JP2024505077A - 蛍光ベースの検出を使用した包埋組織試料の分析 - Google Patents

Abstract

本開示は、包埋媒体内に包埋された試料における天然に存在する成分の自家蛍光を使用する改善された方法及びシステムを対象とする。包埋試料の表面に露出した組織又は細胞調製物の量を決定する方法及びシステムと、包埋試料から関心領域（ＲＯＩ）を含む組織標本を調製する方法及びシステムとを提供する。生体組織の試料をイメージングする方法及びシステムと、包埋組織試料内の様々な細胞型を特定する方法及びシステムとについても提供する。【選択図】図３

Description

本開示は、蛍光ベースの検出、自動組織切片調製（automated tissue section preparation）、及び人工知能（ＡＩ）を使用したホルマリン固定-パラフィン包埋試料（formalin-fixed paraffin-embedded sample）等の包埋組織試料（embedded tissue sample）の分析に関する。

［関連出願の相互参照］
本願は、２０２１年２月１日付出願の米国特許出願第６３／１４４，３７２号の優先権及び利益を主張し、その内容は、全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

ホルマリン固定-パラフィン包埋（ＦＦＰＥ：formalin-fixed paraffin-embedded）組織ブロックの形成は、組織試料の形態及び細胞内容物を保存するのに役立つ。組織処理は一般に、単離された組織を数日間等の期間にわたってホルマリン中に入れ、そして、その組織をパラフィンワックス内に包埋することを含む。ＦＦＰＥ試料は、室温で長期間にわたって適切に貯蔵することができ、特に免疫組織化学的染色及び形態解析に有用である。ＦＦＰＥ試料は、遺伝子発現のプロファイリング及び疾患の研究に使用することもできる。

生物学的検査に際し、ＦＦＰＥ組織ブロックは、一般に、組織ブロックをミクロトーム（microtome）で切削することによってトリミングされる。組織ブロックは、ＦＦＰＥ内の組織の境界を決定するのに技師によって又は自動化された方法を使用して分析され得る。前者の場合に、技師は、一般にＦＦＰＥブロックを調べて、パラフィン内に包埋された組織の拡散画像を観察する。技師は、組織を含む切片の断面領域がどのように見えるはずかを確かめ、それをミクロトームブレード（microtome blade）から出てくるときの組織切片と比較することができる。組織ブロックは、典型的な組織量がブロックの表面に露出し、ブロック面がナイフの刃に確実に一致するようにトリミングされることが好ましい。

自動分析中に、組織をイメージングするのに一般的にカメラが利用される。光源は、パラフィンと組織表面との間の違いを識別する角度で組織ブロックの表面を照射する。パラフィンは組織に比べて滑らかであるため、自動分析はパラフィンと組織との異なる本来の質感を利用して２つの材料間を見分ける。

多くの既存の方法は、組織及びパラフィンの光学的特性及び表面特性のばらつきに影響され易いため、そのような方法は、様々な種類の組織及びパラフィンの分析に使用されたときに、不正確で一貫性のないデータをもたらす。一部の場合に、既存の方法を使用してＦＦＰＥ試料内の組織とパラフィンとを識別することは極めて困難である。

組織ブロックから薄片試料作製法（microtomy）を行った後に、水浴中で組織切片を平滑化し、これをベーキングすることにより、組織切片をスライドにマウントする。ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ：Hematoxylin and Eosin）染色が行われ、組織切片は病理学者によって調査される。癌細胞を含む疑いのあるＨ＆Ｅ染色組織切片を病理学者が調査する際に、彼らは、間質、線維芽細胞、血管、及び細胞外マトリックスからなり得る周囲の良性細胞の中でどの細胞が癌性であるかを特定することになる。腫瘍細胞は、同じ起源の正常細胞と比較して又は細胞外マトリックス内に存在するものを含む他の多くの細胞型（cell type）と比較して、より大きな核を有し得る。細胞外マトリックス及び正常細胞型は、腫瘍細胞と比較してはるかに高いレベルのコラーゲン及びエラスチンを有する傾向がある。

腫瘍における突然変異を特定することにより、病理学者及び腫瘍学者は患者の予後及び療法を指示することが可能となる。癌遺伝子は、正常細胞ではタンパク質の産生を促進し、細胞の正常な成長を刺激する遺伝子である。癌遺伝子に突然変異が存在すると、腫瘍細胞の抑制不能な成長及び増殖が促進される。腫瘍抑制遺伝子は、通常、正常細胞ではタンパク質の過剰増殖を阻害する機能がある遺伝子である。腫瘍抑制遺伝子における突然変異は、腫瘍細胞の成長及び増殖の増加を促進する。癌遺伝子又は腫瘍抑制因子に或る特定の突然変異を有する腫瘍用の薬物が開発されている。癌における免疫応答の役割は、他の調節経路における突然変異を薬物療法により標的とし得ることも示している。

腫瘍細胞における突然変異を特定する場合に、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ：quantitative polymerase chain reaction）及びその他の次世代シーケンシング（ＮＧＳ：next generation sequencing）試験といった突然変異の特定に使用される方法を成功させるには、２０％以上の腫瘍含有量が存在することが好ましい。マクロダイセクション（Macro-dissection）は、病理学者が、好ましくは２０％を超える腫瘍含有量を含む関心領域（ＲＯＩ：regions of interest）を慎重に選ぶ腫瘍濃縮法（tumor enrichment method）である。病理学者は、Ｈ＆Ｅ染色切片の上部にマーカを用いてその領域を囲って円を描く。そして、技師は、スライド上にマウントされた多数の未染色のＦＦＰＥ組織切片を使用して、病理学者によって特定されたＲＯＩを選択する。技師は、典型的には、ＲＯＩ内の組織をスライドから掻き取り、それを遠心分離管に入れる。掻き取られた組織からＤＮＡを単離してＮＧＳ検査を行う。マクロダイセクションでは、明視野顕微鏡（bright field microscope）の前に座って多数のスライドを評価し、高い腫瘍含有量を有する最良の例を見つけた後に手動でＲＯＩを丸で囲むのに非常に時間がかかるため、病理学者に多大な時間が求められる。

デジタル顕微鏡組織画像における核セグメンテーションにより、計算病理学における核形態計測及びその他の分析のための高品質の特徴の抽出が可能となり得る。しかしながら、Ｏｔｓｕセグメンテーション及びｗａｔｅｒｓｈｅｄセグメンテーション等の従来の画像処理技術は、クロマチン（chromatin）がまばらで密集した核等の困難な事例では効果的に機能しない。対照的に、機械学習ベースのセグメンテーション技術は、より全般的な核の外観のセットに対して有効である。しかしながら、機械学習アルゴリズムの訓練には、大規模な画像データセットが必要とされ、そこでは、膨大な数の核がアノテーションされて（annotate：注釈が付けられて）いなければならない。典型的には、核セグメンテーションアルゴリズムの作成には、苦心してアノテーションされた核境界を伴うＨ＆Ｅ染色組織画像の公的にアクセス可能な大規模なデータセットが使用される。有益なデータセットには、複数の患者、病状、及び器官からの多様な核の外観が含まれているべきであり、これで訓練された技術は、うまく一般化して、新規のＨ＆Ｅ染色画像に対して細かい設定なしですぐに使える可能性が高い。

したがって、包埋媒体内の組織試料における関心領域を決定し、包埋試料からの有用な組織切片の効率的な調製を容易にする更なる方法及び装置が求められている。

本発明の態様として、パラフィン等の包埋媒体内に包埋された試料の表面に露出した組織又は細胞調製物（cell preparation）の量を決定する方法が提供される。この方法は、組織の内在性成分（endogenous component）に自家蛍光を生じさせる波長で包埋組織試料又は細胞調製物試料を照射することと、包埋組織試料又は細胞調製物試料によって放出される自家蛍光（autofluorescence）の画像を取得することと、包埋媒体の表面での組織又は細胞調製物が占める画像のパーセンテージを決定することとを含む。

本発明の別の態様として、包埋組織試料内の様々な細胞型を特定する方法が提供される。この方法は、組織の内在性成分に自家蛍光を生じさせる波長で包埋組織試料を照射することと、組織試料によって放出される自家蛍光の画像を取得することと、組織試料によって放出される自家蛍光の画像内の様々な細胞型を自家蛍光特性に基づいて特定することとを含む。

本発明の別の態様として、組織及び包埋媒体を含む包埋組織試料内の関心領域（ＲＯＩ）を特定するように人工知能（ＡＩ）システムを訓練する方法が提供される。この方法は、組織の内在性成分に自家蛍光を生じさせる波長で包埋組織試料を照射することと、包埋組織試料によって放出される自家蛍光の画像を取得することと、画像内のＲＯＩを指示するように画像をアノテーションすることと、アノテーションされた画像をＡＩシステムへと入力することとを含み、ここで、ＡＩシステムは、学習して、アノテーションされていない画像内のＲＯＩを特定するようになる。

本発明の別の態様として、包埋試料から関心領域（ＲＯＩ）を含む組織標本（tissue specimen）を調製する方法が提供される。この方法は、未染色の包埋試料からＲＯＩを特定するように適合された訓練されたＡＩシステムを取得することと、組織及び包埋媒体を含む包埋試料に励起波長を有する電磁放射線（electromagnetic radiation）を照射することと、包埋組織の蛍光画像を生成することと、訓練されたＡＩシステムを使用して、包埋試料を染色せずに、蛍光画像に基づいて包埋試料におけるＲＯＩを特定することと、ＲＯＩを有すると特定された包埋試料の一部を組織標本として収集することとを含む。

本発明の別の態様として、生体組織（biological tissue）の試料をイメージングする方法が提供される。この方法は、生体組織の内在性成分に自家蛍光を生じさせる励起波長で生体組織試料を照射することと、生体組織試料によって放出される自家蛍光の画像を取得して、細胞外マトリックスを含む生体組織の領域を特定することと、生体組織試料内の核を核染色剤で染色して、細胞核を含む生体組織の領域を特定することとを含む。

本発明は、本明細書において記載される方法の様々な工程を実施するように構成された装置も含む。

本方法及び装置のこれらの特徴及び利点並びに他の特徴及び利点は、添付の特許請求の範囲とともに、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。

