JPWO2017175523A1 - 蛍光免疫染色法 - Google Patents

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Abstract

染色対象である抗原Ｐに対して１次抗体１ａ、１ｂを特異的に結合・固定させる第１反応工程と、蛍光ナノ粒子５により修飾された又は後に修飾される２次抗体２ａを、結合・固定された１次抗体１ａ、１ｂに対して特異的に結合させる第２反応工程と、を含む蛍光免疫染色法であって、抗原Ｐに対して１次抗体1ａ、１ｂを介して２次抗体２ａを複数固定させる、低発現の抗原を検出できる蛍光免疫染色法。

Description

本発明は、従来よりも高い蛍光シグナルを得ることができる蛍光免疫染色法に関する。
従来、病理診断用データを得るために、疾病が疑われる被験者の体組織の生検サンプルから標本スライドを作成し、該標本スライド中に前記疾病に起因する抗原（特定抗原）が含まれているか否かを、特定抗体を用いて判断する蛍光免疫染色法が行われている。
例えば、標本スライド中の特定抗原に対して１次抗体、および蛍光標識した２次抗体を順次結合させて、蛍光により特定抗原の有無を判別する方法が行われる（例えば、特許文献１）。
特許文献１には、蛍光免疫染色法として、標本スライドのＨＥＲ２（特定抗原）に対し抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体（４Ｂ５）（１次抗体）を結合させ、該１次抗体に対してビオチン標識抗ウサギ抗体（２次抗体）を結合させた後、蛍光色素内包樹脂粒子（蛍光ナノ粒子）−ストレプトアビジン（ＳＡ）複合体のＳＡ部分を２次抗体のビオチンに結合させて、特定抗原の有無を判別する方法が開示されている。
ここで、一般的には、上述した従来技術（特許文献１）のように、１次抗体および２次抗体として、モノクローナル抗体が使用されている。
特開２０１５−０５９８０６号公報
しかしながら、１次抗体と２次抗体にモノクローナル抗体を使用すると、１つの抗原に対して、１次抗体および蛍光ナノ粒子がそれぞれ１個のみ結合・固定されるに留まり、低発現の抗原を検出しにくいという問題がある。
本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、低発現の抗原を検出できる蛍光免疫染色法の提供をすることを目的とする。
本発明者は、１つの抗原分子に対して、１次抗体を介して、蛍光ナノ粒子で蛍光標識した（又は将来的にされる）２次抗体を２つ以上固定させて増感することにより上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は次のような蛍光免疫染色法を提供する。
［１］染色対象である抗原に対して１次抗体を特異的に結合・固定させる第１反応工程と、２次抗体を、前記結合・固定された１次抗体に対して特異的に結合させる第２反応工程と、前記２次抗体を蛍光ナノ粒子により蛍光標識する第３反応工程と、を含む蛍光免疫染色法であって、
前記抗原１分子に対して前記１次抗体を介して前記２次抗体を複数固定させる、蛍光免疫染色法。
［２］前記１次抗体が遊離の１次抗体であり、前記２次抗体が遊離の２次抗体である、［１］に記載の蛍光免疫染色法。ここで、「遊離の１次抗体」とは、支持体等に固定されていない遊離状態の１次抗体を意味する。また、「遊離の２次抗体」とは、支持体等に固定されていない遊離状態の２次抗体を意味する。
［３］前記１次抗体が蛍光物質を含まない非蛍光性ナノ粒子の表面に固定された１次抗体であり、前記２次抗体が遊離の２次抗体である、［１］に記載の蛍光免疫染色法。
［４］前記１次抗体が遊離の１次抗体であり、前記２次抗体が蛍光ナノ粒子の表面に固定された２次抗体である、［１］に記載の蛍光免疫染色法。
［５］前記１次抗体が非蛍光性ナノ粒子の表面に固定された１次抗体であり、前記２次抗体が蛍光ナノ粒子の表面に固定された２次抗体である、［１］に記載の蛍光免疫染色法。
［６］前記１次抗体がポリクローナル抗体であり、前記２次抗体がモノクローナル抗体である、［１］〜［５］のいずれかに記載の蛍光免疫染色法。
［７］前記１次抗体がモノクローナル抗体であり、前記２次抗体がポリクローナル抗体である、［１］〜［５］のいずれかに記載の蛍光免疫染色法。
［８］前記１次抗体がポリクローナル抗体であり、前記２次抗体がポリクローナル抗体である、［１］〜［５］のいずれかに記載の蛍光免疫染色法。
［９］前記１次抗体がモノクローナル抗体であり、前記２次抗体がモノクローナル抗体である、［１］，［３］〜［５］のいずれかに記載の蛍光免疫染色法。
［１０］前記２次抗体に第２結合基物質が付加されており、前記蛍光ナノ粒子に第１結合基物質が付加されており、
第２反応工程の後に、第１結合基物質と第２結合基物質との特異的な結合を介して前記２次抗体と蛍光ナノ粒子とが結合することで前記蛍光標識がなされる、［１］に記載の蛍光免疫染色法。
［１１］前記第１結合基物質／第２結合基物質の組合せが、ビオチン／アビジン，またはハプテン／抗ハプテン抗体である、［１０］に記載の蛍光免疫染色法。
本発明により、低発現の抗原を検出できる蛍光免疫染色法の提供がなされ、従来技術より高感度で抗原を検出することが可能となる。また、タンパク質の定量性の精度も高まる。
図１（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ本発明に係る蛍光免疫染色法の第１〜第３実施形態を示す図である。 図２（Ｄ）〜（Ｇ）は、本発明に係る蛍光免疫染色法の第４〜第７実施形態を示す図である。 図３（Ｈ）〜（Ｋ）は、本発明に係る蛍光免疫染色法の第８〜第１１実施形態を示す図である。 図４（Ｌ）〜（Ｏ）は、本発明に係る蛍光免疫染色法の第１２〜第１５実施形態を示す図である。
本願発明に係る蛍光免疫染色法は、染色対象である抗原に対して１次抗体を特異的に結合・固定させる第１反応工程と、２次抗体を、前記結合・固定された１次抗体に対して特異的に結合させる第２反応工程と、前記２次抗体を蛍光ナノ粒子により蛍光標識する第３反応工程と、を含む蛍光免疫染色法であって、前記抗原１分子に対して前記１次抗体を介して前記２次抗体を複数固定させることを特徴とする。
以下、先ず本発明に係る蛍光免疫染色法に用いられる各要素について説明する。
［抗原］
抗原は、標本スライドに発現している生体物質、特にタンパク質（抗原）であって、主に病理診断の観点からの定量ないし検出のために、蛍光標識体を用いた免疫染色の対象とするものを指す。本発明を適用することができる抗原の例としては、各種の癌組織の細胞膜で発現しており、バイオマーカーとして利用することができる生体物質、たとえば、癌細胞で発現が上昇し、免疫チェックポイントに関係する膜貫通型タンパク質のＰＤ−Ｌ１（Programmed cell death1 ligand 1）であったり、或いは、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）（Epidermal Growth Factor Receptor：上皮増殖因子受容体）、ＨＥＲ２（Human Epidermal Growth Factor Receptor：ヒト上皮増殖因子受容体）、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＶＥＧＦＲ（Vasular Endothelial Growth Factor Receptor：血管内皮細胞増殖因子受容体）、ＩＧＦＲ（Insulin-like Growth Factor Receptor：インスリン様増殖因子受容体）、ＨＧＦＲ（Hepatocyte Growth Factor Receptor：肝細胞増殖因子受容体）といった増殖因子の受容体（レセプター）や、T細胞表面上にある重要な抑制性の免疫チェックポイント分子であって上記ＰＤ−Ｌ１の受容体であるＰＤ−１（Programmed cell death 1）などの免疫系の受容体であるタンパク質が挙げられる。ＥＧＦＲ／ＨＥＲには、大腸癌などの癌組織において過剰発現しているＥＧＦＲ／ＨＥＲ１（ＥｒｂＢ１とも呼ばれる）、乳癌などの癌組織において過剰発現しているＥＧＦＲ２／ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２、ｎｅｕとも呼ばれる）、ＥＧＦＲ３／ＨＥＲ３およびＥＧＦＲ４／ＨＥＲ４が包含される。ＶＥＧＦＲには、肝臓癌、食道癌などの癌組織における血管内皮細胞において発現が亢進しているＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１とも呼ばれる）、ＶＥＧＦＲ−２（Ｆｌｔ−２、ＫＤＲとも呼ばれる）およびリンパ管内皮細胞において発現が亢進しているＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ−４とも呼ばれる）が包含される。たとえばＰＤ−Ｌ１は、癌に係る病理診断において本発明の方法を実施する際の抗原として好適である。
［１次抗体］
１次抗体は、抗原にユニークなエピトープを認識する抗体であり、遊離の１次抗体であってもよいし、後述する蛍光体を内包しないナノ粒子（非蛍光性ナノ粒子）の表面に直接または間接的に固定された１次抗体であってもよい。ポリクローナル抗体を１次抗体として使用する場合、ポリクローナル抗体として、抗原分子のエピトープを含む特定の配列部分を免疫抗原にして作成される一般的なポリクローナル抗体を用いることができるが、これに限らず、例えば、２種類以上のモノクローナル抗体の混合物をポリクローナル抗体の代替（同等品）として使用してもよい、この場合、抗体ごとに異なるエピトープについて特異的に結合するモノクローナル抗体の組合せが好ましい。
１次抗体は、抗原に結合した状態で２次抗体が結合可能であれば、天然の抗体のように全長を有するものである必要はなく、抗体断片または誘導体であってもよい。すなわち、本明細書における「抗体」という用語には、全長の抗体だけでなく、抗体断片、キメラ抗体（ヒト化抗体等）、多機能抗体などの誘導体が包含される。
なお、１次抗体を産生する動物（免疫動物）の種類は特に限定されるものではなく、従来と同様、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどから選択すればよい。
１次抗体としては、ＩｇＧ抗体を好適に用いることができる。たとえば、ＰＤ−Ｌ１を抗原とする場合は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、ＨＥＲ２を抗原とする場合は抗ＨＥＲ２抗体を用いることができる。
〈非蛍光性ナノ粒子表面に直接結合した１次抗体〉
１次抗体は、上述のように、遊離抗体の他に、直径ｎｍオーダー（主に１〜１０００ｎｍ）の非蛍光性ナノ粒子（後述）の表面に直接固定させた１次抗体であってもよい。
（非蛍光性ナノ粒子）
非蛍光性ナノ粒子は、蛍光物質を含まないナノメートルオーダーのナノ粒子であって、１次抗体が有する官能基と結合可能な官能基を有するか、または導入可能なものであれば有機ナノ粒子でも無機ナノ粒子でもよい。
有機ナノ粒子として、例えば、ポリスチレン、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、アクリル樹脂、尿素樹脂等の樹脂製のナノ粒子を使用することができる。
基本的に、非蛍光性のナノ粒子は、蛍光体を使用しない（添加しない）以外は、後述する蛍光ナノ粒子の製造方法と同様に製造することができる。
非蛍光性のナノ粒子の平均粒子径は、未反応の１次抗体数（＝２次抗体結合可能量）、ひいては検出感度を決定する要素の１つである。そのため、製造時に非蛍光性ナノ粒子の平均粒子径を適切な範囲に調整することが好ましい。非蛍光性ナノ粒子の平均粒子径は、シグナル検出可能な感度が損なわない範囲であれば特に限定されないが、好ましくは５０ｎｍ〜２００ｎｍである。
有機性の非蛍光性ナノ粒子を製造する場合、一般的に知られている重合法のうち、乳化ミセル（Ｗ／Ｏエマルジョン）の中で樹脂モノマーを重合させる乳化重合法を用いることが好ましい。乳化重合法では、添加する界面活性剤の種類や量を変更することで、ミセルサイズ（すなわち、非蛍光性ナノ粒子の平均粒子径）を所望の大きさに好適に調整することができるからである。
（非蛍光性ナノ粒子と１次抗体との結合）
非蛍光性ナノ粒子と１次抗体との間の結合は、蛋白質を有機物や無機物と結合させる公知の方法により行うことができる。その結合態様は、特に限定されず、例えば、生体分子同士間の特異的な結合（ハプテン-抗ハプテン抗体等）を利用して、非蛍光性ナノ粒子と１次抗体とを結合させてもよいし、共有結合，イオン結合，水素結合，配位結合，物理吸着または化学吸着等による結合を用いてもよい。共有結合の場合、結合させやすい観点から、ＳＨ基（抗体側）−マレイミド基等（ナノ粒子側）間の共有結合が好ましい。
マレイミド基と代替可能な官能基としては、ＳＨ基と結合反応可能な、アルデヒド基、ブロモアセトアミド基（ヨードアセトアミド基、ブロモアセトアミド基）等を挙げることができる。しかし、これらの官能基よりもマレイミド基の方が、ＳＨ基との反応性がよく、導入試薬も入手しやすいことから好ましい。
例えば、ポリスチレンを母体とする非蛍光性ナノ粒子を製造し、この非蛍光性ナノ粒子にマレイミド基を導入する方法としては、特開２００７−２３１２０号公報に記載されているように、ポリスチレン鎖のフェニル基をクロロメチル化した状態で、Ｎ−ヒドロキシメチルマレイミドのＯＨ基とクロロメチル基との間でＣｌ交換エーテル化反応をさせてマレイミド基を導入する方法がある。
一方、非蛍光性ナノ粒子が無機ナノ粒子である場合、シランカップリング剤等のカップリング剤を用いてマレイミド基等を導入することができる。
（導入された官能基の確認）
官能基（ＳＨ基と結合可能な基など）が非蛍光性ナノ粒子の表面に導入されたことの確認、およびその官能基の定量は、例えばＦＴ−ＩＲにより、結合に該当する波長ピークと面積を計測する方法や上記官能基を定量するキットにより行うことができる。
導入されたマレイミド基（結合基）を定量する場合は、「AmpliteTM 蛍光マレイミド定量キット」（コスモバイオ社製）を使用して定量することができる。
導入されたアルデヒド基を定量する場合は、2,4-ジニトロフェニルヒドラジン（2,4-dinitrophenylhydrazine；DNPH）法で定量する方法を挙げることができる。この方法は、非蛍光性ナノ粒子表面のアルデヒド基とＤＮＰＨとを反応させてＤＮＰＨ誘導体を形成し、該ＤＮＰＨ誘導体を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供してカラムに吸着および溶出させて、ＤＮＰＨ誘導体に該当する溶出液のフラクションの吸光度（Ａｂｓ．３６０ｎｍ）の吸収量からアルデヒド基を分析・定量する方法である。
導入されたハロアセトアミド基（ヨードアセトアミド基、ブロモアセトアミド基）の場合には、実際にＳＨ基と反応させて副生されるハロゲンを公知の方法で定量することで導入量を調べることができる。
（１次抗体へのＳＨ基導入処理）
１次抗体を還元して、抗原抗体反応に寄与しない抗体部分にあるジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）をチオール基（−ＳＨ）に変換すれば、非蛍光性ナノ粒子の表面に導入した官能基（チオール基等）と反応させて、非蛍光性ナノ粒子に対して抗体を直接結合することができるようになる。ここで、１次抗体の少なくとも１方のＦａｂ領域の結合反応性を損なわないように還元することが必要である。例えば、特開2003-509680号公報には、１次抗体の重鎖を繋ぐジスルフィドのうち、２−アミノエタンチオールを用いることによって、Ｆｃ領域のジスルフィド結合のみを選択的還元することが記載されている。
好適な還元剤としては、例えば、２−アミノエタンチオール、２−メルカプトエタノール等を挙げることができる。還元は、使用する還元剤が還元力を発揮しうる中性領域のｐＨ緩衝液中で実施するようにｐＨ緩衝液（ＰＢＳ等）を使用することが望ましい。
