JP2006314214A - 細胞観察装置、細胞観察方法、及び細胞観察プログラム - Google Patents

Abstract

【課題】長期培養中の細胞に与えるダメージを最小限に抑えつつ、特殊な染料や特殊な遺伝子の導入を要せず、培養中の細胞の生死を精度よく判定できるようにする。
【解決手段】培養中に物理的な損傷を受けずに細胞死を起こした細胞は形状が概略円形となり、そのまま活動を停止し、概略円形の形状を維持する点に着目し、複数の時点で撮影されて計測された細胞領域Ｒ_t,mの特徴を示す細胞パラメータとしての円形度を閾値と比較し（ステップＳ７３２〜Ｓ７３５）、細胞の生死を判定する（ステップＳ７３６，Ｓ７３７）ことで、特殊な染料や特殊な遺伝子の導入を要せず、長期培養中の細胞に与えるダメージを最小限に抑えつつ、培養中の細胞の生死を精度よく判定できるようにした。
【選択図】 図１６

Description

本発明は、生細胞を長期間培養しながら経時的に観察する細胞観察装置、細胞観察方法、及び細胞観察プログラムに関するものである。

一般に、新しい薬品開発や細胞の培養などの分野において、細胞死の把握は、成分の適否、培養条件の決定等のために重要な要素の一つである。ここで、細胞死は、アポトーシス（プログラム細胞死）とネクロシス（壊死）とに分類される。アポトーシスは、プロテアーゼ（タンパク質分解酵素）の活性化によって引き起こされ、発生や細胞数の調節にも関与する等、細胞の正常な活動の一環である。一方、ネクロシスは、外的な要因等による突発的な細胞の死であり、物理的な損傷の他、光、温度、化学物質等の毒性によって細胞死が引き起こされる場合が相当する。

従来、細胞死を検出するために様々な手法が提案されている。特許文献１は、細胞に細胞死判定液を適用し、細胞死の発生を光学的かつ経時的に観察する概念を開示している。また、特許文献２は、２種類の蛍光染料、すなわち生細菌標識用の蛍光染料と死細菌標識用の蛍光染料とを用いて細菌を標識し、これにパルス励起光を照射して蛍光を受光し、電気的に処理することで生死細菌数を精度よく計数する構成を開示している。特許文献３は、死細胞を選択的に染色して観察する手法に関して、細胞接着性膜パターン上に細胞を接着させて培養する点を特徴とする技術を開示しており、これにより、細胞数の計数が容易となり、細胞の正確な生存率を観測することができるという効果を奏している。生存率の正確な把握は、毒性試験における毒性の定量評価に重要である。

一方、特許文献４は、細胞死が起きると細胞外に漏洩するような特殊なマーカータンパク質を発現する遺伝子を細胞に導入し、マーカータンパク質の挙動を観察することで細胞死を検出する技術を開示している。細胞外でマーカータンパク質が観察されれば、それは細胞死があったことを意味する。

特開平５−１８４５７９号公報 特開２０００−３１６５９６号公報 特許第３０７７６２８号公報 国際公開第０２／０５２０３２号パンフレット

ところで、生細胞を長期培養しながら経時的に観察する場合、細胞へのダメージは最小限に抑える必要がある。化学物質の投与を含めた外的な環境変動は、細胞にとって程度の違いはあるものの少なからず毒性を有し、細胞の生存期間を縮める一因となり得る。すなわち、細胞死を観察するための試薬は、それ自体が細胞死の原因となり得る。ところが、特許文献１〜３のものは、死細胞を標識するために染料や試薬を投与しなくてはならず、長期培養中の生細胞にダメージを与えてしまうものであり、生細胞が培養過程で死滅する様子を精度よく観察するのには適さない。

一方、特許文献４のものは、マーカータンパク質を発現させて標識する方式であり、染料などを用いる場合と比較して毒性は低いものの、細胞死を観察するために、特別な遺伝子の導入を必須とする。

本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、長期培養中の細胞に与えるダメージを最小限に抑えつつ、特殊な染料や特殊な遺伝子の導入を要せず、培養中の細胞の生死を精度よく判定できる細胞観察装置、細胞観察方法、及び細胞観察プログラムを提供することを目的とする。

上述した課題を解決し、目的を達成するために、請求項１に係る細胞観察装置は、複数の時点で細胞を撮影して得られたそれぞれの画像の細胞画像データから細胞を示す細胞領域を認識する細胞認識手段と、該細胞認識手段で認識した前記細胞領域の特徴を示す細胞パラメータを計測する細胞パラメータ計測手段と、該細胞パラメータ計測手段で計測した前記細胞パラメータと閾値とを比較して前記細胞の生死を判定する細胞生死判定手段と、を備えたことを特徴とする。

請求項２に係る細胞観察装置は、上記発明において、異なる時点で撮影されたそれぞれの画像の前記細胞画像データから認識された細胞領域同士の対応付けを行う細胞追跡手段をさらに備え、前記細胞生死判定手段は、前記細胞追跡手段で対応付けられたそれぞれの細胞領域について前記細胞パラメータと前記閾値との比較を繰り返し行うことで前記細胞の生死を判定することを特徴とする。

請求項３に係る細胞観察装置は、上記発明において、前記細胞生死判定手段は、繰り返し行った比較の結果として同一の結論となる割合が所定の割合を下回る場合には前記細胞追跡手段で対応付けられた前記細胞領域で示される前記細胞が死滅していないと判定することを特徴とする。

請求項４に係る細胞観察装置は、上記発明において、前記細胞生死判定手段は、前記細胞追跡手段で１つの前記細胞領域に対して複数の前記細胞領域が対応付けられているときには該１つの前記細胞領域で示される前記細胞が死滅していないと判定することを特徴とする。

請求項５に係る細胞観察装置は、上記発明において、前記細胞生死判定手段は、観察対象となる前記細胞の平均的な細胞周期における分裂期より長くなるように設定された撮影期間に渡る複数の時点のそれぞれの前記細胞領域から計測された前記細胞パラメータと前記閾値との比較を繰り返し行うことで前記細胞の生死を判定することを特徴とする。

請求項６に係る細胞観察装置は、上記発明において、前記細胞パラメータは、少なくとも前記細胞領域の円形度を含むことを特徴とする。

請求項７に係る細胞観察装置は、上記発明において、前記細胞パラメータは、少なくとも前記細胞領域の平均輝度を含むことを特徴とする。

請求項８に係る細胞観察装置は、上記発明において、前記細胞パラメータは、少なくとも前記細胞領域のエッジ強度を含むことを特徴とする。

請求項９に係る細胞観察装置は、上記発明において、細胞を培養する培養手段をさらに備えたことを特徴とする。

請求項１０に係る細胞観察装置は、上記発明において、前記細胞は、蛍光タンパクを導入した細胞であることを特徴とする。

請求項１１に係る細胞観察装置は、上記発明において、前記細胞は、局在化せずに発現する蛍光タンパクを導入した細胞であることを特徴とする。

請求項１２に係る細胞観察装置は、上記発明において、複数の時点で細胞を撮影した画像を取得する撮像手段をさらに備えたことを特徴とする。

請求項１３に係る細胞観察プログラムは、細胞観察装置で細胞の観察を行う細胞観察プログラムであって、前記細胞観察装置に、複数の時点で細胞を撮影して得られたそれぞれの画像の細胞画像データから細胞を示す細胞領域を認識する細胞認識ステップと、該細胞認識ステップで認識した前記細胞領域の特徴を示す細胞パラメータを計測する細胞パラメータ計測ステップと、該細胞パラメータ計測ステップで計測した前記細胞パラメータと閾値とを比較して前記細胞の生死を判定する細胞生死判定ステップと、を実行させることを特徴とする。

請求項１４に係る細胞観察プログラムは、上記発明において、異なる時点で撮影されたそれぞれの画像の前記細胞画像データから認識された細胞領域同士の対応付けを行う細胞追跡ステップをさらに含み、前記細胞生死判定ステップは、前記細胞追跡ステップで対応付けられたそれぞれの細胞領域について前記細胞パラメータと前記閾値との比較を繰り返し行うことで前記細胞の生死を判定することを特徴とする。

請求項１５に係る細胞観察プログラムは、上記発明において、前記細胞生死判定ステップは、繰り返し行った比較の結果として同一の結論となる割合が所定の割合を下回る場合には前記細胞追跡ステップで対応付けられた前記細胞領域で示される前記細胞が死滅していないと判定することを特徴とする。

請求項１６に係る細胞観察プログラムは、上記発明において、前記細胞生死判定ステップは、前記細胞追跡ステップで１つの前記細胞領域に対して複数の前記細胞領域が対応付けられているときには該１つの前記細胞領域で示される前記細胞が死滅していないと判定することを特徴とする。

請求項１７に係る細胞観察プログラムは、上記発明において、前記細胞生死判定ステップは、観察対象となる前記細胞の平均的な細胞周期における分裂期より長くなるように設定された撮影期間に渡る複数の時点のそれぞれの前記細胞領域から計測された前記細胞パラメータと前記閾値との比較を繰り返し行うことで前記細胞の生死を判定することを特徴とする。

