JP2006528350A - オーバーラップするスペクトルを有する材料を弁別する方法およびシステム - Google Patents

Abstract

種々のコンピュータによって具体化される方法およびシステムが提供されている。１つのコンピュータによって具体化される方法は、２またはそれを超える数の検出ウインドウ内の単一の事象についてのスペクトルを検出することによって生成される出力信号の間の比を決定する。スペクトルは異なる材料に特有である。スペクトルの少なくとも一部が、２またはそれを超える数の検出ウインドウの少なくとも１つでオーバーラップする。この方法は、異なる材料のいずれが、この比に関連付けされるかを決定することも含む。システムの一例は、２またはそれを超える数の検出ウインドウ内の単一の事象についてのスペクトルを検出するように構成された１ないしは複数の検出器を含む。スペクトルは前述の通りのスペクトルを含む。また１ないしは複数の検出器は、検出されたスペクトルに応答する出力信号の生成も行うように構成される。このシステムはまた、出力信号の間の比を決定し、かつその比に異なる材料のいずれが関連付けされるかを決定するように構成されたプロセッサも含む。

Description

本発明は、類似のスペクトルを有する材料どうしを弁別する方法およびシステムに関する。特定の実施態様は、２もしくはそれを超える数の検出ウインドウ内の単一事象についてスペクトルを検出することによって生成される出力信号の間の比に、いずれの材料（１ないしは複数）が関連付けされるかを決定することを含む、コンピュータ実施方法に関する。

分光分析テクニックは、化学的・生物学的システムの分析に広く採用されている。もっとも頻繁には、これらのテクニックが関心材料による電磁波の吸収や放射を伴う。多くの場合は、吸収または放射をもっとも正確に測定するために、調査しているスペクトルの全関連部分のスキャンが遅いレートで行われる。しかしながら、考慮中のパラメータの質的または量的決定を行うためには、スペクトルの特定部分の検査を行えば足りる。この検査は、たとえば標本の数が比較的大きいか、標本を比較的迅速に分析しなければならないときに使用することができる。その種の情況においては、小さなスペクトルの「スナップショット」の使用が、処理され、分析される生データの量を抑えることによって標本のスループットを向上させることができる。

その種の応用の１つは、化学・生物学が組み合わさったアッセイ産業を含む非常に多くの学科によって利用されるテクノロジであるマイクロアレイの分野に見られる。ある会社、すなわちテキサス州オースチンのルミネックス・コープ（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ）は、種々に着色された蛍光微小球の表面上において生物学的アッセイが行われるシステムを開発した。その種のシステムの一例がチャンドラ（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）ほかに対する特許文献１に例示されており、当該特許については、ここに完全に示されているごとく参照によってこれに援用される。これらの微小球には、それらが比較的高速で流体フロー・デバイス内の検出ゾーンを通過するとき、それぞれの個別の微小球のレーザ励起と蛍光検出によって問い合わせが行われる。その種のシステムは、いくつかの明瞭かつ検出可能な信号を放出する各微小球を用いて、秒当たり数千の微小球の分析を行うことが可能である。数千ないしは数百万の微小球のそれぞれからの完全なスペクトルの獲得し、かつ信号を解釈しデコードすることは、管理不能な量のデータを生成することは明らかである。しかしながらチャンドラ（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）ほかによって述べられているシステムは、微小球からの全体的なスペクトル放射の比較的短い（たとえば約２０ｎｍから約４０ｎｍまで）の連続部分である特定の「ウインドウ」内の蛍光だけを検出することによってデータの管理を達成している。このようにこのシステムは、各微小球について完全な蛍光スペクトルを生成するのではなく、各ウインドウについて単一の値（信号の強度に相関する）のみを生成する。これらの値は、その後の分析のために容易にデータベースにエクスポートすることができる。

上記のシステムにおいては、蛍光染料が微小球に吸収されるか、かつ／または微小球の表面に結合される。染料は、選択されたウインドウの波長内の光を放射できることを基礎として選択される。またウインドウの間隔が開けられ、染料が、隣接するウインドウ内における染料の蛍光信号のオーバーラップが最小に、好ましくは排除されるように設計される。２つのウインドウを使用し、かつそれぞれ１０の異なる濃度において２つの染料を使用することによって、蛍光的に弁別可能な１００の微小球のセットが得られる。

アッセイの別の例が、フルワイラー（Ｆｕｌｗｙｌｅｒ）に対する特許文献２に例示されており、当該特許については、ここに完全に示されているごとく参照によってこれに援用される。特にフルワイラー（Ｆｕｌｗｙｌｅｒ）は、２またはそれを超える数のマーキング作用剤を用いた粒子のラベリングを含む細胞の複数の部分母集団を弁別する方法を述べている。これらの粒子は、それぞれの作用剤がゼロ・パーセントから１００パーセントまでの範囲にわたる作用剤のあらかじめ選択済みの種々の比でマークされる。その種の作用剤のそれぞれは、弁別可能かつ定量化可能なマーキング特性を有する。言い換えると、各蛍光色素は、特有の設計がなされたカラー・バンドにおいて明瞭な放射および／または励起スペクトルを有する。異なってラベル付けされた粒子が、その異なってラベル付けされた粒子のための特定のレセプタを有すると見られる細胞と混合される。各細胞が分析されて、各細胞と関連付けされた任意の２つの識別可能なマーキング特性の比が決定され、その結果、そのマーキング特性の比がマーキング作用剤のあらかじめ選択済みの比の１つに関係する場合には、それを部分母集団カテゴリ内に分類することが可能になる。したがってこの方法は、比を使用して、２つの染料のそれぞれからの信号を検出することによって、異なってラベル付けされた粒子を弁別する。

米国特許第５，９８１，１８０号 米国特許第４，７１７，６５５号 米国特許第５，７３６，３３０号 米国特許第６，０５７，１０７号 米国特許第６，２６８，２２２Ｂ１号 米国特許第６，４４９，５６２Ｂ１号 米国特許第６，５１４，２９５Ｂ１号 米国特許第６，５２４，７９３Ｂ１号 米国特許第６，５２８，１６５Ｂ２号 米国特許第６，５１４，２９５号 米国特許第６，０４６，８０７号 米国特許第６，１３９，８００号 米国特許第６，３６６，３５４号 米国特許第６，４１１，９０４号 米国特許第６，４４９，５６２号 米国特許第６，５２４，７９３号

