JP6518763B2 - 発光観察方法 - Google Patents
発光観察方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6518763B2 JP6518763B2 JP2017524236A JP2017524236A JP6518763B2 JP 6518763 B2 JP6518763 B2 JP 6518763B2 JP 2017524236 A JP2017524236 A JP 2017524236A JP 2017524236 A JP2017524236 A JP 2017524236A JP 6518763 B2 JP6518763 B2 JP 6518763B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cell
- observation
- photoprotein
- luminescence
- reference substance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 24
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 claims description 50
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 claims description 49
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims description 36
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 claims description 18
- 238000012937 correction Methods 0.000 claims description 16
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 claims description 13
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 11
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 claims description 2
- 239000012925 reference material Substances 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 103
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 22
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 12
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 3
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 3
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 3
- 101150038243 CLOCK gene Proteins 0.000 description 2
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- ZKAMEFMDQNTDFK-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazo[4,5-b]pyrazine Chemical group C1=CN=C2NC=NC2=N1 ZKAMEFMDQNTDFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 1
- 241000254064 Photinus pyralis Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000005937 nuclear translocation Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 101150061166 tetR gene Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
- G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
本発明は、発光観察方法に関する。
発光タンパク質は、発光が生じる化学反応を触媒する。発光タンパク質は、しばしば定量的実験に使用される。例えば、あるプロモーターの下流に発光タンパク質遺伝子を配置し、このプロモーターの活性の程度、すなわちこの遺伝子の発現の程度を、発光タンパク質に由来して生じる発光量として測定することが可能となる。
時計遺伝子のリズムや薬剤に対する応答など、細胞が示す複数のシグナルを発光タンパク質による発光の観察によって捉える場合、発光色の異なる発光タンパク質による発光量として、同時に取得することが可能である。例えば、薬剤Ａに対する細胞応答を赤色発光チャンネル、薬剤Ｂに対する発光応答を緑色発光チャンネルとして観察することができる。この場合、高効率で精度良く発光成分を分離定量することが必要となる。