請求項１８に係る細胞観察プログラムは、上記発明において、前記細胞パラメータは、少なくとも前記細胞領域の円形度を含むことを特徴とする。

請求項１９に係る細胞観察プログラムは、上記発明において、前記細胞パラメータは、少なくとも前記細胞領域の平均輝度を含むことを特徴とする。

請求項２０に係る細胞観察プログラムは、上記発明において、前記細胞パラメータは、少なくとも前記細胞領域のエッジ強度を含むことを特徴とする。

請求項２１に係る細胞観察方法は、細胞を培養する培養手段と、該培養手段に収容されている細胞を撮影する撮像手段とを備えた細胞観察装置で細胞の観察を行う細胞観察方法であって、前記培養手段で培養している最中の細胞を前記撮像手段によって複数の時点で撮影して得られたそれぞれの画像の細胞画像データから細胞を示す細胞領域を認識する細胞認識工程と、該細胞認識工程で認識した前記細胞領域の特徴を示す細胞パラメータを計測する細胞パラメータ計測工程と、該細胞パラメータ計測工程で計測した前記細胞パラメータと閾値とを比較して前記細胞の生死を判定する細胞生死判定工程と、を備えたことを特徴とする。

請求項２２に係る細胞観察方法は、上記発明において、異なる時点で撮影されたそれぞれの画像の前記細胞画像データから認識された細胞領域同士の対応付けを行う細胞追跡工程をさらに含み、前記細胞生死判定工程は、前記細胞追跡工程で対応付けられたそれぞれの細胞領域について前記細胞パラメータと前記閾値との比較を繰り返し行うことで前記細胞の生死を判定することを特徴とする。

本発明に係る細胞観察装置、細胞観察方法、及び細胞観察プログラムによれば、複数の時点で撮影されて計測された細胞領域の特徴を示す細胞パラメータを閾値と比較することで、細胞の生死を判定するようにしたので、長期培養中の細胞に与えるダメージを最小限に抑えつつ、特殊な染料や遺伝子の導入を要せず、培養中の細胞の生死を精度よく判定することができるという効果を奏する。加えて、細胞追跡によって対応付けられたそれぞれの細胞領域についてそれぞれの細胞パラメータと閾値との比較を繰り返し行って細胞の生死を判定することで、個々の細胞の生死の判定を一層正確に行うことができるという効果を奏する。

以下に添付図面を参照して、本発明に係る好適な実施の形態について詳述する。本発明の実施の形態に係る細胞観察装置は、蛍光タンパクを導入した複数の生細胞を長期間培養したまま撮像し、個々の細胞の領域を認識し、経時的な位置変化を追尾しつつ、個々の細胞の特徴を示す細胞パラメータを独立に計測した上で、さらに細胞の生死を検出する。

図１は、本実施の形態に係る細胞観察装置の構成例を示す概略ブロック図である。本実施の形態に係る細胞観察装置は、概略的には、細胞を培養する培養部１０１と、この培養部１０１に収容されている細胞を撮像する撮像部２０１と、細胞観察装置の全体の処理及び動作を制御する制御部３０１と、撮像部２０１で撮像した画像のデータや処理後のデータなどの各種データを集中して一時的或いは永続的に記録する記録部３０２と、各種情報の入力を受ける入力部３０３と、画像情報等の各種情報を表示して操作者に提示する表示部３０４とを備える他、前処理部３０５、細胞認識部３０６、パラメータ計測部３０７、細胞追跡部３０８、露出検出部３０９、撮像回数計数部３１０、占有面積算出部３１１、合焦検出部３１２、及び細胞生死判定部３１３を備える。これらの各部３０２〜３１３は、制御部３０１に接続され、制御部３０１により制御される。なお、図１では、制御部３０１から培養部１０１や撮像部２０１に対する制御接続は特に図示していない。また、制御部３０１、前処理部３０５、細胞認識部３０６、パラメータ計測部３０７、細胞追跡部３０８、露出検出部３０９、撮像回数計数部３１０、占有面積算出部３１１、合焦検出部３１２、及び細胞生死判定部３１３によって行われる各処理は、細胞観察装置に搭載されたＣＰＵがＲＯＭ等のメモリに記憶された処理プログラムに基づいて、適宜ＲＡＭ等の記憶装置に必要なデータを書き込みながら行われる。

まず、培養部１０１について説明する。スライドガラス１０２は、局在化せずに発現する蛍光タンパクをあらかじめ導入した複数の生細胞Ｃを保持し、培養部１０１内に設置されている。この培養部１０１は、例えば特開２００４−１１３１７５号公報によって開示された培養容器と同様の構成である。この場合、蛍光タンパクは局在化しないものであれば何でも良く、一般的なクラゲ由来の蛍光タンパク等が利用可能で、一例としてＢＤバイオサイエンス・クロンテック社のｐＥＧＦＰ−Ｎ１を使用することができる。

図２は、培養部１０１の構成例を示す水平断面図であり、図３は、培養部１０１の構成例を示す縦断正面図である。培養手段としての培養部１０１は、図２及び図３に示すように、スライドガラス１０２を内部に収容可能な表裏貫通孔１０３を有する熱伝導に優れた材質、例えば、ステンレス製又はアルミニウム製の筐体１０４と、その筐体１０４の表裏貫通孔１０３を塞ぐ光学的に平滑な２枚のガラス板で形成された観察窓１０５と、筐体１０４内部に培養液Ａを供給する培養液供給パイプ１０６と、筐体１０４内部から不要となった培養液Ａを排出する培養液排出パイプ１０７と、筐体１０４への培養液Ａの出入口に設けられた２つの整流板１０８とを備えている。

生細胞Ｃを健全に育成するためには、スライドガラス１０２上の全域に渡って常に新鮮な培養液Ａが供給されることが望ましい。しかし、培養液Ａの流れが急激な場合、スライドガラス１０２上に着床した生細胞Ｃが剥離する可能性がある。このため、本実施の形態は、各パイプ１０６，１０７付近に整流板１０８を設置し、培養液Ａの流れを均一に分散、回収できるようにしている。

図４は、整流板１０８の構成例を示す斜視図である。整流板１０８は、図４に示すように、厚さ方向に複数の貫通孔１０８ａを形成した多孔性の部材である。入口側の整流板１０８は、培養液供給パイプ１０６から流入する培養液Ａを複数の貫通孔１０８ａに分散させて流通させ、出口側の整流板１０８は、培養液排出パイプ１０７を経て一気に流出しようとする培養液Ａを複数の貫通孔１０８ａに分散させて流通させる。これにより、集中的な流れを分散流に変換し、生細胞Ｃが配置されているスライドガラス１０２近傍において、一定の流速及び流量で培養液Ａを流動させることができる。

培養部１０１には、温度制御ユニット１０９が取り付けられ、培養部１０１の周囲に温水Ｗを流通させる温水流路１１０を形成する。温水流路１１０に温水Ｗを循環させることにより、筐体１０４を介して温水の熱を培養液Ａに伝達させる。この時、図示しない温度センサからの温度情報が制御部３０１に所定時間間隔毎に伝達され、制御部３０１は培養部１０１内の温度が３７±０．５℃の範囲に維持されるように温水Ｗの温度と流量を制御する。

また、図示しないｐＨセンサによって培養液ＡのｐＨ情報が制御部３０１に所定時間間隔毎に伝達され、制御部３０１は培養液のｐＨが所定の範囲に維持されるように培養液Ａ内のＣＯ₂濃度を制御する。

未使用の培養液は、図示しない培養液保存部に保存されており、経時的な劣化を抑えるため、図示しない保冷機構で約４℃に保冷される。保冷された培養液は、図示しない培養液加温機構によって約３７℃に加温された後、培養液供給パイプ１０６を通じて筐体１０４内に供給される。

培養液排出パイプ１０７を通じて排出された培養液は、図示しない廃液保存部に保存される。排出された培養液の一部を新鮮な培養液と混合して筐体１０４内に供給する構成としても良く、この場合、培養液の交換に伴う細胞への衝撃を和らげ、より長期の培養に適した構成となる。

図５は、培養部１０１側と撮像部２０１側との境界部分の断熱構成例を示す断面図である。培養部１０１の発する熱は、断熱手段としての断熱部１１１を設けることで、撮像部２０１側には伝達しないようにする。培養部１０１と撮像部２０１との断熱を行う断熱部１１１の設置個所は、種々考えられるが、本実施の形態では、培養部１０１の筐体１０４と撮像部２０１を構成する撮像素子との間に断熱部１１１を設置している。断熱部１１１は、断熱性が高く伸縮性のある部材、例えばゴム、シリコン、ポリウレタン等を使用したシート状であって、対物レンズ２０２と概略同じ直径の貫通孔１１２が設けられている。培養部１０１と対物レンズ２０２とは貫通孔１１２を通して光学的に接続されており、自由に光線をやり取りできる。一方、培養部１０１の発する熱は断熱部１１１によってそのほとんどが遮られる。一般に、光学系は２５℃前後での使用を前提として調整されており、培養部１０１からの熱で加熱されると想定した性能を発揮できない。特に、撮像部２０１の備えるＣＣＤ等の固体撮像素子は、高温になる程ノイズが増加してＳ／Ｎが劣化するため、微弱な蛍光を捉えるためにはできるだけ低温（ただし、結露させない）に保つ必要がある。

培養手段としては、培養部１０１のように培養液の交換を行うことができるものを用いるとより好ましいが、一般的なウェルプレートを用いて細胞を観察することも可能である。ただし、一般的なウェルプレートを用いた場合には、環境状態を維持したまま培養液を交換することができないため、培養部１０１を用いる場合に比べて、細胞の代謝に伴う培養液の劣化の影響で培養期間は短期に制限されてしまう。