還元時のｐＨ（還元ｐＨ）がアルカリ側になるにつれて抗体分子に含まれるジスルフィド結合（Ｓ―Ｓ結合）の還元量が増加していくことから、還元剤の還元能が発揮できるｐＨ範囲内で、抗体１分子中にＳＨ基が極力少なく導入されるように還元ｐＨを調節することが１次抗体の反応性を損ねない観点から好ましい。還元ｐＨとしては、例えば、２−アミノエタンチオールを使用する場合は、ｐＨ６．０〜７．５に調整することで好適な還元力を得ることができる。２−メルカプトエタノールを使用する場合はｐＨ７．０〜８．５である。還元反応の条件としては、４℃〜８℃で８時間〜３６時間である。また、抗体１モルに対し、還元剤のモル濃度を１００，０００，０００，０００〜１０，０００，０００，０００，０００モルとするのが好ましい。抗体分子中のＳＨ基の定量は、例えば、公知のＳＨ基定量試薬（例：5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)）同仁品コード：Ｄ０２９ 製品名：ＤＴＮＢ）等のＳＨ基定量キットを使用する方法等の公知の方法により行うことができる。
（結合処理）
抗体と非蛍光性ナノ粒子との結合は、非蛍光性ナノ粒子：抗体（モル比）を１：１００，０００〜１：１００，０００，０００の範囲として、室温（１〜４０℃）で１時間〜１２時間結合反応させることが好ましい。この際、結合反応は、キレート剤（ＥＤＴＡなど）を含むｐＨ緩衝液（ＰＢＳ緩衝液等）中で行うことが望ましい。
（別の結合方法）
なお、上記の例はマレイミド基等の官能基と抗体のＳＨ基との結合に関する方法であるが、代替方法として、アミノ基を有する非蛍光性ナノ粒子とｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣとは反応させた後、さらにこれを抗体中のＳＨ基と上記結合反応させて、１次抗体を非蛍光性ナノ粒子に結合させる方法を用いることもできる。
（さらに別の結合方法）
以下の通り、非蛍光ナノ粒子にアミノ基を導入し、さらにアミノ基をマレイミド基に変換する処理を行って上記ＳＨ基を有する１次抗体と結合してもよい。
（非蛍光ナノ粒子へのアミノ基導入）
例えば、非蛍光性ナノ粒子がメラミン樹脂製である場合、非蛍光性ナノ粒子に対してアミノ基を導入する処理を行うことが好ましい。メラミン樹脂はそれ自体がアミノ基を有しているが、アミノ基導入処理を行うことでメラミン系樹脂の蛍光ナノ粒子の表面に対してさらにアミノ基が導入される結果、例えば後述するような抗体に導入したＳＨ基等との反応性が高まるからである。
アミノ基導入処理としては、例えば、上記蛍光ナノ粒子を所定の溶媒（例；水）に分散し、この分散液に対してアミノ基導入試薬を添加し、６０〜８０℃で１０分〜３０分加熱撹拌する処理する例を挙げることができる。
上述のアミノ基導入試薬は、上記のアミノ基導入試薬としては、１，２−ビス（２−アミノエトキシ）エタン（ＢＡＥＥ）またはトリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＡＥＡ）等を使用することができる。
アミノ基が導入されたことの確認は、ＦＴ−ＩＲやＸＰＳ測定等で行うことができる。
（アミノ基からマレイミド基等への変換）
一端部にアミノ基と反応する官能基（ＮＨＳ基等）を有し、他端部に１次抗体のＳＨ基と反応しうる官能基（上記マレイミド基等）を有するリンカーを上記非蛍光性ナノ粒子のアミノ基と反応させることで、非蛍光性ナノ粒子にマレイミド基等を導入することができる。このようなリンカーとしては、「SM(PEG)n」(n=2,4,6,8,12,24)(Thermofisher Scientific社)等を用いることができる。
（非蛍光性ナノ粒子と１次抗体との結合）
非蛍光ナノ粒子と、蛍光ＳＨ基を有する上記抗体との質量比を１：５００〜１：１５００に調節し、ＰＢＳ中で混合し、室温で１時間、両分子を結合する反応を行うことで非蛍光性ナノ粒子と抗体とを結合させることができる。
一方、無機の非蛍光性ナノ粒子に１次抗体を結合させる場合、カップリング剤を用いて結合させてもよい。ここで、カップリング剤は、シラン系、チタネート系、アルミニウム系、ジルコニウム系のカップリング剤等を使用することができ、２種以上のカップリング剤を併用してもよい。非蛍光性ナノ粒子とシランカップリング剤との反応手順は、公知の手法を用いることができる。また、必要に応じて、ＥＤＣ等の縮合剤を用いてもよい。
（結合密度）
非蛍光性ナノ粒子の表面の１次抗体の結合密度は、非蛍光性ナノ粒子の粒子表面にある１次抗体と、抗原あるいは２次抗体との結合反応性が維持されれば特に制限されないが、（ポリクローナル抗体の場合は合計で、）２×１０-14モル／１ｍｍ2粒子表面〜５×１０-7モル／１ｍｍ2粒子表面であることが好ましい。１次抗体の結合密度により非蛍光性ナノ粒子表面に対する２次抗体結合可能量が変化し、それにより検出感度も変わるので、上記結合反応性が維持される範囲で結合密度を調節して検出感度を調節（高低）してもよい。例えば、低感度のために抗原を検出できない場合、導入する官能基（ＳＨ基等）の数を増やすなど、結合密度を高める調整をして検出感度を高めてもよく、逆も同様である。
なお、結合密度は、次のようにして算出される。ＢＣＡ法等で精製処理後の非蛍光性ナノ粒子の表面の１次抗体量を測定し、１次抗体の重量分子量で除することでモル数を算出する。一方、ＳＥＭ等の電子顕微鏡で計測した非蛍光性ナノ粒子の平均粒子径の半値を半径（ｒ）として、球の表面積の公式：４πｒ2から１粒子当たりの非蛍光性ナノ粒子の表面積（平均）を算出し、パーティクルカウンター等で計測した対象の分散液中の粒子数を掛け合わせ、非蛍光性ナノ粒子の総表面積として算出し、この算出値で上記算出したモル数除することで非蛍光性ナノ粒子の表面の１次抗体の結合密度を算出することができる。
［２次抗体］
２次抗体は、抗原に固定された１次抗体の抗原の未反応の部分（Ｆｃ、Ｆ（ａｂ）、またはＦ（ａｂ'））を特異的に認識し、その１次抗体の一部または全部に結合する抗体であって、抗原には結合せず、蛍光ナノ粒子に結合された状態であるか、或いは、将来的に結合される抗体を意味する。
１次抗体が、非蛍光性ナノ粒子の表面に結合されて用いられる態様の場合には、２次抗体は、抗原に固定された非蛍光性のナノ粒子の粒子表面に存在する（抗原と結合しなかった）１次抗体の未反応部分（Ｆｃ、Ｆ（ａｂ）、或いはＦ（ａｂ'）の部分）と反応することとなる。
２次抗体には、ＩｇＧ抗体等を用いることができる。通常、２次抗体は、１次抗体と異なる免疫動物で作製され、１次抗体の動物種の抗体（Ｆｃ領域等）を認識するように作製される。１，２次抗体を産生する動物（免疫動物）の種類は特に限定されるものではなく、従来と同様、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどから選択すればよい。
（２次抗体と蛍光ナノ粒子との結合）
２次抗体と蛍光ナノ粒子との結合は、１次抗体と非蛍光性ナノ粒子との結合について上述したように官能基同士で直接結合させてもよいし、後述するようにリンカーと第１，２結合基物質を利用して間接的に連結させてもよい。２次抗体を蛍光ナノ粒子の表面に結合する場合の、２次抗体の蛍光ナノ粒子の表面への結合密度は、抗原に固定された１次抗体との結合反応性が維持される範囲であれば制限されず、例えば、２×１０-14モル／１ｍｍ2粒子表面〜５×１０-7モル／１ｍｍ2であること（１次抗体と同じ結合密度範囲）が好ましい。なお、２次抗体についての抗体結合密度の算出は非蛍光性ナノ粒子について上述した通りである。特に、１次抗体が非蛍光性ナノ粒子の表面に多数結合されたものである場合には、２次抗体の結合密度は、１次抗体の結合密度と比べて、１．０〜１．５倍程度の密度であることが好ましい。
（２次抗体と蛍光ナノ粒子との間接結合）
２次抗体と蛍光ナノ粒子とを間接的に連結させる方法としては、例えば、２次抗体と蛍光ナノ粒子にそれぞれリンカーを結合させ、リンカーの先端部にそれぞれ付与されている第１，２結合基物質間の特異的な結合反応により、２次抗体と蛍光ナノ粒子とを連結させる方法であってもよい。第１，２結合基物質としては、例えば、ビオチン：アビジンの生体分子の組合せ等が挙げられる。ビオチン：アビジン以外の他の公知物質の組合せ（例；ハプテン：抗ハプテン抗体）でもよい。なお、第１，２結合基物質には、１〜２次抗体や抗原と反応するものは含まれない。
上述した２次抗体に対してリンカーを介して第１結合基物質を修飾する場合、結合に利用可能な官能基と第１結合基物質とを両端に有する公知のリンカーを用いることが好ましい。このようなリンカーは、市販されており、例えばThermofisher scientific社から購入することができる。
例えば、一端部にマレイミド基を有し、他端にビオチンを有するリンカーを使用し、この一端部のマレイミド基を、上述したように還元して形成した抗体のＳＨ基に結合させることで、ＰＧＥを介して２次抗体にビオチンを結合させることができる。このようなリンカーとしては、「Biotin-PEG6-NH-Mal」（PurePEG社製）、またはEZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin（Thermofisher scientific社）が挙げられる。
一方、蛍光ナノ粒子に対してリンカーを介して第２結合基物質を修飾する結合、例えば、ＳＭ（ＰＥＧ）6は、一端部にＮＨＳ基を有し、他端部にマレイミド基を有するリンカーであるので、このリンカーの一端部のＮＨＳ基と、蛍光ナノ粒子に導入したアミノ基とを結合させた後、リンカーの他端部にあるマレイミド基を、上述したように還元して形成したストレプトアビジン（ＳＡ）のＳＨ基に結合させることで、蛍光ナノ粒子に第２結合基物質（この場合はＳＡ）を結合させることができる。
このようなリンカーとしては、「SM(PEG)n」(n=2,4,6,8,12,24)(Thermofisher Scientific社)等が挙げられる。また、上記のアミノ基導入試薬としては、１，２−ビス（２−アミノエトキシ）エタン（ＢＡＥＥ）またはトリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＡＥＡ）等を使用することができる。
最後に、第１，２結合基物質同士を結合させることで、２次抗体に蛍光ナノ粒子が結合して２次抗体が蛍光標識される。なお、第１，２結合基物質同士の結合は、２次抗体を１次抗体に結合させる第２反応工程の前または後の所望のタイミングで２次抗体を蛍光標識することができる。また、２次抗体の蛍光ナノ粒子に対する結合密度や、抗体の使用比率については、非蛍光性ナノ粒子や１次抗体の場合と同様である。
（２次抗体と蛍光ナノ粒子との直接結合）
上記とは異なり、第１，２結合基物質同士を結合させずに、２次抗体と蛍光ナノ粒子との間に１つのリンカーを介在させて両者を連結させる方法でもよい。この場合は、第１反応工程前（免疫染色工程の開始前）に、第３反応工程が行われ、２次抗体が蛍光ナノ粒子と結合して蛍光標識された状態となる。
例えば、一端部にマレイミド基を有し、他端部にＮＨＳ基を有するリンカーを使用し、ＮＨＳ基を上述した蛍光ナノ粒子のアミノ基と結合させ、マレイミド基を、上述したように還元して形成した２次抗体のＳＨ基に結合させることで、蛍光ナノ粒子と２次抗体とを連結させることができる。このようなリンカーとしては上述した「SM(PEG)n」(n=2,4,6,8,12,24)(Thermofisher Scientific社)を好適に使用することができる。
なお、この場合の、蛍光ナノ粒子に対する２次抗体の結合密度および使用比率については蛍光ナノ粒子に対して１次抗体を直接結合する場合と同様である。
（リンカーの長さ，材質）
リンカーを介して結合した２次抗体と蛍光ナノ粒子との複合体において、リンカーに由来する連結部分の長さは、１５オングストローム以上、１０００オングストローム以下であることが望ましく、３０オングストローム以上〜６５オングストローム以下が特に好ましい。リンカーとして使用可能なものとしては、特に限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、フィコール、ポリビニルアルコール、等の親水性高分子である。
［非蛍光性ナノ粒子の製造方法］
上述のとおり非蛍光性ナノ粒子は、蛍光ナノ粒子に蛍光色素を用いないこと以外は同様にして製造することができる。
具体的に、例えば、非蛍光性ナノ粒子を有機ナノ粒子として製造する場合の製造方法としては、先ず蒸留水等の水系分散媒に乳化重合用乳化剤を加え、加熱撹拌しながら所定温度（例；６０〜８０℃）まで昇温させた後、この溶液に樹脂材料を加える。
さらに、溶液に界面活性剤の水溶液を加えて加熱撹拌（例；７０℃で５０分→９０℃で２０分）を行うことで、乳化重合により非蛍光性ナノ粒子を造粒する。
得られたメラミン系の蛍光ナノ粒子の分散液から、余剰の樹脂原料や蛍光色素等の不純物を除く洗浄処理を行うことにより、非蛍光性ナノ粒子を製造することができる。
乳化重合用乳化剤は、公知のものを使用することができ、アニオン系（陰イオン系）、ノニオン系（非イオン系）、カチオン系（陽イオン系）のものがある。正に荷電した置換基ないし部位を有する（カチオン系の）熱硬化性樹脂を合成する場合は、アニオン系またはノニオン系の界面活性剤を用いることが好ましい。逆に負に荷電した置換基ないし部位を有する（アニオン系の）熱硬化性樹脂を合成する場合は、カチオン系またはノニオン系の界面活性剤を用いることが好ましい。
アニオン系の界面活性剤としては、たとえば、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（製品名「ネオペレックス」シリーズ、花王株式会社）が挙げられる。ノニオン系の界面活性剤としては、たとえば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系（製品名「エマルゲン」シリーズ、花王株式会社）の化合物、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）が挙げられる。カチオン系の界面活性剤としては、たとえば、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミドが挙げられる。
また、樹脂材料としては、公知の樹脂モノマーを使用することができ、例えば、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）が挙げられる。
さらに界面活性剤としては、公知のものを使用することができ、例えば、ドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学社製）等が挙げられる。
非蛍光性ナノ粒子の粒径やその変動係数については、走査型電子顕微鏡等で観察し、平均粒子径及び変動係数を算出することにより得ることができる。
［蛍光ナノ粒子］
本発明において用いられる蛍光ナノ粒子としては、抗原を１分子ずつ輝点として表すのに十分な強度の蛍光を発することができる「蛍光物質集積ナノ粒子」が好ましい。
なお、本明細書における「蛍光物質」は、所定の波長の電磁波（Ｘ線、紫外線または可視光線）が照射されてそのエネルギーを吸収することで電子が励起し、その励起状態から基底状態に戻る際に余剰のエネルギーを電磁波として放出する、つまり「蛍光」を発する物質であって、１次抗体と直接的、あるいは間接的に結合させることのできるものを指す。また、「蛍光」は広義的な意味を持ち、励起のための電磁波の照射を止めても発光が持続する発光寿命の長い燐光と、発光寿命が短い狭義の蛍光とを包含する。
〈蛍光物質集積ナノ粒子〉
本発明に使用可能な蛍光物質集積ナノ粒子は、有機物または無機物でできた粒子を母体とし、複数の蛍光物質（たとえば蛍光色素）がその中に内包されているおよび／またはその表面に吸着している構造を有する、ナノサイズの粒子である。この場合、母体（たとえば樹脂）と蛍光物質は、互いに反対の電荷を有する置換基ないし部位を有しており、静電的相互作用が働くものであることが好適である。
蛍光物質集積ナノ粒子を形作る母体のうち、有機物としては、メラミン樹脂、尿素樹脂、アニリン樹脂、グアナミン樹脂、フェノール樹脂、キシレン樹脂、フラン樹脂など、一般的に熱硬化性樹脂に分類される樹脂；スチレン樹脂、アクリル樹脂、アクリロニトリル樹脂、ＡＳ樹脂（アクリロニトリル−スチレン共重合体）、ＡＳＡ樹脂（アクリロニトリル−スチレン−アクリル酸メチル共重合体）など、一般的に熱可塑性樹脂に分類される樹脂；ポリ乳酸等のその他の樹脂；多糖を例示することができ、無機物としてはシリカ、ガラスなどを例示することができる。
・半導体集積ナノ粒子
半導体集積ナノ粒子とは、蛍光体としての半導体ナノ粒子が、上記に記載した母体の中に内包されているおよび／またはその表面に吸着している構造を有する。半導体ナノ粒子を構成する素材は特に限定されるものではなく、たとえば、ＩＩ−ＶＩ族化合物、ＩＩＩ−Ｖ族化合物、またはＩＶ族元素を含有するもの、たとえば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅなどが挙げられる。また、半導体が母体に内包されている場合、母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していても、していなくてもよい。