そこで、特開２００４−３３３４５７号公報では、Ｎ色の発光成分それぞれ光量を、Ｎ−１枚の透過波長帯域が広い高透過率のフィルターを利用し、各発光成分のフィルター透過率とフィルターを透過する全成分の光量の総和から行列式を利用して求める方法を提案している。ここで、フィルター透過率は、細胞の観察に先立って、溶液を用いて予め算出し、定数として使用している。
また、Ｋｗｏｎ Ｈ， ｅｔ ａｌ．， （２０１０） ”Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｄｕａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ ｌｅｖｅｌ”， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ４８（６）： ４６０−４６２では、ダイクロックミラーを用いて２色の発光を分離し、デュアルカラーＣＣＤを用いて同時に撮像して、行列式を用いて各成分の発光強度を算出する手法を開示している。ここで、透過率は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞で緑色と赤色のルシフェラーゼを発現させて算出し、定数として使用している。
しかしながら、酵素学的特性によっては、ある発光波長で発光するはずが外的要因によって発光色が変化してしまい、これが他の発光波長チャンネルへ影響してしまうことが想定される。
例えば、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ由来のルシフェラーゼは、温度の変化によって発光スペクトルが変化する。図６は、リコンビナントタンパク質が示す発光スペクトルの温度による違いを示している。
また、Ｆｒａｇａ Ｈ， （２００８） ”Ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ： Ａ ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ”， Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． Ｓｃｉ．， ７（２）： １４６−１５８には、ｐＨの変動によって発光波長が変化するということが報告されている。
従来の透過率の算出は、算出した透過率を定数として用いている。しかし、温度やｐＨ等の外的要因によって発光スペクトルが変化することがあり、この発光スペクトルの変化によって透過率は変動するため、適切な透過率の算出が課題となっている。
従来の透過率の算出は、あらかじめ各発光タンパク質が発するシグナルのフィルター透過性を定数として利用している。しかし、これは観察中に発光スペクトルが変化しないという前提が必要であり、観察中に発光スペクトルが変化する場合（以下２つの条件を含む場合）にはフレームごとにこの定数を求める必要がある。
本発明は、
（１）発光スペクトルが外的要因によって変化する発光タンパク質を含む２つ以上の発光タンパク質を使用した観察、
（２）観察対象（例えば細胞）から同所的に発せられる発光シグナルが２つ以上の発光タンパク質から発せられる場合、
において、外的要因によらず定量性の高い発光観察方法を提供することを目的とする。
（１）発光スペクトルが外的要因によって変化する発光タンパク質を含む２つ以上の発光タンパク質を使用した観察、
（２）観察対象（例えば細胞）から同所的に発せられる発光シグナルが２つ以上の発光タンパク質から発せられる場合、
において、外的要因によらず定量性の高い発光観察方法を提供することを目的とする。
本発明の一態様によれば、第１の発光タンパク質の遺伝子を発現する観察細胞を含む生体試料と、基準量の前記第１の発光タンパク質を提示する基準物とから放射される発光を、それぞれ異なる波長帯域を有する２種類のフィルターを用いて撮影することで、２枚の波長帯域画像を取得することと、前記２枚の波長帯域画像それぞれから、前記観察細胞からの発光量及び前記基準物からの発光量を定量することと、前記定量した前記基準物からの２種類の発光量を用いて補正定数を算出することと、前記定量した前記観察細胞からの２つの発光量を、前記補正定数を用いて補正することと、を含み、前記補正定数は、前記２つのフィルターの透過率に係わる逆行列により算出される発光観察方法が提供される。
本発明によれば、外的要因によらず定量性の高い発光観察方法を提供することができる。
本発明の一実施形態について図面を参照して説明する。
本実施形態は、生体試料の発光観察方法に関する。具体的には、外的環境要因（例えば、温度）によって、発光色が変化する発光タンパク質を用いたシングルセルイメージングでの色分離を補正する細胞の配置とその方法に関する。発光イメージングでは、時計遺伝子のリズムや薬剤に対する応答など細胞が示す複数のシグナルを、発光色の異なる発光タンパク質が示す発光量として同時に取得することが可能である。例えば、薬剤Ａに対する細胞応答を赤色発光チャンネル（以下、ｃｈと略記する）、薬剤Ｂに対する発光応答を緑色発光ｃｈとして観察する。しかし、発光タンパク質の酵素学的特性によっては、ある発光波長を示す発光タンパク質の発光色が外的要因によって変化し、他の発光波長ｃｈへ影響を与えることが想定される。本実施形態では、温度感受性発光タンパク質を用いて細胞の薬剤応答を観察する際に、観察対象である観察細胞と同一視野内に基準物、例えば指標細胞を配置し、温度変化に伴うスペクトル変化が「観察用ｃｈ」以外のｃｈに与えるクロストークの影響を補正する。