以上の構成により、培養部１０１内部の温度と培養液ＡのｐＨはほぼ一定に保たれている。測定試料となる生細胞の一例として、ヒーラ細胞を用いる。ヒーラ細胞は、子宮頸癌由来であり、創薬毒性試験等で広く用いられている。導入する蛍光タンパクの種類は、アッセイの内容に応じて変更しても良い。

次に、撮像部２０１について説明する。撮像部２０１は、励起光照明部２０３と、ダイクロイックミラー２０４と、対物光学系と２０５と、結像光学系２０６と、蛍光撮像部２０７と、赤外光照明部２０８と、ダイクロイックミラー２０９と、結像光学系２１０と、赤外光撮像部２１１とを有して構成されている。すなわち、本実施の形態の撮像部２０１は、蛍光撮像系と赤外光撮像系とを有する構成とされている。

まず、励起光照明部２０３から放射された光は、ダイクロイックミラー２０４によって反射され、対物レンズ２０２を含む対物光学系２０５と観察窓１０５を経てスライドガラス１０２に照射される。照射された光を励起光として、スライドガラス１０２上の生細胞Ｃに導入された蛍光タンパクから蛍光が発せられ、励起光の反射光と蛍光は共に観察窓１０５から射出される。射出された光は、再度対物光学系２０５を通過し、ダイクロイックミラー２０４に到達するが、蛍光のみが透過し、励起光の反射光は遮断される。ダイクロイックミラー２０４を透過した蛍光は、結像光学系２０６によって細胞光撮像手段としての蛍光撮像部２０７が備えるＣＣＤやＣＭＯＳ等の固体撮像素子上に拡大投影されて結像する。

結像した測定試料の蛍光像を蛍光撮像部２０７が備える固体撮像素子によって画像データに変換し、制御部３０１による制御の下に記録部３０２において一時的或いは永続的に記録する。図６は、蛍光撮像された培養中の細胞画像の一例を示す説明図である。

また、赤外光照明部２０８から放射された光は、一方の観察窓１０５を経てスライドガラス１０２に照射され、その透過光が他方の観察窓１０５から射出される。射出された光は、対物光学系２０５を通過し、ダイクロイックミラー２０９に到達するが、赤外光は全て反射される。反射された赤外光は、結像光学系２１０によって赤外光撮像手段としての赤外光撮像部２１１が備えるＣＣＤやＣＭＯＳ等の固体撮像素子上に拡大投影されて結像する。結像した測定試料の赤外光像を赤外光撮像部２１１が備えるＣＣＤやＣＭＯＳ等の固体撮像素子によって画像データに変換し、制御部３０１による制御の下に、記録部３０２において一時的或いは永続的に記録する。

一般に、蛍光タンパクは全ての細胞に均等に導入できる訳ではなく、また導入できた場合でも直ちに発現するとは限らないため、細胞の全体像を経時的に安定して観察する手段が必要であり、本実施の形態では赤外光像がこれに当たる。赤外光像を表示する場合、初期状態では蛍光タンパクが殆ど或いは全く発現していない測定試料であっても、細胞像を視認しながら観察範囲の確認や調整を行える。

赤外光は、可視光と比較して生細胞に対する光毒性が低いため、可視光を用いて撮像した場合と比較して、より長期間細胞の活性を維持することができる。また、蛍光撮像用の励起光として可視光全域を使用できるようになるため、利用可能な蛍光タンパクの制約が緩和される。

このように、本実施の形態の撮像部２０１によれば、蛍光撮像部２０７や赤外光撮像部２１１を用いてスライドガラス１０２上の生細胞Ｃを撮像することで、生細胞Ｃを撮像した画像の画像データである細胞画像データを取得することが可能である。本実施の形態では、制御部３０１の制御により、あらかじめ設定した時間間隔で自動的に蛍光撮像部２０７によって撮像を行う。そして、細胞の様子を観察したいときに、必要に応じて、ユーザが所望の時期に赤外光撮像部２１１を用いた生細胞Ｃの観察を行うことができる。なお、赤外光撮像部２１１による撮像は、ユーザが所望の時期に行うばかりではなく、制御部３０１の制御によって、蛍光撮像部２０７による撮像と同期したタイミングで行えば、赤外光像と蛍光像との対応付けが容易になるだけでなく、両画像に含まれる生細胞Ｃ同士の対応付けも容易になる。その結果、生細胞Ｃを長期に培養しながら観察する場合に、細胞の活性低下を抑えながら、効率よく生細胞Ｃの観察を行うことが可能となる。蛍光像や赤外光像を撮像した時間を、表示部３０４に表示する機能を付加してもよい。

本実施の形態の構成は、蛍光撮像部２０７と赤外光撮像部２１１とを備えるため、蛍光像の撮像と赤外光像の撮像とを並行して行うことができ、両者を切り替えながら撮像する場合と比較して、撮像に要する時間が大幅に短縮され、切り替え用の駆動部も不要である。

赤外光照明部２０８にリング絞りを加え、ダイクロイックミラー２０９から結像光学系２１０に至る光路に位相板を挿入すれば、透過観察に代えて位相差観察を行うことができる。位相差観察は、透過観察と比較して、よりコントラストの高い画像が得られる。

赤外光照明部２０８にポラライザとＤＩＣ（Differential Interference Contrast）素子を挿入し、ダイクロイックミラー２０９から結像光学系２１０に至る光路にＤＩＣスライダとアナライザを挿入すれば、透過観察に代えて微分干渉観察を行うことができる。微分干渉観察は、透過観察と比較して、よりコントラストの高い画像が得られる。

ステージ搬送機構１１３によって、スライドガラス１０２と、蛍光撮像部２０７や赤外光撮像部２１１が備える固体撮像素子との相対位置を変化させながら、各視野（撮像範囲）について必要な回数だけ撮像と記録を反復し、細胞画像データを取得する。複数の視野を切り替えながら撮像する場合は、各視野でのステージ位置を記録しておき、各視野の２回目以降の撮像に先立って、ステージ搬送機構１１３によりステージ位置を再現する。図７は、複数の視野（視野１〜Ｎ）による撮像の様子を示す説明図である。各視野の位置は任意であり、また、特に格子状に限定されるものではない。また、視野同士に重なりがあってもよい。図８は、各視野１〜Ｎの撮像タイミング例を示す説明図である。各視野１〜Ｎは、撮像間隔が概略一定となるように所定の順番で撮像を行う。

ここで、露出検出部３０９により画像データ撮像時の露出が適正であったか否かを検出する。撮像時の露出が不適正だった場合、直ちに或いは他の任意の観察部位の撮像が完了した時点で、露出不適正部位の撮像をやり直す。この際、露出条件を変更しても良い。同様に、合焦検出部３１２により画像データ撮像時の焦点合わせが適正であったか否かを検出する。撮像時の焦点合わせが不適正だった場合、直ちに或いは他の任意の観察部位の撮像が完了した時点で、合焦不適正部位の撮像をやり直す。この際、焦点合わせの条件を変更しても良い。

また、培養部１０１内は培養液Ａが循環しているが、撮像を行うタイミングに合わせて一時的に循環を停止させても良い。これにより、培養液の流通に由来する撮像時の背景の揺らぎを回避することができる。

さらに、所定の視野における撮像回数を撮像時点認識手段としての撮像回数計数部３１０により計数し、所定の視野の所定回数（フレーム）の撮像後、報知手段としての表示部３０４に画像を表示し、その内容について操作者に確認を求めるようにしてもよい。内容に問題が無いと操作者が判断した場合は処理を継続し、問題ありと判断した場合は、撮像条件の再設定について操作者からの指示を受け付ける。或いは、単に処理を中止してもよい。一定時間経っても操作者からの応答が無い場合は、既定の指示に従い、処理の継続或いは中止を選択する。

なお、本実施の形態では、蛍光撮像部２０７（又は、赤外光撮像部２１１）による撮像回数を計数し、所定回数の撮像後に操作者に画像の確認を求めるようにしたが、撮像回数を基準にするだけではなく、撮像時点認識手段として、観察開始から所定時間の経過を計測する手段（例えば、細胞画像データを撮像した時刻の情報も取得して、その時刻があらかじめ定めた時刻を超えた場合に、所定時点の細胞画像データを取得したことを認識する）を設けることで、画像の確認を行うようにしてもよい。

培養期間が長期となると、培養中の細胞に関して、想定した範囲を逸脱した増殖、死滅、画像輝度値の過大等が起こる可能性があり、或る時点で細胞観察にとって適切な画像を取得できなくなる場合も予想される。そこで、上述のように、所定の時点が経過したことを操作者に認識させたり、処理を中止したりすることで、操作者はそれまでに取得した画像や、その時点の画像を確認して、その後の細胞観察を適切に行うことが可能となる。