本教示は、添付の図面とともに読まれるときに、以下の詳細な説明から最も良く理解される。それらの特徴は必ずしも縮尺通りに描かれていない。

図１Ａ及び図１Ｂは、ヒト組織に内在する様々な蛍光体の励起スペクトル及び放出スペクトルのグラフを示す。図１Ａは、多数の生体分子の励起スペクトルを示し、図１Ｂは、同じ生体分子の放出スペクトルを示す。タンパク質は内在性蛍光体として機能し、タンパク質の蛍光放出を監視することによって検出又は追跡することができる。図１Ｃ及び図１Ｄは、ＦＦＰＥ組織ブロック試料の様々な薄片の蛍光放出画像のコレクションである。図１Ｃは、３６５ｎｍの励起源とともに５６０ｎｍ（５５ｎｍ幅のバンドパス）を中心とする吸収フィルタを使用したパラフィンの存在下での組織の蛍光の画像を示す。図１Ｄは、２８０ｎｍの励起源及び４０５ｎｍ（２０ｎｍ幅のバンドパス）を中心とする吸収フィルタを使用したパラフィンの蛍光を示す。図１Ｄに示されるように、パラフィンは蛍光を発することができるが、包埋試料においては組織の目に見えるほどの蛍光は見られない。この結果は、パラフィンの領域における蛍光を調べることによって、組織とパラフィンとの間のコントラストを更に増強することができることを示している。 図２Ａ～図２Ｉは、様々な組織の種類の明視野画像及び蛍光画像を示す。図２Ａ、図２Ｄ、及び図２Ｇは、白色光源とともに４０５ｎｍのカットオン波長（cut-on wavelength）を有するロングパス吸収フィルタを使用してキャプチャされた画像であり、図２Ｂ、図２Ｅ、及び図２Ｈは、４７０ｎｍの励起源とともに５４５ｎｍ（３０ｎｍのバンドパス）を中心とする吸収フィルタを使用してキャプチャされた画像である。図２Ｃ、図２Ｆ、及び図２Ｉは、３００ｎｍの励起源とともに５４５ｎｍ（３０ｎｍのバンドパス）を中心とする吸収フィルタを使用してキャプチャされた画像である。図２Ａ～図２Ｃは、脂肪組織の画像である。図２Ｄ～図２Ｆは、子宮組織の画像である。図２Ｇ～図２Ｉは、未知の種類の包埋組織の画像である。 図３Ａ～図３Ｄは、乳癌を含む５マイクロメートルの組織切片の自家蛍光（autofluorescence）画像及び対応するＨ＆Ｅ明視野画像を示す。自家蛍光画像は３００ｎｍの励起と５４５－３０バンドパス吸収フィルタとの組合せ及びカメラを使用してキャプチャされた。図３Ａ及び図３Ｂは、それぞれ組織切片の蛍光画像及びＨ＆Ｅ画像を示す。病理学者のアノテーション（青色の円）は、図３Ｃの自家蛍光画像及び図３ＤのＨ＆Ｅにおいて、他の細胞型を含む周囲の組織と比較して、癌細胞の大部分を含む大きな関心領域を示している。 図４Ａ～図４Ｄは、乳癌を含む組織ブロックの自家蛍光画像及び対応するＨ＆Ｅ画像を示す。５マイクロメートルの組織切片の薄片試料作製法の前に、ミクロトーム上のＦＦＰＥブロックを図４Ａにおいてイメージングした。自家蛍光画像は３００ｎｍの励起と５４５－３０バンドパス吸収フィルタとの組合せ及びカメラを使用してキャプチャされた。この組織切片をＨ＆Ｅ染色し、図４Ｂにおいて明視野ＷＳＩ（brightfield ＷＳＩ）をキャプチャした（図３Ｂ及び図３Ｄにも見られる）。病理学者のアノテーション（青色の円）は、図４Ｃの自家蛍光画像及び図４ＤのＨ＆Ｅにおいて、他の細胞型を含む周囲の組織と比較して、癌細胞の大部分を含む大きな関心領域を示す。 図５Ａ～図５Ｄは、露出した組織を検出するのに使用される蛍光ベースの画像処理システムを例示している。自家蛍光イメージングでは、鮮明に合焦した組織と、焦点が外れて見える表面下の組織とが識別された。露出した組織の面積は、局所焦点を測定することによって推定される。パラフィン内に包埋されたＦＦＰＥ組織を含むカセットを上面（図５Ａ）方向及び側面（図５Ｂ）方向から描写している漫画図は、包埋組織が様々な焦点面で見えることを示している。蛍光画像を使用して、組織ブロックについての深度マップを作成し、鮮明に合焦した組織と、焦点が外れた組織とを判定することができる。図５Ｃ及び図５Ｄは、３００ｎｍの励起源とともに５４５ｎｍ（３０ｎｍ幅のバンドパス）を中心とする吸収フィルタを使用してキャプチャされた２つの蛍光画像、及びそれらの蛍光画像に基づいて生成されたパラフィン内に包埋された各組織の対応する深度マップをグレースケールで示す。 図６Ａは、デジタル顕微鏡法による分析用の人工的に造形された組織を含む人工ブロックの漫画図解である。図６Ｂは、人工ＦＦＰＥブロックを作るためにパラフィン内に包埋された人工的に造形された組織の写真である。図６Ｃは、３００ｎｍで照射された人工ブロックを示しており、５４回目の切削によって組織の露出が検出された。グラウンドトゥルースデータ（ground truth data）を決定するために、組織を規則的な形状に切削することによって人工ブロックを作製し、それをデジタル顕微鏡法により測定した（Ａに示される漫画図）。そして、組織をパラフィン内に再包埋してＦＦＰＥブロック（Ｂ）を作製した。このＦＦＰＥブロック（Ｂ）は、薄片試料作製法時に組織が露出するときの既知のパラメータを有し、それによりアルゴリズム作成用のグラウンドトゥルースデータが得られる。（Ｃ）においては、アルゴリズム作成のために組織が３００ｎｍで照明され、これは５４回目の切削により検出された組織の露出によって示される。明視野生画像（brightfield raw image）は、鮮明に合焦した組織を示す蛍光イメージングの改善を実証し、それにより組織が優れた様式でパラフィンから識別された。 図７Ａ～図７Ｃは、肺組織を含むＦＦＰＥブロックの自動薄片試料作製法（automated microtomy）の間の本技術の性能を実証している。肺組織を含むＦＦＰＥブロックの自動薄片試料作製法の間にアルゴリズム性能を実証している。蛍光イメージングが組織ブロックについて波長（３００ｎｍ）で示されている。中央のパネルは、２４回目の５ミクロンの薄片（Ａ）、１２０回目の薄片（Ｂ）、及び３６７回目の薄片（Ｃ）についての露出組織のアルゴリズムベースの検出を示している。２４回目の薄片は、ＦＦＰＥブロック内へのより深い切削と比較して、非常に少ない組織を有していた。 図８Ａ及び図８Ｂは、明視野及び３００ｎｍのＵＶ光源下でのＦＦＰＥ組織ブロックの画像である。図８Ｃは、組織表面のトポロジ（topology）を示す関連の深度マップであり、ここで、黄色のピークはブロック表面に最も近い点を示し、図８Ｄは、図８Ｃにおける３Ｄ深度マップを使用して生成された組織の切片化に最適な予測平面（マップ上部のメッシュ平面）を示している。 図９Ａ～図９Ｆは、蛍光ベースのイメージングを使用したＦＦＰＥ組織の表面下のトポロジ検出を示す。高解像度画像は、自家蛍光イメージングがパラフィン包埋組織内の様々な細胞型を識別し、キャプチャされた画像に詳細な表面下のトポロジ情報を追加することを示している。フィルタを使用して４７０ｎｍの励起及び５２５ｎｍの放出で乳房組織をイメージングした（Ｂ及びＥ）。フィルタを使用して３６５ｎｍの励起／４４５ｎｍの放出で乳房組織をイメージングした（Ｃ及びＦ）。（Ａ及びＤ）は、蛍光イメージングでも可視の扁平上皮（Ａ、Ｂ、及びＣにおいて矢印によって示される）及び脂肪細胞（Ｄ、Ｅ、及びＦにおいて矢印によって示される）の領域を有する乳房組織のＨ＆Ｅ染色された組織切片の画像を示す。２００倍の倍率である。 図１０Ａ～図１０Ｆは、本開示によって提供される新規のワークフローを実証するスキャンされた全スライド画像（ＷＳＩ：whole-slide-image）を示す。自家蛍光イメージングされた未染色の脱パラフィン処理したＦＦＰＥ組織のＷＳＩを２０倍の倍率で図１０Ａ及び図１０Ｄに示す。ＦＩＴＣ（緑色）チャンネルにおいて細胞外マトリックスがはっきりと見られる。図１０Ｂ及び図１０ＥにおけるＤＡＰＩ染色組織の蛍光のＷＳＩは、ＤＡＰＩ含有の蛍光封入剤を加えること（表３におけるワークフローの工程４）により、核が細胞外マトリックスから明確に識別可能であることを示す。Ｈ＆ＥのＷＳＩは、図１０Ｃ及び図１０Ｆにおける対応する領域を示し、腫瘍細胞、脂肪、及び細胞外マトリックスを示す（表３におけるワークフローの工程７）。

本発明の方法は一般に、組織（及び細胞調製物）における内在性蛍光体の自家蛍光を利用して、パラフィン又はエポキシ樹脂等の包埋媒体から組織を識別する。本開示は一般に、組織に適用した本方法を記載しているが、そのような記載は細胞調製物にも同様に当てはまることが理解されるべきである。幾つかの実施形態において、組織又は細胞調製物は、組織、細胞ペレット、及び（２つ以上の細胞型を含み得る）細胞スフェロイド（cell spheroid）からなる群から選択される。組織と包埋媒体との間の対比は、ホルマリン固定-パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織ブロック等の包埋試料を適切な波長で照射し、その結果生じる組織からの内在性自家蛍光放出を検出することによって実現され得る。自家蛍光放出を使用して、組織の成分及びその位置を特定することができる。例えば、本発明の方法を使用して、ホルマリン固定-パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織ブロックの表面に位置する組織のパーセンテージを決定することができる。本開示の蛍光方法を実施した後に、組織切片の生物学的分析又は染色を行うことができる。幾つかの実施形態において、本方法では、組織切片の染色が削減又は回避される。本発明の方法は多岐にわたる組織の種類に有効であり、本発明の方法を使用して、通常の照明条件下では組織成分を識別することが難しい場合において組織成分を特定することができる。

電磁放射線を吸収した物質による光の放出である蛍光は、分析物の存在又は量を解明するのに一般的に使用される。蛍光性化合物は、或る特定の条件下で光を吸収及び放出することができ、ここで、放出される光は一般により低いエネルギの光である。自家蛍光は、生体分子が或る特定の波長で照射されたときの、一般に或る波長ピーク又は波長パターンでの生体分子による天然の光の放出である。各蛍光性生体分子は、その独自の励起スペクトル及び放出スペクトルを有している。ヒト組織及び動物組織において、コラーゲン及びエラスチン等のタンパク質は自家蛍光を発することができる。図１Ａは、多数の生体分子の励起スペクトルを示し、図１Ｂは、同じ生体分子の放出スペクトルを示す。タンパク質は内在性蛍光体として機能し、タンパク質の自家蛍光放出を監視することによってタンパク質を検出又は追跡することができる。

図１Ｃは、３６５ｎｍの励起源とともに５６０ｎｍ（５５ｎｍ幅のバンドパス）を中心とする吸収フィルタを使用したパラフィンの存在下での組織の自家蛍光の画像を示す。図１Ｄは、２８０ｎｍの励起源及び４０５ｎｍ（２０ｎｍ幅のバンドパス）を中心とする吸収フィルタを使用したパラフィンの蛍光を示す。図１Ｄに示されるように、パラフィンは蛍光を発することができるが、包埋試料においては組織の目に見えるほどの自家蛍光は見られない。この結果は、パラフィンの領域における蛍光を調べることによって、組織とパラフィンとの間のコントラストを更に増強することができることを示している。

表１は、組織成分を特定するのに使用することができる内在性蛍光体の励起極大及び放出極大を示す。表１は、Ramanujam, N.著、「腫瘍性組織及び非腫瘍性組織の蛍光分光法（Fluorescence Spectroscopy of Neoplastic and Non-Neoplastic Tissues.）」 Neoplasia. 2000 2, 89-117から抜粋したものである。

表２は、多くの組織の種類にわたって特定された共通のピーク励起波長を示す。共通の分子成分／内在性蛍光体からのスペクトル寄与は組織の種類間で共有される。表２は、Favreau, P.F.ら著、「蛍光励起走査スペクトルイメージングを使用した非標識の分光組織特性評価（Label-free spectroscopic tissue characterization using fluorescence excitation-scanning spectral imaging.）」 J. Biophotonics. 2019;e201900183から抜粋したものである。

図２は、様々な組織の種類の明視野画像及び自家蛍光画像を示す。自家蛍光についてのピーク励起波長及びピーク放出波長は、共通の分子成分又は内在性蛍光体、構造タンパク質、酵素、脂質、及びポルフィリンの濃度における変動により組織の種類間で異なる。明視野画像では、脂肪（パネルＡ）、子宮（パネルＤ）、及び結腸（パネルＧ）においてより少ない表面下のトポロジが示される。脂肪の自家蛍光は、３００ｎｍの励起フィルタ（５４５の放出、３０ｎｍのバンドパス幅）（パネルＣ）と比べて、４７０ｎｍの励起フィルタ（５４５の放出、３０ｎｍのバンドパス幅）（パネルＢ）を使用することで最適であった。子宮及び結腸の場合は、自家蛍光ピーク励起／放出は、４７０ｎｍの励起フィルタ（パネルＥ及びパネルＨ）と比べて、３００ｎｍの励起フィルタとともに５４５ｎｍの放出、３０ｎｍのバンドパス幅（パネルＦ及びパネルＩ）を使用することで最適であった。

自家蛍光のイメージングに使用する最適なフィルタセットを決定するのに、表１及び表２を一般的な指針として使用することができ、市販のフィルタセットを含む多数のフィルタセットを試験することができる。脂肪組織は、４３６ｎｍ付近のピーク励起及び５４０ｎｍの放出を有する高濃度のリン脂質を含む。子宮及び結腸の場合は、それぞれ３２５ｎｍ及び２９０ｎｍでピーク励起を有し、かつ４００ｎｍの放出で放出を有する構造タンパク質が優勢である。

蛍光ベースのイメージングにより、白色光イメージングと比較して、組織切片の表面下のトポロジの２次元（２Ｄ）決定の大幅な改善が可能となる。これは、様々な励起フィルタ及び吸収フィルタを使用したコラーゲン及びエラスチン等の細胞成分の組織自家蛍光の発光によるものである。これにより、白色光照明単独と比べて、表面下のトポロジに多くのコンテキストが追加され、トリミングについての薄片試料作製法の自動化に使用されるアルゴリズム作成の向上につながる。

白色光イメージングを使用してトリミングする以前の方法は、組織及びパラフィンの光学的特性及び表面特性のばらつきに対する感度を欠くため、様々な種類の組織及びパラフィンの分析に使用された場合に、殆どが定性的で不正確である。本方法は、最適な切片化面を決定するとともに、最適な量の組織が露出するまでにどの程度トリミングすべきかを推定する定量的方法を提供する。この方法の利点は、白色光では不可視である自家蛍光ベースのイメージングによる組織表面下のトポロジの決定に基づいており、これにより、自動化された薄片試料作製法の設定におけるトリミング用のアルゴリズムの高度な改善が可能となる。

（表面に露出した組織又は細胞調製物の量の決定）
本開示は、包埋媒体内に包埋された試料の表面に露出した組織又は細胞調製物の量を決定する方法を提供する。

手作業による切片化においては、露出した組織の技師による定性的な評価は、多めにトリミングしすぎてしまう可能性があるため、組織試料の使用に無駄が多くなる場合がある。幾つかの実施形態において、本方法は、組織試料の自家蛍光及び局所焦点測定に基づくアルゴリズムを使用して、パラフィン内に埋設された組織表面のトポロジを推定し、切片化面を特定し、組織の使用を増加させ又は最大化する。露出した組織の面積を定量的に評価することにより、組織の使用量を高めて、その診断可能性を実現することができる。本方法は、どこまでトリミングすると適切なパーセンテージの組織が露出するかを推定することによってトリミングプロセスの速度を上げることもでき、白色光で照明された画像と人間の眼とを使用して用いられる定性的な方法又は白色の照明に関連するアルゴリズムとは対照的に、定量的な精度の高い様式でトリミングプロセスを行うことができる。

