WO2016203617A1 - 発光観察方法 - Google Patents

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    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour

Definitions

  • the present invention relates to a light emission observation method.
  • the photoprotein catalyzes a chemical reaction in which luminescence occurs.
  • Photoproteins are often used for quantitative experiments. For example, it is possible to place a photoprotein gene downstream of a certain promoter and measure the activity of this promoter, that is, the level of expression of this gene, as the amount of luminescence generated from the photoprotein.
  • the cell response to the drug A can be observed as a red light emission channel
  • the light emission response to the drug B can be observed as a green light emission channel. In this case, it is necessary to separate and quantify the luminescent component with high efficiency and accuracy.
  • the light transmittance of each of the N light-emitting components is utilized by using a high-transmittance filter with a wide transmission wavelength band of N ⁇ 1 sheets.
  • a method that uses a determinant to calculate the total light amount of all components.
  • the filter transmittance is calculated in advance using a solution prior to the observation of the cells and used as a constant.
  • Kwon H, et al. (2010) “Bioluminescence imaging of dual gene expression at the single-cell level”, BioTechniques, 48 (6): 460-462 uses a dichroic mirror to separate the two colors of light emission. Simultaneously, and a method for calculating the light emission intensity of each component using a determinant is disclosed.
  • the transmittance is calculated by expressing green and red luciferases in NIH3T3 cells and used as a constant.
  • FIG. 6 shows the temperature difference of the emission spectrum exhibited by the recombinant protein.
  • the filter permeability of the signal emitted by each photoprotein is used in advance as a constant.
  • this requires the premise that the emission spectrum does not change during observation. If the emission spectrum changes during observation (including the following two conditions), this constant must be obtained for each frame.
  • the present invention (1) Observation using two or more photoproteins including photoproteins whose emission spectra change due to external factors, (2) When a luminescent signal emitted from an observation target (for example, a cell) is emitted from two or more photoproteins, An object of the present invention is to provide a method for observing luminescence that is highly quantitative regardless of external factors.
  • a biological sample including an observation cell that expresses the gene of the first photoprotein in a viable state, and the observation in one field when the observation cell is photographed
  • a plurality of wavelength band images are obtained by causing a luminescence reaction in the image, and capturing light emitted from the observation cell and the reference material in different wavelength bands, respectively.
  • Quantifying the amount of luminescence from the observed cells and the amount of luminescence from the reference material calculating a correction constant using the quantified amount of luminescence from the reference material, and performing the quantification.
  • the amount of light emitted from the observation cell, light emission observation method comprising: a correcting using the correction constant is provided.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating an outline of an example of a light emission observation method according to an embodiment.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing an example of observation cells and index cells in one observation field.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating an outline of a configuration example of a system for performing light emission observation according to an embodiment.
  • FIG. 4 is a diagram schematically showing another example of observation cells and index cells in one observation field.
  • FIG. 5 is a diagram schematically showing still another example of observation cells and index cells in one observation field.
  • FIG. 6 is a diagram showing an emission spectrum at each temperature.
  • This embodiment relates to a method for observing luminescence of a biological sample.
  • the present invention relates to a cell arrangement and a method for correcting color separation in single cell imaging using a photoprotein whose luminescent color changes depending on external environmental factors (for example, temperature).
  • luminescence imaging it is possible to simultaneously acquire a plurality of signals indicated by cells such as clock gene rhythm and response to drugs as luminescence amounts indicated by luminescent proteins having different emission colors.
  • the cell response to the drug A is observed as a red light emission channel (hereinafter abbreviated as “ch”)
  • the light emission response to the drug B is observed as a green light emission ch.
  • the photoluminescence color of the photoprotein exhibiting a certain emission wavelength varies depending on external factors and affects other emission wavelengths ch.
  • a reference object for example, an indicator cell is placed in the same field of view as the observation cell to be observed, and the spectrum change due to the temperature change is observed. The effect of crosstalk on channels other than “observation ch” is corrected.
  • a biological sample including an observation cell that expresses the gene for the first photoprotein is maintained in a viable state (step S1).
  • the observation cell is a cell to be observed.
  • the types of observation cells may be any types such as animal cells, plant cells, and microbial cells.
  • the observation cell may be a cultured cell, one of cells contained in a tissue, or one of cells contained in an individual.
  • the observation cell is obtained, for example, by introducing a recombinant gene in which the gene of the first photoprotein is arranged downstream of the expression control region of the gene whose expression state is to be examined. By doing so, the gene of the first photoprotein is expressed in the same pattern as the expression pattern of the original gene by the action of the expression control region for the original gene.
  • the photoprotein means an enzyme that catalyzes a chemical reaction in which luminescence occurs.