ついで、撮像した画像のうち、蛍光撮像部２０７で取得した画像データの処理手順について説明する。図９は、制御部３０１による制御の下に、前処理部３０５等により実行される画像データ処理例を示す概略フローチャートである。前述したような撮像部２０１による細胞画像の撮像（ステップＳ１）に引き続き、前処理部３０５で前処理を行い（ステップＳ２）、細胞認識手段としての細胞認識部３０６で細胞を認識する（ステップＳ３）。ついで、認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを細胞パラメータ計測手段としてのパラメータ計測部３０７で細胞画像データに基づき計測する（ステップＳ４）。さらに、
細胞追跡手段としての細胞追跡部３０８で、異なる時点で撮像された画像の細胞画像データから認識された異なる時点の細胞同士の同一性を細胞パラメータに基づいて判別する（ステップＳ５）。或いは、さらに追跡結果を修正する（ステップＳ６）。さらに、細胞生死判定手段としての細胞生死判定部３１３で、細胞の生死を判定する（ステップＳ７）。そして、得られた追跡結果、生死判定結果等を表示部３０４に表示させ（ステップＳ８）、観察が終了するまで（ステップＳ９：Ｙｅｓ）、上述の処理ステップを同様に繰り返す。

なお、ステップＳ１（又は、ステップＳ１及びステップＳ２）の処理を、複数の時期においてあらかじめ行っておいて、各時期に取得した画像データに対するステップＳ２以降（又は、ステップＳ３以降）の処理を後にまとめて行うようにしてもよい。このように、複数の時期において撮像した画像データをあらかじめ取得しておいて、後にまとめて画像データの処理を行うようにする場合、撮像と画像データの処理とを並行して行う場合と比較し、装置構成が単純化され、安価な計算機を用いて応答性と安定性を向上させることができる。

各処理ステップの内容を個別に説明する。撮像し記録部３０２に記録された細胞画像データを、ステップＳ２では、前処理部３０５において以下のように処理する。まず、細胞画像データにエッジ保存型のローパスフィルタを適用する。エッジ保存型のローパスフィルタは、エッジ部における空間周波数高周波成分の劣化を抑えつつ、エッジ部以外に平滑化の効果をもたらすものであり、細胞の輪郭情報を保存したままノイズ除去ができる点で、本手法に好適である。

このような要件を満たすフィルタとして、バイラテラルフィルタ（Tomasi & Manduchi,"Bilateral Filtering for Gray and Color Images", Proceedings of the 1998 IEEE International Conference on Computer Vision, Bombay, India参照)が知られており、本手法でもこれを使用する。

次に、エッジ保存型ローパスフィルタ適用後の細胞画像データに、さらにエッジ強調のための先鋭化フィルタを適用する。先鋭化フィルタは、注目画素とその近傍の８画素に例えば図１０に示すような重み付けを行って総和を求めるフィルタであり、これを画素毎に反復実行することで、先鋭化処理が実現できる。

ステップＳ３では、前処理後の細胞画像データを、細胞認識部３０６において以下のような手順で分析し、個々の細胞の占める領域を認識する。この手順に従えば、細胞が互いに隣接せずに散在する場合だけでなく、細胞が互いに隣接し、密集している場合にも個々の細胞の占める領域を認識できる。また、細胞領域のエッジが明瞭でない場合にも適用することができる。

まず、画像を高輝度画素の集中する領域毎に領域分割する。一般に、蛍光画像において、細胞は高輝度画素の塊の様相を呈するため、高輝度画素の集中する領域（塊）毎に領域分割することは、画像を細胞毎の領域に分割することに相当する。

このような要件を満たす処理として、分水嶺領域分割が知られている。本実施の形態の細胞認識の処理手順として、この分水嶺領域分割方式を使用する(Vincent & Soille , "Watersheds in Digital Spaces: An Efficient Algorithm Based on Immersion Simulations", IEEE TRANSACTIONS ON PATTERN ANALYSIS AND MACHINE INTELLIGENCE, VOL.13, NO.6, JUNE 1991参照)。原論文における分水嶺領域分割は、画像を低輝度画素の集中する領域に分割するものであるが、ここでは輝度を反転して考え、高輝度領域の分割に適用する。得られた領域分割結果における個々の領域が細胞領域となる。

ここで、隣接する細胞領域の特性に応じて複数の細胞領域を統合し新たな１つの細胞領域とするような、統合処理を行っても良い。分水嶺領域分割処理の結果は、一般に、小領域に分割され易い傾向があるため、統合処理を行うことで認識結果の品質を高めることができる。

領域統合の第１の手法を、図１１を参照して説明する。図１１は、領域統合の第１の手法例を示す概略フローチャートである。まず、各細胞領域において輝度が最大となる点、すなわち輝度の頂点を求める（ステップＳ３１１）。次に、隣接する任意の２つの細胞領域を選択し（ステップＳ３１２）、それらの頂点間を結ぶ線分に沿った道のり距離Ｄ_UWを求める（ステップＳ３１３）。道のり距離Ｄ_UWの計算には式(１)を用いる。

ここで、Ｉ(Ｐ)は、エッジ保存型ローパスフィルタ適用後の画像における画素Ｐの輝度値、／Ｉ(Ｐ_S)は、エッジ保存型ローパスフィルタ適用後の画像における２つの頂点の輝度値の平均、Σは、頂点間を結ぶ線分の全画素について総和を求めることを表す。

ステップＳ３１３で、隣接する細胞領域の全ての組み合わせについて頂点間の道のり距離Ｄ_UWを求めた後、ステップＳ３１４で、この道のり距離Ｄ_UWと所定の閾値Ｖ_UWとの比較を行う。比較の結果、所定の閾値Ｖ_UW以下である場合には（ステップＳ３１４：Ｙｅｓ）、細胞領域同士を１つの領域に統合する（ステップＳ３１５）。このような処理を全組み合わせについて完了するまで（ステップＳ３１６：Ｙｅｓ）、同様に繰り返す。

領域統合の第２の手法を、図１２を参照して説明する。図１２は、領域統合の第２の手法例を示す概略フローチャートである。まず、エッジ保存型ローパスフィルタの出力結果にエッジ抽出フィルタ、例えばSobelフィルタを適用してエッジ画像を得る（ステップＳ３２１）。任意の隣接する細胞領域間の境界を考えて、隣接する任意の２つの細胞領域を選択し（ステップＳ３２２）、式(２)で定義されるエッジ強度Ｄ_UEを求める（ステップＳ３２３）。

ここで、Ｅ(Ｐ)は、エッジ画像における画素Ｐの輝度値、Σは、細胞領域間の境界に含まれる全画素について総和を求めることを表す。

ステップＳ３２３で、隣接する細胞領域の全ての組み合わせについてエッジ強度Ｄ_UEを求めた後、ステップＳ３２４で、このエッジ強度Ｄ_UEと所定の閾値Ｖ_UEとの比較を行う。比較の結果、所定の閾値Ｖ_UE以下である場合には（ステップＳ３２４：Ｙｅｓ）、細胞領域同士を１つの領域に統合する（ステップＳ３２５）。このような処理を全組み合わせについて完了するまで（ステップＳ３２６：Ｙｅｓ）、同様に繰り返す。

これらの第１，第２の領域統合の手法は、それぞれ別個に使用しても良いし、任意の順番で連続して用いても良い。さらに、輝度情報を用いて各細胞領域の妥当性を検証しても良い。そのためには、分割された細胞領域毎に輝度値が最大となる画素を求め、その輝度値が所定の閾値Ｖtminより小さい場合、その領域は細胞領域ではないと判定し、所属する画素も含めて以降の処理の対象から除外する。これにより、蛍光タンパクの導入又は発現が不十分な細胞、及び細胞ではない背景領域を除外することができる。

さらに、細胞領域内の各画素の輝度を所定の閾値Ｖpminと比較し、閾値Ｖpminより輝度の小さい画素を細胞領域から除外しても良い。こうして除外された画素は、以降の処理には使用しない。これにより、細胞領域の中でもＳ／Ｎの低い低輝度部位を除外することができ、細胞領域の境界形状をより正確に認識することが可能となる。
得られた細胞領域、及び各細胞領域に属する画素の集合を記録部３０２に記録する。

なお、赤外光撮像部２１１が撮像した赤外光画像を用いて細胞領域を認識することも可能である。赤外光画像が位相差画像である場合、細胞の存在する領域の輝度値は、背景とは異なる輝度値として観察される。したがって、画像内の各画素について代表的な背景の輝度値Ｐ_BGとの差を求め、差が所定の閾値Ｖ_PGより大きな画素のみを抽出し、一般的なラベリング処理を行って隣接する画素を統合すれば、細胞領域を認識することができる。

図９の処理に戻り、ステップＳ４では、パラメータ計測部３０７において、細胞認識部３０６で認識した細胞領域毎に細胞パラメータを計測し、その計測結果を記録部３０２に記録する。図１３は、記録部３０２に記録された細胞パラメータの計測結果例を示す説明図である。ただし、Ｍは認識された細胞領域の数である。本実施の形態では、細胞パラメータは、例えば、重心位置、面積、円形度、輝度の総和、平均輝度、輝度の標準偏差を測定項目対象としており、細胞画像データ及び細胞領域と関連付けて記録部３０２に記録する。アッセイの内容に応じて、周囲長、フェレ径、長さ、幅、最大輝度等の一般的な測定項目を追加しても良い。

ここで、本実施の形態は、画像内の全ての細胞の面積の総和、すなわち画像内で細胞領域の占める度合いを示す細胞占有値に相当する面積を占有面積算出手段としての占有面積算出部３１１で算出し、画像内で細胞領域の占める面積が、画像の面積に対して所定の割合を超えた場合、制御部３０１にその事象を通知する。この場合、制御部３０１はあらかじめ指定された設定に従い、報知手段としての表示部３０４を通じて操作者にさらに報知しても良いし、培養部１０１の制御状態を変更しても良い。或いは単に通知を無視しても構わない。この機能は、培養が長期になると、細胞の増殖等によって培地の空きスペースが減少することがあるので、細胞培養の過程において培地の空きスペースが不足してきていることを通知する場合に有効である。