・蛍光色素集積ナノ粒子
蛍光色素集積ナノ粒子とは、蛍光色素が、上記に記載した母体の中に内包されている、および／またはその表面に吸着している構造を有する。蛍光色素は特に限定されるものではなく、たとえば、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、芳香環系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、ピロメセン系色素分子などを例示することができる。あるいは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、Ｃｙ（登録商標、ＧＥヘルスケア社製）系色素分子、ＤＹ系色素分子（登録商標、ＤＹＯＭＩＣＳ社製）、ＨｉＬｙｔｅ（登録商標、アナスペック社製）系色素分子、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）系色素分子、ＡＴＴＯ（登録商標、ＡＴＴＯ−ＴＥＣ社製）系色素分子、ＭＦＰ（登録商標、Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）系色素分子などを用いることができる。なお、このような色素分子の総称は、化合物中の主要な構造（骨格）または登録商標に基づき命名されており、それぞれに属する蛍光色素の範囲は当業者であれば過度の試行錯誤を要することなく適切に把握できるものである。また、蛍光色素が母体に内包されている場合、蛍光色素は母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していても、していなくてもよい。
蛍光物質集積ナノ粒子は、公知の方法（たとえば特開２０１３−５７９３７号公報参照）に従って作製することができる。より具体的には、たとえば、シリカを母体とし、その中に蛍光物質が内包されている蛍光物質内包シリカ粒子は、無機半導体ナノ粒子、有機蛍光色素などの蛍光物質と、テトラエトキシシランのようなシリカ前駆体とが溶解している溶液を、エタノールおよびアンモニアが溶解している溶液に滴下し、シリカ前駆体を加水分解することにより作製することができる。
一方、樹脂を母体とし、蛍光物質を樹脂粒子の表面に吸着させるか、樹脂粒子中に内包させるかした蛍光物質内包樹脂粒子は、それらの樹脂の溶液ないし微粒子の分散液を先に用意しておき、そこに無機半導体ナノ粒子、有機蛍光色素などの蛍光物質を添加して撹拌することにより作製することができる。あるいは、樹脂原料の溶液に蛍光色素を添加した後、重合反応を進行させることにより、蛍光物質内包樹脂粒子を作製することもできる。たとえば、母体となる樹脂としてメラミン樹脂のような熱硬化性樹脂を用いる場合、その樹脂の原料（モノマーまたはオリゴマーないしプレポリマー、たとえばメラミンとホルムアルデヒドの縮合物であるメチロールメラミン）と、有機蛍光色素と、好ましくはさらに界面活性剤および重合反応促進剤（酸など）とを含有する反応混合物を加熱し、乳化重合法によって重合反応を進行させることにより、有機蛍光色素内包樹脂粒子を作製することができる。
また、母体となる樹脂としてスチレン系共重合体のような熱可塑性樹脂を用いる場合、その樹脂の原料と、有機蛍光色素と（樹脂の原料モノマーとして、あらかじめ有機蛍光色素を共有結合などで結合させたモノマーを用いるようにしてもよい）、重合開始剤（過酸化ベンゾイル、アゾビスイソブチロニトリルなど）を含有する反応混合物を加熱し、ラジカル重合法またはイオン重合法によって重合反応を進行させることにより、有機蛍光色素内包樹脂粒子を作製することができる。
母体に内包させる蛍光物質としては、上述したような半導体ナノ粒子、蛍光色素のほか、たとえば、Ｙ2Ｏ3、Ｚｎ2ＳｉＯ4等を母体とし、Ｍｎ2+，Ｅｕ3+等を賦活剤とする「長残光蛍光体」を挙げることができる。
蛍光物質集積ナノ粒子（特に上記のような製造方法によって得られる蛍光色素を内包した樹脂粒子）の平均粒子径は、標本スライドの免疫染色に適した粒径であれば特に限定されないが、輝点としての検出のしやすさなどを考慮すると、通常は１０〜５００ｎｍ、好ましくは５０〜２００ｎｍである。また、粒径のばらつきを示す変動係数は、通常は２０％以下であり、好ましくは５〜１５％である。このような条件を満たす蛍光物質集積ナノ粒子は、製造条件を調整することにより製造することができる。たとえば、乳化重合法により蛍光物質集積ナノ粒子を作製する場合は、添加する界面活性剤の量によって粒径を調節することができ、一般的に、蛍光物質集積ナノ粒子の母体原料の量に対する界面活性剤の量が相対的に多ければ粒径は小さくなり、その量が相対的に少なければ粒径は大きくなる傾向にある。なお、界面活性剤については非蛍光性ナノ粒子の製造について上述したものを用いることができる。
なお、蛍光物質集積ナノ粒子の粒径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影して蛍光物質集積ナノ粒子の断面積を計測し、その断面形状を円と仮定したときに、その断面積に相当する円の直径として算出することができる。複数の蛍光物質集積ナノ粒子からなる集団の平均粒子径および変動係数は、十分な数（たとえば１０００個）の蛍光物質集積ナノ粒子について上記のようにして粒径を算出した後、平均粒子径はその算術平均として算出され、変動係数は式：１００×粒径の標準偏差／平均粒子径、により算出される。
[蛍光免疫染色法]
本願発明に係る蛍光免疫染色法は、上述したように、染色対象である抗原に対して１次抗体を特異的に結合・固定させる第１反応工程と、２次抗体を、前記結合・固定された１次抗体に対して特異的に結合させる第２反応工程と、前記２次抗体を蛍光ナノ粒子により蛍光標識する第３反応工程と、を含む蛍光免疫染色法であって、前記抗原１分子に対して前記１次抗体を介して前記２次抗体を複数固定させることを特徴とする。
抗原１分子に対して抗体を複数固定させる態様としては、１次抗体，２次抗体を用いる場合、下記［表１］に示す第１〜第１５実施形態として態様（Ａ）〜（Ｏ）がある（それぞれ、図１〜図４の（Ａ）〜（О）を参照）。
（標本スライド）
公知の方法により、上記抗原（ＰＤ−Ｌ１等）が陽性または陰性の細胞を継代培養し純化した後、ホルマリンで固定化（２４〜４８時間）し、これをパラフィンで包埋し、ミクロトームで切断することにより所定の「標本スライド」を調製してもよいし、公知の組織切片を調製する方法で「標本スライド」を調製してもよい。組織切片、培養細胞どちらから作成した「標本スライド」も、本発明の適用対象となる。
本願発明の蛍光免疫染色法の各実施形態について、標本スライドの染色の行う場合を例にして以下説明する。
[第１実施形態]
第１実施形態の蛍光免疫染色法は、上記標本スライドに対して、遊離の１次抗体としてポリクローナル抗体を抗原に結合させる第１反応工程、および２次抗体としての遊離のモノクローナル抗体を１次抗体に結合させる第２反応工程、２次抗体を蛍光標識する第３反応工程を行う免疫染色工程を少なくとも含む（図１（Ａ）参照）。
以下、標本スライドについての脱パラフィン処理工程および賦活化処理工程、２次抗体を蛍光ナノ粒子で標識する第３反応工程、さらに任意の工程（形態観察用処理工程等）を行った後の標本スライドについて評価（評価工程等）を含む例として説明する。なお、第３反応工程は、第１反応工程や第２反応工程の前または後でもよい。
（１．標本作製工程）
（１−１．脱パラフィン処理）
キシレンを入れた容器に、標本スライドを浸漬させ、パラフィン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
次いでエタノールを入れた容器に標本スライドを浸漬させ、キシレン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
水を入れた容器に、標本スライドを浸漬させ、エタノール除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
（１−２．賦活化処理）
公知の方法に倣い、目的とする生体物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、０．０１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）、５％尿素、０．１Ｍのトリス塩酸緩衝液などを用いることができる。加熱機器はオートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバスなどを用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は５０〜１３０℃、時間は５〜３０分で行うことができる。
次いでＰＢＳを入れた容器に、賦活化処理後の標本スライドを浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。
（２．免疫染色工程）
〈第１反応工程〉
図１（Ａ）に例示したように、遊離のポリクローナル抗体の１次抗体１ａ，１ｂを標本スライドの抗原Ｐのエピトープｅｐ１，ｅｐ２に対して結合させる。
上記結合の反応条件は、一般的なウェスタンブロッティング法における抗体反応の反応温度、反応時間、抗体濃度の条件と同一の条件で行うことができる。例えば、１次抗体の溶液（抗体濃度：１μｇ/ｍＬ）を標本スライド上に載せた状態で、４℃で１晩インキュベーションすることにより行うことができる。また、１次抗体の溶液の中にブロッキング剤、ｐＨ緩衝液(TBS等)、および界面活性剤(Tween20等)をウェスタンブロッティングの１次反応と同様に含めることが好ましい。本実施形態のように１次抗体がポリクローナル抗体の場合、市販品の抗体を1：100 〜1：1,000に希釈し抗体濃度：0.2〜2μｇ/ｍＬとして用いることが好ましい。
なお、抗原に結合させる１次抗体の種類の数は、抗原のエピトープ数や、それに応じて用意される１次抗体の種類数によるため、２つに限定されない。
〈第２反応工程〉
図１（Ａ）に例示したように、１次抗体１ａ，１ｂのＦｃ領域（一部，全部）、または図示はしていないが抗原Ｐに結合していないＦａｂ領域（一部，全部）、すなわち抗原Ｐとの反応に寄与しなかった１次抗体部分に対して、モノクローナル抗体の２次抗体２ａを複数結合させる。したがって、１つの抗原Ｐに対して２次抗体２ａが２以上固定される。
使用する２次抗体２ａの濃度は、上記固定がされれば特に制限されないが、通常０．８〜１．２μｇ/ｍＬであり、希釈倍率を変更して一連の免疫染色工程を行うことで最適な濃度を設定することができる。なお、抗原Ｐに対して結合させる１次抗体の種類数は２つに限定されない。
〈第３反応工程〉
２次抗体２ａに蛍光ナノ粒子５を結合して蛍光標識する。図１（Ａ）に示した例では、この蛍光標識は第１，２結合基物質（例；ビオチン３とストレプトアビジン４）同士の結合を介して行われる。このとき、蛍光ナノ粒子５は、ＰＢＳ等の生理的ｐＨ緩衝液に０．００５〜０．５ｎＭで分散した液として使用することが好ましい。この分散液には、ブロッキング剤（ＢＳＡ等）、ｐＨ緩衝剤（リン酸）を適宜含めてもよい。上記分散液を標本スライド上に載せて、室温で１〜5時間インキュベートすることで蛍光ナノ粒子を２次抗体に結合させることができる。
なお、この第３反応工程は、第１反応工程の前、または第１反応工程〜第２反応工程の間に行ってもよいが、第２反応工程の後に行う方が２次抗体の１次抗体との結合反応性が損なわれにくいため好ましい。
また、第１〜第３反応工程の各工程の後にＰＢＳ等で標本スライドを洗浄する洗浄工程を設けることが好ましい。上述したような１次反応工程を行う前に、ＢＳＡ含有ＰＢＳなど公知のブロッキング剤やＴｗｅｅｎ２０などの界面活性剤を滴下することが好ましい。
免疫染色工程の各工程の条件、例えば、第１反応工程、第２反応工程それぞれにおける、所定の溶液（試薬）に標本スライドを浸漬する際の温度および浸漬時間は、従来の蛍光免疫染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。
（３．標本後処理工程）
免疫染色工程を終えた標本スライドは、観察に適したものとなるよう、固定化・脱水、透徹、封入などの処理を行うことが好ましい。
固定化・脱水処理は、標本スライドを固定処理液（ホルマリン、パラホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、アセトン、エタノール、メタノール等の架橋剤）に浸漬すればよい。透徹は、固定化・脱水処理を終えた標本スライドを透徹液（キシレン等）に浸漬すればよい。封入処理は、透徹処理を終えた標本スライドを封入液に浸漬すればよい。これらの処理を行う上での条件、たとえば標本スライドを所定の処理液に浸漬する際の温度および浸漬時間は、従来の蛍光免疫染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。
（４．任意工程）
本発明では、もしも必要であれば、明視野において細胞、組織、臓器等の形態を観察することができるようにするための、形態観察染色工程を含めることができる。形態観察染色工程は、常法に従って行うことができる。標本スライドの形態観察に関しては、細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤〜濃赤色に染色される、エオジンを用いた染色が標準的に用いられている。また、細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色〜淡青色に染色される、ヘマトキシリンを用いた染色も標準的に用いられている（これら２つの染色を同時に行う方法はヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）として知られている）。形態観察染色工程を含める場合は、免疫染色工程の後に行うようにしてもよいし、免疫染色工程の前に行うようにしてもよい。
（５．評価工程）
（５−１．観察・撮影）
観察・撮影工程では、所望の倍率における顕微鏡の同一視野において、免疫染色工程で用いた蛍光ナノ粒子中の蛍光物質を励起可能な波長の光をそれぞれ標本スライドに照射し、発した蛍光による免疫染色像それぞれを観察・撮影する。これらの励起光の照射は、たとえば、蛍光顕微鏡が備えるレーザー光源と、必要に応じて所定の波長を選択的に透過させる励起光用光学フィルターを用いることで照射することができる。免疫染色像の撮影は、たとえば、蛍光顕微鏡が備えるデジタルカメラによって行うことができる。免疫染色像の撮影の際には、必要に応じて所定の波長を選択的に透過させる蛍光用光学フィルターを用いることで、目的とする蛍光のみを含み、目的としない蛍光やノイズとなる励起光およびその他の光を排除した免疫染色像を撮影することができる。
（５−２．画像処理・シグナル計測）
画像処理・計測工程では、抗原に関して撮影された免疫染色像について、画像処理に基づき、抗原に対応する蛍光標識シグナルに対応する蛍光標識シグナルを計測し、細胞膜の領域内にある前記抗原に対応する蛍光標識シグナルを特定する。
蛍光標識シグナルは、蛍光の輝点数として扱うことが好ましい。
画像処理に用いることができるソフトウェアとしては、たとえば「ＩｍａｇｅＪ」（オープンソース）が挙げられる。このような画像処理ソフトウェアを利用することにより、免疫染色像から、所定の波長（色）の輝点を抽出してその輝度の総和を算出したり、所定の輝度以上の輝点の数を計測したりする処理、特に、次に述べる第１実施形態および第２実施形態を行う為の処理を、半自動的に、迅速に行うことができる。
（定量性に関する評価）
本実施態様の蛍光免疫染色法で染色した場合の陽性の標本スライドの（１細胞当たりの）平均輝点数を調べ、発現量が既知の抗原陽性の培養細胞を用いて、発現量の蛍光ナノ粒子のスコア（１個の細胞当たりについて同一条件で観察した場合に確認される粒子数）との相関関係を調べ、相関関係がＲ2≧０．７０であることを確認することで定量性が充分であることを確認することができる。なお、１つの「輝点」が複数の「粒子」で構成されていることもあるため、１つの「輝点」の輝度を、１つの「粒子」あたりの平均輝度で割ると、その輝点に含まれる「粒子数」が算出される。
（第１実施形態の作用、効果）
以下、図１（Ａ）を参照して第１実施形態の作用、効果について説明する。
