JP2010210444A

JP2010210444A - 多抗原同時検出用ナノ粒子

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Publication number: JP2010210444A
Application number: JP2009057199A
Authority: JP
Inventors: Shunichi Kuroda; 俊一黒田; Takashi Matsuzaki; 高志松崎; Masumi Iijima; 益巳飯嶋
Original assignee: Beacle Inc
Current assignee: Beacle Inc
Priority date: 2009-03-10
Filing date: 2009-03-10
Publication date: 2010-09-24

Abstract

【課題】測定抗原物質を認識する抗体の由来種や対応する２次抗体の入手可能性を考慮することなく、多抗原を同時に免疫学的測定法によって検出すること本発明の課題である。また免疫学的測定における検出感度を上昇させることも課題となる。
【解決手段】本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、自己組織化能を有するタンパク質が脂質２重膜を取り込むことにより形成されるナノ粒子であって、該粒子は蛍光を発することが可能な物質によって修飾されることを特徴とし、該自己組織化能を有するタンパク質が抗体結合能を有することを特徴とする多抗原同時検出用ナノ粒子の開発に至った。
本発明の多抗原同時検出用ナノ粒子を用いることによって、測定抗原物質を認識する抗体の由来種や対応する２次抗体の入手可能性を考慮することなく、多抗原を同時に免疫学的測定法によって検出することが可能となった。
【選択図】図５

Description

本出願の発明は、自己組織化能を有するタンパク質が、脂質２重膜を取り込むことにより形成されるナノ粒子であって、該粒子は蛍光を発することが可能な物質によって修飾されており、該自己組織化能を有するタンパク質が抗体結合能を有し、該抗体によって捕捉される抗原物質を、ウエスタンブロッティング法、蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）、蛍光免疫測定法（FLISA）、細胞免疫染色法、組織免疫染色法、フローサイトメトリー法、蛍光標示式細胞分取法（FACS）、タンパク質マイクロアレイ法、in vivoイメージングなどを用いて多抗原を同時に検出するナノ粒子を提供する。

近年の免疫学的測定法の技術進歩によって、多種の抗原を測定する方法やそれに必要なツールなどが開発されている。しかしながら、このような測定に必須とされる抗体は、その機能の多様性から免疫学的測定法に使用するに当たり、様々な恩恵をもたらす一方様々な制約を課すという欠点も有する。一般的に免疫学的測定法とは、
（i）測定対象となる抗原物質を認識する抗体（１次抗体）によって捕捉させる工程、
（ii）引き続いて一次抗体を、蛍光色素・発色色素・酵素などの各種物質によって標識化された、その他の抗体（２次抗体）によって認識する工程、
（iii）該標識化する物質を検出することで、測定対象となる抗原物質を測定方法である。

ここで２次抗体は、１次抗体を特異的に認識するものであることが不可欠である。１次抗体が特殊な動物種由来のものである場合は、それに対応する２次抗体が入手不可能であることもありえる。

また、数種類の抗原を同時に測定する免疫学的測定法として免疫細胞（または組織）染色法や、フローサイトメトリー法、ＦＡＣＳ法などが挙げられる。ここで、所望の測定対象となる抗原が２種類以上存在し、各々の抗原に特異的に認識する抗体が同一の動物種由来のものしか入手できない場合は、その測定は断念されることになってしまう。なぜならば、１次抗体の検出に用いる標識化２次抗体は、通常、１次抗体の動物種を認識するため、同じ動物種由来の異なる抗原に対する１次抗体を区別することは不可能である。
さらに、数種類の標識化抗体を２次抗体として用いたとしても、それぞれの１次抗体を差別化し、異なる標識化された２次抗体をそれぞれに結合させることは極めて困難であり、同一系内での反応を行う限り不可能である。

そこで、前記の免疫細胞（または組織）染色法や、フローサイトメトリー法、ＦＡＣＳ法、タンパク質マイクロアレイ法を用いて、多抗原を同時に測定する方法ではそれぞれの抗原に対して異なる動物種の１次抗体を選択する必要があり、更にこのような選択が必須であるために、抗体の特異性の度合いや入手の容易性、価格の手頃さなどの選択の余地が少なくなる。ひいては、抗体を自作することも必要となる。たとえ運よく測定対象物質を認識する１次抗体の動物種がすべて異なる組み合わせで入手できたとしても、それぞれに対応する異なる色素によって標識化された２次抗体を入手する必要があり、最終的に測定を実現させる難易度は高い。せいぜい２〜３種類程度の抗原を同時に測定することが限度である。そこで、２次抗体を介さずに１次抗体のみで上記測定を可能にするために、１次抗体を直接標識化した製品や、所望の１次抗体を標識化するためのキットが市場に存在する。しかしながら該方法を採用するに当たって、前者の抗体は入手が容易ではないこと、後者の方法では経済的に不利な状況などがあり得ることから、多抗原同時測定の問題点を解決できていない。

抗原タンパク質を容易に解析する他の免疫学的測定法として、ウエスタンブロッティング法がある。上記の免疫細胞（または組織）染色法などの方法とは、測定対象となる物質の分子量が明確に判断される点において異なる。この方法は主に酵素が標識された２次抗体又は直接酵素が標識された１次抗体を用いることが一般的であり、標識化された酵素の働きによって基質を発色させて抗原物質を検出する方法（発色法）、または標識化された酵素の働きによって基質を発光させて抗原物質を検出する方法（発光法）が主に選択される。

これらの方法では、たとえ異なる１次抗体を用いて所望の多抗原を同時に測定するにしても、該１次抗体に対応するそれぞれの２次抗体の標識酵素を異なるものに設計しても、同時に検出する実験系において、検出する基質の発光や発色は１種類の基質しか選択することができない。したがって、様々な抗原を区別して認識することは出来ない。

ウエスタンブロッティング法においては多種のタンパク質を含むクルードサンプル中に含まれる特定のタンパク質を抗原として測定することが望ましい場合があり得る。しかしながら上記の問題点から、異なる多抗原を識別して免疫学的な測定を行うことは不可能に近く、数段階の処理に分けて手間のかかる実験操作が必要となる。そこで、蛍光標識された２次抗体を用いて、検出する方法が検出機器の技術進歩によって可能となったが、上記の免疫細胞（または組織）染色法などにおける問題点と同様に、抗体種などの組み合わせにかかる問題が生じており、画期的な解決には至っていない。

近年、市販が開始された試薬として、ＺｅｎｏｎＡｌｅｘａＦｌｕｏｒラベリングキット（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社）が存在する。しかしながら、該キットは動物種およびサブタイプ特異的な蛍光標識２次抗体であることを特徴としており、所望の多抗原を認識するすべての１次抗体に対応するものをカバーするには、動物種と抗体サブタイプ数と蛍光色素数の乗算によって得られる、多数の製品を用意する必要があるため、根本的な解決には至っていない。

免疫学的測定法において必須である１次抗体の抗原認識能は、非常に重要であるにもかかわらず、市場にはごく少量の抗原を特異的に認識する能力のない質の悪い抗体があまた存在する。しかしながら所望の抗原を測定するためには、時間的・経済的な事情により、そのような質の悪い抗体を選択せざるを得ないこともありえる。そこで、１次抗体や２次抗体の感度を上昇させる試薬があまた存在するが、すべて問題を解決するには至っておらず、画期的な技術の開発が切望されている。

本発明者らによって報告されたＰｒｏｔｅｉｎＡ由来のＺＺドメインを介して抗体を提示するタンパク質ナノ粒子は、ドラック及び遺伝子デリバリーシステムへの応用（特許文献１）や抗体整列用センシング基板などへの応用（特許文献２）に、利用可能である。

特開２００４−２３１３特開２００７−１２７６２６

本発明の多抗原同時検出用ナノ粒子を用いることで、上記のような免疫学的測定における抗体の選択の制約を回避することができ、免疫学的測定における多抗原の同時検出が可能となる。すなわち、本発明の多抗原同時検出用ナノ粒子を用いることによって、測定抗原物質を認識する抗体の由来種や対応する２次抗体の入手可能性を考慮することなく、多抗原を同時に免疫学的測定法によって検出することが可能となる。さらに、免疫学的測定における検出感度を上昇させることも可能になる。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、自己組織化能を有するタンパク質が、脂質２重膜を取り込むことにより形成されるナノ粒子であって、該粒子は蛍光を発することが可能な物質によって修飾されることを特徴とし、該自己組織化能を有するタンパク質が抗体結合能を有することを特徴とする多抗原同時検出用ナノ粒子の開発に至った。