本方法は、組織の内在性成分に自家蛍光を生じさせる波長で包埋組織試料又は細胞調製物試料を照射することと、包埋組織試料又は細胞調製物試料によって放出される自家蛍光の画像を取得することと、包埋媒体の表面での組織又は細胞調製物が占める画像のパーセンテージを決定することとを含む。

幾つかの実施形態において、包埋媒体の表面での組織が占める画像のパーセンテージは、組織及び包埋媒体を含む包埋組織試料から組織切片を薄切することと、包埋組織試料に励起波長を有する電磁放射線を照射することと、包埋試料の自家蛍光放出から蛍光画像を生成することと、蛍光画像のピクセルについて局所焦点尺度（local focus measure）を決定することと、自家蛍光の画像ぼけの評価に基づいて組織の深度マップを構築することと、深度マップに基づいて包埋試料についての切片化面（sectioning plane）を決定することとによって決定される。

本開示は、焦点尺度ベースの検出方法（focus-measure-based detection method）を展開して、トリミングの間にＦＦＰＥブロックにおける露出した組織の量を定量化する。自家蛍光イメージングは、様々な組織の種類にわたってより一貫したシグナルを与える可能性がある追加情報を提供する。露出される組織の量を定量化して最適なトリミング及び切片化を行うために自家蛍光イメージングを使用する。

幾つかの実施形態において、局所焦点尺度は、演算子を蛍光画像に適用することによって決定される。例えば、演算子は変形ラプラス演算子（modified Laplacian operator）であり得る。幾つかの実施形態において、局所焦点尺度は、入力画像内の複数のピクセルを囲うｎ×ｎの近傍において測定される。

幾つかの実施形態において、上記方法は、１つ以上の処理演算を実行して、蛍光画像を取得することを更に含む。処理演算は、画像レジストレーション（image registration）、コントラスト強調、及び画像平滑化（image smoothing）からなる群から選択され得る。

幾つかの実施形態において、切片化面及び切削組織切片内の組織の所望の量は１０％～１００％である。例えば、幾つかの実施形態において、切片化面及び切削組織切片内の組織の所望の量は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、若しくは約１００％、又は上述の値のいずれか２つの値の間の端点を有する範囲内である。幾つかの実施形態において、各薄片画像上の焦点指標（focus metric）を初回の薄片画像に対して正規化することによって、露出した組織を特定する。幾つかの実施形態において、所望の組織量が存在する場合の切片化面で包埋組織試料から組織切片を切削する。幾つかの実施形態において、所望の組織量が決定された後に、その切片化面の包埋試料から組織切片を切削する。

（包埋組織試料内の様々な細胞型の特定）
本開示はまた、包埋組織試料内の様々な細胞型を特定する方法を提供する。この方法は、組織の内在性成分に自家蛍光を生じさせる波長で包埋組織試料を照射することと、組織試料によって放出される自家蛍光の画像を取得することと、組織試料によって放出される自家蛍光の画像内の様々な細胞型を自家蛍光特性に基づいて特定することとを含んでなる。

幾つかの実施形態において、包埋組織試料内の様々な細胞型は、組織及び包埋媒体を含む包埋組織試料から組織切片を露出させることと、包埋組織試料に励起波長を有する電磁放射線を照射することと、包埋試料の自家蛍光放出から蛍光画像を生成することと、蛍光画像のピクセルについて局所焦点尺度を決定することと、蛍光の画像ぼけの評価に基づいて組織の深度マップを構築することとによって決定される。幾つかの実施形態において、組織の深度マップは、包埋媒体内の組織の表面下のトポロジである。

幾つかの実施形態において、蛍光画像はイメージングデバイスによってキャプチャされる。

幾つかの実施形態において、局所焦点尺度は、変形ラプラス演算子等の演算子を蛍光画像に適用することによって決定される。幾つかの実施形態において、局所焦点尺度は、入力画像内の複数のピクセルを囲うｎ×ｎの近傍において測定される。幾つかの実施形態において、上記方法は、画像レジストレーション、コントラスト強調、及び画像平滑化からなる群から選択される処理演算等の１つ以上の処理演算を実行して蛍光画像を取得することを更に含む。

幾つかの実施形態において、組織試料についての最適な切片化面の予測は、包埋媒体内の組織の表面下のトポロジの評価に基づく。

（包埋組織試料内の関心領域（ＲＯＩ）を特定する人工知能（ＡＩ）システムの訓練）
本開示はまた、組織及び包埋媒体を含む包埋組織試料内の関心領域（ＲＯＩ）を特定する人工知能（ＡＩ）システムを訓練する方法を提供する。この方法は、組織の内在性成分に自家蛍光を生じさせる波長で包埋組織試料を照射することと、包埋組織試料によって放出される自家蛍光の画像を取得することと、画像内のＲＯＩを指示するように画像をアノテーションすることと、アノテーションされた画像をＡＩシステムへと入力することとを含んでなり、ここで、ＡＩシステムは、学習して、アノテーションされていない画像内のＲＯＩを特定するようになる。

幾つかの実施形態において、包埋組織試料は、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色、免疫組織化学（ＩＨＣ：immunohistochemistry）染色、又はタンパク質マーカについての免疫蛍光（ＩＦ：immunofluorescence）染色で染色されている。幾つかの実施形態において、包埋組織試料の画像を、包埋組織試料の全スライド画像に対してアノテーションする。

幾つかの実施形態において、包埋試料は組織ブロックの部分として照射され、上記方法は包埋試料を組織ブロックから組織切片として薄切することを更に含む。

幾つかの実施形態において、訓練されたＡＩシステムは、分子アッセイ（molecular assay）のために腫瘍濃縮法に従って腫瘍細胞を含むＲＯＩを特定するように適合される。

幾つかの実施形態において、ＡＩシステムは、機械学習システム、深層学習システム、ニューラルネットワーク、畳み込みニューラルネットワーク、完全畳み込みニューラルネットワーク、セグメンテーション畳み込みニューラルネットワーク、リカレントニューラルネットワーク（recurrent neural network）、統計モデルベースのシステム、又は決定的アルゴリズムベースの解析システムの少なくとも１つを含む。

幾つかの実施形態において、未訓練の又は事前訓練されたＡＩシステムを取得することと、明視野イメージング又は自家蛍光ベースのイメージングによって検出可能な染色剤で包埋組織試料を染色することと、染色された包埋組織試料の１つ以上の染色画像を明視野イメージング又は自家蛍光イメージングによって生成することと、染色された包埋組織試料のＲＯＩを、１つ以上の染色画像に対してアノテーションすることと、１つ以上の染色画像のアノテーションされたＲＯＩを、未染色の自家蛍光画像にマッピングすることと、マッピングされた蛍光画像を使用することによって未訓練の又は事前訓練されたＡＩシステムを訓練することとによって、ＡＩシステムは、学習して、アノテーションされていない画像内のＲＯＩを特定するようになる。幾つかの実施形態において、ＡＩシステム訓練データをマッピングされた自家蛍光画像から取得して、未訓練の又は事前訓練されたＡＩシステムを訓練する。

幾つかの実施形態において、ＡＩシステムは、未染色の包埋組織試料上のＲＯＩを特定するように適合される。幾つかの実施形態において、ＲＯＩは、腫瘍含有領域を特定する。幾つかの実施形態において、ＲＯＩは、腫瘍核を取り囲む細胞外マトリックス及び細胞質からの内在性蛍光体の濃度に対応する自家蛍光レベルを検出することによって特定される。

幾つかの実施形態において、腫瘍核を取り囲む細胞外マトリックス及び細胞質の自家蛍光レベルを、コントロール試料（control sample）の自家蛍光レベルと比較する。コントロール試料は、コントロール核、コントロール細胞質、コントロール間質、又はコントロール細胞外マトリックス成分を含み得る。幾つかの実施形態において、腫瘍核を取り囲む細胞外マトリックス又は細胞質の自家蛍光レベルは、コントロール試料の自家蛍光レベルよりも低い。コントロール核は、微細なクロマチン及び単一の核小体（nucleolus）を備えた腫瘍核よりも小さい場合がある。

幾つかの実施形態において、上記方法は、包埋試料を組織切片としてスライド上にマウントし、第１のフィルタ及び第２のフィルタを使用して組織をイメージングすることと、組織切片を処理して包埋媒体を除去し、核を透過処理して核に対する染色を容易にすることと、核に特異的なＤＡＰＩ等の染色剤を組織切片に適用して、核染色組織切片を形成することと、核染色組織切片をイメージングして、核染色組織切片画像を生成することと、核染色封入剤を除去することと、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色剤、免疫組織化学（ＩＨＣ）染色剤、又は免疫蛍光（ＩＦ）染色剤を適用して、細胞染色組織切片を生成することと、細胞染色組織切片にカバースリップ（coverslip）をかけることと、明視野イメージングを使用して細胞染色組織切片をイメージングして、染色画像を生成することとを更に含む。

本開示は、未染色の脱パラフィン処理された組織を最初にＦＩＴＣフィルタ及びＤＡＰＩフィルタにおいて自家蛍光についてイメージングして細胞質ゾル及び細胞外マトリックスを特定するワークフローを提供する。そして、脱パラフィン処理された組織をペプシン又は電界処理のいずれかによって処理して、ＤＡＰＩ染色が核に浸透し得るようにする。そして、ＤＡＰＩ染色組織を、ＦＩＴＣチャンネル及びＤＡＰＩチャンネルにおいて蛍光について再度イメージングする。第１の画像は、ＦＩＴＣ自家蛍光のみを示している。第２の画像は、核から細胞質ゾル及び細胞外マトリックスを非常に明確に識別するＦＩＴＣ及びＤＡＰＩで染色された蛍光を示している。この技術の追加の利点は、密集した核間であっても核の境界が非常に明確に特定されることである。したがって、ＡＩの訓練用に、第２のＤＡＰＩ染色画像をベースとして使用し、Ｈ＆Ｅ画像にマッピングし直して、周囲の正常細胞及び細胞外マトリックスに対する腫瘍核の核セグメンテーションを実現することが可能である。このワークフローにより、病理学者は、核セグメンテーションモデルの訓練のためにＨ＆Ｅ染色切片をアノテーションするという骨の折れるプロセスから解放されることとなる。

このワークフローは、病理学者及び計算生物学者によるＨ＆Ｅ染色組織切片の分析によって得られたデータを使用するよりも明確かつ簡潔な方式で、マクロダイセクション及び核セグメンテーション用に作成された機械学習アルゴリズムの訓練に役立つことになる。

本開示は、（１）核形態計測解析のために核セグメンテーションを実行するアルゴリズムベースの検出方法と、（２）後続のゲノム検査方法のために腫瘍の関心領域のマクロダイセクションを実行するアルゴリズムベースの検出方法とに使用することができるワークフローを記載している。このワークフローを使用して作成されたアルゴリズムは、薄片試料作製法の間に未染色のＦＦＰＥブロックを使用して又はスライド上の組織切片を使用して展開することができる。

核セグメンテーションアルゴリズムを作成する以前の技術では、苦心してアノテーションされたＨ＆Ｅ画像の大規模なデータベースが必要とされる。ＤＡＰＩ染色された核は、細胞質コンパートメント及び細胞外マトリックスにおいて見られる自家蛍光から非常に明確に識別されるため、本方法は、病理学者のアノテーションを必要としない。

マクロダイセクション用のアルゴリズムを作成する以前の技術では、Ｈ＆Ｅ染色された組織切片を病理学者によりアノテーションした後に、これをブロック面又はスライド上にマウントされた組織切片の自家蛍光画像にマッピングし直すことも必要とされた。マクロダイセクション用に作成されたアルゴリズムは、腫瘍及び正常な核のサイズの違いを使用する場合があり、これらのアルゴリズムは、選択される関心領域内の腫瘍細胞の数を定量化することができる。

（包埋試料からの関心領域（ＲＯＩ）を含む組織標本の調製）
本開示はまた、包埋試料から関心領域（ＲＯＩ）を含む組織標本を調製する方法であって、未染色の包埋試料からＲＯＩを特定するように適合された訓練されたＡＩシステムを取得することと、組織及び包埋媒体を含む包埋試料に励起波長を有する電磁放射線を照射することと、包埋試料の蛍光画像を生成することと、訓練されたＡＩシステムを使用して、包埋試料を染色せずに、蛍光画像に基づいて包埋試料におけるＲＯＩを特定することと、ＲＯＩを有すると特定された包埋試料の一部を組織標本として収集することとを含んでなる方法を提供する。蛍光画像は、包埋試料を含む組織切片から、及び／又は包埋試料を含む組織ブロックから生成され得る。幾つかの実施形態において、蛍光画像を組織切片から生成し、包埋試料の収集された部分を組織ブロックから収集する。