上記のシステムまたは方法のいずれにおいても、弁別可能なセットの数を拡張できるいくつかの方法がある。光の散乱を基礎として弁別することができる異なるサイズの微小球の使用は、セットの数が実質的に倍増する。別の方法は、各染料について弁別可能な強度の数を増加させることである。たとえば、例示のケースでの１０ではなく、１５の異なる染料強度が可能であれば、２２５のセットが達成可能になる。第３の方法は、第３のウインドウを追加し、それに続いて第３の染料を追加、またはさらに追加することであり、これは指数関数的にセットの数が増加することになる。これらの方法のそれぞれは、テストに成功しており、種々の程度で使用されている。しかしながら、それぞれは幾重にも複雑性を追加し、それがプラットフォーム製造の費用または困難の大きな増加を招く可能性がある。

本発明は、概して、２またはそれを超える数の一意的であるが類似のスペクトルを弁別する方法に関する。特定の実施態様は、両方のスペクトルまたはすべてのスペクトルに共通の、２またはそれを超える数の異なる検出「ウインドウ」内の信号の検出を含む。ここで述べている方法は、これらの異なるスペクトル特性を呈する粒子の母集団の間の弁別に使用することができ、臨床生物学的アッセイを含む多数の分野において用途を見出すことになろう。

一実施態様は、２またはそれを超える数の検出ウインドウ内における単一の事象についてスペクトルを検出することによって生成される出力信号の間の比を決定することを含むコンピュータによって実施される方法に関する。ここで用いている「事象」と言う表現は、測定（１ないしは複数）を実行して意味のある情報を含む出力信号（１ないしは複数）をもたらすことの可能な標本または標本の部分として定義される。臨床生物学的アッセイの意味においては、事象を、流体フロー光学デバイス（たとえば、フロー血球計算器タイプの計測器）の測定ウインドウを通って流れる微小球、粒子、または細胞とすることができる。このほかにも表現「事象」を使用して記述できる標本または標本の部分が多数あることは自明であり、ここで使用する「事象」には可能なすべての代替物の包含が意図されている。

ここで使用している「検出ウインドウ」という表現は、概して、出力信号を生成することのできる波長または波長の範囲を言う。波長または波長の範囲は、材料の照明に使用される照明源の波長（１ないしは複数）および／または、材料によって放射、散乱、透過がなされる光を検出するように構成された検出器が検出可能な光の波長（１ないしは複数）によって決定することができる。しかしながらより一般的に述べれば、検出ウインドウの波長（１ないしは複数）は、弁別される材料やそれぞれのスペクトルに応じて多様となろう。たとえばスペクトルは異なる材料に特有である。それに加えて、好ましくは２またはそれを超える数の検出ウインドウのうちの少なくとも１つの中においてスペクトルの少なくとも一部がオーバーラップする。またこの方法は、異なる材料のうちのいずれがその比に関連付けされているかの決定も含む。いくつかの実施態様においては、この方法が、その比に関連付けされた異なる材料の濃度の決定も含む。

ある実施態様においては、２またはそれを超える数の検出ウインドウが、異なる材料の全体的なスペクトルの、異なる連続部分に延びる。それに加えて、出力信号のそれぞれが対応する検出ウインドウ内において検出されたスペクトルの強度に対応する単一の値を有することができる。

一実施態様においては、２またはそれを超える数の検出ウインドウが、異なる検出器の検出ウインドウを含む。代替実施態様においては、１つの検出器の異なる検出ウインドウを、２またはそれを超える数の検出ウインドウが含む。いくつかの実施態様においては、スペクトルが略同一波長においてピークを有する。それに代えて、スペクトルが、異なる波長においてピークを有してもよい。いずれの実施態様においても、２またはそれを超える数の検出ウインドウの１つを、当該２またはそれを超える数の検出ウインドウの別の検出ウインドウ内に完全に収めることができる。

スペクトルは、異なる材料による光の放射、吸収、または透過の結果として生成されることがある。一実施態様においては、スペクトルが異なる材料によって蛍光が放射された結果として生成される。別の実施態様においては、異なる材料が微小球に関連付けされた材料を含む。その種の実施態様においては、スペクトルが、それらの材料の異なる蛍光放射スペクトルを含む。追加の実施態様においては、異なる材料が溶液内に材料を含む。その種の実施態様においては、スペクトルが、それらの材料の異なる吸収、透過、または放射スペクトルを有する。さらに別の実施態様においては、スペクトルが溶液内の２またはそれを超える数の材料のスペクトルの組み合わせを含む。この実施態様においては、この方法が、溶液内の２またはそれを超える数の材料について個別の濃度または比の決定を含む。一実施態様においては、流体フロー光学デバイス（たとえば、フロー血球計算器タイプの計測器）によって出力信号を生成する。別の実施態様においては、スペクトル計テクニックによって出力信号が生成されるようにしてもよい。上に述べたこの方法の実施態様のそれぞれは、ここで述べている任意のほかのステップを含んでもよい。

追加の実施態様は、別のコンピュータによって実施される方法に関係する。この方法は、２またはそれを超える数の検出ウインドウ内における単一の事象についてスペクトルを検出することによって生成される出力信号の間の比を決定することを含む。スペクトルは、異なる材料に特有である。２またはそれを超える数の検出ウインドウの少なくとも１つにおいて、スペクトルの少なくとも一部がオーバーラップする。この方法はまた、その比と、それらの異なる材料の個別の材料の実質的に純粋な標本についての既知の比を比較することによって１ないしは複数の異なる材料の濃度を決定することを含む。一実施態様においては、異なる材料が混合される。別の実施態様においては、実質的に同時にスペクトルが検出される。

一実施態様においては、２またはそれを超える数の検出ウインドウが、異なる検出器の検出ウインドウを含む。別の実施態様においては、１つの検出器の異なる検出ウインドウを、２またはそれを超える数の検出ウインドウが含む。２またはそれを超える数の検出ウインドウは、異なる材料の全体的なスペクトルの、異なる連続部分に延びる。いくつかの実施態様においては、スペクトルが略同一波長においてピークを有する。別の実施態様においては、スペクトルが異なる波長においてピークを有する。追加の実施態様においては、２またはそれを超える数の検出ウインドウの１つを、当該２またはそれを超える数の検出ウインドウの別の検出ウインドウ内に完全に収めることができる。

