JPH0538297A - 酵素活性測定方法及び装置 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 微量な試料中の生体物質等に結合した酵素の
活性を、気泡やメニスカスの影響を受けずに精度よく検
出できるようにする。 【構成】 試料の基準物質を混在させ、酵素の作用で変
化する物質の蛍光強度を測定すると共に、酵素の作用を
受けない基準物質の蛍光強度を測定して、これらの二つ
の蛍光強度から、試料中の生体物質の量を定量する。
活性を、気泡やメニスカスの影響を受けずに精度よく検
出できるようにする。 【構成】 試料の基準物質を混在させ、酵素の作用で変
化する物質の蛍光強度を測定すると共に、酵素の作用を
受けない基準物質の蛍光強度を測定して、これらの二つ
の蛍光強度から、試料中の生体物質の量を定量する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、免疫反応等の測定用標
識として用いられた酵素の活性を、その酵素の作用を受
けた物質の蛍光強度を検出することを通じて測定する方
法、及び装置に関するものである。
識として用いられた酵素の活性を、その酵素の作用を受
けた物質の蛍光強度を検出することを通じて測定する方
法、及び装置に関するものである。
【０００２】
【発明の背景と従来技術】従来より、例えば微量の生体
物質を測定する方法として、酵素を標識として用いた酵
素標識免疫測定方法や、酵素標識ＤＮＡハイブリダイゼ
ーション法が知られている。
物質を測定する方法として、酵素を標識として用いた酵
素標識免疫測定方法や、酵素標識ＤＮＡハイブリダイゼ
ーション法が知られている。
【０００３】これらの方法は、免疫反応等により生じた
免疫複合体等に直接的あるいは間接的に標識された酵素
の活性を、基質の変化を検出することで、生体物質の存
在や量の測定を行なうことを原理とした方法であり、例
えば、酵素活性の作用を受けた試料の光吸収係数の変化
を測定する方法、酵素活性の作用を受けた試料の蛍光強
度の変化を測定する方法、酵素活性の作用を受けた試料
の発光強度の変化を測定する方法等が知られている。そ
してこれらのうち後二者の蛍光や発光を利用して酵素活
性を測定する方法は、前者の光吸収による酵素活性を測
定する方法に比べて高感度な測定が可能であり、しかも
短時間で測定が可能という利点がある。なかでも蛍光を
利用する方法は高感度な酵素活性測定法として知られて
いる。
免疫複合体等に直接的あるいは間接的に標識された酵素
の活性を、基質の変化を検出することで、生体物質の存
在や量の測定を行なうことを原理とした方法であり、例
えば、酵素活性の作用を受けた試料の光吸収係数の変化
を測定する方法、酵素活性の作用を受けた試料の蛍光強
度の変化を測定する方法、酵素活性の作用を受けた試料
の発光強度の変化を測定する方法等が知られている。そ
してこれらのうち後二者の蛍光や発光を利用して酵素活
性を測定する方法は、前者の光吸収による酵素活性を測
定する方法に比べて高感度な測定が可能であり、しかも
短時間で測定が可能という利点がある。なかでも蛍光を
利用する方法は高感度な酵素活性測定法として知られて
いる。
【０００４】また、試料の蛍光強度等の変化から生体物
質等を定量測定する場合の検出手法についてもいくつか
の提案があり、例えば酵素反応が開始した後ある時間が
経過した特定のの時点で測定を行ない、その測定値から
酵素活性を求める方法（一点法と称されている）、酵素
反応が進む一連の過程中の前後の二つの時点で測定を行
ないその測定値の差から酵素活性を求める方法（二点法
と称されている）、酵素反応の進行に追従して略連続的
に測定を行ないその連続した測定値の変化率から酵素活
性を求める方法（レート法と称されている）などが知ら
れている。
質等を定量測定する場合の検出手法についてもいくつか
の提案があり、例えば酵素反応が開始した後ある時間が
経過した特定のの時点で測定を行ない、その測定値から
酵素活性を求める方法（一点法と称されている）、酵素
反応が進む一連の過程中の前後の二つの時点で測定を行
ないその測定値の差から酵素活性を求める方法（二点法
と称されている）、酵素反応の進行に追従して略連続的
に測定を行ないその連続した測定値の変化率から酵素活
性を求める方法（レート法と称されている）などが知ら
れている。
【０００５】そして、近年においては特に臨床診断等の
分野で微量物質の定量測定の意義，評価が次第に高ま
り、微量な生体物質を高精度，高感度に測定することが
求められるようになってきており、このような要求に応
じて、複数の試料間での汚染がないシステムや、検出感
度が高くかつ多数検体の連続測定を行なうに適した検出
器等も提案されつつある。
分野で微量物質の定量測定の意義，評価が次第に高ま
り、微量な生体物質を高精度，高感度に測定することが
求められるようになってきており、このような要求に応
じて、複数の試料間での汚染がないシステムや、検出感
度が高くかつ多数検体の連続測定を行なうに適した検出
器等も提案されつつある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】ところで、上述のよう
な高感度，高精度な生体物質等の定量測定を目的として
提案され、あるいは既に実施に供されている従来の方
法，装置においては、例えば、試料中に存在する気泡や
液のメニスカス等の影響を無視できないために、測定精
度を一定以上に向上させるのには限界があることが指摘
されている。このようなものの影響によって限界を生ず
る理由の一つは、代表的には、対象とする生体物質等の
試料が一般に微量である点にある。微量である分上記影
響を無視できない場合が多いからである。
な高感度，高精度な生体物質等の定量測定を目的として
提案され、あるいは既に実施に供されている従来の方
法，装置においては、例えば、試料中に存在する気泡や
液のメニスカス等の影響を無視できないために、測定精
度を一定以上に向上させるのには限界があることが指摘
されている。このようなものの影響によって限界を生ず
る理由の一つは、代表的には、対象とする生体物質等の
試料が一般に微量である点にある。微量である分上記影
響を無視できない場合が多いからである。
【０００７】例えば、気泡が存在すると気泡がない場合
に比べて蛍光測定値が大きくなるため、測定中に気泡が
消えると、例えばレート法では真の値よりも低いレート
値を示す結果となる。ところが、標識酵素の反応を受け
る基質を反応容器内に注入する場合、この基質分注は多
数検体の迅速処理のために出来るだけ速やかに行なうこ
とが望まれ、また分注量の精度を高める目的で分注終了
時のノズル先端での液滴付着を避けることが求められる
が、このためにノズルからの液吐出速度を大きくする
と、分注液の泡立ちを招く傾向が大きくなる。また一般
に酵素標識免疫測定においては、基質分注前に免疫反応
複合体と未反応物を分離するいわゆるＢ／Ｆ分離の操作
を行なうが、この際に使用する洗浄液に界面活性剤を含
んでおり、その濃度を上げると気泡が発生し易くなる。
に比べて蛍光測定値が大きくなるため、測定中に気泡が
消えると、例えばレート法では真の値よりも低いレート
値を示す結果となる。ところが、標識酵素の反応を受け
る基質を反応容器内に注入する場合、この基質分注は多
数検体の迅速処理のために出来るだけ速やかに行なうこ
とが望まれ、また分注量の精度を高める目的で分注終了
時のノズル先端での液滴付着を避けることが求められる
が、このためにノズルからの液吐出速度を大きくする
と、分注液の泡立ちを招く傾向が大きくなる。また一般
に酵素標識免疫測定においては、基質分注前に免疫反応
複合体と未反応物を分離するいわゆるＢ／Ｆ分離の操作
を行なうが、この際に使用する洗浄液に界面活性剤を含
んでおり、その濃度を上げると気泡が発生し易くなる。
【０００８】そこでこれらの問題を原理的に克服して、
より精度を向上した測定を可能とする新たな提案が待た
れている。
より精度を向上した測定を可能とする新たな提案が待た
れている。
【０００９】また上記の問題とは別に、蛍光測定の高感