第１実施形態の蛍光免疫染色法によれば、エピトープｅｐ１，ｅｐ２の各エピトープに対して、ポリクローナル抗体である１次抗体１ａ，１ｂがそれぞれ特異的に結合した上で、この１次抗体１ａ，１ｂに対して２次抗体２ａ，２ｂ、蛍光ナノ粒子が順次連結され検出が行われるので、検出ノイズを低く抑えることができる。また、１つの抗原に対して蛍光ナノ粒子をそれぞれ２個固定されるので検出感度が高まる。なお、２個に限らず、１次抗体の種類数を増やしてもよい。抗原Ｐのエピトープ数と、使用する１次抗体の種類数により、１つの抗原Ｐに結合させる蛍光ナノ粒子５の数（すなわち検出感度）を調節することもできる。
[第２実施形態]
第２実施形態は、第１実施形態の免疫染色工程のみを変更したものであるので、それ以外の工程については説明を省略し、免疫染色工程についてのみ以下説明する。また、免疫染色工程について、下記説明以外の事項については第１実施形態と同様である（他の実施形態も同様である）。
〈第１反応工程〉
図１（Ｂ）に示すように、遊離のモノクローナル抗体である１次抗体１ａの溶液を、標本スライド上に載せて抗原抗体反応を行い、これにより標本スライドの抗原Ｐが有する複数のエピトープｅｐ１，ｅｐ２のうちｅｐ１に対してのみ、１次抗体１ａを結合する。
〈第２反応工程〉
図１（Ｂ）に示すように１次抗体１ａのＦｃ領域（一部，全部）、または抗原Ｐに結合していないＦａｂ領域（一部，全部）、すなわち抗原Ｐとの反応に寄与しなかった１次抗体部分に対して、ポリクローナル抗体（２次抗体）２ａ〜２ｃを結合させる第２反応工程を行い、１つの抗原に対して２次抗体を２以上固定させる。
〈第３反応工程〉
第１実施態様と同様にして、図１（Ｂ）に示すように、ポリクローナル抗体である２次抗体２ａ〜２ｃに対し、ビオチン３とストレプトアビジン４との結合を介して、それぞれ蛍光ナノ粒子５を結合させる。その結果、１つの抗原Ｐに対し、２次抗体２ａ〜２ｃを介して蛍光ナノ粒子５を結合・固定させる。
（第２実施形態の作用、効果）
以下、第２実施形態の作用、効果について説明する。
第２実施形態の蛍光免疫染色法によれば、１次抗体１ａがモノクローナル抗体であるので、抗原Ｐに対して特に特異性が維持された状態で１次抗体１ａを結合させることができ、その上で、この１次抗体１ａに対してポリクローナル抗体である２次抗体２ａ〜２ｃおよび蛍光ナノ粒子５が複数種類、結合・固定することから、特異性が好適に維持された状態で増感させることができる。
また、蛍光ナノ粒子と２次抗体の結合は、ビオチン３とアビジン４との結合によるため、蛍光ナノ粒子はその種類に関係なく２次抗体に結合することができる点でも、好適に増感させることができる。なお、使用する２次抗体の種類数は、３種類に限らず、増感の必要に応じて増減してよく、例えば２種類でもよい。
[第３実施形態]
第３実施形態は、第１実施形態の免疫染色工程のみを変更したものであるので、それ以外の工程については説明を省略し、免疫染色工程についてのみ以下説明する。
〈第１反応工程〉
図１（Ｃ）に示すように、遊離のポリクローナル抗体である１次抗体１ａ，１ｂの溶液を、標本スライド上に載せて抗原抗体反応をさせる。これにより、標本スライドの抗原Ｐが有するエピトープｅｐ１，ｅｐ２に対して、１次抗体１ａ，１ｂがそれぞれ結合する。
〈第２反応工程〉
図１（Ｃ）に示すように１次抗体１ａ，１ｂのＦｃ領域（一部，全部）、または抗原Ｐに結合していないＦａｂ領域（一部，全部）に対して（すなわち抗原Ｐとの反応に寄与しなかった１次抗体部分に対して）、遊離のポリクローナル抗体である２次抗体２ａ，２ｂを結合させる第２反応工程を行い、１つの抗原に対して２次抗体を２以上固定させる。
〈第３反応工程〉
第１実施態様と同様にして、図１（Ｃ）に示すように、ポリクローナル抗体である２次抗体２ａ，２ｂに対して、ビオチン３とストレプトアビジン４との結合を介して、それぞれ蛍光ナノ粒子５を結合させる。その結果、１つの抗原Ｐに対して２以上の２次抗体２ａ，２ｂと蛍光ナノ粒子５が結合・固定される。
（第３実施形態の作用、効果）
以下、第３実施形態の作用、効果について説明する。
第３実施形態の蛍光免疫染色法によれば、抗原Ｐが有する複数のエピトープｅｐ１，ｅｐ２に１次抗体１ａ，１ｂを結合させ、さらに、この１次抗体の複数個所に２次抗体２ａ，２ｂを結合させた上で、この２次抗体２ａ，２ｂに蛍光ナノ粒子５がそれぞれ結合するため、好適に増感させることができる。なお、使用する２次抗体の種類数は、３種類に限らず、増感の必要に応じて増減してよく、例えば２種類等でもよい。１次抗体についても同様である。
[第４実施形態]
第４実施形態は、第１実施形態の免疫染色工程のみを変更したものであるので、それ以外の工程については説明を省略し、免疫染色工程についてのみ以下説明する。
〈第１反応工程〉
図２（Ｄ）に示すように、遊離のモノクローナル抗体である１次抗体１ａの溶液を、標本スライド上に載せて抗原抗体反応をさせる。これにより、標本スライドの抗原Ｐが有するエピトープｅｐ１のみに１次抗体１ａが結合する。
〈第２反応工程〉
図２（Ｄ）に示すように、蛍光ナノ粒子５の粒子表面に多数密集して直結されたモノクローナル抗体の２次抗体２ａを、１次抗体１ａのＦｃ領域（一部，全部）、または、抗原Ｐに結合していないＦａｂ領域（一部，全部）に対し（すなわち抗原Ｐとの反応に寄与しなかった１次抗体部分に対して）、結合させる第２反応工程を行い、抗原Ｐに対して蛍光ナノ粒子５を固定させる。
〈第３反応工程〉
上記の第１反応工程または第２反応工程の前に、２次抗体について前述したように蛍光ナノ粒子５に２次抗体２ａを多数結合させる。
（第４実施形態の作用、効果）
以下、第４実施形態の作用、効果について説明する。
第４実施形態の蛍光免疫染色法によれば、１次抗体１ａがモノクローナル抗体であるので、抗原Ｐに対して特に特異性が維持された状態で１次抗体１ａが結合させることができる。そして、蛍光ナノ粒子５の表面には２次抗体２ａが密集して存在し直結されている為、遊離状態の２次抗体と比べて高い確率で、上記１次抗体１ａに対して、２次抗体２ａ結合させることができ、この結合により蛍光ナノ粒子５を２次抗体とともに結合させることができるので、好適に増感させることができる。
なお、２次抗体の特性（１次抗体との結合親和性等）に応じて、蛍光ナノ粒子５の表面の２次抗体２ａの結合密度、蛍光ナノ粒子５の平均粒子径（すなわち１粒子あたりの２次抗体数）を変更してもよい。
[第５実施形態]
第５実施形態は、第１実施形態の免疫染色工程のみを変更したものであるので、それ以外の工程については説明を省略し、免疫染色工程についてのみ以下説明する。
〈第１反応工程〉
図２（Ｅ）に示すように、遊離のモノクローナル抗体である１次抗体１ａの溶液を、標本スライド上に載せて抗原抗体反応をさせる。これにより、標本スライドの抗原Ｐが有するエピトープｅｐ１のみに１次抗体１ａが結合する。
〈第２反応工程〉
図２（Ｅ）に示すように１次抗体１ａのＦｃ領域（一部，全部）、または抗原Ｐに結合していないＦａｂ領域（一部，全部）に対して（すなわち抗原Ｐとの反応に寄与しなかった１次抗体部分に対して）、蛍光ナノ粒子５の表面に複数直結されたポリクローナル抗体である２次抗体２ａ，２ｂを結合させる第２反応工程を行い、抗原Ｐに対して２次抗体２ａ，２ｂおよび蛍光ナノ粒子５を固定させる。
〈第３反応工程〉
上記の第１反応工程または第２反応工程の前に、２次抗体について前述したように蛍光ナノ粒子５に２次抗体２ａ，２ｂを多数結合させる。
（第５実施形態の作用、効果）
以下、第５実施形態の作用、効果について説明する。
第５実施形態の蛍光免疫染色法によれば、１次抗体１ａがモノクローナル抗体であるので、抗原Ｐに対して特に特異性が維持された状態で１次抗体を結合させることができる。また、蛍光ナノ粒子５の表面には２次抗体２ａ，２ｂがポリクローナル抗体として多数密集して存在する為、モノクローナル抗体が多数密集して存在する場合と比べて、１次抗体に対して異なる複数の箇所で連結固定され（図２（Ｅ）参照）、より一層高い確率および特異性でもって前記１次抗体に対し２次抗体２ａおよび蛍光ナノ粒子５を結合・固定させることができ、好適に増感させることができる。
[第６実施形態]
第６実施形態は、第１実施形態の免疫染色工程のみを変更したものであるので、それ以外の工程については説明を省略し、免疫染色工程についてのみ以下説明する。
〈第１反応工程〉
図２（Ｆ）に示すように、遊離のポリクローナル抗体である１次抗体１ａ，１ｂの溶液を、標本スライド上に載せて抗原抗体反応をさせる。これにより、標本スライドの抗原Ｐが有する複数のエピトープｅｐ１，ｅｐ２に対して、１次抗体１ａ，１ｂがそれぞれ結合する。
〈第２反応工程〉
図２（Ｆ）に示すように、蛍光ナノ粒子５の粒子表面に多数密集して直結されたモノクローナル抗体である２次抗体２ａを、１次抗体１ａ，１ｂのＦｃ領域（一部，全部）またはＦａｂ領域（一部，全部）に対して（すなわち抗原Ｐとの反応に寄与しなかった１次抗体部分に対して）結合させる第２反応工程を行い、１つの抗原Ｐに対して２以上の２次抗体２ａと蛍光ナノ粒子５を固定させる。
〈第３反応工程〉
上記の第１反応工程または第２反応工程の前に、２次抗体について前述したように蛍光ナノ粒子５に２次抗体２ａを多数結合させる。
（第６実施形態の作用、効果）
以下、第６実施形態の作用、効果について説明する。
第６実施形態の蛍光免疫染色法によれば、ポリクローナル抗体である１次抗体１ａ，１ｂが抗原Ｐのエピトープｅｐ１，ｅｐ２と結合し、蛍光ナノ粒子５の表面に密集して固定された多数のモノクローナル抗体の２次抗体２ａが、１次抗体１ａ，１ｂの共通するＦｃ領域やＦａｂ領域の一部または全部にそれぞれ結合するので、１次抗体の種類に拘わらず、また複数個所で、蛍光ナノ粒子が抗原Ｐに対して強固に固定されて、抗原Ｐの検出がされやすくなる。
[第７実施形態]
第７実施形態は、第１実施形態の免疫染色工程のみを変更したものであるので、それ以外の工程については説明を省略し、免疫染色工程についてのみ以下説明する。
〈第１反応工程〉
図２（Ｇ）に示すように、遊離のポリクローナル抗体である１次抗体１ａ，１ｂの溶液を、標本スライド上に載せて抗原抗体反応をさせる。これにより、標本スライドの抗原Ｐが有する複数のエピトープｅｐ１，ｅｐ２に対して、１次抗体１ａ，１ｂが結合する。
〈第２反応工程〉
図２（Ｇ）に示すように１次抗体１ａ，１ｂのＦｃ領域（一部，全部）、または抗原Ｐに結合していないＦａｂ領域（一部，全部）に対して（すなわち抗原Ｐとの反応に寄与しなかった１次抗体部分に対して）、蛍光ナノ粒子５に直接結合された複数のポリクローナル抗体である２次抗体２ａ，２ｂを結合させる第２反応工程を行い、１つの抗原Ｐに対して２以上の２次抗体２ａ，２ｂと蛍光ナノ粒子５を結合・固定させる。
〈第３反応工程〉
上記の第１反応工程または第２反応工程の前に、前述したように蛍光ナノ粒子５に２次抗体２ａ，２ｂを多数結合させる。
（第７実施形態の作用、効果）
以下、第７実施形態の作用、効果について説明する。
第７実施形態の蛍光免疫染色法によれば、ポリクローナル抗体である１次抗体１ａ，１ｂがそれぞれ抗原Ｐと結合し、蛍光ナノ粒子５の表面に密集して直結された２次抗体２ａ，２ｂが、１次抗体１ａ，１ｂのＦｃ領域（全体,一部）、又はＦａｂ領域（一部，全部）に対して、互いに異なる位置で、それぞれ結合するので、蛍光ナノ粒子が抗原に対して特に特異性が高い状態で強固に固定される。なお、使用する１次抗体，２次抗体の種類数は、２種類に限らず、増感の必要に応じて増減してよく、例えば３種類でもよい。
[第８実施形態]
第８実施形態は、第１実施形態の免疫染色工程のみを変更したものであるので、それ以外の工程については説明を省略し、免疫染色工程についてのみ以下説明する。
〈第１反応工程〉
図３（Ｈ）に示すように、粒子表面にモノクローナル抗体である１次抗体１ａが多数密集して結合された非蛍光性ナノ粒子５ａの粒子分散液を、標本スライド上に載せて抗原抗体反応をさせる。これにより、標本スライドの抗原Ｐが有する複数のエピトープｅｐ１に対して、モノクローナル抗体１ａが非蛍光性ナノ粒子５ａとともに結合する。
なお、１次抗体が粒子表面に結合した非蛍光性ナノ粒子５ａの使用量は、主として、１次抗体の非蛍光性ナノ粒子５ａの表面での結合密度、１次抗体の抗原との結合親和性、非蛍光性ナノ粒子５ａの平均粒子径との関係で決定され、１次抗体が抗原に対して結合しうる濃度であれば特に制限されない。例えば、非蛍光性ナノ粒子５ａの表面にある１次抗体の濃度が前述した第１実施形態で説明した遊離の１次抗体の濃度と同等となるように、非蛍光性ナノ粒子５ａをＰＢＳ等の緩衝液に分散させて用いることができる。
抗原と蛍光ナノ粒子との間にモノクローナルの１次抗体および２次抗体、ビオチン-アビジンの結合を介在させる場合の１次抗体と比べて、非蛍光性ナノ粒子表面の１次抗体のモル数（または個数），モル濃度は、抗体力価にもよるが、１０倍以上のに設定することが好ましい（以下同様）。
また、モノクローナル抗体１ａの抗原への結合は、例えば通常の１次抗体反応と同じ条件で行うことができ、例えば、１〜１０℃で４〜１２時間インキュベートすることにより行うことができる。
〈第２反応工程〉
図３（Ｈ）に示すように、抗原Ｐに固定された非蛍光性ナノ粒子５ａの表面に多数密集して存在する１次抗体１ａのＦａｂ領域（一部，全部），または抗原Ｐに結合していないＦｃ領域（一部，全部）に対して（すなわち抗原Ｐとの反応に寄与しなかった１次抗体部分に対して）、複数の遊離のモノクローナル抗体である２次抗体２ｄを結合させる第２反応工程を行う。
〈第３反応工程〉
ビオチン３とストレプトアビジン４との結合を介して、２次抗体２ｄに蛍光ナノ粒子５を固定させる。その結果、１つの抗原Ｐに対して２以上の２次抗体２ｄ、蛍光ナノ粒子５が結合・固定される。
（第８実施形態の作用、効果）
以下、第８実施形態の作用、効果について説明する。
第８実施形態の蛍光免疫染色法によれば、非蛍光性ナノ粒子５ａの表面には１次抗体１ａが多数密集して存在する為、１次抗体１ａが遊離状態の場合と比べて高確率で、１次抗体を抗原Ｐに結合させることができる。また、１つの抗原Ｐに対してモノクローナル抗体としての１次抗体１ａが１箇所でのみ結合するので特異性が高い。そして、抗原Ｐと反応しなかった非蛍光性ナノ粒子５ａの表面に密集する多数の１次抗体１ａに２次抗体２ｄが複数結合し、これら２次抗体２ｄに蛍光ナノ粒子５がそれぞれ結合するので、特異性が好適に維持された状態で非常に効率よく増感させることができる。使用する１次抗体１ａ、２次抗体２ｄ、または蛍光ナノ粒子５の量を調節することで、検出感度を幅広く調節することができ、検出感度のダイナミックレンジが広がり特に有利である。
[第９実施形態]
第９実施形態は、第１実施形態の免疫染色工程のみを変更したものであるので、それ以外の工程については説明を省略し、免疫染色工程についてのみ以下説明する。
〈第１反応工程〉
図３（Ｉ）に示すように、粒子表面にモノクローナル抗体である１次抗体１ａが多数密集して結合された非蛍光性ナノ粒子５ａの粒子分散液を、標本スライド上に載せて抗原抗体反応をさせる。これにより、標本スライドの抗原Ｐが有する複数のエピトープｅｐ１に対して、１次抗体１ａが結合する。なお、１次抗体１ａが粒子表面に多数密集して結合した非蛍光性ナノ粒子５ｂの使用量は、第８実施形態と同様である。
〈第２反応工程〉
図３（Ｉ）に示すように、抗原Ｐに固定された非蛍光性ナノ粒子５ｂの表面にある、抗原Ｐに結合していない多数の１次抗体１ａのＦｃ領域（一部，全部）、またはＦａｂ領域（一部，全部）に対して（すなわち抗原Ｐとの反応に寄与しなかった１次抗体部分に対して）、遊離の複数のポリクローナル抗体である２次抗体２ａ，２ｄを結合させる。
〈第３反応工程〉
ビオチン３とストレプトアビジン４との結合を介して、２次抗体２ａ，２ｄに蛍光ナノ粒子５を固定させる。その結果、１つの抗原Ｐに対して２以上の２次抗体２ｄ、蛍光ナノ粒子５が結合・固定される。
（第９実施形態の作用、効果）
以下、第９実施形態の作用、効果について説明する。
第９実施形態の蛍光免疫染色法によれば、非蛍光性ナノ粒子５ｂの表面には１次抗体１ａが多数密集して存在する為、１次抗体１ａが遊離状態の場合と比べて高確率で、１次抗体１ａを抗原Ｐに結合させることができる。また、１つの抗原Ｐに対してモノクローナル抗体としての１次抗体１ａが１箇所でのみ結合するので特異性が高い。そして、抗原Ｐと反応しなかった非蛍光性ナノ粒子５ａの表面の多数の１次抗体１ａの様々な箇所に対して、ポリクローナル抗体としての２次抗体２ａ，２ｄが結合し、その上で、この２次抗体２ａ，２ｄに蛍光ナノ粒子５ａが結合するので、２次抗体としてモノクローナル抗体を使用する場合と比べて、２次抗体の結合数が多く効率よく増感させることができる。その結果、検出感度のダイナミックレンジも広がり、さらに広いダイナミックレンジの範囲で、使用する１次抗体、２次抗体、または蛍光ナノ粒子の量を調節することで、検出感度をより幅広く好適に調節することができる。
