JP2007232631A - 生細胞内の特定タンパク質の定量方法および標準蛍光マイクロビーズの作製方法 - Google Patents
生細胞内の特定タンパク質の定量方法および標準蛍光マイクロビーズの作製方法 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】本発明は、1)測定対象となる細胞内の標的タンパク質に由来する蛍光の強度を測定し;2)細胞の周辺に撒布した標準蛍光マイクロビーズの蛍光強度を測定し;そして、3)1)の蛍光タンパク質または蛍光化合物由来の蛍光強度と、2)の標準蛍光マイクロビーズの蛍光強度とを比較する、ことを含む。
【選択図】なし
Description
本発明は、以下の工程:
1)以下のいずれかの蛍光強度を測定し、
i)標的タンパク質が蛍光タンパク質の場合に、当該蛍光タンパク質に由来する蛍光の強度、
ii)標的タンパク質が蛍光タンパク質以外の場合に、当該標的タンパク質と融合するように構築された蛍光タンパク質に由来する蛍光の強度、または
iii)標的タンパク質が蛍光タンパク質以外の場合に、当該標的タンパク質を認識するモノクローナル抗体に結合した、または当該モノクローナル抗体に結合する二次抗体に結合した蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物に由来する蛍光の強度;
2)前記細胞の周辺に撒布した標準蛍光マイクロビーズの蛍光強度を測定し;そして、
3)1)の蛍光タンパク質または蛍光化合物由来の蛍光強度と、2)の標準蛍光マイクロビーズの蛍光強度とを比較する、ことを含む。
本発明はまた、一態様において、工程1)の蛍光タンパク質または蛍光化合物由来の蛍光と、工程2)の標準蛍光マイクロビーズの蛍光が、同種の蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物に由来する場合、標準蛍光マイクロビーズは既知分子数の蛍光タンパク質および/または蛍光化合物を担体に固定させたものであり、1細胞当たりの標的タンパク質の分子数は以下の式Iで算出される:
本発明はまた、一態様において、担体に固定させる蛍光タンパク質は1〜140万分子である。
本発明はさらに、一態様において、標的タンパク質が蛍光タンパク質以外の場合であって、工程1)において、当該標的タンパク質を認識するモノクローナル抗体に結合した、または当該モノクローナル抗体に結合する二次抗体に結合した蛍光化合物に由来する蛍光の強度を測定し、そして、標準蛍光マイクロビーズは、既知分子数の蛍光化合物を担体に固定させたものである。
本発明はまた、一態様において、標的タンパク質の分子数の定量はリアルタイムで行われる。
1)所期の量の蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物を所期の量の担体と混合し、
2)未結合の蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物の量を測定し、そして、
3)1ビーズあたりに結合した蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物の分子数を算出することを含む、前記作成方法を提供することを目的とする。
本発明は、測定対象となる細胞に存在する、標的タンパク質の分子数を定量する方法を提供する。本発明の方法は:
1)以下のいずれかの蛍光強度を測定し、
i)標的タンパク質が蛍光タンパク質の場合に、当該蛍光タンパク質に由来する蛍光の強度、
ii)標的タンパク質が蛍光タンパク質以外の場合に、当該標的タンパク質と融合するように構築された蛍光タンパク質に由来する蛍光の強度、または
iii)標的タンパク質が蛍光タンパク質以外の場合に、当該標的タンパク質を認識するモノクローナル抗体に結合させた蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物に由来する蛍光の強度;
2)前記細胞の周辺に撒布した標準蛍光マイクロビーズの蛍光強度を測定し;そして、
3)1)の蛍光タンパク質または蛍光化合物由来の蛍光強度と、2)の標準蛍光マイクロビーズの蛍光強度とを比較する、ことを含む。
本発明の方法は、測定対象となる細胞中の蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物由来の蛍光強度を測定する工程を含む。測定対象となる細胞に存在する標的タンパク質は、蛍光タンパク質および蛍光タンパク質以外のタンパク質のいずれであってもよい。
標的タンパク質が蛍光タンパク質の場合には、当該標的タンパク質自体が蛍光を発する。
標的タンパク質が蛍光タンパク質以外のタンパク質である場合には、自ら蛍光を発することがない。本態様では、標的タンパク質が蛍光タンパク質により蛍光を発するように、標的タンパク質は蛍光タンパク質と融合するように構築されている。
また、好ましい態様において、標的タンパク質が蛍光タンパク質以外のタンパク質である場合、標的タンパク質は当該標的タンパク質を認識するモノクローナル抗体に結合した、または当該モノクローナル抗体に結合する二次抗体に結合した蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物により、標的タンパク質の分子数に応じて蛍光を発する。本態様においては、蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物は標的タンパク質を認識するモノクローナル抗体に結合していても、標的タンパク質を認識するモノクローナル抗体を認識する二次抗体に結合していても、いずれでもよい。本態様においては、標的タンパク質は内因性および外因性のいずれであることも可能である。