  • the photoprotein may be a photoprotein having a characteristic that when the luminescence reaction is catalyzed in the presence of a sufficient amount of a substrate, the amount of luminescence varies with time. Such fluctuation is, for example, a decrease in light emission amount. In such a photoprotein, although the substrate is sufficiently present, the amount of luminescence decreases with the passage of time. Such fluctuation is, for example, an increase in light emission amount.
  • Firefly luciferase uses firefly luciferin as a luminescent substrate.
  • Another example of such a photoprotein is luciferase derived from marine organisms using a compound having an imidazopyrazine skeleton as a luminescent substrate.
  • Step S2 when the observation cell OC is photographed, a reference object that presents a reference amount of the first photoprotein is prepared so that the observation cell OC enters the single field of view OFV ( Step S2).
  • the reference material is, for example, a cell (hereinafter referred to as an index cell IC).
  • the same amount of the first photoprotein as that of the observation cell OC is expressed. That is, the index cell IC as a reference is a cell different from the observation cell OC.
  • the indicator cell IC may be the same type of cell as the observation cell OC. For example, some cells may be selected as the observation cell OC and the other part as the index cell IC from the same type of cell group.
  • the indicator cell IC serving as a reference may be any one such as animal cells, plant cells, and microbial cells.
  • the indicator cell IC may be a cultured cell, one of cells contained in a tissue, or one of cells contained in an individual.
  • the index cell IC thus prepared is prepared so as to enter with the observation cell OC in one visual field OFV when the observation cell OC is photographed. Specifically, for example, the observation cell OC and the indicator cell IC are mixed and seeded in a ⁇ 35 mm glass bottom dish.
  • the reference object is an index for correcting the emission color
  • it may be a solid such as a well or a particle or a liquid in addition to a cell.
  • the reference substance is a solid, the first photoprotein is immobilized on the surface of the solid.
  • a biological sample including the observation cell OC and the reference object, for example, the indicator cell IC is prepared, next, a predetermined stimulus is given to the observation cell OC and the indicator cell IC.
  • a luminescent substrate corresponding to the protein is administered to the culture solution to cause a luminescent reaction in each of them (step S3).
  • the luminescent substrate can be administered to the culture solution at any timing. For example, it may be administered immediately before the observation cell OC is observed. Or you may administer a luminescent substrate in the step which produces a culture solution.
  • a plurality of wavelength band images are acquired as a plurality of light emission images by photographing light emission emitted from the observation cell OC and the reference object (index cell IC) in different wavelength bands (light emission wavelengths Ch) (steps). S4).
  • the luminescent image is an image obtained by imaging light emitted from the observation cell OC and the reference object (index cell IC).
  • the luminescent image includes, for example, a filter that mainly transmits only light having a specific wavelength corresponding to light emission, an image sensor that converts light into an electric signal, and an image processing unit that generates a luminescent image from the electric signal. It can be obtained using a device.
  • Examples of an apparatus for acquiring a luminescence image are a luminescence microscope, a luminescence imaging system, and the like.
  • Specific examples of the luminescence imaging system include a luminescence imaging system LV200 (manufactured by Olympus Corporation).
  • the luminescence imaging system 1 includes a microscope 10 stored in a light-shielded state in a housing (not shown), a computing device 20 capable of performing various computations such as a personal computer, and computations such as a keyboard and a mouse. And an input unit 30 for inputting a user instruction to the device 20.
  • the microscope 10 is provided with an optical system 11, a light source 12, and an imaging device 13.
  • the optical system 11 includes various lenses and mirrors.
  • the optical system 11 includes a plurality of filters F1 and F2 that can be selectively inserted into the optical path.
  • the plurality of filters F1 and F2 have different transmission wavelengths. However, they do not have to be completely different from each other, provided that they have wavelength bands that do not overlap each other, and the wavelength bands that do not overlap each other correspond to the desired emission wavelength ch.
  • the light source 12 emits arbitrary illumination light (for example, white light) necessary for obtaining a bright field image, and the light emitted from the light source 12 passes through the optical system 11 and the observation cell OC, the reference object,
  • the biological sample 40 including the indicator cell IC is irradiated.
  • the biological sample 40 is preferably housed in a culture chamber so that cells can be maintained viable in a predetermined culture environment.
  • the imaging device 13 includes an imaging device such as a cooled CCD, for example, and generates an image signal related to a microscope image of the biological sample 40 via the optical system 11.
  • the computing device 20 includes an imaging control unit 21, an image acquisition unit 22, a light source control unit 23, an optical system control unit 24, a recording unit 25, and an image analysis unit 26.
  • the imaging control unit 21 controls the operation of the imaging device 13.
  • the image acquisition unit 22 is an image processing unit that acquires an image from the imaging device 13 and performs necessary image processing and the like.
  • the light source control unit 23 controls the operation of the light source 12.