[第１０実施形態]
第１０実施形態は、第１実施形態の免疫染色工程のみを変更したものであるので、それ以外の工程については説明を省略し、免疫染色工程についてのみ以下説明する。
〈第１反応工程〉
図３（Ｊ）に示すように、粒子表面にポリクローナル抗体である１次抗体１ａ，１ｂが多数密集して結合された非蛍光性ナノ粒子５ａの粒子分散液を、標本スライド上に載せて抗原抗体反応をさせる。これにより、標本スライドの抗原Ｐが有する複数のエピトープｅｐ１，ｅｐ２に対して、１次抗体１ａ，１ｂが結合する。なお、１次抗体１ａ，１ｂが粒子表面に多数密集して結合した非蛍光性ナノ粒子５ａの使用量は、第８実施形態と同様である。
〈第２反応工程〉
図３（Ｊ）に示すように抗原Ｐに固定された非蛍光性ナノ粒子５ａの表面にある多数の１次抗体１ａ，１ｂのＦｃ領域（一部，全部）、またはＦａｂ領域（一部，全部）に対して（すなわち抗原Ｐとの反応に寄与しなかった１次抗体部分に対して）、遊離のモノクローナル抗体である２次抗体２ｄを複数結合させる。
〈第３反応工程〉
ビオチン３とストレプトアビジン４との結合を介して、２次抗体２ｄに蛍光ナノ粒子５を固定させる。その結果、１つの抗原Ｐに対して２以上の２次抗体２ｄ、蛍光ナノ粒子５が結合・固定される。
（第１０実施形態の作用、効果）
以下、第１０実施形態の作用、効果について説明する。
第１０実施形態の蛍光免疫染色法によれば、非蛍光性ナノ粒子５ａの表面には１次抗体１ａ，１ｂが多数存在する為、１次抗体１ａ，１ｂが遊離状態の場合と比べて高確率で、１次抗体１ａ，１ｂを抗原Ｐに結合させることができる。また、１次抗体１ａ，１ｂがポリクローナル抗体であるので、第９実施形態の場合（非蛍光性ナノ粒子５ａの表面にモノクローナル抗体を固定した場合）よりも、さらに強固に抗原Ｐに非蛍光性ナノ粒子が固定されるので、特異性も高く、好適に増感させることができる。
[第１１実施形態]
第１１実施形態は、第１実施形態の免疫染色工程のみを変更したものであるので、それ以外の工程については説明を省略し、免疫染色工程についてのみ以下説明する。
〈第１反応工程〉
図３（Ｋ）に示すように、粒子表面にポリクローナル抗体１ａ，１ｂを多数結合された非蛍光性ナノ粒子５ａの粒子分散液を、標本スライド上に載せて抗原抗体反応をさせる。これにより、標本スライドの抗原Ｐが有する複数のエピトープｅｐ１，ｅｐ２に対して、ポリクローナル抗体である１次抗体１ａ，１ｂが結合する。なお、１次抗体１ａ，１ｂが粒子表面に多数密集して結合した非蛍光性ナノ粒子５ａの使用量は、第８実施形態と同様である。
〈第２反応工程〉
図３（Ｋ）に示すように、抗原Ｐに固定された非蛍光性ナノ粒子５ａの表面にある、抗原Ｐに結合していない多数の１次抗体１ａのＦｃ領域（一部，全部）、またはＦａｂ領域（一部，全部）に対して（すなわち抗原Ｐとの反応に寄与しなかった１次抗体部分に対して）、遊離のポリクローナル抗体である２次抗体２ａ，２ｄ，２ｆを複数結合させる。
〈第３反応工程〉
ビオチン３とストレプトアビジン４との結合を介して、２次抗体２ａ，２ｄ，２ｆに蛍光ナノ粒子５を固定させる。その結果、１つの抗原Ｐに対して２以上の２次抗体２ａ，２ｄ，２ｆ、および蛍光ナノ粒子５が結合・固定される。
（第１１実施形態の作用、効果）
以下、第１１実施形態の作用、効果について説明する。
第１１実施形態の蛍光免疫染色法によれば、非蛍光性ナノ粒子５ａの表面には１次抗体１ａ，１ｂが多数存在する為、１次抗体１ａ，１ｂが遊離状態の場合と比べて高確率で、１次抗体を抗原Ｐに結合させることができる。また、１次抗体１ａ，１ｂがポリクローナル抗体であるので、非蛍光性ナノ粒子５ａの表面にモノクローナル抗体を固定した場合よりも、さらに強固に抗原Ｐに非蛍光性ナノ粒子５ａが固定され、より特異性が高い。さらに、抗原に固定された非蛍光性ナノ粒子５ａの表面に存在する多数の１次抗体の１ａ，１ｂのＦｃ領域またはＦａｂ領域の一部，全部のうち２つ以上に対して、遊離のポリクローナル抗体の２次抗体２ａ，２ｄ，２ｆが結合し、その上でこの２次抗体に蛍光ナノ粒子５が結合するので、２次抗体がモノクローナル抗体である場合と比べて２次抗体，蛍光ナノ粒子の結合数が多く、検出感度を高めることができ、検出のダイナミックレンジが広がる。
[第１２実施形態]
第１２実施形態は、第１実施形態の免疫染色工程のみを変更したものであるので、それ以外の工程については説明を省略し、免疫染色工程についてのみ以下説明する。
〈第１反応工程〉
図４（Ｌ）に示すように、粒子表面にモノクローナル抗体１ａが多数結合された非蛍光性ナノ粒子５ａの粒子分散液を、標本スライド上に載せて抗原抗体反応をさせる。これにより、標本スライドの抗原Ｐが有するエピトープｅｐ１に対して、モノクローナル抗体である１次抗体１ａが結合する。なお、１次抗体１ａが粒子表面に多数密集して結合した非蛍光性ナノ粒子５ａの使用量は、第８実施形態と同様である。
〈第２反応工程〉
図４（Ｌ）に示すように、抗原Ｐに固定された非蛍光性ナノ粒子５ａの表面にある、多数の１次抗体１ａのＦｃ領域（一部，全部）、またはＦａｂ領域（一部，全部）に対して（すなわち抗原Ｐとの反応に寄与しなかった１次抗体部分に対して）、蛍光ナノ粒子５の表面に多数結合したモノクローナル抗体である２次抗体２ｃを複数結合させ、１つの抗原Ｐに対して２以上の２次抗体２ｃの結合を介して蛍光ナノ粒子５を１つまたは２以上固定させる。
〈第３反応工程〉
上記の第１反応工程または第２反応工程の前に、前述したように蛍光ナノ粒子５に２次抗体２ｃを多数結合させる。
（第１２実施形態の作用、効果）
以下、第１２実施形態の作用、効果について説明する。
第１２実施形態の蛍光免疫染色法によれば、１次抗体１ａがモノクローナル抗体であるので、抗原に対して特に特異性が維持された状態で１次抗体が結合される。非蛍光性ナノ粒子５ａの表面には１次抗体１ａが多数密集して存在する為、１次抗体１ａが遊離状態である場合と比べて高確率で、抗原Ｐに対して１次抗体を結合させることができる。そして、非蛍光性ナノ粒子５ａ表面に抗原Ｐと反応しなかった多数の１次抗体１ａに対し、蛍光ナノ粒子５の表面に多数結合された２次抗体２ｃが結合することになるので、１次抗体１ａに対し２次抗体２ｃを高確率で結合させることができ、好適に増感させることができる。
[第１３実施形態]
第１３実施形態は、第１実施形態の免疫染色工程のみを変更したものであるので、それ以外の工程については説明を省略し、免疫染色工程についてのみ以下説明する。
〈第１反応工程〉
図４（Ｍ）に示すように、粒子表面にモノクローナル抗体１ａが多数密集して結合された非蛍光性ナノ粒子５ａの粒子分散液を、標本スライド上に載せて抗原抗体反応をさせる。これにより、標本スライドの抗原Ｐのエピトープｅｐ１に対して、モノクローナル抗体１ａ（１次抗体）が結合する。なお、１次抗体１ａが粒子表面に多数密集して結合した非蛍光性ナノ粒子５ａの使用量は、第８実施形態と同様である。
〈第２反応工程〉
図４（Ｍ）に示すように、抗原Ｐに固定された非蛍光性ナノ粒子５ａの表面にある、抗原Ｐに結合していない多数の１次抗体１ａのＦｃ領域（一部，全部）およびＦａｂ領域（一部，全部）に対して（すなわち抗原Ｐとの反応に寄与しなかった１次抗体部分に対して）、蛍光ナノ粒子５の表面に多数結合したポリクローナル抗体としての２次抗体２ｄ，２ｃを複数結合させる。これにより、１つの抗原Ｐに対し２以上の２次抗体１ａの結合を介して蛍光ナノ粒子５が１つまたは２以上固定される。
〈第３反応工程〉
上記の第１反応工程または第２反応工程の前に、前述したように蛍光ナノ粒子５に２次抗体２ｃ，２ｄを多数結合させる。
（第１３実施形態の作用、効果）
以下、第１３実施形態の作用、効果について説明する。
第１３実施形態の蛍光免疫染色法によれば、１次抗体１ａがモノクローナル抗体であるので、抗原Ｐに対して特に特異性が維持された状態で１次抗体１ａが結合される。非蛍光性ナノ粒子５ａの表面には１次抗体１ａが多数存在する為、１次抗体１ａが遊離状態の場合と比べて、高い確率で抗原Ｐに対して１次抗体１ａを結合させることができる。そして、抗原Ｐと反応しなかった非蛍光性ナノ粒子５ａ表面上の多数の１次抗体１ａに対し、蛍光ナノ粒子５の表面に多数密集して結合されたポリクローナル抗体２ｃ，２ｄが２次抗体として結合することになるので、１次抗体１ａの様々な結合箇所に対し２次抗体を高確率で結合反応させることができ、好適に増感させることができる。
[第１４実施形態]
第１４実施形態は、第１実施形態の免疫染色工程のみを変更したものであるので、それ以外の工程については説明を省略し、免疫染色工程についてのみ以下説明する。
〈第１反応工程〉
図４（Ｎ）に示すように、粒子表面にポリクローナル抗体である１次抗体１ａ，１ｂが多数密集して結合された非蛍光性ナノ粒子５ａの粒子分散液を、標本スライド上に載せて抗原抗体反応をさせる。これにより、標本スライドの抗原Ｐが有する複数のエピトープｅｐ１，ｅｐ２に対して、１次抗体１ａ，１ｂが結合し非蛍光性ナノ粒子５ａが抗原Ｐに固定される。なお、１次抗体１ａ，１ｂが粒子表面に結合した非蛍光性ナノ粒子５ａの使用量は、第８実施形態と同様である。
〈第２反応工程〉
図４（Ｎ）に示すように、抗原Ｐに固定された非蛍光性ナノ粒子５ａの表面にある、抗原Ｐに結合していない多数の１次抗体１ａ，１ｂのＦｃ領域（全部、一部）、またはＦａｂ領域（一部，全部）に対して（すなわち抗原Ｐとの反応に寄与しなかった１次抗体部分に対して）、蛍光ナノ粒子５の粒子表面に多数結合したモノクローナル抗体の２次抗体２ｄを複数結合させ、１つの抗原に対し２以上の抗体の結合を介して蛍光ナノ粒子を１つまたは２以上固定させる。
抗原と蛍光ナノ粒子との間にモノクローナルの１次抗体および２次抗体、ビオチン-アビジンの結合を介在させる場合の２次抗体と比べて、蛍光ナノ粒子表面の２次抗体のモル数（または個数）、モル濃度、は、抗体力価にもよるが、１０倍以上に設定することが好ましい（以下同様）。
〈第３反応工程〉
上記の第１反応工程または第２反応工程の前に、前述したように蛍光ナノ粒子５に２次抗体２ｄを多数結合させる。
（第１４実施形態の作用、効果）
以下、第１４実施形態の作用、効果について説明する。
第１４実施形態の蛍光免疫染色法によれば、非蛍光性ナノ粒子５ａの表面には１次抗体１ａ，１ｂが多数存在する為、１次抗体が遊離状態である場合と比べて高い確率で、１次抗体１ａを抗原Ｐに結合させることができる。また、１次抗体１ａ，１ｂがポリクローナル抗体であるので、非蛍光性ナノ粒子５ａの表面にモノクローナル抗体を固定した場合よりも、強固に抗原Ｐに非蛍光性ナノ粒子５ａが固定され、特異性も高まる。
また、非蛍光性ナノ粒子５ａの表面の抗原Ｐと反応しなかった多数の１次抗体１ａ，１ｂ間で共通する部位（例；Ｆｃ領域の一部）に対し、蛍光ナノ粒子５の表面に多数結合されたモノクローナル抗体２ｄが結合することになるので、１次抗体１ａの種類にかかわらず結合させることができる上に、１次抗体１ａに対し２次抗体２ｃ，２ｄを高確率で結合させることができ、この点で好適に増感させることができる。
[第１５実施形態]
第１５実施形態は、第１実施形態の免疫染色工程のみを変更したものであるので、それ以外の工程については説明を省略し、免疫染色工程についてのみ以下説明する。
〈第１反応工程〉
図４（Ｏ）に示すように、粒子表面にポリクローナル抗体である１次抗体１ａ，１ｂが多数密集して結合された非蛍光性ナノ粒子５ａの粒子分散液を、標本スライド上に載せて抗原抗体反応をさせる。これにより、標本スライドの抗原Ｐが有する複数のエピトープｅｐ１，ｅｐ２に対して、１次抗体１ａ，１ｂがそれぞれ結合する。なお、１次抗体１ａ，１ｂが粒子表面に多数密集して結合した非蛍光性ナノ粒子５ａの使用量は、第８実施形態と同様である。
〈第２反応工程〉
図４（Ｏ）に示すように、抗原Ｐに固定された非蛍光性ナノ粒子５ａの表面にある１次抗体１ａ，１ｂのＦｃ領域（一部，全部）、またはＦａｂ領域（一部，全部）に対して（すなわち抗原Ｐとの反応に寄与しなかった１次抗体部分に対して）、蛍光ナノ粒子５の表面に多数結合したポリクローナル抗体２ｄ，２ｃ（２次抗体）を結合させ、１つの抗原Ｐに対し２以上の２次抗体２ｃ，２ｄの結合を介して蛍光ナノ粒子５を１つまたは２以上固定させる。
〈第３反応工程〉
上記の第１反応工程または第２反応工程の前に、前述したように蛍光ナノ粒子５に２次抗体２ｃ，２ｄを多数結合させる。
（第１５実施形態の作用、効果）
以下、第１５実施形態の作用、効果について説明する。
第１５実施形態の蛍光免疫染色法によれば、非蛍光性ナノ粒子５ａの表面には１次抗体１ａ，１ｂが多数密集して存在する為、遊離の１次抗体の場合と比べて高い確率で、１次抗体１ａ，１ｂを抗原Ｐに結合させることができる。また、非蛍光性ナノ粒子５ａの表面の１次抗体１ａ，１ｂがポリクローナル抗体であるので、非蛍光性ナノ粒子５ａの表面にモノクローナル抗体を固定した場合よりも、強固に抗原Ｐに非蛍光性ナノ粒子５ａが固定されるので、より特異性が高い。
また、非蛍光性ナノ粒子５ａの表面の抗原Ｐと反応しなかった多数の１次抗体１ａ，１ｂに対し、蛍光ナノ粒子５の表面に多数結合されたポリクローナル抗体が２次抗体として１次抗体１ａ，１ｂの異なる結合部位（例；Ｆｃ領域の全体とＦａｂ領域一部）に結合することになるので、１次抗体に対し２次抗体を強固かつ高確率で結合させることができ、好適に増感させることができる。
［製造例１］（蛍光ナノ粒子（平均粒子径１５０nm）の製造）
蛍光ナノ粒子（平均粒子径１５０nm）の製造を、以下の工程(1-1)〜(1-6)により行った。
工程(1-1)：蛍光色素として赤色発光色素であるスルホローダミン１０１（Sulforhodamine101、シグマアルドリッチ社製）１４．４ｍｇを蒸留水２２ｍＬに加えて溶解させた。
その後、この溶液に乳化重合用乳化剤のエマルジョン（登録商標）４３０（ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王社製）の５％水溶液を２ｍＬ加えた。
工程(1-2)：この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら７０℃まで昇温させた後、この溶液にメラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）を０．６５ｇ加えた。
工程(1-3)：さらに、この溶液に界面活性剤としてドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学社製）の１０％水溶液を１０００μＬ加え、７０℃で５０分間加熱撹拌した。
工程(1-4)：その後、９０℃に昇温して２０分間加熱撹拌した。
工程(1-5)：得られたメラミン系の蛍光ナノ粒子の分散液から、余剰の樹脂原料や蛍光色素等の不純物を除くため、純水による洗浄を行った。具体的には、遠心分離機（クボタ社製マイクロ冷却遠心機３７４０）にて２００００Ｇで１５分間、遠心分離し、上澄み除去後、超純水を加えて超音波照射して再分散した。
工程(1-6)：工程(1-5)の蛍光ナノ粒子の分散液について、遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による洗浄を５回繰り返した。得られたメラミン系の蛍光ナノ粒子はメラミン樹脂自体が骨格に多くのアミノ基を含むことから、プラス電荷となった。樹脂粒子の電荷の評価は、ＮＭＲやＩＲ等による樹脂成分分析と、ゼータ電位測定により行なった。ナノ粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ；日立（登録商標）社製Ｓ−８００型）で観察し、平均粒子径及び変動係数を算出した。得られた蛍光ナノ粒子の平均粒子径は１５０ｎｍであり、変動係数は１４．７％であった。
［製造例２］<ポリクローナル抗体が結合した蛍光ナノ粒子の製造>
（蛍光ナノ粒子へのアミノ基導入）
製造例１で製造したメラミン系の蛍光ナノ粒子（平均粒子径１５０ｎｍ）に対して、下記工程（2-1）〜（2-3）を行うことにより該蛍光ナノ粒子にアミノ基を導入した。
工程（2-1）：０．１ｍｇの上記蛍光ナノ粒子を純水１ｍＬに分散させ、分散液を調製した。次いで、トリス（2−アミノエチル）アミン（Tris(2-aminoethyl)amine）２０μＬを上記分散液に添加し、７０℃で２０分加熱撹拌した。
工程（2-2）：反応混合物を１００００Ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