本発明の方法は、測定対象となる細胞の周辺に撒布した標準蛍光マイクロビーズの蛍光強度を測定する工程を含む。
ここで「周辺」とは、同一のカルチャーディッシュまたは同一のマルチウェルデッシュのウェルの中の範囲という意味であり、好ましくは、蛍光顕微鏡下の観察で測定対象となる細胞と同一視野に入る範囲内をいう。
1つのマイクロビーズに結合している蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物の分子数は、以下のようにあらかじめ決定されているものである。即ち、結合している蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物の分子数の測定方法は、「IV.標準蛍光マイクロビーズの作成方法」の項目で詳述されるが、例えば以下のように行われる:i)濃度および分子数が判明している蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物溶液と粒子数が判明している担体溶液とを、緩衝液中で混合する;ii)担体と蛍光タンパク質および/または蛍光化合物の結合したビーズを分離した後、緩衝液中に残存する未結合の蛍光タンパク質および/または蛍光化合物量蛍光強度を測定する;そして、iii)ii)で測定した蛍光強度から未結合の蛍光タンパク質および/または蛍光化合物の量を決定し、1ビーズあたりに結合した蛍光タンパク質および/または蛍光化合物の分子数を算出する。この際、あらかじめ緩衝液中の蛍光強度と蛍光タンパク質および/または蛍光化合物の分子数についての検量線を作成しておき、これに基づいて未結合の蛍光タンパク質および/または蛍光化合物の量を決定することが望ましい。
本発明の標準蛍光マイクロビーズに使用される蛍光タンパク質または蛍光化合物は、標的タンパク質が蛍光タンパク質の場合には、直接的に比較することが可能なため、同種の蛍光タンパク質であることが望ましい。また、標的タンパク質が蛍光タンパク質以外であって、当該標的タンパク質が蛍光タンパク質と融合するように構築されている場合はもまた、直接的に比較することが可能なため、同種の蛍光タンパク質であることが望ましい。さらに、標的タンパク質が蛍光タンパク質以外であって、当該標的タンパク質がモノクローナル抗体に結合した、または当該モノクローナル抗体に結合する二次抗体に結合した蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物により認識される場合、直接的に比較することが可能なため、同種の蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物であることが望ましい。
本発明の方法は、測定対象となる細胞の蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物由来の蛍光強度と、標準蛍光マイクロビーズの蛍光強度とを比較する工程を含む。
また、本工程の好ましい態様において、蛍光が同種の蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物に由来する場合、1細胞あたりの標的タンパク質の分子数は、以下の式Iにより算出される。
1ビーズあたりの蛍光強度は、複数個の標準蛍光マイクロビーズの平均蛍光強度と1ビーズあたりのビーズ面積の積で求められる。ここで、ビーズ間の蛍光強度の誤差を少なくするために複数個の標準蛍光マイクロビーズ、好ましくは4〜10個、最も好ましくは8個のビーズで蛍光強度の平均をとり、この平均値を採用する。
・FITCを使用した1ビーズあたりの蛍光強度÷FITCの蛍光量子収率(0.59)×EGFPの蛍光量子収率(0.70)
の解を、「EGFPを使用した1ビーズあたりの蛍光強度」として使用することができる。ただし、使用される蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物ごとの分子吸光効率が高い場合にはこれを考慮しなければならない。ここで「蛍光量子収率」とは、吸収された光子数と放出された光子数の割合であり、多くの蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物について蛍光量子収率は公知であるし、未知であったとしても当該技術分野の慣用技術を用いてこれを測定することができる。また「分子吸光効率」とは、一定の波長の光に対する蛍光物質の吸収の強さをいう。
本発明は、既知分子数の蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物が担体に固定されていることを特徴とする、上記標的タンパク質の分子数を定量する方法に使用するための、標準蛍光マイクロビーズおよびその使用を提供する。
また、担体に固定されている蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物の分子数を定量する方法は、上述の通りであり、さらに実施例においても例示される。当該標準蛍光マイクロビーズを本発明の定量方法に使用することにより、測定対象となる細胞における、蛍光強度と分子数の関係が明らかとなり、標的タンパク質の分子数を定量することが可能となる。
本発明は、上記標的タンパク質の分子数を定量する方法に使用するための、標準蛍光マイクロビーズのセットであって、結合した蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物の数が異なる複数種類のマイクロビーズを含む、前記セットおよびその使用を提供する。
また、本発明は、既知分子数の蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物が担体に固定されていることを特徴とする、標準蛍光マイクロビーズの作成方法を提供する。
(1)所期の量の蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物を所期の量の担体と混合し、
(2)未結合の蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物の量を測定し、そして、
(3)1ビーズあたりに結合した蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物の分子数を算出することを含む。
蛍光タンパク質の量は当該技術分野で公知のアッセイにより測定することが可能であり、蛍光強度と蛍光タンパク質の量との関係が判明していれば、蛍光強度を測定することにより測定可能である。また、蛍光化合物の量は、市販の製品であればラベルに記載の情報から知ることもでき、蛍光強度と蛍光化合物量との関係が判明していれば、蛍光タンパク質同様、蛍光強度を測定することにより測定可能である。
(1)の工程に次いで、蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物を結合した担体は、例えば遠心分離などの方法により上清と分離される。担体に結合しなかった蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物の量は、(1)の工程の測定方法と同様の方法により測定されうる。好ましくは、あらかじめ使用された蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物の蛍光強度と量の関係を示す検量線を作成しておき、これに基づいて算出される。
(1)の工程で使用した蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物の分子数および担体の粒子数と、(2)の工程で決定した担体に未結合の蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物の分子数を用いて、以下の算出式により1ビーズあたりに結合した蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物の分子数を算出することができる:
・{(1)の工程で使用した蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物の分子数 − (2)の工程で決定した担体に未結合の蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物の分子数}÷(1)の工程で使用した担体の粒子数
高度に精製された6×His Tag融合EGFPタンパク質(以下EGFPと略す)をPIERCE社のBCA Compat−Able Protein Assay Kitによって正確に定量し、24.2μg/μlの50mM Tris (pH8.0) EGFP懸濁溶液を調製した。さらに、この終濃度が5,1,0.1,0.01,0.001μg/μlとなるようにTris−tween緩衝液(終濃度50mM Tris pH8.0, 0.05% Tween20, 0.05% アジ化ナトリウム)に懸濁した。
実施例1で作製した標準蛍光マイクロビーズ1〜9もしくは、PBS緩衝液でビーズ濃度を5倍希釈したもの各80μlをBDファルコン社製 Microtest 96 well Assay Plateに分注した後、富士フィルム社製蛍光アナライザーFLA−5000(励起光 473nm)で蛍光強度を測定しプロットした(図1および2)。希釈せずに測定した結果からは1ビーズあたりのEGFPが1000〜20000分子数の間で、5倍希釈したものでは1394000分子数まで蛍光強度との高い直線性が確認できた。このことから、EGFPの分子数と蛍光強度との間には一定の比例関係があることが示唆された。
EGFPを発現している細胞は、ヒト子宮由来Hela細胞の染色体上にCMV(サイトメガロウィルス)もしくはEF1−α(ヒト伸長因子)由来のプロモーター制御下のEGFP発現カセットが複数個挿入された安定形質転換細胞を用いた。これらの細胞を1ウェルあたり1×104細胞/ウェルとなるように、旭テクノガラス社製EZ Viewカルチャープレートに継代を行い、2日後細胞が接着していることを確認した後、培地を蛍光観察に適したPBS緩衝液に置き換えた。
・1細胞あたりのEGFP発現分子数=(1細胞あたりの蛍光強度)÷(1ビーズあたりの蛍光強度)×(1ビーズあたりに結合しているEGFP分子数)
・1細胞あたりの蛍光強度=1細胞の平均蛍光強度×細胞面積
・1ビーズあたりの蛍光強度=8個の蛍光マイクロビーズの平均蛍光強度×1個あたりのビーズ面積