  • the optical system control unit 24 controls the optical system 11. For example, when a bright field image is acquired, the illumination light emitted from the light source 12 is applied to the biological sample 40 via the optical system 11. Further, when a bright field image is acquired, the exposure time is relatively short. On the other hand, when a luminescent image is acquired, the illumination light emitted from the light source 12 is blocked and the biological sample 40 is not illuminated. Further, when a luminescent image is acquired, the exposure time is set to be relatively long.
  • the optical system control unit 24 also controls selective insertion of the plurality of filters F1 and F2 into the optical path when a light emission image is acquired.
  • the recording unit 25 records a bright field image and a wavelength band image that is a light emission image acquired when each absorption filter is inserted.
  • the image analysis unit 26 performs analysis processing such as quantifying the amount of light emitted from the observation cell OC from a plurality of wavelength band images recorded in the recording unit 25.
  • the recording unit 25 also records the analysis result of the image analysis unit 26.
  • the image analysis unit 26 quantifies the light emission amount from the observation cell OC and the light emission amount from the index cell IC, which is a reference object, from a plurality of wavelength band images (step S5). This includes designating a region of interest including a cell whose amount of luminescence should be quantified by the input unit 30 in the bright field image recorded in the recording unit 25. The image analysis unit 26 quantifies the light emission amount in the region corresponding to the region of interest in each wavelength band image recorded in the recording unit 25.
  • the image analysis unit 26 calculates a correction constant using the light emission amount from the index cell IC, which is a quantified reference material (step S6), and uses this correction constant to quantify the light emission amount from the observed cell OC. Is corrected (step S7).
  • the image analysis unit 26 performs correction using crosstalk correction (fluorescence separation) software (PlizMage) of the fluorescent image.
  • This software is software for correcting crosstalk of fluorescent images, it can be corrected by the same operation because the phenomenon is similar to the overlap of emission signals.
  • the light emission amount (corrected light emission amount: GREEN and RED) for each wavelength band (each light emission wavelength ch) is determined by the actual light emission amount (filters F1 and F2) as shown in the following equation (1).
  • the light emission amount obtained from the used wavelength band image: Fgreen and Fred) and the inverse matrix related to the transmittance of the filters F1 and F2 can be calculated.
  • step S6 the value of the inverse matrix related to the transmittances of the filters F1 and F2 is calculated as a correction constant using the light emission amount obtained from the indicator cell IC. That is, conventionally, the inverse matrix related to the filter transmittance, which is a correction constant, has been calculated in advance using a solution or the like prior to cell observation. This requires the premise that the spectrum of the signal emitted from the photoprotein does not change during the measurement. However, when the spectrum changes, if the value of the inverse matrix shown in the equation (1) is a constant, actual measurement conditions and deviation occur. Therefore, in the present embodiment, calculation is performed during cell observation using the index cell IC as a reference.
  • step S7 the light emission amount obtained from the observation cell OC is actually observed light emission amount Fgreen, Fred, and using the calculated correction constant, the light emission amount GREEN, RED can be calculated.
  • step S8 the above steps S4 to S7 are repeated every time a predetermined time has passed (step S9). That is, the time lapse photography for every predetermined time and the calculation of the light emission amount from the observation cell OC are repeated.
  • steps S5 to S7 may be performed collectively for each of a plurality of wavelength band images recorded in the recording unit 25 after the time-lapse shooting is completed.
  • the inverse matrix related to the filter transmittance which is a correction constant, is calculated based on the light emission amount of the reference object during the observation to correct the light emission amount of the observation cell OC. . Therefore, even if the emission spectrum of the observation cell OC changes due to external factors such as temperature and pH, the change can be corrected, and emission observation with high quantitativeness can be performed.
  • an expression vector for the second photoprotein different from the first photoprotein was prepared using the same method as the above method, and the produced nuclear translocation signal attached.
  • the HeLa cell expressing the second photoprotein may be used as an indicator cell IC (second indicator cell IC2) different from the indicator cell IC (first indicator cell IC1) as described above.
  • a necessary element for the indicator cell IC is that a site or a cell where each photoprotein used in the indicator cell IC is expressed can be specified.
  • FIG. 4 shows an example in which two photoproteins are expressed in different cells, but the present invention is not limited to this.
  • the first photoprotein is a nucleus and the second photoprotein is a cytoplasm, if it can be spatially separated in one cell, it can be used as an indicator cell IC. . That is, a plurality of photoproteins may be localized in one indicator cell IC.
  • the number of types of index cells can be reduced by using the cells processed in such a manner that the localization of a plurality of photoproteins is different as the index cell IC as a reference.