ある実施態様においては、スペクトルが、異なる材料による蛍光放射の結果として生成される。それに代えて、異なる材料による光の放射、吸収、または透過の結果としてスペクトルが生成されるようにしてもよい。一実施態様においては、異なる材料が微小球に関連付けされた材料を含み、スペクトルが、それらの材料の異なる蛍光放射スペクトルを含む。別の実施態様においては、異なる材料が溶液内に材料を含み、スペクトルは、それの材料の異なった吸収、透過、または放射スペクトルを有する。

いくつかの実施態様においては、出力信号のいくつかが、対応する検出ウインドウ内において検出されたスペクトルの強度に対応する単一の値を有する。一実施態様においては、それらの出力信号が流体フロー光学デバイスによって生成される。別の実施態様においては、これらの出力信号は分光分析テクニックによって生成される。上に述べたこの方法の実施態様のそれぞれは、ここで述べている任意のほかのステップを含むこともできる。

別の実施態様は、２またはそれを超える数の検出ウインドウ内における単一の事象についてスペクトルを検出することによって生成される出力信号の間の比を決定することを含む、コンピュータによって実施される別の方法に関係する。２またはそれを超える数の検出ウインドウの少なくとも１つにおいて、スペクトルの少なくとも一部がオーバーラップする。またこの方法は、その比からスペクトルの間を弁別することを含む。この方法は、ここで述べている任意のほかのステップを含むこともできる。

ここで述べている方法は、２またはそれを超える数の、異なっているが類似したスペクトルを互いに弁別する正確な方法を好適に提供する。したがって、この方法を使用して、前述したような類似のスペクトルを有する異なる材料の間を弁別することができる。そのため、ここで述べている方法を使用して類似のスペクトルを有する染料材料を互いに弁別できることから、この方法は、測定方法に使用可能な染料材料の数を増加することになる。ここで述べている方法とシステムの追加の利点は、以下の詳細な説明によって明白なものとなろう。

追加の実施態様は、１ないしは複数の検出器およびプロセッサを含むシステムに関する。１ないしは複数の検出器は、２またはそれを超える数の検出ウインドウ内の単一の事象についてスペクトルを検出するように構成される。スペクトルは、異なる材料に特有である。２またはそれを超える数の検出ウインドウの少なくとも１つにおいて、スペクトルの少なくとも一部がオーバーラップする。また１ないしは複数の検出器は、検出されたスペクトルに応答して出力信号を生成するように構成される。プロセッサは、出力信号の間の比を決定するように構成される。またこのプロセッサは、異なる材料のいずれがその比に関連付けされるかを決定するように構成される。一実施態様においては、プロセッサがさらに、その比に関連付けされる異なる材料の濃度を決定するように構成される。

２またはそれを超える数の検出ウインドウは、異なる材料の全体的なスペクトルの、異なる連続部分に延びる。一実施態様においては、２またはそれを超える数の検出ウインドウの１つを、当該２またはそれを超える数の検出ウインドウの別の検出ウインドウ内に完全に収めることができる。それに加えて、出力信号のそれぞれは、対応する検出ウインドウ内において検出されたスペクトルの強度に対応する単一の値を有することができる。

一実施態様においては、２またはそれを超える数の検出ウインドウが、異なる検出器の検出ウインドウを含む。別の実施態様においては、１つの検出器の異なる検出ウインドウを、２またはそれを超える数の検出ウインドウが含む。いくつかの実施態様においては、スペクトルが略同一波長においてピークを有する。別の実施態様においては、スペクトルが異なる波長においてピークを有する。

スペクトルは、異なる材料による光の放射、吸収、または透過の結果として生成される。一実施態様においては、スペクトルが異なる材料によって蛍光が放射された結果として生成される。別の実施態様においては、異なる材料が微小球に関連付けされた材料を含む。その種の実施態様の１つにおいては、スペクトルが、それらの材料の異なる蛍光放射スペクトルを含む。一実施態様においては、システムが流体フロー光学デバイスとして構成される。別の実施態様においては、システムが分光分析テクニックを実行するように構成される。さらにこのシステムは、ここで述べるように構成することができる。

本発明のこのほかの目的ならびに利点については、以下の詳細な説明を読み、添付図面を参照することによって明らかなものとなろう。

本発明には、種々の修正および変形が可能であるが、図面内の例によって示されるその特定の実施態様をここで詳細に説明する。しかしながら、図面とそれに対する詳細な説明には、開示された特定の形式に本発明を限定することが意図されているのではなく、それとは逆に、付随する特許請求の範囲によって定義されるとおりの本発明の精神と範囲に含まれるすべての修正、等価、代替が保護される意図であることを理解する必要がある。

以下の説明は、概してスペクトルを解釈するテクニックについて述べていることに注意すべきである。以下の説明は、概して、そのコンセプトの応用の例として、流体フロー光学デバイス内の蛍光と蛍光微小球を使用する。しかしながら、ここで提供する例が、このテクニックの使用に限定されることは意図していない。たとえば、当業者には自明となろうが、これは、蛍光、粒子、あるいは流体フロー・デバイスに限定されない一般的な分光分析テクニックである。適切な微小球、ビーズ、粒子の例は、フルトン（Ｆｕｌｔｏｎ）に対する特許文献３、チャンドラ（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）ほかに対する特許文献１、フルトン（Ｆｕｌｔｏｎ）に対する特許文献４、チャンドラ（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）ほかに対する特許文献５、チャンドラ（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）ほかに対する特許文献６、チャンドラ（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）ほかに対する特許文献７、チャンドラ（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）ほかに対する特許文献８、チャンドラ（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）に対する特許文献９に例示されており、これらの特許文献については、ここに完全に示されているごとく参照によってこれに援用される。ここで述べる方法は、これらの特許の中で述べられている微小球、ビーズ、粒子のいずれとともにでも使用することができる。それに加えて、フロー血球計算器内における使用のための微小球は、テキサス州オースチンのルミネックス・コープ（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ）等の製造者から獲得することができる。

このほかの、測定パラメータがある範囲にわたって再現可能な分布を示す分光分析テクニック、たとえば赤外線、紫外線／可視光（ＵＶ／Ｖｉｓ）、ラマン、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、放射線等も使用することができる。また、検出可能なパラメータを、放射、吸収、透過等とすることができる。信号の検出は、限定する意図ではないが、光電子増倍管、アバランシェ・フォトダイオード、電荷結合デバイス、ピン・ダイオード等を含む任意の適切なデバイスによって達成することができる。粒子に加えて、媒体を、ここで述べているとおりの信号タイプが観察される固体、液体、気体、またはそのほかの形式とすることができる。