度化が求めらている。例えばＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモ
ン）の免疫測定では、従来は検出下限界は０．１μＩＵ
／ｍｌ程度であったが、最近、ＴＳＨが異常低値を示す
病態を診断する必要から０．０１μＩＵ／ｍｌの検出下
限界が求められるようになり、このために標識酵素の非
特異的反応の低減化と共に、検出の高感度化が求められ
ているのである。そしてこのような検出感度の向上のた
めには、外乱等による測定値の変化と、実際の測定値の
変化とが明らかに区別できなければならない。
度化が求めらている。例えばＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモ
ン）の免疫測定では、従来は検出下限界は０．１μＩＵ
／ｍｌ程度であったが、最近、ＴＳＨが異常低値を示す
病態を診断する必要から０．０１μＩＵ／ｍｌの検出下
限界が求められるようになり、このために標識酵素の非
特異的反応の低減化と共に、検出の高感度化が求められ
ているのである。そしてこのような検出感度の向上のた
めには、外乱等による測定値の変化と、実際の測定値の
変化とが明らかに区別できなければならない。
【００１０】本発明者はこのような観点から鋭意検討を
重ね、酵素標識免疫測定法や酵素標識ＤＮＡハイブリダ
イゼーション法による測定において、測定精度向上に障
害となっている問題、例えば試料中の気泡の存在による
影響、メニスカスによる影響、試料の撹拌のために例え
ば反応容器内に磁性粒子を填加してこれを振動磁界によ
り移動させるようなことに伴う影響、光源光の経時的な
変化、等々の影響を低減でき、誤差が少なく、高精度，
高感度な測定を実現できる方法，装置の提供を目的とし
て本発明をなすに至った。
重ね、酵素標識免疫測定法や酵素標識ＤＮＡハイブリダ
イゼーション法による測定において、測定精度向上に障
害となっている問題、例えば試料中の気泡の存在による
影響、メニスカスによる影響、試料の撹拌のために例え
ば反応容器内に磁性粒子を填加してこれを振動磁界によ
り移動させるようなことに伴う影響、光源光の経時的な
変化、等々の影響を低減でき、誤差が少なく、高精度，
高感度な測定を実現できる方法，装置の提供を目的とし
て本発明をなすに至った。
【００１１】また本発明の他の目的は、光源と反応容器
の位置関係が容器に投射される光量が多少変化してもそ
れが測定結果に影響せず、常に安定して高精度な測定を
実現できる方法，装置の提供をすることにある。
の位置関係が容器に投射される光量が多少変化してもそ
れが測定結果に影響せず、常に安定して高精度な測定を
実現できる方法，装置の提供をすることにある。
【００１２】更にまた本発明の別の目的は、酵素標識免
疫測定法や酵素標識ＤＮＡハイブリダイゼーション法に
よる測定を実施する場合に、従来、測定誤差低減のため
に装置構成上の負担が大きくなっていた基質分注手段や
試料撹拌手段等の構成を簡易化，自動化に有益で、しか
も高精度な測定を維持できる新規な測定方法及び装置を
提供することにある。
疫測定法や酵素標識ＤＮＡハイブリダイゼーション法に
よる測定を実施する場合に、従来、測定誤差低減のため
に装置構成上の負担が大きくなっていた基質分注手段や
試料撹拌手段等の構成を簡易化，自動化に有益で、しか
も高精度な測定を維持できる新規な測定方法及び装置を
提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段及び作用】以上のような目
的を実現するために、本発明者は、酵素と、この酵素の
作用を受けて生成物を生ずる基質と、上記酵素の作用は
受けないが蛍光は発する基準物質とを含んだ試料に、励
起光を照射し、これによって該試料から放射される蛍光
のうち、少なくとも上記生成物からの蛍光を含む波長の
蛍光強度により第一の測定値を求めると共に、該第一の
測定値を求めた波長とは異なりかつ少なくとも上記基準
物質からの蛍光を含む波長の蛍光強度により第二の測定
値を求め、これらの第一の測定値と第二の測定値の比に
基づき上記酵素の活性を求めることを特徴とする本発明
の酵素活性測定方法を完成した。
的を実現するために、本発明者は、酵素と、この酵素の
作用を受けて生成物を生ずる基質と、上記酵素の作用は
受けないが蛍光は発する基準物質とを含んだ試料に、励
起光を照射し、これによって該試料から放射される蛍光
のうち、少なくとも上記生成物からの蛍光を含む波長の
蛍光強度により第一の測定値を求めると共に、該第一の
測定値を求めた波長とは異なりかつ少なくとも上記基準
物質からの蛍光を含む波長の蛍光強度により第二の測定
値を求め、これらの第一の測定値と第二の測定値の比に
基づき上記酵素の活性を求めることを特徴とする本発明
の酵素活性測定方法を完成した。
【００１４】酵素活性を求めるには、例えば第一の波長
領域で測定した第一の測定値を、上記第二の測定値で割
った値の時間に対する変化率に基づき、例えば既知の試
料を用いて予め作成しておいた検量線を用いて求めるこ
とができる。ここで蛍光強度の時間に対する変化率を、
上述した二点法で求めたり、レート法として上述したよ
うに酵素反応の経過に追従して略連続的に測定を行ない
その連続した測定値の変化率から酵素活性を求める方法
が特に好ましい方法として推奨されるが、特にこれに限
定されるものではない。
領域で測定した第一の測定値を、上記第二の測定値で割
った値の時間に対する変化率に基づき、例えば既知の試
料を用いて予め作成しておいた検量線を用いて求めるこ
とができる。ここで蛍光強度の時間に対する変化率を、
上述した二点法で求めたり、レート法として上述したよ
うに酵素反応の経過に追従して略連続的に測定を行ない
その連続した測定値の変化率から酵素活性を求める方法
が特に好ましい方法として推奨されるが、特にこれに限
定されるものではない。
【００１５】本発明方法の特徴は、次ぎのように説明さ
れる。いま上記基質、酵素作用を受けて生ずる生成物、
及び基準物質のいずれもが蛍光物質であるとし、これら
に励起光を照射した時に各々の物質から放射される蛍光
を考えると、蛍光強度は蛍光物質の濃度と比例関係を有
し、また泡等の外乱の影響は全体に表われるから、上記
の所定の波長で測定される第一の測定値（FI１）と、こ
れとは異なる波長で測定される上記第二の測定値（FI
２）とは夫々下記式で表わされることになる。
れる。いま上記基質、酵素作用を受けて生ずる生成物、
及び基準物質のいずれもが蛍光物質であるとし、これら
に励起光を照射した時に各々の物質から放射される蛍光
を考えると、蛍光強度は蛍光物質の濃度と比例関係を有
し、また泡等の外乱の影響は全体に表われるから、上記
の所定の波長で測定される第一の測定値（FI１）と、こ
れとは異なる波長で測定される上記第二の測定値（FI
２）とは夫々下記式で表わされることになる。
【００１６】（FI１）＝ｐ×（ｋ１×［基質］＋ｋ２×
［生成物］＋ｋ３×［基準物質］） （FI２）＝ｐ×（ｋ４×［基質］＋ｋ５×［生成物］＋
ｋ６×［基準物質］） （但し式中において、ｐは泡等により試料全体に現われ
る蛍光の変動係数であり、［ ］は夫々の物質の濃度、
ｋ１〜ｋ６は夫々の物質のその波長領域に係わる比例係
数を表し、ｋ１／ｋ４＝ｋ２／ｋ５＝ｋ３／ｋ６≠０で
ある。） ここで、本発明方法によりこれらの比を求めると下記式
（１）となり、更に基質濃度を生成物濃度で表わすよう
に式を変形すれば、生成物濃度は下記式（２）により基
準物質濃度と比例係数ｋ１〜ｋ６から得ることができ
る。
［生成物］＋ｋ３×［基準物質］） （FI２）＝ｐ×（ｋ４×［基質］＋ｋ５×［生成物］＋
ｋ６×［基準物質］） （但し式中において、ｐは泡等により試料全体に現われ
る蛍光の変動係数であり、［ ］は夫々の物質の濃度、
ｋ１〜ｋ６は夫々の物質のその波長領域に係わる比例係
数を表し、ｋ１／ｋ４＝ｋ２／ｋ５＝ｋ３／ｋ６≠０で
ある。） ここで、本発明方法によりこれらの比を求めると下記式
（１）となり、更に基質濃度を生成物濃度で表わすよう
に式を変形すれば、生成物濃度は下記式（２）により基
準物質濃度と比例係数ｋ１〜ｋ６から得ることができ
る。
【００１７】
【数１】