  • SYMBOLS 1 Luminous imaging system, 10 ... Microscope, 11 ... Optical system, 12 ... Light source, 13 ... Imaging device, 20 ... Arithmetic device, 21 ... Imaging control part, 22 ... Image acquisition part, 23 ... Light source control part, 24 ... Optical System control unit, 25 ... recording unit, 26 ... image analysis unit, 30 ... input unit, 40 ... biological sample, F1, F2 ... filter, IC, IC1, IC2 ... index cell, OC ... observation cell, OFV ... visual field.

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Abstract

発光観察方法は、第１の発光タンパク質の遺伝子を発現する観察細胞を含む生体試料を生存状態で維持することと、前記観察細胞を撮影した際に１つの視野の中に前記観察細胞と共に入るように、基準量の前記第１の発光タンパク質を提示する基準物を用意することと、前記観察細胞及び前記基準物に対して所定の刺激を与えて、前記観察細胞及び前記基準物において発光反応を生じさせることと、前記観察細胞及び前記基準物から放射される発光を、それぞれ異なる波長帯域で撮影することで、複数の波長帯域画像を取得することと、を含む。発光観察方法は、さらに、前記複数の波長帯域画像から、前記観察細胞からの発光量及び前記基準物からの発光量を定量することと、前記定量した前記基準物からの発光量を用いて補正定数を算出することと、前記定量した前記観察細胞からの発光量を、前記補正定数を用いて補正することと、を含む。

Description

発光観察方法
　本発明は、発光観察方法に関する。
　発光タンパク質は、発光が生じる化学反応を触媒する。発光タンパク質は、しばしば定量的実験に使用される。例えば、あるプロモーターの下流に発光タンパク質遺伝子を配置し、このプロモーターの活性の程度、すなわちこの遺伝子の発現の程度を、発光タンパク質に由来して生じる発光量として測定することが可能となる。
　時計遺伝子のリズムや薬剤に対する応答など、細胞が示す複数のシグナルを発光タンパク質による発光の観察によって捉える場合、発光色の異なる発光タンパク質による発光量として、同時に取得することが可能である。例えば、薬剤Ａに対する細胞応答を赤色発光チャンネル、薬剤Ｂに対する発光応答を緑色発光チャンネルとして観察することができる。この場合、高効率で精度良く発光成分を分離定量することが必要となる。
　そこで、特開２００４－３３３４５７号公報では、Ｎ色の発光成分それぞれ光量を、Ｎ－１枚の透過波長帯域が広い高透過率のフィルターを利用し、各発光成分のフィルター透過率とフィルターを透過する全成分の光量の総和から行列式を利用して求める方法を提案している。ここで、フィルター透過率は、細胞の観察に先立って、溶液を用いて予め算出し、定数として使用している。
　また、Ｋｗｏｎ　Ｈ，　ｅｔ　ａｌ．，　（２０１０）　”Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｍａｇｉｎｇ　ｏｆ　ｄｕａｌ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｔ　ｔｈｅ　ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ　ｌｅｖｅｌ”，　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　４８（６）：　４６０－４６２では、ダイクロックミラーを用いて２色の発光を分離し、デュアルカラーＣＣＤを用いて同時に撮像して、行列式を用いて各成分の発光強度を算出する手法を開示している。ここで、透過率は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞で緑色と赤色のルシフェラーゼを発現させて算出し、定数として使用している。
　しかしながら、酵素学的特性によっては、ある発光波長で発光するはずが外的要因によって発光色が変化してしまい、これが他の発光波長チャンネルへ影響してしまうことが想定される。
　例えば、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ　ｐｙｒａｌｉｓ由来のルシフェラーゼは、温度の変化によって発光スペクトルが変化する。図６は、リコンビナントタンパク質が示す発光スペクトルの温度による違いを示している。