幾つかの実施形態において、包埋試料の収集された部分から包埋媒体を除去して、組織標本を得る。幾つかの実施形態において、組織標本から細胞成分を除去して核酸標本（nucleic acid specimen）を得て、核酸標本から核酸配列（nucleic acid sequence）を決定する。

幾つかの実施形態において、訓練されたＡＩシステムは、組織の内在性成分に自家蛍光を生じさせる波長で包埋組織試料を照射することと、包埋組織試料によって放出される自家蛍光の画像を取得することと、画像内のＲＯＩを指示するように画像をアノテーションすることと、アノテーションされた画像をＡＩシステムへと入力することとによって得られ、ここで、ＡＩシステムは、学習して、アノテーションされていない画像内のＲＯＩを特定するようになる。

幾つかの実施形態において、ＡＩシステムは、機械学習システム、深層学習システム、ニューラルネットワーク、畳み込みニューラルネットワーク、完全畳み込みニューラルネットワーク、セグメンテーション畳み込みニューラルネットワーク、リカレントニューラルネットワーク、統計モデルベースのシステム、又は決定的アルゴリズムベースの解析システムの少なくとも１つを含む。

幾つかの実施形態において、訓練されたＡＩシステムは、自家蛍光を使用して包埋試料を組織ブロックの部分としてイメージングし、包埋試料を組織ブロックから組織切片として薄切することと、包埋試料を組織切片としてスライド上にマウントし、第１のフィルタ及び第２のフィルタを使用して組織をイメージングすることと、組織切片を処理して包埋媒体を除去し、核に対する染色剤に対して核を透過処理することと、核染色封入剤中の核染色剤を組織切片に適用して、核染色組織切片を形成することと、核染色組織切片をイメージングして、核染色組織切片画像を生成することと、核染色封入剤を除去することと、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色剤、免疫組織化学（ＩＨＣ）染色剤、又は免疫蛍光（ＩＦ）染色剤を適用して、細胞染色組織切片を生成することと、細胞染色組織切片にカバースリップをかけることと、明視野イメージングを使用して細胞染色組織切片をイメージングして、染色画像を生成することとによって得られる。

（生体組織の試料のイメージング）
本開示はまた、生体組織の試料をイメージングする方法であって、生体組織の内在性成分に自家蛍光を生じさせる励起波長で生体組織試料を照射することと、生体組織試料によって放出される自家蛍光の画像を取得して、細胞外マトリックスを含む生体組織の領域を特定することと、生体組織試料内の核を核染色剤で染色して、細胞核を含む生体組織の領域を特定することとを含んでなる方法を提供する。

幾つかの実施形態において、生体組織試料を脱パラフィン処理し、洗浄溶液で前処理する。例えば、洗浄溶液は、キシレン及びペプシン消化（xylene and pepsin digestion）、又は再水和（rehydration）を伴う電界処理を含み得る。幾つかの実施形態において、核染色剤は蛍光封入剤を含む。幾つかの実施形態において、生体組織試料を蛍光イメージングによってスキャンする。幾つかの実施形態において、組織切片を水中に浸すことによってＤＡＰＩを除去する。

幾つかの実施形態において、訓練されたＡＩシステムを作成する。

幾つかの実施形態において、細胞核を含む生体組織の領域を特定する工程により、腫瘍細胞及び核染色腫瘍細胞の特定が可能となる。

幾つかの実施形態において、生体組織試料を使用して、各自家蛍光画像を作成する。幾つかの実施形態において、自家蛍光画像は、第１の画像である。幾つかの実施形態において、生体組織試料において核を核染色剤で染色することによって第２の画像を取得する。幾つかの実施形態において、第１の画像及び第２の画像により、生体組織内の腫瘍境界が特定される。幾つかの実施形態において、Ｈ＆Ｅ画像又はＩＨＣ画像に第２の画像をマッピングして、腫瘍細胞の核セグメンテーションを示す。

幾つかの実施形態において、細胞核を含む生体組織の領域は、腫瘍核である。幾つかの実施形態において、腫瘍核を取り囲む細胞外マトリックスの自家蛍光レベルを検出することによって、細胞核を含む生体組織の領域を特定する。腫瘍核を取り囲む細胞外マトリックスの自家蛍光レベルを、コントロール試料の自家蛍光レベルと比較することができる。コントロール試料は、コントロール核、コントロール細胞質、コントロール間質、又はコントロール細胞外マトリックス成分を含み得る。腫瘍核を取り囲む細胞外マトリックスの自家蛍光レベルは、コントロール試料の自家蛍光レベルよりも低い場合がある。幾つかの実施形態において、コントロール核は、腫瘍核よりも小さく、単核であり、１つの核小体及び微細なクロマチンを含む。

（本方法に関する追加情報）
上述の方法の様々な実施形態を、あらゆる所望の方式で実装することができる。幾つかの実施形態において、包埋媒体はパラフィンである。幾つかの実施形態において、包埋媒体はエポキシ樹脂である。

幾つかの実施形態において、イメージングデバイスを使用して自家蛍光放出を検出する。幾つかの実施形態において、イメージングデバイスは、デジタルカメラ等のカメラを備えている。そのような場合に、組織及びパラフィン等の包埋媒体を含む包埋試料に光を照射し、その結果生じる自家蛍光放出を、デジタルカメラを使用してキャプチャする。デジタル画像における自家蛍光の存在は、研究中の試料において組織が存在することの指標を与える。幾つかの実施形態において、本方法を、デジタルカメラ及びミクロトームを備える光学システムを使用して実施する。幾つかの実施形態において、本方法を、蛍光顕微鏡を使用して実施する。

幾つかの実施形態において、包埋媒体は、選択された波長で照射されたときに実質的な自家蛍光を示さない。

本方法を使用して、あらゆる種類の組織を分析することができる。幾つかの実施形態において、組織は、ヒト組織である。幾つかの実施形態において、組織は、動物組織である。幾つかの実施形態において、組織は、マウス、ラット、イヌ、又は霊長類の組織である。本方法を使用して、あらゆる器官又は解剖学的部分からの組織切片を分析することができる。幾つかの実施形態において、組織は、乳房、前立腺、肺、結腸、直腸、膀胱、子宮体部、甲状腺、腎臓、口腔（例えば、扁桃腺）、膵臓、肝臓、子宮頸部、胃、小腸、脳、脊髄、心臓、骨、関節、食道、胆嚢、脂肪、皮膚、脾臓、胎盤、陰茎、尿道、卵管、卵巣、外陰部、副腎、虫垂、又は眼から単離される。幾つかの実施形態において、組織は、ヒト又は動物を起源とするペレット化された細胞である。幾つかの実施形態において、本方法を使用して、罹患した組織又は健康な組織を試験する。幾つかの実施形態において、本方法を使用して、癌、感染性疾患、代謝性疾患、変性疾患、炎症性疾患、又はそれらの組合せを特定する。

幾つかの実施形態において、包埋試料はホルマリン固定-パラフィン包埋試料である。ホルマリン固定-パラフィン包埋試料は、あらゆる種類のパラフィンから形成され得る。幾つかの実施形態において、パラフィンは、完全精製パラフィンワックス（fully refined paraffin wax）と合成樹脂又はポリマとのブレンドである。幾つかの実施形態において、パラフィンは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：dimethyl sulfoxide）を含む。幾つかの実施形態において、ホルマリン固定-パラフィン包埋試料は、造粒パラフィンワックス、完全精製パラフィンワックス、半精製パラフィンワックス、又はそれらの組合せから形成される。したがって、幾つかの実施形態においては、ホルマリン固定-パラフィン包埋試料において、造粒パラフィンワックス、完全精製パラフィンワックス、又は半精製パラフィンワックスから組織を識別することができる。幾つかの実施形態において、ホルマリン固定-パラフィン包埋試料は、Ｓｐｅｃｔｒｕｍパラフィン、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅパラフィン、Ｆｉｓｈｅｒｆｉｎｅｓｔ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈパラフィンワックス、ＥＭＳ Ｐａｒａｍａｔ、Ｐａｒａｐｌａｓｔ、Ｐｏｌｙｆｉｎ、Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ ＶＩＰ、Ｌｅｉｃａ Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ Ｐａｒａｐｌａｓｔ、又はそれらの組合せから形成される。

幾つかの実施形態において、包埋媒体はエポキシ樹脂である。幾つかの実施形態において、エポキシ樹脂は、グリシジルエポキシ樹脂である。幾つかの実施形態において、エポキシ樹脂は、非グリシジルエポキシ樹脂である。幾つかの実施形態において、エポキシ樹脂は、脂肪族樹脂及び脂環式樹脂から選択される非グリシジル樹脂である。幾つかの実施形態において、エポキシ樹脂は、グリシジルアミン、グリシジルエステル、グリシジルエーテル、及びそれらの組合せから選択されるグリシジルエポキシである。幾つかの実施形態において、エポキシ樹脂は、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ethylene glycol diglycidyl ether）である。幾つかの実施形態において、エポキシ樹脂は、Ａｒａｌｄｉｔｅ、Ｑｕｅｔｏｌ、Ｅｐｏｎ ８１２、Ｅｍｂｅｄ ８１２、Ｐｏｌｙ－Ｂｅｄ ８１２、又はそれらの組合せである。幾つかの実施形態において、エポキシ樹脂は、グリセロールベースの脂肪族エポキシ樹脂である。幾つかの実施形態において、組織をエポキシ樹脂内に包埋することにより、改善された形態を有する組織切片が得られる。

幾つかの実施形態において、包埋試料を切削して又は薄切して、薄片及びトリミングされたブロックを得る。幾つかの実施形態において、包埋試料をミクロトームにおいて薄切又はトリミングする。幾つかの実施形態において、包埋試料がミクロトームによって薄切又はトリミングされている間に、包埋試料の自家蛍光を検出する。トリミングされたブロックに光を照射し、これを分析して、自家蛍光の存在を決定する。イメージングを使用して、自家蛍光の存在を決定することができる。トリミングプロセス及び／又は照射プロセスを必要に応じて繰り返す。例えば、組織の表面が見つかるまで、トリミングプロセス／照射プロセスを繰り返すことができる。

幾つかの実施形態において、１つ以上の内在性化学種の自家蛍光を定量的に測定して、包埋試料内の組織の位置を決定する。

幾つかの実施形態において、蛍光デジタル画像のピクセル強度を使用して、包埋試料内の組織の成分及び／又は位置を決定する。トリミングされたブロックに光を照射し、蛍光顕微鏡を使用してデジタル画像を取得する。蛍光顕微鏡システムは、蛍光分析中に検出された光子をピクセル強度値に変換するソフトウェアを備えていることから、利用者は関心領域のピクセル強度を決定することができる。トリミングされたブロックを、更に薄切又はトリミングし、蛍光顕微鏡システムによって分析して、第２のデジタル画像を得る。２つ以上のデジタル画像のピクセル強度の比較を使用して、包埋試料内の組織の位置を決定することができる。例えば、２つのデジタル画像間でのピクセル強度値の増加は、トリミングされたブロック内の組織が露出しており、生物学的検査のために切削及び使用の準備ができていることを示し得る。

幾つかの実施形態において、本方法を使用して、包埋試料内の組織試料の表面の成分及び／又は位置を決定する。幾つかの実施形態において、本方法を使用して、包埋試料における組織から包埋媒体への遷移部又は包埋媒体から組織への遷移部の位置を決定する。幾つかの実施形態において、本方法を使用して、組織のその全体の位置を突き止める。

幾つかの実施形態において、上記方法は、包埋試料から切片を薄切することと、決定された組織表面の位置に基づいて切片を受け入れる又は拒否することとを含む。幾つかの実施形態において、照射を多数回実施し、各照射の前に包埋試料を切削する。

組織内の内在性化学種の自家蛍光放出を使用して、包埋試料内の組織の成分及び／又は位置を決定することができる。組織内のあらゆる内在性蛍光体を使用することができる。幾つかの実施形態において、内在性蛍光体は、コラーゲン、エラスチン、トリプトファン、ポルフィリン、フラビン、ＮＡＤＨ、ピリドキシン、リポ色素、又はそれらの組合せである。幾つかの実施形態において、コラーゲンの自家蛍光放出を使用して、包埋試料内の組織の位置を決定する。幾つかの実施形態において、エラスチンの自家蛍光放出を使用して、包埋試料内の組織の位置を決定する。幾つかの実施形態において、トリプトファンの自家蛍光放出を使用して、包埋試料内の組織の成分及び／又は位置を決定する。幾つかの実施形態において、コラーゲン、エラスチン、及びトリプトファンの１つ以上を使用して、包埋試料内の組織の位置を決定する。

幾つかの実施形態において、約３２０ｎｍ～約３８０ｎｍの波長を有する励起光を使用して、コラーゲンの自家蛍光を検出する。幾つかの実施形態において、コラーゲンの最大自家蛍光放出は、約３７５ｎｍ～約４２５ｎｍの波長で検出される。

幾つかの実施形態において、約３２０ｎｍ～約３８０ｎｍの波長を有する励起光を使用して、エラスチンの自家蛍光を検出する。幾つかの実施形態において、エラスチンの最大自家蛍光放出は、約４００ｎｍ～約４５０ｎｍの波長で検出される。