【００１８】この式（１）あるいは（２）を用いて二つ
の測定値の比を求めることにより、酵素活性を示す値か
ら蛍光の変動の影響が除去されることが分かる。
の測定値の比を求めることにより、酵素活性を示す値か
ら蛍光の変動の影響が除去されることが分かる。
【００１９】なお上記の式は、試料中に存在する基質，
生成物，基準物質の全てが励起光によって蛍光を発する
場合として一般的に説明しているが、第一の測定値を得
るための波長の選択や、第二の測定値を得るための波長
の選択等により、ｋ１＝０や、ｋ１＝ｋ４＝ｋ５＝０と
することもでき（なお完全に０である場合の他、実質的
に０と見なすことができる場合であってもよい）、一方
の測定値（例えば第一の測定値）において生成物からの
蛍光強度を検出することと、他方の測定値（例えば第二
の測定値）から基準物質の蛍光強度を検出することとを
必須とすることで、本発明方法の目的を達成できる。
生成物，基準物質の全てが励起光によって蛍光を発する
場合として一般的に説明しているが、第一の測定値を得
るための波長の選択や、第二の測定値を得るための波長
の選択等により、ｋ１＝０や、ｋ１＝ｋ４＝ｋ５＝０と
することもでき（なお完全に０である場合の他、実質的
に０と見なすことができる場合であってもよい）、一方
の測定値（例えば第一の測定値）において生成物からの
蛍光強度を検出することと、他方の測定値（例えば第二
の測定値）から基準物質の蛍光強度を検出することとを
必須とすることで、本発明方法の目的を達成できる。
【００２０】本発明の方法における励起光の波長は、基
質と生成物のうちの少なくともいずれか一方、及び基準
物質の双方を同時に励起することができる波長領域を含
むように選択される。
質と生成物のうちの少なくともいずれか一方、及び基準
物質の双方を同時に励起することができる波長領域を含
むように選択される。
【００２１】試料中から放射される蛍光のうちで第一の
測定値を求めるために測定する蛍光波長（以下「第一の
蛍光波長」という）は、上述の如く、基質あるいは生成
物から放射される蛍光の波長領域を含む範囲から選択さ
れ、第二の測定値を求めるための蛍光波長（以下「第二
の蛍光波長」という）は、基準物質から放射される蛍光
波長領域を含む範囲から選択される。ここで波長とは、
所定の波長領域を包含するものをいう。
測定値を求めるために測定する蛍光波長（以下「第一の
蛍光波長」という）は、上述の如く、基質あるいは生成
物から放射される蛍光の波長領域を含む範囲から選択さ
れ、第二の測定値を求めるための蛍光波長（以下「第二
の蛍光波長」という）は、基準物質から放射される蛍光
波長領域を含む範囲から選択される。ここで波長とは、
所定の波長領域を包含するものをいう。
【００２２】励起光の波長と第一の蛍光波長は、基質が
生成物に変化することで生ずる蛍光特性の変化が蛍光測
定値に反映するように選択される。
生成物に変化することで生ずる蛍光特性の変化が蛍光測
定値に反映するように選択される。
【００２３】酵素は、遊離の天然酵素等であってもよい
し、あるいは遊離の抗原，抗体，ＤＮＡなどに結合され
た酵素でもよく、更に、酵素標識免疫測定法や酵素標識
ＤＮＡハイブリダイゼーション法の結果、小容器の内壁
あるいはシート表面等に間接的に結合された酵素であっ
てもよい。
し、あるいは遊離の抗原，抗体，ＤＮＡなどに結合され
た酵素でもよく、更に、酵素標識免疫測定法や酵素標識
ＤＮＡハイブリダイゼーション法の結果、小容器の内壁
あるいはシート表面等に間接的に結合された酵素であっ
てもよい。
【００２４】酵素標識免疫測定法や酵素標識ＤＮＡハイ
ブリダイゼーション法における標識酵素としてはアルカ
リ性フォスファターゼやβ−ガラクトシダーゼ等を代表
的に例示することができ、前者のアルカリ性フォスファ
ダーゼの作用で蛍光測定値が変化する基質としては、例
えば４−メチルウンベリフェリルリン酸を例示できる。
この基質は上記酵素の作用により４−メチルウンベリフ
ェロンに変化（生成）する。また後者のβ−ガラクトシ
ダーゼの作用で蛍光測定値が変化する基質としては、例
えば４−メチルウンベリフェリルガラクトシドを例示で
き、この基質は上記酵素により４−メチルウンベリフェ
ロンに変化（生成）する。そして例えば上記生成物（４
−メチルウンベリフェロン）に対し、アルカリ性（ｐＨ
１０）の下で３６５ｎｍの波長を持つ励起光を照射（図
４（ｂ）参照）すると、４−メチルウンベリフェロンは
４５０ｎｍ付近に極大をもつ蛍光（図４（ａ）参照）を
発するが、４−メチルウンベリフェリルリン酸及び４−
メチルウンベリフェリルガラクトシドからの蛍光は殆ど
無視できる。したがって３６５ｎｍの励起光を照射する
ことで試料から放射される蛍光のうちから、４５０ｎｍ
前後の波長の蛍光を取り出して生成物からの蛍光強度を
測定することができる。
ブリダイゼーション法における標識酵素としてはアルカ
リ性フォスファターゼやβ−ガラクトシダーゼ等を代表
的に例示することができ、前者のアルカリ性フォスファ
ダーゼの作用で蛍光測定値が変化する基質としては、例
えば４−メチルウンベリフェリルリン酸を例示できる。
この基質は上記酵素の作用により４−メチルウンベリフ
ェロンに変化（生成）する。また後者のβ−ガラクトシ
ダーゼの作用で蛍光測定値が変化する基質としては、例
えば４−メチルウンベリフェリルガラクトシドを例示で
き、この基質は上記酵素により４−メチルウンベリフェ
ロンに変化（生成）する。そして例えば上記生成物（４
−メチルウンベリフェロン）に対し、アルカリ性（ｐＨ
１０）の下で３６５ｎｍの波長を持つ励起光を照射（図
４（ｂ）参照）すると、４−メチルウンベリフェロンは
４５０ｎｍ付近に極大をもつ蛍光（図４（ａ）参照）を
発するが、４−メチルウンベリフェリルリン酸及び４−
メチルウンベリフェリルガラクトシドからの蛍光は殆ど
無視できる。したがって３６５ｎｍの励起光を照射する
ことで試料から放射される蛍光のうちから、４５０ｎｍ
前後の波長の蛍光を取り出して生成物からの蛍光強度を
測定することができる。
【００２５】上記のような基質，生成物を含む試料に対
し、本発明方法の特徴的構成として加えられる基準物質
は、上記の励起光の照射を受けて、酵素の作用により変
化する蛍光スペクトルの変化の形とは異なる蛍光スペク
トルの形をもつ蛍光を放射する物質の中から選択され
る。
し、本発明方法の特徴的構成として加えられる基準物質
は、上記の励起光の照射を受けて、酵素の作用により変
化する蛍光スペクトルの変化の形とは異なる蛍光スペク
トルの形をもつ蛍光を放射する物質の中から選択され
る。
【００２６】上記で代表的に例示した４−メチルウンベ
リフェロンの例でいえば、３６５ｎｍの励起光の照射を
受けて例えば５００ｎｍ以上の波長の蛍光を放射する物
質から該基準物質を選択することが好ましい。このよう
な基準物質として用いることが出来る物質の例を以下の
化１，化２に例示した。
リフェロンの例でいえば、３６５ｎｍの励起光の照射を
受けて例えば５００ｎｍ以上の波長の蛍光を放射する物
質から該基準物質を選択することが好ましい。このよう
な基準物質として用いることが出来る物質の例を以下の
化１，化２に例示した。
【００２７】
【化１】
【００２８】
【化２】
【００２９】これらの物質の励起スペクトルの極大は３
６５ｎｍにないが、例えば上記表中に例示されたダンシ
ル−Ｌ−アラニンは、図５（ａ）に示すように励起スペ
クトルに幅をもっているので，３６５ｎｍの励起光を照
射することで約５５０ｎｍに極大をもつ蛍光の放射が得
られる（図５（ｂ）参照）。
６５ｎｍにないが、例えば上記表中に例示されたダンシ
ル−Ｌ−アラニンは、図５（ａ）に示すように励起スペ
クトルに幅をもっているので，３６５ｎｍの励起光を照
射することで約５５０ｎｍに極大をもつ蛍光の放射が得
られる（図５（ｂ）参照）。
【００３０】なお酵素反応の生成物として４−メチルウ
ンベリフェロンを用いダンシル−Ｌ−アラニンを基準物
質として用いた場合には、両者の蛍光スペクトルが多少
重なる（図４（ｂ）及び図５（ｂ）参照）。このため、
第一の蛍光波長として４５０ｎｍ前後の波長の光を取り
出すと、その中に基準物質からの蛍光もわずかに含まれ