　また、Ｆｒａｇａ　Ｈ，　（２００８）　”Ｆｉｒｅｆｌｙ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：　Ａ　ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ　ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｒｅｃｅｎｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ”，　Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．　Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．　Ｓｃｉ．，　７（２）：　１４６－１５８には、ｐＨの変動によって発光波長が変化するということが報告されている。
　従来の透過率の算出は、算出した透過率を定数として用いている。しかし、温度やｐＨ等の外的要因によって発光スペクトルが変化することがあり、この発光スペクトルの変化によって透過率は変動するため、適切な透過率の算出が課題となっている。
　従来の透過率の算出は、あらかじめ各発光タンパク質が発するシグナルのフィルター透過性を定数として利用している。しかし、これは観察中に発光スペクトルが変化しないという前提が必要であり、観察中に発光スペクトルが変化する場合（以下２つの条件を含む場合）にはフレームごとにこの定数を求める必要がある。
　本発明は、
（１）発光スペクトルが外的要因によって変化する発光タンパク質を含む２つ以上の発光タンパク質を使用した観察、
（２）観察対象（例えば細胞）から同所的に発せられる発光シグナルが２つ以上の発光タンパク質から発せられる場合、
において、外的要因によらず定量性の高い発光観察方法を提供することを目的とする。
　本発明の一態様によれば、第１の発光タンパク質の遺伝子を発現する観察細胞を含む生体試料を生存状態で維持することと、前記観察細胞を撮影した際に１つの視野の中に前記観察細胞と共に入るように、基準量の前記第１の発光タンパク質を提示する基準物を用意することと、前記観察細胞及び前記基準物に対して所定の刺激を与えて、前記観察細胞及び前記基準物において発光反応を生じさせることと、前記観察細胞及び前記基準物から放射される発光を、それぞれ異なる波長帯域で撮影することで、複数の波長帯域画像を取得することと、前記複数の波長帯域画像から、前記観察細胞からの発光量及び前記基準物からの発光量を定量することと、前記定量した前記基準物からの発光量を用いて補正定数を算出することと、前記定量した前記観察細胞からの発光量を、前記補正定数を用いて補正することと、を含む発光観察方法が提供される。
　本発明によれば、外的要因によらず定量性の高い発光観察方法を提供することができる。
図１は、一実施形態に係る発光観察方法の一例の概略を示す図である。 図２は、１つの観察視野中の観察細胞と指標細胞の例を概略的に示す図である。 図３は、一実施形態に係る発光観察を行うためのシステムの構成例の概略を示す図である。 図４は、１つの観察視野中の観察細胞と指標細胞の別の例を概略的に示す図である。 図５は、１つの観察視野中の観察細胞と指標細胞の更に別の例を概略的に示す図である。 図６は、各温度における発光スペクトルを示す図である。
　本発明の一実施形態について図面を参照して説明する。
　本実施形態は、生体試料の発光観察方法に関する。具体的には、外的環境要因（例えば、温度）によって、発光色が変化する発光タンパク質を用いたシングルセルイメージングでの色分離を補正する細胞の配置とその方法に関する。発光イメージングでは、時計遺伝子のリズムや薬剤に対する応答など細胞が示す複数のシグナルを、発光色の異なる発光タンパク質が示す発光量として同時に取得することが可能である。例えば、薬剤Ａに対する細胞応答を赤色発光チャンネル（以下、ｃｈと略記する）、薬剤Ｂに対する発光応答を緑色発光ｃｈとして観察する。しかし、発光タンパク質の酵素学的特性によっては、ある発光波長を示す発光タンパク質の発光色が外的要因によって変化し、他の発光波長ｃｈへ影響を与えることが想定される。本実施形態では、温度感受性発光タンパク質を用いて細胞の薬剤応答を観察する際に、観察対象である観察細胞と同一視野内に基準物、例えば指標細胞を配置し、温度変化に伴うスペクトル変化が「観察用ｃｈ」以外のｃｈに与えるクロストークの影響を補正する。
　以下に上記方法に含まれる各工程に関して、図１を参照して、順に説明する。
　まず、第１の発光タンパク質の遺伝子を発現する観察細胞を含む生体試料を生存状態で維持する（ステップＳ１）。
　観察細胞は、観察の対象となる細胞である。観察細胞の種類は、動物細胞、植物細胞および微生物細胞等、あらゆるものであってよい。また、観察細胞は、培養細胞、組織に含まれる細胞の１つ、または個体に含まれる細胞の１つであってよい。
　観察細胞は、例えば、発現の状態を調べようとする遺伝子の発現制御領域の下流に、第１の発光タンパク質の遺伝子が配置された組み替え遺伝子が導入されることで得られる。こうすることで、第１発光タンパク質の遺伝子は、元の遺伝子のための発現制御領域の作用により、元の遺伝子の発現パターンと同様のパターンで発現することになる。
　なお、発光タンパク質とは、発光が生じる化学反応を触媒する酵素を意味する。発光タンパク質は、十分量の基質の存在下において発光反応を触媒させた場合に、時間の経過に伴い発光量が変動するという特性を有する発光タンパク質であって良い。このような変動とは、例えば、発光量の減少である。このような発光タンパク質では、基質は十分に存在するにもかかわらず、時間の経過に従って発光量が減少する。また、このような変動とは、例えば、発光量の増大である。