また、本実験で得られたEGFP発現分子数が妥当な値であるかを検証するため、ウェスタンブロッティングによるEGFP発現分子数の定量を行った。CMV−EGFP安定形質転換細胞及びEF1−α−EGFP安定形質転換細胞からPIERCE社M−PER Mammalian Protein Extraction Reagent を用いてタンパク抽出を行った。4×104細胞相当のタンパク抽出液とEGFPを5,1,0.5,0.1,0.05,0.01,0.005μg(標準物質)をSDS−PAGEした後、ウェスタンブロッティング(1次抗体:Invitrogen社製 GFP抗血清、2次抗体:アマシャム社製 Anti−rabbit IgG−HRP、検出フィルム:アマシャム社製 Hyper Film MP Enveloped)により検出を行った。フィルムに感光したバンド強度をImage J ver.1.92で計測し、標準物質から得られた検量線をもとに1細胞あたりのEGFP発現分子数を定量した結果についても表4に示す。
本技術を用いて測定したEGFP安定形質転換細胞の1細胞あたりのEGFP発現分子数は、従来のウェスタン解析で算出した1細胞あたりのEGFP発現分子数とほぼ同等の値を示した。
Claims (11)
- 測定対象となる細胞に存在する、標的タンパク質の分子数を定量する方法であって、
1)以下のいずれかの蛍光強度を測定し、
i)標的タンパク質が蛍光タンパク質の場合に、当該蛍光タンパク質に由来する蛍光の強度、
ii)標的タンパク質が蛍光タンパク質以外の場合に、当該標的タンパク質と融合するように構築された蛍光タンパク質に由来する蛍光の強度、または
iii)標的タンパク質が蛍光タンパク質以外の場合に、当該標的タンパク質を認識するモノクローナル抗体に結合した、または当該モノクローナル抗体に結合する二次抗体に結合した蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物に由来する蛍光の強度;
2)前記細胞の周辺に撒布した標準蛍光マイクロビーズの蛍光強度を測定し;そして、
3)1)の蛍光タンパク質または蛍光化合物由来の蛍光強度と、2)の標準蛍光マイクロビーズの蛍光強度とを比較する
ことを含む、前記方法。 - 標準蛍光マイクロビーズが、既知分子数の蛍光タンパク質および/または蛍光化合物を担体に固定させたものである、請求項1に記載の方法。
- 工程1)の蛍光タンパク質または蛍光化合物由来の蛍光と、工程2)の標準蛍光マイクロビーズの蛍光が、同種の蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物に由来する場合、標準蛍光マイクロビーズが、既知分子数の蛍光タンパク質および/または蛍光化合物を担体に固定させたものであり、1細胞当たりの標的タンパク質の分子数を以下の式Iで算出する、請求項1または2に記載の方法。
- 標的タンパク質が蛍光タンパク質以外の場合であって、工程1)において、当該標的タンパク質を認識するモノクローナル抗体に結合した、または当該モノクローナル抗体に結合する二次抗体に結合した蛍光化合物に由来する蛍光の強度を測定し、そして、標準蛍光マイクロビーズが、既知分子数の蛍光化合物を担体に固定させたものである、請求項2または3に記載の方法。
- 測定対象となる細胞が生細胞である、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
- 標的タンパク質の分子数の定量がリアルタイムで行われる、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
- 測定対象となる細胞内における、工程1)の蛍光タンパク質および/または蛍光化合物の蛍光の強度と、工程2)の標準蛍光マイクロビーズの蛍光の強度の測定を、蛍光顕微鏡の同一視野で行う、請求項1から6のいずれか1項に記載の方法。
- 既知分子数の蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物が担体に固定されていることを特徴とする、請求項1から7のいずれか1項に記載の方法に使用するための、標準蛍光マイクロビーズ。
- 請求項1から7のいずれか1項に記載の方法に使用するための、標準蛍光マイクロビーズのセットであって、結合した蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物の分子数が異なる複数種類のマイクロビーズを含む、前記セット。
- 既知分子数の蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物が担体に固定されていることを特徴とする、標準蛍光マイクロビーズ、あるいは、結合した蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物の分子数が異なる複数種類のマイクロビーズのセットの、請求項1から7のいずれか1項に記載の方法への使用。
- 既知分子数の蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物が担体に固定されていることを特徴とする、標準蛍光マイクロビーズの作成方法であって、
1)所期の量の蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物を所期の量の担体と混合し、
2)未結合の蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物の量を測定し、そして、
3)1ビーズあたりに結合した蛍光タンパク質もしくは蛍光化合物の分子数を算出することを含む、前記作成方法。
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