ることになるが、本発明の特徴である第一の蛍光波長で
測定した第一の測定値と上記５００ｎｍ以上の波長で測
定した第二の測定値の比を求めても、その値は時間に対
する変化率には影響しない。
ンベリフェロンを用いダンシル−Ｌ−アラニンを基準物
質として用いた場合には、両者の蛍光スペクトルが多少
重なる（図４（ｂ）及び図５（ｂ）参照）。このため、
第一の蛍光波長として４５０ｎｍ前後の波長の光を取り
出すと、その中に基準物質からの蛍光もわずかに含まれ
ることになるが、本発明の特徴である第一の蛍光波長で
測定した第一の測定値と上記５００ｎｍ以上の波長で測
定した第二の測定値の比を求めても、その値は時間に対
する変化率には影響しない。
【００３１】また上述の場合、第二の蛍光波長で測定し
た第二の測定値に４−メチルウンベリフェロンからの蛍
光も含まれるが、４−メチルウンベリフェロンの影響が
大きくならないように第二の蛍光波長と基準物質の濃度
を選ぶことで本発明の効果を適切に発揮させることがで
きる。具体的には例えば、上述の例の実施に当たり試料
中に共存させるべき基準物質の濃度を、第二の蛍光波長
における蛍光強度が十分に強く、しかも基準物質による
励起光の吸収が過大にならない範囲とすること、一般的
には吸収率が５０％以下とすることがよい。また基質あ
るいは生成物の蛍光スペクトルの波長と基準物質の励起
スペクトルの波長が重なる場合には、基質あるいは生成
物から放射された蛍光が基準物質により再吸収されるの
で、基準物質の濃度は該再吸収の割合が過大とならない
範囲、一般的には再吸収の割合が５０％以下とすること
がよい。
た第二の測定値に４−メチルウンベリフェロンからの蛍
光も含まれるが、４−メチルウンベリフェロンの影響が
大きくならないように第二の蛍光波長と基準物質の濃度
を選ぶことで本発明の効果を適切に発揮させることがで
きる。具体的には例えば、上述の例の実施に当たり試料
中に共存させるべき基準物質の濃度を、第二の蛍光波長
における蛍光強度が十分に強く、しかも基準物質による
励起光の吸収が過大にならない範囲とすること、一般的
には吸収率が５０％以下とすることがよい。また基質あ
るいは生成物の蛍光スペクトルの波長と基準物質の励起
スペクトルの波長が重なる場合には、基質あるいは生成
物から放射された蛍光が基準物質により再吸収されるの
で、基準物質の濃度は該再吸収の割合が過大とならない
範囲、一般的には再吸収の割合が５０％以下とすること
がよい。
【００３２】本発明方法の測定対象とできる試料は、上
記酵素標識免疫測定法や酵素標識ＤＮＡハイブリダイゼ
ーション法を適用できるものであれば特に限定されるこ
とはなく、一般的には小さなカップ状の小容器に入れて
測定装置に供給される場合が多い。
記酵素標識免疫測定法や酵素標識ＤＮＡハイブリダイゼ
ーション法を適用できるものであれば特に限定されるこ
とはなく、一般的には小さなカップ状の小容器に入れて
測定装置に供給される場合が多い。
【００３３】また本発明の酵素活性測定装置の特徴は、
酵素の作用に由来して増加あるいは減少する蛍光物質及
び酵素の作用を受けないが蛍光は発する基準物質を含む
試料に対して励起光を照射する投光手段と、試料が放射
する蛍光のなかから上記蛍光物質に由来した第一の測定
値を求める波長の成分を取り出して蛍光強度を測定する
第一の受光測定手段と、試料が放射する蛍光のなかから
上記基準物質に由来した第二の測定値を求める波長の成
分を取り出して蛍光強度を測定する第二の受光測定手段
と、これら第一の受光測定手段及び第二の受光測定手段
で測定した測定値を入力として酵素活性を演算する演算
手段とを備えたという構成をなすところにある。
酵素の作用に由来して増加あるいは減少する蛍光物質及
び酵素の作用を受けないが蛍光は発する基準物質を含む
試料に対して励起光を照射する投光手段と、試料が放射
する蛍光のなかから上記蛍光物質に由来した第一の測定
値を求める波長の成分を取り出して蛍光強度を測定する
第一の受光測定手段と、試料が放射する蛍光のなかから
上記基準物質に由来した第二の測定値を求める波長の成
分を取り出して蛍光強度を測定する第二の受光測定手段
と、これら第一の受光測定手段及び第二の受光測定手段
で測定した測定値を入力として酵素活性を演算する演算
手段とを備えたという構成をなすところにある。
【００３４】上記において、励起光を照射する投光手段
は、一般的には光源，レンズ，フィルター，ミラー，集
光レンズ等を適宜組み合わせた光学系として構成され
る。光源は好ましくは点滅点灯する方式のものがよい。
受光側での同期検波により、受光センサから得られる信
号から外乱光等の影響を除去して、試料に起因する蛍光
成分のみを取り出して、より信頼性の高い蛍光強度の検
出が可能になるからである。光源点滅のためには、例え
ば機械式のチョッパでもよいが、放電管あるいは蛍光管
を用いて数１０Ｈｚ〜数１００Ｈｚの範囲で点滅させる
光源ランプは長時間連続運転での耐久性に優れた光源と
して有利である。電源には上記周波数の交流やパルス電
源や、上記周波数で断続される数ｋＨｚ〜数十ｋＨｚの
高周波交流電源を用いることもできる。
は、一般的には光源，レンズ，フィルター，ミラー，集
光レンズ等を適宜組み合わせた光学系として構成され
る。光源は好ましくは点滅点灯する方式のものがよい。
受光側での同期検波により、受光センサから得られる信
号から外乱光等の影響を除去して、試料に起因する蛍光
成分のみを取り出して、より信頼性の高い蛍光強度の検
出が可能になるからである。光源点滅のためには、例え
ば機械式のチョッパでもよいが、放電管あるいは蛍光管
を用いて数１０Ｈｚ〜数１００Ｈｚの範囲で点滅させる
光源ランプは長時間連続運転での耐久性に優れた光源と
して有利である。電源には上記周波数の交流やパルス電
源や、上記周波数で断続される数ｋＨｚ〜数十ｋＨｚの
高周波交流電源を用いることもできる。
【００３５】本発明における酵素活性測定装置の受光測
定手段は、第一及び第二の受光測定手段として構成さ
れ、夫々、ミラー、集光レンズ、フィルター、フォトダ
イオードや光電子増倍管等の受光センサなどの受光光学
系と、増幅器などの電気回路要素を組み合わせて構成さ
れる。なお上述したように光源光の点滅点灯手段が組み
合わせられる場合には、例えば蛍光管等を点滅させるた
めのクロック信号を用いて受光センサからの電気信号を
同期検波する検波器も併せて用いられる。
定手段は、第一及び第二の受光測定手段として構成さ
れ、夫々、ミラー、集光レンズ、フィルター、フォトダ
イオードや光電子増倍管等の受光センサなどの受光光学
系と、増幅器などの電気回路要素を組み合わせて構成さ
れる。なお上述したように光源光の点滅点灯手段が組み
合わせられる場合には、例えば蛍光管等を点滅させるた
めのクロック信号を用いて受光センサからの電気信号を
同期検波する検波器も併せて用いられる。
【００３６】本発明における酵素活性測定装置は、試料
に対して励起光を照射する向きと逆向きに試料から放射
された蛍光を検出する方式や、励起光の照射と蛍光の取
り出しを直角方向にする方式のいずれであっても良い
が、多数の試料を対象として連続的な能率の良い酵素活
性測定を行なうためには、投光系の光路と受光系の光路
を重複させたトップ−トップ方式による構成のものが好
ましく採用される。例えば投光系の光路中にダイクロイ
ックミラー等を配置して光源光を反射させて下向きに照
射し、かつ受光系の光路中に配置したフィルター，ハー
フミラーあるいはダイクロイックミラー等により、試料
から上向きに放射された蛍光を第一の蛍光波長の成分を
含む光と、第二の蛍光波長の成分を含む光に分け、それ
ぞれ別々の受光センサで検出するようにした構成のもの
を例示できる。特にダイクロイックミラーを用いること
は、特性を励起光の波長と蛍光波長に合わせて選択する
ことによって励起光と蛍光のロスを減らし有効に利用で
きる点で有利である。
に対して励起光を照射する向きと逆向きに試料から放射
された蛍光を検出する方式や、励起光の照射と蛍光の取
り出しを直角方向にする方式のいずれであっても良い
が、多数の試料を対象として連続的な能率の良い酵素活
性測定を行なうためには、投光系の光路と受光系の光路