　発光量が減少するという特性を示す発光タンパク質の例は、ホタルルシフェラーゼである。ホタルルシフェラーゼは、ホタルルシフェリンを発光基質とする。また、そのような発光タンパク質の別の例は、イミダゾピラジン骨格を有する化合物を発光基質とする、海洋生物等に由来するルシフェラーゼである。
　なお、観察細胞の数は、１つに限らない。
　次に、図２に示すように、観察細胞ＯＣを撮影した際に１つの視野ＯＦＶの中に観察細胞ＯＣと共に入るように、基準量の第１の発光タンパク質を提示する基準物を用意する（ステップＳ２）。
　基準物は、例えば細胞である（以下、指標細胞ＩＣと称する）。この場合、この指標細胞ＩＣ中において、観察細胞ＯＣとは同じ第１の発光タンパク質が一定量発現している。すなわち、基準物としての指標細胞ＩＣは、観察細胞ＯＣとは異なる細胞である。但し、指標細胞ＩＣは、観察細胞ＯＣと同種の細胞であってもよい。例えば、同種の細胞群の中から、一部の細胞を観察細胞ＯＣとし、その他の一部を指標細胞ＩＣとして選択してもよい。基準物となる指標細胞ＩＣは、動物細胞、植物細胞および微生物細胞等、あらゆるものであって良い。また、指標細胞ＩＣは、培養細胞、組織に含まれる細胞の１つ、または個体に含まれる細胞の１つであって良い。
　こうして作製した指標細胞ＩＣを、観察細胞ＯＣを撮影した際に１つの視野ＯＦＶの中に観察細胞ＯＣと共に入るように用意する。具体的には、例えばΦ３５ｍｍガラスボトムディッシュに、観察細胞ＯＣと指標細胞ＩＣを混ぜ合わせて播種する。
　なお、基準物は、発光色を補正するための指標であるため、細胞以外にも、ウェルや粒子といった固体や、液体などでも良い。基準物が固体である場合には、第１の発光タンパク質は、その固体の表面に固定されている。
　こうして、観察細胞ＯＣと基準物、例えば指標細胞ＩＣとを含む生体試料が準備できたならば、次に、観察細胞ＯＣと指標細胞ＩＣに対して所定の刺激を与える、例えば、第１の発光タンパク質に応じた発光基質を培養液に投与して、それぞれにおいて発光反応を生じさせる（ステップＳ３）。発光基質は、任意のタイミングで培養液に投与することができる。例えば、観察細胞ＯＣを観察する直前に投与しても良い。あるいは、培養液を作製する段階において発光基質を投与しても良い。
　そして、観察細胞ＯＣ及び基準物（指標細胞ＩＣ）から放射される発光を、それぞれ異なる波長帯域（発光波長Ｃｈ）で撮影することで、複数の発光画像として複数の波長帯域画像を取得する（ステップＳ４）。
　発光画像とは、観察細胞ＯＣおよび基準物（指標細胞ＩＣ）からの発光を撮像することにより得られる画像である。発光画像は、例えば、発光に応じた特定の波長を有した光のみを主に透過させるフィルターと、光を電気信号に変換する撮像素子と、電気信号から発光画像を作り出す画像処理手段とを含む装置を用いて取得することができる。発光画像を取得するための装置の例は、発光顕微鏡、発光イメージングシステム等である。発光イメージングシステムの具体例は、発光イメージングシステムＬＶ２００（オリンパス株式会社製）を含む。
　このような、発光イメージングシステムの概略を図３に示す。図３に示すように、この発光イメージングシステム１は、図示しないハウジングに遮光状態で格納された顕微鏡１０と、例えばパーソナルコンピュータといった各種演算を行うことができる演算装置２０と、例えばキーボードやマウスといった演算装置２０にユーザによる指示を入力するための入力部３０と、を備える。
　顕微鏡１０には、光学系１１と光源１２と撮像装置１３とが設けられている。光学系１１は、種々のレンズやミラーを含む。また、光学系１１は、選択的に光路に挿入し得る複数のフィルターＦ１，Ｆ２を含む。複数のフィルターＦ１，Ｆ２は、互いに透過波長が異なっている。ただし、完全に異なっている必要は無く、互いに重複しない波長帯域を備え、その重複しない波長帯域が、所望の発光波長ｃｈに対応していれば良い。光源１２は、明視野画像を得るために必要な任意の照明光（例えば白色光）を射出し、この光源１２から射出された光は、光学系１１を介して、観察細胞ＯＣと基準物、例えば指標細胞ＩＣとを含む生体試料４０に照射される。この生体試料４０は、好ましくは所定の培養環境により細胞が生存可能に維持されるよう、培養チャンバ内に収容されている。撮像装置１３は、例えば冷却ＣＣＤ等による撮像素子を含み、光学系１１を介して生体試料４０の顕微鏡画像に係る画像信号を生成する。
　演算装置２０は、撮影制御部２１と、画像取得部２２と、光源制御部２３と、光学系制御部２４と、記録部２５と、画像解析部２６と、を備える。撮影制御部２１は、撮像装置１３の動作を制御する。画像取得部２２は、撮像装置１３から画像を取得し、必要な画像処理等を行う画像処理手段である。
　光源制御部２３は、光源１２の動作を制御する。光学系制御部２４は、光学系１１を制御する。例えば、明視野画像が取得されるときは、光源１２から射出された照明光は、光学系１１を介して生体試料４０に照射される。また、明視野画像が取得されるときは、露光時間は比較的短くされる。一方、発光画像が取得されるときは、光源１２から射出された照明光は遮断され、生体試料４０は照明されない。また、発光画像が取得されるときは、露光時間は比較的長く設定される。光学系制御部２４は、また、発光画像が取得されるときは、複数のフィルターＦ１，Ｆ２の光路への選択的な挿入を制御する。