以下に上記方法に含まれる各工程に関して、図１を参照して、順に説明する。
まず、第１の発光タンパク質の遺伝子を発現する観察細胞を含む生体試料を生存状態で維持する（ステップＳ１）。
観察細胞は、観察の対象となる細胞である。観察細胞の種類は、動物細胞、植物細胞および微生物細胞等、あらゆるものであってよい。また、観察細胞は、培養細胞、組織に含まれる細胞の１つ、または個体に含まれる細胞の１つであってよい。
観察細胞は、例えば、発現の状態を調べようとする遺伝子の発現制御領域の下流に、第１の発光タンパク質の遺伝子が配置された組み替え遺伝子が導入されることで得られる。こうすることで、第１発光タンパク質の遺伝子は、元の遺伝子のための発現制御領域の作用により、元の遺伝子の発現パターンと同様のパターンで発現することになる。
なお、発光タンパク質とは、発光が生じる化学反応を触媒する酵素を意味する。発光タンパク質は、十分量の基質の存在下において発光反応を触媒させた場合に、時間の経過に伴い発光量が変動するという特性を有する発光タンパク質であって良い。このような変動とは、例えば、発光量の減少である。このような発光タンパク質では、基質は十分に存在するにもかかわらず、時間の経過に従って発光量が減少する。また、このような変動とは、例えば、発光量の増大である。
発光量が減少するという特性を示す発光タンパク質の例は、ホタルルシフェラーゼである。ホタルルシフェラーゼは、ホタルルシフェリンを発光基質とする。また、そのような発光タンパク質の別の例は、イミダゾピラジン骨格を有する化合物を発光基質とする、海洋生物等に由来するルシフェラーゼである。
なお、観察細胞の数は、１つに限らない。
次に、図２に示すように、観察細胞ＯＣを撮影した際に１つの視野ＯＦＶの中に観察細胞ＯＣと共に入るように、基準量の第１の発光タンパク質を提示する基準物を用意する（ステップＳ２）。
基準物は、例えば細胞である（以下、指標細胞ＩＣと称する）。この場合、この指標細胞ＩＣ中において、観察細胞ＯＣとは同じ第１の発光タンパク質が一定量発現している。すなわち、基準物としての指標細胞ＩＣは、観察細胞ＯＣとは異なる細胞である。但し、指標細胞ＩＣは、観察細胞ＯＣと同種の細胞であってもよい。例えば、同種の細胞群の中から、一部の細胞を観察細胞ＯＣとし、その他の一部を指標細胞ＩＣとして選択してもよい。基準物となる指標細胞ＩＣは、動物細胞、植物細胞および微生物細胞等、あらゆるものであって良い。また、指標細胞ＩＣは、培養細胞、組織に含まれる細胞の１つ、または個体に含まれる細胞の１つであって良い。
こうして作製した指標細胞ＩＣを、観察細胞ＯＣを撮影した際に１つの視野ＯＦＶの中に観察細胞ＯＣと共に入るように用意する。具体的には、例えばΦ３５ｍｍガラスボトムディッシュに、観察細胞ＯＣと指標細胞ＩＣを混ぜ合わせて播種する。
なお、基準物は、発光色を補正するための指標であるため、細胞以外にも、ウェルや粒子といった固体や、液体などでも良い。基準物が固体である場合には、第１の発光タンパク質は、その固体の表面に固定されている。
こうして、観察細胞ＯＣと基準物、例えば指標細胞ＩＣとを含む生体試料が準備できたならば、次に、観察細胞ＯＣと指標細胞ＩＣに対して所定の刺激を与える、例えば、第１の発光タンパク質に応じた発光基質を培養液に投与して、それぞれにおいて発光反応を生じさせる（ステップＳ３）。発光基質は、任意のタイミングで培養液に投与することができる。例えば、観察細胞ＯＣを観察する直前に投与しても良い。あるいは、培養液を作製する段階において発光基質を投与しても良い。
そして、観察細胞ＯＣ及び基準物（指標細胞ＩＣ）から放射される発光を、それぞれ異なる波長帯域（発光波長Ｃｈ）で撮影することで、複数の発光画像として複数の波長帯域画像を取得する（ステップＳ４）。
発光画像とは、観察細胞ＯＣおよび基準物（指標細胞ＩＣ）からの発光を撮像することにより得られる画像である。発光画像は、例えば、発光に応じた特定の波長を有した光のみを主に透過させるフィルターと、光を電気信号に変換する撮像素子と、電気信号から発光画像を作り出す画像処理手段とを含む装置を用いて取得することができる。発光画像を取得するための装置の例は、発光顕微鏡、発光イメージングシステム等である。発光イメージングシステムの具体例は、発光イメージングシステムＬＶ２００（オリンパス株式会社製）を含む。
このような、発光イメージングシステムの概略を図３に示す。図３に示すように、この発光イメージングシステム１は、図示しないハウジングに遮光状態で格納された顕微鏡１０と、例えばパーソナルコンピュータといった各種演算を行うことができる演算装置２０と、例えばキーボードやマウスといった演算装置２０にユーザによる指示を入力するための入力部３０と、を備える。