を重複させたトップ−トップ方式による構成のものが好
ましく採用される。例えば投光系の光路中にダイクロイ
ックミラー等を配置して光源光を反射させて下向きに照
射し、かつ受光系の光路中に配置したフィルター，ハー
フミラーあるいはダイクロイックミラー等により、試料
から上向きに放射された蛍光を第一の蛍光波長の成分を
含む光と、第二の蛍光波長の成分を含む光に分け、それ
ぞれ別々の受光センサで検出するようにした構成のもの
を例示できる。特にダイクロイックミラーを用いること
は、特性を励起光の波長と蛍光波長に合わせて選択する
ことによって励起光と蛍光のロスを減らし有効に利用で
きる点で有利である。
【００３７】光源光，受光センサ，フィルターなどの位
置等は、例えばダイクロイックミラー等の採用する構成
要素の特性に合わせて選択される。
置等は、例えばダイクロイックミラー等の採用する構成
要素の特性に合わせて選択される。
【００３８】図６の（ａ）〜（ｃ）は夫々、上述したト
ップ−トップ方式を採用した例の測定装置の光学系の構
成概要を示したものであり、光源光５０１からの光をハ
ーフミラー又はダイクロイックミラー５０７，５０８を
介して試料容器２内の試料１に照射し、これによって放
射された蛍光をフィルター５０５，５０６を通して受光
センサ５０３，５０４に受光させるようにしている。な
お図６（ｂ），（ｃ）中の符号は、図６（ａ）と同じ構
成要素にそれぞれ１０，２０を加えて付している。
ップ−トップ方式を採用した例の測定装置の光学系の構
成概要を示したものであり、光源光５０１からの光をハ
ーフミラー又はダイクロイックミラー５０７，５０８を
介して試料容器２内の試料１に照射し、これによって放
射された蛍光をフィルター５０５，５０６を通して受光
センサ５０３，５０４に受光させるようにしている。な
お図６（ｂ），（ｃ）中の符号は、図６（ａ）と同じ構
成要素にそれぞれ１０，２０を加えて付している。
【００３９】本発明の演算装置において行なう割算処理
は、第一の受光系で得られた電気信号と第二の受光系で
得られた電気信号とを、アナログ的に処理してもよい
し、上記各信号をＡ／Ｄ変換してデジタル信号に変換し
た後に、デジタルコンピュータなどのデジタル演算回路
で処理するようにしてもよい。
は、第一の受光系で得られた電気信号と第二の受光系で
得られた電気信号とを、アナログ的に処理してもよい
し、上記各信号をＡ／Ｄ変換してデジタル信号に変換し
た後に、デジタルコンピュータなどのデジタル演算回路
で処理するようにしてもよい。
【００４０】図７は以上のような構成をもつ測定装置の
信号処理系を模式的に示したものであり、図７（ａ）は
直流電源８０により連続点灯される光源７０を用いた例
であり、図７（ｂ）はパルス電源８１により点滅点灯さ
れる光源７０を用いた例を示している。受光センサ６
３，６４に入力された光は、電気信号７１，７２として
アンプ７３，７４で増幅され、Ａ／Ｄ変換器７５，７６
でデジタル信号に変換された後、コンピュータなどのデ
ジタル演算回路７７により、例えば時間に対する変化率
の計算と割り算処理が行なわれる。
信号処理系を模式的に示したものであり、図７（ａ）は
直流電源８０により連続点灯される光源７０を用いた例
であり、図７（ｂ）はパルス電源８１により点滅点灯さ
れる光源７０を用いた例を示している。受光センサ６
３，６４に入力された光は、電気信号７１，７２として
アンプ７３，７４で増幅され、Ａ／Ｄ変換器７５，７６
でデジタル信号に変換された後、コンピュータなどのデ
ジタル演算回路７７により、例えば時間に対する変化率
の計算と割り算処理が行なわれる。
【００４１】図７（ｂ）の８２はクロック発生回路であ
り、パルス電源８１と受光系の同期検波回路８３，８４
を同期させるように用いられる。
り、パルス電源８１と受光系の同期検波回路８３，８４
を同期させるように用いられる。
【００４２】なお上記電気信号７１，７２をアナログ割
り算回路に入力し、その出力をＡ／Ｄ変換器によってデ
ジタル信号に変換し、その後、コンピュータなどのデジ
タル演算回路により、上述した時間に対する変化率の計
算等を行なってもよいことは当然である。
り算回路に入力し、その出力をＡ／Ｄ変換器によってデ
ジタル信号に変換し、その後、コンピュータなどのデジ
タル演算回路により、上述した時間に対する変化率の計
算等を行なってもよいことは当然である。
【００４３】
【実施例】以下本発明を図面に示す実施例に基づいて更
に詳細に説明する。
に詳細に説明する。
【００４４】実施例１ 図３は、本発明方法の測定に用いる装置（トップ−トッ
プ方式光学系を有する構成）の一例を示したものであ
り、この図において、２は数μｌ程度の少量の試料液１
が充填されているカップ状の試料容器（上端口径１０ｍ
ｍ、容積１ｍｌ）であり、図示しない基質充填−酵素反
応の工程を経て蛍光検出のための測定位置に移入され
る。この図３は測定位置に該試料容器１が移入された状
態を図示している。なお本例における基質から変化した
生成物は、４−メチルウンベリフェリルリン酸のアルカ
リ性フォスファターゼによる生成物であって、図４
（ａ），（ｂ）の蛍光特性を有する４−メチルウンベリ
フェロンであり、また基準物質としては図５（ａ），
（ｂ）で示した蛍光特性を有するダンシル−Ｌ−アラニ
ンを用いた。
プ方式光学系を有する構成）の一例を示したものであ
り、この図において、２は数μｌ程度の少量の試料液１
が充填されているカップ状の試料容器（上端口径１０ｍ
ｍ、容積１ｍｌ）であり、図示しない基質充填−酵素反
応の工程を経て蛍光検出のための測定位置に移入され
る。この図３は測定位置に該試料容器１が移入された状
態を図示している。なお本例における基質から変化した
生成物は、４−メチルウンベリフェリルリン酸のアルカ
リ性フォスファターゼによる生成物であって、図４
（ａ），（ｂ）の蛍光特性を有する４−メチルウンベリ
フェロンであり、また基準物質としては図５（ａ），
（ｂ）で示した蛍光特性を有するダンシル−Ｌ−アラニ
ンを用いた。
【００４５】６１は励起光の投光光学系の光源を示し、
光源光は、３２０ｎｍ〜３８０ｎｍの光を透過するフィ
ルター６２を通して、ハーフミラー６７により反射され
て、試料容器２中の試料１に向けて励起光として下向き
に照射されるようになっている。
光源光は、３２０ｎｍ〜３８０ｎｍの光を透過するフィ
ルター６２を通して、ハーフミラー６７により反射され
て、試料容器２中の試料１に向けて励起光として下向き
に照射されるようになっている。
【００４６】この励起光の照射により試料液１から放射
された蛍光は、上向きにハーフミラー６７を通過し、ダ
イクロイックミラー６８で第一の蛍光波長を含む光と第
二の蛍光波長を含む光に分けられる。このダイクロイッ
クミラー６８は、５３０ｎｍ以上の光は透過するが、４
２０ｎｍ〜５３０ｎｍの光は反射する特性をもつように
設けられている。
された蛍光は、上向きにハーフミラー６７を通過し、ダ
イクロイックミラー６８で第一の蛍光波長を含む光と第
二の蛍光波長を含む光に分けられる。このダイクロイッ
クミラー６８は、５３０ｎｍ以上の光は透過するが、４
２０ｎｍ〜５３０ｎｍの光は反射する特性をもつように
設けられている。
【００４７】上記ダイクロイックミラー６８で分けられ
た第一の蛍光波長の光は、４５０ｎｍ〜５１０ｎｍの光
を透過するフィルター６５を通ることで波長を選択され
て受光センサ６３に受光され、他方第二の蛍光波長の光
は、そのまま上向きに進み６００ｎｍ以上の光を透過す
るフィルター６６を通ることで波長を選択されて受光セ
ンサ６４に受光される。
た第一の蛍光波長の光は、４５０ｎｍ〜５１０ｎｍの光
を透過するフィルター６５を通ることで波長を選択され
て受光センサ６３に受光され、他方第二の蛍光波長の光
は、そのまま上向きに進み６００ｎｍ以上の光を透過す
るフィルター６６を通ることで波長を選択されて受光セ
ンサ６４に受光される。
【００４８】以上の構成をなす測定装置を用いて、アル
カリ性フォスファダーゼで標識された生体物質、基質
（４−メチルウンベリフェリルリン酸）と基準物質（ダ
ンシル−Ｌ−アラニン）を混在させた試料液の蛍光を測
定した。なおアルカリ性フォスファターゼは任意量、４