占有面積計算部３１１は、細胞画像内で細胞領域の占める面積を細胞占有値として求めるものである。細胞画像は、蛍光画像或いは赤外光画像のいずれであっても構わない。蛍光画像を対象とする場合、パラメータ計測部３０７により細胞領域の面積が計測されているので、画像内の全ての細胞領域の面積を合計すれば、画像内で細胞領域の占める面積を求めることができる。赤外光画像を対象とする場合、細胞の存在する領域の輝度値は、背景とは異なる輝度値として観察される。したがって、まず画像内の各画素について代表的な背景の輝度値Ｐ_BGとの差を求め、差が所定の閾値Ｖ_PGより大きな画素のみを抽出する。さらに、画像内で抽出された画素の数を計数すれば、画像内で細胞領域の占める面積が得られる。

以上の手順により、複数の細胞画像を含む単一の細胞画像に関して、個々の細胞の領域を求めた上で細胞パラメータを計測することができる。所定の時間間隔Δｔ毎に細胞画像の撮像とパラメータ計測とを反復して行うことで、細胞パラメータを時間経過に伴って蓄積することができる。

ここで、このままの処理では、異なる時刻に計測された細胞パラメータ同士が関連付けられておらず、経時的に計測した状態とは言えない。そこで、異なる時刻に撮影された細胞画像間において、細胞領域の対応付けを行い、その結果を用いて細胞パラメータ同士の関連付けを行う必要がある。

細胞領域の対応付けは、細胞追跡部３０８において、ステップＳ５，Ｓ６の処理として以下のように実行される。ここで、時刻ｔ₁において認識された細胞領域をＲ_t1,m、時刻ｔ₂において認識された細胞領域をＲ_t2,nと表すものとする。ただし、時刻ｔ₂は時刻ｔ₁より時系列的に後の時刻である。ｍ，ｎは同一画像内で重複の無い細胞領域の識別番号で、１≦ｍ≦Ｍ，１≦ｎ≦Ｎであり、ＭとＮはそれぞれ時刻ｔ₁，ｔ₂で認識された細胞領域の数を表す。

まず、２つの細胞領域Ｒ_t1,mとＲ_t2,nの関連性に関する評価関数を式(３)で定義する。式(３)で計算される評価値Ｊ₁が小さい程、２つの領域は関連性が高く、同一の細胞を示している可能性が高いと言える

［数３］
Ｊ₁＝Ｊ₁(Ｒ_t1,m，Ｒ_t2,n)＝ｋ_dδ_d＋ｋ_aδ_a＋ｋ_cδ_c ……(３)
δ_d：重心間の距離
δ_a：面積の差
δ_c：円形度の差
ｋ_d，ｋ_a，ｋ_c：所定の重み付け係数

図１４は、ｍとｎの可能な組み合わせについて評価値を計算した結果を示す説明図である。ただし、図１４では記述の簡便のため、Ｊ₁(Ｒ_t1,m，Ｒ_t2,n)をＪ_m,nと簡略表記している。

ここで、時刻ｔ₁の領域Ｒ_t1,mに対応する時刻ｔ₂の領域Ｒ_t2,n^を式(４)に従って決定する。すなわち、Ｒ_t2,n^とは、領域Ｒ_t1,mとの間の評価値Ｊ₁を最小化するような時刻ｔ₂の領域である。

評価値Ｊ₁が最小となるｎ＾が複数存在する場合、それらに対して式(５)に示す第２の評価関数を適用し、評価値Ｊ₂が、より小さくなる組み合わせを決定する。第２の評価値Ｊ₂が最小となる組み合わせも複数あった場合、操作者へのメッセージを表示部３０４に表示し、操作者が正しいと判断する組み合わせを入力部３０３より入力させ、入力結果に基づいて対応付けを行う。

[数５]
Ｊ₂＝Ｊ₂(Ｒ_t1,m，Ｒ_t2,n)＝ｋ_sδ_s＋ｋ_mδ_m＋ｋ_vδ_v ……(５)
δ_s：輝度の総和の差
δ_m：平均輝度の差
δ_v：輝度の標準偏差の差
ｋ_s，ｋ_m，ｋ_v：所定の重み付け係数

ただし、評価値Ｊ₁，Ｊ₂の両方を求めず、どちらか一方のみを用いることで処理を高速化しても良い。また、操作者へのメッセージ表示、及び操作者からの入力ステップを省略し、評価値Ｊ₁又はＪ₂を最小化する複数の対応関係を全て記録するようにしても良い。

時刻ｔ₁の領域Ｒ_t1,mと時刻ｔ₂の領域Ｒ_t2,n^は、同一の細胞を異なる時刻に認識した結果と考えられるから、両者の計測済みの細胞パラメータも同一の細胞に対する異なる時刻での計測値とみなせる。そこで、細胞パラメータの値を、細胞画像、細胞領域、細胞領域の対応付け情報、時刻情報と関連付け、併せて記録手段としての記録部３０２に記録することで、経時的なパラメータ計測が完了する。

経時的に、蛍光タンパクが新たに発現し蛍光を発するようになった場合、観察画面外にあった細胞が観察画面内へと移動した場合、重なり合っていた複数の細胞が分かれた場合、又は細胞が分裂した場合は、細胞認識部３０６において認識される細胞領域の数が増加するため、時刻ｔ₂の細胞領域に対応する時刻ｔ₁の細胞領域が存在しない場合や、時刻ｔ₂の複数の細胞が時刻ｔ₁の１つの細胞に対応する場合が発生する。

また、経時的に、蛍光タンパクの蛍光強度が低下した場合、観察画面内にあった細胞が観察画面外へと移動した場合、複数の細胞が重なり合った場合、又は細胞が死滅した場合は、細胞認識部３０６において認識される細胞領域の数が減少するため、時刻ｔ₁の細胞領域に対応する時刻ｔ₂の細胞領域が存在しない場合や、時刻ｔ₁の複数の細胞が時刻ｔ₂の１つの細胞に対応する場合が発生する。

対応する細胞領域が無い場合は、対応領域が無いことを意味するフラグを記録する。１つの細胞領域に複数の細胞領域が対応する場合は、全ての対応関係を記録する。表示部３０４を通じて操作者にメッセージを表示し、操作者からの入力を元に対応関係を修正しても良い。複数の細胞領域の対応を記録する際のデータ表現は、各時刻を高さに、各細胞領域を節点に対応させた木構造を用いる。表現の自由度がより高いグラフ構造を用いても良い。

なお、細胞領域の対応付けに関しては、以下のような改良を加えた変形例であってもよい。第１の変形例は、最小の評価値Ｊが所定の閾値Ｖ_jmaxより大きい場合、その対応付けは無効とみなす。この場合、領域Ｒ_t1,mに対応する時刻ｔ₂の領域は発見できなかったとし、領域Ｒ_t1,mに対する経時的パラメータ計測は時刻ｔ₁までで打ち切る。この変形例は、ノイズの影響を低減させるために有効である。

第２の変形例は、領域Ｒ_t1,mと対応する領域Ｒ_t2,n^の重心間距離を求め、重心間距離が所定の閾値Ｖ_dmaxより大きかった場合、その対応付けは無効とみなす。この場合、領域Ｒ_t1,mに対応する時刻ｔ₂の領域は発見できなかったとし、領域Ｒ_t1,mに対する経時的パラメータ計測は時刻ｔ１までで打ち切る。この変形例は、細胞領域対応付け処理の誤りを低減させるために有効である。
以上の手順により、細胞のパラメータを経時的に計測することができる。

次に、ステップＳ７では、細胞生死判定部３１３において各細胞の生死を判定する。細胞生死判定部３１３における細胞生死の判定には、以下に示すように複数の処理手順が存在し、これらのうち１つ以上の手順を用いて判定処理を行う。

図１５は、細胞生死判定処理の第１の処理手順を示す概略フローチャートである。図１５に示す概略フローチャートは、培養中に物理的な損傷を受けずに細胞死を起こした細胞は、形状が概略円形となり、そのまま活動を停止し、概略円形の形状を維持するという細胞の特性に基づいた細胞生死判定処理手順を例示する。

まず、細胞領域Ｒ_t,mの属する時刻ｔのフレームから所定のＮ_F1フレーム前まで１フレームずつ経時的に遡り、異なる時点で撮影されたそれぞれのフレーム中の細胞領域Ｒ_t,mの円形度Ｃを細胞パラメータとして取得し、取得した円形度Ｃを所定の閾値Ｖ_Cと比較し、閾値Ｖ_Cを超えているか否かを判定する処理をフレーム毎に繰り返し行う（ステップＳ７１１〜Ｓ７１４）。ここに、円形度Ｃは、細胞領域Ｒ_t,mの面積をＡ、輪郭の長さ（周囲長）をＬとした場合、Ｃ＝４πＡ／Ｌ² で定義され、細胞形状が丸くなった程度を判定する尺度として利用する。