顕微鏡１０には、光学系１１と光源１２と撮像装置１３とが設けられている。光学系１１は、種々のレンズやミラーを含む。また、光学系１１は、選択的に光路に挿入し得る複数のフィルターＦ１，Ｆ２を含む。複数のフィルターＦ１，Ｆ２は、互いに透過波長が異なっている。ただし、完全に異なっている必要は無く、互いに重複しない波長帯域を備え、その重複しない波長帯域が、所望の発光波長ｃｈに対応していれば良い。光源１２は、明視野画像を得るために必要な任意の照明光（例えば白色光）を射出し、この光源１２から射出された光は、光学系１１を介して、観察細胞ＯＣと基準物、例えば指標細胞ＩＣとを含む生体試料４０に照射される。この生体試料４０は、好ましくは所定の培養環境により細胞が生存可能に維持されるよう、培養チャンバ内に収容されている。撮像装置１３は、例えば冷却ＣＣＤ等による撮像素子を含み、光学系１１を介して生体試料４０の顕微鏡画像に係る画像信号を生成する。
演算装置２０は、撮影制御部２１と、画像取得部２２と、光源制御部２３と、光学系制御部２４と、記録部２５と、画像解析部２６と、を備える。撮影制御部２１は、撮像装置１３の動作を制御する。画像取得部２２は、撮像装置１３から画像を取得し、必要な画像処理等を行う画像処理手段である。
光源制御部２３は、光源１２の動作を制御する。光学系制御部２４は、光学系１１を制御する。例えば、明視野画像が取得されるときは、光源１２から射出された照明光は、光学系１１を介して生体試料４０に照射される。また、明視野画像が取得されるときは、露光時間は比較的短くされる。一方、発光画像が取得されるときは、光源１２から射出された照明光は遮断され、生体試料４０は照明されない。また、発光画像が取得されるときは、露光時間は比較的長く設定される。光学系制御部２４は、また、発光画像が取得されるときは、複数のフィルターＦ１，Ｆ２の光路への選択的な挿入を制御する。
記録部２５は、明視野画像と各吸収フィルター挿入時に取得された発光画像である波長帯域画像とを記録する。画像解析部２６は、記録部２５に記録された複数の波長帯域画像から、観察細胞ＯＣからの発光量を定量する等の解析処理を行う。なお、記録部２５は、この画像解析部２６の解析結果も記録する。
そして、画像解析部２６により、複数の波長帯域画像から、観察細胞ＯＣからの発光量と基準物である指標細胞ＩＣからの発光量とを定量する（ステップＳ５）。これは、記録部２５に記録された明視野画像において、発光量を定量すべき細胞を含む関心領域を入力部３０により指定することを含む。画像解析部２６は、記録部２５に記録された各波長帯域画像における関心領域に対応する領域の発光量を定量する。
その後、画像解析部２６により、定量した基準物である指標細胞ＩＣからの発光量を用いて補正定数を算出し（ステップＳ６）、この補正定数を用いて、定量した観察細胞ＯＣからの発光量を補正する（ステップＳ７）。
例えば、画像解析部２６は、蛍光画像のクロストーク補正（蛍光分離）ソフトウェア（ＰｒｉｚＭａｇｅ）を用いて補正を実施する。本ソフトウェアは蛍光画像のクロストークを補正するためのソフトウェアであるが、発光シグナルのオーバーラップと現象が似ているため同様の操作で補正可能である。各波長帯域（各発光波長ｃｈ）単独の発光量（補正後の発光量：ＧＲＥＥＮとＲＥＤ）は、以下の（１）式に示すように、実際に測定される発光量（フィルターＦ１，Ｆ２を用いた波長帯域画像から得られる発光量：ＦｇｒｅｅｎとＦｒｅｄ）と、フィルターＦ１，Ｆ２の透過率に係わる逆行列とから、算出することができる。
そこで、ステップＳ６では、指標細胞ＩＣから得られる発光量を用いて、補正定数として、フィルターＦ１，Ｆ２の透過率に係わる逆行列の値を算出する。すなわち、従来は補正定数であるフィルター透過率に係わる逆行列は、細胞の観察に先立って溶液等を用いて予め算出していた。これは、測定中には発光タンパク質から発せられるシグナルのスペクトルは変化しないという前提が必要になる。しかし、スペクトルが変化する場合には、（１）式に示される逆行列の数値が定数であると、実際の測定条件とズレが生じる。そこで、本実施形態では、基準物である指標細胞ＩＣを用いて細胞の観察中に算出する。
そして、ステップＳ７において、観察細胞ＯＣから得られる発光量を実際に観察される発光量Ｆｇｒｅｅｎ，Ｆｒｅｄとして、この算出した補正定数を用いて上記（１）式により各波長帯域単独の発光量ＧＲＥＥＮ，ＲＥＤを算出することができる。
その後、観察終了するまで（ステップＳ８）、所定時間経過する毎に（ステップＳ９）、上記ステップＳ４乃至ステップＳ７の工程を繰り返す。すなわち、所定時間毎のタイムラプス撮影と観察細胞ＯＣからの発光量の算出とを繰り返す。
なお、ステップＳ５乃至ステップＳ７の工程は、タイムラプス撮影終了後に、記録部２５に記録した各回の複数の波長帯域画像毎に、纏めて実施するようにしても良いことは勿論である。
本実施形態による蛍光観察方法によれば、観察中に基準物の発光量に基づいて補正定数であるフィルター透過率に係わる逆行列を算出して観察細胞ＯＣの発光量を補正するようにしている。従って、温度やｐＨ等の外的要因によって観察細胞ＯＣの発光スペクトルが変化したとしても、その変化を補正することができ、定量性の高い発光観察が行える。
なお、多ｃｈでの観察の際には、上記方法と同様の手法を用いて第１の発光タンパク質とは異なる第２の発光タンパク質のための発現ベクターを作製し、作製した核移行シグナル付きの第２の発光タンパク質を発現するＨｅＬａ細胞を、上記のような指標細胞ＩＣ（第１の指標細胞ＩＣ１）とは別の指標細胞ＩＣ（第２の指標細胞ＩＣ２）として用いても良い。