−メチルウンベリフェリルリン酸の濃度は１ｍＭ、ダン
シル−Ｌ−アラニンの濃度は１００μｇ／ｍｌである。
カリ性フォスファダーゼで標識された生体物質、基質
（４−メチルウンベリフェリルリン酸）と基準物質（ダ
ンシル−Ｌ−アラニン）を混在させた試料液の蛍光を測
定した。なおアルカリ性フォスファターゼは任意量、４
−メチルウンベリフェリルリン酸の濃度は１ｍＭ、ダン
シル−Ｌ−アラニンの濃度は１００μｇ／ｍｌである。
【００４９】これにより検出された第一の蛍光波長の測
定値Ａと第二の蛍光波長Ｂの測定値の時間依存性を図１
に示した。また、第一の蛍光波長で測定した第一の測定
値を第二の蛍光波長で測定した第二の測定値で割った値
（相対蛍光強度）の時間依存性を図２に示した。図１及
び図２中の〜で示した位置は、人為的に試料液に空
気を吹き込むことで形成された泡が破壊又は移動したた
め、測定される蛍光の強度が変化した位置を示してい
る。
定値Ａと第二の蛍光波長Ｂの測定値の時間依存性を図１
に示した。また、第一の蛍光波長で測定した第一の測定
値を第二の蛍光波長で測定した第二の測定値で割った値
（相対蛍光強度）の時間依存性を図２に示した。図１及
び図２中の〜で示した位置は、人為的に試料液に空
気を吹き込むことで形成された泡が破壊又は移動したた
め、測定される蛍光の強度が変化した位置を示してい
る。
【００５０】ここで図の対比から分かるように、空気を
吹き込むと蛍光強度が大きく変化するが、図２で示した
第一の蛍光測定値を第２の蛍光測定値で割った値は、気
泡の影響を受けることがなく、したがって本発明方法に
より測定した測定値は、試料中に気泡が存在してもその
影響を受けることなく、蛍光物質の蛍光強度の変化を正
確に検出できる効果が確認された。
吹き込むと蛍光強度が大きく変化するが、図２で示した
第一の蛍光測定値を第２の蛍光測定値で割った値は、気
泡の影響を受けることがなく、したがって本発明方法に
より測定した測定値は、試料中に気泡が存在してもその
影響を受けることなく、蛍光物質の蛍光強度の変化を正
確に検出できる効果が確認された。
【００５１】実施例２ 本発明方法により得られた測定の結果を従来方法と比較
するために次の試験を行なった。
するために次の試験を行なった。
【００５２】上記実施例１と同様の構成を有する装置Ａ
ＩＡ １２００（（株）東ソー社製）を用いて以下の試
験を行なった。すなわち、本例では撹拌用の磁性体粒子
（直径約１．５ｍｍ）の数個を填加した上記試料容器
に、アルカリ性フォスファターゼ５０μｌをピペッター
により手分注し、これに、４−メチルウンベリフェリル
リン酸溶液（４−メチルウンベリフェリルリン酸２６ｍ
ｇを、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールを
４．５ｇ含有する水溶液１００ｍｌに溶解して調整した
もの）に予めダンシル−Ｌ−アラニンを０．１ｍｇ／ｍ
ｌ（基質溶液１００ｍｌに対して５ｍｇ）添加した溶液
をピペッターにより手分注で２００μｌ分注し、これを
直ちに検出器下に移動させて、直後から２秒間隔で１０
０秒間、第一及び第二の波長で蛍光強度の測定を行な
い、以下の算出式（３）を用いて最小二乗法によりレー
トを求めて（試験例Ｎｏ１〜１０）、その結果を下記第
１表に示した。なお測定中は磁性体粒子を振動磁界によ
り往復運動させた。また試験を行なったうち（Ｎｏ１，
９）については、検出操作を行う直前に容器内の液に空
気を吹き込んだ。
ＩＡ １２００（（株）東ソー社製）を用いて以下の試
験を行なった。すなわち、本例では撹拌用の磁性体粒子
（直径約１．５ｍｍ）の数個を填加した上記試料容器
に、アルカリ性フォスファターゼ５０μｌをピペッター
により手分注し、これに、４−メチルウンベリフェリル
リン酸溶液（４−メチルウンベリフェリルリン酸２６ｍ
ｇを、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールを
４．５ｇ含有する水溶液１００ｍｌに溶解して調整した
もの）に予めダンシル−Ｌ−アラニンを０．１ｍｇ／ｍ
ｌ（基質溶液１００ｍｌに対して５ｍｇ）添加した溶液
をピペッターにより手分注で２００μｌ分注し、これを
直ちに検出器下に移動させて、直後から２秒間隔で１０
０秒間、第一及び第二の波長で蛍光強度の測定を行な
い、以下の算出式（３）を用いて最小二乗法によりレー
トを求めて（試験例Ｎｏ１〜１０）、その結果を下記第
１表に示した。なお測定中は磁性体粒子を振動磁界によ
り往復運動させた。また試験を行なったうち（Ｎｏ１，
９）については、検出操作を行う直前に容器内の液に空
気を吹き込んだ。
【００５３】 （Sig(4MU)−Sig(4MU0) ）／（ref(DLA)−ref(DLA0) ） …（３） （但し、式中においてSig(4MU)は、第一の波長によって
測定された蛍光強度の測定値（実質的に４−メチルウン
ベリフェロンの蛍光強度）であり、Sig(4MU0)は空カッ
プでの測定値である。また、ref(DLA)は第二の波長によ
って測定された蛍光強度の測定値（実質的に基準物質の
蛍光強度の測定値）であり、ｒｅｆ（ＤＬＡ０）は空カ
ップでの測定値である。） また、アルカリ性フォスファターゼを添加しない他は上
記と同様にして試験を行ない、同様にして蛍光強度の測
定及びレート算出を行なって（試験例Ｎｏ１１〜１
９）、その結果を下記第２表に示した。また試験を行な
ったうち（Ｎｏ１３，１５）については、検出操作を行
う直前に容器内の液に空気を吹き込んだ。なお本実験で
は、市販の免疫反応用試薬（Ｅテスト「ＴＯＳＯＨ」、
東ソー株式会社製）から取得した撹拌用ビーズを使用し
た。ビーズは、使用に先立って十分に洗浄したが、ごく
僅かなアルカリ性フォスファターゼがその表面に非特異
的に結合してるものと考えられた。
測定された蛍光強度の測定値（実質的に４−メチルウン
ベリフェロンの蛍光強度）であり、Sig(4MU0)は空カッ
プでの測定値である。また、ref(DLA)は第二の波長によ
って測定された蛍光強度の測定値（実質的に基準物質の
蛍光強度の測定値）であり、ｒｅｆ（ＤＬＡ０）は空カ
ップでの測定値である。） また、アルカリ性フォスファターゼを添加しない他は上
記と同様にして試験を行ない、同様にして蛍光強度の測
定及びレート算出を行なって（試験例Ｎｏ１１〜１
９）、その結果を下記第２表に示した。また試験を行な
ったうち（Ｎｏ１３，１５）については、検出操作を行
う直前に容器内の液に空気を吹き込んだ。なお本実験で
は、市販の免疫反応用試薬（Ｅテスト「ＴＯＳＯＨ」、
東ソー株式会社製）から取得した撹拌用ビーズを使用し
た。ビーズは、使用に先立って十分に洗浄したが、ごく
僅かなアルカリ性フォスファターゼがその表面に非特異
的に結合してるものと考えられた。
【００５４】更にまた、比較のために、上記アルカリ性
フォスファターゼを添加した場合と添加しなかった場合
の夫々につき、上記第一の波長で検出した蛍光強度の測
定値のみから、従来の算出法に従った下記の式（４）を
用いて最小二乗法によりレートを求め（Ｎｏ１〜１０及
びＮｏ１１〜１９）、その結果を下記第１表，第２表に
併記した。
フォスファターゼを添加した場合と添加しなかった場合
の夫々につき、上記第一の波長で検出した蛍光強度の測
定値のみから、従来の算出法に従った下記の式（４）を
用いて最小二乗法によりレートを求め（Ｎｏ１〜１０及
びＮｏ１１〜１９）、その結果を下記第１表，第２表に
併記した。
【００５５】 （（Ｓｉｇ（４ＭＵ）−Sig(4MU0) ）／ref(UV) ）×50 …（４） （但し、式中においてSig(4MU)、Sig(4MU0) は上記の式
（３）と同様である。なお（／ref(UV）) の項は、光源
光の経時的な変動を除去するために測定値を光源光の強
度で除算する項であり、（×50）の項は、本発明方法の
測定値との比較を容易化するために便宜的に掛けた係数
である。）
（３）と同様である。なお（／ref(UV）) の項は、光源
光の経時的な変動を除去するために測定値を光源光の強
度で除算する項であり、（×50）の項は、本発明方法の
測定値との比較を容易化するために便宜的に掛けた係数