幾つかの実施形態において、約１８０ｎｍ～約２３０ｎｍの波長を有する励起光を使用して、トリプトファンの自家蛍光を検出する。幾つかの実施形態において、トリプトファンの最大自家蛍光放出は、約３００ｎｍ～約３５０ｎｍの波長で検出される。

包埋試料にあらゆる適切な波長を有する光を照射することができる。幾つかの実施形態において、包埋試料に約２００ｎｍ～約６００ｎｍの波長を有する光を照射する。したがって、幾つかの実施形態において、包埋試料に約２００ｎｍ～約６００ｎｍ、約２００ｎｍ～約５５０ｎｍ、約２００ｎｍ～約５００ｎｍ、約２００ｎｍ～約４５０ｎｍ、約２００ｎｍ～約４００ｎｍ、約２００ｎｍ～約３５０ｎｍ、約２５０ｎｍ～約６００ｎｍ、約２５０ｎｍ～約５５０ｎｍ、約２５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約２５０ｎｍ～約４５０ｎｍ、約２５０ｎｍ～約４００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５５０ｎｍ、約３００ｎｍ～約６００ｎｍ、約３５０ｎｍ～約６００ｎｍ、約４００ｎｍ～約６００ｎｍ、約４５０ｎｍ～約６００ｎｍ、約３５０ｎｍ～約５５０ｎｍ、約３５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４００ｎｍ～約６００ｎｍ、約４００ｎｍ～約５５０ｎｍ、又は約４５０ｎｍ～約６００ｎｍの波長を有する光を照射する。

包埋試料の自家蛍光放出を、あらゆる適切な波長、通常は最大放出波長で検出することができる。幾つかの実施形態において、包埋試料は、約３００ｎｍ～約６００ｎｍの波長で最大自家蛍光放出を有する。したがって、幾つかの実施形態において、包埋試料は、約３００ｎｍ～約６００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５５０ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３００ｎｍ～約４５０ｎｍ、約３００ｎｍ～約４００ｎｍ、約３５０ｎｍ～約６００ｎｍ、約３５０ｎｍ～約５５０ｎｍ、約３５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約３５０ｎｍ～約４５０ｎｍ、約４００ｎｍ～約６００ｎｍ、約４５０ｎｍ～約５５０ｎｍ、又は約５００ｎｍ～約６００ｎｍの波長で最大自家蛍光放出を有する。

蛍光法は一般に、当該技術分野において既知のように、光源及び蛍光を検出するように構成された検出器を使用して実施される。幾つかの実施形態において、蛍光技術は、特定の波長又はその範囲の光を当てることができる光源を使用して実施される。幾つかの実施形態において、包埋試料を１つ以上の光源を使用して照射する。幾つかの実施形態において、光源は、発光ダイオード（ＬＥＤ）光源である。幾つかの実施形態において、光源は、水銀アークランプである。幾つかの実施形態において、光源は、キセノンアークランプである。幾つかの実施形態において、光源は、レーザである。幾つかの実施形態において、本方法を、１つ以上の励起フィルタを有する蛍光システムを使用して実施する。幾つかの実施形態において、蛍光システムは、アパーチャ及び１つ以上の吸収フィルタを備える。幾つかの実施形態において、蛍光システムは、イメージングレンズ及びイメージングカメラを備える。

包埋試料をあらゆる適切な方法を使用して形成することができる。幾つかの実施形態において、組織を被験体から取得し、切片化する。組織をホルマリン溶液と接触させ、室温で少なくとも４８時間固定する。一般的に、一連のエタノール浴を使用して組織を脱水した後に、ワックスブロック内へと包埋する。ワックスは、一般に、約２０個～約４０個の炭素数の鎖長を有する直鎖状アルカンの混合物を含む。幾つかの実施形態において、固定剤としてグルタルアルデヒドを使用して、エポキシ樹脂内に組織を包埋する。包埋試料を薄切又は切片化して、あらゆる後続の分析（例えば、顕微鏡スライド分析）を行うことができる。

幾つかの実施形態において、包埋試料を更にトリミング又は切片化して、組織切片又は組織薄片を形成することができる。（例えば、ミクロトームブレードを使用する）あらゆる適切な方法を使用して、包埋試料をトリミング又は切片化することができる。幾つかの実施形態において、キシレン等の洗浄剤を使用して、切片から包埋媒体を除去することができる。幾つかの実施形態において、ヘマトキシリン及び／又はエオシン、酸性／塩基性フクシン、又はグラム染色剤等の少なくとも１つの染色剤を使用して組織切片を染色する。幾つかの実施形態において、組織切片をスライド上にマウントして分析することができる。染色組織切片は、あらゆる適切な方法（例えば、顕微鏡を使用した病理学的分析）を使用した更なる分析を受けることができる。

幾つかの実施形態において、本方法を実施して、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）試験法において使用するための包埋組織の位置を突き止める。幾つかの実施形態において、本方法を実施して、発色性ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）試験法において使用するための包埋組織の位置を突き止める。

別の実施形態において、本開示は、組織及び包埋媒体を含む包埋試料を少なくとも１つの光源で照射して第１の蛍光放出及び第２の蛍光放出を生成し、第１の蛍光放出及び第２の蛍光放出を検出し、第１の蛍光放出及び第２の蛍光放出に基づいて包埋試料内の組織の少なくとも一部の位置を決定することによって、包埋試料内の組織の位置を決定する方法を提供する。

幾つかの実施形態において、包埋試料に約２５０ｎｍ～約３２５ｎｍの波長を有する光を照射する。幾つかの実施形態において、包埋試料に約３００ｎｍ～約４００ｎｍの波長を有する光を照射する。幾つかの実施形態において、包埋試料を両方の波長で同時に照射する。幾つかの実施形態において、明視野顕微鏡法を本発明の方法と組み合わせて使用して、包埋試料内の組織の位置を決定する。

幾つかの実施形態において、第１の蛍光放出は、包埋試料内の包埋媒体（例えば、パラフィン）の蛍光によって生成される。幾つかの実施形態において、第２の蛍光放出は、包埋試料内に存在する組織成分の自家蛍光によって生成される。幾つかの実施形態において、第１の蛍光放出は、約３７５ｎｍ～約４２５ｎｍの波長で最大蛍光を有し、かつ第２の蛍光放出は、約５００ｎｍ～約６００ｎｍの波長で最大蛍光を有する。

幾つかの実施形態において、包埋試料を２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つ）の光源を使用して照射する。幾つかの実施形態において、２つ以上の光源は同じである。幾つかの実施形態において、２つ以上の光源は異なっている。幾つかの実施形態において、試料を２つ以上の光源によって同時に又は別々に照射する。

幾つかの実施形態において、上記方法をダイクロイックフィルタの不存在下で実施する。

幾つかの実施形態において、上記方法は、包埋試料面の平面から約１０度～約２０度の斜角等で、包埋試料を横方向に前面照明することを含む。幾つかの実施形態において、高い開口数を有するレンズによって蛍光放出が収集される。幾つかの実施形態において、２つ以上の横方向（例えば、左又は右又は上又は下）からの照明により、均一な励起パターン及び放出パターンが生成される。

幾つかの実施形態において、放出光の励起及び収集には、高開口数の対物レンズが使用されるだけでなく、励起フィルタ及び吸収フィルタを備えたダイクロイックビームスプリッタを有するフィルタキューブも使用される。幾つかの実施形態において、ダイクロイックフィルタの後に追加のレンズを使用して、放出光をイメージングセンサ上へと合焦させる。

幾つかの実施形態において、包埋媒体は弱い自家蛍光を発する。したがって、幾つかの実施形態において、蛍光色素を包埋媒体に添加することができる。蛍光色素は、組織試料内の内在性蛍光体の放出波長とは異なる波長で光を放出するため、蛍光色素からの蛍光放出を使用して、包埋試料内の組織の位置を決定することができる。蛍光色素を包埋媒体内に取り込んだ後に、包埋試料を形成することができる。

別の実施形態において、本開示は、包埋試料から組織切片を薄切する装置を提供する。この装置は、直線運動に適合された試料保持具、ナイフ保持具、及び試料保持具の反対側のナイフ保持具によって保持されたナイフを、試料保持具が直線的に移動すると、試料保持具によって保持された試料がナイフによって薄切されて組織切片が形成されるように備えたミクロトームと、試料保持具に向けられた少なくとも１つの光源と、試料保持具によって保持された試料からの放出光をキャプチャするように配置された光学システムとを備えてなる。

幾つかの実施形態において、上記装置は、少なくとも２つの光源を備えている。幾つかの実施形態において、上記装置は、少なくとも３つの光源を備えている。幾つかの実施形態において、上記装置は、少なくとも４つの光源を備えている。

幾つかの実施形態において、上記装置は、励起フィルタ及び吸収フィルタを備えたダイクロイックビームスプリッタを有するフィルタキューブを備えている。幾つかの実施形態において、上記装置は、ダイクロイックフィルタを備えている。幾つかの実施形態において、上記装置は、ダイクロイックフィルタの後に、放出光をイメージングセンサ上に合焦させる追加のレンズを備えている。幾つかの実施形態において、上記装置は、フィルタキューブアセンブリ内に吸収フィルタを備えており、ここで、少なくとも１つの励起源の切り替えにより少なくとも１つのフィルタが切り替わる。

幾つかの実施形態において、上記装置は、１つ以上の励起フィルタを備えている。幾つかの実施形態において、上記装置は、アパーチャを備えている。幾つかの実施形態において、上記装置は、高開口数を有するレンズを備えている。幾つかの実施形態において、上記装置は、１つ以上の吸収フィルタを備えている。幾つかの実施形態において、上記装置は、イメージングレンズを備えている。幾つかの実施形態において、光学システムは、カメラを備えている。幾つかの実施形態において、光学システムは、デジタルカメラを備えている。幾つかの実施形態において、光学システムは、少なくとも１つの蛍光放出を検出することができる。

幾つかの実施形態において、上記装置は、ミクロトームブレードと、少なくとも１つの光源と、少なくとも１つの励起フィルタと、少なくとも１つのアパーチャと、少なくとも１つの吸収フィルタと、レンズアセンブリと、少なくとも１つのカメラとを備えている。

幾つかの実施形態において、上記装置は、ミクロトームブレードと、少なくとも２つの光源と、少なくとも２つの励起フィルタと、少なくとも１つのアパーチャと、少なくとも２つの吸収フィルタと、レンズアセンブリと、少なくとも１つのカメラと、吸収フィルタ間を切り替える少なくとも１つの機構とを備えている。

幾つかの実施形態において、上記装置は、ミクロトームブレードと、少なくとも２つの光源と、少なくとも２つの励起フィルタと、少なくとも１つのアパーチャと、デュアルバンドバンドパス吸収フィルタと、レンズアセンブリと、少なくとも１つの多色カメラとを備えている。幾つかの実施形態において、多色カメラは、各ピクセルの前方にマイクロフィルタを有する。

幾つかの実施形態において、上記装置は、ミクロトームブレードと、少なくとも１つの光源と、少なくとも１つの励起フィルタと、少なくとも１つのアパーチャ、対物レンズアセンブリ、チューブレンズ又はリレーレンズと、ダイクロイックビームスプリッタと、フィルタキューブアセンブリ内の少なくとも１つの吸収フィルタと、少なくとも１つのカメラとを備えている。幾つかの実施形態において、励起源間の切り替えは、フィルタの切り替えを伴う。

本発明の方法及び装置を、様々な蛍光ベースのイメージングシステムとともに使用することができる。幾つかの実施形態において、本装置は、ミクロトームブレード、１つ以上の光源、１つ以上の励起フィルタ、２次元アパーチャ、１つ以上の吸収フィルタ、イメージングレンズ、及び／又はイメージングカメラを備えている。ＬＥＤ光源と、励起フィルタと、アパーチャと、吸収フィルタを切り替える機構を備えた吸収フィルタと、レンズアセンブリと、カメラとを典型的に備える単色蛍光イメージングシステムを使用して、包埋試料をイメージングすることができる。多数のＬＥＤ光源と、励起フィルタと、アパーチャと、電動ホイールアセンブリを備えた吸収フィルタと、レンズアセンブリと、カメラとを典型的に備える多色蛍光イメージングシステムを使用して、包埋試料をイメージングすることができる。蛍光イメージングシステムの他の構成要素としては、２色バンドパス吸収フィルタ、多色イメージセンサを備えたカラーカメラ、対物レンズアセンブリ、ダイクロイックビームスプリッタ、チューブレンズ又はリレーレンズを挙げることができる。幾つかの実施形態において、励起源の切り替えは、本開示の一実施形態によるフィルタの切り替えを伴う。

幾つかの実施形態において、光学システムは、光学システムと通信し、試料からの蛍光放出に基づいてシグナルを与えるように構成されたプロセッサを備えている。

（実施例１）
この実施例は、組織切片の蛍光ベースのイメージングを使用する腫瘍組織をマクロダイセクションする方法の一実施形態を例示している。図３Ａ～図３Ｄは、乳癌を含む５マイクロメートルの組織切片の自家蛍光画像と、腫瘍の関心領域が周囲の正常細胞に対してどこに位置するかを示すように印が付けられた対応するＨ＆Ｅ画像とを示す。図３Ａ及び図３Ｃにおいて、スライド上にマウントされたＦＦＰＥ組織切片を、自家蛍光を使用してイメージングした。そして、５マイクロメートルの切片をスライド上にマウントし、Ｈ＆Ｅによって染色した。染色組織切片を図３Ｂ及び図３Ｄに示す。病理学者のアノテーション（青色の円）は、自家蛍光画像（図３Ｃ）及びＨ＆Ｅ染色切片（図３Ｄ）において、他の細胞型を含む周囲の組織と比較して、癌細胞の大部分を含む大きな関心領域を示す。

腫瘍含有組織においては、典型的には、腫瘍細胞の核は拡大し、核物質は凝縮する。したがって、腫瘍細胞の核は、他の細胞成分、つまり間質及び細胞外マトリックス成分と同程度の蛍光を発しない。

アルゴリズム作成については、スライド上の組織切片のラベル付けされた自家蛍光画像から生成される腫瘍濃縮された関心領域（ＲＯＩ）を検出するセグメンテーション畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ：convolutional neural network）モデルを作成する。ラベル付けされた訓練データを収集するのに、３００ｎｍの励起での自家蛍光を５４５－３０バンドパス吸収フィルタと組み合わせて使用することによって、切片の低解像度の自家蛍光画像をスライドから取得する。そして、切片をＨ＆Ｅ染色し、４０倍の倍率でイメージングする。そして、病理学者は、Ｈ＆Ｅ染色された全スライド画像（ＷＳＩ）内の腫瘍細胞のＲＯＩをアノテーションし、２０％以上の腫瘍含有量を含むＲＯＩをグラウンドトゥルースとして特定する。このアノテーションされたＲＯＩを対応する自家蛍光画像にマッピングすることによって、同じ領域を自家蛍光画像内でラベル付けされた訓練データとしてマスク処理する。この訓練セットに基づいて訓練されたセグメンテーションＣＮＮモデルを未知の試料の自家蛍光画像に適用して、腫瘍濃縮されたＲＯＩを特定し、こうしてゲノミクス検査用に濃縮する（enrich）ことができる。マウントされたＦＦＰＥ組織切片に対するスライドの背面でＲＯＩに印を付けて、ワークフローにおける次の工程の準備が整う。

（実施例２）
この実施例は、組織ブロックの蛍光ベースのイメージングを使用する腫瘍組織をマクロダイセクションする方法の一実施形態を例示している。図４Ａ～図４Ｄは、乳癌を含むブロックの自家蛍光画像と、腫瘍の関心領域が周囲の正常細胞に対してどこに位置するかの対応するＨ＆Ｅ画像とを示す。図４Ａ及び図４Ｃにおいて、乳癌を含むＦＦＰＥブロックを、自家蛍光を使用してイメージングした。そして、ＦＦＰＥブロックから切削した５マイクロメートルの切片をスライド上にマウントし、Ｈ＆Ｅによって染色した（図４Ｂ及び図４Ｄ）。病理学者のアノテーション（青色の円）は、自家蛍光画像（図４Ｃ）及びＨ＆Ｅ染色切片（図４Ｄ）において、他の細胞型を含む周囲の組織と比較して、癌細胞の大部分を含む大きな関心領域を示す。

上述のように、腫瘍含有組織においては、典型的には、腫瘍細胞の核は拡大し、核物質は凝縮する。したがって、腫瘍細胞の核は、他の細胞成分、つまり間質及び細胞外マトリックス成分と同程度の蛍光を発しない。

アルゴリズム作成については、ラベル付けされた自家蛍光画像から生成される腫瘍濃縮された関心領域（ＲＯＩ）を検出するセグメンテーション畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）モデルを作成する。ラベル付けされた訓練データを収集するのに、３００ｎｍの励起での自家蛍光を５４５－３０バンドパス吸収フィルタと組み合わせて使用することによって、切片の低解像度の自家蛍光画像をトリミングステージ上で取得する。そして、切片をスライド上にマウントし、Ｈ＆Ｅ染色し、４０倍の倍率でイメージングする。そして、病理学者は、Ｈ＆Ｅ染色された全スライド画像（ＷＳＩ）内の腫瘍細胞のＲＯＩをアノテーションし、２０％以上の腫瘍含有量を含むＲＯＩをグラウンドトゥルースとして特定する。このアノテーションされたＲＯＩを対応する自家蛍光画像にマッピングすることによって、同じ領域を自家蛍光画像内でラベル付けされた訓練データとしてマスク処理する。この訓練セットに基づいて訓練されたセグメンテーションＣＮＮモデルを未知の試料の自家蛍光画像に適用して、腫瘍濃縮されたＲＯＩを特定し、こうしてゲノミクス検査用に濃縮することができる。マウントされたＦＦＰＥ組織切片に対するスライドの背面でＲＯＩに印を付けて、ワークフローにおける次の工程の準備が整う。

（実施例３）
この実施例は、トリミングの間にＦＦＰＥブロックにおける露出した組織の量を定量化する焦点尺度ベースの検出方法を例示している。自家蛍光イメージングは、様々な組織の種類にわたってより一貫したシグナルをもたらす可能性がある追加情報を提供する。露出される組織の量を定量化して最適なトリミング及び切片化を行うためにアルゴリズムを使用する。ブロックにおける露出した組織のパーセンテージを評価する定量的アプローチは、自動トリミングステーションの利便性を高め、組織を節約することとなる。

手作業による切片化においては、露出した組織の組織技師による定性的な評価は、多めにトリミングしすぎてしまう可能性があるため、ＦＦＰＥ組織切片の両方の無駄の多い使用となり得る。露出した組織の面積を定量的に評価することにより、組織の使用量を最適化して、それらの診断可能性を実現することができる。また、白色光で照明された画像と人間の眼とを使用して用いられる定性的な方法又は白色の照明に関連するアルゴリズムとは対照的に、どこまでトリミングすると適切なパーセンテージの組織が露出するかを推定することによって、定量的な精度の高い様式でトリミングプロセスの速度を上げることにもなる。

図５Ａ～図５Ｄは、露出した組織を検出するのに使用される蛍光ベースの画像処理システムを例示している。自家蛍光イメージングでは、鮮明に合焦した組織と、焦点が外れて見える表面下の組織とが識別される。露出した組織の面積を、局所焦点を測定することによって推定した。パラフィン内に包埋されたＦＦＰＥ組織を含むカセットを上面（図５Ａ）方向及び側面（図５Ｂ）方向から描写している漫画図は、包埋組織が様々な焦点面で見えることを示している。蛍光画像を使用して、組織ブロックについての深度マップを作成し、鮮明に合焦した組織と、焦点が外れた組織とを判定することができる。

図５Ｃ及び図５Ｄの画像は、各薄片をトリミングした後に、組織ブロックの切削面に平行な６メガピクセルＣＭＯＳセンサによって自動的に収集された。画質を向上させるのに、画像レジストレーション、ＣＬＡＨＥコントラスト強調、及びガウスぼかし等の幾つかの処理演算を実行する。変形ラプラス演算子を画像全体に適用して、各ピクセルについての局所焦点尺度を決定する。画像ぼけの評価に基づいて、組織の深度マップを構築する。各薄片画像の焦点指標を初回の薄片画像に対して正規化することによって、露出した組織表面を特定する。アルゴリズムを評価するためのグラウンドトゥルースとして役立てるのに、組織を規則的な幾何学的形状に削り、パラフィン内に包埋した。

（実施例４）
信頼性の高いデータを収集するために、組織を人工的な形状に切削することによって人工ブロックを作製し、その蛍光をデジタル顕微鏡法により測定した。図６Ａは、人工的に造形された組織を含む人工ブロックの漫画図解である。図６Ｂは、人工ＦＦＰＥブロックを作るためにパラフィン内に再包埋された人工的に造形された組織の写真である。人工ブロックの薄片試料作製法を行うと、人工ブロックは、組織が露出するときの既知のパラメータを有することになり、それによりアルゴリズム作成に信頼性の高いデータが得られる。図６Ｃにおいては、アルゴリズム作成のために組織が３００ｎｍで照明され、これは５４回目の切削により検出された組織の露出によって示される。明視野生画像は、鮮明に合焦した組織を示す蛍光イメージングにおける改善を実証し、それにより組織が優れた様式でパラフィンから識別される。

（実施例５）
図７Ａ～図７Ｃは、肺組織を含むＦＦＰＥブロックの自動薄片試料作製法の間の実施例３において作成されたアルゴリズムの性能を実証した。蛍光イメージングが組織ブロックについて波長（３００ｎｍ）で示されている。中央のパネルは、２４回目の５ミクロンの薄片（図７Ａ）、１２０回目の薄片（図７Ｂ）、及び３６７回目の薄片（図７Ｃ）についての露出組織のアルゴリズムベースの検出を示している。２４回目の薄片は、ＦＦＰＥブロック内へのより深い切削と比較して、非常に少ない組織を有していた。

（実施例６）
どの励起／放出の光学バンドによって組織のより正確な表面下のトポロジが検出されるかを調べるのに、幾つかのＬＥＤ光源（３００ｎｍ、４７０ｎｍ、及び白色光を含む）及びカルーセル中に配置された最大６つの異なる吸収フィルタを用いて蛍光イメージングシステムを構築した。ＬＥＤ光源は、法線入射から４５度から６０度の間の様々な軸外角度で組織ブロックを照明する。図８Ａ及び図８Ｂの画像は、トリミングする前に、組織ブロックの表面に平行な６メガピクセルＣＭＯＳセンサによって自動的に収集された。画質を向上させるのに、画像レジストレーション、ＣＬＡＨＥコントラスト強調、及びガウスぼかし等の幾つかの処理演算を実行する。図８Ｃに示される組織の深度マップは、各ピクセルについての局所焦点測定に基づいて構築される。図８Ｄにおいて示される組織使用量を最大化するように予測された最適な切片化面を、組織トポロジ（tissue topology）に基づいて計算することができた。

明視野（図８Ａ）下及び３００ｎｍのＵＶ光源下（図８Ｂ）でのＦＦＰＥ組織ブロックの画像。図８Ｃは、黄色の最大値をもつ組織表面のトポロジを示す関連の深度マップであり、ミクロトーム上へと構築された低解像度設定において表面下のトポロジが評価可能であることを示している。図８Ｄは、組織の使用量を最大化するように予測された最適な切片化面である。

（実施例７）
図９は、実施例６のシステムを使用した蛍光ベースのイメージングを使用するホルマリン固定-パラフィン包埋組織の表面下のトポロジ検出を示す。高解像度画像は、自家蛍光イメージングがパラフィン包埋組織内の様々な細胞型を識別し、キャプチャされた画像に詳細な表面下のトポロジ情報を追加することを示している。フィルタを使用して４７０ｎｍの励起及び５２５ｎｍの放出で乳房組織をイメージングした（パネルＢ及びパネルＥ）。フィルタを使用して３６５ｎｍの励起／４４５ｎｍの放出で乳房組織をイメージングした（パネルＣ及びパネルＦ）。（パネルＡ及びパネルＤ）は、蛍光イメージングでも可視の扁平上皮（パネルＡ、パネルＢ、及びパネルＣにおいて矢印によって示される）及び脂肪細胞（パネルＤ、パネルＥ、及びパネルＦにおいて矢印によって示される）の領域を有する乳房組織のＨ＆Ｅ染色された組織切片の画像を示す。脂肪及び扁平上皮は、蛍光イメージングでは非常に明るく見える周囲の間質と比較して明らかである。２００倍の倍率である。

（実施例８）
この実施例は、（１）核形態計測解析のために核セグメンテーションを実行するアルゴリズムベースの検出方法、又は（２）後続のゲノム検査方法のために腫瘍の関心領域のマクロダイセクションを実行するアルゴリズムベースの検出方法、あるいはそれらの両方に使用することができる新規のワークフローを記載している。このワークフローを使用して作成されたアルゴリズムは、薄片試料作製法の間に未染色のＦＦＰＥブロックを使用して又はスライド上の組織切片を使用して展開され得る。新規のワークフローの一実施形態を表３に記載する。

図１０は、ワークフローを実証するスキャンされたＷＳＩを示す。自家蛍光イメージングされた未染色の脱パラフィン処理したＦＦＰＥ組織のＷＳＩを２０倍の倍率でパネルＡ及びパネルＤに示す。ＦＩＴＣ（緑色）チャンネルにおいて細胞外マトリックスがはっきりと見られる。パネルＢ及びパネルＥのＤＡＰＩ染色組織の蛍光のＷＳＩは、ＤＡＰＩ含有の蛍光封入剤を加えることで（表３におけるワークフローの工程４）、核が細胞外マトリックスから明確に識別可能であることを示す。パネルＣ及びパネルＦの対応する領域のＨ＆Ｅ染色された組織のＷＳＩは、腫瘍細胞、脂肪、及び細胞外マトリックスを示す（表３におけるワークフローの工程７）。

（参考文献）
・Walterらの米国特許出願公開第２０１０／０１１８１３３号
・Wuらの米国特許出願公開第２０１９／０１８８４４６号
・Schleiferらの米国特許出願公開第２０１９／０３６８９８２号
・Philips Computational PathologyからのＴｉｓｓｕｅＭａｒｋ
・Ramanujam, N.著、「腫瘍性組織及び非腫瘍性組織の蛍光分光法（Fluorescence Spectroscopy of Neoplastic and Non-Neoplastic Tissues.）」 Neoplasia. 2000 2, 89-117.
・Favreau, P.F. et al.著、「蛍光励起走査スペクトルイメージングを使用した非標識の分光組織特性評価（Label-free spectroscopic tissue characterization using fluorescence excitation-scanning spectral imaging.）」 J. Biophotonics. 2019;e201900183