そして、時刻ｔのフレームからＮ_F1フレーム前までの複数のフレーム中、所定の閾値Ｐ₁₁％以上のフレームで、円形度Ｃが閾値Ｖ_Cより大きいかを判定する（ステップＳ７１５）。閾値Ｐ₁₁％以上のフレームで円形度Ｃが閾値Ｖ_Cより大きい場合には（ステップＳ７１５：Ｙｅｓ）、細胞領域Ｒ_t,mの属する時刻ｔのフレームから所定のＮ_F1フレーム前まで１フレームずつ経時的に遡り、そのフレーム期間での細胞領域Ｒ_t,mの経時的な対応付けの結果を取得し、１対１の対応であるかの判定をフレーム毎に繰り返し行う（ステップＳ７１６〜Ｓ７１９）。このフレーム期間内で所定の閾値Ｐ₁₂％以上のフレームで対応付けが１対１であった場合には（ステップＳ７２０：Ｙｅｓ）、この細胞領域Ｒ_t,mに関して細胞死と判定する（ステップＳ７２１）。経時的に同一とみなせる細胞領域が細胞死により丸くなった状態を維持していると認定できるためである。

一方、円形度Ｃが閾値Ｖ_Cより大きいフレーム数が所定の閾値Ｐ₁₁％を下回る場合には（ステップＳ７１５：Ｎｏ）、この細胞領域Ｒ_t,mに関して細胞死ではないと判定する（ステップＳ７２２）。これは、細胞死を起こした細胞は概略円形となった形状を継続するという特性が認められないためである。ここで、所定の閾値Ｐ₁₁％としては１００％に設定し、全てのフレームで円形度Ｃが閾値Ｖ_Cより大きくない場合に細胞死ではないと判定するようにしてもよいが、１００％は必ずしも要求されず、１００％未満に設定された閾値Ｐ₁₁により規定される割合を下回った場合に細胞死ではないと判定するようにしてもよい。フレームによっては、細胞パラメータ、ここでは円形度の取得が適正でない場合もあり得るからである。これにより、細胞死の誤検出を抑制することが可能となる。

また、Ｎ_F1フレーム前まで遡ったフレーム期間内で所定の閾値Ｐ₁₂％以上のフレームで対応付けが１対１でなかった場合（ステップＳ７２０：Ｎｏ）、この細胞領域Ｒ_t,mに関して細胞死ではないと判定する（ステップＳ７２２）。細胞形状が概略円形となる状態は、細胞死の場合だけでなく、平均的な細胞周期における分裂期（Ｍ期）でも観察されるが、分裂期の場合には、その直後に細胞分裂が起きるため、経時的な細胞領域の対応付けが１対複数となり、対応付けが１対１のフレーム数が所定の閾値Ｐ₁₂％を下回り、１つの細胞領域に対して複数の細胞領域が対応付けられているフレーム数が多くなることで細胞死と区別して判定することができる。このためにも、経時的な時間に相当するフレーム数を規定するＮ_F1は、Ｎ_F1フレーム前まで遡る撮像期間が観察対象とする細胞の平均的な細胞周期における分裂期よりも長くなるような値に設定することが望ましい。所定の閾値Ｐ₁₂％に関しても、閾値Ｐ₁₁％の場合と同様、１００％であってもよいが、１００％であることは必ずしも要求されない。

図１６は、細胞生死判定処理の第２の処理手順を示す概略フローチャートである。図１６に示す概略フローチャートは、第１の処理手順と同様、培養中に物理的な損傷を受けずに細胞死を起こした細胞は、形状が概略円形となり、そのまま活動を停止し、概略円形の形状を維持するという細胞の特性に基づいた細胞生死判定処理手順を例示する。

まず、細胞領域Ｒ_t,mの属する時刻ｔのフレームから所定のＮ_F2フレーム前まで１フレームずつ経時的に遡り、異なる時点で撮影されたそれぞれのフレーム中の細胞領域Ｒ_t,mの円形度Ｃを細胞パラメータとして取得し、取得した円形度Ｃを所定の閾値Ｖ_Cと比較し、閾値Ｖ_Cを超えているか否かを判定する処理をフレーム毎に繰り返し行う（ステップＳ７３１〜Ｓ７３４）。ここに、円形度Ｃは、第１の処理手順で定義した通りである。時刻ｔのフレームからＮ_F2フレーム前までの複数のフレーム中、所定の閾値Ｐ₂％以上のフレームで、円形度Ｃが閾値Ｖ_Cより大きい場合には（ステップＳ７３５：Ｙｅｓ）、この細胞領域Ｒ_t,mに関して細胞死と判定する（ステップＳ７３６）。該細胞領域が細胞死により丸くなった状態を維持していると認定できるためである。

一方、円形度Ｃが閾値Ｖ_Cより大きいフレーム数が所定の閾値Ｐ₂％を下回る場合には（ステップＳ７３５：Ｎｏ）、この細胞領域Ｒ_t,mに関して細胞死ではないと判定する（ステップＳ７３７）。これは、細胞死を起こした細胞は概略円形となった形状を継続するという特性が認められないためである。すなわち、細胞形状が概略円形となる状態は、細胞死の場合だけでなく、平均的な細胞周期における分裂期（Ｍ期）でも観察されるが、細胞分裂の場合には、その細胞分裂後の細胞の活動に応じて細胞形状が変化し、概略円形となった形状を維持しないので、細胞死と区別して判定することができる。このためにも、経時的な時間に相当するフレーム数を規定するＮ_F2は、Ｎ_F2フレーム前まで遡る撮像期間が観察対象とする細胞の平均的な細胞周期における分裂期よりも長くなるような値に設定することが望ましい。所定の閾値Ｐ₂％に関しても、閾値Ｐ₁₁％の場合と同様、１００％であってもよいが、１００％であることは必ずしも要求されない。

図１７は、細胞生死判定処理の第３の処理手順を示す概略フローチャートである。図１７に示す概略フローチャートは、細胞死を起こした細胞のうち、特に培養液Ａ中に浮遊している死細胞を検出するためのものである。細胞死を起こしスライドガラス１０２から剥離した細胞は、前述の処理手順の場合と同様に形状が概略円形となることに加え、撮像の合焦位置（スライドガラス１０２面）から手前側に外れるため、ぼやけ気味の画像となり、輪郭部でのエッジ強度が低下するという特性に基づいた細胞生死判定処理手順を例示する。すなわち、円形度という形状特性に代えて、スライドガラス１０２面に対する細胞位置（焦点深度）をエッジ強度という細胞パラメータを用いて、総合的に判断することにより、細胞死による細胞の剥離を検出するものである。

まず、細胞領域Ｒ_t,mの属する時刻ｔのフレーム画像を取得し、前述のエッジ保存型ローパスフィルタの出力結果に一般的なエッジ抽出フィルタ、例えばSobelフィルタを適用してエッジ画像を得る（ステップＳ７４１，Ｓ７４２）。そして、時刻ｔのフレームに属する細胞領域Ｒ_t,mに対して任意の隣接する細胞領域間の境界を考えて、隣接する任意の２つの細胞領域を選択し（ステップＳ７４３）、式(６)で定義されるエッジ強度Ｅを細胞パラメータとして求め、このエッジ強度Ｅが所定の閾値Ｖ_Eを超えているかを判定する（ステップＳ７４４）。

ここで、Ｅ(Ｐ)は、エッジ画像における画素Ｐの輝度値、Σは、細胞領域間の輪郭上の全画素について総和を求めることを表す。

同様に、細胞領域Ｒ_t,mの円形度Ｃを取得し、所定の閾値Ｖ_C2を超えているかを判定する（ステップＳ７４５）。次に、細胞領域Ｒ_t,mの円形度Ｃが所定の閾値Ｖ_C2より大きく、かつ、エッジ強度Ｅが所定の閾値Ｖ_Eより小さい場合、細胞死擬陽性と判定する（ステップＳ７４６）。このような細胞死擬陽性の判定処理を、目的とする細胞領域Ｒ_t,mの属する時刻ｔのフレームから、所定のＮ_F3フレーム前まで経時的に遡りながら、フレーム毎に繰り返し行う（ステップＳ７４７，Ｓ７４８，Ｓ７４２〜Ｓ７４６）。そして、所定の閾値Ｐ₃％以上のフレームで細胞死擬陽性と判定された場合には（ステップＳ７４９：Ｙｅｓ）、細胞死であると判定する（ステップＳ７５０）。一方、細胞死擬陽性と判定されたフレーム数が所定の閾値Ｐ₃％を下回る場合には（ステップＳ７４９：Ｎｏ）、細胞死ではないと判定する（ステップＳ７５１）。

なお、第３の処理手順の場合も、経時的な時間に相当するフレーム数を規定するＮ_F3は、Ｎ_F3フレーム前まで遡る撮像期間が観察対象とする細胞の平均的な細胞周期における分裂期よりも長くなるような値に設定することが望ましい。所定の閾値Ｐ₃％に関しても、閾値Ｐ₁₁％等の場合と同様、１００％であってもよいが、１００％であることは必ずしも要求されない。

図１８は、細胞生死判定処理の第４の処理手順を示す概略フローチャートである。図１８に示す概略フローチャートは、培養中に物理的な損傷を受けずに細胞死を起こした細胞は、丸くなる際に細胞膜の表面張力によって収縮し、そのまま活動を停止するという細胞の特性に基づいた細胞生死判定処理手順を例示する。ここで、丸くなる際に収縮により見掛け上の面積が減少し、その結果、平均輝度が生細胞の場合よりも上昇することから、表面張力によって収縮するという事象を平均輝度で判断するものである。