本発明は以下の通りである。
項１
自己組織化能を有するタンパク質が、脂質二重膜を取り込むことによって形成されるナノ粒子であって、該ナノ粒子が蛍光物質によって蛍光標識化されていること及び、該自己組織化能を有するタンパク質が抗体若しくは抗体断片、または抗体結合用ポリペプチドを有することを特徴とする、多抗原同時検出用ナノ粒子。
項２
前記の自己組織化能を有するタンパク質がＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）タンパク質であるであることを特徴とする、項１に記載の多抗原同時検出用ナノ粒子。
項３
前記の抗体結合用ポリペプチドがＺＺタグであることを特徴とする、項１または項２に記載の多抗原同時検出用ナノ粒子。
項４
項１〜３に記載の多抗原同時検出用ナノ粒子を１種類以上用いて、前記の抗体若しくは抗体断片、または前記の抗体結合用ポリペプチドに結合させた抗体によって捕捉される抗原物質を、免疫学的測定法によって検出する方法。
項５
前記の抗体を結合させる工程において化学架橋剤を用いることを特徴とする、項４に記載の方法。
項６
多抗原同時検出用ナノ粒子に結合していない、遊離した抗体もしくは抗体断片を、該抗体と特異的に結合するアフィニティレジンを用いて除去する工程を含む、項４または項５のいずれかに記載の方法。
項７
多抗原同時検出用ナノ粒子に結合していない、遊離した抗体を、蛍光標識化されていない多抗原同時測定用ナノ粒子を用いて除去する工程を含む、項５〜６のいずれか１項に記載の方法。
項８
前記の抗体を結合させる工程において、多抗原同時測定用ナノ粒子と抗体の分子量のモル量の比が１：０．００５〜１：１０であることを特徴とする項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
項９
項１〜４のいずれか１項に記載の多抗原同時測定用ナノ粒子を、１種類以上含む免疫学的測定用キット。
項１０
項１〜４のいずれか１項に記載の多抗原同時測定用ナノ粒子を、２種類以上含む免疫学的測定用キット。
項１１
蛍光標識化されていない多抗原同時測定用ナノ粒子を含む項９または項１０に記載の免疫学的測定用キット。
項１２
項１〜４のいずれか１項に記載の多抗原同時検出用ナノ粒子を含む、免疫学的測定用キット組成物。

本発明の多抗原同時検出用ナノ粒子が生物種や抗体のサブタイプを問わずに広範な抗体に結合する性質を利用し、従来は同時に使用することが困難であった抗体の組み合わせでも、簡便かつ効率的に多種類の抗原を同時にバイオイメージング技術により検出する技術を提供することが出来る。したがって、本技術では（蛍光色素数）だけ用意すればよいので効率的である。また、本発明の多抗原同時検出用ナノ粒子には、１分子の抗体と比べて極めて大量の蛍光色素を結合できるので蛍光輝度が高い。さらに、本発明の多抗原同時検出用ナノ粒子はその表面に抗体を整列化して結合・提示されるので、高い抗原捕捉能力を有する。

（ａ）本発明の多抗原同時検出用ナノ粒子および、（ｂ）抗体が結合した多抗原同時検出用ナノ粒子の１つの態様を表す模式図である。本発明の多抗原同時検出用ナノ粒子に結合しない遊離抗体を除去する工程を表した模式図である。（ａ）本発明の多抗原同時検出用ナノ粒子を用いたウエスタンブロッティング法による免疫学的測定法と、従来の蛍光物質結合抗体を用いたウエスタンブロッティング法による免疫学的測定法を単一抗原の検出において比較した模式図および、（ｂ）その結果を表す図である。（ｂ）の左のパネルは、本発明の多抗原同時検出用ナノ粒子を用いた結果を示し、右のパネルは従来の蛍光標識化２次抗体を用いた結果を示す。（ａ）本発明の多抗原同時検出用ナノ粒子と市販品であるＺｅｎｏｎを用いるウエスタンブロッティング法において、単一抗原の検出の比較を表した模式図および結果の図である。（ｂ）本発明の多抗原同時検出用ナノ粒子と市販品であるＺｅｎｏｎを用いるウエスタンブロッティング法において、多抗原の検出の比較を表した模式図および結果の図である。（ａ）本発明の多抗原同時検出用ナノ粒子を用いたウエスタンブロッティング法による免疫学的測定法によって多抗原を同時検出する模式図および、（ｂ）その結果を表す図である。

この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。また、この発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋａｎｄＭａｎｉａｔｉｓ，「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔａｌ．「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ，２００７等に記載されている。

本発明の多抗原同時検出用ナノ粒子は、自己組織化能を有するタンパク質を形成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んだタンパク質発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、該形質転換体を大量培養することで産生される。好ましくは、特開２００７−１２７６２６「免疫学的測定用ナノ粒子」に記載された方法によって産生される。

本発明における脂質二重膜は、８〜２０ｎｍの厚さで２枚の脂質の層からなっており、それぞれの層の中で、両親媒性脂質の極性の頭部が親水系の溶媒と接触しており、非極性の炭化水素の部分が２重層の内部を向いているものをいう。脂質２重膜の例としては、細胞膜や核膜、小胞体膜、ゴルジ体膜、液胞膜のような生細胞における生体膜、または人工的に作製したリポソーム等が挙げられる。中でも小胞体膜由来の脂質２重膜がより好ましい。脂質二重膜としては、真核生物、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、昆虫細胞など由来のものが好ましく、特に好ましくは酵母由来の脂質二重膜が用いられる。

本発明の自己組織化能を有するタンパク質は、種々のウイルスから得られるウイルス粒子構成タンパク質を適用することができる。例として、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＢＶｉｒｕｓ；ＨＢＶ）やＣ型肝炎ウイルス（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＣＶｉｒｕｓ）、マイクロウイルス（ＭｉｃｒｏＶｉｒｕｓ）、ファージウイルス（ＰｈａｇｅＶｉｒｕｓ）、アデノウイルス（ＡｄｅｎｏＶｉｒｕｓ）、パルボウイルス（ＰａｒｖｏＶｉｒｕｓ）、パポバウイルス（ＰａｐｏｖａＶｉｒｕｓ）、レトロウイルス（ＲｅｔｒｏＶｉｒｕｓ）、レオウイルス（ＲｅｏＶｉｒｕｓ）、コロナウイルス（ＣｏｒｏｎａＶｉｒｕｓ）、カイコ細胞質多角体病ウイルス（ＢｏｍｂｙｘＭｏｒｉＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃＰｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓＶｉｒｕｓ）、レトロウイルス（ＲｅｔｒｏＶｉｒｕｓ）、レンチウイルス（ＬｅｎｔｉＶｉｒｕｓ）、カリシウイルス、ノロウイルス、サポウイルスなどの構成タンパク質や膜タンパク質、表面抗原タンパク質、または多角体タンパク質等が挙げられる。より好ましい例としては、肝炎ウイルス由来のタンパク質が挙げられる。更に好ましくはＢ型肝炎ウイルス由来のタンパク質である。最も好ましくはヒトＢ型肝炎ウイルス表面抗原(ＨＢｓＡｇ)タンパク質である。このとき、自己組織能が失われない限りにおいて、種々の変異を持つ変異体であってもよく、ＨＢｓＡｇタンパク質のアミノ酸の一部を欠失、置換、挿入させることにより、抗体提示の効率を上昇させることができる。

本発明の自己組織化能を有するタンパク質は、例えば宿主細胞に対して、由来する天然タンパク質や遺伝子工学的に組み替えられたタンパク質、種々の合成タンパク質等である。

本発明において宿主細胞とは、真核生物、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、昆虫細胞など由来のものが好ましく、より好ましくは酵母細胞である。より好ましくは、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり、特に好ましくは、ＢＹ２１４４５株、ＢＹ４７０８株、ＢＹ４７０９株、（ナショナルバイオリソースプロジェクト）またはＪＴ００７−１Ｄ株である。最も好ましくは、ＪＴ００７−１Ｄ株である。

本発明のナノ粒子は、内部に空間を有する中空ナノ粒子であっても良いものとする。その空間は必ずしも気体系の空間である必要はなく、溶液系の空間であってもよいものとする。

本発明の、自己組織化能を有するタンパク質が脂質２重膜を取り込むことにより形成されるナノサイズの粒子を生産する生物種にとくに制限はなく、真核生物、原核生物いずれによる生産であっても良いが、自己組織化能を高めるため、真核生物による生産が好ましく、さらに好ましくは酵母細胞による生産である。ウイルス、ファージなどの感染工程を含むことや、組換え体も、本発明のナノサイズの粒子を生産する生物種の範囲である。

本発明のナノ粒子は、５〜１０００ｎｍの直径を持つ粒子である。好ましくは１０〜５００ｎｍの直径を持つ粒子である。より好ましくは２０〜３００ｎｍの直径を持つ粒子である。さらに好ましくは３０〜２００ｎｍの直径を持つ粒子である。最も好ましくは４０〜１５０ｎｍの直径を持つ粒子である。

本発明の多抗原同時測定用ナノ粒子は、好ましくは、主にタンパク質と脂質、糖を主要な構成成分とし、そのうち主要な成分はタンパク質である。

本発明の抗体結合部位を持つタンパク質が自己組織化する能力を有することは、結合される抗体の高密度整列、並びに高密度提示を可能にし、免疫学的測定における感度の向上において重要な性質である。さらに、自己組織化する能力を有することは、自己組織化の過程で、他の夾雑タンパク質を排除することを示し、これは免疫学的測定の精度を向上（非特異的シグナルを抑制）させる上で重要な性質である。さらに、さらに、脂質二重膜を取り込むことによって、HBsAg Lタンパク質の膜配向性を正しく保ち，L蛋白質に含まれるZZドメインを効率よく粒子の外側へ提示可能である。

本発明における蛍光物質は、特定の波長範囲の電磁波の光エネルギーを吸収することで化合物内の電子が励起し、基底状態に戻る際に余分なエネルギーを電磁波として放出するものであれば特に限定されない。例としては、ＣｙＤｙｅ（登録商標）、ＡｌａｘａＦｌｕｏｒ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅ社：登録商標）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎＩｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ；ＦＩＴＣ）、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）、ローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴｅｔｒａｍｅｔｈｙｌＲｈｏｄａｍｉｎｅＩｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ；ＴＲＩＴＣ）テキサスレッド（登録商標）、ダンシル、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ、量子ドット、緑色蛍光タンパク質（ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）アナログ、ＬＩ−ＣＯＲｄｙｅ、ＣａｓｃａｄｅＢｌｕｅ、ＩＲＤｙｅなどが挙げられる。

本発明における多抗原同時検出用ナノ粒子には、単一の抗体に対して数種類の蛍光物質によって修飾することも可能である。他の態様として、同一の抗原を認識する数種類の抗体に対して、それぞれ異なる傾向物質によって修飾された多抗原同時検出用ナノ粒子させて用いることが可能である。本発明の多抗原同時検出用ナノ粒子を用いると、1次抗体に対して2次抗体を作用させる工程は必要なく、抗体と細胞を作用させる工程のみで済むために、測定対象となる抗原を含む細胞のバイアビリティが向上する効果が得られる。また、本発明の多抗原同時検出用ナノ粒子に修飾できる標識物質が多いため、２次抗体を用いることによって得られる感度の増幅効果が失われることはない。その際、それぞれの蛍光色素に対して吸収可能な励起光を照射することによってより詳細な解析を行うことが可能となる。具体的にこのような効果は、フローサイトメトリー法またはＦＡＣＳを用いる解析で得ることができる。ノイズ低減された情報を得ることができる。また、細胞分取の際には、より純度の高い単一性のある細胞集団を得ることが出来る。

本発明において多抗原同時検出用ナノ粒子を蛍光標識化する方法は、市販の１級アミンに所望の化合物を結合させ、被結合分子を標識化することのできる化学架橋剤を含むキットを用いてもよいものとする。例えばＡｍｅｒｓｈａｍＣｙＤｙｅｍｏｎｏｒｅａｃｔｉｖｅＮＨＳＥｓｔｅｒｓ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）、ＣｙＤｙｅＡｎｔｉｂｏｄｙＬａｂｅｌｌｉｎｇＫｉｔｓ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）、ＡｍｅｒｓｈａｍＣｙＤｙｅＭａｌｅｉｍｉｄｅｓ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）などのキットを用いることが挙げられる。架橋剤のスペーサー分子の構造は、本発明の目的が達成される範囲において特に限定されることはない。

本発明における多抗原同時検出用ナノ粒子を蛍光標識化する方法として、脂質２重膜に対して、疎水性相互作用などを機序とした方法を用いて蛍光標識化しても良いものとする。該機序によって標識できる分子の例として、Ｖｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＭｕｌｔｉｃｏｌｏｒＣｅｌｌ−ＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ *ＤｉＯ、ＤｉＩ、ＤｉＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｂｅｓ社）、ＰＫＨ６７ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＣｅｌｌＬｉｎｋｅｒＭｉｄｉＫｉｔｆｏｒＧｅｎｅｒａｌＣｅｌｌＭｅｍｂｒａｎｅＬａｂｅｌｉｎｇ（Ｓｉｇｍａ社）などが挙げられる。

本発明における多抗原同時検出用ナノ粒子を蛍光標識化する方法として、蛍光タンパク質を、自己組織化能を有するタンパク質に融合させる方法であっても良いものとする。例えば、自己組織化能を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含んだ発現ベクターに、蛍光タンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を組み込んだ発現ベクターと適当な宿主細胞を用いて、蛍光標識化多抗原同時検出用ナノ粒子を作成方法が挙げられる。すなわち、多抗原同時検出用ナノ粒子にあらかじめ蛍光タンパク質が融合した態様で、生合成によって得る方法である。本発明の蛍光タンパク質の例として、ＧＦＰ（ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰｒｏｔｅｉｎ）、ＣＦＰ（ＣｙａｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰｒｏｔｅｉｎ）、ＹＦＰ（ＹｅｌｌｏｗＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰｒｏｔｅｉｎ）、ＲＦＰ（ＲｅｄＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ）、ＯＦＰ（ＯｒａｎｇｅＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ）などが挙げられる。

本発明の多抗原同時検出用ナノ粒子に結合させることができる抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいものとする。

本発明の多抗原同時検出用ナノ粒子に結合させることができる抗体の由来となる動物種は特に限定されない。

本発明の多抗原同時検出用ナノ粒子に結合させることができる抗体は、その抗体の定常領域によって分別されるすべての種のグロブリン分子を結合させることができるものとする。

本発明の抗体断片は抗体の有する抗原認識能を有しているタンパク質又はペプチドであれば良いものとする。その例としては、植田克美監修の「抗体医薬の最前線」（シーエムシー出版）に記載の抗体断片やそれらの多価化抗体などの抗体構造物が挙げられる。

本発明の抗原物質とは、生体内における免疫システムにおいて非自己または異物と認識され、該抗原に特異性を持って結合する抗体を産生しうることのできる物質である。例えばタンパク質、タンパク質若しくはペプチド、糖鎖、糖脂質、脂質、または単純な化学物質があげられる。

本発明の多抗原同時検出用ナノ粒子において、抗体が結合する部位は抗体と特異性を持って結合する部位であれば特に限定されない。例としてはＰｒｏｔｅｉｎＡに含まれるＺドメインや、ＰｒｏｔｅｉｎＧもしくはＰｒｏｔｅｉｎＬの抗体結合部位などが挙げられる。最も好ましくはＰｒｏｔｅｉｎＡに含まれるＺドメインである。

本発明において抗体が結合する部位は、自己組織化能を有するタンパク質と疎水的に結合していてもよく、化学結合などにより共有的に結合しても良い。好ましい態様は、抗体が結合する部位が融合タンパク質として自己組織化能を有するタンパク質に融合していることである。そこで、融合の部位は自己組織化能を失わない限りにおいて、Ｎ末端からＣ末端までの全ての場所に存在し得るが、粒子を形成したときに外側に存在することが好ましい。上記の融合タンパク質の作製方法の例として、自己組織化能を有するタンパク質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んだタンパク質発現ベクターに、抗体と特異性を持って結合する部位に相当するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を挿入したタンパク質発現ベクターと、適当な宿主細胞を用いることによって、多抗原同時検出用ナノ粒子を作製する方法が挙げられる。

本発明におけるＺＺタグは、Ｚドメインと呼ばれるＰｒｏｔｅｉｎＡのもつ抗体のＦｃ領域との結合部位がタンデムに並んだドメインを示す。ＺＺタグのアミノ酸配列は、次のような繰返し配列もしくはその変異体である。ＡＱＨＤＥＡＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ（配列番号１）。ＺＺタグは分子量が小さく立体障害を起こさない観点からも好ましく用いられる。自己組織化能を有するタンパク質を形成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んだ、タンパク質発現ベクターに配列番号２のヌクレオチド配列を挿入して、適当な宿主細胞で発現させることで作製することができる。このＺＺ領域（ＺＺタグ）と呼ばれるポリペプチドもしくはその変異体を用いることで、立体障害なく、抗体をより高効率に多抗原同時検出用ナノ粒子表面に整列提示することが可能となり、免疫学的測定をより感度を向上させることも可能となる。

本発明における多抗原同時検出用ナノ粒子と測定抗原を認識する抗体分子（以下、該抗体を抗原認識抗体とする）の結合は、
（i）多抗原同時検出用ナノ粒子の抗体認識部位に、該抗体を認識することが出来るその他の抗体（以下、該抗体をアダプター抗体とする）を、多抗原同時検出用ナノ粒子に結合させる工程、
（ii）工程（i）によって多抗原同時検出用ナノ粒子に結合されたアダプター抗体と、抗原認識抗体を結合させる工程、
によって、結合の効率を上昇させることが可能となる。

別の態様として、
（i）多抗原同時検出用ナノ粒子にアダプター抗体の抗体断片を結合させる工程、
（ii）工程（i）によって多抗原同時検出用ナノ粒子に結合されたアダプター抗体の抗体断片と、抗原認識抗体を結合させる工程、
によっても、結合の効率を上昇させることが可能となる。

本発明における蛍光未標識化多抗原同時検出用ナノ粒子とは、自己組織化能を有するタンパク質が、脂質二重膜を取り込むことによって形成されるナノ粒子であって、該ナノ粒子が蛍光を発する化合物によって修飾されていないことを特徴とし、さらに該自己組織化能を有するタンパク質が抗体結合用ポリペプチドを有することを特徴とする、多抗原同時検出用ナノ粒子である。すなわち、該粒子は抗体結合能を有するものの、励起光に対して蛍光を発する能力が無い多抗原同時検出用ナノ粒子である。

本発明における抗体除去用ゲルレジンは、多抗原同時検出用ナノ粒子と結合せずに遊離した抗体と特異的に結合する抗体認識部位を有するものであればよく、抗体の定常領域に結合するものが望ましい。また、ゲルレジンとは担体に該抗体認識部位を有する分子が結合したものが望ましい。例えばプロテインＡセファロース、プロテインＧセファロース、プロテインＬセファロース、プロテインＡアガロース、プロテインＧアガロース、プロテインＬアガロース、などの抗体認識部位を有する分子がセファロースに結合したものが挙げられる。

本発明における抗体除去用ゲルレジンは、抗体と特異的に結合する抗原そのものを用いて除去することも可能である。抗原タンパク質や抗原認識部位のペプチドをアガロースやセルロースなどの担体にあらかじめ結合させておいて、前記の遊離抗体を除去することが可能である。

本発明における免疫学的測定とは、抗体と抗原の特異的な結合を用いることで、抗体によって補足される抗原分子を認識して対象の抗原分子を測定すること、または抗原によって補足される抗体分子を認識して対象の抗原分子を測定することである。例として、ウエスタンブロッティング法、蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＬＩＳＡ）、細胞免疫染色法、組織免疫染色法、フローサイトメトリー法、蛍光標示式細胞分取法(ＦＡＣＳ)、タンパク質マイクロアレイ法およびｉｎｖｉｖｏイメージング法、などが挙げられる。

本発明における免疫学的測定用キットとは、該キットに１つでも多抗原同時検出用ナノ粒子が含まれていればよいものとし、他のキット組成物と混合されて提供されてよいものとする。例えば、数種類のボトルによって提供される１のキットであって、該キットを構成する１つまたは２以上のボトルのすべてが、多抗原同時検出用ナノ粒子からなる態様で提供される場合や、１つのボトルに数種類の多抗原同時検出用ナノ粒子が含まる態様があげられる。

本発明の免疫学的測定用キット組成物とは、免疫学的測定を目的としたキットの構成物であって、１の独立した組成物としての態様であることを表す。例えば他のキットと共に用いることで、免疫学的測定が達成できることを特徴とする１のボトルに、本発明の多抗原同時測定用ナノ粒子が含まれる態様が挙げられる。

本発明における多抗原同時検出用ナノ粒子を用いて免疫学的測定を行う方法は、
（a）：多抗原同時検出用ナノ粒子と結合を所望する抗体を溶液中で混ぜ合わせ、インキュベーションする工程、
（b）：（a）の工程によって得られた溶液を、抗原と認識できる環境下に存在させ、前記の抗体によって該抗原を捕捉する工程、
（c）：（b）の工程によって捕捉された抗原を、多抗原同時検出用ナノ粒子に修飾された蛍光物質を検出・定量し、抗原を認識・測定する工程、
によって実施される。

多抗原同時検出用ナノ粒子が、既に抗体若しくは抗体断片が結合した態様で作製されていれば、上記の（a）工程は必ずしも必要ないものとする。

（a）の工程において、多抗原同時検出用ナノ粒子と前記の抗体を混ぜ合わせる際のそれぞれのモル量の比は、１：０．００５〜１：１０の範囲である。より好ましくは１：０．０１〜１：１の範囲である。更に好ましくは１：０．０２〜１：０．４の範囲である。（a）の工程において、抗体と多抗原同時検出用ナノ粒子の結合は、化学架橋剤を用いてより強固にしても良いものとする。

（a）の工程において、インキュベーションする時間は１分〜１２時間の範囲である。より好ましくは３０分〜２時間の範囲である。

（a）の工程において、インキュベーションする温度環境は４℃〜３０℃の範囲である。より好ましくは２０℃〜２５℃の範囲である。

（a）の工程と（b）の工程の間に、多抗原同時検出用ナノ粒子と結合しなかった遊離抗体を取り除く工程として
（d）：（a）の工程によって得られた溶液に、グリシンを加えて、更に抗体除去用レジンと混ぜ合わせて、インキュベーションする工程、
があってもよいものとする。

（d）の工程において、インキュベーションする時間は１０秒〜５分の範囲である。より好ましくは３０秒〜３分の範囲である。

（d）の工程において、インキュベーションする温度環境は１５℃〜３０℃の範囲である。より好ましくは２０℃〜２５℃の範囲である。

（b）の工程には、インキュベーションの環境中に多抗原同時検出用ナノ粒子から遊離した抗体を取り除くために、蛍光未標識化多抗原同時検出用ナノ粒子を同時に加えてインキュベーションしても良いものとする。

（b）および（c）の工程には、（a）の工程によって作成した２種類以上の多抗原同時検出用ナノ粒子を用いて、２種類以上の多抗原を認識・測定することが出来る。その際、各々の多抗原同時検出用ナノ粒子に標識された蛍光分子は、異なる励起波長によって励起されることが望ましい。ある程度励起波長の異なる蛍光分子の組み合わせによって多抗原を同時に認識・測定する場合は、励起光の範囲を選択するフィルターなどを工夫して組み合わせることが可能である。また、大多数の抗原を同時に認識・測定する場合であって、非常に近い励起波長を有する蛍光物質の組み合わせによる場合であっても、例えば共焦点レーザー操作顕微鏡ＬＳＭ５１０ＭＥＴＡ（Ｚｅｉｓｓ社）に搭載された、プリズムを通して励起光を選択することで、本願発明の多抗原同時測定が可能となる。具体的には、プリズムによって分けられた光を、ｅｍｉｓｓｉｓｏｎｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇなる方法で分離することの出来る方法である。このように数種類の蛍光物質をその同時検出する方法については科学雑誌ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓのＡｐｐｌｉａｔｉｏｎＮｏｔｅ「ＩｍａｇｉｎｇＳｉｘＰｒｏｔｅｉｎｓａｔａＴｉｍｅｗｉｔｈｔｈｅＬＳＭ５１０ＭＥＴＡｆｒｏｍＣａｒｌＺｅｉｓｓ．」（２００６年７月１１日オンライン発表）に記載の方法を用いることによって、当業者が実施することができる。

ウエスタンブロッティング法は所望の抗原物質の測定のみならず、該抗原の分子量情報も得られることが特徴である。そこで、本発明の多抗原同時測定用ナノ粒子をウエスタンブロッティング法に用いることによって、従来の技術よりも多くの利点が得られる。具体的な効果を以下に示す。
１．免疫沈降法によって調整したサンプルのウエスタンブロッティング法による解析
免疫沈降法とは、抗体を用いて所望の測定対象物質を濃縮することや、タンパク質―タンパク質などの生体分子間の相互作用を解析する際に多く用いられている方法である。このような免疫沈降法を用いて作製したサンプル中には測定の対象となる抗原のみならず抗体分子そのものも含まれることになる。

従来のウエスタンブロッティング法では、該方法の工程に含まれる抗体分子そのもの（重鎖：50〜70kDa、軽鎖：20〜30kDa）が検出されてしまい、目的の測定対象となる抗原分子が、抗体分子その物の分子量の範囲に該当すれば、該測定対象抗原物質の検出が出来ない問題があった。これは、ウエスタンブロッティング法の工程に含まれるＳＤＳ−ＰＡＧＥの処理によってサンプル中に含まれる抗体が変性されていても、該変性抗体を２次抗体が認識して捕捉することが問題であるためである。従って、測定対象の抗原物質を認識した1次抗体のみを認識することが出来ず、免疫沈降法とウエスタンブロッティング法の組み合わせる実験手法には常に困難が生じていた。

これらの問題を解決するために、直接標識物質が修飾された１次抗体を用いる方法、若しくは１次抗体を自ら標識用いる方法、または変性した抗体分子は認識せず、非変性の１次抗体のみを認識する２次抗体が市販されている。しかしながら前者の２つは上記の従来技術で記載したとおり、入手の困難性や経済的な面を考慮して課題が残り、後者は満足のいく結果が得られる質の２次抗体は存在しない。

そこで、本発明の多抗原同時測定用ナノ粒子をウエスタンブロッティングにて用いる際、２次抗体は必要とせずに所望の抗原を測定することが出来るので、上記のような問題は発生すらしない。また、測定対象となる抗原物質が多数のタンパク質等からなる複合体である際には、多抗原同時測定用ナノ粒子をウエスタンブロッティングにて用いることによって、同時に多数の抗原物質を測定することも可能となる。さらに、２次抗体を用いることによって得られる効果とされる、検出強度の上昇の点においても、本発明の多抗原同時測定用ナノ粒子は多数の蛍光色素を結合させることが出来るので、検出強度が２次抗体を用いる方法と比較して劣ることはない。
２．細胞内シグナルトランスダクション関連タンパク質の網羅的解析
細胞内のシグナル伝達に関与するタンパク質の解析には主にウエスタンブロッティング法が用いられる。これらのタンパク質はリン酸化を受けることによってその活性を評価することが多く、リン酸化タンパク質を特異的に認識する抗体も多く市販されている。また、これらのシグナル伝達に関与するタンパク質の多くは、ファミリーを形成しており、さらに各種タンパク質の多くは、多数のサブタイプを有する該ファミリーに属するすべてのタンパク質を網羅的に解析する際は、所望の検出対象となるすべての抗原に対して、それぞれに同一条件にて調整したサンプルを用意して、解析する必要がある。しかしながら、本発明の多抗原同時測定用ナノ粒子を用いることによって、各抗原に対して同一のサンプルを用意する必要はなく非常に有効である。本発明はそれぞれの抗体に対して、それぞれ異なる蛍光色素を有するプローブを提供することが出来るからである。

その他の態様として、前記のリン酸化タンパク質は様々な生命現象に呼応して、１のタンパク質が２以上の機能を有するものが存在し、該タンパク質は多数のリン酸化部位を有していることが多い。そこで、このような多機能タンパク質の解析においては、各種機能に対してリン酸化部位を同定することが一般的である。従って、多数のリン酸化部位を区別して認識できる抗リン酸化抗体を多数用いて、同時に該リン酸化部位を同定することも、本発明は提供することができる。
３．２種類以上のタンパク質によって構成される高次構造を有するタンパク質の解析
タンパク質には、オペロンと呼ばれる１の遺伝子群によって形成される２以上のタンパク質によって、該タンパク質の機能を発揮させる仕組みを有するものが存在する。特に、真菌類が有する酵素などにはこのような機能を持つものが多い。すなわち、該酵素の解析には、異なる２以上のタンパク質を同時に解析する必要がある。
４．生体内においてプロセッシングを受けるタンパク質の解析
生体内のタンパク質などの抗原物質は様々なプロセッシングを受ける。例えばシグナルペプチドの有無、タンパク質中のドメイン構造体の欠失若しくは付加、または糖鎖修飾の有無などである。前記のプロセッシングは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分子量変化を認識できる現象であれば、それぞれの抗原分子を、多抗原同時測定用ナノ粒子を用いて測定または解析することが可能となる。
５．ウエスタンブロッティング改変法への適用
ウエスタンブロッティング法は上記の通り抗原と抗体の相互作用によって抗原を測定する方法であるが、該方法を元に様々な変法が開発されている。例えばウエストウエスタン法、ファーウエスタン法や、ＥＭＳＡ（ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＭｏｂｉｌｉｔｙＳｈｉｆｔＡｓｓａｙ）法などである。本発明の多抗原同時測定用ナノ粒子は、１次抗体、２次抗体と抗体を作用させる工程が分かれていないので、ＰＶＤＦ膜などのタンパク質をメンブレンに転写させてタンパク質間の相互作用を測定するウエストウエスタン法やファーウエスタン法などに用いることが有効である。

上記の方法において、解析の対象となる抗原物質の計算分子量が同一か、あるいは近似していたとしても、異なる修飾を受けた抗原物質の識別は、ウエスタンブロッティング法に用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける移動度が異なることから可能である。また、それらを識別する解像度を上げることは、ポリアクリルアミドゲルを工夫することによって可能となる。

本発明の多抗原同時検出用ナノ粒子を用いて、ＦＡＣＳ用いた免疫学的測定の手法の一例を示す。

フローサイトメトリーまたは蛍光活性化セルソーター(Fluorescence Activated Cell Sorter)（ＦＡＣＳ）の方法は、Current Protocols in Cytometry and Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを基に実施することが出来る。

A．細胞質表面染色
（i）細胞を50 mLのチューブに回収する。5 分間1000 rpmで遠心し、上清を吸引除去し、1ｘPBS(-) で終濃度1ｘ10⁷ cells/mLになるように穏やかに再懸濁する工程、（ただし、接着細胞の場合トリプシン処理は行なわず、0.2%のEDTA/PBS(-)による処理で細胞を剥離後、1ｘPBS(-)で洗浄する工程となる。）
（ii）至適濃度にFACS bufferで希釈した抗体−多抗原同時検出用ナノ粒子の複合体もしくは、蛍光未標識化多抗原同時検出用ナノ粒子を10⁶ cells あたり20 μLチューブに加える工程、
（iii）調製した細胞サンプル100 mLをチューブに加え、ボルテックスをかけ、暗所・氷上で15〜30分間インキュベートし、染色反応を行う工程、
（iv）FACS buffer (2%FBS in PBS(-))で細胞を３回洗浄する。5分間1000 pmで遠心後、上清を吸引除去し、再度FACS buffer を1mL加え、穏やかに再懸濁する工程、
（v）FACS解析を行い、陽性細胞を分取する工程、
多抗原同時検出用ナノ粒子の蛍光強度は極めて高いため、従来の蛍光標識抗体を用いた方法よりも、より低出力のレーザーを用いて、低侵襲性のFACS解析が可能となり、分取後の細胞の生存率を著しく上昇させることが出来ると予想される。また、同種抗体を用いたマルチカラー解析による分取も可能となる。

B．細胞質内染色
（i）細胞を50 mLのチューブに回収する。5分間2000 rpmで遠心し、培地を吸引除去し、室温に戻した1ｘPBS(-)で終濃度1ｘ10⁷ cells/mLとなるように再懸濁する工程、
（ii）5 分間2000 rpmで遠心し、PBS(-) を除いて4℃の1ｘPBS(-)を50 mL用いて洗浄する。再度5 分間2000rpm で遠心し、PBS(-)を除く工程、
（iii）1ｘ10⁶ cellsあたり4℃の４％パラホルムアルデヒド/PBS(-) 1mLを加え、氷上で15〜30分間インキュベートし細胞を固定する工程、
（iv）4℃の1ｘPBSを50 mL用いて細胞を2 回洗浄し、遠心後上清を吸引除去する工程、
（v）10⁶ cellsあたり−20℃の100%メタノールを1 mL加え、ボルテックス後、氷上で15分間インキュベートする工程、（又は、4℃の0.1％サポニン/PBS(-)を1 mL加え、氷上で１時間インキュベートする工程、）
（vi）細胞を5分間2000 rpmで遠心し、4℃のFACS bufferを用いて2回洗浄する。
（vii）5 分間2000 rpmで遠心し上清を吸引除去する工程、
（viii）10⁷ cells あたり1 mLのFACS bufferを加え、100 μLずつチューブに分注する工程、
（ix）至適濃度にFACS bufferで希釈した抗体−多抗原同時検出用ナノ粒子の複合体もしくは、蛍光未標識化多抗原同時検出用ナノ粒子を20 μLをチューブに加え、暗所室温で1時間インキュベートし、染色反応を行う工程、
（x）1 mLのFACS buffer用いて細胞を３回洗浄し、500 μLのFACS bufferで再懸濁する。
（xi）FACS解析を行う工程。

本発明の多抗原同時測定用ナノ粒子の蛍光強度は極めて高いため、従来の蛍光標識抗体法に比べ検出感度が高く、これまで感度不足のため不可能であったFACS解析が可能となると予想される。また、同種抗体を用いたマルチカラー解析も可能となる。

本発明の多抗原同時検出用ナノ粒子を用いた、組織染色法による免疫学的測定の手法の一例を示す。
マウス組織切片（パラフィン、凍結、樹脂など）の作製
（i）スライドグラスに切片を貼付け、風乾する工程、
（ii）PBS(-)で２回x 2分間洗浄する工程、
（iii）抗マウスFc Fabフラグメント/0.2% normal goat serum in PBS(-)によって、室温で１時間ブロッキングする工程、
（iv）PBS(-)で２回x 2分間洗浄する工程、
（v）マウス由来一次抗体−多抗原同時検出用ナノ粒子の複合体を含む0.2% normal goat serum in PBS(-)によって、室温１時間反応させる工程、
（vi）PBS(-)で3回x 10分間洗浄する工程、
（vii）カバーガラスで封埋する工程、
（viii）顕微鏡を用いて観察する工程。
マルチカラー検出の場合
（i）スライドグラスに切片を貼付け、風乾する工程、
（ii）PBS(-)で２回x 2分間洗浄する工程、
（iii）抗マウスFc Fabフラグメント/0.2% normal goat serum in PBS(-)によって、室温で１時間ブロッキングする工程、
（iv）PBS(-)で２回x 2分間洗浄する工程、
（v）数種のマウス由来一次抗体−多抗原同時検出用ナノ粒子の複合体および、過剰量の未標識ZZ-BNC/0.2% normal goat serum in PBS(-)によって、室温１時間反応。
（vi）PBS(-)で3回x 10分間洗浄する工程、
（vii）カバーガラスで封埋する工程、
（viii）顕微鏡を用いて観察する工程。

本発明の多抗原同時測定用ナノ粒子を用いて、マウス組織の蛍光免疫染色を行う利点として、通常マウス組織をマウス由来抗体を一次抗体として蛍光免疫染色を行う場合、マウス組織中に含まれる内在性のマウス抗体（IgG）が一次抗体の検出に用いる２次抗体（抗マウスIgG）と反応し、高いバックグランンドとなるため、目的とする抗原の検出が極めて困難となる。この問題を解決するため、Vector社より、マウス組織中の内在性IgGを未標識抗マウスIgG Fab フラグメントによってマスクするキット（Mouse on Mouse, Vector M.O.M. Fluorescein Kit, FMK-2201）が市販されている。さらに本キットでは、マウス組織中の内在性Fc受容体によるバックグランドを回避するため、マウス由来の１次抗体の検出を、ビオチン化抗マウスIgG Fabフラグメントおよび蛍光標識アビジンを用いることを推奨している。

しかしながら、組織中の内在性マウス抗体分子であるIgGのブロッキングが十分でないことや、ビオチン−アビジン結合を用いた検出系のため、組織中の内在性ビオチンによるバックグランドが問題となるなどの問題点が多い。さらに、本キットを用いて複数のマウス由来抗体を１次抗体として多重染色では、個々の抗体についてそれぞれ別々に染色反応を行う必要があり、またその都度IgGのブロッキングから行う必要があるため、染色手順が極めて難雑であり、多くの時間と試薬が必要となる。

一方で、本発明の多抗原同時測定用ナノ粒子を用いた組織染色では、１次抗体は予め蛍光標識した抗体結合能を有するポリペプチドを含む自己組織化能を有するタンパク質によって形成されるナノ粒子上に結合又は架橋させるため、マウス組織中の内在性IgGをマスクする必要はなく、予め内在性のFc受容体を抗マウスFcもしくはFabフラグメントによってブロッキングするのみで、簡便に蛍光染色が可能である。

また特筆すべき点として、多種類のマウス由来一次抗体を用いた多重染色の場合、多抗原同時測定用ナノ粒子を用いることによって、これまで不可能であった複数の抗体の同時反応による複数抗原の同時検出が可能であり、時間と試薬を大幅に節約できる。
また、ラット組織に対して、ラット由来抗体を１次抗体として蛍光免疫染色を行う場合も同様の利点がある。

本発明の多抗原同時測定用ナノ粒子を用いて、マウス組織以外の蛍光免疫染色を行う利点として、ウエスタンブロッティング法と同様に、これまで不可能であった複数の同種由来抗体を用いた抗原の同時検出が可能となり、同一切片中に存在する複数の抗原の空間的な分布の差をより詳細に（連続切片中でずれなく）解析できる。また、多抗原同時測定用ナノ粒子の蛍光強度が高いため、高感度な検出が可能である。

以下、本発明を実施例に従いより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。

本実施例では、本発明における多抗原同時検出用ナノ粒子の１つの態様として、ＩｇＧＦｃ結合ドメインであるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＰｒｏｔｅｉｎＡ由来のＺドメインを２個タンデムに有し、変異型ＨＢｓＡｇのＬタンパク質で構成されるナノ粒子であることを特徴とする、ＺＺ粒子（以下ＺＺ−ＢＮＣ）に対して、種々のＣｙＤｙｅ蛍光色素（Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７）を標識したＣｙ−ＺＺ−ＢＮＣ（Ｃｙ２−ＺＺ−ＢＮＣ、Ｃｙ３−ＺＺ−ＢＮＣ、Ｃｙ５−ＺＺ−ＢＮＣ、Ｃｙ７−ＺＺ−ＢＮＣ）を作製し、更に各種抗体をそれぞれ異なる蛍光標識化ＺＺ−ＢＮＣ結合にさせて、抗体−Ｃｙ−ＺＺ−ＢＮＣ複合体を作製した。前記抗体に対応する各抗原タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後に、ＰＤＶＦ膜へ転写した。該ＰＶＤＦ膜に対して、各種抗体−Ｃｙ−ＺＺ−ＢＮＣ複合体をプローブとして抗原タンパク質の検出をウエスタンブロッティング法によって行った。前記各抗原蛋白質の検出は、フルオロ・イメージアナライザーＦＬＡ−９０００（富士フィルム、日本）を用いて行った。

その結果、単一抗原の検出系においては、一次及び二次抗体を用いる従来の蛍光発光法と比較して、検出される抗原シグナルの強度が増加し、さらに抗原の検出限界が上昇した。また、手法の簡便化により操作時間が短縮された。

多種抗原検出系においては、同種由来の抗体の使用にもかかわらず、該抗体を同時に使用しても多種抗原を一度に検出（マルチカラー検出）することが可能となり、更には抗原の蛍光強度および検出限界が上昇した。したがって、多抗原同時検出用ナノ粒子を用いた高感度マルチカラーバイオイメージングへの新しい応用技術が開発された。
実施例１：Ｃｙ蛍光色素標識ＺＺ−ＢＮＣ（Ｃｙ−ＺＺ−ＢＮＣ）の作製
本実施例では、本発明者らによって報告されたＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２Ｊａｎ２５；２６７（３）：１９５３−６１．記載の遺伝子組換え酵母（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＡＨ２２Ｒ⁻（ｌｅｕ２⁻）株）の記載に基づいて作製した、ＺＺタグを提示するＨＢｓＡｇのＬタンパク質を発現するＺＺ−ＢＮＣ（特許出展）を用いた。

種々のＣｙ蛍光色素［Ｃｙ２ｂｉｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｅａｃｔｉｖｅｄｙｅｔｏｌａｂｅｌ，Ｃｙ３ｂｉｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｅａｃｔｉｖｅｄｙｅｔｏｌａｂｅｌ，Ｃｙ５ｂｉｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｅａｃｔｉｖｅｄｙｅｔｏｌａｂｅｌ，Ｃｙ７ｂｉｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｅａｃｔｉｖｅｄｙｅｔｏｌａｂｅｌ（ジーイーヘルスケア、米国）］に、ＺＺ−ＢＮＣ（１ｍｇ／ｍｌ）を各々添加し、室温で１時間反応させた。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ(-)、ｐＨ７．４）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５クロマトグラフィー（ジーイーヘルスケア）１０ｍｌに供し、その後ＰＢＳで溶出して、各種Ｃｙ−ＺＺ−ＢＮＣ（Ｃｙ２−ＺＺ−ＢＮＣ、Ｃｙ３−ＺＺ−ＢＮＣ、Ｃｙ５−ＺＺ−ＢＮＣ、Ｃｙ７−ＺＺ−ＢＮＣを回収した（図１−ａ）。
実施例２：抗体−Ｃｙ−ＺＺ−ＢＮＣ複合体の作製
単一抗原の検出系において、５ μｇのＣｙ２−ＺＺ−ＢＮＣと、１ μｇのａｎｔｉ−ｖｉｍｅｎｔｉｎｍｏｕｓｅＩｇＧ２ａ（プロゲン）をＰＢＳ５０ μｌに添加し、その後室温で３０分間反応させて、ａｎｔｉ−ｖｉｍｅｎｔｉｎ−Ｃｙ２−ＺＺ−ＢＮＣ複合体を作製した（図１−ｂ）。

また、マルチカラー検出系では、５μｇ各種Ｃｙ−ＺＺ−ＢＮＣと測定対象となる各種抗原に対する１ μｇの抗体、および５０μＭのＢＳ３（ピアス、ロックフォード、イリノイ、米国）をＰＢＳ５０ μｌ中に添加し、室温で３０分間反応させた後、１００μＭＧｌｙｃｉｎｅを加え、反応を停止した。各種多抗原同時測定用ナノ粒子と抗体の組み合わせは、Ｃｙ２−ＺＺ−ＢＮＣに対してａｎｔｉ−ＧＳＴｍｏｕｓｅＩｇＧ２ａ（ナカライテスク、京都、日本）、Ｃｙ３−ＺＺ−ＢＮＣに対してａｎｔｉ−ａｃｔｉｎｍｏｕｓｅＩｇＧ２ａ（シグマ、セントルイス、ミズーリ州、米国、Ｃｙ５−ＺＺ−ＢＮＣに対してａｎｔｉ−ｔｕｂｕｌｉｎｍｏｕｓｅＩｇＧ２ｂ（ミリポア)、Ｃｙ７−ＺＺ−ＢＮＣに対してａｎｔｉ−ｄｅｓｍｉｎｍｏｕｓｅＩｇＧ２ａ（アブノバ）である（図４−ａ）。反応停止後に残存する、遊離の抗体を除くために、ＰＢＳで平衡化したｎＰｒｏｔｅｉｎＡｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦａｓｔＦｌｏｗ（ジーイーヘルスケア）１００ μｌに該反応液を添加し、室温で１５分間インキュベーションした後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、２分間、４℃）をおこない、各抗体−Ｃｙ−ＺＺ−ＢＮＣ複合体（ａｎｔｉ−ＧＳＴ−Ｃｙ２−ＺＺ−ＢＮＣ、ａｎｔｉ−ａｃｔｉｎ−Ｃｙ３−ＺＺ−ＢＮＣ、ａｎｔｉ−ｔｕｂｕｌｉｎ−Ｃｙ５−ＺＺ−ＢＮＣ、ａｎｔｉ−ｄｅｓｍｉｎ−Ｃｙ７−ＺＺ−ＢＮＣ）を回収した（図２）。各抗体−Ｃｙ−ＺＺ−ＢＮＣ複合体に未蛍光標識で、かつ抗体の結合していないＺＺ−ＢＮＣ（５ μｇ）を添加し、３０分間反応させた後、前記の４種類の抗体−Ｃｙ−ＺＺ−ＢＮＣ複合体を混合して、マルチカラー用の抗体−Ｃｙ−ＺＺ−ＢＮＣ複合体を作製した。
実施例３：抗体−Ｃｙ−ＺＺ−ＢＮＣ複合体を用いた単一抗原検出法と蛍光発光検出法（従来法）との比較（図３−ａ）
抗原［Ｖｉｍｅｎｔｉｎ（プロゲン）；分子量約５５ｋＤａ］（５００、５０、５、０．５ｎｇ）を１４％ゲルのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬｔｒａｎｓｆｅｒｍｅｍｂｒａｎｅ，ミリポア）に転写した。ブロッキングバッファー［５％スキムミルク／ＴＢＳＴ（０．２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１．４ＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）］を用いて、該ＰＶＤＦ膜を４℃の環境下にて５０ｍｌで１時間ブロッキングした後、５００ μｌのブロッキングバッファーと混合したａｎｔｉ−ｖｉｍｅｎｔｉｎ−Ｃｙ２−ＺＺ−ＢＮＣ複合体（５０ μｌ）を、室温で１時間作用させた。

また比較実験例として、蛍光標識２次抗体を使用した蛍光発光検出法（従来法）を同時に行った。従来法は、ブロッキングバッファーにて１／１０００に希釈した一次抗体（ａｎｔｉ−ｖｉｍｅｎｔｉｎ）を、室温で１時間、転写後のＰＶＤＦ膜と作用させ、その後ＴＢＳＴで洗浄した。引きつづき前記のＰＶＤＦ膜に対して、ブロッキングバッファーにて１／１００に希釈した二次抗体［Ｃｙ２−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＧｏａｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ジャクソンイムノリサーチ）］を、室温で１時間作用させた。最後に、該ＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴで洗浄後、フルオロ・イメージアナライザーＦＬＡ−９０００（富士フィルム、日本）を用いて解析した。

結果を図３−ｂに示す。抗原であるｖｉｍｅｎｔｉｎは、多抗原同時検出用ナノ粒子を用いた方法では５ｎｇ、従来法では５０ｎｇまで検出されたことから、従来法と比較して検出限界が約１０倍上昇し、更に蛍光強度も上昇した。すなわち、抗体のみからなる従来法と比較して、本発明の多抗原同時検出用ナノ粒子を用いる方法のほうが優れていることがわかる。これは、多抗原同時検出用ナノ粒子に結合させることのできる蛍光物質の量が多いために生ずる結果である。さらに、多抗原同時検出用ナノ粒子に結合させることのできる抗体の量が多いことにも起因する。また、検出方法の簡便化されたことによって操作時間が短縮された。
実施例４：抗体−Ｃｙ−ＺＺ−ＢＮＣ複合体およびＺｅｎｏｎのシングルカラーとマルチカラー検出の比較
シングルカラー検出法では、各々５００、５０、５、または０．５ｎｇの各種抗原［Ａｃｔｉｎ（シグマ社；分子量約４２ｋＤａ）またはＤｅｓｍｉｎ（プロゲン社；分子量約５３ｋＤａ）]を測定対象サンプルとした。これらの測定対象サンプルを、１４％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって分離した。その後、測定対象サンプルを、ＰＶＤＦ膜に転写した後、該ＰＶＤＦ膜を５０ｍｌのブロッキングバッファーを用いて４℃の環境下、１時間ブロッキングした。ＰＶＤＦ膜は、各々の測定対象抗原を評価するために、二枚作製した。

４５０μｌのブロッキングバッファーに混合させたａｎｔｉ−ａｃｔｉｎ−Ｃｙ２−ＺＺ−ＢＮＣ複合体またはａｎｔｉ−ｄｅｓｍｉｎ−Ｃｙ２−ＺＺ−ＢＮＣ複合体（実施例２で作製したもの）を、前記のそれぞれのＰＶＤＦ膜に添加して室温で１時間作用させた（図４のａ上段左側）。この時、平行してＺｅｎｏｎＭｏｕｓｅＩｇＧラベリングキット（モレキュラープローブ）での検出をプロトコルにしたがって行った。Ａｌｅｘａ５５５標識ｌａｂｅｌｉｎｇｒｅａｇｅｎｔ５ μｌとａｎｔｉ−ａｃｔｉｎｍｏｕｓｅＩｇＧ２ａを１ μｇまたはａｎｔｉ−ｄｅｓｍｉｎｍｏｕｓｅＩｇＧ２ａを１ μｇ、ＰＢＳ１０ μｌ中に添加し、室温で５分間反応させた後、ｂｌｏｃｋｉｎｇｒｅａｇｅｔ５ μｌを添加し、室温で５分間反応させた。該反応液とブロッキングバッファー５００ μｌと混合し、前記のそれぞれのＰＶＤＦ膜に添加して室温で１時間作用させた（図４のａ上段右側）。最後に、各ＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴで洗浄後、フルオロ・イメージアナライザーＦＬＡ−９０００で解析した。

マルチカラー検出法では、２種類の抗原［ＡｃｔｉｎまたはＤｅｓｍｉｎ]を、それぞれ５００、１００、２０、４ｎｇずつ等量混合し、測定対象サンプルとした。これらの測定対象サンプルを、１４％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。その後、測定対象サンプルを、ＰＶＤＦ膜に転写した後、該ＰＶＤＦ膜を５０ｍｌのブロッキングバッファーを用いて４℃の環境下、１時間ブロッキングした。

４００ μｌのブロッキングバッファーと混合させた、２種のマルチカラー用抗体−Ｃｙ−ＺＺ−ＢＮＣ複合体（ａｎｔｉ−ａｃｔｉｎ−Ｃｙ３−ＺＺ−ＢＮＣおよびａｎｔｉ−ｄｅｓｍｉｎ−Ｃｙ５−ＺＺ−ＢＮＣ；それぞれ実施例２で作製したもの）を、前記のブロッキング後のＰＶＤＦ膜に添加して室温で１時間作用させた（図４のｂ上段左側）。この時、平行してＺｅｎｏｎＭｏｕｓｅＩｇＧラベリングキットでの検出をプロトコルにしたがって行った。各Ａｌｅｘａ標識ｌａｂｅｌｉｎｇｒｅａｇｅｎｔ５ μｌと各種抗原に対する抗体を１ μｇ（Ａｌｅｘａ５５５標識ｌａｂｅｌｉｎｇｒｅａｇｅｎｔとａｎｔｉ−ａｃｔｉｎｍｏｕｓｅＩｇＧ２ａ、Ａｌｅｘａ６４７標識ｌａｂｅｌｉｎｇｒｅａｇｅｎｔとａｎｔｉ−ｄｅｓｍｉｎｍｏｕｓｅＩｇＧ２ａ）、ＰＢＳ１０ μｌ中に添加し、室温で５分間反応させた後、ｂｌｏｃｋｉｎｇｒｅａｇｅｔ５ μｌを添加し、室温で５分間反応させた。２種の複合体を含む該反応液とブロッキングバッファー５００ μｌに加えて混合し、前記のＰＶＤＦ膜に添加して室温で１時間作用させた（図４のｂ上段右側）。最後に、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴで洗浄後、フルオロ・イメージアナライザーＦＬＡ−９０００で解析した。

結果を、図４のａ、ｂの各下段示す。シングルカラーおよびマルチカラーの両方の検出法において、本発明の多抗原同時測定用ナノ粒子は、Ｚｅｎｏｎより蛍光強度が上昇し、検出限界が約５〜１０倍上昇した。これらの結果は、上記の実施例３の結果と同様に、本発明の多抗原同時測定用ナノ粒子が多数の蛍光色素及び抗体を結合させる能力を有するからである。
実施例５：同種由来の各抗体−Ｃｙ−ＺＺ−ＢＮＣ複合体を用いた多種抗原の同時検出法（マルチカラー検出法；図５−ａ）
各５００ｎｇの各種抗原［ＧＳＴ；分子量約３０ｋＤａ、Ａｃｔｉｎ、Ｔｕｂｕｌｉｎ（サイトスケルトン社；分子量約５５ｋＤａ）、Ｄｅｓｍｉｎ］を単一測定対象サンプルとした。また、マルチカラー検出法の測定対象サンプルとしては前記４種類の抗原を混合したものを用いた。これらの測定対象サンプルを、１４％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって分離した。その後、測定対象サンプルをＰＶＤＦ膜に転写した後、該ＰＶＤＦ膜を５０ｍｌのブロッキングバッファーを用いて４℃の環境下、１時間ブロッキングした。

３００ μｌのブロッキングバッファーに混合させた、マルチカラー用の抗体−Ｃｙ−ＺＺ−ＢＮＣ複合体（実施例２にて作製した４種類の多抗原同時測定用ナノ粒子の混合物）を、前記のブロッキング後のＰＶＤＦ膜に添加して室温で１時間作用させた。最後に、該ＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴで洗浄後、フルオロ・イメージアナライザーＦＬＡ−９０００（富士フィルム）を用いて、解析した。

結果を、図５−ｂに示す。最も左のレーン（Ｍｉｘ．）が、各種抗原を混合したサンプルである。混合サンプルを構成する各種抗原であるＧＳＴ、Ａｃｔｉｎ、Ｔｕｂｕｌｉｎ、およびＤｅｓｍｉｎが、それぞれ分子量３０ｋＤａ、４２ｋＤａ、５５ｋＤａ、５３ｋＤａとして検出された。各々の抗原を捕捉する抗体と多抗原同時検出用ナノ粒子が有する標識蛍光色素の色の組み合わせを考慮することで、同一レーン内の分子量の異なる抗原をそれぞれに識別し、さらに検出することに成功したものである。最も左のレーンの混合サンプルを構成する各々の抗原の確認は、右に並ぶ４つのレーン（単一測定対象サンプル）の結果と比較して行うことが出来る。

したがって、同種由来の抗体を２種類以上同時に使用しても、各々認識するそれぞれの抗原をクロストークすること無く、同時に検出することが可能であった（マルチカラー検出）。

本発明の多抗原同時検出用ナノ粒子は、大学や研究機関にて用いられる各種免疫学的測定法の実験試薬として用いることが可能である。また、再生医療や免疫医療などの医療の場面で、フローサイトメーターによる細胞の調整に用いることも可能である。

Claims

自己組織化能を有するタンパク質が、脂質二重膜を取り込むことによって形成されるナノ粒子であって、該ナノ粒子が蛍光物質によって蛍光標識化されていること及び、該自己組織化能を有するタンパク質が抗体若しくは抗体断片、または抗体結合用ポリペプチドを有することを特徴とする、多抗原同時検出用ナノ粒子。
前記の自己組織化能を有するタンパク質がＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）タンパク質であるであることを特徴とする、請求項１に記載の多抗原同時検出用ナノ粒子。
前記の抗体結合用ポリペプチドがＺＺタグであることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の多抗原同時検出用ナノ粒子。
請求項１〜３に記載の多抗原同時検出用ナノ粒子を１種類以上用いて、前記の抗体若しくは抗体断片、または前記の抗体結合用ポリペプチドに結合させた抗体によって捕捉される抗原物質を、免疫学的測定法によって検出する方法。
前記の抗体を結合させる工程において化学架橋剤を用いることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
多抗原同時検出用ナノ粒子に結合していない、遊離した抗体もしくは抗体断片を、該抗体と特異的に結合するアフィニティレジンを用いて除去する工程を含む、請求項４または請求項５のいずれかに記載の方法。
多抗原同時検出用ナノ粒子に結合していない、遊離した抗体を、蛍光標識化されていない多抗原同時測定用ナノ粒子を用いて除去する工程を含む、請求項５〜６のいずれか１項に記載の方法。
前記の抗体を結合させる工程において、多抗原同時測定用ナノ粒子と抗体の分子量のモル量の比が１：０．００５〜１：１０であることを特徴とする請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
請求項１〜４のいずれか１項に記載の多抗原同時測定用ナノ粒子を、１種類以上含む免疫学的測定用キット。
請求項１〜４のいずれか１項に記載の多抗原同時測定用ナノ粒子を、２種類以上含む免疫学的測定用キット。
蛍光標識化されていない多抗原同時測定用ナノ粒子を含む請求項９または請求項１０に記載の免疫学的測定用キット。
請求項１〜４のいずれか１項に記載の多抗原同時検出用ナノ粒子を含む、免疫学的測定用キット組成物。