工程（2-3）：エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を１回ずつ行った。
得られたアミノ基を導入した蛍光ナノ粒子のＦＴ−ＩＲ測定およびＸＰＳ測定を行ったところ、アミノ基に由来する吸収が観測でき、アミノ基が導入されたことが確認できた。
（マレイミド基の導入）
以下の工程(3-1)〜(3-3)により、マレイミド基修飾したメラミン系の蛍光ナノ粒子を調製した。
工程(3-1)：アミノ基を導入した上記蛍光ナノ粒子を、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ｛リン酸緩衝液生理的食塩水｝に３ｎＭとなるように分散させた。この分散液に対して、終濃度１０ｍＭとなるように、ＳＭ（ＰＥＧ）12（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオアミド）−ドデカンエチレングリコール］エステル）を混合し、混合液を室温で１時間反応させた。
工程(3-2)：反応後の該混合液を１００００Ｇで２０分間遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡ２ｍＭ含有したＰＢＳを加えて沈殿物を分散させた。再度遠心分離を行った。
工程(3-3)：同様の手順による洗浄を３回行うことで、蛍光ナノ粒子にＰＥＧ鎖を介してマレイミド基が付加した蛍光ナノ粒子が得られた。
（蛍光ナノ粒子とポリクローナル抗体との結合）
工程(4-1)：「ビオチン標識抗ウサギ（ラビット）IgG抗体（動物種：ヤギ）」（製品番号:426011,426012、ニチレイバイオサイエンス社）１００μｇをＰＢＳ１００μＬに溶解させた。この抗体溶液に１Ｍの２−メルカプトエタノールを０．００２ｍＬ（０．２×１０-5モル）添加して、ｐＨ８．５、室温で３０分間反応させて上記抗体の還元を行った。
工程(4-2)：工程(4-1)後の反応液をゲル濾過カラムに供して、過剰の２−メルカプトエタノールを除去し、ＳＨ基を有する上記抗体（抗ウサギIgG ポリクローナル抗体）の溶液を得た。
（ＳＨ基を有する抗ＨＥＲ２抗体とマレイミド基修飾したスルホローダミン内包メラミンナノ粒子との結合）
工程(5-1)：工程(3-3)を経て得られたマレイミド基修飾した上記メラミン系の蛍光ナノ粒子０．０１μｇと、工程(4-2)を経て得られたＳＨ基を有する上記抗体（抗ウサギIgG ポリクローナル抗体）１０μｇとをＰＢＳ１ｍＬ中で混合し、室温で１時間、両分子を結合する反応を行った。
工程(5-2)：１０ｍＭの２−メルカプトエタノール４μＬを工程（5-1）後の反応液に添加して結合反応を停止させた。
工程(5-3)：工程(5-2)からの溶液を１００００ｇで６０分間遠心分離処理を行い、上澄みを除去した。その後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加えて沈降物を分散させた後、上記遠心分離を再度行った。同様の手順による洗浄を３回行った。最後に５００μＬのＰＢＳにより分散させて、２次抗体として抗ウサギIgG ポリクローナル抗体が結合した蛍光ナノ粒子を得た。
［製造例３］<モノクローナル抗体が直接結合した蛍光ナノ粒子の製造>
製造例２で使用した「ビオチン標識抗ウサギIgG抗体（動物種：ヤギ）」の代わりに、「ＬＯ−ＲＧ−１」（フナコシ社製の抗ウサギＩｇＧ抗体）を使用したこと以外は、製造例２と同様にして、２次抗体として抗ウサギＩｇＧ抗体（モノクローナル抗体）が結合したメラミン系の蛍光ナノ粒子の製造を行った。
［製造例４］<ポリクローナル抗体が結合した非蛍光性ナノ粒子の製造>
製造例１において、蛍光色素を使用しなかったこと以外は製造例１と同様にして、蛍光体を内包しないメラミンナノ粒子（非蛍光性ナノ粒子）を製造した。
さらに、製造例２において、蛍光ナノ粒子の代わりに上記の非蛍光性ナノ粒子を使用し、「ビオチン標識抗ウサギIgG抗体（動物種：ヤギ）」の代わりに、ヒトのＰＤ−Ｌ１に結合可能なポリクローナル抗体である「Anti-PD-L1 抗体 (ab58810)」(動物種：ラビット、Abcam社)を使用し、その他については製造例２と同様にして、抗ＰＤ−Ｌ１抗体「Anti-PD-L1 抗体 (ab58810)」が結合した非蛍光性のメラミンナノ粒子を製造した。このときの非蛍光性ナノ粒子の表面の１次抗体の結合密度は、1粒子に1000個程度の上記抗体が結合しており、約3.54×１０14（個／ｍｍ2粒子表面）であった。
（抗体結合密度の決定）
製造した抗体結合の非蛍光性のメラミンナノ粒子について、ＢＣＡ法を行い、粒子表面に結合している蛋白質の量（抗体の全重量）を測定し、使用した抗体の重量分子量から粒子表面に固定された抗体のモル数や個数を算出した。
一方、上記非蛍光性ナノ粒子の平均粒子径（１５０ｎｍ）を用いて４πｒ2から平均粒子表面積を算出した。また、パーティクルカウンターを使用して前記非蛍光性ナノ粒子の分散液の濃度（個/μL）を決定し、分散液の全量（μL）から非蛍光性ナノ粒子の総数（個）を計測した。平均粒子表面積(mm2/個)に、計測した粒子の総数（個）を乗じて非蛍光性ナノ粒子の総表面積(mm2)を算出した。上記抗体のモル数と該粒子総表面積(mm2)とから、抗体結合密度(抗体モル数/mm2)を計算した。
［製造例５］<モノクローナル１次抗体が結合した非蛍光性ナノ粒子の製造>
製造例１において、蛍光色素を使用しなかったこと以外は製造例１と同様にして、蛍光体を内包しないメラミンナノ粒子（非蛍光性ナノ粒子）を製造した。
さらに、製造例３において、蛍光ナノ粒子の代わりに上記非蛍光性ナノ粒子を使用し、また、「ビオチン標識抗ウサギIgG抗体（動物種：ヤギ）」（製品番号:426011,426012、ニチレイバイオサイエンス社）の代わりに、「ＰＤ−Ｌ１（E1L3N（登録商標）ＸＰ（登録商標）Rabbit mAb」（ＣＳＴジャパン社）を使用し、その他については製造例３と同様にして、「ＰＤ−Ｌ１（E1L3N（登録商標）ＸＰ（登録商標）Rabbit mAb」が結合した非蛍光性のメラミンナノ粒子を製造した。製造例４の抗体結合密度の決定方法に倣って、このときの非蛍光性ナノ粒子の表面の１次抗体の結合密度を測定したところ、1粒子に1000個程度の上記抗体が結合しており、約3.54×１０14（個／ｍｍ2粒子表面）であった。
［製造例６］<ビオチン修飾された遊離のポリクローナル抗体（２次抗体）の用意〉
ヒストファイン「ビオチン標識抗ウサギIgG抗体（動物種：ヤギ）」（製品番号:426011,426012、ニチレイバイオサイエンス社）を購入し、この抗体の溶液（アジ化ナトリウム0.1%を含む）を以下の工程(6-1)に供した。
工程(6-1)：上記抗体の溶液を脱塩カラム「Zeba Desalt Spin Columns」（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製，Cat.#89882）に供して精製した。脱塩した反応溶液の波長３００ｎｍの吸収を分光高度計（日立製「Ｆ−７０００」）により計測して反応溶液に含まれるタンパク質の量を算出した。５０ｍＭＴｒｉｓ溶液により反応溶液を２５０μｇ／ｍＬに調整し、該溶液をビオチン修飾された遊離のポリクローナル抗体（２次抗体）の溶液として用いた。
［製造例７］〈ビオチン修飾された遊離のモノクローナル抗体（２次抗体）の製造〉
工程(7-1)：５０ｍＭＴｒｉｓ溶液に「ＬＯ−ＲＧ−１」（フナコシ社製の抗ウサギＩｇＧ抗体）（動物種：ラット）５０μｇを溶解した。
工程(7-2)：該溶液に、最終濃度３ｍＭとなるようにＤＴＴ（ジチオスレイトール）溶液を混合した。その後、該溶液を３７℃で３０分間反応させた。
工程(7-3)：その後、脱塩カラムを用いてＤＴＴで還元化した２次抗体を精製した。
工程(7-4)：精製した抗体全量のうち２００μＬを５０ｍＭＴｒｉｓ溶液に溶解して抗体溶液を得た。
工程(7-5)：その一方で、スペーサーの長さが３０オングストロームであるリンカー試薬「Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ6‐ＮＨ‐Ｍａｌ」（ＰｕｒｅＰＥＧ社製,製品番号2461006-250）を、ＤＭＳＯを用いて０．４ｍＭとなるように調整した。
工程(7-6)：この溶液８．５μＬを前記抗体溶液に添加し、混和して３７℃で３０分間反応させた。
工程(7-7)：この反応溶液を脱塩カラム「Zeba Desalt Spin Columns」（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製，Cat.#89882）に供して精製した。脱塩した反応溶液の波長３００ｎｍの吸収を分光高度計（日立製「Ｆ−７０００」）により計測して反応溶液に含まれるタンパク質の量を算出した。５０ｍＭＴｒｉｓ溶液により反応溶液を２５０μｇ／ｍＬに調整し、該溶液をビオチン修飾された遊離のモノクローナル抗体（２次抗体）の溶液として用いた。
［製造例８］〈リンカーを介してストレプトアビジンが結合したスルホローダミン内包ナノ粒子の製造〉
（ＳＨ基を有するストレプトアビジンの調製）
ＳＨ基を有するストレプトアビジンの調製は以下のように行った。
工程(8-1)：１ｍｇ／ｍＬに調整したストレプトアビジン（和光純薬工業社製）４０μＬに対して、６４ｍｇ／ｍＬに調整した２−イミノチオラン（ｐｉｅｒｃｅ社製）７０μＬを室温で１時間反応させた。すなわち、ストレプトアビジンのアミノ基に対してチオール基を導入した。
工程(8-2)：このストレプトアビジン溶液をゲルろ過カラム（Ｚａｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ：フナコシ）により脱塩し、ＳＨ基を有したストレプトアビジン０．０４ｍｇを得た。
（蛍光ナノ粒子へのマレイミド基の導入）
工程(8-3)：製造例２の工程（2-3）で得られた、アミノ基を導入した上記蛍光ナノ粒子を、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ｛リン酸緩衝液生理的食塩水｝に３ｎＭとなるように分散させた。
工程(8-4)：この分散液に対して、終濃度１０ｍＭとなるように、リンカーとしてのＳＭ（ＰＥＧ）12（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオアミド）−ドデカンエチレングリコール］エステル）を混合し、混合液を室温で１時間反応させた。
工程(8-5)：反応後の該混合液を１００００Ｇで２０分間遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡ２ｍＭ含有したＰＢＳを加えて沈殿物を分散させた。再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで、蛍光ナノ粒子にＰＥＧ鎖を介してマレイミド基が付加した蛍光ナノ粒子が得られた。
（蛍光ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合）
マレイミド基を付加した上記蛍光ナノ粒子を、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳに０．６７ｎＭとなるように分散させた。この蛍光ナノ粒子の分散液７４０μＬと、ＳＨ基を導入した上記ストレプトアビジン０．０４ｍｇとを混合し、室温で１時間反応させた。この反応液に１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲル濾過カラムを用いて未反応の抗フルオレセイン抗体等を除去し、リンカーを介してストレプトアビジンが結合したスルホローダミン内包ナノ粒子を得た。このときの蛍光ナノ粒子の表面のストレプトアビジンの結合密度を測定したところ、1粒子に1000個程度のストレプトアビジンが結合しており、約3.54×１０14（個／ｍｍ2粒子表面）であった。
［製造例９］
（染色対象（ＰＤ−Ｌ１の培養細胞の標本スライド）の用意）
公知の方法に従い、パラフィンにより固定化されたＰＤ−Ｌ１陽性の培養細胞の標本スライドを用意した。
また、ノイズ計測用として、ＰＤ−Ｌ１が陰性の細胞を培養してパラフィンで固定して標本スライド（以下、単に「標本スライド（ノイズ計測用）」という）を作成した。 なお、陽性の培養細胞株はNCI-H460（生物： ホモサピエンス、人間 /組織： 肺：胸水 /病： 癌; 大細胞肺癌）、陰性の培養細胞株はNCI-H446（生物： ホモサピエンス、人間/組織：肺;胸水：転移部位由来/病： 癌;小細胞肺癌）（ATCC（登録商標）社製）を用いた。培養条件は下記の通りである。
なお、継代は、一般的な公知の継代培養により行った。表２に示したように、継代の際の細胞表面の洗浄は0.25%トリプシンを使用し、新しい培地の容量と、該培地に加える細胞浮遊液の添加量との比を1：3〜1：8（または1：3〜1：6）とした。
（ホルマリン固定パラフィン包埋）
上記培養した各種の培養細胞の標本スライド化は、下記工程(A-1)〜(A-8)に基づいて、一般的なホルマリン固定・パラフィン包埋（FFPE）の条件に基づいて行った。
工程(A-1):新鮮な3mm角程度に切り出した上記ＰＤ−Ｌ１の培養細胞の組織ブロックをホルマリン緩衝液「10%中性緩衝ホルマリン液」（和光純薬工業社）を使用して室温で４８時間固定処理を行った。
工程(A-2):水道水で1時間組織を洗浄した。
工程(A-3)：70%, 80%, 95%のエタノールでそれぞれ45分間組織を浸し、100%エタノールは1時間ずつ3回換えて脱水した。
工程(A-4)：組織をキシレンに浸し、キシレンは1時間ずつ2回交換した。
工程(A-5)：パラフィンに浸し、1時間ずつ3回パラフィンを交換した。
工程(A-6): 組織をパラフィンブロックにした。
工程(A-7)：パラフィン包埋ブロックをミクロトームで6μmに薄切し、40℃の蒸留水中に浮かべた。
工程(A-8)：免疫組織染色に適したガラススライドに標本を移し、オーバーナイトで乾燥させ使用するまで室温で保管した。
［比較例１］
（免疫染色工程）
［脱パラフィン処理工程］
工程（1A）：上記標本スライドをキシレンに１０分浸漬させて標本スライド中のパラフィンを除去してキシレンで置換した。途中３回キシレンを交換した。
工程（1B）：工程（1A）を経た標本スライドをエタノールに５分浸漬させて標本スライド中のキシレンをエタノールで置換した。途中３回エタノールを交換した。
工程（1C）：工程（1B）を経た標本スライドを蒸留水に５分浸漬させて、標本スライド中のエタノールを蒸留水で置換した。途中３回蒸留水を交換した。
［賦活化処理工程］
工程（2A）：工程(1C)で得た標本スライドを１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に１０分浸漬させて、標本スライド中の水をクエン酸緩衝液で置換した。
工程（2B）：工程（2A）を経た標本スライドをオートクレーブ処理（１２１℃で１０分間）した。
工程（2C）：工程（2B）を経た標本スライドを室温まで放冷後、ＰＢＳに５分浸漬させた。途中３回PBSを交換した。
工程（2D）：工程（2C）を経た標本スライド全体に対して、ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳを滴下して室温で３０分放置した。
［第１反応工程］
工程(3A)：無脂肪のドライミルクを５％ｗ/ｖ、１×ＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む溶液を用意した。
工程(3B)：工程(3A)で用意した溶液で、ヒトＰＤ−Ｌ１に結合可能な抗ＰＤ−Ｌ１抗体である１次抗体としての「ＰＤ−Ｌ１（E1L3N（登録商標）ＸＰ（登録商標）Rabbit mAb」（動物種：ラビット，ＣＳＴジャパン社）を８００倍希釈し、この抗体溶液を１００μＬ、ＰＤ−Ｌ１培養細胞の標本スライドの上に載置して、４℃で１晩インキュベーションした。
［洗浄工程１］
工程（4A）：工程（3B）を経た標本スライドをそれぞれ５分ＰＢＳに浸漬させた。途中３回PBSを交換した。
［第２反応工程］
工程（5A）：工程(3A)で用意した溶液で、製造例７で用意したビオチン修飾された遊離のモノクローナル抗体（２次抗体）「LO-RG-1」（フナコシ社製の抗ウサギＩｇＧ抗体）の抗体溶液を２００倍希釈し、この溶液を１００μＬ、工程(4A)を経たＰＤ−Ｌ１培養細胞の標本スライド上に載置して、室温で３０分反応させた。
［洗浄工程２］
工程（6A）：工程（5A）を経た標本スライドをそれぞれ５分ＰＢＳに浸漬させた。途中３回PBSを交換した。
［第３反応工程］