また、指標細胞ＩＣとして必要な要素は、指標細胞ＩＣで使用している各発光タンパク質が発現している部位または細胞を特定できることである。例えば、図４では、２つの発光タンパク質をそれぞれ違う細胞で遺伝子発現させた例を示しているが、これに限定されるものではない。例えば、図５に示すように、第１の発光タンパク質は核、第２の発光タンパク質は細胞質というように、１つの細胞において空間的に分離できていれば、指標細胞ＩＣとして使用することができる。すなわち、複数の発光タンパク質を１つの指標細胞ＩＣ中に局在させても良い。
このように複数の発光タンパク質の局在が異なるように加工した細胞を基準物である指標細胞ＩＣとして使用することで、指標細胞の種数を減らすことができる。
１…発光イメージングシステム、 １０…顕微鏡、 １１…光学系、 １２…光源、 １３…撮像装置、 ２０…演算装置、 ２１…撮影制御部、 ２２…画像取得部、 ２３…光源制御部、 ２４…光学系制御部、 ２５…記録部、 ２６…画像解析部、 ３０…入力部、 ４０…生体試料、 Ｆ１，Ｆ２…フィルター、 ＩＣ，ＩＣ１，ＩＣ２…指標細胞、 ＯＣ…観察細胞、 ＯＦＶ…視野。
Ｋｗｏｎ Ｈ， ｅｔ ａｌ．， （２０１０） "Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｄｕａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ ｌｅｖｅｌ"， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ４８（６）： ４６０−４６２
Ｆｒａｇａ Ｈ， （２００８） "Ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ： Ａ ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ"， Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． Ｓｃｉ．， ７（２）： １４６−１５８
Ｙａｏ Ｆ， ｅｔ ａｌ．， （１９９８） "Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ， ｔｅｔＲ， ｒａｔｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｔｅｔＲ−ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｆｕｓｉｏｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ， ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ"， Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ， ９（１３）： １９３９−１９５０
Ｇｏｓｓｅｎ Ｍ ＆ Ｂｕｊａｒｄ Ｈ， （１９９２） "Ｔｉｇｈｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ"， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ， ８９（１２）： ５５４７−５５５１
Claims (7)
- 第１の発光タンパク質の遺伝子を発現する観察細胞を含む生体試料と、基準量の前記第１の発光タンパク質を提示する基準物とから放射される発光を、それぞれ異なる波長帯域を有する２種類のフィルターを用いて撮影することで、２枚の波長帯域画像を取得することと、
前記２枚の波長帯域画像それぞれから、前記観察細胞からの発光量及び前記基準物からの発光量を定量することと、
前記定量した前記基準物からの２つの発光量を用いて補正定数を算出することと、
前記定量した前記観察細胞からの２つの発光量を、前記補正定数を用いて補正することと、
を含み、
前記補正定数は、前記２種類のフィルターの透過率に係わる逆行列により算出される発光観察方法。 - 前記観察細胞及び前記基準物に対して所定の刺激を与えて、前記観察細胞及び前記基準物において発光反応を生じさせることと、
前記２枚の波長帯域画像を経時的に複数回取得することと、
を更に含み、
前記発光反応を生じさせることは、前記複数回取得の内の第１回目の取得よりも時間的に前に行い、
前記定量することと、前記補正定数を算出することと、前記補正することと、を各回に取得した前記２枚の波長帯域画像毎に行う請求項１に記載の発光観察方法。 - 前記基準物は、前記観察細胞とは異なる細胞、液体及び固体の内の１つである請求項１に記載の発光観察方法。
- 前記観察細胞を撮影した際に１つの視野の中に前記観察細胞及び前記基準物と共に入るように、前記第１の発光タンパク質とは異なる第２の発光タンパク質を提示する第２の基準物を用意することを更に含む請求項１に記載の発光観察方法。
- 前記基準物は、前記第１の発光タンパク質を発現する第１の指標細胞であり、
前記第２の基準物は、前記第２の発光タンパク質を発現する第２の指標細胞である請求項４に記載の発光観察方法。 - 前記基準物は、前記第１の発光タンパク質に加えて、前記第１の発光タンパク質とは異なる第２の発光タンパク質を提示する請求項１に記載の発光観察方法。