　記録部２５は、明視野画像と各吸収フィルター挿入時に取得された発光画像である波長帯域画像とを記録する。画像解析部２６は、記録部２５に記録された複数の波長帯域画像から、観察細胞ＯＣからの発光量を定量する等の解析処理を行う。なお、記録部２５は、この画像解析部２６の解析結果も記録する。
　そして、画像解析部２６により、複数の波長帯域画像から、観察細胞ＯＣからの発光量と基準物である指標細胞ＩＣからの発光量とを定量する（ステップＳ５）。これは、記録部２５に記録された明視野画像において、発光量を定量すべき細胞を含む関心領域を入力部３０により指定することを含む。画像解析部２６は、記録部２５に記録された各波長帯域画像における関心領域に対応する領域の発光量を定量する。
　その後、画像解析部２６により、定量した基準物である指標細胞ＩＣからの発光量を用いて補正定数を算出し（ステップＳ６）、この補正定数を用いて、定量した観察細胞ＯＣからの発光量を補正する（ステップＳ７）。
　例えば、画像解析部２６は、蛍光画像のクロストーク補正（蛍光分離）ソフトウェア（ＰｒｉｚＭａｇｅ）を用いて補正を実施する。本ソフトウェアは蛍光画像のクロストークを補正するためのソフトウェアであるが、発光シグナルのオーバーラップと現象が似ているため同様の操作で補正可能である。各波長帯域（各発光波長ｃｈ）単独の発光量（補正後の発光量：ＧＲＥＥＮとＲＥＤ）は、以下の（１）式に示すように、実際に測定される発光量（フィルターＦ１，Ｆ２を用いた波長帯域画像から得られる発光量：ＦｇｒｅｅｎとＦｒｅｄ）と、フィルターＦ１，Ｆ２の透過率に係わる逆行列とから、算出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　そこで、ステップＳ６では、指標細胞ＩＣから得られる発光量を用いて、補正定数として、フィルターＦ１，Ｆ２の透過率に係わる逆行列の値を算出する。すなわち、従来は補正定数であるフィルター透過率に係わる逆行列は、細胞の観察に先立って溶液等を用いて予め算出していた。これは、測定中には発光タンパク質から発せられるシグナルのスペクトルは変化しないという前提が必要になる。しかし、スペクトルが変化する場合には、（１）式に示される逆行列の数値が定数であると、実際の測定条件とズレが生じる。そこで、本実施形態では、基準物である指標細胞ＩＣを用いて細胞の観察中に算出する。
　そして、ステップＳ７において、観察細胞ＯＣから得られる発光量を実際に観察される発光量Ｆｇｒｅｅｎ，Ｆｒｅｄとして、この算出した補正定数を用いて上記（１）式により各波長帯域単独の発光量ＧＲＥＥＮ，ＲＥＤを算出することができる。
　その後、観察終了するまで（ステップＳ８）、所定時間経過する毎に（ステップＳ９）、上記ステップＳ４乃至ステップＳ７の工程を繰り返す。すなわち、所定時間毎のタイムラプス撮影と観察細胞ＯＣからの発光量の算出とを繰り返す。
　なお、ステップＳ５乃至ステップＳ７の工程は、タイムラプス撮影終了後に、記録部２５に記録した各回の複数の波長帯域画像毎に、纏めて実施するようにしても良いことは勿論である。
　本実施形態による蛍光観察方法によれば、観察中に基準物の発光量に基づいて補正定数であるフィルター透過率に係わる逆行列を算出して観察細胞ＯＣの発光量を補正するようにしている。従って、温度やｐＨ等の外的要因によって観察細胞ＯＣの発光スペクトルが変化したとしても、その変化を補正することができ、定量性の高い発光観察が行える。
　なお、多ｃｈでの観察の際には、上記方法と同様の手法を用いて第１の発光タンパク質とは異なる第２の発光タンパク質のための発現ベクターを作製し、作製した核移行シグナル付きの第２の発光タンパク質を発現するＨｅＬａ細胞を、上記のような指標細胞ＩＣ（第１の指標細胞ＩＣ１）とは別の指標細胞ＩＣ（第２の指標細胞ＩＣ２）として用いても良い。
　また、指標細胞ＩＣとして必要な要素は、指標細胞ＩＣで使用している各発光タンパク質が発現している部位または細胞を特定できることである。例えば、図４では、２つの発光タンパク質をそれぞれ違う細胞で遺伝子発現させた例を示しているが、これに限定されるものではない。例えば、図５に示すように、第１の発光タンパク質は核、第２の発光タンパク質は細胞質というように、１つの細胞において空間的に分離できていれば、指標細胞ＩＣとして使用することができる。すなわち、複数の発光タンパク質を１つの指標細胞ＩＣ中に局在させても良い。
　このように複数の発光タンパク質の局在が異なるように加工した細胞を基準物である指標細胞ＩＣとして使用することで、指標細胞の種数を減らすことができる。
　　１…発光イメージングシステム、　１０…顕微鏡、　１１…光学系、　１２…光源、　１３…撮像装置、　２０…演算装置、　２１…撮影制御部、　２２…画像取得部、　２３…光源制御部、　２４…光学系制御部、　２５…記録部、　２６…画像解析部、　３０…入力部、　４０…生体試料、　Ｆ１，Ｆ２…フィルター、　ＩＣ，ＩＣ１，ＩＣ２…指標細胞、　ＯＣ…観察細胞、　ＯＦＶ…視野。
特開２００４－３３３４５７号公報