伝統的な分光分析法、たとえば蛍光分光分析法においては、ソースまたは検出器の波長が、検査する材料について連続するスペクトルを生成する波長の範囲にわたって変更される。代替方法は、材料の特性が既知であるが、その存在または濃度の検出が望まれているとき、励起と検出波長を一定に維持し、結果の信号を記録する。この手順は、特定の状態に帰属する信号についての単一の値を生成する。しかしながらこの分析方法の弱点は、類似の材料もまた、その完全なスペクトルが明白に異なる場合であってもモニタされるスペクトル「ウインドウ」内において信号を示すことである。

スペクトル・ウインドウ内において類似となり得る信号の例を、ローダミンＢとローダミン６Ｇによって放出される蛍光信号とすることができる。前者は、５４３ｎｍにおいて、後者は５２４ｎｍにおいてピーク放出を有する。検出ウインドウが５２０ｎｍから５５０ｎｍまでのスペクトル範囲をモニタするようにセットされている場合には、適切な波長において励起されたときにこれら両方の染料が顕著な信号を示すことになる。いずれの染料が観察されているかが既知であれば、観察された信号を基礎として溶液内の染料の濃度を決定することが可能になる。しかしながらシステム内にいずれの染料があるかわからない場合には、この信号がそれらの間を弁別する方法を提供しないことになる。この決定を行うためには、さらに追加のスペクトル情報が必要になる。

追加の検出ウインドウの使用は、２つの類似するスペクトルの間の弁別を可能にする。前述したとおり、検出ウインドウは、異なる材料の全体的なスペクトルの、異なる連続部分に延びる。しかしながら、以前の方法やシステムとは異なり、ここで述べている方法とシステムにおいては、複数の材料のスペクトルが、２またはそれを超える数の検出ウインドウの少なくとも１つにおいてオーバーラップする。たとえば、前述の例に戻って参照すると、約５５０ｎｍから約５６０ｎｍまでのスペクトルを検出するように構成された追加の検出ウインドウは、それらの染料の間を弁別する充分な情報を提供し、したがって濃度の決定を可能にする。各染料が広い信号を放出することから、それぞれは、この新しいウインドウ内にその信号の部分を有することになる。第２のウインドウ（５５０ｎｍ〜５６０ｎｍ）対第１のウインドウ（５２０ｎｍ〜５５０ｎｍ）の信号の比Ｒを計算することにより、ローダミンＢについての比Ｒが、ローダミン６Ｇについての比Ｒより大きいことが示されることになる。重要なことは、特定の染料について観察される比が、染料濃度の広い範囲にわたってある意味で一定となることである。このテクニックの有用性は、染料のスペクトルが充分に異なり、観察される比が濃度の有効範囲にわたって一定して弁別可能であることを要求する。

したがって、概して言えば、異なる材料に特有であるスペクトルの少なくとも一部が、２またはそれを超える数の検出ウインドウの少なくとも１つ内において好ましくオーバーラップする。それらの検出ウインドウについての出力信号は、対応する検出ウインドウ内において検出されたスペクトルの強度に対応する単一の値を持つ。この方法においては、２またはそれを超える数の検出ウインドウ内の単一の事象についてスペクトルを検出することによって生成された出力信号の間の比を使用して、異なる材料のいずれがその比に関連付けされるかを決定することができる。これらの出力信号は、ここで述べているような流体フロー光学デバイスによって生成することができる。それに代えて、この分野に周知の任意のテクニックを含む分光分析テクニックによって出力信号を生成してもよい。

それに加えて、このシステムが２つの染料（またはほかの吸収または放射材料）の間だけの弁別に限定されないことに注意することが重要である。２つのウインドウのセットによって弁別可能になる染料の数は、染料の適切な選択とともにウインドウの位置と幅の最適化によって拡張することが可能である。観察される信号の間において一意的な比を生成できることは、異なるスペクトル放射の識別を提供する。また、各染料が一意的な比を生成することになるため、あるウインドウからの一方の染料についての信号が、他方の染料がこのウインドウ内においてゼロを超える信号を有する限り、ゼロとなることが許される。同様に、ここで述べている方法は、２つの信号検出ウインドウに限定されない。改良されたスペクトル弁別は、追加のウインドウの使用を通じて達成できるが、追加のウインドウは、操作されるデータの量を増加することになる。それに加えて検出ウインドウのサイズは、例として与えたものと実質的に異なることが許される。たとえば、検出ウインドウのサイズは、検出システムの効率によってのみ限定され、範囲を決め、その範囲内における信号を再現可能に測定する。

また、２またはそれを超える数のスペクトルが、それぞれのピーク（たとえばピーク強度）についてオフセットできる、またはできないということへの注意も重要である。たとえば、２つの蛍光染料の放射スペクトルが、概略で同一の波長においてピークを呈するが、一方の幅が他方より大きい場合には、スペクトルにおけるそれらの差が、結果として２つの検出ウインドウ内の信号間における強度の一意的な差をもたらすことがある。これらの、およびそのほかの実施形態においては、２またはそれを超える数の検出ウインドウの１つが、当該２またはそれを超える数の検出ウインドウの別の検出ウインドウ内に、完全に入ることもあれば、入らないこともある。

別の例は、ここで述べている方法の応用を例示している。前述した蛍光染料微小球の場合において、１００のスペクトル的に明瞭な微小球のセットを、スペクトルのオーバーラップが最小の２つの異なる蛍光染料（ここではＡおよびＢと示す）を用いて微小球の母集団に着色することによって生成することができる。その種の１つの例がチャンドラ（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）ほかに対する特許文献１０に例示されており、当該特許文献については、ここに完全に示されているごとく参照によってこれに援用される。染料の溶液が、２つの染料のそれぞれの、１０の異なる濃度において準備される場合には、１００の明瞭な着色溶液と、１００の蛍光的に明瞭な微小球の母集団を作ることができる。これらの一意的な微小球は、フロー血球計算器、またはそのほかの、個別の微小球または微小球のグループのスペクトル的な問い合わせを行うことのできるデバイスを使用してスペクトル的に弁別することができる。