- 前記基準物は、前記第１の発光タンパク質及び前記第２の発光タンパク質の局在が異なるように加工した指標細胞である請求項６に記載の発光観察方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2015/067615 WO2016203617A1 (ja) | 2015-06-18 | 2015-06-18 | 発光観察方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2016203617A1 JPWO2016203617A1 (ja) | 2018-04-05 |
| JP6518763B2 true JP6518763B2 (ja) | 2019-05-22 |
Family
ID=57545239
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2017524236A Active JP6518763B2 (ja) | 2015-06-18 | 2015-06-18 | 発光観察方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6518763B2 (ja) |
| WO (1) | WO2016203617A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018216181A1 (ja) * | 2017-05-25 | 2018-11-29 | オリンパス株式会社 | 測定方法 |
| JPWO2021235519A1 (ja) * | 2020-05-20 | 2021-11-25 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4767206A (en) * | 1984-12-24 | 1988-08-30 | Flow Cytometry Standards Corporation | Calibration method for flow cytometry using fluorescent microbeads and synthesis thereof |
| JP2912957B2 (ja) * | 1991-06-18 | 1999-06-28 | 東ソー株式会社 | 酵素活性測定方法及び装置 |
| JP3716502B2 (ja) * | 1996-07-24 | 2005-11-16 | 東ソー株式会社 | 蛍光検出装置 |
| JP4748719B2 (ja) * | 2006-03-02 | 2011-08-17 | 国立大学法人大阪大学 | 生細胞内の特定タンパク質の定量方法および標準蛍光マイクロビーズの作製方法 |
| JP2007327928A (ja) * | 2006-06-09 | 2007-12-20 | Olympus Corp | 細胞周期弁別方法、その画像処理システム、及びそのプログラム |
| JP2009156715A (ja) * | 2007-12-27 | 2009-07-16 | Panasonic Corp | 生体物質検出装置 |
| JP6081226B2 (ja) * | 2013-02-27 | 2017-02-15 | オリンパス株式会社 | 発光量を補正する方法 |
-
2015
- 2015-06-18 WO PCT/JP2015/067615 patent/WO2016203617A1/ja active Application Filing
- 2015-06-18 JP JP2017524236A patent/JP6518763B2/ja active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPWO2016203617A1 (ja) | 2018-04-05 |
| WO2016203617A1 (ja) | 2016-12-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11703454B2 (en) | Method and apparatus for multiplexed imaging of spectrally-similar fluorophores | |
| JP5927251B2 (ja) | 発光測定方法および発光測定システム | |
| US20100227316A1 (en) | Luminescense measuring apparatus and luminescense measuring method | |
| Musielak et al. | A versatile optical clearing protocol for deep tissue imaging of fluorescent proteins in Arabidopsis thaliana | |
| Aswendt et al. | Quantitative in vivo dual-color bioluminescence imaging in the mouse brain | |
| CN101351736A (zh) | 发光测量装置及发光测量方法 | |
| CN106052866A (zh) | 生物光子光谱检测系统及检测方法 | |