Ｋｗｏｎ　Ｈ，　ｅｔ　ａｌ．，　（２０１０）　"Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｍａｇｉｎｇ　ｏｆ　ｄｕａｌ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｔ　ｔｈｅ　ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ　ｌｅｖｅｌ"，　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　４８（６）：　４６０－４６２ Ｆｒａｇａ　Ｈ，　（２００８）　"Ｆｉｒｅｆｌｙ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：　Ａ　ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ　ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｒｅｃｅｎｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ"，　Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．　Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．　Ｓｃｉ．，　７（２）：　１４６－１５８ Ｙａｏ　Ｆ，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９８）　"Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ　ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ，　ｔｅｔＲ，　ｒａｔｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｔｅｔＲ－ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｆｕｓｉｏｎ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ"，　Ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｅ　ｔｈｅｒａｐｙ，　９（１３）：　１９３９－１９５０ Ｇｏｓｓｅｎ　Ｍ　＆　Ｂｕｊａｒｄ　Ｈ，　（１９９２）　"Ｔｉｇｈｔ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ"，　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ，　８９（１２）：　５５４７－５５５１

Claims (9)

  1. 　第１の発光タンパク質の遺伝子を発現する観察細胞を含む生体試料を生存状態で維持することと、
    　前記観察細胞を撮影した際に１つの視野の中に前記観察細胞と共に入るように、基準量の前記第１の発光タンパク質を提示する基準物を用意することと、
    　前記観察細胞及び前記基準物に対して所定の刺激を与えて、前記観察細胞及び前記基準物において発光反応を生じさせることと、
    　前記観察細胞及び前記基準物から放射される発光を、それぞれ異なる波長帯域で撮影することで、複数の波長帯域画像を取得することと、
    　前記複数の波長帯域画像から、前記観察細胞からの発光量及び前記基準物からの発光量を定量することと、
    　前記定量した前記基準物からの発光量を用いて補正定数を算出することと、
    　前記定量した前記観察細胞からの発光量を、前記補正定数を用いて補正することと、
    　を含む発光観察方法。
  2. 　前記複数の波長帯域画像を経時的に複数回取得することを更に含み、
    　前記定量することと、前記補正定数を算出することと、前記補正することと、を各回に取得した前記複数の波長帯域画像毎に行う請求項１に記載の発光観察方法。
  3. 　前記基準物は、前記観察細胞とは異なる細胞、液体及び固体の内の１つである請求項１に記載の発光観察方法。
  4. 　前記観察細胞を撮影した際に１つの視野の中に前記観察細胞及び前記基準物と共に入るように、前記第１の発光タンパク質とは異なる第２の発光タンパク質を提示する第２の基準物を用意することを更に含む請求項１に記載の発光観察方法。
  5. 　前記基準物は、前記第１の発光タンパク質を発現する第１の指標細胞であり、
    　前記第２の基準物は、前記第２の発光タンパク質を発現する第２の指標細胞である請求項４に記載の発光観察方法。
  6. 　前記基準物は、前記第１の発光タンパク質に加えて、前記第１の発光タンパク質とは異なる第２の発光タンパク質を提示する請求項１に記載の発光観察方法。
  7. 　前記基準物は、前記第１の発光タンパク質及び前記第２の発光タンパク質の局在が異なるように加工した指標細胞である請求項６に記載の発光観察方法。
  8. 　前記指標細胞は、細胞膜と核とで異なる発光タンパク質が存在するように加工されている請求項７に記載の発光観察方法。
  9. 　前記複数の波長帯域画像を取得することは、互いに透過波長帯域の異なる複数のフィルターを用いて画像を取得することを含み、
    　前記補正定数は、前記複数のフィルターの透過率に係わる請求項１乃至８の何れかに記載の発光観察方法。
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