まず、細胞領域Ｒ_t,mの属する時刻ｔのフレームから所定のＮ_F2フレーム前まで１フレームずつ経時的に遡り、異なる時点で撮影されたそれぞれのフレーム中の細胞領域Ｒ_t,mの平均輝度(／Ｍ)を細胞パラメータとして取得し、取得した平均輝度(／Ｍ)を所定の閾値Ｖ_Mと比較し、閾値Ｖ_Mを超えているか否かを判定する処理をフレーム毎に繰り返し行う（ステップＳ７６１〜Ｓ７６４）。時刻ｔのフレームからＮ_F4フレーム前までの複数のフレーム中、所定の閾値Ｐ₄％以上のフレームで、平均輝度(／Ｍ)が閾値Ｖ_Mより大きい場合には（ステップＳ７６５：Ｙｅｓ）、この細胞領域Ｒ_t,mに関して細胞死と判定する（ステップＳ７６６）。該細胞領域が細胞死により丸くなり輝度的に明るい状態を維持していると認定できるためである。

一方、平均輝度(／Ｍ)が閾値Ｖ_Mより大きいフレーム数が所定の閾値Ｐ₄％を下回る場合には（ステップＳ７６５：Ｎｏ）、この細胞領域Ｒ_t,mに関して細胞死ではないと判定する（ステップＳ７６７）。これは、細胞死を起こした細胞は丸くなり輝度的に明るい状態を継続するという特性が認められないためである。すなわち、細胞の輝度が一時的に上昇する現象は、細胞死の場合だけでなく、平均的な細胞周期における分裂期（Ｍ期）でも観察されるが、細胞分裂の場合には、その細胞分裂後の細胞の活動に応じてその輝度が低下し、輝度的に明るい状態を維持しないので、細胞死と区別して判定することができる。このためにも、経時的な時間に相当するフレーム数を規定するＮ_F4は、Ｎ_F4フレーム前まで遡る撮像期間が観察対象とする細胞の平均的な細胞周期における分裂期よりも長くなるような値に設定することが望ましい。所定の閾値Ｐ₄％に関しても、閾値Ｐ₁₁％等の場合と同様、１００％であってもよいが、１００％であることは必ずしも要求されない。

図１９は、細胞生死判定処理の第５の処理手順を示す概略フローチャートである。図１９に示す概略フローチャートは、細胞死を起こした細胞のうち、特に培養液Ａ中に浮遊している死細胞を検出するためのものである。細胞死を起こしスライドガラス１０２から剥離した細胞は、前述の処理手順３の場合と同様に、撮像の合焦位置（スライドガラス１０２面）から手前側に外れるため、輝度が増大して観察されるとともに、ぼやけ気味の画像となり輪郭部でのエッジ強度が低下するという特性に基づいた細胞生死判定処理手順を例示する。

まず、細胞領域Ｒ_t,mの属する時刻ｔのフレーム画像を取得し、前述のエッジ保存型ローパスフィルタの出力結果に一般的なエッジ抽出フィルタ、例えばSobelフィルタを適用してエッジ画像を得る（ステップＳ７７１，Ｓ７７２）。そして、時刻ｔのフレームに属する細胞領域Ｒ_t,mに対して任意の隣接する細胞領域間の境界を考えて、隣接する任意の２つの細胞領域を選択し（ステップＳ７７３）、前述の式(６)で定義されるエッジ強度Ｅを細胞パラメータとして求め、このエッジ強度Ｅが所定の閾値Ｖ_Eを超えているかを判定する（ステップＳ７７４）。

同様に、細胞領域Ｒ_t,mの平均輝度(／Ｍ)を取得し、所定の閾値Ｖ_M2を超えているかを判定する（ステップＳ７７５）。次に、細胞領域Ｒ_t,mの平均輝度(／Ｍ)が所定の閾値Ｖ_M2より大きく、かつ、エッジ強度Ｅが所定の閾値Ｖ_Eより小さい場合、細胞死擬陽性と判定する（ステップＳ７７６）。このような細胞死擬陽性の判定処理を、目的とする細胞領域Ｒ_t,mの属する時刻ｔのフレームから、所定のＮ_F5フレーム前まで経時的に遡りながら、フレーム毎に繰り返し行う（ステップＳ７７７，Ｓ７７８，Ｓ７７２〜Ｓ７７６）。そして、所定の閾値Ｐ₅％以上のフレームで細胞死擬陽性と判定された場合には（ステップＳ７７９：Ｙｅｓ）、細胞死であると判定する（ステップＳ７８０）。一方、細胞死擬陽性と判定されたフレーム数が所定の閾値Ｐ₅％を下回る場合には（ステップＳ７７９：Ｎｏ）、細胞死ではないと判定する（ステップＳ７８１）。

なお、第５の処理手順の場合も、経時的な時間に相当するフレーム数を規定するＮ_F5は、Ｎ_F5フレーム前まで遡る撮像期間が観察対象とする細胞の平均的な細胞周期における分裂期よりも長くなるような値に設定することが望ましい。所定の閾値Ｐ₅％に関しても、閾値Ｐ₁₁％等の場合と同様、１００％であってもよいが、１００％であることは必ずしも要求されない。

細胞生死判定処理の第１〜第５の処理手順において、細胞死ではないと判定された細胞は生きているものと結論付ける。

細胞の生死を判定する際には、これらの第１〜第５の処理手順のいずれを用いてもよい。さらには、複数の手順を実行して判定結果を組合せてよく、この場合には、さらに精度の高い判定が可能となる。

本実施の形態の細胞生死判定によれば、各細胞について細胞死であるか否かを判定できるので、生細胞と死細胞との数を正確に把握でき、培養中の細胞に関して、細胞の生存率を正確に求めることができる。さらには、各細胞について経時的に細胞パラメータを計測しながら細胞生死の判定を行っているので、長期培養中の細胞に関して、どのような過程を経て細胞死に至ったかをデータ上で正確に再現することができる。このような判定のために、特殊な染料や特殊な遺伝子導入を要せず、培養中の細胞に与えるダメージを最小限に抑えながら、細胞の生死を精度よく判定することができる。

最後に、図９の処理に戻り、ステップＳ８の処理として、細胞パラメータ表示手段としての表示部３０４にて、認識した細胞領域と計測した細胞パラメータを表示する。図２０は、処理結果の表示の一例を示す説明図である。表示部３０４が備える表示画面３１４は、２つの表示領域３１４ａ，３１４ｂを有し、表示領域３１４ａには、処理対象時点において認識された個々の細胞領域が表示される。ここで、細胞領域にはラベリング処理を適用し、領域毎に識別可能な色、輝度、線種、パターンを与え、例えばラベル画像ａ〜ｅとして表示する。ラベル画像と同じ表示範囲の赤外光画像或いは蛍光画像を連動して表示させても良いし、ラベル画像、赤外光画像、蛍光画像のうち複数を重ね合わせて表示しても良い。或いは、スーパーインポーズ表示を行っても良い。計測した細胞パラメータは、表示領域３１４ｂにおいて、時間を横軸、パラメータ値を縦軸とした折れ線チャートとして表示する。

さらに、操作者による入力部３０３中のマウス操作等に応じて両者の表示内容を同期して強調表示すれば、表示内容の視認性が向上する。図２１は、例えばラベル画像ｃを強調表示の指示対象として選択指定した場合に対応する細胞パラメータの折れ線チャートも強調表示される一例を示す説明図である。この場合、操作者が片方を選択強調した場合、対応する他方も同期して強調表示する。この際、細胞死と判定された細胞は、視覚的に識別可能な強調表示を行う。例えば、色、輝度、形状、パターンの異なる図形や文字を付与する、点滅させる、等であってもよい。或いは、表示から除外してもよく、これらの表示を切り替えてもよい。

本実施の形態では、生細胞Ｃに蛍光タンパクを導入し観察しているが、蛍光タンパクに代えて発光遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子を導入すれば、蛍光画像に代えて発光画像が撮像できる。この場合、励起光照明部２０３及びダイクロイックミラー２０４は不要であり、構成を簡略化できる。発光画像は、細胞光撮像手段としての蛍光撮像部２０７によって撮像される。発光画像に対しては、蛍光画像と同じ手順で処理を行えば良い。このように、例えば細胞が自発光する場合や蛍光を発する場合など、細胞が赤外光以外の光を発する場合でも細胞画像データを取得して細胞観察を行うことができる。

また、本実施の形態では、細胞内に局在せずに発現する蛍光タンパクを使用しているが、細胞核、細胞質、核膜、細胞膜、或いはオルガネラに局在して発現する蛍光タンパクであっても構わない。

なお、パラメータ計測部３０７において計測する細胞パラメータは、本実施の形態に例示したものに限定されず、さらに、面積、周囲長、外接矩形位置、Ｘ方向フェレ径、Ｙ方向フェレ径、最小フェレ径、最大フェレ径、平均フェレ径、凸周囲長、円形度（真円度）、孔の数、ラフネス（凸周囲長と周囲長の比）、オイラー数、長さ、幅、扁平度、輝度の総和、最小輝度、最大輝度、平均輝度、輝度の標準偏差、輝度の分散、エントロピー、重心位置、２次モーメント、主軸方向、のいずれか或いは複数であっても良い。

さらに、パラメータ計測部３０７は、任意の複数の細胞からなるグループに対して、細胞数、最小細胞間距離、最大細胞間距離、平均細胞間距離、細胞間距離の標準偏差、細胞間距離の分散、並びに個々の細胞に対して計測した各パラメータの最小値、最大値、平均値、標準偏差、分差、総和、中間値、のいずれか或いは複数を求めても良い。

以上、本実施の形態によれば、蛍光物質によって標識された複数の生細胞を経時的に撮像し、個々の細胞を認識し、経時的な位置変化を追尾しつつ、細胞に与えるダメージを最小限に抑え、特殊な染料や特殊な遺伝子導入を用いずに、細胞の生死を精度よく判定する装置を実現できる。

本発明は、上述した実施の形態に限らず、本発明の趣旨を逸脱しない範囲であれば、種々の変形が可能である。例えば、前述の細胞認識部３０６、パラメータ計測部３０７、細胞追跡部３０８、細胞生死判定部３１３等の各部による処理手順は、あらかじめ用意された細胞観察プログラムを制御部３０１などのマイクロコンピュータで実行することにより実現するようにしてもよい。この細胞観察プログラムは、インターネットなどのネットワークを介して配布することもできる。また、この細胞観察プログラムは、ハードディスク、ＦＤ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＤＶＤなどのマイクロコンピュータで読み取り可能な記録媒体に記録され、マイクロコンピュータによって記録媒体から読み出されることにより実行することもできる。

本発明の実施の形態に係る細胞観察装置の構成例を示す概略ブロック図である。 培養部の構成例を示す水平断面図である。 培養部の構成例を示す縦断正面図である。 整流板の構成例を示す斜視図である。 培養部側と撮像部側との境界部分の断熱構成例を示す断面図である。 蛍光撮像された培養中の細胞画像の一例を示す説明図である。 複数の視野（視野１〜Ｎ）による撮像の様子を示す説明図である。 各視野１〜Ｎの撮像タイミング例を示す説明図である。 画像データ処理例を示す概略フローチャートである。 先鋭化フィルタによる重み付け例を示す図である。 領域統合の第１の手法例を示す概略フローチャートである。 領域統合の第２の手法例を示す概略フローチャートである。 記録部に記録された細胞パラメータの計測結果例を示す説明図である。 ｍとｎの可能な組み合わせについて評価値を計算した結果を示す説明図である。 細胞生死定処理の第１の処理手順を示す概略フローチャートである。 細胞生死定処理の第２の処理手順を示す概略フローチャートである。 細胞生死定処理の第３の処理手順を示す概略フローチャートである。 細胞生死定処理の第４の処理手順を示す概略フローチャートである。 細胞生死定処理の第５の処理手順を示す概略フローチャートである。 処理結果の表示の一例を示す説明図である。 強調表示の一例を示す説明図である。

符号の説明

１０１ 培養部
２０１ 撮像部
３０６ 細胞認識部
３０７ パラメータ計測部
３０８ 細胞追跡部
３１３ 細胞生死判定部

Claims (22)

1. 複数の時点で細胞を撮影して得られたそれぞれの画像の細胞画像データから細胞を示す細胞領域を認識する細胞認識手段と、
   該細胞認識手段で認識した前記細胞領域の特徴を示す細胞パラメータを計測する細胞パラメータ計測手段と、
   該細胞パラメータ計測手段で計測した前記細胞パラメータと閾値とを比較して前記細胞の生死を判定する細胞生死判定手段と、
   を備えたことを特徴とする細胞観察装置。
2. 異なる時点で撮影されたそれぞれの画像の前記細胞画像データから認識された細胞領域同士の対応付けを行う細胞追跡手段をさらに備え、
   前記細胞生死判定手段は、前記細胞追跡手段で対応付けられたそれぞれの細胞領域について前記細胞パラメータと前記閾値との比較を繰り返し行うことで前記細胞の生死を判定することを特徴とする請求項１に記載の細胞観察装置。
3. 前記細胞生死判定手段は、繰り返し行った比較の結果として同一の結論となる割合が所定の割合を下回る場合には前記細胞追跡手段で対応付けられた前記細胞領域で示される前記細胞が死滅していないと判定することを特徴とする請求項２に記載の細胞観察装置。
4. 前記細胞生死判定手段は、前記細胞追跡手段で１つの前記細胞領域に対して複数の前記細胞領域が対応付けられているときには該１つの前記細胞領域で示される前記細胞が死滅していないと判定することを特徴とする請求項２又は３に記載の細胞観察装置。
5. 前記細胞生死判定手段は、観察対象となる前記細胞の平均的な細胞周期における分裂期より長くなるように設定された撮影期間に渡る複数の時点のそれぞれの前記細胞領域から計測された前記細胞パラメータと前記閾値との比較を繰り返し行うことで前記細胞の生死を判定することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載の細胞観察装置。
6. 前記細胞パラメータは、少なくとも前記細胞領域の円形度を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１つに記載の細胞観察装置。
7. 前記細胞パラメータは、少なくとも前記細胞領域の平均輝度を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１つに記載の細胞観察装置。
8. 前記細胞パラメータは、少なくとも前記細胞領域のエッジ強度を含むことを特徴とする請求項６又は７に記載の細胞観察装置。
9. 細胞を培養する培養手段をさらに備えたことを特徴とする請求項１〜８のいずれか１つに記載の細胞観察装置。
10. 前記細胞は、蛍光タンパクを導入した細胞であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１つに記載の細胞観察装置。
11. 前記細胞は、局在化せずに発現する蛍光タンパクを導入した細胞であることを特徴とする請求項１０に記載の細胞観察装置。
12. 複数の時点で細胞を撮影した画像を取得する撮像手段をさらに備えたことを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１つに記載の細胞観察装置。
13. 細胞観察装置で細胞の観察を行う細胞観察プログラムであって、
    前記細胞観察装置に、
    複数の時点で細胞を撮影して得られたそれぞれの画像の細胞画像データから細胞を示す細胞領域を認識する細胞認識ステップと、
    該細胞認識ステップで認識した前記細胞領域の特徴を示す細胞パラメータを計測する細胞パラメータ計測ステップと、
    該細胞パラメータ計測ステップで計測した前記細胞パラメータと閾値とを比較して前記細胞の生死を判定する細胞生死判定ステップと、
    を実行させることを特徴とする細胞観察プログラム。
14. 異なる時点で撮影されたそれぞれの画像の前記細胞画像データから認識された細胞領域同士の対応付けを行う細胞追跡ステップをさらに含み、
    前記細胞生死判定ステップは、前記細胞追跡ステップで対応付けられたそれぞれの細胞領域について前記細胞パラメータと前記閾値との比較を繰り返し行うことで前記細胞の生死を判定することを特徴とする請求項１３に記載の細胞観察プログラム。
15. 前記細胞生死判定ステップは、繰り返し行った比較の結果として同一の結論となる割合が所定の割合を下回る場合には前記細胞追跡ステップで対応付けられた前記細胞領域で示される前記細胞が死滅していないと判定することを特徴とする請求項１４に記載の細胞観察プログラム。
16. 前記細胞生死判定ステップは、前記細胞追跡ステップで１つの前記細胞領域に対して複数の前記細胞領域が対応付けられているときには該１つの前記細胞領域で示される前記細胞が死滅していないと判定することを特徴とする請求項１４又は１５に記載の細胞観察プログラム。
17. 前記細胞生死判定ステップは、観察対象となる前記細胞の平均的な細胞周期における分裂期より長くなるように設定された撮影期間に渡る複数の時点のそれぞれの前記細胞領域から計測された前記細胞パラメータと前記閾値との比較を繰り返し行うことで前記細胞の生死を判定することを特徴とする請求項１３〜１６のいずれか１つに記載の細胞観察プログラム。
18. 前記細胞パラメータは、少なくとも前記細胞領域の円形度を含むことを特徴とする請求項１３〜１７のいずれか１つに記載の細胞観察プログラム。
19. 前記細胞パラメータは、少なくとも前記細胞領域の平均輝度を含むことを特徴とする請求項１３〜１７のいずれか１つに記載の細胞観察プログラム。
20. 前記細胞パラメータは、少なくとも前記細胞領域のエッジ強度を含むことを特徴とする請求項１８又は１９に記載の細胞観察プログラム。
21. 細胞を培養する培養手段と、該培養手段に収容されている細胞を撮影する撮像手段とを備えた細胞観察装置で細胞の観察を行う細胞観察方法であって、
    前記培養手段で培養している最中の細胞を前記撮像手段によって複数の時点で撮影して得られたそれぞれの画像の細胞画像データから細胞を示す細胞領域を認識する細胞認識工程と、
    該細胞認識工程で認識した前記細胞領域の特徴を示す細胞パラメータを計測する細胞パラメータ計測工程と、
    該細胞パラメータ計測工程で計測した前記細胞パラメータと閾値とを比較して前記細胞の生死を判定する細胞生死判定工程と、
    を備えたことを特徴とする細胞観察方法。
22. 異なる時点で撮影されたそれぞれの画像の前記細胞画像データから認識された細胞領域同士の対応付けを行う細胞追跡工程をさらに含み、
    前記細胞生死判定工程は、前記細胞追跡工程で対応付けられたそれぞれの細胞領域について前記細胞パラメータと前記閾値との比較を繰り返し行うことで前記細胞の生死を判定することを特徴とする請求項２１に記載の細胞観察方法。

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