工程（7A）：ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳでもって、製造例８で製造したストレプトアビジン修飾のスルホローダミンを内包したメラミン系の蛍光ナノ粒子を０．０５ｎＭに希釈した。次に、該希釈により得られた分散液を、工程（2D）を経た標本スライド全体に滴下して室温で３時間放置した。
［洗浄工程３］
工程（8A）：工程（5A）を経た標本スライドをそれぞれ５分ＰＢＳに浸漬させた。途中３回PBSを交換した。
［形態観察用処理工程］
工程（9A）：工程（8A）を経た標本スライドを４％中性パラホルムアルデヒド溶液で１０分間固定処理した後、ヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）を行った。ＨＥ染色は、免疫染色した標本スライドをマイヤーヘマトキシリン液で１５分間染色してヘマトキシリン染色を行った。その後、該標本スライドを４５℃の流水で３分間洗浄した。次に、１％エオジン液で１分間染色してエオジン染色を行った。その後、純エタノールに５分間漬ける操作４回行い、洗浄・脱水を行った。続いてキシレンに５分間漬ける操作を４回行い、透徹を行った。
工程（9B）：工程（9A）を経た標本スライド全体に対して「Aquatex（登録商標）」（製品番号108562、Merck Millipore社製）を滴下した後、カバーガラスを載せて室温で３０分以上放置することで前記標本スライドを封入した。
［観察工程］
上記一連の工程を経た標本スライドに対して所定の励起光を照射して蛍光を発するようにした。その状態の標本スライドを蛍光顕微鏡（ＢＸ−５３，オリンパス社製）により観察および撮像を行った。また、輝点計測は、ＩｍａｇｅＪ ＦｉｎｄＭａｘｉｍａ法により計測した。
上記励起光は、光学フィルターに通すことで５４５〜５６５ｎｍに設定した。また、観察する蛍光の波長（ｎｍ）の範囲についても、光学フィルターに通すことで５７０〜５９０ｎｍに設定した。
顕微鏡観察、画像取得時の励起波長条件は、５５０ｎｍの励起では視野中心部付近の照射エネルギーが９００Ｗ／ｃｍ2となるようにした。画像取得時の露光時間は画像の輝度が飽和しないように任意に設定（例えば４０００μ秒に設定）して撮像した。次に、蛍光顕微鏡等を用いて撮像した顕微鏡画像を用いて、輝度が所定の閾値を超えた部分を輝点として計測し、１細胞当たりの蛍光ナノ粒子の数や蛍光シグナルの強度（シグナル（相対値）を算出した。この比較例１のシグナル値を後記実施例と対比するための基準とした（相対値＝１とした）。
また、標本スライド（ノイズ計測用）についても同様に脱パラフィン処理工程〜観察工程を行い、シグナル値を計測し、この計測したシグナル値を後記実施例のノイズ値と対比するための基準（相対値＝１）とした。
定量性については「○」であった。なお、定量性の基準として、発現量が既知のＰＤ−Ｌ１の培養細胞を用いて、発現量の蛍光ナノ粒子のスコア（１個の細胞当たりについて同一に観察工程をした場合に確認される粒子数）との相関関係がＲ2≧０．７０のものを「○」とし、０．７０未満のものを「×」とした。
［実施例１］(1次抗体：遊離モノクローナル抗体、2次抗体:遊離ポリクローナル抗体)
実施例１では、比較例１における第２反応工程を下記の通りに行ったことを除いて、その他の脱パラフィン処理工程、賦活化処理工程、第１反応工程、第３反応工程、洗浄工程、および観察工程等は、比較例１と同様に行った。
［第２反応工程］
工程（5A）：工程(3A)で用意した溶液を用いて、製造例６で用意したビオチン修飾された遊離のポリクローナル抗体（２次抗体）の抗体溶液を２００倍希釈し、この溶液を１００μＬ、工程(4A)を経たＰＤ−Ｌ１培養細胞の標本スライド）の上に載置して、室温で３０分反応させた。
［結果］
その結果、比較例１を基準としたシグナル値は２であった。ノイズ値（相対値）は、比較例１の標本スライド（ノイズ計測用）の計測値を１とした場合の値であり、１．５であった。S/N比（相対値）は1.33であった。また、定量性については「○」であった。
［実施例２］(1次抗体：遊離ポリクローナル抗体、2次抗体:遊離モノクローナル抗体)
実施例２では、比較例１において第１反応工程を下記の通りに行ったことを除いて、その他の脱パラフィン処理工程、賦活化処理工程、第２反応工程、洗浄工程１〜３、第３反応工程、観察工程等は、比較例１と同様に行った。
［第１反応工程］
工程(3A)：無脂肪のドライミルクを５％ｗ/ｖ、１×ＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む溶液を用意した。
工程(3B)：工程(3A)で用意した溶液を用いて、ヒトのＰＤ−Ｌ１に結合可能なポリクローナル抗体である「Anti-PD-L1 抗体 (ab58810)」(動物種：ラビット、Abcam社)を２００倍希釈し、この抗体溶液を１００μＬ、ＰＤ−Ｌ１培養細胞の標本スライド上に載置して、４℃で１晩インキュベーションした。
なお、上記１次抗体は、比較例１で使用した１次抗体のモル数と同じモル数となるように調整して使用した。
［結果］
その結果、比較例１を基準としたシグナル値（相対値）は２であり、ノイズ値（相対値）は１であった。S/N比（相対値）は２であった。また、定量性は「○」であった。実施例２の結果を表３に示す。
［実施例３］(1次抗体：遊離ポリクローナル抗体、2次抗体：遊離ポリクローナル抗体)
実施例３では、比較例１において、第１反応工程と第２反応工程を下記の通り行ったことを除いて、その他の脱パラフィン処理工程、賦活化処理工程、洗浄工程１〜３、第３反応工程、観察工程等は、比較例１と同様に行った。
［第１反応工程］
工程(3A)：無脂肪のドライミルクを５％ｗ/ｖ、１×ＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む溶液を用意した。
工程(3B)：工程(3A)で用意した溶液を用いて、「Anti-PD-L1 抗体 (ab58810)」(動物種：ラビット、Abcam社)を２００倍希釈し、この抗体溶液を１００μＬ、ＰＤ−Ｌ１培養細胞の標本スライド上に載置して、４℃で１晩インキュベーションした。
なお、上記１次抗体は、比較例１で使用した１次抗体のモル数と同じモル数となるように調整して使用した。
［第２反応工程］
工程（5A）：工程(3A)で用意した溶液で、製造例６で用意したビオチン修飾された遊離のポリクローナル抗体（２次抗体）の抗体溶液を２００倍希釈し、この溶液を１００μＬ、工程(4A)を経たＰＤ−Ｌ１培養細胞の標本スライド上に載置して、室温で３０分反応させた。
［結果］
実施例３の結果、比較例１を基準としたシグナル（相対値）は４であり、ノイズ値（相対値）は３であった。S/N比（相対値）は1.33であった。また定量性は「○」であった。実施例３の結果を表３に示す。
［実施例４］(1次抗体：非蛍光性ナノ粒子に直結されたモノクローナル抗体、2次抗体：遊離のモノクローナル抗体)
実施例３では、比較例１において、第１反応工程を下記の通り行ったことを除いて、その他の脱パラフィン処理工程、賦活化処理工程、洗浄工程１〜３、第２反応工程、第３反応工程、および観察工程等は、比較例１と同様に行った。
［第１反応工程］
工程(3A)：無脂肪のドライミルクを５％ｗ/ｖ、１×ＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む溶液を用意した。
工程(3B)：製造例５で製造した、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（E1L3N）が粒子表面に複数結合した非蛍光性のメラミンナノ粒子を、該抗ＰＤ−Ｌ１抗体のモル数および濃度が、比較例１で使用した１次抗体の１０倍のモル数および濃度(mol/μL)となるように工程(3A)で用意した溶液に分散した液を１００μＬ製造し、該液の全量を「ＰＤ−Ｌ１培養細胞」の上に載置して、４℃で１晩インキュベーションした。
具体的には、製造例４で前述した抗体結合密度の決定で説明した方法で得られる下記式１に記載の情報から、１次抗体が結合した非蛍光性ナノ粒子の分散液（製造例５参照）１μＬあたりに含まれる抗体のモル数を下記式１より算出し、この情報に基づいて比較例１で使用した１次抗体のモル数と同じモル数および濃度(mol/μL)となるように１次抗体の使用量を調整した。
（式１）
モル数/μＬ＝「非蛍光性ナノ粒子の分散液の濃度（個/μL）」×「平均粒子表面積(mm2/個)」×非蛍光性ナノ粒子の表面の「抗体結合密度（抗体のモル数/mm2）」
［結果］
実施例４の結果、比較例１を基準としたシグナル（相対値）は４であり、ノイズ値（相対値）は３であった。S/N比（相対値）は1.33であった。また、定量性は「○」であった。実施例４の結果を表３に示す。
［実施例５］(1次抗体：非蛍光性ナノ粒子に直結されたモノクローナル抗体、2次抗体：遊離のポリクローナル抗体)
実施例５では、比較例１において、第１反応工程および第２反応工程を下記の通り行ったことを除いて、その他の脱パラフィン処理工程、賦活化処理工程、洗浄工程１〜３、第３反応工程、および観察工程等は、比較例１と同様に行った。
［第１反応工程］
工程(3A)：無脂肪のドライミルクを５％ｗ/ｖ、１×ＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む溶液を用意した。
工程(3B)：製造例５で製造した、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（E1L3N）が粒子表面に複数結合した非蛍光性のメラミンナノ粒子（非蛍光性ナノ粒子）を、該抗ＰＤ−Ｌ１抗体のモル数および濃度が、比較例１で使用した１次抗体の１０倍のモル数および濃度(mol/μL)となるように、工程(3A)で用意した溶液中に分散した液を１００μＬ製造し、その全量を「ＰＤ−Ｌ１培養細胞」の上に載置して、４℃で１晩インキュベーションした。
具体的には、１次抗体の使用量は、実施例４で説明したように式１から算出して決定した。
［第２反応工程］
工程（5A）：工程(3A)で用意した溶液で、製造例６で用意したビオチン修飾された遊離のポリクローナル抗体（２次抗体）「ヒストファイン（登録商標）」（ビオチン標識抗ウサギIgG抗体，動物種：ヤギ，製品番号:426011,426012、ニチレイバイオサイエンス社）の抗体溶液を２００倍希釈し、この溶液を１００μＬ、工程(4A)で得た標本スライド（「ＰＤ−Ｌ１培養細胞」の標本スライド）の上に載置して、室温で３０分反応させた。
［結果］
実施例５の結果、比較例１を基準としたシグナル（相対値）は８であり、ノイズ値（相対値）は６であった。また、S/N比（相対値）は1.33であり、定量性は「○」であった。
実施例５の結果を表３に示す。
［実施例６］(1次抗体：非蛍光性ナノ粒子に直結されたポリクローナル抗体、2次抗体：遊離モノクローナル抗体)
実施例６では、比較例１において、第１反応工程および第２反応工程を下記の通り行ったことを除いて、その他の脱パラフィン処理工程、賦活化処理工程、洗浄工程１〜３、第３反応工程、および観察工程等は、比較例１と同様に行った。
［第１反応工程］
工程(3A)：無脂肪のドライミルクを５％ｗ/ｖ、１×ＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む溶液を用意した。
工程(3B)：製造例４で製造した、抗ＰＤ−Ｌ１抗体であるポリクローナル抗体（ab58810）が粒子表面に複数結合した非蛍光性のメラミンナノ粒子を、該抗ＰＤ−Ｌ１抗体のモル数および濃度が、比較例１で使用した１次抗体の１０倍のモル数および濃度(mol/μL)となるように、工程(3A)で用意した溶液中に分散した液を１００μＬ製造し、その全量を「ＰＤ−Ｌ１培養細胞」の上に載置して、４℃で１晩インキュベーションした。
具体的には、１次抗体の使用量は、実施例４で説明したように式１から算出して決定した。
［結果］
実施例６の結果、比較例１を基準としたシグナル値（相対値）は８であり、ノイズ値（相対値）は４であった。また、S/N比（相対値）は２であり、定量性は「○」であった。
実施例６の結果を表３に示す。
［実施例７］(1次抗体：非蛍光性ナノ粒子に直結されたポリクローナル抗体、2次抗体：遊離ポリクローナル抗体)
実施例７では、比較例１において、第１反応工程および第２反応工程を下記の通り行ったことを除いて、その他の脱パラフィン処理工程、賦活化処理工程、洗浄工程１〜３、第３反応工程、および観察工程等は、比較例１と同様に行った。
［第１反応工程］
工程(3A)：無脂肪のドライミルクを５％ｗ/ｖ、１×ＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む溶液を用意した。 工程(3B)：製造例４で製造した、抗ＰＤ−Ｌ１抗体であるポリクローナル抗体（ab58810）が粒子表面に複数結合した非蛍光性のメラミンナノ粒子を、該抗ＰＤ−Ｌ１抗体のモル数および濃度が、比較例１で使用した１次抗体の１０倍のモル数および濃度(mol/μL)となるように工程(3A)で用意した溶液に分散した液を１００μＬ製造し、該液の全量を「ＰＤ−Ｌ１培養細胞」の上に載置して、４℃で１晩インキュベーションした。
具体的には、１次抗体の使用量は、実施例４で説明したように式１から算出して決定した。
［第２反応工程］
工程（5A）：工程(3A)で用意した溶液で、製造例６で用意したビオチン修飾された遊離のポリクローナル抗体（２次抗体）「ヒストファイン（登録商標）」（ビオチン標識抗ウサギIgG抗体，動物種：ヤギ，製品番号:426011,426012、ニチレイバイオサイエンス社）の抗体溶液を２００倍希釈し、この溶液を１００μＬ、工程(4A)で得た標本スライド（「ＰＤ−Ｌ１培養細胞」の標本スライド）の上に載置して、室温で３０分反応させた。
［結果］
実施例７の結果、比較例１を基準としたシグナル値（相対値）は１２であり、ノイズ値（相対値）は８であった。また、S/N比（相対値）は1.50であり、定量性は「○」であった。実施例７の結果を表３に示す。
［実施例８］(1次抗体：遊離モノクローナル抗体、2次抗体：蛍光ナノ粒子直結のモノクローナル抗体)
実施例８では、比較例１において、第２反応工程を下記の通り行ったことを除いて、その他の脱パラフィン処理工程、賦活化処理工程、洗浄工程１〜３、第１反応工程、第３反応工程、および観察工程等は、比較例１と同様に行った。
［第２反応工程］
工程（5A）：製造例３で用意したモノクローナル抗体「LO-RG-1」直結蛍光ナノ粒子を、比較例１の工程(3A)で用意した溶液でもって、該２次抗体が比較例１で使用した２次抗体の１０倍のモル数および濃度(mol/μL)となるように分散した分散液を調製し、この分散液１００μＬを工程(4A)で得た標本スライド（「ＰＤ−Ｌ１培養細胞」の標本スライド）の上に載置して、室温で３０分反応させた。
［結果］
実施例８の結果、比較例１を基準としたシグナル値（相対値）は１であり、ノイズ値（相対値）は０．８であった。また、S/N比（相対値）は1.25であり、定量性は「○」であった。実施例８の結果を表３に示す。
［実施例９］(1次抗体：遊離モノクローナル抗体、蛍光ナノ粒子直結のポリクローナル抗体)
実施例９では、比較例１において、第２反応工程を下記の通り行ったことを除いて、その他の脱パラフィン処理工程、賦活化処理工程、洗浄工程１〜３、第１反応工程、第３反応工程、および観察工程等は、比較例１と同様に行った。
［第２反応工程］
工程（5A）：製造例４で用意したポリクローナル抗体（２次抗体）「ヒストファイン」直結蛍光ナノ粒子を、比較例１の工程(3A)で用意した溶液でもって、該２次抗体が比較例１で使用した２次抗体の１０倍のモル数および濃度(mol/μL)となるように分散液を調製し、この溶液を１００μＬ、工程(4A)で得た標本スライド（「ＰＤ−Ｌ１培養細胞」の標本スライド）の上に載置して、室温で３０分反応させた。
［結果］
実施例９の結果、比較例１を基準としたシグナル値（相対値）は２であり、ノイズ値（相対値）は１．５であった。また、S/N比（相対値）は1.33であり、定量性は「○」であった。実施例９の結果を表３に示す。
［実施例１０］(1次抗体：遊離ポリクローナル抗体、蛍光ナノ粒子直結のモノクローナル抗体)
実施例１０では、比較例１において、第１反応工程および第２反応工程を下記の通り行ったことを除いて、その他の脱パラフィン処理工程、賦活化処理工程、洗浄工程１〜３、第３反応工程、および観察工程等は、比較例１と同様に行った。
［第１反応工程］
工程(3A)：無脂肪のドライミルクを５％ｗ/ｖ、１×ＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む溶液を用意した。