| US20200158719A1 (en) | Method of specifying cell, method of producing cell population and cell specifying system | |
| JP6518763B2 (ja) | 発光観察方法 | |
| Van Rijnberk et al. | A dual transcriptional reporter and CDK-activity sensor marks cell cycle entry and progression in C. elegans | |
| Lambrechts et al. | A causal relation between bioluminescence and oxygen to quantify the cell niche | |
| Moreira Teixeira et al. | New bioimaging avenues for organs‐on‐chips by integration of bioluminescence | |
| US10401276B2 (en) | Method for generating three-dimensional luminescence image, and imaging system | |
| Wu et al. | Defining clonal color in fluorescent multi-clonal tracking | |
| US20190352727A1 (en) | METHOD FOR ANALYZING SOMATIC CELL REPROGRAMMING, AND METHOD FOR SETTING UP QUALITY EVALUATION CRITERIA FOR iPS CELL USING THE METHOD | |
| Dikovskaya et al. | Measuring Changes in Keap1‐Nrf2 Protein Complex Conformation in Individual Cells by FLIM‐FRET | |
| Stadtfeld et al. | Fluorescent protein-cell labeling and its application in time-lapse analysis of hematopoietic differentiation | |
| EP3435135B1 (en) | Microscope and method for observing biological sample in living state | |
| WO2016189628A1 (ja) | 発光測定方法 | |
| WO2018216181A1 (ja) | 測定方法 | |
| Liao et al. | Counting fluorescently labeled proteins in tissues in the spinning–disk microscope using single–molecule calibrations | |
| Hiratsuka et al. | Single-cell live imaging | |
| Guo et al. | Analysis of the localization of MEN components by live cell imaging microscopy | |
| Manzella‐Lapeira et al. | Imaging Protein‐Protein Interactions by Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy in Live Cells | |
| Mudumbi et al. | Determination of Membrane Protein Distribution on the Nuclear Envelope by Single‐Point Single‐Molecule FRAP |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180125 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181127 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190128 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190205 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190314 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190326 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190422 |
|
| R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 6518763 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |