JPH1033159A - 蛍光検出装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 測光光学系に対する容器の位置のずれの影響
を低減することができる蛍光検出法を提供する。 【解決手段】 蛍光物質から発する蛍光の一部を透過し
残りを反射する部分反射ミラー８と、この部分反射ミラ
ー８を透過した光と反射した光の光強度をそれぞれ波長
選択して測光するように対に設けられた第一および第二
のフォトダイオード２，３とを備え、第一のフォトダイ
オード２と第二のフォトダイオード３を、部分反射ミラ
ー８に対して光学的に等価となるように配置した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、免疫化学分析法，
装置などに用いられる蛍光検出方法及び装置に関するも
のであり、特に、測定物質からの蛍光と基準物質からの
蛍光を測光し、両者の測光結果から測定対象物の濃度を
高精度に求めるために用いられる蛍光検出方法及び装置
に関するものである。

【０００２】

【従来技術】免疫反応により結合した複合体に含まれる
蛍光物質等の標識、あるいは標識によって生成される蛍
光物質を利用して免疫学的な分析を行う方法が従来から
知られており、このうちの一つである酵素標識蛍光免疫
分析法は、例えば、測定対象物を含む血清と、酵素で標
識した抗体と、固相に固定した抗体とを接触させて免疫
学的に反応して結合した複合体を形成させ、酵素で標識
された抗体のうちの複合体を形成していない未反応のも
のを除去した後、この複合体に含まれる酵素に対する酵
素基質を加え、酵素反応の結果生成した蛍光物質の蛍光
強度を測定することで測定対象物質を定量する方法とし
て知られている。

【０００３】このような方式のための従来の蛍光検出装
置は、光源とレンズを含む励起光照射用光学系と、少な
くとも一つの検出素子，一つのレンズ及び波長選択素子
を含む蛍光測光用光学系により構成され、測定物質（蛍
光物質）から放出された蛍光を測光している。励起光
（照明光）の進行方向については、蛍光の進行方向と光
軸が実質的に一致する光学系あるいは光軸が直交する光
学系が、測光セルの形状や回りの状態によって選択され
て用いられている。なお励起光の進行方向が蛍光の進行
方向と一致する光学系では、励起光と蛍光の進行方向が
重なるため、ダイクロイックミラーなどの部分反射ミラ
ーが用いられている。

【０００４】ところで従来の検出装置では、試料表面の
メニスカスの変化、泡の存在等により測定値が変動して
測定精度が必ずしも高く得られないという問題や、測定
物質の濃度が高くなると励起光が測定物質に吸収されて
励起蛍光の強度が低下し、蛍光強度と測定物質の濃度間
の直線性が失われるという問題があった。

【０００５】この問題を解消するために試料中に測定物
質と同じ波長で励起することができる蛍光基準物質を添
加し、測定物質からの蛍光と、同一波長の励起光により
蛍光励起可能でかつ測定対象物質とは異なる波長の蛍光
を発し得る基準物質からの蛍光とを各々測定し、測定対
象物質の濃度を求める方法が提案されている（特開平５
−３８２９７号公報）。

【０００６】この方法は、異なる波長の蛍光を利用する
ことから二波長蛍光測定法と称することができ、例えば
ダイクロイックミラーなどの部分反射ミラーを用いて蛍
光を二分した後、分離した各光をそれぞれ波長選択素子
を通過させることで、測定物質からの蛍光と基準物質か
らの蛍光とをそれぞれ選択的にとりだし、それぞれの蛍
光強度を検出し、基準物質からの蛍光の変化に基づいて
測定物質からの蛍光の検出結果を補正するものである。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上記方法により精度の
高い測定が実現されるが、本発明者はより高精度の測定
を実現するために、更に検討を進めた。そして上記した
従来の二波長蛍光測定法で検出する二つの蛍光強度の信
号の変化率が、多数測定するサンプル毎に必ずしも一定
しないことを知見した。

【０００８】この信号の変化率（変化の割合）が一致し
ない原因を検討したところ次のことが明らかになった。

【０００９】すなわち、サンプル中の生理活性物質等の
量を定量する例えば酵素免疫測定法を実施する装置で
は、酵素を含む複合体を比較的小さな容器内に存在さ
せ、この容器の多数を所定の光学的測光ステーションに
機械的，自動的に搬入させて測光するのが普通であり、
測光ステーションに搬入された各容器を測光光学系に対
して常に一定の位置にずれなく送り込むことは容易でな
い。特に多数容器の迅速処理が望まれる工業的な装置で
は、測光光学系に対して搬入容器の位置を常に一定の相
対的位置関係に与えることは極めて困難であるから、位
置ずれを招くことは一般に避け難い。更に、酵素基質を
容器に分注する際に泡が発生することがあり、泡の発生
を完全に抑えることは困難である。そしてこの位置ずれ
又は泡の発生に起因する信号の変化の割合が、前記二つ
の検出素子で一致しないことがこの位置ずれの影響を完
全に補正できないという問題を招く原因になっていた。
すなわち、検出素子の位置のずれ、各検出素子の前段に
設置することがあるアパーチャの位置のずれ、各検出素
子の光軸とのずれ、各検出素子の感度ムラなどの物理的
不等価性のために、前記の反応容器の位置のずれや泡の
発生の場合に、検出信号の変化割合は二つの検出素子に
おいて同等にならない。

【００１０】そしてこれは、例えば、基準物質について
検出される蛍光強度が容器の位置ずれの影響を比較的大
きく受け、他方の測定物質ではあまり影響を受けない場
合を例にすると、同じ（補正式などを用いる）手順で補
正した結果は位置ずれ分の影響を含むデータとなってし
まう問題として把握される。

【００１１】本発明は従来法のこのような問題を解決し
て、測光光学系に対する容器の位置ずれの影響を低減す
ることができる蛍光検出法及び酵素活性測定法、並びに
これらに用いる装置の提供を目的としてなされたもので
ある。

【００１２】

【課題を解決するための手段及び作用】前記の目的を達
成する本発明の特徴は、前記した特許請求の範囲の各請
求項に記載したところにある。

【００１３】本願の請求項１に記載した蛍光検出装置の
発明は、励起光照射により蛍光物質から発する蛍光の一
部を透過し残りを反射する光分離素子と、この光分離素
子を透過した光と反射した光の光強度をそれぞれ波長選
択して測光するように対に設けられた第一および第二の
検出素子とを備えた蛍光検出装置において、前記対をな
す検出素子を、前記光分離素子に対し光学的に等価にな
るように配置したことを特徴とする。

【００１４】前記において「光学的に等価となるように
配置」というのは、二つの検出素子からの出力信号の変
化が同程度となるように（できるだけ変化の割合に差が
ないように）配置することをいう。

【００１５】前記の「光分離素子」としては、請求項３
で挙げるダイクロイックミラー，貼り合わせプリズム等
の部分反射ミラーを例示することができ、要するに蛍光
物質から発せられる蛍光の一部を透過し残りを反射する
ものであればよい。蛍光強度が十分に強い場合は光学ガ
ラスや石英ガラスなどの透明板を用いることもできる
が、一般的にはダイクロイックミラーなどの部分反射ミ
ラーが蛍光を無駄なく検出素子に導くことができるので
好ましく採用される。透明板あるいはダイクロイックミ
ラーなどは通常光軸に対して４５°の角度で挿入される
が、厚さがあると光軸を偏移させるため、できるだけ薄
いものが好ましく、一般的には１ｍｍ前後ものが好まし
く用いられる。二等辺直角三角形プリズムを二個斜辺同
士で貼り合わせた貼り合わせプリズムは、透過光の光軸
を偏移させないことから特に高精度が求められる場合に
適している。貼り合わせ面に多層膜を形成するなどの方
法により、波長選択特性をもたせた光分離素子を用いる
こともできる。

【００１６】「検出素子」としては一般的にはフォトダ
イオード、光電子増倍管等が好ましく用いられるがこれ
に限定されるものではない。

【００１７】請求項１の発明の特徴の一つは、対をなす
検出素子が、光分離素子に対して互いに光学的に等価と
なるように配置されているところにある。ここで、「光
学的に等価となるように配置」というのは、光学的な条
件のすべてが等価であることまで要求するものではな
く、二つの検出素子からの出力信号の変化が同程度とな
るように（できるだけ変化の割合に差がないように）し
た配置関係にあることをいう。

【００１８】この請求項１の発明によれば、一対の検出
素子が前記配置関係にあることにより、一対の検出素子
である第一及び第二の検出素子の変化割合が、すべての
点に対して実質的に（可及的に）同一とすることができ
（反応容器の位置のずれが生じた場合の照射光量の比を
実質的に同一に変化させることができ）、蛍光物質から
発した蛍光強度が、前記した容器の位置ずれなどの影響
を受けることなく高精度な測定が実現される。

【００１９】本願の請求項２の発明は、蛍光物質から発
する蛍光を光分離素子に導く光路上に第一の集光素子及
び第二の集光素子をその順に配置し、かつ第一の集光素
子による蛍光物質の像が第二の集光素子上に形成される
と共に、第一の集光素子の像が前記第一及び第二の検出
素子上に形成されるようにしたことを特徴とする。

【００２０】本願の請求項４に記載した蛍光検出装置の
発明は、免疫学的反応で結合した複合体が含む酵素の反
応で容器内に生ずる蛍光物質を光学的に測光する蛍光検
出装置であって、容器内の蛍光物質を励起させる光を照
射する光源光学系と、蛍光物質から発する蛍光の一部を
透過し残りを反射する光分離素子と、この光分離素子を
透過した光と反射した光の光強度をそれぞれ波長選択し
て測光するように対に設けられた第一および第二の検出
素子と、蛍光物質から発する蛍光を前記光分離素子に導
く光路上に設けられた第一及び第二の集光素子とを備
え、この対をなす検出素子は、第一の集光素子による蛍
光物質の像が第二の集光素子上に形成されると共に、第
一の集光素子の像が第一及び第二の検出素子上に形成さ
れるように配置して、前記対をなす検出素子が光分離素
子に対し互いに光学的に等価となるようにしたことを特
徴とする。光分離素子を第一の集光素子と第二の集光素
子の間に配置することもできるが、この場合、第二の集
光素子を光分離素子と第一の検出素子及び光分離素子と
第二の検出素子の間にそれぞれ配置する。

【００２１】また請求項５の発明は、前記容器内の測光
対象物質を、免疫学的反応で結合した複合体に含まれる
酵素の作用で生成した蛍光物質（以下「生成蛍光物質」
という）と、酵素の作用はうけずに蛍光を発する基準蛍
光物質とし、また前記いずれか一方の検出素子は生成蛍
光物質の蛍光波長を選択して測光し、いずれか他方の検
出素子は基準蛍光物質の蛍光波長を選択して測光するこ
とを特徴とする。

【００２２】この発明において用いる酵素の作用で生成
する蛍光物質、及び酵素の作用を受けない基準蛍光物質
としては、例えば前述した特開平５−３８２９７号公報
記載の物質を用いることができる。前者としては、例え
ば酵素（アルカリ性フォスファターゼ）の作用で４−メ
チルウンベリフェリルリン酸から生ずる４−メチルウン
ベリフェロン（生成蛍光物質）を挙げることができ、こ
れはアルカリ性（ｐＨ１０）下で３６５ｎｍの波長の励
起光照射で約４５０ｎｍ付近に極大をもつ蛍光を発す
る。これに対し、同条件下（同ｐＨ，同波長励起光の照
射用）で約５５０ｎｍ付近に極大をもつ蛍光を放射する
ダンシル−Ｌ−アラニンを前記後者の基準蛍光物質とし
て挙げることができる。

【００２３】請求項６の発明は、容器内の測定対象物質
のうちの免疫学的反応で結合した複合体に含まれる標識
を蛍光物質としたことを特徴とする。

【００２４】以上の各請求項に記載の発明における光源
としては放電管、蛍光灯など適宜のものを用いることが
できる。また点滅式の光源を用い、点滅式の光源を用い
検出素子（受光側）で同期検波することで外乱光の影響
を除去することもできる。

【００２５】また、各検出素子あるいは光源に近接して
光路を制限するアパーチャを設けることも好ましい。例
えば、一般に矩形形状の検出素子の近傍に検出面を小さ
く制限する円形形状のアパーチャを設けることによっ
て、反応容器の位置がずれた場合の反応容器側壁からの
反射光の変化の影響を軽減できる利点がある。

【００２６】かかる構成により、試料、第一の集光素
子、第二の集光素子及び一対の検出素子を前記配置関係
とすることにより、反応容器の位置ずれが生じたときに
第一及び第二の検出素子のすべての点に対して照射光が
略同一の比で変化し、免疫学的反応で結合した複合体が
含む酵素の反応により容器内に生成した蛍光物質等、お
よび基準蛍光物質からの蛍光強度を、位置ずれの影響を
ほとんど受けることなく一対の検出素子で測光できる。
すなわち、この発明によれば、経時的に量が変化しない
基準蛍光物質からの蛍光強度の測光情報と、経時的に酵
素活性により量が変化（増加）する生成蛍光物質からの
蛍光強度の測光情報とを、二つの光学的に等価となるよ
うに配置した一対の検出素子により、位置ずれの影響を
可及的に軽減して高精度な測光情報として得ることがで
きる。

【００２７】以上の本願請求項１〜６の発明において、
検出光学系の光の波長選択は、光分離素子から検出素子
へ至る光路の途中に波長選択素子を配置して行うことが
でき、また透過する光の波長選択は光分離素子にこの波
長選択機能をもたせて行うこともできる。このような波
長選択素子としては通常フィルターが用いられる。例え
ば、一方の検出素子の手前には測定対象物質の蛍光を透
過し基準蛍光物質の蛍光を遮断するフィルター、他方の
検出素子の手前に基準蛍光物質の蛍光を透過し、測定対
象物質の蛍光を遮断するフィルターを配置することがで
きる。フィルターは、バンドパスフィルターあるいはカ
ットオフフィルターなどを挙げることができる。干渉フ
ィルターすなわち干渉膜を利用したバンドパスフィルタ
ーは急峻な特性をもつため、蛍光検出器の波長選択に好
ましく用いられる。また測定対象物質から出る蛍光と基
準蛍光物質から出る蛍光のうち、長波長側の蛍光を選択
するためには干渉フィルターだけでなく、カットオフフ
ィルターを用いることができる。光源が波長分布をもつ
場合には不要な波長を除去するために励起光源系の光路
中に波長選択素子を配置することも好ましく、この場合
には干渉フィルターあるいは色ガラスバンドパスフィル
ターを用いることができる。フィルターの特性は、単独
のフィルターでもたせることができるが、光選択能をも
った光分離素子と組み合わせてもたせることもでき、ま
た複数のフィルターを組み合わせることで必要とする波
長選択能をもたせることもできる。なお、上述した種々
のフィルターの波長選択性は、要求される検出精度にも
よるが、生成蛍光物質と基準蛍光物質にそれぞれ由来す
る励起光吸収により減衰した励起光に起因する蛍光をそ
れぞれ一方の物質に概ね由来するものとして検出できれ
るものであればよく、検出波長のみを透過させる厳格な
波長選択能を求められるものではない。

【００２８】また、以上の各請求項に記載の本発明にお
いては、光源像を容器内に投影する集光素子、及び容器
内の蛍光物質の像を前記した条件で投影する第一，第二
の集光素子を、各光路中に設けることが好ましく採用さ
れ、前記第一の集光素子と光源光学系の集光素子とを共
用する場合、あるいはこれらを別個に設ける場合のいず
れも可能である。これらの集光素子としては通常はレン
ズが用いられる。レンズの曲率半径は像の位置に応じて
適宜選択され、また口径は利用する光の広がりに応じて
適宜選択される。レンズは二群構成となり、各群は単レ
ンズでも複合レンズでもよく、また両凸、平凸などどち
らでも使用でき、球面収差などを考慮して選択すること
ができる。なお本発明でいう、像が形成されるとは集光
素子上等において完全な像が形成される場合の他、完全
に合焦していない、ぼけた像が形成される場合であって
もよい。

【００２９】なお、上記各請求項の発明は以上の構成に
限定されるものではなく、適宜必要な構成を採用するこ
とができる。また、励起光の照射用光路と蛍光の射出光
路の光軸を一致させる方式、これらの光軸を直交させる
方式などいずれであってもよい。

【００３０】以上の各請求項の発明において、基準蛍光
物質からの蛍光強度の検出結果に基づいて生成蛍光物質
からの光強度の検出結果を補正する補正手段は、種々の
方式のものを用いることができ、例えば所定の演算式を
プログラムしたＭＰＵ（マイクロプロセッサユニット）
を利用して構成することができる。補正方式としては、
演算方式の他、予め求めた検量線を用いる方式、記憶手
段（ＲＯＭ等）に記憶した情報を読み出す方式など適宜
のものを採用することができる。

【００３１】また以上の各請求項の発明によれば、経時
的に量が変化しない基準蛍光物質と、経時的に酵素活性
により量が変化する生成蛍光物質とが共存している容器
から射出される蛍光強度の測光情報を、光学的に等価と
なるように配置した一対の検出素子でそれぞれ測光し、
本来量変化がないために蛍光強度が変化しないはずの基
準蛍光物質について検出される蛍光強度の変化に基づい
て、酵素活性で生ずる生成蛍光物質から発する蛍光の強
度を補正して真の生成蛍光物質の量を求めることができ
る。

【００３２】

【発明の実施の形態】

実施形態１ 図１は、本発明の蛍光検出装置（酵素活性測定装置）の
一例の構成概要を示したものであり、図において１は光
源であり、光源アパーチャ１２、波長選択素子であるフ
ィルター９、部分反射ミラー（ハーフミラー）７、集光
素子であるレンズ４を透して、容器１３内に光源像（光
源そのもの又は光源アパーチャ）を形成（結像）させる
ように励起光を照射できるよう構成されている。

【００３３】前記の容器１３は、測定対象の生理活性物
質を含むサンプル、酵素標識抗体、固相化抗体の反応に
よって容器内の固相担体に結合固定された複合体を内部
に有し、かつ該複合体中の酵素の作用を受けて蛍光物質
を生成する基質が注入された状態で、図示しない搬送機
構により図示位置に送り込まれて停止され、所定の測光
操作が行われる。なおこの容器１３には、酵素の作用を
受けない基準蛍光物質が予め容器内の固相に固定されて
いるか、あるいは上記基質の注入時等の測光操作前に添
加するか、基質液中に予め添加しておいてもよい。１４
は容器１３中の蛍光物質を含む液を示す。

【００３４】上記のように測光位置に容器１３が送り込
まれ、光源１より励起光が照射されると、該容器１３内
において、酵素の作用により生成累積量が漸次増加する
蛍光物質と、酵素の作用を受けない基準蛍光物質が励起
されて蛍光を発し、この蛍光は、上記レンズ４、部分反
射ミラー７、レンズ５を通して、その蛍光の一部は部分
反射ミラー８で反射されると共に残りは該部分反射ミラ
ー８を透過する。

【００３５】そして該部分反射ミラー８を反射した光は
フィルター１０を通って所定波長の光が選択されてフォ
トダイオード２に投影され、部分反射ミラー８を透過し
た光はフィルター１１を通って所定波長の光が選択され
てフォトダイオード３に投影される。

【００３６】以上の構成において、本例の特徴は、蛍光
物質から発する蛍光を光分離素子に導く光路上に配置し
たレンズ（第一の集光素子）４およびレンズ（第二の集
光素子）５を、レンズ４による蛍光物質の像がレンズ５
の上に形成され、かつレンズ４の像が、フォトダイオー
ド（第一の検出素子）２およびフォトダイオード（第二
の検出素子）３上に形成されるようにしたところにあ
る。またこれらのフォトダイオード２，３の前に、アパ
ーチャ（図示せず）を配置することも好ましく、例えば
受光面が６ｍｍ×６ｍｍの矩形の検出素子の全面に直径
５ｍｍの円形アパーチャを配置することで、反応容器の
位置のずれによる反応容器側壁の影響を排除できるとい
う効果が奏される。

【００３７】本例によれば、一対のフォトダイオード
２，３を上記のように配置することで、容器から投影光
学系（レンズ４、部分反射ミラー７、レンズ５、部分反
射ミラー８等）を通してこれら一対のフォトダイオード
に照射される光は両者フォトダイオードのすべての点に
対して変化する割合を実質的に同一（差を可及的に小さ
く）にでき、容器が測光光学系に対して位置ずれ（図１
の例では、左右あるいは図の紙面に垂直な２方向で与え
られる平面上での位置ずれ）を招いても、これによる信
号変化率の違いを大幅に低減できる。

【００３８】なお、上記のフォトダイオード２および３
で測光された蛍光強度を示す信号は、図示しないＭＰＵ
に送られ所定の補正処理を行って、酵素の作用により生
成累積量が漸次増加する蛍光物質の量、実質的には複合
体を形成した酵素量を通じてサンプル中の生理活性物質
の量が定量される。

【００３９】また図１の装置のように投影光路の部分反
射ミラー８の前段にレンズ（第２の集光素子）５を設置
する場合の他、図４に示すように部分反射ミラー８の後
段にレンズ５をそれぞれ設置しても同様の作用が得られ
る。なお図４において図１と共通する部材には同じ符号
を付した。

【００４０】実施形態２ 図２に示される本例は、光源光学系と測光光学系の光軸
が直交するようにした酵素活性測定装置（蛍光検出装
置）の他一例の構成概要を示した平面図であり、実施形
態１と共通する部品及び相互の関係については、共通の
符号を付して説明は省略する。

【００４１】本例における特徴は、細長い蛍光灯を光源
１０１として用い、アパーチャ１１２、フィルター１０
９を通して、上記レンズ４とは別のレンズ１０６を通し
て容器（透明材料からなる容器）１１３に励起光を照射
するようにしているところにある。なお光源像はレンズ
１０６により略容器内に結像（形成）するようにされ、
レンズ４により蛍光物質の像がレンズ５の上に形成され
る、かつレンズ４の像がレンズ５により一対のフォトダ
イオード２，３の略検出面上に形成されるようになって
いる。

【００４２】本例によれば、実施形態１と同じ効果が得
られることに加え、一つの光源１０１を複数の並設した
蛍光検出装置に共用できるという効果が奏される。

【００４３】また図２の装置のように投影光路の部分反
射ミラー８の前段にレンズ５を設置する場合の他、図５
に示すように部分反射ミラー８の後段にレンズ５をそれ
ぞれ設置しても同様の作用が得られる。なお図５におい
て図２と共通する部材には同じ符号を付した。

【００４４】

【実施例】

実施例１ 蛍光紙の中心部を直径２ｍｍφを残して周囲を黒く塗り
つぶした紙を、図１に示した上方開放形状の内径８ｍｍ
の黒色カップの底部に、前記蛍光紙の中心部が中心位置
となるようにして動かないように詰め、図１の装置（た
だし光源としては細長い蛍光ランプを用いた）を用いて
蛍光を測定した。

【００４５】測定操作は、蛍光検出装置の測光光学系の
光軸が、黒色カップの中心（蛍光紙の中心）と略一致し
たときと、カップを水平方向に位置をずらせたときの双
方について測定した。

【００４６】蛍光強度の測定は、フォトダイオード２の
出力信号の変化、フォトダイオード３の出力信号の変化
を検出し、両者の出力信号の比（二波長蛍光）の変化
を、測光光学系の光軸が黒色カップの中心と略一致した
ときの値を１００として記録した。また比較のために、
フォトダイオード２の出力信号（一波長蛍光）の変化を
測光光学系の黒色カップの中心と略一致したときの値を
１００として記録した。これらの結果を図３に示す。

【００４７】この結果からわかるように、比較の装置で
はカップの位置を測光光学系の光軸から±３ｍｍ位置を
ずらせたときに、信号が８０％から７０％低下したのに
対し、本発明の装置では、その信号の低下は５から１２
％であり、位置ずれによる影響が大幅に低減されること
が確認された。

【００４８】実施例２ 反応容器内に存在する上記生成蛍光物質と基準蛍光物質
が、反応容器の位置のずれにより検出素子であるフォト
ダイオードの出力信号に変化する程度を調べるために次
の試験を行った。なおこの試験の生成蛍光物質として
は、アルカリ性フォスファターゼを酵素として４−メチ
ルウンベリフェリルリン酸（４ＭＵＰ；基質）が変化し
て生成する４メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）を用い
た。

【００４９】すなわち、黒色のカップ（反応容器）に、
測定対象物質としての蛍光物質として上記４メチルウン
ベリフェロン（４ＭＵ）の４０００ｎＭと、基準蛍光物
質であるダンシルアラニン（ＤＡ）の０．１ｍｇ／ｍｌ
を含む試料溶液２２０μｌを入れた反応容器を、酵素免
疫反応測定装置ＡＩＡ１２００（東ソー社製）の間欠搬
送機構の凹所に担持させて蛍光を測光するすために配置
した測光光学系の測光位置に送り込んだ。なお本例で
は、反応容器の確実な嵌挿，取出しためにこの反応容器
を搬送する間欠搬送機構の凹所の余裕（遊度（ガタ））
を約１．５ｍｍ程度として与え、これにより、上記測光
光学系の光軸と反応容器の中心位置との間に前記範囲の
遊度に応じた位置ずれを生ずるようにした。

【００５０】なお本例では例数を多数とするために、装
置としては一本のランプ（光源）で同時に複数の反応容
器内の蛍光物質を励起可能である図１の構成の装置を用
い、同じ条件で構成した二つの測光光学系に対し同じ条
件で調製した二つの反応容器を送り込む方式で試験を行
った。

【００５１】この結果、位置ずれの点を除けば全く同じ
条件で測光を行った４ＭＵ（生成蛍光物質）の蛍光強度
の変動係数（標準偏差／平均値）は、２３〜２４％とい
う比較的大きな値を示したのに対し、該４ＭＵとＤＡ
（基準蛍光物質であるダンシルアラニン）の蛍光強度の
比の変動係数は１．０６〜１．８３％という極めて小さ
な値であることが確認された。したがって、例えば基準
蛍光物質であるＤＡ（ダンシルアラニン）の蛍光強度に
基づいて４ＭＵ（生成蛍光物質）の蛍光強度を補正する
ようにすれば、測定対象物質のデータとして検出した上
記４ＭＵの変動係数を、従来の検出方法や装置に比べ
て、１／１０以下、上記試験例で言えば１／１６という
ように変動程度を極めて小さくすることが可能な高精度
な蛍光検出を実現できることになる。

【００５２】

【発明の効果】本発明によれば以下の効果が奏される。

【００５３】請求項１の発明によれば、光分離素子に対
して一対の検出素子が光学的に等価となるように配置さ
れていることにより、蛍光物質から発した蛍光は二つの
検出素子のすべての点について実質的に同一の比をとる
ことができて、試料（サンプル）を入れた容器の測光光
学系に対する位置のずれの影響を可及的に小さくした高
精度な蛍光検出ができる。

【００５４】請求項２の発明によれば、反応容器内の蛍
光物質から発する蛍光を、光分離素子上に導く光路上に
例えばレンズで構成される第一，第二の集光素子をその
順に配置し、かつこの第一のレンズによる蛍光物質の像
が第二のレンズ上に形成され、第一のレンズの像が第
一，第二の検出素子の上に形成されるように構成するこ
とで、反応容器の測光光学系に対する位置のずれの影響
をより一層軽減できるという効果がある。

【００５５】請求項４、５の発明によれば、上述した蛍
光検出装置を、免疫学的反応で結合した複合体に含まれ
る酵素の量を、この酵素の活性で生ずる蛍光物質からの
蛍光強度を利用して有効に測定できる。

【００５６】請求項６、７の発明によれば、励起光が蛍
光物質に吸収される影響を含むが、経時的な物質量の変
化がない基準蛍光物質からの蛍光強度の測光情報と、経
時的に酵素活性により物質量が変化する生成蛍光物質か
らの蛍光強度の測光情報とを、二つの光学的に等価とな
るように配置した一対の検出素子によって測光すること
ができるので、蛍光物質を収容している容器の光学系に
対する位置のずれなどの影響を解消した測光情報を得る
ことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施形態１の酵素活性測定装置（蛍光
検出装置）の構成概要を示した正面図。

【図２】本発明の実施形態２の酵素活性測定装置（蛍光
検出装置）の構成概要を示した平面図。

【図３】蛍光検出装置の測光光学系の光軸がカップの中
心と略一致したときと、カップを水平方向に位置をずら
せたときとのフォトダイオードの出力信号の変化を示し
た図。

【図４】図１の装置の変形例を示した図。

【図５】図２の装置の変形例を示した図。

【符号の説明】

１・・・光源、２・・・フォトダイオード（第一の検出
素子）、３・・・フォトダイオード（第二の検出素
子）、４，５，１０６・・・レンズ、７，８・・・部分
反射ミラー、９，１０，１１・・・フィルター、１２，
１１２・・・アパーチャ、１３，１１３・・・容器、１
４・・・蛍光物質を含む液。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 励起光照射により蛍光物質から発する蛍
   光の一部を透過し残りを反射する光分離素子と、この光
   分離素子を透過した光と反射した光の光強度をそれぞれ
   波長選択して測光するように対に設けられた第一および
   第二の検出素子とを備えた蛍光検出装置において、 前記対をなす検出素子を、前記光分離素子に対し互いに
   光学的に等価となるように配置したことを特徴とする蛍
   光検出装置。
2. 【請求項２】 請求項１において、蛍光物質から発する
   蛍光を光分離素子に導く光路上に第一の集光素子及び第
   二の集光素子をその順に配置し、かつ第一の集光素子に
   よる蛍光物質の像が第二の集光素子上に形成されると共
   に、第一の集光素子の像が前記第一及び第二の検出素子
   上に形成されるようにしたことを特徴とする蛍光検出装
   置。
3. 【請求項３】 請求項１又は２において、光分離素子は
   ダイクロイックミラー，貼り合わせプリズムなどの部分
   反射ミラーであることを特徴とする蛍光検出装置。
4. 【請求項４】 免疫学的反応で結合した複合体が含む酵
   素の反応で容器内に生ずる蛍光物質又は免疫学的反応で
   結合した複合体が含む蛍光物質を光学的に測光する蛍光
   検出装置であって、容器内の蛍光物質を励起させる光を
   照射する光源光学系と、蛍光物質から発する蛍光の一部
   を透過し残りを反射する光分離素子と、この光分離素子
   を透過した光と反射した光の光強度をそれぞれ波長選択
   して測光するように対に設けられた第一および第二の検
   出素子と、蛍光物質から発する蛍光を前記光分離素子に
   導く光路上に設けられた第一及び第二の集光素子とを備
   え、前記対をなす集光素子は、第一の集光素子による蛍
   光物質の像が第二の集光素子上に形成されると共に、第
   一の集光素子の像が第一及び第二の検出素子上に形成さ
   れるように配置して、前記対をなす検出素子が光分離素
   子に対し互いに光学的に等価となるようにしたことを特
   徴とする蛍光検出装置。
5. 【請求項５】 請求項４において、容器内の測光対象物
   質が、免疫学的反応で結合した複合体に含まれる酵素の
   作用で生成した蛍光物質と、酵素の作用はうけずに蛍光
   を発する基準蛍光物質とであり、前記いずれか一方の検
   出素子は、反応生成した蛍光物質の蛍光波長を選択して
   測光し、いずれか他方の検出素子は基準蛍光物質の蛍光
   波長を選択して測光するものであることを特徴とする蛍
   光検出装置。
6. 【請求項６】 請求項４において、容器内の測定対象物
   質が、免疫学的反応で結合した複合体に含まる蛍光物質
   と、蛍光を発する前記基準蛍光物質とであり、前記いず
   れか一方の検出素子は、複合体に含まれる蛍光物質の蛍
   光波長を選択して測光し、いずれか他方の検出素子は基
   準蛍光物質の蛍光波長を選択して測光するものであるこ
   とを特徴とする蛍光検出装置。
7. 【請求項７】 請求項４において、前記基準蛍光物質か
   らの蛍光強度の検出結果に基づき前記生成蛍光物質から
   の蛍光強度の検出結果を補正する補正手段を設けたこと
   を特徴とする蛍光検出装置。
8. 【請求項８】 請求項１ないし７のいずれかにおいて、
   検出素子で測光する光の波長選択を、光分離素子から検
   出素子へ至る光路の途中に配置した波長選択素子で行う
   ことを特徴とする蛍光検出装置。
9. 【請求項９】 請求項１ないし７のいずれかにおいて、
   光分離素子は、透過する光の波長選択機能を有すること
   を特徴とする蛍光検出装置。
10. 【請求項１０】 請求項１ないし９のいずれかにおい
    て、光源像を前記容器内に結像させる集光素子を有する
    ことを特徴とする蛍光検出装置。