工程(3B)：工程(3A)で用意した溶液を用いて、ヒトのＰＤ−Ｌ１に結合可能なポリクローナル抗体である「Anti-PD-L1 抗体 (ab58810)」(動物種：ラビット、Abcam社)を２００倍希釈し、この抗体溶液を１００μＬ、ＰＤ−Ｌ１培養細胞の標本スライド上に載置して、４℃で１晩インキュベーションした。
なお、上記１次抗体は、比較例１で使用した１次抗体のモル数と同じモル数となるように調整して使用した。
［第２反応工程］
工程（5A）：製造例３で用意したモノクローナル抗体「LO-RG-1」直結蛍光ナノ粒子を、比較例１の工程(3A)で用意した溶液でもって、該２次抗体が比較例１で使用した２次抗体の１０倍のモル数および濃度(mol/μL)となるように分散した分散液を調製し、この分散液１００μＬを工程(4A)で得た標本スライド（「ＰＤ−Ｌ１培養細胞」の標本スライド）の上に載置して、室温で３０分反応させた。
［結果］
実施例１０の結果、比較例１を基準としたシグナル値（相対値）は４であり、ノイズ値（相対値）は２．５であった。また、S/N比（相対値）は1.60であり、定量性は「○」であった。実施例１０の結果を表３に示す。
［実施例１１］(1次抗体：遊離ポリクローナル抗体、蛍光ナノ粒子直結のモノクローナル抗体)
実施例１１では、比較例１において、第１反応工程および第２反応工程を下記の通り行ったことを除いて、その他の脱パラフィン処理工程、賦活化処理工程、洗浄工程１〜３、第３反応工程、および観察工程等は、比較例１と同様に行った。
［第１反応工程］
工程(3A)：無脂肪のドライミルクを５％ｗ/ｖ、１×ＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む溶液を用意した。
工程(3B)：工程(3A)で用意した溶液を用いて、ヒトのＰＤ−Ｌ１に結合可能なポリクローナル抗体である「Anti-PD-L1 抗体 (ab58810)」(動物種：ラビット、Abcam社)を２００倍希釈し、この抗体溶液を１００μＬ、ＰＤ−Ｌ１培養細胞の標本スライド上に載置して、４℃で１晩インキュベーションした。
なお、上記１次抗体は、比較例１で使用した１次抗体のモル数と同じモル数となるように調整して使用した。
［第２反応工程］
工程（5A）：製造例４で用意したポリクローナル抗体（２次抗体）「ヒストファイン」直結蛍光ナノ粒子を、比較例１の工程(3A)で用意した溶液でもって、該２次抗体が比較例１で使用した２次抗体の１０倍のモル数および濃度(mol/μL)となるように分散液を調製し、この溶液を１００μＬ、工程(4A)で得た標本スライド（「ＰＤ−Ｌ１培養細胞」の標本スライド）の上に載置して、室温で３０分反応させた。
［結果］
実施例１１の結果、比較例１を基準としたシグナル値（相対値）は８であり、ノイズ値（相対値）は４．５であった。また、S/N比（相対値）は1.78であり、定量性は「○」であった。実施例１１の結果を表３に示す。
［実施例１２］(1次抗体：非蛍光性ナノ粒子に直結されたモノクローナル抗体、蛍光ナノ粒子直結のモノクローナル抗体)
実施例１２では、比較例１において、第１反応工程および第２反応工程を下記の通り行ったことを除いて、その他の脱パラフィン処理工程、賦活化処理工程、洗浄工程１〜３、第３反応工程、および観察工程等は、比較例１と同様に行った。
［第１反応工程］
工程(3A)：無脂肪のドライミルクを５％ｗ/ｖ、１×ＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む溶液を用意した。
工程(3B)：製造例５で製造した、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（E1L3N）が粒子表面に複数結合した非蛍光性のメラミンナノ粒子（非蛍光性ナノ粒子）を、該抗ＰＤ−Ｌ１抗体のモル数および濃度が、比較例１で使用した１次抗体の１０倍のモル数および濃度(mol/μL)となるように、工程(3A)で用意した溶液中に分散した液を１００μＬ製造し、その全量を「ＰＤ−Ｌ１培養細胞」の上に載置して、４℃で１晩インキュベーションした。
具体的には、１次抗体の使用量は、実施例４で説明したように式１から算出して決定した。
［第２反応工程］
工程（5A）：製造例３で用意したモノクローナル抗体「LO-RG-1」直結蛍光ナノ粒子を、比較例１の工程(3A)で用意した溶液でもって、該２次抗体が比較例１で使用した２次抗体の１０倍のモル数および濃度(mol/μL)となるように分散した分散液を調製し、この分散液１００μＬを工程(4A)で得た標本スライド（「ＰＤ−Ｌ１培養細胞」の標本スライド）の上に載置して、室温で３０分反応させた。
［結果］
実施例１２の結果、比較例１を基準としたシグナル値（相対値）は８であり、ノイズ値（相対値）は５．５であった。また、S/N比（相対値）は1.45であり、定量性は「○」であった。実施例１２の結果を表３に示す。
［実施例１３］(1次抗体：非蛍光性ナノ粒子に直結されたモノクローナル抗体、蛍光ナノ粒子直結のポリクローナル抗体)
実施例１３では、比較例１において、第１反応工程および第２反応工程を下記の通り行ったことを除いて、その他の脱パラフィン処理工程、賦活化処理工程、洗浄工程１〜３、第３反応工程、および観察工程等は、比較例１と同様に行った。
［第１反応工程］
工程(3A)：無脂肪のドライミルクを５％ｗ/ｖ、１×ＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む溶液を用意した。
工程(3B)：製造例５で製造した、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（E1L3N）が粒子表面に複数結合した非蛍光性のメラミンナノ粒子（非蛍光性ナノ粒子）を、該抗ＰＤ−Ｌ１抗体のモル数および濃度が、比較例１で使用した１次抗体の１０倍のモル数および濃度(mol/μL)となるように、工程(3A)で用意した溶液中に分散した液を１００μＬ製造し、その全量を「ＰＤ−Ｌ１培養細胞」の上に載置して、４℃で１晩インキュベーションした。
具体的には、１次抗体の使用量は、実施例４で説明したように式１から算出して決定した。
［第２反応工程］
工程（5A）：製造例４で用意したポリクローナル抗体（２次抗体）「ヒストファイン」直結蛍光ナノ粒子を、比較例１の工程(3A)で用意した溶液でもって、該２次抗体が比較例１で使用した２次抗体の１０倍のモル数および濃度(mol/μL)となるように分散液を調製し、この溶液を１００μＬ、工程(4A)で得た標本スライド（「ＰＤ−Ｌ１培養細胞」の標本スライド）の上に載置して、室温で３０分反応させた。
［結果］
実施例１３の結果、比較例１を基準としたシグナル値（相対値）は１２であり、ノイズ値（相対値）は６．５であった。また、S/N比（相対値）は1.85であり、定量性は「○」であった。実施例１３の結果を表３に示す。
［実施例１４］(1次抗体：非蛍光性ナノ粒子に直結されたポリクローナル抗体、蛍光ナノ粒子直結のモノクローナル抗体)
実施例１４では、比較例１において、第１反応工程および第２反応工程を下記の通り行ったことを除いて、その他の脱パラフィン処理工程、賦活化処理工程、洗浄工程１〜３、第３反応工程、および観察工程等は、比較例１と同様に行った。
［第１反応工程］
工程(3A)：無脂肪のドライミルクを５％ｗ/ｖ、１×ＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む溶液を用意した。
工程(3B)：製造例４で製造した、抗ＰＤ−Ｌ１抗体であるポリクローナル抗体（ab58810）が粒子表面に複数結合した非蛍光性のメラミンナノ粒子を、該抗ＰＤ−Ｌ１抗体のモル数および濃度が、比較例１で使用した１次抗体の１０倍のモル数および濃度(mol/μL)となるように、工程(3A)で用意した溶液中に分散した液を１００μＬ製造し、その全量を「ＰＤ−Ｌ１培養細胞」の上に載置して、４℃で１晩インキュベーションした。
具体的には、１次抗体の使用量は、実施例４で説明したように式１から算出して決定した。
［第２反応工程］
工程（5A）：製造例３で用意したモノクローナル抗体「LO-RG-1」直結蛍光ナノ粒子を、比較例１の工程(3A)で用意した溶液でもって、該２次抗体が比較例１で使用した２次抗体の１０倍のモル数および濃度(mol/μL)となるように分散した分散液を調製し、この分散液１００μＬを工程(4A)で得た標本スライド（「ＰＤ−Ｌ１培養細胞」の標本スライド）の上に載置して、室温で３０分反応させた。
［結果］
実施例１４の結果、比較例１を基準としたシグナル値（相対値）は16であり、ノイズ値（相対値）は10であった。また、S/N比（相対値）は1.60であり、定量性は「○」であった。実施例14の結果を表３に示す。
［実施例１５］(1次抗体：非蛍光性ナノ粒子に直結されたポリクローナル抗体、蛍光ナノ粒子直結のポリクローナル抗体)
実施例１５では、比較例１において、第１反応工程および第２反応工程を下記の通り行ったことを除いて、その他の脱パラフィン処理工程、賦活化処理工程、洗浄工程１〜３、第３反応工程、および観察工程等は、比較例１と同様に行った。
［第１反応工程］
工程(3A)：無脂肪のドライミルクを５％ｗ/ｖ、１×ＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む溶液を用意した。
工程(3B)：製造例４で製造した、抗ＰＤ−Ｌ１抗体であるポリクローナル抗体（ab58810）が粒子表面に複数結合した非蛍光性のメラミンナノ粒子を、該抗ＰＤ−Ｌ１抗体のモル数および濃度が、比較例１で使用した１次抗体の１０倍のモル数および濃度(mol/μL)となるように、工程(3A)で用意した溶液中に分散した液を１００μＬ製造し、その全量を「ＰＤ−Ｌ１培養細胞」の上に載置して、４℃で１晩インキュベーションした。
具体的には、１次抗体の使用量は、実施例４で説明したように式１から算出して決定した。
［第２反応工程］
工程（5A）：製造例４で用意したポリクローナル抗体（２次抗体）「ヒストファイン」直結蛍光ナノ粒子を、比較例１の工程(3A)で用意した溶液でもって、該２次抗体が比較例１で使用した２次抗体の１０倍のモル数および濃度(mol/μL)となるように分散液を調製し、この溶液を１００μＬ、工程(4A)で得た標本スライド（「ＰＤ−Ｌ１培養細胞」の標本スライド）の上に載置して、室温で３０分反応させた。
［結果］
実施例１５の結果、比較例１を基準としたシグナル値（相対値）は24であり、ノイズ値（相対値）は16であった。また、S/N比（相対値）は1.50であり、定量性は「○」であった。実施例15の結果を表３に示す。
［考察］
実施例１〜１５では、いずれも比較例１と比べてＳ／Ｎ比が向上した。
すなわち、１つの抗原に対し、蛍光ナノ粒子で蛍光標識された（または将来的にされる）２次抗体を２以上結合させる構成により、１つの抗原に対して、１つのモノクローナル抗体（２次抗体）を結合させる比較例１の蛍光免疫染色法よりもＳ／Ｎ比が向上した。
（遊離の１次抗体と２次抗体を使用する場合）
表３の結果から、遊離のポリクローナル抗体を用いる場合、Ｓ／Ｎ比の観点では、１次抗体として遊離のポリクローナル抗体を使用するとともに、２次抗体として遊離のモノクローナル抗体を使用して、前記抗原１分子に対して前記２次抗体を複数固定させる蛍光免疫染色法が好ましい。また、シグナル増強の観点では、１次抗体と２次抗体の双方に遊離のポリクローナル抗体を使用して、前記抗原１分子に対して前記２次抗体を複数固定させる蛍光免疫染色法が好ましい。
（非蛍光性ナノ粒子に直結した１次抗体、遊離の２次抗体を使用する場合）
表３の結果から、非蛍光性ナノ粒子に直結した１次抗体、遊離の２次抗体を使用する場合、Ｓ／Ｎ比の観点では、１次抗体として非蛍光性ナノ粒子の表面に複数結合させたポリクローナル抗体を使用するとともに、２次抗体として遊離のモノクローナル抗体を使用し、前記抗原１分子に対して前記２次抗体を複数固定させる蛍光免疫染色法が好ましい。
また、シグナル増強の観点では、１次抗体として非蛍光性ナノ粒子の表面に複数結合させたポリクローナル抗体を使用するとともに、２次抗体として遊離のポリクローナル抗体を使用して、前記抗原１分子に対して前記２次抗体を複数固定させる蛍光免疫染色法が好ましい。
（遊離の１次抗体、蛍光ナノ粒子に直結した２次抗体を使用する場合）
表３の結果から、遊離の１次抗体、蛍光ナノ粒子に直結した２次抗体を使用する場合、Ｓ／Ｎ比の観点、シグナル増強の観点ともに、１次抗体として遊離のポリクローナル抗体を使用するとともに、２次抗体として蛍光ナノ粒子に直結したポリクローナル抗体を使用し、前記抗原１分子に対して前記２次抗体を複数固定させる蛍光免疫染色法が好ましい。
（非蛍光性ナノ粒子に直結した１次抗体、蛍光ナノ粒子に直結した２次抗体を使用する場合）
表３の結果から、非蛍光性ナノ粒子に直結した１次抗体、蛍光ナノ粒子に直結した２次抗体を使用する場合、Ｓ／Ｎ比の観点では、１次抗体として非蛍光性ナノ粒子の表面に複数結合させたモノクローナル抗体を使用するとともに、２次抗体として蛍光ナノ粒子の表面に複数固定したポリクローナル抗体を使用し、前記抗原１分子に対して前記２次抗体を複数固定させる蛍光免疫染色法が好ましい。
また、シグナル増強の観点では、１次抗体として非蛍光性ナノ粒子の表面に複数結合させたポリクローナル抗体を使用するとともに、２次抗体として蛍光ナノ粒子の表面に複数固定したポリクローナル抗体を使用し、前記抗原１分子に対して前記２次抗体を複数固定させる蛍光免疫染色法が好ましい。
以上、本発明について、実施の形態および実施例に基づいて説明してきたが、本発明はこれらに限定されず、本願の特許請求の範囲に記載された本発明の要旨に逸脱しないかぎり、設計変更は許容される。
１ａ，１ｂ・・・１次抗体
２ａ〜２ｆ・・・２次抗体
３・・・ビオチン（第１結合基物質）
４・・・ストレプトアビジン（第２結合基物質）
５・・・蛍光ナノ粒子
Ｐ・・・抗原
ｅｐ１・・・第１エピトープ
ｅｐ２・・・第２エピトープ

Claims (11)

  1. 染色対象である抗原に対して１次抗体を特異的に結合・固定させる第１反応工程と、２次抗体を、前記結合・固定された１次抗体に対して特異的に結合させる第２反応工程と、前記２次抗体を蛍光ナノ粒子により蛍光標識する第３反応工程と、を含む蛍光免疫染色法であって、
    前記抗原１分子に対して前記１次抗体を介して前記２次抗体を複数固定させる、蛍光免疫染色法。
  2. 前記１次抗体が遊離の１次抗体であり、前記２次抗体が遊離の２次抗体である、請求項１に記載の蛍光免疫染色法。
  3. 前記１次抗体が蛍光物質を含まない非蛍光性ナノ粒子の表面に固定された１次抗体であり、前記２次抗体が遊離の２次抗体である、請求項１に記載の蛍光免疫染色法。
  4. 前記１次抗体が遊離の１次抗体であり、前記２次抗体が蛍光ナノ粒子の表面に固定された２次抗体である、請求項１に記載の蛍光免疫染色法。
  5. 前記１次抗体が非蛍光性ナノ粒子の表面に固定された１次抗体であり、前記２次抗体が蛍光ナノ粒子の表面に固定された２次抗体である、請求項１に記載の蛍光免疫染色法。
  6. 前記１次抗体がポリクローナル抗体であり、前記２次抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛍光免疫染色法。
  7. 前記１次抗体がモノクローナル抗体であり、前記２次抗体がポリクローナル抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛍光免疫染色法。
  8. 前記１次抗体がポリクローナル抗体であり、前記２次抗体がポリクローナル抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛍光免疫染色法。
  9. 前記１次抗体がモノクローナル抗体であり、前記２次抗体がモノクローナル抗体である、請求項１，３〜５のいずれか１項に記載の蛍光免疫染色法。
  10. 前記２次抗体に第２結合基物質が付加されており、前記蛍光ナノ粒子に第１結合基物質が付加されており、
    第２反応工程の後に、第１結合基物質と第２結合基物質との特異的な結合を介して前記２次抗体と蛍光ナノ粒子とが結合することで前記蛍光標識がなされる、請求項１に記載の蛍光免疫染色法。
  11. 前記第１結合基物質／第２結合基物質の組合せが、ビオチン／アビジン，またはハプテン／抗ハプテン抗体である、請求項１０に記載の蛍光免疫染色法。
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