（例示的な実施形態）
ここで開示されている主題により提供される例示的な実施形態は、特許請求の範囲及び以下の実施形態を含むが、これらに限定されない。

実施形態１．
包埋媒体内に包埋された試料の表面に露出した組織又は細胞調製物の量を決定する方法であって、組織の内在性成分に自家蛍光を生じさせる波長で包埋組織試料又は細胞調製物試料を照射することと、包埋組織試料又は細胞調製物試料によって放出される自家蛍光の画像を取得することと、包埋媒体の表面での組織又は細胞調製物が占める画像のパーセンテージを決定することとを含んでなる方法。

実施形態２．
包埋媒体の表面での組織が占める画像のパーセンテージは、組織及び包埋媒体を含む包埋組織試料から組織切片を薄切することと、包埋組織試料に励起波長を有する電磁放射線を照射することと、包埋試料の自家蛍光放出から蛍光画像を生成することと、蛍光画像のピクセルについて局所焦点尺度を決定することと、蛍光の画像ぼけの評価に基づいて組織の深度マップを構築することと、深度マップに基づいて包埋試料についての切片化面を決定することとによって決定される、実施形態１の方法。

実施形態３．
局所焦点尺度は、演算子を蛍光画像に適用することによって決定される、実施形態２の方法。

実施形態４．
演算子は、変形ラプラス演算子である、実施形態３の方法。

実施形態５．
１つ以上の処理演算を実行して蛍光画像を取得することを更に含み、ここで、処理演算の少なくとも１つは、画像レジストレーション、コントラスト強調、及び画像平滑化からなる群から選択される、実施形態２又は３の方法。

実施形態６．
切片化面及び切削された組織切片内の組織の所望の量は、組織ブロック内の１０％～１００％の組織の最大断面積である、実施形態２～５のいずれかの方法。

実施形態７．
局所焦点尺度は、入力画像内の複数のピクセルを囲うｎ×ｎの近傍において測定される、実施形態２～６のいずれかの方法。

実施形態８．
各薄片画像上の焦点指標を初回の薄片画像に対して正規化することによって、露出した組織を特定する、実施形態２～７のいずれかの方法。

実施形態９．
所望の組織量が存在する場合の切片化面で包埋組織試料からの組織切片を切削する、実施形態８の方法。

実施形態１０．
所望の組織量が決定された後に、切片化面の包埋試料から組織切片を切削する、実施形態９の方法。

実施形態１１．
包埋組織試料内の様々な細胞型を特定する方法であって、組織の内在性成分に自家蛍光を生じさせる波長で包埋組織試料を照射することと、組織試料によって放出される自家蛍光の画像を取得することと、組織試料によって放出される自家蛍光の画像内の様々な細胞型を自家蛍光特性に基づいて特定することとを含んでなる方法。

実施形態１２．
包埋組織試料内の様々な細胞型は、組織及び包埋媒体を含む包埋組織試料から組織切片を露出させることと、包埋組織試料に励起波長を有する電磁放射線を照射することと、包埋試料の自家蛍光放出から蛍光画像を生成することと、蛍光画像のピクセルについて局所焦点尺度を決定することと、蛍光の画像ぼけの評価に基づいて組織の深度マップを構築することとによって決定される、実施形態１１の方法。

実施形態１３．
蛍光画像をイメージングデバイスによってキャプチャする、実施形態１２の方法。

実施形態１４．
演算子を蛍光画像に適用することによって局所焦点尺度を決定する、実施形態１２又は１３の方法。

実施形態１５．
演算子は、変形ラプラス演算子である、実施形態１４の方法。

実施形態１６．
１つ以上の処理演算を実行して蛍光画像を取得することを更に含み、ここで、処理演算の少なくとも１つは、画像レジストレーション、コントラスト強調、及び画像平滑化からなる群から選択される、実施形態１２～１４の方法。

実施形態１７．
局所焦点尺度は、入力画像内の複数のピクセルを囲うｎ×ｎの近傍において測定される、実施形態１２～１６のいずれかの方法。

実施形態１８．
組織の深度マップは、包埋媒体内の組織の表面下のトポロジである、実施形態１２～１７のいずれかの方法。

実施形態１９．
組織試料についての最適な切片化面の予測は、包埋媒体内の組織の表面下のトポロジの評価に基づく、実施形態１２～１８のいずれかの方法。

実施形態２０．
組織又は細胞調製物は、組織、細胞ペレット、及び細胞スフェロイドからなる群から選択される、実施形態１の方法。

実施形態２１．
細胞スフェロイドは、２つ以上の細胞型を含む、実施形態２０の方法。

実施形態２２．
組織及び包埋媒体を含む包埋組織試料内の関心領域（ＲＯＩ）を特定するように人工知能（ＡＩ）システムを訓練する方法であって、組織の内在性成分に自家蛍光を生じさせる波長で包埋組織試料を照射することと、包埋組織試料によって放出される自家蛍光の画像を取得することと、画像内のＲＯＩを指示するように画像をアノテーションすることと、アノテーションされた画像をＡＩシステムへと入力することとを含んでなり、ここで、ＡＩシステムは、学習して、アノテーションされていない画像内のＲＯＩを特定するようになる、方法。

実施形態２３．
ＡＩシステムは、機械学習システム、深層学習システム、ニューラルネットワーク、畳み込みニューラルネットワーク、完全畳み込みニューラルネットワーク、統計モデルベースのシステム、又は決定的アルゴリズムベースの解析システムの少なくとも１つを含む、実施形態２２の方法。

実施形態２４．
ＡＩシステムは、畳み込みニューラルネットワークである、実施形態２２の方法。

実施形態２５．
ＡＩシステムは、セグメンテーション畳み込みニューラルネットワークを含む、実施形態２２の方法。

実施形態２６．
ＡＩシステムは、リカレントニューラルネットワークである、実施形態２２の方法。

実施形態２７．
包埋組織試料は、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色、免疫組織化学（ＩＨＣ）染色、又はタンパク質マーカについての免疫蛍光（ＩＦ）染色で染色されている、実施形態２２又は２６の方法。

実施形態２８．
包埋組織試料の画像を、包埋組織試料の全スライド画像に対してアノテーションする、実施形態２２～２７のいずれかの方法。

実施形態２９．
訓練されたＡＩシステムは、分子アッセイのために腫瘍濃縮法に従って腫瘍細胞を含むＲＯＩを特定するように適合される、実施形態２２～２８のいずれかの方法。

実施形態３０．
包埋試料は組織ブロックの部分として照射され、方法は包埋試料を組織ブロックから組織切片として薄切することを更に含む、実施形態２２～２９のいずれかの方法。

実施形態３１．
未訓練の又は事前訓練されたＡＩシステムを取得することと、明視野イメージング又は蛍光ベースのイメージングによって検出可能な染色剤で包埋組織試料を染色することと、染色された包埋組織試料の１つ以上の染色画像を、明視野イメージング又は蛍光イメージングによって生成することと、染色された包埋組織試料のＲＯＩを、１つ以上の染色画像に対してアノテーションすることと、１つ以上の染色画像のアノテーションされたＲＯＩを、未染色の自家蛍光画像にマッピングすることと、マッピングされた蛍光画像を使用することによって未訓練の又は事前訓練されたＡＩシステムを訓練することと
によって、ＡＩシステムは、学習して、アノテーションされていない画像内のＲＯＩを特定するようになる、実施形態２２～３０のいずれかの方法。

実施形態３２．
ＡＩシステム訓練データをマッピングされた自家蛍光画像から取得して、未訓練の又は事前訓練されたＡＩシステムを訓練する、実施形態３１の方法。

実施形態３３．
ＡＩシステムは、未染色の包埋組織試料上のＲＯＩを特定するように適合される、実施形態２２～３２のいずれかの方法。

実施形態３４．
ＲＯＩは、腫瘍含有領域を特定する、実施形態２２～３３のいずれかの方法。

実施形態３５．
ＲＯＩを、腫瘍核を取り囲む細胞外マトリックス及び細胞質からの内在性蛍光体の濃度に対応する蛍光レベルを検出することによって特定する、実施形態３４の方法。

実施形態３６．
腫瘍核を取り囲む細胞外マトリックス及び細胞質の自家蛍光レベルを、コントロール試料の自家蛍光レベルと比較する、実施形態３５の方法。

実施形態３７．
コントロール試料は、コントロール核、コントロール細胞質、コントロール間質、又はコントロール細胞外マトリックス成分を含む、実施形態３６の方法。

実施形態３８．
腫瘍核を取り囲む細胞外マトリックス又は細胞質の自家蛍光レベルは、コントロール試料の自家蛍光レベルよりも低い、実施形態３６又は３７の方法。

実施形態３９．
コントロール核は、微細なクロマチン及び単一の核小体を備えた腫瘍核よりも小さい場合がある、実施形態１４の方法。

実施形態４０．
包埋試料を組織切片としてスライド上にマウントし、第１のフィルタ及び第２のフィルタを使用して組織をイメージングすることと、組織切片を処理して包埋媒体を除去し、核を透過処理して核に対する染色を容易にすることと、核に特異的なＤＡＰＩ等の染色剤を組織切片に適用して、核染色組織切片を形成することと、核染色組織切片をイメージングして、核染色組織切片画像を生成することと、核染色封入剤を除去することと、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色剤、免疫組織化学（ＩＨＣ）染色剤、又は免疫蛍光（ＩＦ）染色剤を適用して、細胞染色組織切片を生成することと、細胞染色組織切片にカバースリップをかけることと、明視野イメージングを使用して細胞染色組織切片をイメージングして、染色画像を生成することとを更に含む、実施形態２２の方法。

実施形態４１．
包埋試料から関心領域（ＲＯＩ）を含む組織標本を調製する方法であって、未染色の包埋試料からＲＯＩを特定するように適合された訓練されたＡＩシステムを取得することと、組織及び包埋媒体を含む包埋試料に励起波長を有する電磁放射線を照射することと、包埋試料の蛍光画像を生成することと、訓練されたＡＩシステムを使用して、包埋試料を染色せずに、蛍光画像に基づいて包埋試料におけるＲＯＩを特定することと、ＲＯＩを有すると特定された包埋試料の一部を組織標本として収集することとを含んでなる方法。

実施形態４２．
包埋試料を含む組織切片から蛍光画像を生成する、実施形態４１の方法。

実施形態４３．
包埋試料を含む組織ブロックから蛍光画像を生成する、実施形態４１の方法。

実施形態４４．
組織切片から蛍光画像を生成し、包埋試料の収集された部分を組織ブロックから収集する、実施形態４１の方法。

実施形態４５．
包埋試料の収集された部分から包埋媒体を除去して組織標本を得る、実施形態４１～４４のいずれかの方法。

実施形態４６．
組織標本から細胞成分を除去して核酸標本を得て、核酸標本から核酸配列を決定することを更に含む、実施形態４５の方法。

実施形態４７．
訓練されたＡＩシステムは、組織の内在性成分に自家蛍光を生じさせる波長で包埋組織試料を照射することと、包埋組織試料によって放出される自家蛍光の画像を取得することと、画像内のＲＯＩを指示するように画像をアノテーションすることと、アノテーションされた画像をＡＩシステムへと入力することとによって得られ、ここで、ＡＩシステムは学習して、アノテーションされていない画像内のＲＯＩを特定するようになる、実施形態４１～４６のいずれかの方法。

実施形態４８．
ＡＩシステムは、畳み込みニューラルネットワークである、実施形態４７の方法。

実施形態４９．
ＡＩシステムは、セグメンテーション畳み込みニューラルネットワークを含む、実施形態４７の方法。

実施形態５０．
ＡＩシステムは、リカレントニューラルネットワークである、実施形態４７の方法。

実施形態５１．
訓練されたＡＩシステムは、自家蛍光を使用して包埋試料を組織ブロックの部分としてイメージングし、包埋試料を組織ブロックから組織切片として薄切することと、包埋試料を組織切片としてスライド上にマウントし、第１のフィルタ及び第２のフィルタを使用して組織をイメージングすることと、組織切片を処理して包埋媒体を除去し、核に対する染色剤に対して核を透過処理することと、核染色封入剤中の核染色剤を組織切片に適用して、核染色組織切片を形成することと、核染色組織切片をイメージングして、核染色組織切片画像を生成することと、核染色封入剤を除去することと、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色剤、免疫組織化学（ＩＨＣ）染色剤、又は免疫蛍光（ＩＦ）染色剤を適用して、細胞染色組織切片を生成することと、細胞染色組織切片にカバースリップをかけることと、明視野イメージングを使用して細胞染色組織切片をイメージングして、染色画像を生成することとによって得られる、実施形態４１～５０のいずれかの方法。

実施形態５２．
生体組織の試料をイメージングする方法であって、生体組織の内在性成分に自家蛍光を生じさせる励起波長で生体組織試料を照射することと、生体組織試料によって放出される自家蛍光の画像を取得して、細胞外マトリックスを含む生体組織の領域を特定することと、生体組織試料内の核を核染色剤で染色して、細胞核を含む生体組織の領域を特定することとを含んでなる方法。

実施形態５３．
生体組織試料を脱パラフィン処理し、洗浄溶液で前処理する、実施形態５２の方法。

実施形態５４．
洗浄溶液は、キシレン及びペプシン消化、又は再水和を伴う電界処理を含む、実施形態５３の方法。

実施形態５５．
核染色剤は、蛍光封入剤を含む、実施形態５２～５４のいずれかの方法。

実施形態５６．
生体組織試料を蛍光イメージングによってスキャンする、実施形態５２～５５のいずれかの方法。

実施形態５７．
組織切片を水中に浸すことによってＤＡＰＩを除去する、実施形態５２～５６のいずれかの方法。

実施形態５８．
訓練されたＡＩシステムを作成する、実施形態５２～５７のいずれかの方法。

実施形態５９．
細胞核を含む生体組織の領域を特定することにより、腫瘍細胞及び核染色腫瘍細胞の特定が可能となる、実施形態５２～５８のいずれかの方法。

実施形態６０．
生体組織試料を使用して各自家蛍光画像を作成する、実施形態５２～５９のいずれかの方法。

実施形態６１．
蛍光画像は、第１の画像である、実施形態６０の方法。

実施形態６２．
生体組織試料において核を核染色剤で染色することによって第２の画像を取得する、実施形態６１の方法。

実施形態６３．
第１の画像及び第２の画像により、生体組織内の腫瘍境界を特定する、実施形態６２の方法。

実施形態６４．
第２の画像をＨ＆Ｅ画像又はＩＨＣ画像にマッピングして、腫瘍細胞の核セグメンテーションを示す、実施形態６２又は６３の方法。

実施形態６５．
細胞核を含む生体組織の領域は、腫瘍核である、実施形態５２～６４のいずれかの方法。

実施形態６６．
腫瘍核を取り囲む細胞外マトリックスの自家蛍光レベルを検出することによって、細胞核を含む生体組織の領域を特定する、実施形態６５の方法。

実施形態６７．
腫瘍核を取り囲む細胞外マトリックスの自家蛍光レベルを、コントロール試料の自家蛍光レベルと比較する、実施形態６６の方法。

実施形態６８．
コントロール試料は、コントロール核、コントロール細胞質、コントロール間質、又はコントロール細胞外マトリックス成分を含む、実施形態６７の方法。

実施形態６９．
腫瘍核を取り囲む細胞外マトリックスの蛍光レベルは、コントロール試料の蛍光レベルよりも低い、実施形態６８の方法。

実施形態７０．
コントロール核は、腫瘍核よりも小さく、単核であり、１つの核小体及び微細なクロマチンを含む、実施形態６９の方法。

本開示を考慮して、方法及び装置を、本教示を踏まえて実装することができることが留意される。さらに、種々のコンポーネント、材料、構造、及びパラメータは、単に例証及び例として含まれ、制限的な意味では含まれない。本開示を考慮して、本教示を、他の用途で実装することができ、これらの用途で実装するコンポーネント、材料、構造、及び機器を、添付の特許請求の範囲内に留まりながら、決定することができる。

本明細書中に開示されるように、多くの値の範囲が提示される。文脈により明らかに逆のことが示されない限り、その範囲の上限及び下限の間に介在する各値もまた、下限の単位の１０分の１まで、具体的に開示されているということを理解すべきである。任意の記載された値又は記載された範囲中に介在する値と記載された又はその記載された範囲中に介在する任意のその他の値との間のより小さい各範囲が本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、この範囲中に含まれるか又は除外される場合があり、上限及び下限の一方若しくは両方がそのより小さい範囲に含まれるか、又はいずれも含まれない、各範囲はまた、記載された範囲において限界値が具体的に除外されたかに応じて（subject to）、本発明に包含される。記載された範囲が上限及び下限の一方又は両方を含む場合、それらの含められた上限及び下限の一方又は両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。

他に規定のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本教示の実施又は試験に際して使用してもよいが、いくつかの例示的な方法及び材料をこれより記載する。

本明細書において使用される用語が、特定の実施形態を説明するためのものであり、制限的であることを意図されないことが理解される。規定される用語は、規定される用語の技術的及び科学的意味に加えて、本教示の技術分野において一般に理解され受け入れられているようなものである。

「自家蛍光」（autofluorescence）という用語は、タンパク質等の生体分子による天然の光の放出を指す。

「蛍光体」（fluorophore）という用語は、光で励起すると光を再放出し得る蛍光性化合物を指す。「内在性蛍光体」（endogenous fluorophore）という用語は、自家蛍光を発することができる天然に存在する生体物質を指す。

「固定された」（fixed）組織は、適切な期間にわたって固定剤と接触させた組織である。

「包埋組織」（embedded tissue）又は「包埋試料」（embedded sample）は、パラフィン又はエポキシ樹脂等の包埋媒体によって部分的に又は完全に取り囲まれた組織試料である。本開示の包埋組織又は包埋試料は、包埋組織の薄切又はトリミングから得られる組織切片と混同されるべきではない。

「ホルマリン固定-パラフィン包埋ブロック」（formalin-fixed paraffin-embedded block）又は「ホルマリン固定-パラフィン包埋試料」（formalin-fixed paraffin-embedded sample）又は「ＦＦＰＥ試料」（FFPE sample）という用語は、パラフィン内に包埋されたホルマリン処理組織を指す。

「ピクセル強度」（pixel intensity）又は「ピクセル強度値」（pixel intensity value）という用語は、区別なく使用され、デジタル画像内の関心領域にわたって平均化された検出された蛍光シグナルを指す。デジタル画像を取得する間に、各ピクセルで検出された光子は、検出された光子の数に比例する強度値に変換される。ピクセル強度を使用して、標本内の蛍光体の局所濃度を決定することができる。

本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合に、それらの通常の意味に加えて、「実質的な」（substantial）又は「実質的に」（substantially）という用語は、当業者に許容可能な限界又は程度の範囲内であることを意味する。例えば、「実質的に中止された」とは、当業者が中止を許容可能であると考えることを意味する。

本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合に、その通常の意味に加えて、「略」（approximately）及び「約」（about）という用語は、当業者に許容可能な限界又は量の範囲内であることを意味する。「約」という用語は、概して、示された数の±１５％を指す。例えば、「約１０」は、８．５～１１．５の範囲を示すことができる。例えば、「略同じ」（approximately the same）とは、当業者には比較される事物が同じであるとみなされることを意味する。

本開示において、数値範囲は、その範囲を規定する数字を含む。本開示においては、語句「含む」（comprising）が見られる場合はいつでも、その代わりに、語句「本質的にからなる」（consisting essentially of）又は「からなる」（consisting of）が使用できることが考えられる。

別段定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。

本明細書において参照される特許及び刊行物は、引用することにより明示的に本明細書の一部をなすものとする。いかなる出版物の引用も出願日前のその開示のためであり、本発明の請求項が先行発明のためにかかる出版物に先行する権限を有しないことを認めるものと解釈すべきではない。さらに、提示の刊行日は実際の刊行日とは異なる可能性があり、別に確認する必要がある。

本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、「a」、「an」、及び「the」という用語は、文脈によって別段明記されない限り、単数及び複数の双方の指示対象を含む。

本開示を読む際に当業者に明らかなように、本明細書に記載及び説明される個々の実施形態は各々、本教示の範囲又は趣旨を逸脱することなく他の幾つかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離するか、又はそれと組み合わせることができる個別の構成要素及び特徴を有する。列挙されるいずれの方法も、列挙される事象の順序又は論理的に可能な任意の他の順序で行うことができる。

Claims (20)

1. 包埋媒体内に包埋された試料の表面に露出した組織又は細胞調製物の量を決定する方法であって、
   前記組織の内在性成分に自家蛍光を生じさせる波長で包埋組織試料又は細胞調製物試料を照射することと、
   前記包埋組織試料又は細胞調製物試料によって放出される自家蛍光の画像を取得することと、
   前記包埋媒体の表面での前記組織又は細胞調製物が占める前記画像のパーセンテージを決定することと
   を含んでなる方法。
2. 前記包埋媒体の表面での組織が占める前記画像のパーセンテージは、
   前記組織及び前記包埋媒体を含む前記包埋組織試料から組織切片を薄切することと、
   前記包埋組織試料に励起波長を有する電磁放射線を照射することと、
   前記包埋組織試料の自家蛍光放出から蛍光画像を生成することと、
   前記蛍光画像のピクセルについて局所焦点尺度を決定することと、
   蛍光の画像ぼけの評価に基づいて前記組織の深度マップを構築することと、
   前記深度マップに基づいて前記包埋組織試料についての切片化面を決定することと
   によって決定される、請求項１に記載の方法。
3. 前記局所焦点尺度は、演算子を前記蛍光画像に適用することによって決定される、請求項２に記載の方法。
4. 前記演算子は、変形ラプラス演算子である、請求項３に記載の方法。
5. １つ以上の処理演算を実行して前記蛍光画像を取得することを更に含み、前記処理演算の少なくとも１つは、画像レジストレーション、コントラスト強調、及び画像平滑化からなる群から選択される、請求項２又は３に記載の方法。
6. 前記切片化面及び切削された組織切片内の組織の所望の量は、組織ブロック内の組織の最大断面積の１０％～１００％である、請求項２～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記局所焦点尺度は、入力画像内の複数のピクセルを囲うｎ×ｎの近傍において測定される、請求項２～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 各薄片画像上の焦点指標を初回の薄片画像に対して正規化することによって、前記露出した組織を特定する、請求項２～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 所望の組織量が存在する場合の切片化面で前記包埋組織試料からの前記組織切片を切削する、請求項８に記載の方法。
10. 前記所望の組織量が決定された後に、前記切片化面の前記包埋試料から前記組織切片を切削する、請求項９に記載の方法。
11. 包埋組織試料内の様々な細胞型を特定する方法であって、
    組織の内在性成分に自家蛍光を生じさせる波長で前記包埋組織試料を照射することと、
    前記包埋組織試料によって放出される前記自家蛍光の画像を取得することと、
    前記包埋組織試料によって放出される前記自家蛍光の画像内の様々な細胞型を自家蛍光特性に基づいて特定することと
    を含んでなる方法。
12. 前記包埋組織試料内の様々な細胞型は、
    組織及び包埋媒体を含む前記包埋組織試料から組織切片を露出させることと、
    前記包埋組織試料に励起波長を有する電磁放射線を照射することと、
    前記包埋組織試料の自家蛍光放出から蛍光画像を生成することと、
    前記蛍光画像のピクセルについて局所焦点尺度を決定することと、
    前記蛍光の画像ぼけの評価に基づいて前記組織の深度マップを構築することと
    によって決定される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記局所焦点尺度は、入力画像内の複数のピクセルを囲うｎ×ｎの近傍において測定される、請求項１２に記載の方法。
14. 前記組織の深度マップは、前記包埋媒体内の前記組織の表面下のトポロジである、請求項１２又は１３に記載の方法。
15. 組織及び包埋媒体を含む包埋組織試料内の関心領域（ＲＯＩ）を特定するように人工知能（ＡＩ）システムを訓練する方法であって、
    前記組織の内在性成分に自家蛍光を生じさせる波長で前記包埋組織試料を照射することと、
    前記包埋組織試料によって放出される前記自家蛍光の画像を取得することと、
    前記画像内のＲＯＩを指示するように前記画像をアノテーションすることと、
    前記アノテーションされた画像を前記ＡＩシステムへと入力することと
    を含んでなり、
    前記ＡＩシステムは、学習して、アノテーションされていない画像内のＲＯＩを特定するようになるものである、方法。
16. 前記ＡＩシステムは、機械学習システム、深層学習システム、ニューラルネットワーク、畳み込みニューラルネットワーク、完全畳み込みニューラルネットワーク、統計モデルベースのシステム、又は決定的アルゴリズムベースの解析システムの少なくとも１つを含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記包埋組織試料の画像を、前記包埋組織試料の全スライド画像に対してアノテーションする、請求項１５又は１６に記載の方法。
18. 前記包埋試料は組織ブロックの部分として照射され、前記方法は前記組織ブロックから組織切片として前記包埋試料を薄切することを更に含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 未訓練の又は事前訓練されたＡＩシステムを取得することと、
    明視野イメージング又は蛍光ベースのイメージングによって検出可能な染色剤で前記包埋組織試料を染色することと、
    染色された前記包埋組織試料の１つ以上の染色画像を明視野イメージング又は蛍光イメージングによって生成することと、
    染色された前記包埋組織試料のＲＯＩを、前記１つ以上の染色画像に対してアノテーションすることと、
    前記１つ以上の染色画像のアノテーションされたＲＯＩを、未染色の自家蛍光画像にマッピングすることと、
    マッピングされた蛍光画像を使用することによって、前記未訓練の又は事前訓練されたＡＩシステムを訓練することと
    によって、前記ＡＩシステムは、学習して、アノテーションされていない画像内のＲＯＩを特定するようになるものである、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記ＡＩシステムは、未染色の包埋組織試料上のＲＯＩを特定するものである、請求項１５～１９のいずれか一項に記載の方法。