微小球は、狭い波長帯のウインドウ内において（たとえば、ここではウインドウ１、ウインドウ２とする２つのウインドウ内において）放射信号を検出することによってスペクトル的に弁別することができる。さらに、ウインドウ１は、染料Ａからの信号を効率的に検出するように選択され、ウインドウ２は染料Ｂからの放射に対応するように選択される。スペクトル的にウインドウ２と近い第３のウインドウ（つまりウインドウ３）が追加される場合には、ウインドウ２、３によって検出可能であり、結果としてウインドウ２と３の間に一意的な比をもたらす信号を放出することになる第３の染料（染料Ｂ’）を選択することができる。その場合、１０の異なる濃度の、染料ＡとＢ’のそれぞれを使用して１００の新しい染料の溶液を作り、１００の新しい蛍光微小球の母集団を作ることができる。ウインドウ２、３からの信号の間に一意的な比を生成することができる別の染料（染料Ｂ”）の追加が、染料Ａ、Ｂ”を使用する追加の１００の一意的なビーズの母集団の構成を可能にすることは容易に理解できるであろう。追加の母集団は、一意的な比を生成する染料を見つけることが可能である限り、類似の態様で生成することが可能である。さらに、スペクトル的にウインドウ１と近い別のウインドウ（ウインドウ４）が追加される場合には、染料Ｂ、Ｂ’、Ｂ”等と組み合わされる新しい染料（染料Ａ‘、Ａ”等）を使用して類似の系列を構成し、一意的な蛍光微小球のセットの可能数を大きく広げることができる。

別の実施形態においては、コンパウンドの混合が存在するときに観察できるような、実質的に同時に決定されるオーバーラップするスペクトルの逆コンボリューションにこの方法を使用することができる。たとえば、微小球に取り付けられる材料は、前述したとおりに弁別することができる。その種の１つの実施形態においては、この方法が、異なる材料の１ないしは複数の濃度を、その比と、それらの異なる材料を構成すると推測される個別の材料の純粋な標本についての既知の比を比較することによって決定することを含む。しかしながら濃度を、この分野で周知のほかの任意の方法を使用してその比から決定してもよい。この態様においては、この方法を、ビーズの表面上において２またはそれを超える数の染料を使用するマルチ‐レポータ・アッセイにおける微小球の識別に使用することができ、その際、決定された染料の濃度が微小球のアイデンティティの決定に使用される。その種の材料には、たとえば、何らかの方法で核酸、酵素、抗原等に取り付けられる蛍光剤も含まれる。別の例は、各染料の濃度または濃度比の検出または決定が望まれている２またはそれを超える数の染料の溶液となろう。特に、そのスペクトルは、溶液内の異なる材料のスペクトルを含む。その種の実施形態においては、スペクトルが、それらの材料の異なる吸収、透過、または放射スペクトルを含む。それに加えて、スペクトルは、溶液内の２またはそれを超える数の材料のスペクトルの組み合わせを含んでもよい。またこの方法は、溶液内の２またはそれを超える数の材料についての個別の濃度または比の決定をも含んでもよい。

上記のような例においては、蛍光染料を例として用いると、染料Ａが、それ自体で２つの検出ウインドウの間において１の比をもたらし、染料Ｂが、それ自体で１００の比をもたらすとすれば、２つの染料の混合は、１と１００の間の比をもたらすことになる。さらに、その混合が、支配的に染料Ａからなるとすれば、観察される比が１により近づくことになり、より多くの染料Ｂが存在する場合には、１００により近づくことになる。したがって、その比は、染料の混合の組成と相関し、その結果、特定の比に対して、各染料の寄与に起因する観察される信号の母集団の計算が可能になる。これは、各染料に帰属する信号の部分が既知であり、染料の濃度に対する信号の相関が既知であるとき、それにより２つの染料の濃度を同時に決定することができるということに従う。染料間の相互干渉から、クエンチングとそのほかのエネルギ伝達現象等の複雑な問題が生じることがあるが、これらは、染料濃度の既知の組み合わせを使用する標準曲線の構成によって説明することが可能である。３またはそれを超える数のオーバーラップする染料の分析の複雑性は、著しく増加することがあるが、可能性としていくつかの可能解を生じさせる。しかしながら、別の手段を通じて不正確な解の排除が可能になることもある。

図１は、ここで述べている方法の実施に使用することのできる測定システムの一例を例示している。ここで注意する必要があるが、図１は縮尺を考慮して描かれていない。特に、図の要素のいくつかの縮尺は、それらの要素の特性を強調するために著しく誇張されている。

図１においては、測定システムが、微小球１０が流れるキュベット１２の断面を通る面に沿って描かれている。一実施形態においては、キュベットが、フロー血球計算器に使用されているような標準的な水晶キュベットである。しかしながら、このほかの任意の適切なタイプの目視または搬送チャンバを使用して、分析のための標本を搬送することもできる。測定システムは光源１４を含む。光源１４は、この分野で周知の任意の適切な、レーザ等の光源を含むことができる。光源は、ブルー光またはグリーン光といった１ないしは複数の波長を有する光を放出するように構成してもよい。光源１４は、微小球がキュベットを通って流れるとき、それらを照明するように構成するこの照明は、微小球に、１ないしは複数の波長または波長帯を有する蛍光を放射させる。いくつかの実施形態においては、システムは、光源から微小球またはフローパス上に光を集束させるように構成された１ないしは複数のレンズ（図示せず）を含む。またシステムは、１を超える数の光源を含むこともできる。一実施形態においては、異なる波長（たとえば、ブルー光とグリーン光）を有する光を用いて微小球を照明するように光源を構成してもよい。いくつかの実施形態においては、光源を、異なる方向から微小球を照明するように構成してもよい。

微小球から前方に散乱された光は、折り曲げミラー１８によって、あるいはそのほかの光指向コンポーネントによって検出システム１６に向ける。それに代えて、検出システム１６を、前方に散乱される光のパス内に直接配置してもよい。この態様では、折り曲げミラーまたはそのほかの光指向コンポーネント（１ないしは複数）をシステム内に含めなくてもよい。一実施形態においては、前方に散乱される光を、図１に示されているとおり、光源１４による照明方向から約１８０度の角度で微小球によって散乱される光とすることができる。前方に散乱される光の角度は、光源による照明の方向から正確に１８０度でなくてよく、したがって光源からの入射光が、検出システムの感光表面に入射しなくてもよい。たとえば、前方に散乱される光が、照明の方向から１８０度より小さい角度、またはそれより大きい角度で微小球によって散乱される光（たとえば、約１７０度、約１７５度、約１８５度、または約１９０度の角度で散乱される光）であってもよい。

光源による照明の方向から約９０度の角度で微小球によって散乱および／または放射がなされる光を収集することもできる。一実施形態においては、この散乱光を、１ないしは複数のビームスプリッタまたはダイクロイック・ミラーによって１を超える数の光ビームに分割することができる。たとえば、照明の方向に対して約９０度の角度で散乱される光を、ビームスプリッタ２０によって２つの異なる光ビームに分割することができる。２つの異なる光ビームは、ビームスプリッタ２２、２４によって再び分割されて、４つの異なる光ビームを作ることができる。これらの光ビームのそれぞれは、それぞれが１ないしは複数の検出器を含む異なる検出システムに向けることができる。たとえば、４つの光ビームの１つを検出システム２６に向けることができる。検出システム２６は、微小球によって散乱された光を検出するように構成してもよい。

残り３つの光ビームは、検出システム２８、３０、３２に向けられる。検出システム２８、３０、３２は微小球によって放出される蛍光を検出するように構成されている。それぞれの検出システムは、異なる波長または異なる波長の範囲の蛍光を検出するように構成してもよい。たとえば、検出システムの１つをグリーンの蛍光を検出するように構成してもよい。別の検出システムをイエロ‐オレンジの蛍光の検出、さらに別の検出システムをレッドの蛍光の検出を行うように構成することができる。別の例においては、異なる検出器が異なる検出ウインドウを有することができ、その少なくとも１つにおいては、詳しくは前述したとおり、異なる材料のスペクトルの少なくとも一部がオーバーラップする。別の実施形態においては、検出器の１つが異なる検出ウインドウを有することができ、その１つにおいて、異なる材料のスペクトルの少なくとも一部がオーバーラップする。複数の検出ウインドウを有することのできる検出器の一例は、マルチ‐アノード光電子増倍管であり、それにおいては各アノードを異なる検出ウインドウとして使用することができる。

いくつかの実施形態においては、検出システム２８、３０、３２に、それぞれスペクトル・フィルタ３４、３６、３８を結合させることができる。これらのスペクトル・フィルタは、それぞれの検出システムが検出するように構成された波長を除く波長の蛍光を遮断するように構成される。それに加えて、１ないしは複数のレンズ（図示せず）を検出システムのそれぞれと光学的に結合させることができる。これらのレンズは、散乱された光または放出された蛍光を検出器の感光表面に集束するように構成される。

検出器の出力電流は、それに入射した蛍光に比例し、電流パルスとなる。この電流パルスを電圧パルスに変換し、ロー・パス・フィルタリングを行い、その後、Ａ／Ｄコンバータ（図示せず）によってディジタル化する。ＤＳＰ等のプロセッサ４０が、パルスの下の面積を積分し、蛍光の大きさを表す値を生成する。それに加えてプロセッサは、ここで述べている追加の機能（たとえば、出力信号の間の比を決定し、異なる材料のうちのいずれがその比に関連付けされるかを決定すること）を実行することもできる。図１に示されているとおり、プロセッサ４０は、伝達媒体４２を介して検出システム２６に結合されている。プロセッサ４０を、伝達媒体４２および１ないしは複数のそのほかのコンポーネント（図示せず）、たとえばＡ／Ｄコンバータを介して間接的に検出システム２６に結合してもよい。類似の態様において、システム内のほかの検出器とプロセッサを結合することができる。

いくつかの実施形態においては、微小球によって放出された蛍光から生成される出力信号が処理されて、微小球のアイデンティティとその微小球の表面上において行われる反応についての情報が決定される。たとえば、微小球のアイデンティティの決定に、これらの検出器のうちの２つからの出力信号を使用し、微小球の表面上において行われる反応の決定に別の出力信号を使用することができる。微小球のアイデンティティは、２またはそれを超える数の検出ウインドウ内において生成された出力信号の比を基礎として決定することができる。たとえば、検出システム３０、３２が異なる検出ウインドウを有している場合には、微小球のアイデンティティを、それぞれの検出システムによって生成される出力信号の強度と結合させる、検出システム３０によって生成された出力信号に対する、検出システム３２によって生成された出力信号の比から決定することができる。したがって、検出器とスペクトル・フィルタの選択を、微小球に組み込まれるか、または結合される染料、および／または測定される反応（つまり、その反応に関係する反応体に組み込まれるか結合される染料（１ないしは複数））のタイプに応じて変更することができる。

特定の例においては、検出器および／またはスペクトル・フィルタの選択が、微小球に組み込まれるか、または結合される染料のピーク放射に依存することができる。たとえば、前述したとおりローダミンＢは５４３ｎｍにピーク放射を有しており、ローダミン６Ｇは５２４ｎｍにピーク放射を有している。微小球が、それらの一方または両方を用いて着色される場合には、検出システム３０を、約５２０ｎｍから約５５０ｎｍまでの波長範囲に入る光を検出するように構成すればよい。それに加えて検出システム３２を、約５５０ｎｍから約５６０ｎｍまでの波長範囲に入る光を検出するように構成してもよい。

別の例においては、上述したように、２つの蛍光染料の放射スペクトルがオフセットされず、略同一の波長においてピーク放射を示すことができる。この種の例においては、それらのピーク放射の一方または両方に関する放射スペクトルの特性が異なる。その場合、放射スペクトルが、２つの検出ウインドウの間において強度の一意的な比を有する。したがって一実施形態においては、検出システム３０、３２が異なる検出ウインドウを有しているが、一方の検出システムの検出ウインドウが他方の検出システムの検出ウインドウ内に完全に、または部分的に含まれる。たとえば、２つの染料のピーク放射が約５４０ｎｍにある場合、検出システム３０の検出ウインドウは約５３０ｎｍから５５０ｎｍまでの波長範囲を有し、検出システム３２の検出ウインドウは約５１０ｎｍから５７０ｎｍまでの波長範囲を有することができる。ここで注意する必要があるが、上記の波長範囲は例示に過ぎず、たとえば微小球の染料に応じて変化することになる。

図１のシステムは、異なる染料特性を有する微小球の間を弁別するための２つの異なる検出ウインドウを有する２つの検出システムを含んで示されているが、ここで理解されるとおり、このシステムは、２を超える数のその種の検出ウインドウ（つまり、３つの検出ウインドウ、４つの検出ウインドウ等）を含むことができる。その種の実施形態においては、システムが追加のビームスプリッタと、追加の、別の検出ウインドウを有する検出システムを含むことができる。２を超える数の検出システムのための検出ウインドウは、前述したとおりに決定することができる。それに加えて、スペクトル・フィルタおよび／またはレンズを、それぞれの追加の検出システムに結合することができる。

別の実施形態においては、システムが、微小球の表面において反応される異なる材料の間を弁別するように構成された２またはそれを超える数の検出システムを含むことができる。これらの異なる反応体材料は、微小球の染料特性と異なる染料特性を有することができる。しかしながら、反応体材料は、類似の放射スペクトルを有するような染料特性を有することができる。たとえば反応体材料の放射スペクトルは、オーバーラップすることができる。一実施形態においては、放射スペクトルがオフセットされたピーク放射を有することがあるが、１ないしは複数の同一波長において強い信号を示すこともできる。別の実施形態においては、放射スペクトルが略同一のピーク放射を有するが、ピーク放射の片側または両側において異なる特性を有することができる。したがって、放射スペクトルと反応体材料を、前述したとおりに弁別することができる。

ここで述べている方法を実施するために使用することのできる測定システムの追加の例が、チャンドラ（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）ほかに対する特許文献１、チャンドラ（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）に対する特許文献１１、チャンドラ（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）に対する特許文献１２、チャンドラ（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）に対する特許文献１３、チャンドラ（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）に対する特許文献１４、チャンドラ（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）ほかに対する特許文献１５、およびチャンドラ（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）ほかに対する特許文献１６の中に例示されており、これらの特許文献については、ここに完全に示されているごとく参照によってこれに援用される。これらの特許の中で述べられている測定システムは、前述したとおりの検出ウインドウを有するように構成してもよい。さらに、ここで述べている測定システムを、それらの特許の中で述べられているとおりに構成することもできる。

ここで述べたような方法を具体化するプログラム命令は、キャリア媒体を介して送信し、あるいはそれにストアすることができる。キャリア媒体は、有線、ケーブル、またはワイヤレス送信リンク等の送信媒体、あるいは有線、ケーブル、またはリンクに沿って伝播する信号とすることができる。またキャリア媒体は、読み出し専用メモリ、ランダム・アクセス・メモリ、磁気または光学ディスク、または磁気テープ等のストレージ媒体とすることもできる。

ある実施形態においては、図１のプロセッサ４０等のプロセッサは、前述の実施形態に従いコンピュータによって実施される方法を具体化するプログラム命令を実行するように構成される。プロセッサは、種々の形式を取ることができ、それにはＤＳＰ、パーソナル・コンピュータ・システム、メイン・フレーム・コンピュータ・システム、ワークステーション、ネットワーク・アプライアンス、インターネット・アプライアンス、携帯情報端末（「ＰＤＡ」）、テレビジョン・システム、あるいはそのほかのデバイスを含むことができる。概して、「コンピュータ・システム」という用語は、メモリ媒体から命令を実行する１ないしは複数のプロセッサを有する任意のデバイスを包含するとして広く定義することができる。

プログラム命令は、とりわけプロシージャ‐ベースのテクニック、コンポーネント‐ベースのテクニック、および／またはオブジェクト指向テクニックが含まれる種々の方法のいずれにおいても具体化することができる。たとえば、アクティブＸ（ＡｃｔｉｖｅＸ）コントロール、Ｃ＋＋オブジェクト、ジャバビーンズ（ＪａｖａＢｅａｎｓ）、マイクロソフト・ファウンデーション・クラス（「ＭＦＣ」）、あるいはそのほかのテクノロジまたは方法を使用し、希望に応じてプログラム命令を具体化することができる。

この開示の恩典を受ける当業者であれば認識することになろうが、本発明は、類似の吸収、透過、または放射のスペクトルの間を弁別する方法を提供する。本発明の種々の側面の実施形態の追加の修正や変形は、この記述に照らせば当業者に明白であろう。したがって、この記述は、本発明を実施する一般的な方法を当業者に教示することを目的とした例示としてのみ解釈されるべきである。ここに示し、説明した本発明の形式は、現在のところ好ましい実施形態として取り上げられていることを理解する必要がある。ここで例示し、述べられている要素ならびに材料が置換され、部品ならびにプロセスが転換され、本発明の特定の特徴が独立に使用されるといったことは許され、それらすべては、本発明のこの記述の恩典を受ける当業者には自明であろう。付随する特許請求の範囲に記述されているとおりの本発明の精神ならびに範囲から逸脱することなしに、ここに記述されている要素内における変更を行うことができる。

ここで述べている方法の実施に使用することのできるシステムの一例を例示した概略図である。

Claims (47)

1. ２またはそれを超える数の検出ウインドウ内の単一の事象についてのスペクトルを検出することによって生成される出力信号の間の比を決定することであって、前記スペクトルが異なる材料に特有であり、前記２またはそれを超える数の検出ウインドウの少なくとも１つにおいて前記スペクトルの少なくとも一部がオーバーラップする、前記決定することと、
   前記異なる材料のいずれが、前記比に関連付けされるかを決定すること、
   を含むコンピュータによって実施される方法。
2. 前記２またはそれを超える数の検出ウインドウは、異なる検出器の検出ウインドウを含む請求項１に記載の方法。
3. 前記２またはそれを超える数の検出ウインドウは、１つの検出器の異なる検出ウインドウを含む請求項１に記載の方法。
4. 前記スペクトルは、略同一の波長においてピークを有する請求項１に記載の方法。
5. 前記スペクトルは、異なる波長においてピークを有する請求項１に記載の方法。
6. 前記スペクトルは、前記異なる材料によって蛍光が放射される結果として生成される請求項１に記載の方法。
7. 前記２またはそれを超える数の検出ウインドウは、前記異なる材料の全体的なスペクトルの異なる連続部分に広がる請求項１に記載の方法。
8. 前記出力信号のそれぞれは、対応する検出ウインドウ内において検出される前記スペクトルの強度に対応する単一の値を有する請求項１に記載の方法。
9. 前記２またはそれを超える数の検出ウインドウのうちの１つは、前記２またはそれを超える数の検出ウインドウのうちの別の検出ウインドウの中に完全に収まる請求項１に記載の方法。
10. 前記異なる材料は、微小球に関連付けされる材料を含み、前記スペクトルは、前記材料の異なる蛍光放射スペクトルを含む請求項１に記載の方法。
11. 前記異なる材料は溶液内の材料を含み、前記スペクトルは、前記材料の異なる吸収、透過、または放射のスペクトルを含む請求項１に記載の方法。
12. 前記スペクトルは、溶液内の２またはそれを超える数の前記材料のスペクトルの組み合わせを含み、前記方法は、さらに、溶液内の前記２またはそれを超える数の材料について個別の濃度または比を決定することを含む請求項１１に記載の方法。
13. 前記出力信号は、流体フロー光学デバイスによって生成される請求項１に記載の方法。
14. 前記出力信号は、分光分析テクニックによって生成される請求項１に記載の方法。
15. 前記スペクトルは、前記異なる材料による光の放出、吸収、または透過の結果として生成される請求項１に記載の方法。
16. さらに、前記比に関連付けされる前記異なる材料の濃度を決定することを含む請求項１に記載の方法。
17. ２またはそれを超える数の検出ウインドウ内の単一の事象についてのスペクトルを検出することによって生成される出力信号の間の比を決定することであって、前記スペクトルが異なる材料に特有であり、前記２またはそれを超える数の検出ウインドウの少なくとも１つにおいて前記スペクトルの少なくとも一部がオーバーラップする、前記決定することと、
    前記比と、前記異なる材料の個別の材料の実質的に純粋な標本についての既知の比を比較することによって前記異なる材料のうちの１ないしは複数の濃度を決定すること、
    を含むコンピュータによって実施される方法。
18. 前記異なる材料は混合される請求項１７に記載の方法。
19. 前記スペクトルは実質的に同時に検出される請求項１７に記載の方法。
20. 前記２またはそれを超える数の検出ウインドウは、異なる検出器の検出ウインドウを含む請求項１７に記載の方法。
21. 前記２またはそれを超える数の検出ウインドウは、１つの検出器の異なる検出ウインドウを含む請求項１７に記載の方法。
22. 前記スペクトルは、略同一の波長においてピークを有する請求項１７に記載の方法。
23. 前記スペクトルは、異なる波長においてピークを有する請求項１７に記載の方法。
24. 前記スペクトルは、前記異なる材料によって蛍光が放射される結果として生成される請求項１７に記載の方法。
25. 前記２またはそれを超える数の検出ウインドウは、前記異なる材料の全体的なスペクトルの異なる連続部分に広がる請求項１７に記載の方法。
26. 前記出力信号のそれぞれは、対応する検出ウインドウ内において検出される前記スペクトルの強度に対応する単一の値を有する請求項１７に記載の方法。
27. 前記２またはそれを超える数の検出ウインドウのうちの１つは、前記２またはそれを超える数の検出ウインドウのうちの別の検出ウインドウの中に完全に収まる請求項１７に記載の方法。
28. 前記異なる材料は、微小球に関連付けされる材料を含み、前記スペクトルは、前記材料の異なる蛍光放射スペクトルを含む請求項１７に記載の方法。
29. 前記異なる材料は溶液内の材料を含み、前記スペクトルは、前記材料の異なる吸収、透過、または放射のスペクトルを含む請求項１７に記載の方法。
30. 前記出力信号は、流体フロー光学デバイスによって生成される請求項１７に記載の方法。
31. 前記出力信号は、分光分析テクニックによって生成される請求項１７に記載の方法。
32. 前記スペクトルは、前記異なる材料による光の放出、吸収、または透過の結果として生成される請求項１７に記載の方法。
33. ２またはそれを超える数の検出ウインドウ内の単一の事象についてのスペクトルを検出することによって生成される出力信号の間の比を決定することであって、前記２またはそれを超える数の検出ウインドウの少なくとも１つにおいて前記スペクトルの少なくとも一部がオーバーラップする、前記決定すること、
    前記比から前記スペクトルの間を弁別すること、
    を含む、コンピュータによって実施される方法。
34. ２またはそれを超える数の検出ウインドウ内の単一の事象についてのスペクトルを検出するように構成された１ないしは複数の検出器であって、前記スペクトルが異なる材料に特有であり、かつ前記２またはそれを超える数の検出ウインドウの少なくとも１つにおいて前記スペクトルの少なくとも一部がオーバーラップし、さらに、前記検出されたスペクトルに応答して出力信号を生成するように構成された、前記１ないしは複数の検出器と、
    前記出力信号の間の比を決定し、かつ前記異なる材料のいずれが、前記比に関連付けされるかを決定するように構成されたプロセッサと、
    を含むシステム。
35. 前記２またはそれを超える数の検出ウインドウは、異なる検出器の検出ウインドウを含む請求項３４に記載のシステム。
36. 前記２またはそれを超える数の検出ウインドウは、１つの検出器の異なる検出ウインドウを含む請求項３４に記載のシステム。
37. 前記スペクトルは、略同一の波長においてピークを有する請求項３４に記載のシステム。
38. 前記スペクトルは、異なる波長においてピークを有する請求項３４に記載のシステム。
39. 前記スペクトルは、前記異なる材料によって蛍光が放射される結果として生成される請求項３４に記載のシステム。
40. 前記２またはそれを超える数の検出ウインドウは、前記異なる材料の全体的なスペクトルの異なる連続部分に広がる請求項３４に記載のシステム。
41. 前記出力信号のそれぞれは、対応する検出ウインドウ内において検出される前記スペクトルの強度に対応する単一の値を有する請求項４項に記載のシステム。
42. 前記２またはそれを超える数の検出ウインドウのうちの１つは、前記２またはそれを超える数の検出ウインドウのうちの別の検出ウインドウの中に完全に収まる請求項３４に記載のシステム。
43. 前記異なる材料が微小球に関連付けされる材料を含み、前記スペクトルが前記材料の異なる蛍光放射スペクトルを含む請求項３４に記載のシステム。
44. 前記システムは、流体フロー光学デバイスとして構成される請求項３４に記載のシステム。
45. 前記システムは、分光分析テクニックを実行するように構成される請求項３４に記載のシステム。
46. 前記スペクトルは、前記異なる材料による光の放出、吸収、または透過の結果として生成される請求項３４に記載のシステム。
47. さらに前記プロセッサが、前記比に関連付けされる前記異なる材料の濃度を決定するように構成される請求項３４に記載のシステム。

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