である。）
【００５６】
【表１】
【００５７】
【表２】
【００５８】この第１表の結果から、従来法に比べ本発
明方法による場合において、変動係数（ＣＶ値）が小さ
く、高精度な測定結果の得られることが確認でき、また
第２表の結果から、本発明方法では従来法に比べて標準
偏差（ＳＤ値）が大幅に小さいことが確認された。
明方法による場合において、変動係数（ＣＶ値）が小さ
く、高精度な測定結果の得られることが確認でき、また
第２表の結果から、本発明方法では従来法に比べて標準
偏差（ＳＤ値）が大幅に小さいことが確認された。
【００５９】また、測定中に空気を検出操作を行う直前
に場合の測定値の変動を明かとするために、上記アルカ
リ性フォスファターゼを添加した場合の本発明方法の算
出結果を図８の（Ａ），（Ｂ）に、従来法の算出結果を
同図８の（ａ），（ｂ）で示し、アルカリ性フォスファ
ターゼを添加しなかった場合の本発明方法の算出結果を
図８の（Ｃ），（Ｄ）に、従来法の算出結果を同図８の
ｃ，ｄで示した。
に場合の測定値の変動を明かとするために、上記アルカ
リ性フォスファターゼを添加した場合の本発明方法の算
出結果を図８の（Ａ），（Ｂ）に、従来法の算出結果を
同図８の（ａ），（ｂ）で示し、アルカリ性フォスファ
ターゼを添加しなかった場合の本発明方法の算出結果を
図８の（Ｃ），（Ｄ）に、従来法の算出結果を同図８の
ｃ，ｄで示した。
【００６０】これらの図から、従来法の算出結果（ａ〜
ｄ）では空気を吹き込んだ時点で大きな乱れが生じてい
るが、本発明方法の算出結果（Ａ〜Ｄ）ではこのような
乱れの生じていないことが分かる。
ｄ）では空気を吹き込んだ時点で大きな乱れが生じてい
るが、本発明方法の算出結果（Ａ〜Ｄ）ではこのような
乱れの生じていないことが分かる。
【００６１】
【発明の効果】以上述べたように、本発明よりなる酵素
活性測定方法及びその装置は、酵素標識免疫測定法や酵
素標識ＤＮＡハイブリダイゼーション法等において高精
度の酵素活性の測定が要求される場合に、試料中の気泡
やメニスカスの影響による誤差が極めて少なく高精度な
測定が行なえるという効果がある。
活性測定方法及びその装置は、酵素標識免疫測定法や酵
素標識ＤＮＡハイブリダイゼーション法等において高精
度の酵素活性の測定が要求される場合に、試料中の気泡
やメニスカスの影響による誤差が極めて少なく高精度な
測定が行なえるという効果がある。
【００６２】また酵素標識免疫測定法や酵素標識ＤＮＡ
ハイブリダイゼーション法による測定を機械化した装置
で実施する場合の測定誤差を小さくするため、従来装置
構成上の負担が大きかった基質の分注手段、酵素反応中
の撹拌手段等を、高精度な測定を維持しつつ簡易に構成
できるという効果もある。
ハイブリダイゼーション法による測定を機械化した装置
で実施する場合の測定誤差を小さくするため、従来装置
構成上の負担が大きかった基質の分注手段、酵素反応中
の撹拌手段等を、高精度な測定を維持しつつ簡易に構成
できるという効果もある。
【００６３】また従来のこの種の測定装置においては、
例えば励起光を発するランプの発光強度が経時的に劣化
するという問題を考慮して該ランプの発光強度を検出す
るセンサを利用し測定蛍光値を補正（例えば測定検出し
た蛍光値を発光強度で割算する補正）を行なっている例
はあるが、この方式では、ランプ発光強度の経時的な変
化を補正することはできても、測定対象の試料容器とラ
ンプの位置がずれているために該容器に入る光束が変動
することには対処できないのに対し、本発明方法の方式
では、上記式（１）からも分かるように、同一時点で測
定した二つの蛍光強度の比が、測定結果となるため、光
源光の強さは直接測定結果に影響せず、測定精度の飛躍
的な向上が得られるという効果がある。
例えば励起光を発するランプの発光強度が経時的に劣化
するという問題を考慮して該ランプの発光強度を検出す
るセンサを利用し測定蛍光値を補正（例えば測定検出し
た蛍光値を発光強度で割算する補正）を行なっている例
はあるが、この方式では、ランプ発光強度の経時的な変
化を補正することはできても、測定対象の試料容器とラ
ンプの位置がずれているために該容器に入る光束が変動
することには対処できないのに対し、本発明方法の方式
では、上記式（１）からも分かるように、同一時点で測
定した二つの蛍光強度の比が、測定結果となるため、光
源光の強さは直接測定結果に影響せず、測定精度の飛躍
的な向上が得られるという効果がある。
【００６４】更に上記のように種々の外乱の影響が除去
されるため、高感度な測定が実現できる効果もある。
されるため、高感度な測定が実現できる効果もある。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例において測定された第一の蛍光波長での
第一の測定値と第二の蛍光波長での第二の測定値の時間
依存性を示した図である。
第一の測定値と第二の蛍光波長での第二の測定値の時間
依存性を示した図である。
【図２】第一の測定値を第二の測定値で割った相対蛍光
強度の時間依存性を示した図である。
強度の時間依存性を示した図である。
【図３】本発明の実施例の蛍光検出器の構成概要の一例
を示した図である。
を示した図である。
【図４】４−メチルウンベリフェリルリン酸のアルカリ
性フォスファターゼによる生成物である４−メチルウン
ベリフェロンの励起スペクトルと蛍光スペクトルを示し
た図である。
性フォスファターゼによる生成物である４−メチルウン
ベリフェロンの励起スペクトルと蛍光スペクトルを示し
た図である。
【図５】基準物質であるダンシルアラニンの励起スペク
トルと蛍光スペクトルを示した図である。
トルと蛍光スペクトルを示した図である。
【図６】（ａ）〜（ｃ）は夫々、本発明の酵素標識免疫
測定装置を構成する測定光学系の構成概要を説明するた
めの図である。
測定装置を構成する測定光学系の構成概要を説明するた
めの図である。
【図７】（ａ），（ｂ）は夫々、本発明の測定法におけ
る信号処理を示した図である。
る信号処理を示した図である。
【図８】（ａ），（ｂ）はアルカリ性フォスファターゼ
を添加した試料液の蛍光強度の変化を従来法により算出
した結果を示した図であり、（Ａ），（Ｂ）は同蛍光強
度の変化を本発明方法により算出した結果を示した図で
ある。
を添加した試料液の蛍光強度の変化を従来法により算出
した結果を示した図であり、（Ａ），（Ｂ）は同蛍光強
度の変化を本発明方法により算出した結果を示した図で
ある。
【図９】（ｃ），（ｄ）はアルカリ性フォスファターゼ
を実質的に添加しなかった試料液の蛍光強度の変化を従
来法により算出した結果を示した図であり、（Ｃ），
（Ｄ）は同蛍光強度の変化を本発明方法により算出した
結果を示した図である。
を実質的に添加しなかった試料液の蛍光強度の変化を従
来法により算出した結果を示した図であり、（Ｃ），
（Ｄ）は同蛍光強度の変化を本発明方法により算出した
結果を示した図である。
６１・・・光源、６２，６５，６６ ・・フィルター、
６３，６４・・・受光素子、６７・・・ハーフミラー、
６８・・・ダイクロイックミラー。
６３，６４・・・受光素子、６７・・・ハーフミラー、
６８・・・ダイクロイックミラー。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/535 8310−2Ｊ 33/543 Ｃ 7906−2Ｊ
Claims (9)
- 【請求項１】 酵素と、この酵素の作用を受けて生成物
を生ずる基質と、上記酵素の作用は受けないが蛍光は発
する基準物質とを含んだ試料に、励起光を照射し、これ
によって該試料から放射される蛍光のうち、少なくとも
上記生成物からの蛍光を含む波長の蛍光強度により第一
の測定値を求めると共に、該第一の測定値を求めた波長
とは異なりかつ少なくとも上記基準物質からの蛍光を含
む波長の蛍光強度により第二の測定値を求め、これら第
一の測定値と第二の測定値の比に基づき上記酵素の活性
を求めることを特徴とする酵素活性測定方法。 - 【請求項２】 請求項１において、基質及び生成物の双
方が蛍光物質であることを特徴とする酵素活性測定方
法。 - 【請求項３】 請求項１又は２において、励起光を、基
質と生成物のうち少なくとも一方と基準物質の双方を励
起できる波長領域を含むように設定すると共に、第一の
測定値は、基質あるいは生成物のいずれか一方又は双方
から放射される蛍光の波長領域で測定し、第二の測定値
は、基質及び生成物から放射される蛍光が実質的に含ま
れずに基準物質から放射される蛍光が殆どである波長領
域で測定することを特徴とする酵素活性測定方法。 - 【請求項４】 請求項１乃至３のいずれかにおいて、第
一の測定値を第二の測定値で除算した値の経時的な変化
率に基づいて酵素活性を求めることを特徴とする酵素活
性測定方法。 - 【請求項５】 請求項１乃至４のいずれかにおいて、酵
素が酵素標識免疫測定方法において測定される対象であ
ることを特徴とする酵素活性測定方法。 - 【請求項６】 請求項１乃至４のいずれかにおいて、酵
素が酵素標識ＤＮＡハイブリダイゼーション法において
測定される対象であることを特徴とする酵素活性測定方
法。 - 【請求項７】 酵素の作用に由来して増加あるいは減少
する蛍光物質及び酵素の作用を受けないが蛍光は発する
基準物質を含む試料に対して励起光を照射する投光手段
と、試料が放射する蛍光のなかから上記蛍光物質に由来
した第一の測定値を求める波長の成分を取り出して蛍光
強度を測定する第一の受光測定手段と、試料が放射する
蛍光のなかから上記基準物質に由来した第二の測定値を
求める波長の成分を取り出して蛍光強度を測定する第二
の受光測定手段と、これら第一の受光測定手段及び第二
の受光測定手段で測定した測定値を入力として酵素活性
を演算する演算手段とを備えたことを特徴とする酵素活
性測定装置。 - 【請求項８】 請求項７において、試料が充填されてい
る上方開口型の容器に対して投光手段から励起光を照射
する光路と、この容器内の試料から放射されて受光手段
に入射される蛍光の光路とを、該容器の上方開口から入
出射するように重複して設けたことを特徴とする酵素活
性測定装置。 - 【請求項９】 請求項７又は８において、演算手段が、
第一の測定値を第二の測定値で除算する割算回路を有す
ることを特徴とする酵素活性測定装置。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3146301A JP2912957B2 (ja) | 1991-06-18 | 1991-06-18 | 酵素活性測定方法及び装置 |
| EP92305595A EP0521636B1 (en) | 1991-06-18 | 1992-06-18 | Method of assay of enzymatic activity and apparatus therefor |
| DE69222236T DE69222236T2 (de) | 1991-06-18 | 1992-06-18 | Verfahren zur Untersuchung enzymatischer Aktivität und Vorrichtung hierfür |
| US07/900,286 US5460943A (en) | 1991-06-18 | 1992-06-18 | Method of assay of enzymatic activity |
| US08/415,570 US5677134A (en) | 1991-06-18 | 1995-04-03 | Method of assay of enzymatic activity and apparatus therefor |
| US08/470,827 US5738997A (en) | 1991-06-18 | 1995-06-06 | Method of assay of enzymatic activity and apparatus therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3146301A JP2912957B2 (ja) | 1991-06-18 | 1991-06-18 | 酵素活性測定方法及び装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0538297A true JPH0538297A (ja) | 1993-02-19 |
| JP2912957B2 JP2912957B2 (ja) | 1999-06-28 |
Family
ID=15404586
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3146301A Expired - Fee Related JP2912957B2 (ja) | 1991-06-18 | 1991-06-18 | 酵素活性測定方法及び装置 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5460943A (ja) |
| EP (1) | EP0521636B1 (ja) |
| JP (1) | JP2912957B2 (ja) |
| DE (1) | DE69222236T2 (ja) |
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| JP2006528350A (ja) * | 2003-07-18 | 2006-12-14 | ルミネックス・コーポレーション | オーバーラップするスペクトルを有する材料を弁別する方法およびシステム |
| WO2016203617A1 (ja) * | 2015-06-18 | 2016-12-22 | オリンパス株式会社 | 発光観察方法 |
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| SE501428C2 (sv) * | 1993-06-24 | 1995-02-13 | Cma Microdialysis Res Ab | Fluorescensdetektor jämte bäranordning för utbytbar provkuvett vid en fluorescensdetektor |
| SE9501069D0 (sv) * | 1995-03-24 | 1995-03-24 | Pharmacia Ab | Apparatus and method for performing fluorometric measurement |
| FI954511A0 (fi) * | 1995-09-22 | 1995-09-22 | Labsystems Oy | Fluorometer |
| FI954510A0 (fi) * | 1995-09-22 | 1995-09-22 | Labsystems Oy | Analysator |
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| US6608671B2 (en) | 1998-07-17 | 2003-08-19 | Vertex Pharmaceuticals (San Diego) Llc | Detector and screening device for ion channels |
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- 1992-06-18 US US07/900,286 patent/US5460943A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-18 EP EP92305595A patent/EP0521636B1/en not_active Expired - Lifetime
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- 1995-06-06 US US08/470,827 patent/US5738997A/en not_active Expired - Lifetime
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