CoCl2(Roche社製)、0.125μLのTdT enzyme(Roche社製)、及び1μLの2mM BrdUTP(SIGMA社製)に蒸留水を加えて最終量50μLとしたものである。
上記操作後の各wellに、100μLずつPBS加えておいたものを試料とし、CELAVIEW(オリンパス社製)を用いて、DAPI染色画像(二本鎖核酸染色画像)とTUNEL染色画像を取得し、解析した。なお、以下に示す条件により、染色画像の取得を行った。
Type: Object−based
ZDC Sequence : Don’t use ZDC
Acquisition
Color channel: DAPI
Microscope
Objective : LUCPLFLAN 20×
Filter cube : UV
Z offset(μm) : 0
Camera
Exposure time(ms): 25
Preacquisition delay(s): 0
Illumination
Fluorescence
Excitation filter : UV
Intensity : 33.3
Color channel : Alexa647
Microscope
Objective : LUCPLFLAN 20×
Filter cube : Cy5
Z offset (μm) : −1
Camera
Exposure time(ms): 500
Preacquisition delay(s): 0
Illumination
Fluorescence
Excitation filter : RED
Intensity : 100
Well Manager
Position : 6Columns/well 6Rows/well 36Total positions
Spacing : 550Column spacing(μm) 550Row spacing(μm)
図8(a)は、細胞核領域が抽出されて認識された細胞を、面積値とサーキュラリティーファクターをパラメータとして、ドットプロット(スキャッターグラム)により表示したものである。1ドットが1細胞(すなわち1細胞核領域)を示している。なお、ドットプロットに換えてヒストグラムにより表示してもよい。図8(a)のドットプロットに示すように、解析対象とする細胞核領域(細胞)を含む集団(線で囲まれた領域)を特定し、当該集団に含まれるものに対してのみ、以降の画像解析を行った。
Claims (6)
- 画像解析により、DNAが断片化されたアポトーシス細胞を検出する方法であって、
(a)細胞観察用容器に固定された1又は複数の細胞に対して、蛍光性の二本鎖核酸染色剤を用いた核染色と、DNA鎖切断部位を蛍光標識するTUNEL染色とを行う工程と、
(b)前記工程(a)において染色された細胞を、顕微鏡を用いて撮像し、各細胞の二本鎖核酸染色画像及びTUNEL染色画像を取得する工程と、
(c)前記工程(b)において取得された二本鎖核酸染色画像を解析することにより、当該画像中の細胞の核が断片化されているか否かを判別する工程と、
(d)前記工程(b)において取得されたTUNEL染色画像を解析することにより、当該画像中の細胞のDNA鎖の切断が生じているか否かを判別する工程と、
(e)前記工程(c)において核が断片化されていると判別された細胞であって、かつ、前記工程(d)においてDNA鎖の切断が生じていると判別された細胞を、DNAが断片化されている細胞として検出する工程と、
を有し、前記工程(c)における二本鎖核酸染色画像の解析を、
細胞核用閾値、断片化細胞核用閾値、細胞核用面積閾値、及びTUNEL染色用閾値を予め記憶する閾値記憶部を備える細胞画像解析装置に、前記二本鎖核酸染色画像を入力する画像入力工程と、
前記細胞画像解析装置が、入力された二本鎖核酸染色画像から、前記細胞核用閾値以上の輝度値を有する領域のうち細胞核用面積閾値以上の面積を有する領域を細胞核領域として抽出する細胞核領域抽出工程と、
前記細胞画像解析装置が、前記細胞核領域から、断片化細胞核用閾値以上の輝度値を有する領域を断片化細胞核領域として抽出する断片化細胞核領域抽出工程と、
前記細胞画像解析装置が、前記細胞核領域から抽出された断片化細胞核領域が、2個以上である場合に前記細胞核領域を含む細胞の核が断片化されており、1個又は0個である場合に前記細胞核領域を含む細胞の核は断片化されていないと判別する断片化細胞核判別工程と、
により行い、
前記工程(d)におけるTUNEL染色画像の解析を、
前記細胞画像解析装置に、前記TUNEL染色画像を入力する画像入力工程と、
前記細胞画像解析装置が、入力されたTUNEL染色画像の、前記二本鎖核酸染色画像において抽出された細胞核領域に相当する領域に含まれる画素の輝度値の統計値を測定するTUNEL染色輝度値測定工程と、
前記細胞画像解析装置が、前記統計値が、前記TUNEL染色用閾値以上である場合に前記細胞核領域を含む細胞はDNA鎖の切断が生じており、前記TUNEL染色用閾値未満である場合に前記細胞核領域を含む細胞はDNA鎖の切断が生じていないと判別するDNA鎖切断判別工程と、
により行うことを特徴とする、DNAが断片化されたアポトーシス細胞の検出方法。 - 前記細胞観察用容器が、スライドガラスまたはマルチウェルプレートであることを特徴とする請求項1に記載のDNAが断片化されたアポトーシス細胞の検出方法。
- 顕微鏡画像の取得および画像解析を、イメージングサイトメータを用いて行うことを特徴とする請求項1又は2に記載のDNAが断片化されたアポトーシス細胞の検出方法。
- 細胞核用閾値、断片化細胞核用閾値、細胞核用面積閾値、及びTUNEL染色用閾値を予め記憶する閾値記憶部と、
蛍光性の二本鎖核酸染色剤により染色された細胞が撮像された二本鎖核酸染色画像と、DNA鎖切断部位を蛍光標識するTUNEL染色された、前記二本鎖核酸染色画像と同一視野のTUNEL染色画像を入力する画像入力部と、
入力された二本鎖核酸染色画像から、前記細胞核用閾値以上の輝度値を有する領域のうち細胞核用面積閾値以上の面積を有する領域を細胞核領域として抽出する細胞核領域抽出部と、
前記細胞核領域から、断片化細胞核用閾値以上の輝度値を有する領域を断片化細胞核領域として抽出する断片化細胞核領域抽出部と、
前記細胞核領域から抽出された断片化細胞核領域が、2個以上である場合に前記細胞核領域を含む細胞の核が断片化されており、1個又は0個である場合に前記細胞核領域を含む細胞の核は断片化されていないと判別する断片化細胞核判別部と、
入力されたTUNEL染色画像の、前記二本鎖核酸染色画像において抽出された細胞核領域に相当する領域に含まれる画素の輝度値の統計値を測定するTUNEL染色輝度値測定部と、
前記統計値が、前記TUNEL染色用閾値以上である場合に前記細胞核領域を含む細胞はDNA鎖の切断が生じており、前記TUNEL染色用閾値未満である場合に前記細胞核領域を含む細胞はDNA鎖の切断が生じていないと判別するDNA鎖切断判別部と、
核が断片化されていると判定され、かつ、DNA鎖の切断が生じていると判定された細胞を、DNAが断片化されたアポトーシス細胞であると解析する解析部と、
を備えることを特徴とする細胞画像解析装置。 - 前記断片化細胞核領域抽出部は、
前記細胞核領域から断片化細胞核用閾値以上の輝度値を有する領域を候補領域として抽出する候補領域抽出部と、
前記候補領域において、各画素の輝度値の傾きに基づいた境界線検出処理を行うことによって境界線を検出し、検出された境界線によって囲まれる領域を断片化細胞核領域として抽出する領域決定部と、
を備えることを特徴とする請求項4記載の細胞画像解析装置。 - 細胞核用閾値、断片化細胞核用閾値、細胞核用面積閾値、及びTUNEL染色用閾値を予め記憶する閾値記憶部を備えるコンピュータに対し、
蛍光性の二本鎖核酸染色剤により染色された細胞が撮像された二本鎖核酸染色画像と、DNA鎖切断部位を蛍光標識するTUNEL染色された、前記二本鎖核酸染色画像と同一視野のTUNEL染色画像を入力する画像入力工程と、
入力された二本鎖核酸染色画像から、前記細胞核用閾値以上の輝度値を有する領域のうち細胞核用面積閾値以上の面積を有する領域を細胞核領域として抽出する細胞核領域抽出工程と、
前記細胞核領域から、断片化細胞核用閾値以上の輝度値を有する領域を断片化細胞核領域として抽出する断片化細胞核領域抽出工程と、
前記細胞核領域から抽出された断片化細胞核領域が、2個以上である場合に前記細胞核領域を含む細胞の核が断片化されており、1個又は0個である場合に前記細胞核領域を含む細胞の核は断片化されていないと判別する断片化細胞核判別工程と、
入力されたTUNEL染色画像の、前記二本鎖核酸染色画像において抽出された細胞核領域に相当する領域に含まれる画素の輝度値の統計値を測定するTUNEL染色輝度値測定工程と、
前記統計値が、前記TUNEL染色用閾値以上である場合に前記細胞核領域を含む細胞はDNA鎖の切断が生じており、前記TUNEL染色用閾値未満である場合に前記細胞核領域を含む細胞はDNA鎖の切断が生じていないと判別するDNA鎖切断判別工程と、
核が断片化されていると判定され、かつ、DNA鎖の切断が生じていると判定された細胞を、DNAが断片化されたアポトーシス細胞であると解析する解析工程と、
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